WO2005043146A1 - バイオセンサおよびその製造方法 - Google Patents

バイオセンサおよびその製造方法 Download PDF

Info

Publication number
WO2005043146A1
WO2005043146A1 PCT/JP2004/016085 JP2004016085W WO2005043146A1 WO 2005043146 A1 WO2005043146 A1 WO 2005043146A1 JP 2004016085 W JP2004016085 W JP 2004016085W WO 2005043146 A1 WO2005043146 A1 WO 2005043146A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
buffer
mediator
surfactant
dispersion
production method
Prior art date
Application number
PCT/JP2004/016085
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Hideaki Yamaoka
Tomomichi Tsujimoto
Original Assignee
Arkray, Inc.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Arkray, Inc. filed Critical Arkray, Inc.
Priority to DE602004028267T priority Critical patent/DE602004028267D1/de
Priority to US10/572,423 priority patent/US20070034512A1/en
Priority to EP04793193A priority patent/EP1679508B1/en
Priority to AT04793193T priority patent/ATE475085T1/de
Priority to JP2005515161A priority patent/JP4088312B2/ja
Publication of WO2005043146A1 publication Critical patent/WO2005043146A1/ja

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/001—Enzyme electrodes
    • C12Q1/004—Enzyme electrodes mediator-assisted
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing

Definitions

  • the present invention c background art relating biosensor electrochemically measuring the measurement object in the sample
  • an electrode system having a working electrode (also referred to as a measurement electrode) and a counter electrode is formed on an electrically insulating substrate by a method such as screen printing or the like. It can be produced by forming a reagent layer containing an oxidoreductase that reacts with a substance, a mediator (electron transfer substance), and the like (for example, see Patent Document 1).
  • the object to be measured is oxidized and the mediator is reduced, for example, by the catalytic action of the oxidoreductase.
  • the reduced mediator (hereinafter, referred to as “reduced mediator”) is reoxidized by an electrochemical method using the electrode system, and an object of measurement in the sample liquid is determined from an oxidation current value obtained by the reoxidation. Can be calculated.
  • Patent document 1 JP-A-1-291153
  • an object of the present invention is to provide a biosensor capable of avoiding the influence of oxygen on a mediator and capable of measuring an object to be measured in a sample solution quickly, simply, and with high accuracy.
  • a method for producing a biosensor according to the present invention comprises preparing a substrate having an electrode, and coating the electrode surface with at least a mediator, a surfactant, a buffer, and a layered inorganic compound. It is a production method including a step of forming an inorganic gel layer to be contained.
  • the biosensor of the present invention is a biosensor manufactured by the manufacturing method of the present invention.
  • the present inventors have conducted intensive studies on a neurosensor to prevent a mediator (reduced mediator) reduced by a reaction between an object to be measured in a sample and an oxidoreductase from being naturally oxidized.
  • a mediator reduced mediator
  • an inorganic gel layer is formed by a layered inorganic compound.
  • the inorganic gel layer further contains a surfactant and a buffer, the reduced mediator is reduced. It has been found that an inorganic gel layer having an effect of preventing natural oxidation can be formed. It has been found for the first time by the present inventors that the effect of preventing the natural oxidation can be obtained by such a method.
  • the reduced mediator for indirectly measuring an object to be measured in a sample is regenerated by, for example, oxygen in the measurement atmosphere or dissolved oxygen in the sample. It can be prevented from being acidified. Therefore, it is possible to provide a biosensor excellent in measurement accuracy, in which a measurement error due to reoxidation of the reduced mediator is eliminated.
  • “natural oxidation of the mediator” refers to, for example, dissolved oxygen in a liquid sample at the time of use of a noise sensor or oxygen absorbed by moisture in air (for example, moisture in air during storage). Absorbs oxygen in the air) to oxidize the mediator.
  • a component containing the mediator, a surfactant, a buffer, and a layered inorganic compound For example, a component containing the mediator, a surfactant, a buffer, and a layered inorganic compound.
  • the mediator forms a complex in which the mediator fits tightly into a sheet of the layered inorganic compound, and the mediator is a liquid. It is considered that contact with dissolved oxygen contained in the sample or the like is prevented.
  • the layered inorganic compound shuts out water as described above, whereby the attack of the dissolved oxygen on the mediator can be prevented.
  • the presence of the surfactant further disperses the complex in which the layered inorganic compound and the mediator are not polymerized and insolubilized.
  • a gel layer can be formed.
  • the dispersion contains a buffer
  • a uniform inorganic gel layer can be formed, and the function of preventing iridescence can be further improved.
  • the buffering agent acts as a binder when forming a complex of the mediator and the layered inorganic compound. Due to this action as a binder, a complex in which the bond between the mediator and the layered inorganic compound is further strengthened is formed.For example, a liquid containing dissolved oxygen can be further shut out, and the mediator is reoxidized by oxygen. It is possible to prevent the dangling.
  • the surfactant also has a function as a so-called blocking agent that prevents the buffering agent, the layered inorganic compound and the mediator from forming a polymer and becoming indispensable. It is thought to fulfill.
  • the biosensor of the present invention can be prevented from being reoxidized by, for example, oxygen in the measurement atmosphere or dissolved oxygen in the sample by manufacturing the biosensor by the method described above. For this reason, the biosensor of the present invention eliminates measurement errors due to reoxidation of the reduced mediator, and is excellent in measurement accuracy.
  • the transfer of electrons from the oxidoreductase to the mediator is performed via the interlayer of the layered inorganic compound, which is not water, that is, via the electric double layer. . Therefore, according to the biosensor of the present invention in which moisture is shut off by the inorganic gel layer, for example, there is an effect that deterioration can be prevented even in a high humidity environment. Further, it is considered that the electric double layer of the layered inorganic compound allows electrons to pass more easily than water, which leads to an increase in the reaction rate.
  • biosensor according to the production method of the present invention can For example, it is also possible to prevent the electrode from being colored due to oxidation.
  • the inorganic gel layer that prevents the mediator from oxidizing naturally is also referred to as an "antioxidant layer”.
  • FIG. 1 is a process chart showing an example of a method for producing a biosensor in an embodiment of the present invention, wherein (A) and (F) show respective steps.
  • FIG. 2 is a cross-sectional view of the biosensor according to the embodiment.
  • FIG. 3 is a graph showing a temporal change of a current value when a sample is measured by a glucose sensor in the example of the present invention.
  • FIG. 3 (A) is an example, and FIG. Indicates the results of the comparative examples, respectively.
  • FIG. 4 is a graph showing a relationship between a dissolved oxygen concentration in a sample and a rate of change (%) in another example of the present invention.
  • FIG. 5 is a graph showing a relationship between a dissolved oxygen concentration in a sample and a rate of change (%) in still another example of the present invention.
  • FIG. 6 is a graph showing a relationship between a dissolved oxygen concentration in a sample and a rate of change (%) in still another example of the present invention.
  • the layered inorganic compound is preferably a layered clay mineral, particularly preferably a swellable clay mineral.
  • the layered inorganic compound may be, for example, a compound in which a polyhedron of an inorganic substance is connected in a plane to form a sheet structure, and the sheet structure is further layered to form a crystal structure.
