KR20060115883A

KR20060115883A - 당화 단백질의 측정 방법

Info

Publication number: KR20060115883A
Application number: KR1020067010461A
Authority: KR
Inventors: 유리코 다니구치; 히로유키 에비누마; 가즈노리 사이토
Original assignee: 다이이치 가가쿠 야쿠힝 가부시키가이샤
Priority date: 2003-11-19
Filing date: 2004-11-18
Publication date: 2006-11-10
Also published as: CN1875115A; TWI350372B; EP1693461A1; US7951553B2; JP2011115179A; KR101134607B1; US20080233605A1; ATE509119T1; ES2363228T3; EP1693461A4; JP5517976B2; CN1875115B; TW200528716A; WO2005049857A1; EP1693461B1; JP4769579B2; JPWO2005049857A1

Abstract

본 발명은 푸락토실 리신류의 영향을 경감하고, 또한 간편하고 효율 좋은 당화 단백질, 푸락토실 펩티드 또는 푸락토실 아미노산을 측정하는 방법 및 측정용 시약을 제공한다. 푸락토실 펩티드 또는 푸락토실 아미노산에 pH 4.0∼7.0에서 푸락토실 펩티드 또는 푸락토실 아미노산의 측정용 효소를 특이적으로 작용시켜 얻어진 생성물을 pH 4.0∼7.0에서 측정하는 것을 특징으로 하는 시료중의 푸락토실 펩티드 또는 푸락토실아미노산의 측정에 있어서의 푸락토실 리신류의 영향의 경감 방법 및 그것을 이용한 당화 단백질의 측정 방법을 제공한다.

Description

당화 단백질의 측정 방법{METHOD OF ASSAYING GLYCOPROTEIN}

본 발명은 시료중의 당화 단백질(glycated protein), 당화 펩티드(glycated peptide) 또는 당화 아미노산(glycated amino acid)의 측정 방법 및 그의 측정 방법으로 이용되는 측정용 시약에 관한 것이다.

당화 단백질은 단백질이 비효소적으로 당화된 단백질로, 당 측의 알데히드기와 단백질 측의 아미노기가 쉬프 염기를 형성한 후, 아마도리 전이(Amadori rearrangement)를 거쳐 형성되는 아마도리 화합물이다. 당화 단백질은 생체내에 널리 존재하고 있으며, 이 중 혈액중의 당화 단백질의 농도는 혈청 중에 용해하고 있는 글루코오스 등의 단당의 농도에 의존하고 있다. 당화 단백질로서는 단백질의 아미노 말단의 α-아미노기가 당화된 것(예를 들면, 당화 헤모글로빈), 단백질의 내부 리신 잔기의 ε-아미노기가 당화된 것(예를 들면, 당화 알부민)을 들 수 있으며, 혈청 중의 당화 알부민의 농도나 적혈구 중의 당화 헤모글로빈과 난당화 헤모글로빈과의 존재비는 과거 일정 기간의 평균 혈당치를 반영하는 것으로부터, 당뇨병의 진단, 병상의 관리, 치료 효과의 판정 등, 임상 진단의 지표로서 사용되고 있다.

당화 단백질의 측정 방법으로서는 간단히 수행될 수 있으며, 임상 검사실에 서 흔히 사용되는 자동분석장치에도 적응 가능한 효소법이 알려져 있다(예를 들면, 특허문헌 1 참조). 효소법은 시료중의 당화 단백질에 단백질 분해효소를 작용시키고, 다음 공정의 기질로 되는 당화 펩티드 또는 당화 아미노산을 유리시키는 전처리 공정, 이어서 유리된 기질에 당화 펩티드 특이 효소 또는 당화 아미노산 특이 효소(예를 들면, 옥시다제)를 작용시켜 검출 가능한 생성물(예를 들면, 과산화수소)을 생성시키고, 이 검출 가능한 생성물을 측정하는 측정 공정으로 이루어진 방법이다.

그러나, 지금까지 보고되어 있는 효소법은 전처리 공정에서의 단백질 분해효소 및 측정 공정에 있어서의 특이 효소가 당화 단백질, 당화 펩티드, 당화 아미노산(이하, 총칭하여 "당화 단백질 등"이라 하기도 한다) 개개 분자의 차이를 엄밀하게 인식할 수가 없기 때문에, 측정 대상의 당화 단백질 등과 측정 대상외의 당화 단백질 등이 공존하는 경우, 전기 특이 효소가 이 측정 대상외의 당화 단백질 등과도 반응해 버려, 측정 방법으로서의 특이성이 저하하는 문제가 있다.

전기 측정 공정에 이용되는 당화 펩티드 특이 효소 또는 당화 아미노산 특이 효소로서는 종래, 코리네박테리움 속균을 생산하는 옥시다제(예를 들면, 특허문헌 2 참조), 아스페르길루스 속균을 생산하는 옥시다제(예를 들면, 특허문헌 3 참조)등이 알려져 있지만, 이들의 효소는 당화 아미노산에는 잘 작용하지만, 당화 펩티드에는 작용하기 어렵다. 최근, 푸락토실 아미노산옥시다제를 개변한 효소(특허문헌 4), 또는 사상균 유래 푸락토실 펩티드옥시다제(특허문헌 5)가 보고되어 있으며, 이들 옥시다제는 pH 8.0의 조건하에서 당화 펩티드, 특히 푸락토실 바릴 히스 티딘에 대해서 특이적으로 작용한다고 여겨지고 있다.

전술한 푸락토실 아미노산 옥시다제를 이용한 당화 헤모글로빈의 측정에서는 헤모글로빈 β-서브유닛의 아미노 말단의 바린이 당화된 푸락토실 바린이나, 푸락토실 바린에 다시 1아미노산이 부가하고 있는 푸락토실 바릴 히스티딘과 단백질중의 리신잔기가 당화된 ε-푸락토실 리신에 대한 반응성의 차이가 옥시다제의 특이성을 결정한다. 그러나, 헤모글로빈 분자에는 44개의 리신 잔기가 존재하고 있어, ε-푸락토실 리신에 대한 반응성이 낮아도, 그 영향을 무시할 수 없다. 또한, 헤모글로빈이나 기타 혈장 단백질 유래(예를 들면, 당화 알부민 등)또는 식품, 약제 유래의 푸락토실 리신을 함유하는 화합물(이하, "푸락토실 리신류"라고 하기도 한다)에 의한 정오차를 종래의 방법에서는 회피할 수 없다.

특허문헌 1 : 일본국 특허공개 평 11-127895호 공보

특허문헌 2: 일본국 특허공고 평 5-33997호 공보

특허문헌 3: 일본국 특허공개 평 3-155780호 공보

특허문헌 4: 일본국 특허공개 2001-95598호 공보

특허문헌 5: 일본국 특허공개 2003-235585호 공보

따라서, 본 발명은 푸락토실 리신류의 영향을 경감시켜 각종 자동 분석장치에 적용할 수 있는 간편하고, 효율 좋은, 당화 단백질, 푸락토실 펩티드 또는 푸락토실 아미노산을 측정하는 방법 및 그의 측정용 시약을 제공하는 것에 있다.

본 발명자들은 이러한 실정을 감안하여 예의 연구한 결과, pH 4.0∼7.0에서 푸락토실 펩티드 또는 푸락토실 아미노산의 측정용 효소를 특이적으로 작용시킴으로서 당화 단백질, 푸락토실 펩티드 또는 푸락토실 아미노산의 측정에 있어서, 반응액 중에 존재하는 푸락토실 리신류의 영향을 경감시킬 수 있음을 발견하고, 본 발명을 완성했다.

즉, 본 발명은 푸락토실 펩티드 또는 푸락토실 아미노산에 pH 4.0∼7.0에서 푸락토실 펩티드 또는 푸락토실 아미노산의 측정용 효소를 특이적으로 작용시켜, 얻어진 생성물을 pH 4.0∼7.0에서 측정함을 특징으로 하는 푸락토실 펩티드 또는 푸락토실 아미노산의 측정에 있어서의 푸락토실 리신류의 영향을 경감시키는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명은 또한, 당화 단백질 함유 시료를 단백질 분해효소로 처리하여 유리하는 푸락토실 펩티드 또는 푸락토실 아미노산에, pH 4.0∼7.0에서 푸락토실 펩티드 또는 푸락토실 아미노산의 측정용 효소를 특이적으로 작용시켜, 얻어진 생성물을 pH 4.0∼7.0에서 측정함을 특징으로 하는 시료중의 당화 단백질의 측정에 있어서의 푸락토실 리신류의 영향을 경감시키는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명은 또한, 적어도, (A)단백질 분해효소, (B)pH 4.0∼7.0에서 푸락토실 펩티드 또는 푸락토실 아미노산에 특이적으로 작용하여 과산화수소를 생성하는 옥시다제 및 (C)과산화수소를 측정하기 위한 시약을 포함한 푸락토실 리신류의 영향을 경감한 당화 단백질 측정용 시약을 제공하는 것이다.

본 발명은 또한, 푸락토실 펩티드 또는 푸락토실 아미노산에, pH 4.0∼7.0에서, 적어도 (A) 푸락토실 펩티드 또는 푸락토실 아미노산의 측정용 효소, (B) 과산화수소를 측정하기 위한 시약 및 (C) 당산화 분해효소를 작용시킴을 특징으로 하는 푸락토실 펩티드 또는 푸락토실 아미노산의 측정에 있어서의 푸락토실 리신류의 영향을 경감시키는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명은 더욱이, 당화 단백질 함유 시료를 단백질 분해효소로 처리해 얻어진 푸락토실 펩티드 또는 푸락토실 아미노산에 pH 4.0∼7.0에서, 적어도(A) 푸락토실 펩티드 또는 푸락토실 아미노산의 측정용 효소, (B) 과산화수소를 측정하기 위한 시약 및 (C) 당산화 분해효소를 작용시킴을 특징으로 하는 당화 단백질의 측정에 있어서의 푸락토실 리신류의 영향을 경감시키는 방법을 제공하는 것이다.

[발명의 효과]

본 발명에 의하면, 푸락토실 리신류의 영향을 경감하여 정확히 당화 단백질, 푸락토실 펩티드 또는 푸락토실 아미노산을 측정할 수가 있다. 본 발명의 측정 방법은 간편한 조작으로 측정이 가능하기 때문에, 각종 분석방법에 적용할 수 있으며, 임상 검사의 영역에 있어도 지극히 유용하다.

[도 1] 본 발명의 방법에 의한 헤모글로빈 A1c 값(%)(실시예 5)및 비교예 5에 의한 헤모글로빈 A1c 값(%)과 참조예와의 상관관계를 나타내는 도이다.

[발명을 실시하기 위한 최선의 형태]

당화 단백질은 단백질이 글루코오즈 등의 알도오즈와 비효소적으로 결합하여 생성한 것이면 어떤 것이라도 좋다. 예를 들면, 당화 헤모글로빈, 당화 알부민 등을 들 수 있으며, 이 중 당화 헤모글로빈, 특히 헤모글로빈 A1c(HbA1c)가 측정 대상으로서 바람직하게 이용된다.

당화 단백질을 함유하는 시료로서는 생체 시료로서 전혈, 혈구, 혈청, 혈장, 골수액, 땀, 뇨, 눈물, 타액, 피부, 점막, 모발을 들 수 있다. 또한, 당화 단백질은 주스, 조미료 등의 식품 일반적으로도 함유되어 있다. 이들 중, 시료로서는 전혈, 혈구, 혈청, 혈장이 바람직하다. 이들의 시료는 그대로 측정에 제공하는 것은 물론, 여과나 투석 처리의 후에 측정에 제공해도 좋고, 또한 측정해야 할 당화 단백질을 적당히 농축, 추출, 더욱이 물 또는 후술하는 완충액으로 희석하여도 좋다.