  • Examples of the shape of the polyhedron include a tetrahedral sheet and an octahedral sheet, and specific examples include a Si tetrahedron and an A1 octahedron.
  • Such layered inorganic compounds include, for example, layered clay minerals, porcelain, idocite talcite, smectite, halloysite, kaolin minerals, mica and the like.
  • the layered clay mineral generally includes an aluminum silicate mineral which occupies most of clay (fine earth-like inorganic granules which exhibit plasticity in a wet state with water).
  • Si is a tetrahedron of Si surrounded by four oxygen atoms (O)
  • A1 or Mg is 6
  • An Al octahedron or an Mg octahedra surrounded by one hydroxyl group (OH group) or six oxygen atoms is the minimum constituent unit.
  • a sheet of a hexagonal mesh may be used in which the Si tetrahedron shares one surface with another Si tetrahedron and the remaining apexes of oxygen atoms are directed in the same direction.
  • tetrahedral sheet an A1 octahedron or Mg octahedron shares a ridge with another octahedron to form a sheet (octahedral sheet), and the tetrahedral sheet and the octahedron And a sheet in which face sheets are laminated in layers.
  • a mineral having a structure in which the tetrahedral sheet and the octahedral sheet are stacked one by one, and a layer in which 1: 1 layer is further laminated, is a 1: 1 type mineral;
  • Two-to-one layer of two octahedral sheets sandwiched by one tetrahedral sheet and two or more layers of minerals are used as a 2: 1 type mineral;
  • Minerals with a structure sandwiched by octahedral sheets are called 2: 1: 1 type minerals.
  • an octahedral sheet has metal ions at all octahedral positions with Mg (OH).
  • Trioctahedral The thing called 3octahedral type (Trioctahedral), the octahedral sheet is Al (OH) and 1Z3 is vacant
  • the layered inorganic compound in the present invention is preferably a 2: 1 type mineral.
  • Examples of the element constituting the layered inorganic compound include lithium, sodium, lithium, magnesium, aluminum, silicon, oxygen, hydrogen, fluorine, carbon, and the like, and any one of them may be used. However, two or more types may be used. Although not particularly limited, examples of the specific examples include, for example, a compound represented by the following formula (1)-(9), and these compounds may include, for example, water of crystallization. These formulas are formulas as mineralogically or chemically pure compounds, but may actually contain impurities such as, for example, sodium silicate.
  • M is at least one selected from the group consisting of H, Li, Na, and K; X is at least one of ⁇ and F; It is a positive number.
  • M is at least one selected from the group consisting of H, Li, Na and K; X is at least one of ⁇ and F; It is a positive number.
  • M is at least one selected from the group consisting of H, Li, Na, and K;
  • X is at least one of ⁇ and F; It is a positive number.
  • M is at least one selected from the group consisting of H, Li, Na and K
  • X is at least one of ⁇ and F, and is less than 4. It is a positive number.
  • M is preferably at least one of Li and Na, more preferably Na
  • X is preferably at least one of OH and F, more preferably F.
  • M is preferably at least one of Li and Na, more preferably Li, and X is preferably at least one of OH and F, and more preferably F.
  • X preferably comprises halogen, NO, SO, CO and OH
  • Group power At least one of the selected at least one group and the auronic organic acid, more preferably CO, and X is a halogen, OH, NO or monovalent organic acid.
  • X is preferably at least one of OH and F, and is preferably Or OH.
  • X is preferably at least one of OH and F, preferably OH, is preferably a positive number less than 4, and is preferably a positive number less than 3.
  • the layered inorganic compound include, for example, 1: 1 type clay minerals such as kaolinite, halloysite, and serpentine; talc, neurophilite, smectite, and vermiculite (represented by the formula (2)).
  • 1 type clay minerals such as mica containing fluorinated tetracyanite mica (formula (5)) and tenyonite (formula (6));
  • 1 1 type clay minerals such as kaolinite, halloysite, and serpentine
  • talc neurophilite
  • smectite smectite
  • vermiculite represented by the formula (2).
  • 2: 1 type clay minerals such as mica containing fluorinated tetracy
  • Smectite includes, for example, montmorillonite (formula (1)), bentonite which is a natural product containing 40 to 80% of montmorillonite depending on the ion species in a tetrahedral or octahedral lattice subjected to isomorphous substitution, and piderite.
  • Dioctahedral type such as (formula (2)); hectorite (formula (3), preferably formula (8)), sabonite (formula (4), preferably formula (9)); Includes three octahedral types such as knight.
  • the talcite at the mouth is represented, for example, by the above formula (7). Specifically, for example, Mg
  • Al (OH) CO ⁇ 4 ⁇ ⁇ is a layered mineral represented by Mg (OH) (brucite: medium
  • MI indicates an exchangeable cation represented by a monovalent cation, for example, H +, Na +,
  • Montmorillonite (Montmori 1 loni te) M i S i 4 (Al 2 — x Mg x ) 0 (OH) 2 ⁇ nH 2 0 Piedelite (Beidellite) MI ; (Si 4 _ x Al x ) Al 20 ! (OH) 2 ⁇ nH 2 0 Hectorite MI Si 4 (Mg 3 — xLijO!
  • the average pore size of the layered inorganic compound is not particularly limited, but is preferably, for example, a particle size that can be uniformly dispersed in a solvent.
  • the layered inorganic compound is generally plate-shaped particles, and is in a dynamic equilibrium in which a plurality of particles repeatedly aggregate and cleave, so it is difficult to define the average particle size itself.
  • a method such as a light scattering method or observation using an electron microscope, it is preferably in the range of lnm—20 ⁇ m, more preferably lOnm—2 ⁇ m, when dispersed in water. Range.
  • pillars such as quaternary ammonium salts can be provided to adjust the interlayer distance, interlayer charge and polarity in advance.
  • a 2: 1 type clay mineral is more preferred, and a swellable clay mineral having ion exchange ability is particularly preferred.
  • swellable clay minerals more preferred are bentonite, smectite, vermiculite, synthetic fluoromica, and particularly preferred are synthetic smectites such as synthetic hectorite and synthetic savonite; represented by synthetic fluoromica.
  • These layered inorganic compounds may be used alone or in combination of two or more.
  • a layered inorganic compound for example, commercially available products can be used, and trade names Lucentite SWN, trade name Lucentite SWF (synthetic hectorite), trade name ME (fluorine mica) manufactured by Corp Chemical Co., Ltd. ), A product name of Smecton SA (manufactured by Kunimine Industries Co., Ltd.) G), Kyowa Chemical Industry Co., Ltd.
  • an amphoteric surfactant is more preferable than, for example, an amphoteric surfactant having a positive charge and a negative charge in the same molecule.
  • an amphoteric surfactant having a positive charge and a negative charge in the same molecule and separating the positive charge and the negative charge for example, carboxybetaine , Sulfobetaine and phosphobetaine.
  • carboxybetaine alkyldimethylaminoacetic acid betaine and the like
  • sulfobetaine CHAPS, CHAPSO, alkylhydroxysulfobetaine and the like
  • sulfobetaine is preferable
  • CHAPS and CHAPSO are more preferable
  • CHAPS is particularly preferable.