본 발명에 대해서는 먼저, 단백질 분해효소를 이용하여 당화 단백질로부터 푸락토실 펩티드 또는 푸락토실 아미노산을 유리시킨다. 단백질 분해효소는 단백질 분해 활성, 펩티드 분해 활성을 가지고 있으면 특히 제한되지 않지만, 단시간에 효율적으로 푸락토실 펩티드 또는 푸락토실 아미노산, 바람직하기로는 푸락토실 바릴 펩티드 또는 푸락토실 바린을 유리시키는 것이 좋다. 이 단백질 분해효소의 기원은 미생물 유래, 동물유래, 식물유래 등 어느 것이어도 좋고, 특히 한정은 되지 않는다. 구체적으로는 프로테이나제 K, 트립신, 브로메라인, 카르복시펩티다제, 파파인, 펩신, 아미노펩티다제 등 연구 용도의 시판품으로서 용이하게 입수할 수 있는 것, 뉴트럴 프로테이나제, 토요짐 NEP(이상, Toyobo, Ltd.제), 산성 프로테아제, 알칼리프로테아제, 모르신, AO 프로테아제, 펩티다제(이상, Kikkoman Corporation제), 스미짐 CP, 스미짐 TP, 스미짐 LP50D(이상, Shin Nihon Chemical Co., Ltd.제), 써모아제 PC10F, 프로틴 PC, 프로틴 PC10F, 프로틴 PS10, 프로틴 NY10, 프로틴 NL10, 프로틴 NC25(이상, Daiwa Kasei K. K.제), 악티나제 AS(Kaken Pharmaceutical Co., Ltd.제), 프로나 E(Roche제), 우마미자임, 프로테아제S「아마노」G, 프로테아제 A「아마노」G, 프로테아제 P 「아마노」3G(이상, Amano Enzyme Inc.제)등 공업용으로서 시판되고 있는 것을 들 수 있다. 이들 단백질 분해효소는, 푸락토실 펩티드 등에 작용시켜, 작용 전후의 시료를 캐필러리 전기영동을 이용하여 분석, 비교함으로써 효과를 확인할 수 있다. 상기 단백질 분해효소는 단독으로 이용해도, 또는 2종 이상을 조합하여 이용해도 좋다. 이들 중에서, 바실러스속, 아스페르길루스속 또는 스트렙토마이시스속의 미생물 유래, 또는 그의 유전자에 의해 산생되는 것, 또는 메타로프로테이나제, 중성 프로테아제, 산성 프로테아제 또는 알칼리성 프로테아제에 속하는 것이 바람직하다. 바실러스속 유래의 효소로서는 프로틴 PC10F, 프로틴 NC25(Daiwa Kasei K. K.제), 토요짐 NEP(Toyobo, Ltd.제)등, 아스페르길루스속 유래의 효소로서는 모르신(Kikkoman Corporation제), 스트렙토마이시스속 유래의 효소로서는 악티나제 AS, 악티나제 AF, 악티나제 E(Kaken Pharmaceutical Co., Ltd.), 프로테아제, Type-XIV(Sigma제)등을 들 수 있다. 이들은 단독으로 사용할 수 있으나, 토요짐 NEP 등은 프로테이나제 K와 혼합하여 병용 할 수도 있다.

단백질 분해효소의 사용농도는 목적으로 하는 푸락토실 펩티드 또는 푸락토 실 아미노산을 효율적으로 유리할 수 있는 농도이면 특히 제한은 없다. 사용하는 효소의 비활성 등을 고려해, 실험적으로 사용농도를 적당히 설정할 수가 있다. 예를 들면, 아스페르길루스속균 유래의 단백질 분해효소(예를 들면, 모르신, Kikkoman Corporation제)를 0.0001∼50mg/㎖, 바람직하기로는 0.001∼20mg/㎖ 가한다. 단백질 분해효소로 처리할 때의 pH는 특히 조정 하지 않아도 되지만, 사용하는 효소의 작용에 바람직한 pH로 되도록, 적당한 pH 조정제, 예를 들면 후기의 완충액에 의해 pH 3.0∼11.0으로 조정하여도 좋다. 처리 온도는 10∼40℃가 바람직하다.

완충액으로서는 특히 제한은 없고, 인산, 프탈산, 시트르산, 트리스, 말레인산, 숙신산, 옥살산, 타르타르산, 아세트산, 굿(MES, PIPES, ADA 등)의 완충액 등을 사용할 수 있다. 완충액의 농도도 특히 제한은 없지만, 0.00001∼2mol/ℓ, 보다 바람직하기로는 0.001∼1mol/ℓ이다.

시료를 단백질 분해효소로 처리하여 얻어진 유리 푸락토실 펩티드 또는 푸락토실 아미노산으로서는 푸락토실 바릴 히스티딘, 푸락토실 바린 등을 들 수 있다. 또, 생체 시료나 식품 중에는 단백질 분해효소를 작용시키기 전에 이미 당화 단백질이 분해되어 유리된 펩티드나 아미노산에 글루코오스가 결합한 후, 아마도리 전이를 거쳐 생성한 푸락토실 펩티드 또는 푸락토실 아미노산도 포함되어 있으며, 이들도 유리된 푸락토실 펩티드 또는 푸락토실 아미노산에 포함된다.

유리 푸락토실 펩티드 또는 푸락토실 아미노산은 푸락토실 펩티드 또는 푸락토실 아미노산의 측정용 효소를 작용시키고, 그의 작용에 의한 생성물을 측정함으로써 측정할 수 있다.

이 푸락토실 펩티드 또는 푸락토실 아미노산의 측정용 효소로서는 유리 푸락토실 펩티드 또는 푸락토실 아미노산을 대사할 수 있는 것이면 특히 제한되지 않고, 예를 들면, 푸락토실 아미노산옥시다제(일본국 특허공개 2003-79386호 공보 및 국제 공개 제 97/20039호 팜플렛), 케토아민옥시다제(일본국 특허공개 평5-19219호 공보), 푸락토실 펩티드옥시다제(일본국 특허공개 2001-95598호 공보 및 일본국 특허공개 2003-235585호 공보)등을 들 수 있다. 이들 중, 푸락토실 펩티드옥시다제가 바람직하다. 이들 효소는 미생물 유래, 동물 유래, 식물유래 등의 어는 것이라도 좋고, 또 유전자 조작에 의해 만들어진 것이라도 좋다. 더욱이, 화학 수식의 유무도 묻지 않는다. 이들의 효소는 용액 상태에서도 건조 상태에서도 좋고, 불용성 담체에 유지 또는 결합되고 있어도 좋고, 단독으로 또는 2 종 이상을 조합하여 사용할 수 있다.

이들의 효소의 사용량은 효소의 종류에 따라서 다르지만, 바람직하기로는 0.001∼1000 단위/㎖, 특히 바람직하기로는 0.1∼500 단위/㎖이다. 사용하는 효소의 비활성 등을 고려하여 실험적으로 사용 농도를 적당히 설정할 수 있다. 작용시킬 때의 pH는 사용하는 효소의 바람직한 pH를 고려하면서, 본 발명의 효과가 얻어지는 pH 4.0∼7.0, 바람직하기로는 4.0∼6.7이 되도록 완충액을 이용하여 조정한다. 작용 온도는 예를 들면, 10∼40℃이고, 통상의 효소 반응에 이용되는 온도를 적당히 선택할 수 있다. 이 경우의 완충액은 전술한 바와 같이, 특히 제한 없이, 인산, 프탈산, 시트르산, 트리스, 말레인산, 숙신산, 옥살산, 주석산, 아세트산, 굿의 완충액 등이 사용될 수 있다. 이들 중, 인산, 시트르산, ADA(N-(2-아세트아미 드)이미노 2아세트산)가 푸락토실 펩티드 또는 푸락토실 아미노산의 측정용 효소의 보존 안정성에도 우수하여 바람직하다. 완충액의 농도도 특히 제한은 없지만, 0.00001∼2mol/㎍, 보다 바람직하기로는 0.001∼1 mol/ℓ이다.

상기 측정용 효소는 필요에 따라서, 다른 효소, 조효소, 피산화성 정색시약 등도 조합해 사용할 수가 있다. 다른 효소로서는 퍼옥시다제, 디아포라제 또는 푸락토실 바린을 기질로 하지 않는 아미노산 대사 효소 등을 들 수 있다. 또한, 아스코르빈산옥시다제, 피리루빈옥시다제 등의 혈액중의 협잡성분을 처리하기 위한 효소도 사용할 수 있다. 조효소로서는 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드(NAD), 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 환원형(NADH), 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 포스페이트(NADP), 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 환원형 인산(NADPH), 티오-NAD, 티오-NADP 등을 들 수 있다.

피산화성 등색시약으로서는 과산화수소와 반응하여 등색 하는 것이면 어떤 것이라도 좋다. 예를 들면, 4-아미노안티피린과 페놀계, 나프톨계 또는 아닐린계 화합물과의 조합, 3-메틸-2-벤조티아졸리논 히드라존과 아닐린계 화합물과의 조합 등을 들 수 있다. 4-아미노안티피린과 조합할 수가 있는 페놀계 화합물로서는 페놀, p-클로로페놀, 2,4-디클로로페놀, 2,4-디브로모페놀, 2,4,6-트리클로로페놀 등을 들 수 있으며, 아닐린계 화합물로서는 N,N-디메틸 아닐린, N,N-디에틸아니린, N,N-디메틸-m-톨루이딘, N,N-디에틸-m-톨루이딘, N-에틸-N-술포프로필-m-톨루이딘, N-에틸-N-(2-히드록시-3-술포프로필)-m-톨루이딘(TOOS), N-에틸-N-(3-메틸페닐)-N'-아세틸에틸렌디아민, 3-메틸-N-에틸-N-(히드록시에틸)아닐린, N-에틸-N-(2-히드 록시-3-술포프로필)아닐린(ALaS), N-에틸-N-(3-술포프로필)아닐린(ALPS), N,N-디메틸-m-아니시딘, N-에틸-N-(2-히드록시-3-술포프로필)-m-아니시딘(ADOS)등을 들 수 있다. 그 밖에, N-(카르복시메틸아미노카르보닐)-4,4'-비스(디메틸아미노)디페닐아민ㅇ나트륨염(DA-64), 10-(카르복시메틸아미노카르보닐)-3,7-비스(디메틸아미노)페노티아진ㅇ나트륨염(DA-67), 10-N-메틸카르바모일-3,7-디메틸아미노-10H-페노티아진(MCDP), N,N,N',N',N",N"-헥사-3-술포프로필-4,4',4"-트리아미노트리페닐메탄(TPM-PS), 디아미노벤지딘, 히드록시페닐프로피온산, 테트라메틸벤지딘, 오르토페닐렌디아민 등을 들 수 있다.

전기 측정용 효소를 작용시켜 얻어진 생성물로서는 예를 들면, 펩티드, 과산화수소, 당오손 등을 들 수 있다. 유리된 푸락토실 펩티드 또는 푸락토실 아미노산의 측정은 이들 생성물을 측정함으로서 행해지지만, 단시간에 간단하게 측정할 수 있기 때문에, 과산화수소를 측정하는 것이 바람직하다. 과산화수소의 측정 방법으로서는, 예를 들면, 산소 전극을 이용하는 전기적 방법, 퍼옥시다제, 또는 디아포라제와 상기의 발색제를 이용하는 효소적 방법을 들 수 있지만, 후자의 효소적 방법이 바람직하다.

과산화수소의 측정은 통상, 전기 측정용 효소를 작용시켜 과산화수소를 발생시키는 공정에 연속하여 행하여지나, 과산화수소의 측정 용액은 완충액을 이용하여 pH 4.0∼7.0, 바람직하기로는 pH 4.0∼6.7로 조정한다. 발색의 정도(흡광도 변화량)는 분광 광도계에 의해 측정하며, 표준으로 하는 농도 기존의 푸락토실 펩티드 또는 푸락토실 아미노산 등의 흡광도와 비교하여 시료 중에 포함되는 당화 단백질, 푸락토실 펩티드 또는 푸락토실 아미노산을 측정할 수가 있다.