  • the buffer is preferably an amine buffer, for example, Tris, ACES, CHES, CAPSO, TAPS, CAPS, Bis-Tris, TAPSO, TES, Tricine and AD A And the like, preferably ACES and Tris, and more preferably ACES. These substances may be used alone or in combination of two or more.
  • a buffer having a carboxyl group is also preferable.
  • Examples of the combination of the amine buffer and the surfactant include Tris and C HAPS, ACES and CHAPS, and combinations of ACES and CHAPSO, and more preferably CHAPS and ACES.
  • Examples of the combination of the buffer having a carboxyl group and the surfactant include, for example, sodium succinate acetate and CHAPS or CHAPSO, malonic acid acetate sodium and CHAPS, malic acid acetate sodium and CHAPS or CHAPSO, and acetate acetate. Examples include Na and CHAPS, and a combination of Na succinate acetate and CHAPS is preferable.
  • the mediator for example, a mediator that becomes a reduced form by a reaction between an oxidoreductase and an object to be measured as described later, is electrochemically oxidized, and can be detected by an oxidation current is preferable.
  • magus Conventionally known magus can be used.
  • ferricyanidai potassium, fuecsen, osmium complex, ruthenium complex, NAD +, NADP + and the like can be used.
  • the inorganic gel layer is preferably formed by applying a dispersion containing at least a mediator, a surfactant, a buffer, and a layered inorganic compound.
  • a layer containing an oxidoreductase is formed on the inorganic gel layer. It may be formed and used as a reagent layer of a laminate, or the dispersion may further contain an oxidoreductase, and an inorganic gel layer containing the oxidoreductase may be formed on the electrode surface to form a single reagent layer. Is also good.
  • a single reagent layer is formed as described above, it is not necessary to separately form a layer containing an oxidoreductase and a layer containing a mediator, so that the production is further simplified.
  • Such a biosensor is particularly preferable when an enzyme that does not require oxygen is used in an enzymatic reaction, such as glucose dehydrogenase (GDH).
  • GDH glucose dehydrogenase
  • the oxidoreductase is not particularly limited, for example, as long as it undergoes an oxidation-reduction reaction with the analyte in the sample and the mediator, and can be appropriately determined according to the type of the analyte.
  • glucose oxidase GOD
  • vilanose oxidase glucose dehydrogenase
  • GDH glucose dehydrogenase
  • lactate oxidase lactate dehydrogenase
  • fructose dehydrogenase galactose oxidase
  • cholesterol oxidase cholesterol monophosphate
  • anorecono reoxidase anorecono redehydrogenase
  • pyruvate oxidase glucose 6-phosphate dehydrogenase, amino acid dehydrogenase, formate dehydrogenase, glycerono redehydrogenase, asinole Co
  • a oxidase choline oxidase, 4-hydroxybenzoate Acid hydroxylase, maleate dehydrogenase, sarcosine oxidase, pericase and the like.
  • Combinations of the acid reductase and the mediator are not particularly limited !, but, for example, GOD and potassium ferricyanide, GDH and ruthenium complex, cholesterol dehydrogenase and Hue sen, alcohol dehydrogenase and copper There are various combinations of complexes.
  • FIGS. 1A to 1F are perspective views showing a series of steps for manufacturing a biosensor.
  • FIG. 2 is a cross-sectional view in the II direction of the biosensor shown in FIG. 1 (F).
  • the same portions are denoted by the same reference numerals.
  • this biosensor 1 includes an electrode system including a substrate 11, a working electrode 12 having a lead portion 12a, and a counter electrode 13 having a lead portion 13a.
  • Insulating layer 14 An inorganic gel layer (antioxidant layer) containing a mediator, a layered inorganic compound and a surfactant, an enzyme reagent layer containing an oxidoreductase, a spacer having an opening, and a cover having a through hole; Have.
  • a detection unit 15 is provided on one end (right side in both figures) of the substrate 11, and the detection electrode 15 is provided with a working electrode 12 and a counter electrode 13. Are arranged in parallel in the width direction of the substrate 11.
  • One ends of the two electrodes are lead portions 12a and 13a (left sides in both figures), respectively, and these are arranged so that the other end of the detection unit 15 is perpendicular to the other ends (see FIG. )).
  • An insulating portion is provided between the working electrode 12 and the counter electrode 13.
  • an insulating layer 14 is laminated on the substrate 11 having such an electrode system except for the lead portions 12a and 13a and the detecting portion 15, as shown in FIG.
  • An inorganic gel layer 16 and an enzyme reagent layer 17 are stacked in this order on the detection section 15 where 14 is not stacked. Then, as shown in FIG.
  • a spacer 18 having an opening at a location corresponding to the detection unit 15 is disposed on the insulating layer 14. Further, a cover 19 having a through hole 20 at a part corresponding to the opening is disposed on the spacer 18 (FIG. 1 (F)).
  • the space part of the opening and the space part between the enzyme reagent layer 17 and the insulating layer 14 and the cover 19 becomes a sample supply part 21 having a cabillary structure.
  • the through holes 20 serve as air holes for inhaling the sample by capillary action.
  • the size of the biosensor 1 is not particularly limited and can be appropriately set depending on the amount of the supplied sample and the like.
  • the overall length is 5 to 50 mm
  • the overall width is 1 to 50 mm
  • the maximum thickness is 2000 to 500 ⁇ m. m, minimum thickness 50-500 ⁇ m.
  • length refers to the length in the longitudinal direction of the biosensor
  • width refers to the length in the width direction (hereinafter the same).
  • the size of the substrate 11 is, for example, 5 to 50 mm in length, 1 to 50 mm in width, and 1000 to 1000 in thickness.
  • the size of the insulating layer 14 is, for example, 5 to 50 mm in length, 1 to 50 mm in width, and 10 to 20 O / zm in thickness
  • the size of the detecting unit 15 is, for example, 0.1 to 1 in length.
  • the size of the inorganic gel layer 16 is, for example, 0.1 to 10 mm in length, 0.1 to 10 mm in width, and 0.001 to 500 m in thickness
  • the enzyme reagent layer is 10 mm in width and 0.1 to 10 mm in width.
  • the size of 17 is 0.1-10 mm in length, 0.1-10 mm in width, and 0.001-500 m in thickness.
  • the size of the spacer is, for example, 1 to 50 mm in length, 1 to 50 mm in width, and 10 to 1000 m in thickness, and its opening is, for example, 0.1 mm in length. — 10 mm, width 0.01 — 10 mm.
  • the size of the cover 19 is, for example, 5 to 50 mm in length, 1 to 50 mm in width, and 10 to 1000 m in thickness, and the through hole has a diameter of 0.1 to 10 mm, for example. .
  • the content of the layered inorganic compound in the inorganic gel layer 16 can be controlled by the type and the amount of the sample supplied, it can be appropriately determined according to the area and the like of the detecting section 15, for example, the detection unit 15 area lcm 2 per
  • the range is from 0.003 to 30 mg, preferably from 0.1 to 10 mg, more preferably from 0.3 to 13 mg.