본 발명의 측정 방법에서는 푸락토실 펩티드 또는 푸락토실 아미노산을 유리시키는 공정과 유리된 푸락토실 펩티드 또는 푸락토실 아미노산을 측정하는 공정을 각각 행하여 당화 단백질을 측정할 수도 있고, 이들의 공정을 연속적으로 1단계로 행하여 측정할 수도 있다.

또한, 본 발명의 측정 방법에서는 반응액 또는 측정액을 pH 4.0∼7.0, 바람직하기로는 pH 4.0∼6.7로 조정함으로써, 푸락토실 펩티드 또는 푸락토실 아미노산의 측정용 효소의 푸락토실 리신류에 대한 영향을 경감할 수가 있다. 따라서, 유리한 푸락토실 펩티드 또는 푸락토실 아미노산을 측정하는 공정에서는 상기 pH로 조정하는 것이 필수이다.

본 발명의 푸락토실 리신류의 영향을 경감한 당화 단백질 측정용 시약은 적어도 (A) 단백질 분해효소, (B) pH 4.0∼7.0에서 푸락토실 펩티드 또는 푸락토실 아미노산에 특이적으로 작용하여 과산화수소를 생성하는 옥시다제 및 (C) 과산화수소를 측정하기 위한 시약을 포함한다. 또한, 전기 (B) 기재의 옥시다제를 푸락토실 펩티드 또는 푸락토실 아미노산에 작용시킨 결과 생성되는 글루코손에 다시 당산화 분해효소를 작용시켜, 과산화수소를 생성시켜 감도 증가를 도모할 수가 있다(일본국 특허공개 2000-333696 호 공보). 전기 당산화 분해효소로서는 글루코스옥시다아제, β-갈락토시다아제 및 피라노오즈옥시다제로 이루어진 군에서 선택된 적어도 1종의 산화효소인 것이 바람직하다. 각각의 효소 및 시약의 구체적인 설명은 전술한 바와 같다. 기타, 당화 헤모글로빈, 특히 헤모글로빈 A1c를 측정할 때에는 적혈구 로부터 헤모글로빈을 꺼내 반응에 제공하기 위한 전처리제 등을 사용할 수 있으며, 혈액중의 협잡성분을 처리하는 효소, 반응 조정제, 시약의 안정화제, 또 염화나트륨, 염화칼륨, 페로시안화칼륨 등의 염, 환원성 물질의 영향 회피하기 위한 테트라졸륨염, 방부제로서 항생물질, 아지드화나트륨 등도 첨가할 수 있다.

상기 적혈구로부터 헤모글로빈을 꺼내 반응에 제공하기 위한 전처리제로서는, 폴리옥시에틸렌 유도체로부터 선택되는 비이온계 계면활성제(예를 들면, 트리톤 X-100 등), 음이온계 계면활성제 등을 이용할 수가 있다. 이들 계면활성제의 사용량은 필요에 따라 여과, 투석처리 등을 행한 시료중, 0.0001∼10%, 바람직하기로는 0.001∼1%이다.

본 발명의 당화 단백질 측정용 시약은 용액 상태뿐만이 아니라, 건조 상태나 겔 상태에서도 제공할 수 있다. 또, 유리병, 플라스틱 용기 등에 충전하는 것 이외, 불용성 담체에 도포, 함침 등의 형태로 제공할 수 있다. 불용성 담체로서는 예를 들면, 라텍스, 유리, 콜로이드 등의 입자, 구상 담체, 반도체나 유리 등의 평판상 담체, 종이나 니트로셀루로오즈 등의 막상 담체, 섬유상 담체를 들 수 있다.

실시예

이하, 실시예를 들어 본 발명을 더욱 상세하게 설명하나, 본 발명은 이들 한정되는 것은 아니다.

[실시예 1] 푸락토실 아미노산의 측정

(1) 시료의 조제

푸락토실 바린(fV), 푸락토실 바릴 히스티딘(fVH)(이상, BioQuest제), ε-푸락토실 리신(fK)(Kikkoman Corporation제)을 칭량하여, 20mmol/ℓ 인산 완충액(pH 7.0)에 용해하여 0.3mmol/ℓ 농도의 시료로 했다.

(2)시료의 측정

히타치 7150형 자동 분석장치를 이용하여, 아래 조작에 의해 각 시료의 측정을 행했다.

<제 1시약>

0.1mol/ℓ 인산 완충액

실시예 1; pH 5.5, pH 6.0, pH 6.5, pH 7.0

비교예 1; pH 7.5, pH 8.0

<제 2시약>

5 단위/㎖ 푸락토실 펩티드옥시다제(FPOX-CE, Kikkoman Corporation제)

20 단위/㎖ 퍼옥시다제(III)(Toyobo, Ltd.제)

1mmol/ℓ N-에틸-N-(2-히드록시-3-술포프로필)-m-톨루이딘(TOOS)

1mmol/ℓ 4-아미노안티피린

0.1mol/ℓ 인산 완충액

실시예 1; pH 5.5, pH 6.0, pH 6.5, pH 7.0

비교예 1; pH 7.5, pH 8.0

(제 1시약과 제 ２시약은 동일한 pH의 조합으로 사용했다.)

시료 20㎕에 제 1시약 240㎕를 가하고, 37℃에서 5분간 가온한 후, 흡광도를 측정했다(흡광도 1). 그 다음에 제 ２시약 80㎕를 가하고, 37℃에서 5분간 가온한 후 흡광도를 측정했다(흡광도 II). 흡광도의 측정은 주파장 546nm(부파장 800nm)에서 행하고, 시료 대신 생리 식염수를 이용하여 동일하게 조작한 것(시약 블랭크)을 대조로 했다.

각 시료의 흡광도 I 및 흡광도 II로부터 식 A를 이용하여 각 시료의 흡광도 변화량(측정값)을 산출했다.

식 A: 흡광도 변화량(측정값)= 흡광도 II－(흡광도 I×(20＋240)/(20＋240＋80))

얻어진 각 측정값을 이용하여, 푸락토실 바린의 측정값에 대한 ε-푸락토실리신의 측정값의 비(fK/fV) 및 푸락토실 바릴 히스티딘의 측정값에 대한 ε-푸락토실 리신의 측정값의 비(fK/fVH)를 산출했다. 또, pH 8.0 조건에 있어서의 fK/fV 및 fK/fVH 각각의 측정값의 비를 100%로 하여 각 pH 조건의 측정치의 비도 비교했다. 결과를 표 1에 나타냈다.