  • the layered inorganic compound is smectite, for example, in the range of 0.003 to 30 mg, preferably in the range of 0.1 to 10 mg, more preferably in the range of 0.3 to 3 mg per 1 cm 2 of the area. It is. If the content is an area lcm 2 per 0.
  • the amount of the layered inorganic compound per area is related to the thickness of the inorganic gel layer 16, and as described above, the thickness of the layer is preferably in the range of 0.001 to 500 m.
  • the content of a surfactant (for example, an amphoteric surfactant) in the inorganic gel layer 16 can be appropriately determined, for example, according to the amount of the layered inorganic compound.
  • the range is from 0.1 mmol to 100 mmol, preferably from 0.5 mmol to 1 O mmol, and more preferably from 0.5 mmol to 1 mmol.
  • the content of the mediator in the inorganic gel layer 16 is determined by, for example, the type of a sample to be measured, the type of an object to be measured, the amount of acid ligase in the enzyme reagent layer described below, and the like.
  • the inorganic gel layer 16 may further contain a buffer.
  • the content of the buffer in the inorganic gel layer 16 can be appropriately determined, for example, in accordance with the amount of the layered inorganic compound.
  • the buffer is, for example, 0.1 mmol to 100 mmol. It is more preferably in the range of lmmol-50mmol, particularly preferably in the range of lOmmol-20mmol.
  • the content of the acid-reducing enzyme in the enzyme reagent layer 17 is not particularly limited, and the content of the sample is It can be appropriately determined according to the type and amount thereof, the type and amount of the measurement object, and the like. Specifically, it is in the range of, for example, 0.1 U-100 KU, preferably in the range of 1 U-10 KU, and more preferably in the range of 1 U-100 U, per 1 cm 2 of the area of the detection unit 15.
  • the ratio of the amount of the enzyme in the enzyme reagent layer 17 to the mediator in the inorganic gel layer 16 is, for example, in the range of 0.01-1M, preferably 0.01-1M, per 1000U of the enzyme. It is in the range of 5M, more preferably in the range of 50 mM-200 mM.
  • Such a biosensor can be produced, for example, as follows.
  • a substrate 11 for forming an electrode system is prepared.
  • the material of the substrate 11 is preferably an electrically insulating material, for example, plastic, glass, paper, ceramics, rubber, and the like.
  • the plastic include polyethylene terephthalate (PET), polystyrene (PS), polymethacrylate (PMMA), polypropylene (PP), acrylate resin, and glass epoxy.
  • an electrode system including a working electrode 12 having a lead portion 12a and a counter electrode 13 having a lead portion 13a is formed on a substrate 11.
  • the electrode can be formed by a known method such as screen printing, a coating method, and a vapor deposition method, depending on the type of the electrode, such as a carbon electrode, a gold electrode, a noradium electrode, or a platinum electrode.
  • a carbon electrode for example, it can be formed by means of screen printing or coating of carbon ink on the substrate 11.
  • the gold electrode can be formed by, for example, a vapor deposition method, a plating method, a sputtering method, a gold foil sticking method, or the like.
  • the deposition method is, for example, by an ion plating method, vacuum 1. 33 X 10- 4 Pa, input power 300 W, rate 5 X 10- NMZ seconds, under conditions of time 2 minutes, for example, plastic such as P ET
  • gold is vapor-deposited on a sheet, and a kiss cut device is used to make a cut in the gold foil layer vapor-deposited on the sheet. As a result, the cut portion becomes an insulating portion, and an electrode system including a working electrode and a counter electrode can be formed.
  • an insulating layer 14 is formed on the substrate 11 on which the electrode systems 12 and 13 are formed.
  • This insulating layer is formed on the substrate 11 excluding the lead portions 12a and 13a of the electrodes (the left side in FIG. 1B) and the detection portion 15 for forming an inorganic gel layer described later.
  • the insulating layer 14 can be formed, for example, by printing an insulating paste obtained by dissolving an insulating resin in a solvent on the substrate 11, and subjecting this to a heat treatment or an ultraviolet treatment.
  • Examples of the insulating resin include polyester, butyral resin, and phenol resin.
  • Examples of the solvent include carbitol acetate and a dibasic acid ester-based mixed solvent (DBE solvent). And the like.
  • the concentration of the insulating resin in the paste is, for example, preferably in the range of 65 to 95% by weight, more preferably in the range of 75 to 90% by weight, and particularly preferably in the range of 80 to 85% by weight. is there.
  • the conditions of the heat treatment can be appropriately determined according to the type of the insulating resin used.
  • the insulating layer 14 can be formed by a method other than the printing method, such as coating, film bonding, and etching.
  • the inorganic gel layer 16 is formed on the substrate 11 and the electrodes 12 and 13 in the detection unit 15 where the insulating layer 14 is not formed.
  • the inorganic gel layer 16 can be formed, for example, by preparing a dispersion liquid containing a mediator and a surfactant and in which the layered inorganic compound is dispersed, dispensing the dispersion to the detection unit 15, and drying. .
  • the inorganic gel layer 16 does not necessarily need to be always in a gel state, but before use, it becomes a gel state when impregnated with a liquid sample or the like which may be dried in the drying step. Is preferred.
  • the solvent used for preparing the dispersion for example, water, buffer alcohol, N, N-dimethylformamide (DMF), dimethylsulfoxide (DMSO) and the like can be used, and among them, ultrapure is preferred. Water.
  • the concentration of the layered inorganic compound in the dispersion is, for example, in the range of 0.1 to 100 mg / mL, preferably in the range of 11 to 100 mgZmL, and more preferably in the range of 10 to 30 mgZmL. is there.
  • the concentration of the surfactant in the dispersion is, for example, in the range of 11 to 200 mM, preferably in the range of 11 to 100 mM, and more preferably in the range of 110 to 10 mM.
  • the addition ratio of the layered inorganic compound and the surfactant in the dispersion liquid is such that the surfactant force is, for example, 0.1 mmol-100 mmol per 300 mg of the layered inorganic compound. , Preferably in the range of 0.5 mmol-lOmmol, more preferably in the range of 0.5 mmol-lmmol.
  • the concentration of the mediator in the dispersion is, for example, in the range of 110 mM, preferably in the range of 100 to 800 mM, more preferably in the range of 200 to 500 mM, and particularly preferably. It is around 300mM.
  • the dispersion preferably further contains a buffer such as an amine-based buffer as described above.
  • a buffer such as an amine-based buffer as described above.
  • the concentration of the buffer is, for example, in the range of 110 mM, preferably 10 mM. —5 OOmM range, more preferably 50-200mM range.
  • the addition ratio of the buffer to the layered inorganic compound is 0.3 g of the layered inorganic compound, and the buffering agent power is, for example, 0.1 mmol to 100 mmol, preferably 1 mmol to 50 mmol, Particularly preferably, it is in the range of 10 mmol to 20 mmol.