[표 1]

표 1로부터 명백한 바와 같이, fK/fV, fK/fVH의 어느 경우에서도, 실시예의 측정값의 비는 비교예와 비교하여, 크게 낮은 값이었다. 본 발명의 방법은 fV, fVH에 대한 특이성이 높고, 푸락토실 리신류와의 반응성이 낮은 것을 알았다.

[실시예 2] 푸락토실 아미노산의 측정

(1) 시료의 조제

실시예 1과 동일하게, 푸락토실 바실 히스티딘(fVH)(BioQuest제), ε-푸락토실 리신(fK)(Kikkoman Corporation제)를 0.02mol/ℓ의 인산 완충액(pH 7.0)에 용해하여 0.3mmol/ℓ 농도의 시료로 했다.

(2) 시료의 측정

<제 1시약>

실시예 1의 제 1시약을 사용했다.

<제 ２시약>

5단위/㎖ 푸락토실 펩티드옥시다제(FPOX-CE)를 5단위/㎖ 푸락토실 펩티드옥시다제(FPOX-EE)로 대신하는 이외는 실시예 1과 동일한 조성의 제 ２시약을 사용했다.

(제 1시약과 제 ２시약은 동일한 pH의 조합으로 사용했다.)

실시예 1과 동일한 조작을 행했다. 결과를 표 2에 나타냈다.

[표 2]

표 2로부터 명백한 바와 같이, 실시예 1과는 다른 푸락토실 펩티드옥시다제(FPOX-EE)를 사용한 경우에도 비교예와 비하여 fK/fVH가 큰폭으로 감소하고 있으며, 푸락토실 바릴 히스티딘에 대한 특이성이 높고, 푸락토실 리신류와의 반응성이 낮음을 알았다.

[실시예 3] 푸락토실 아미노산 및 푸락토실 펩티드의 측정

(1)시료의 조제

푸락토실 바린, 푸락토실 바릴 히스티딘(이상, BioQuest제), ε-푸락토실 리신(Kikkoman Corporation제)을 각각 칭량하여 0.02mol/ℓ 인산 완충액(pH 7.0)에 용해하여 0.6mmol/ℓ 농도의 용액으로 했다. 0.6mmol/ℓ 푸락토실 바린 용액 및 0.6mmol/ℓ 푸락토실 바릴 히스티딘 용액에 등량의 0.02mol/ℓ 인산 완충액(pH 7.0)또는 0.6mmol/ℓ ε-푸락토실 리신 용액을 혼합하고, 0.3mmol/ℓ 푸락토실 바린 시료, 0.3mmol/ℓ 푸락토실 바실 히스티딘 시료, 또는 ε-푸락토실 리신과의 혼합 시료(각 기질의 농도는 0.3mmol/ℓ)로 했다.

(2)시료의 측정

히타치 7150 형 자동 분석장치를 이용하여, 아래 조작에 의해 각 시료의 측정을 행했다.

<제 1시약>

실시예 1의 제 1시약 중, pH 5.5와 pH 6.5의 것 및 비교예 1 중 pH 8.0의 것을 사용했다.

<제 ２시약>

실시예 1의 제 ２시약 중, pH 5.5와 pH 6.5의 것 및 비교예 1 중 pH 8.0의 것을 사용했다.

(제 1시약과 제 ２시약은 공통의 pH의 조합으로 사용했다.)

실시예 1과 동일하게 조작하여 푸락토실 바린 시료의 측정치에 대한 푸락토실바린과 ε-푸락토실리신과의 혼합 시료의 측정값의 비((fV＋fK)/fV) 및 푸락토실 바릴 히스티딘 시료의 측정치에 대한 푸락토실 바릴 히스티딘과 ε-푸락토실 리신과의 혼합 시료의 측정값의 비((fVH＋fK)/fVH)를 산출하여 평가했다. 결과를 표 3에 나타낸다.

[표 3]

표 3으로부터 명백한 바와 같이, 실시예 3에서는 비교예 3과 비교하여 ε-푸락토실 리신의 영향이 크게 경감될 수 있음을 알았다.

[실시예 4] 헤모글로빈 A1c(HbA1c)%의 측정

(1) 시료의 조제

EDTA를 항응고제로서 함유하는 채혈관을 이용하여 피검사자 15명으로부터 통상의 방법에 의해 채혈한 전혈을 냉실에 밤새 정치하여 적혈구를 침강시켰다. 침강한 적혈구 층으로부터 10㎕를 채취하고, 이것에, 0.1% 트리톤 X-100 수용액 300㎕를 가하여 혼합하여 혈구 용혈액 시료를 조제했다.

(2)시료의 측정

히타치 7150형 자동 분석장치를 이용하여, 아래 조작에 의해 각 시료의 측정을 실시했다.

<제 1시약>

1 단위/㎖ 프로테이나제 K

2mmol/ℓ WST-3(Dojindo제)

0.02mol/ℓ 인산 완충액(pH 8.0)

<제 ２시약>

4 단위/㎖ 푸락토실 펩티드옥시다제(FPOX-CE, Kikkoman Corporation제)

20 단위/㎖ 퍼옥시다제(III)(Toyobo, Ltd.제)

80 μmol/ℓ DA-64(Wako Pure Chemical Industries, Ltd.제)

7500 단위/㎖ 토요짐 NEP(Toyobo, Ltd.제)*

37.5mmol/ℓ NaCl

0.2mol/ℓ 인산 완충액(실시예 4: pH 6.0, 비교예 4: pH 8.0)

* 각각의 토요짐 NEP는 10만 단위/㎖를 500mmol/ℓ NaCl를 함유하는 20mmol/ℓ의 인산 완충액(실시예 4: pH 6.0, 비교예 4: pH 8.0)에 대해, 4℃에서 4시간 투석한 후 이용했다.