  • the order of adding each of the components such as the mediator, the layered inorganic compound, and the surfactant to the solvent is not particularly limited. For example, first, after the layered inorganic compound is added to the solvent and sufficiently stirred, , Add a surfactant. It is preferable that the mediator is finally dissolved after the addition of the buffer. According to this order, although the mechanism is unknown, it is possible to form an inorganic gel layer that is more uniform and is prevented from contacting with oxygen.
  • the buffer may be added together with the surfactant. Particularly preferably, after the addition of the surfactant.
  • the method for preparing the dispersion is not particularly limited. For example, it is preferable to adjust the pH or select the type of buffer to be used according to the type of mediator to be used. The following is a specific example according to the type of mediator.
  • a layered inorganic compound such as smectite becomes transparent when dissolved in a solvent such as water.
  • the pH of the dispersion is highly alkaline (around pHIO). Meanwhile, neutral
  • the mediator enzyme or the like which is preferably used in the vicinity of a stable pH condition, that is, near neutrality.
  • inorganic gels may become cloudy or precipitate near neutrality. In this case, if the above-mentioned amine-based buffer is added as a buffer, the pH of the dispersion can be adjusted to around neutral, and the mechanism is unclear.
  • a mediator that does not cause precipitation can be added.
  • an inorganic gel layer that can sufficiently prevent reoxidation of the mediator can be reliably formed.
  • the present inventors have also found for the first time that adding a surfactant such as an amphoteric surfactant and then adding an amine-based buffer can sufficiently prevent cloudiness and precipitation of the prepared dispersion. That's all.
  • a surfactant such as an amphoteric surfactant
  • an amine-based buffer it is preferable to add a surfactant to a dispersion of the layered inorganic compound, and then add an amine-based buffer.
  • the pH of the dispersion after the addition of the amino-based buffer is, for example, in the range of 915, preferably 8-6, and more preferably 7.5-7.
  • mediators that are preferably used near neutrality include, for example, potassium potassium, cytochrome C, PQQ, NAD +, NADP +, and copper complexes.
  • a mediator that is preferably used in the vicinity of acidity When a mediator that is preferably used in the vicinity of acidity is used, the following preparation method is preferable. As described above, generally, when a layered inorganic compound (inorganic gel) is dissolved in a solvent, it becomes transparent, and the pH of the dispersion becomes strongly alkaline. In this case, in order to add a mediator that is preferably used in the vicinity of an acid, for example, an acid such as HC1 is added to the dispersion, the pH of the dispersion is adjusted to an acidic side, and the surfactant is added. It is preferable to add a buffer having a carboxyl group as described above, adjust the pH, and then add a mediator.
  • an acid such as HC1
  • Such a method is preferable for the following reason.
  • an inorganic layered conjugate such as smectite is added to an acid such as HC1 and the like under a strongly acidic condition (for example, around pH 2)
  • the dispersion once becomes cloudy and aggregates.
  • the present inventors have found that by continuing (for example, about 24 hours), the dispersion can be made transparent even on the acidic side.
  • the dispersion in this state does not contain a buffer serving as a binder as described above, so that the effect of the buffer cannot be obtained. If the acidity is strong, the enzyme may be deactivated.
  • the present inventors added a surfactant such as an amphoteric surfactant to a dispersion liquid that had been clarified in the vicinity of a strongly acidic solution, and then added a buffer having a carboxyl group to the dispersion.
  • a surfactant such as an amphoteric surfactant
  • a buffer having a carboxyl group to the dispersion.
  • the pH of the dispersion is preferably 13 to 13 and more preferably 1.5-2.
  • the acid to be used is not particularly limited, and examples thereof include hydrochloric acid, phosphoric acid, and acetic acid.
  • the conditions for stirring the dispersion under strong acid are not particularly limited, but the stirring time is, for example, 12 to 72 hours, preferably 18 to 48 hours, and particularly preferably 24 to 30 hours.
  • the pH of the dispersion is preferably set to 3 to 6, more preferably 4 to 5, and particularly preferably 4.5 to 4. 8
  • the mediator include ruthenium complex, osmium complex, phenocenene, phenazine methosulfate, indophenol, methylene blue and the like.
  • the solvent is temporarily kept, and the standing time is, for example, preferably 24 hours or more, more preferably 24 hours or more. Is more than 3 days.
  • the injection ratio of the dispersion into the detection unit 15 can be appropriately determined, for example, according to the size of the detection unit 15, the content of the layered inorganic compound in the dispersion, the type of the layered inorganic compound, and the like. Specifically, it is more preferable to inject the dispersion so as to be in the range of 0.003 to 30 mg per layer of the detection unit 15 (cm 2 ), for example, in the range of 0.003 to 30 mg. It is in the range of 1-lOmg, particularly preferably in the range of 0.3-3mg.
  • the concentration of the layered inorganic compound in the dispersion is 0.3% by weight, it is preferable to inject a range of 0.001 to 10 mL per cm 2 of the detection area. More preferably, it is in the range of 0.03 to 3.3 mL, particularly preferably in the range of 0.1 to 1 mL.
  • the method of injecting the dispersion into the detection unit 15 is not particularly limited. It can be performed using an automatic drive type dispenser or the like.
  • the means for drying the injected dispersion liquid is not particularly limited, and for example, a method such as natural drying, air drying, reduced-pressure drying, or freeze-drying may be employed. Further, these means may be combined.
  • the treatment temperature is preferably in the range of 10-60 ° C, more preferably in the range of 25-50 ° C, and particularly preferably in the range of 30-40 ° C.
  • the relative humidity RH is preferably in the range of 5 to 40%, more preferably in the range of 10 to 20%, and particularly preferably in the range of 10 to 15%.
  • the treatment time can be determined as appropriate depending on the drying means, for example, but is preferably in the range of 1 to 60 minutes, more preferably 5 to 30 minutes, and particularly preferably 5 to 10 minutes. Range.
  • an enzyme reagent layer 17 is formed on the inorganic gel layer 16.
  • the enzyme reagent layer 17 can be formed by preparing an enzyme solution containing the oxidoreductase, injecting the enzyme solution onto the inorganic gel layer 16, and drying the solution. Further, as the acid-reducing enzyme, for example, those described above can be used.
  • the enzyme solution can be prepared, for example, by sufficiently dissolving the enzyme in a solvent.
  • the solvent is not particularly limited, but for example, water, a buffer, an organic solvent such as ethanol, methanol, butanol, dimethylsulfoxide (DMSO), and tetrahydrofuran can be used.
  • the buffer include a phosphate buffer, a citrate buffer, an acetate buffer, a Tris-HCl buffer, a Good buffer, and the like.
  • the pH can be appropriately determined depending on the type of the enzyme. For example, a range of 5-10 is more preferable, a range of 6-9 is particularly preferable, and a range of 7-8 is particularly preferable.
  • the water include purified water, distilled water, ultrapure water and the like. Among them, ultrapure water is preferable since it has a very small amount of impurities and can produce a highly accurate biosensor.
  • the concentration of the reagent in the enzyme solution is not particularly limited, but is, for example, preferably in the range of 11 OKUZmL, more preferably in the range of 3-6KUZmL.
  • the enzyme solution preferably further contains a surfactant, particularly preferably an amphoteric surfactant.
  • a surfactant particularly preferably an amphoteric surfactant.