** 본 발명 및 비교예의 반응액의 최종 pH는 각각 6.7 및 8.0이다.

각 시료 20㎕에 제 1시약 240 ㎕를 가하고, 37℃에서 5분간 가온한 후의 흡광도를 측정했다(흡광도 III). 이어서 제 ２시약 80㎕를 가하고, 37℃에서 5분간 가온한 후의 흡광도를 측정했다(흡광도 IV). 또, 각각의 시료의 흡광도 III 및 흡광도 IV로부터, 식 B를 이용하여 각 시료중의 푸락토실 펩티드 량에 의한 흡광도 변화량(흡광도 V)을 산출했다.

식 B: 흡광도 V= 흡광도 IV-(흡광도 III××0＋240)/(20＋240＋80))

상기 흡광도 III은 총헤모글로빈 농도에 비례하므로, 헤모글로빈 A1c 값(%) 기존의 혈구 용혈액(헤모글로빈 A1c값 8.6%)을 상기와 동일하게 조작했을 경우의 흡광도 III 및 V와 비교하여 각 시료의 헤모글로빈 A1c 값(%)을 산출했다. 실시예 4 비교예 4에 의해 구하여진 헤모글로빈 A1c 값을 라텍스 법을 원리로 하는 시판 킷 「라피디아 Alc」(FUJIREBIO Inc.제)에 의해 측정한 각 시료중의 헤모글로빈 A1c 값(%)(참조예)와 비교했다. 결과를 표 4 에 나타냈다.

[표 4]

표 4로부터 명백한 바와 같이, 비교예 4에서는 본래 일어날 수 없는 음의 값이 되어 버리는 경우가 있는데 반해, 본 발명의 측정 방법은 비교예에 비해 참조예와의 상관성이 양호함이 판명되었다. 따라서, 본 발명의 측정 방법에서는 헤모글로빈 유래의 ε-푸락토실 리신 또는 푸락토실 리실 펩티드의 영향을 받지 않고, 시료중의 헤모글로빈 A1c 값(%)을 측정할 수 있다.

[실시예 5J 헤모글로빈 A1c 값(%)의 측정(1)시료의 조제

실시예 4와 동일하게 사람 혈구 시료 35예로부터 혈구 용혈액 시료를 조제했다.

(2)시료의 측정

히타치 7150형 자동 분석장치를 이용하여 아래 조작에 의해 각 시료의 측정 을 행했다.

<제 1시약>

1단위/㎖ 프로테이나제K

0.2% 프라이서후A208B(DAI-ICHI KOGYO SEIYAKU Co., Ltd.제)

0.02mol/ℓ 인산 완충액(pH 8.0)

<제 ２시약>

4단위/㎖ 푸락토실 펩티드옥시다제(FPOX-CE, Kikkoman Corporation제)

20단위/㎖ 퍼옥시다제(III)(Toyobo, Ltd.제)

80μmol/ℓ TPM-PS(Dojindo제)

7500단위/㎖ 토요짐 NEP(Toyobo, Ltd.제)*

37.5mmol/ℓ NaCl

0.2mol/ℓ 인산 완충액(pH 5.5, 6.0, 7.0, 8.0)

* 각각의 토요짐 NEP는 10만단위/㎖를 500mmol/ℓ의 NaCl을 함유하는 20mmol/ℓ의 인산 완충액(pH 5.5, 6.0, 7.0, 8.0)에 대해, 4℃에서 4시간 투석한 후, 이용했다.

시료 20㎕에 제 1시약 240㎕를 가하고, 파장 600nm에서 흡광도(흡광도 VI)를, 시료 대신에 생리 식염수를 이용하여 동일하게 조작한 것의 (시약 블랭크)를 대조로 측정했다. 그 다음에 37℃에서 5분간 가온한 후, 제 ２시약 80㎕를 가하고, 37℃에서 5분간 가온 후의 파장 600nm의 흡광도(흡광도 VII)를 시약 블랭크를 대조에 측정했다. 이들 4종의 반응액의 최종 pH는 각각 6.4, 6.7, 7.2, 8.0이고, 헤모 글로빈 A1c 값(%)은 실시예 4와 동일하게 하여 산출했다. 참조예로서 시판 킷「라피디아 Alc」(FUJIREBIO Inc.제)를 이용하여 제조원 지정의 방법으로 측정했다. 실시예 5 및 비교예 5에 의한 헤모글로빈 에 나타냈다. 또한, 본 발명의 방법 및 비교예의 각각에 대해서, 참조예에 대한 상관계수 및 참조예의 측정값과의 차이의 참조예의 측정값에 대한 퍼센트(% 바이어스)의 평균치를 표 5에 나타냈다.

[표 5]

본 발명의 측정 방법은 참조예와 잘 일치하고 있는 것이 판명되었다. 본 발명의 측정 방법에서는 헤모글로빈 유래의 ε-푸락토실 리신 또는 푸락토실 리실 펩티드의 영향을 받지 않고, 시료중의 헤모글로빈 A1c 값(%)을 측정할 수 있다.

[실시예 6] 푸락토실 펩티드 또는 푸락토실 아미노산의 측정용 효소의 보존 안정성의 확인

(1)효소액의 조제

하기 처방으로 효소액을 조제했다.

50mmol/ℓ 완충액(pH 6.0)*

* 완충제의 종류는 인산칼륨, 시트르산나트륨 및 N-(2-아세트아미드)이미노 ·2 아세트산(ADA)의 3 종류

5단위/㎖ 퍼옥시다제(III)(Toyobo, Ltd.제)

1단위/㎖ 푸락토실 펩티드옥시다제(FPOX-CE, Kikkoman Corporation제)

(2)효소액의 보존

전기 3종류의 효소액 각각을 4℃, 37℃에서 밤새 방치했다.

(3)효소액중의 효소 활성의 측정

히타치 7170형 자동 분석장치를 이용하여 하기 조작에 의해 효소액중의 효소 활성을 측정했다.

<희석 효소액>

상기 3 종류의 효소액 각각을 100mmol/ℓ 인산 완충액(pH 7.5)으로 2배로 희석하여 측정에 사용했다.