  • amphoteric surfactant for example, those described above can be used.
  • this enzyme solution does not serve as a substrate for oxidoreductase! / And amino acids and derivatives thereof, amine conjugates such as imidazole, betaine and the like.
  • the saccharide include sucrose, raffinose, ratatitol, ribitol, arabitol and the like.
  • the saccharides are used, for example, for improving the stability of enzymes
  • the amino acids, derivatives thereof, and betaines are used, for example, for preventing solidification due to drying of reagents
  • imidazole is used for, for example, stabilizing mediators. It can be added.
  • the amount of the enzyme solution to be injected can be appropriately determined depending on the size of the enzyme reagent layer 17 to be formed, the concentration of the reagent, the amount of the sample, the type of the object to be measured, and the like.
  • the means for drying the injected enzyme solution is not particularly limited. For example, methods such as natural drying, air drying, reduced-pressure drying, and freeze-drying may be employed, and these methods may be combined.
  • the drying conditions include, for example, a temperature range of 10 to 60 ° C, a relative humidity of RH 5 to 40%, and a time period of 1 to 60 minutes.
  • the temperature should be appropriately set according to the type of the enzyme so as not to deactivate the enzyme.
  • a spacer 18 is disposed on the insulating layer 14. As shown, the spacer 18 has an opening at a position corresponding to the enzyme reagent layer 17.
  • a material of the spacer 18 for example, a resin film or a tape can be used.
  • a cover 19 described later can be easily bonded not only by bonding with the insulating film 14.
  • a spacer may be formed by, for example, resist printing.
  • a cover 19 is arranged on the spacer 17.
  • the material of the cover 19 is not particularly limited. For example, various plastics and the like can be used, and a transparent resin such as PET is preferable.
  • the Noosensor 1 thus manufactured is stored for a long period of time, it is preferable to hermetically store it together with a desiccant such as molecular sieve, silica gel, calcium oxide, etc., in order to prevent the influence of moisture.
  • a desiccant such as molecular sieve, silica gel, calcium oxide, etc.
  • the biosensor 1 includes, for example, means for applying a predetermined voltage for a certain period of time, means for measuring an electric signal transmitted from the biosensor, and arithmetic means for calculating the electric signal into the concentration of a measurement object. It can be used in combination with measuring equipment equipped with various means such as Wear.
  • the method of using the biosensor 1 will be described using an example in which the sample is whole blood, the measurement target is glucose, the oxidative reductase is GDH, and the mediator is ferricyanidari potassium.
  • a whole blood sample is brought into contact with one end of the opening 21 of the biosensor 1.
  • the opening 21 has a cavity structure, and the cover 19 corresponding to the other end is provided with an air hole 20, so that the sample is sucked into the inside by capillary action.
  • the aspirated sample penetrates into the enzyme reagent layer 17 provided on the detection unit 15, dissolves GDH in the enzyme reagent layer 17, and furthermore, the inorganic gel layer 16 below the enzyme reagent layer 17 Reach the surface.
  • glucose in the sample reaching the surface, GDH, and potassium ferricyanide in the inorganic gel layer 16 react. Specifically, glucose, which is a measurement target, is oxidized by GDH, and the electrons transferred by the oxidization reaction reduce ferricyanide potassium, thereby producing potassium ferrosyanide (ferrosyan ion).
  • the force of the sample passing through the enzyme reagent layer 17 and reaching the inorganic gel layer 16 does not reach the electrode surface through the inorganic gel layer 16. For this reason, it is considered that the reduced potassium ferrocyanide can be prevented from being reoxidized by the dissolved oxygen in the sample, thereby suppressing a decrease in measurement accuracy. It has been confirmed by an electron microscope that moisture has not reached the electrode surface. Further, since impurities such as red blood cells contained in the sample cannot pass between the layered inorganic compounds, adsorption on the surfaces of the electrodes 12 and 13 without passing through the inorganic gel layer 16 is also prevented. You.
  • the biosensor of the present invention is applied to glucose measurement.
  • the present invention is not limited to this. It can be a biosensor for the subject.
  • ratate oxidase can be used for a biosensor for measuring lactic acid
  • alcohol oxidase can be used for a biosensor for measuring alcohol
  • cholesterol oxidase can be used for a sensor for measuring cholesterol.
  • vilanose oxidase or glucose oxidase can also be used as a reagent.
  • an oxidoreductase is further added to a dispersion in which the above-mentioned layered inorganic compound or the like is dispersed. And a single layer also serving as an inorganic gel layer.
  • the amount of the acid-reducing enzyme in the dispersion is not particularly limited, and for example, the above-mentioned amount can be referred to.
  • a glucose sensor having the same structure as that of Fig. 1 (F) was produced as described below.
  • a PET substrate (50 mm long, 6 mm wide, 250 m thick) was prepared as the insulating substrate 11 of the glucose sensor, and one surface thereof was screen printed to have a lead portion.
  • a carbon electrode system consisting of the pole 12 and the counter electrode 13 was formed.
  • the insulating layer 14 was formed on the electrode as described below.
  • an insulating resin polyester was dissolved in a solvent carbitol acetate to a concentration of 75% by weight to prepare an insulating paste, which was screen-printed on the electrode.
  • the printing conditions were a 300 mesh screen, a squeegee pressure of 40 kg, and the amount of printing was 0.002 mL per 1 cm 2 of electrode area. Screen printing was not performed on the detection unit 15 and the lead units 12a and 13a. Then, heat treatment was performed at 90 ° C. for 60 minutes to form the insulating layer 14. Subsequently, an inorganic gel layer 16 was formed on the detection unit 15 where the insulating layer 14 was not formed as described below.
  • This mixed solution is used as an inorganic gel layer forming solution (PH 7.5).
  • the final concentration of the composition in the inorganic gel forming liquid is shown below.
  • the inorganic gel-forming solution 1. O / zL was dispensed to the detection unit 15. The surface area of the detection unit 15 was about 0.1 cm 2 , and the surface area of the electrodes 12 and 13 in the detection unit 15 was about 0.12 cm 2 . Then, this was dried at 30 ° C. and a relative humidity of 10% for 10 minutes to form an inorganic gel layer 16.
  • an enzyme reagent layer 17 was formed on the inorganic gel layer 16. This was formed by dispensing 1.0 L of 5000 UZ mL GDH aqueous solution on the inorganic gel layer 16 of the detection unit 15 and drying it at 30 ° C. and 10% relative humidity for 10 minutes.
  • a spacer 18 having an opening is disposed on the insulating layer 14, and a cover 19 having a through-hole 20 serving as an air hole is disposed on the spacer 18 to form a biosensor 1 was prepared. Since the space of the opening of the spacer 18 sandwiched between the cover 19 and the insulating layer 14 has a cabillary structure, this was used as a sample supply unit 21.
  • Example 2 As Comparative Example 1, a glucose sensor was produced in the same manner as in Example 1, except that purified water was used instead of the synthetic smectite suspension in the preparation of the inorganic gel layer forming liquid. .
  • Example 2
  • Example 2 As a liquid sample, human whole blood was used. First, the whole blood after blood collection was allowed to stand at 37 ° C for about 1 day to adjust the glucose concentration to OmgZlOOmL. Next, glucose was added to the mixture to prepare samples with various glucose concentrations (about 200, 400, and 600 mg / 100 mL). In addition, the whole blood of glucose-free pulp was made glucose concentration OmgZlOOmL. Then, as Example 2, after applying a voltage of 200 mV to the glucose sensor 1, the sample was spotted on the sample supply unit 21, and the time course of the response current 5 seconds after the spotting was measured. As Comparative Example 2, the glucose sensor of Comparative Example 1 was similarly measured.
  • FIG. 3 is a graph showing the change over time in the current value when the sample was measured with the glucose sensor.
  • FIG. 3 (A) shows the results of Example 2 and
  • FIG. B shows the results of Comparative Example 2, respectively.
  • the peak of the response current value is earlier than that of the glucose sensor of Comparative Example 1 shown in FIG. And a high peak current value was obtained.
  • a high peak current value was obtained because oxygen was cut off in the inorganic gel layer, so that the mediator oxygen reduced by the reaction of glucose and GDH caused oxygen. It is considered to be a force that could be electrochemically oxidized without being re-oxidized and whose oxidation current could be measured.
  • the peak of the current value appeared earlier because the mediator [Ru (NH)] C1 was embedded in the smectite sheet in the inorganic gel layer on the electrode and was strong.
  • the mediator Since the mediator is loosely fixed to the surface of the electrode via smectite, the mediator is loosely fixed, and as the concentration of the mediator near the electrode increases, the reaction speed is increased.
  • Comparative Example 3 showed a significant change in the CV value to 7.30, especially when the glucose concentration in the sample was increased to 824 mgZl00 mL, whereas Example 3 According to this, it is understood that the CV value is stable between 2.34 and 3.02 and can be measured with good reproducibility regardless of the increase in the glucose concentration. From these results, according to the glucose sensor of the example, it is higher than the biosensor of the comparative example without smectite! It can be said that measurement can be performed with reproducibility.
  • Example 4 After the glucose sensor was exposed to the room maintained at 80% relative humidity and a temperature of 40 ° C for 17 hours, a voltage of 200 mV was applied between the electrodes. Then, a human whole blood sample added with glucose so as to have a glucose concentration of 0, 600 mgZl00 mL was spotted, and spotted for 5 seconds. Later response current values were measured. This is Example 4.
  • Comparative Example 4 measurement was similarly performed for the glucose sensor of Comparative Example 1 described above. As a control of Example 4 and Comparative Example 4, using the glucose sensor, the response current value of the sample under the normal room temperature and humidity (about 25 ° C., about 60% Rh) was used. It was measured. Then, the sensitivity (%) of Example 4 and Comparative Example 4 when the current value of the control was 100% was determined. Table 3 below shows the results.
  • the inorganic gel layer blocks, for example, moisture in the air and dissolved oxygen in the sample, and can prevent the mediator from coming into contact with oxygen. It is resistant to
  • Glucose was added to human whole blood to prepare a sample so that the glucose concentration was 11 lmgZlOOmL. Further, the dissolved oxygen was around 25.ImmHg (unadjusted), 92.OmmHg, and 171. Each was adjusted to be around 6 mmHg. The dissolved oxygen concentration was adjusted to a high concentration (92. OmmHg, 171.6 mmHg) by mixing the above sample without dissolved oxygen (25. ImmHg) with oxygen in a test tube.
  • the smectite concentration (Lucentite SWN) in the inorganic gel layer forming solution was 0.12%, 0.24%, 0.36%, 0.48% (w / v). Except for the above, four types of glucose sensors were produced in the same manner as in the above-mentioned row f. And the glucose sensor After applying a voltage of 200 mV between the electrodes, the sample was spotted, and the response current value was measured 5 seconds after spotting. For each of these glucose sensors, the response of each sample (dissolved oxygen: 92. OmmHg, 171.6 mmHg) was calculated from the following equation (10) with reference to the response current value for the sample whose dissolved oxygen was not adjusted (25. lm mHg).
  • Fig. 4 is a graph showing the relationship between the concentration of dissolved oxygen in the sample and the rate of change (%). It is.
  • the change rate (%) indicates that the response current changes as the absolute value increases.
  • Rate of change (%) [(A / B) -l] X 100 (10)
  • the inorganic gel layer forming liquid a dispersion prepared so as to have the following final concentration was used.
  • As the enzyme solution a 1200 UZmL GOD solution (manufactured by Amano) was used instead of the GDH aqueous solution.
  • Ru (NH)] C1 instead of Felician-Dai potassium (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)
  • a glucose sensor was prepared in the same manner as in Example 1 except that a Tris-HC1 buffer (pH 7.4, manufactured by Dojin-Danigaku Kenkyusho) was used instead of the S buffer.
  • a Tris-HC1 buffer pH 7.4, manufactured by Dojin-Danigaku Kenkyusho
  • Glucose was added to human whole blood to prepare a sample so that the glucose concentration became 600 mgZl00 mL, and the dissolved oxygen was further reduced to 48.9 mmHg (unadjusted), 106.4 mmHg, and 188.4 mmHg. Each was adjusted to become.
  • the dissolved oxygen concentration was adjusted to a high concentration by mixing the sample without dissolved oxygen adjustment with oxygen in a test tube.
  • Glucose was added to human whole blood to prepare a sample having a glucose concentration of 600mgZl00mL. Then, a voltage of 500 mV was applied between the electrodes of the glucose sensor, and the response current value was measured 5 seconds after the sample was spotted. The glucose sensor of Comparative Example 6 was similarly measured. Then, for Example 6 and Comparative Example 6, in the same manner as in Example 5, based on the response current value with respect to the sample of which dissolved oxygen was not adjusted (48.9 mmHg), each sample ( The change rate (%) of the response current value with respect to dissolved oxygen of 106.4 mmHg and 180.4 mmHg) was determined. These results are shown in FIG. FIG. 5 is a graph showing the relationship between the concentration of dissolved oxygen in the sample and the rate of change (%). In FIG. 5, ⁇ indicates the results of Example 6 and indicates the results of Comparative Example 6.
  • Example 7 the DALCose sensor prepared in Example 1 using CHAPS (amphoteric surfactant) as a surfactant and ACES buffer as an amine-based buffer was used.
  • Comparative Example 7 was performed in the same manner as in the above-described Example except that cholic acid (an ionic surfactant) was used instead of CHAPS as a surfactant, and sodium phosphate was used instead of ACES as a buffer.
  • a glucose sensor was prepared and used in the same manner as in 1.
  • Glucose was added to human whole blood to prepare a sample having a glucose concentration of lOOmgZlOOmL, and the dissolved oxygen was 34.7 mmHg (unadjusted), 117.lmmHg, and 185.3 mmHg. Each was adjusted to be around g.
  • the dissolved oxygen concentration was adjusted to a high concentration by mixing the dissolved oxygen-free sample with oxygen in a test tube.
  • FIG. 6 is a graph showing the relationship between the concentration of dissolved oxygen in the sample and the rate of change (%).