<효소 활성 측정용 제 1시약>

0.5mmol/ℓ N-에틸-N-(2-히드록시-3-술포프로필)-m-톨루이딘(TaOS)

0.5mmol/ℓ 4-아미노안티피린

1단위/㎖ 퍼옥시다제(III)(Toyobo, Ltd.제)

100mmol/ℓ 인산 완충액(pH 7.5)

<효소 활성 측정용 제 ２시약>

150mmol/ℓ 푸락토실글리신 수용액

희석 효소액 6.5㎕에 효소 활성 측정 제 1시약 182㎕를 가하고, 37℃에서 5분간 가온했다. 그 다음에 효소 활성 측정용 제 ２시약 26㎕를 가하고, 효소 활성 측정용 제 ２시약을 첨가한 후, 2분∼3분의 546nm에서의 흡광도의 변화량을 측정했 다. 4℃로 보존한 효소액의 흡광도 변화량을 100%로 하고, 37℃에서 보존한 효소액의 흡광도 변화량을 상대 치로 나타내어 안정성을 평가했다.

인산칼륨 완충액에서는 95%, 시트르산 나트륨 완충액에서는 98%, ADA 완충액에서 89%의 상대 활성이 측정되고, 이들 완충제가 푸락토실 펩티드 또는 푸락토실 아미노산의 측정용 효소의 보존 안정성이 우수함이 확인되었다.

Claims

푸락토실 펩티드 또는 푸락토실 아미노산에 pH 4.0∼7.0에서 푸락토실 펩티드 또는 푸락토실 아미노산의 측정용 효소를 특이적으로 작용시켜 얻어진 생성물을 pH 4.0∼7.0에서 측정함을 특징으로 하는 푸락토실 펩티드 또는 푸락토실 아미노산의 측정에 있어서의 푸락토실 리신류의 영향의 경감 방법.
당화 단백질 함유 시료를 단백질 분해효소로 처리하고, 유리하는 푸락토실 펩티드 또는 푸락토실 아미노산에, pH 4.0∼7.0에서 푸락토실 펩티드 또는 푸락토실 아미노산의 측정용 효소를 특이적으로 작용시켜 얻어진 생성물을 pH 4.0∼7.0에서 측정함을 특징으로 하는 시료중의 당화 단백질의 측정에 있어서의 푸락토실 리신류의 영향의 경감 방법.
제 2항에 있어서, 당화 단백질이 당화 헤모글로빈인 것이 특징인 푸락토실 리신류의 영향의 경감 방법.
제 2항 또는 제 3항에 있어서, 단백질 분해효소가 바실러스속, 아스페르길루스속 또는 스트렙토마이시스속의 미생물 유래 또는 이 미생물의 유전자를 재조합 조작하여 얻어진 것이 특징인 푸락토실 리신류의 영향의 경감 방법.
제 1항 내지 제 4항의 어느 1항에 있어서, 푸락토실 펩티드가 푸락토실 바실 히스티딘인 것이 특징인 푸락토실 리신류의 영향의 경감 방법.
제 1항 내지 제 4항의 어느 1항에 있어서, 푸락토실 아미노산이 푸락토실 바린인 것을 특징으로 하는 푸락토실 리신류의 영향의 경감 방법.
제 1항 내지 제 6항의 어느 1항에 있어서, 푸락토실 펩티드 또는 푸락토실 아미노산의 측정용 효소가 푸락토실 펩티드옥시다제인 것을 특징으로 하는 푸락토실 리신류의 영향의 경감 방법.
제 1항 내지 제 7항의 어느 1항에 있어서, 얻어진 생성물이 과산화수소인 것이 특징인 푸락토실 리신류의 영향의 경감 방법.
적어도, (A)단백질 분해효소, (B) pH 4.0∼7.0에서 푸락토실 펩티드 또는 푸락토실 아미노산에 특이적으로 작용하여 과산화수소를 생성하는 옥시다제 및 (C) 과산화수소를 측정하기 위한 시약을 포함한 푸락토실 리신류의 영향을 경감한 당화 단백질 측정용 시약.
푸락토실 펩티드 또는 푸락토실 아미노산에 pH 4.0∼7.0에서 적어도(A) 푸락토실 펩티드 또는 푸락토실 아미노산의 측정용 효소, (B) 과산화수소를 측정하기 위한 시약 및 (C) 당산화 분해효소를 작용시킴을 특징으로 하는 푸락토실 펩티드 또는 푸락토실 아미노산의 측정에 있어서의 푸락토실 리신류의 영향의 경감 방법.
당화 단백질 함유 시료를 단백질 분해효소로 처리해 얻어진 푸락토실 펩티드 또는 푸락토실 아미노산에, pH 4.0∼7.0에서, 적어도(A) 푸락토실 펩티드 또는 푸락토실 아미노산의 측정용 효소, (B) 과산화수소를 측정하기 위한 시약 및 (C) 당산화 분해효소를 작용시킴을 특징으로 하는 당화 단백질의 측정에 있어서의 푸락토실 리신류의 영향의 경감 방법.
제 1항 내지 제 4항의 어느 1항에 있어서, 당화 단백질이 당화 헤모글로빈인 것을 특징으로 하는 푸락토실 리신류의 영향의 경감 방법.
제 11항 또는 제 12항에 있어서, 단백질 분해효소가 바실러스속, 아스페르길루스속 또는 스트렙토마이시스속의 미생물 유래 또는 이 미생물의 유전자를 재조합 조작에 의해 얻어진 것인 푸락토실 리신류의 영향의 경감 방법.
제 10항 내지 제 13항의 어느 1항에 있어서, 푸락토실 펩티드가 푸락토실 바릴 히스티딘인 푸락토실 리신류의 영향의 경감 방법.
제 10항 내지 제 13항의 어느 1항에 있어서, 푸락토실 아미노산이 푸락토실 바린인 푸락토실 리신류의 영향의 경감 방법.
제 1항 내지 제 4항의 어느 1항에 있어서, 푸락토실 펩티드 또는 푸락토실 아미노산의 측정용 효소가 푸락토실 펩티드옥시다제인 푸락토실 리신류의 영향의 경감 방법.