  • ⁇ indicates the result of Example 7 and ⁇ indicates the result of Comparative Example 7.
  • a biosensor was produced in the same manner as in Example 1 except that an inorganic gel-forming liquid was prepared by the method described below.
  • this suspension was mixed with 200 mM Na succinate acetate buffer (pH 4.5) so as to be 1: 1.
  • the suspension after mixing this buffer had a pH of about 4.5.
  • the above-mentioned suspension containing the buffer was further used as a mediator.
  • [Ru (NH)] C1 manufactured by Aldrich
  • the final concentration of the composition in this inorganic gel forming liquid is shown below.
  • a reduced mediator for indirectly measuring a measurement target in a sample includes oxygen in the measurement atmosphere and oxygen in the sample. Since reoxidation by dissolved oxygen or the like can be prevented, a measurement error due to reoxidation of the reduced mediator can be eliminated, and a Noo sensor excellent in measurement accuracy can be provided.

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
  • Silicates, Zeolites, And Molecular Sieves (AREA)

Abstract

　メディエータに対する酸素の影響を回避し、かつ試料溶液中の測定対象物を、迅速かつ簡便に、高精度で測定できるバイオセンサを提供する。電極を有する基板を準備し、前記電極表面に、メディエータと界面活性剤と緩衝剤と層状無機化合物とを含有する溶媒を塗布して、前記メディエータの自然酸化を防止する無機ゲル層を形成し、さらに、前記層上に、酸化還元酵素を含む酵素試薬層を形成してバイオセンサを製造できる。このバイオセンサは、前記無機ゲル層によって、測定対象物と酸化還元酵素との反応によって還元されたメディエータが、溶存酸素等により再酸化されることなく、電気化学的に測定される。                                                                                 

Description

明 細 書
バイオセンサおよびその製造方法
技術分野
[0001] 本発明は、試料中の測定対象物を電気化学的に測定するバイオセンサに関する c 背景技術
[0002] 従来、特定の測定対象物を含む試料液について、例えば、試料液の希釈や攪拌 等を行わずに、簡便かつ迅速に前記測定対象物を定量できるバイオセンサが広く使 用されている。このようなバイオセンサは、例えば、電気絶縁性の基板上に、スクリー ン印刷等の方法によって作用極 (測定極ともいう）と対極とを有する電極系を形成し、 その上に、前記測定対象物と反応する酸化還元酵素およびメディエータ (電子伝達 物質)等を含む試薬層を形成することにより作製できる (例えば、特許文献 1参照)。こ の試薬層に、前記測定対象物を含む試料液を接触させると、前記酸化還元酵素の 触媒作用によって、例えば、前記測定対象物が酸化され、前記メディエータが還元さ れる。この還元されたメディエータ（以下、「還元型メディエータ」という）を、前記電極 系を用いた電気化学的手法により再酸化し、これにより得られた酸化電流値から前 記試料液中の測定対象物の濃度が算出できる。
[0003] しかしながら、反応雰囲気中に酸素が存在したり、試料液中に溶存酸素が存在す る場合、前記還元型メディエータは、前述のように電気化学的に再酸ィ匕されるだけで なぐ前記酸素によっても再酸ィ匕されてしまう。このため、電気化学的な再酸化による 酸ィ匕電流値に誤差が生じ、測定精度が低下するという問題があった。
[0004] このような問題を回避する方法として、例えば、窒素雰囲気下での測定等が考えら れるが、これでは手間が力かり操作も煩雑となる。また、全く酸素が無い条件下では、 酵素反応に酸素を必要とする酸ィ匕還元酵素を使用することができないという問題もあ り、適用範囲が非常に狭くなる。
特許文献 1 :特開平 1 -291153号公報
発明の開示
発明が解決しょうとする課題 [0005] そこで、本発明の目的は、メディエータに対する酸素の影響を回避し、かつ試料液 中の測定対象物を、迅速かつ簡便に、高精度で測定できるバイオセンサの提供であ る。
課題を解決するための手段
[0006] 前記目的を達成するために、本発明のバイオセンサの製造方法は、電極を有する 基板を準備し、前記電極表面に、少なくともメディエータと界面活性剤と緩衝剤と層 状無機化合物とを含有する無機ゲル層を形成する工程を含む製造方法である。
[0007] また、本発明のバイオセンサは、前記本発明の製造方法により製造したバイオセン サである。
発明の効果
[0008] 本発明者らは、ノィォセンサについて、試料中の測定対象物と酸化還元酵素との 反応によって還元されたメディエータ (還元型メディエータ）が自然酸化されることを 防止すベぐ鋭意研究を行った。その結果、一般に、例えば、層状無機化合物によつ て無機ゲル層が形成されることは知られている力 無機ゲル層がさらに界面活性剤 および緩衝剤を含有することによって、前記還元型メディエータの自然酸化を防止す る効果を発揮する無機ゲル層を形成できることを見出した。このような方法によって、 前記自然酸ィ匕防止の効果が得られることは、本発明者らが初めて見出した事である 。前述のような方法で無機ゲル層を形成すれば、試料中の測定対象物を間接的に 測定するための前記還元型メディエータが、例えば、測定雰囲気中の酸素や試料中 の溶存酸素等によって再酸ィ匕されることを防止できる。このため、前記還元型メディ エータの再酸ィ匕による測定誤差が解消された、測定精度に優れるバイオセンサを提 供できる。なお、本発明において、「前記メディエータの自然酸化」とは、例えば、ノ ィ ォセンサの使用時における液体試料中の溶存酸素や、空気中の水分に吸収された 酸素（例えば、保存時に空気中水分が空気中酸素を吸収する）によって、前記メディ エータが酸ィ匕されることを ヽぅ。
[0009] 界面活性剤および緩衝剤存在下で無機ゲル層を形成することによって、酸化防止 機能が発揮されるのは、おそらく以下に示すメカニズムによると推測される。
[0010] 例えば、前記メディエータと界面活性剤と緩衝剤と層状無機化合物とを含有する分 散液を塗布して形成された前記無機ゲル層内にお ヽては、前記メディエータが前記 層状無機化合物のシート内にしつ力りとはまり込んだ複合体を形成し、前記メデイエ ータが液体試料等に含まれる溶存酸素と接触するのを防止していると考えられる。通 常、試料液中には酸素が溶存しているため、前述のように層状無機化合物が水をシ ャットアウトすることにより、前記メディエータに対する前記溶存酸素の攻撃を防止で きるのである。そして、前述のようにさらに界面活性剤が存在することによって、層状 無機化合物とメディエータとが重合して不溶化することなぐこれらの複合体が分散さ れた状態となり、前記効果を十分に発揮できる無機ゲル層を形成できるのである。
[0011] また、前記分散液が緩衝剤を含むことによって、均一な無機ゲル層の形成が可能 になり、酸ィ匕防止機能をより一層向上することができるのである。これは、前記緩衝剤 力 前記メディエータと層状無機化合物との複合体を形成する際にバインダーとして 作用するためと考えられる。このノインダ一としての作用によって、メディエータと層状 無機化合物との結合がより一層強固となった複合体が形成されるため、例えば、溶存 酸素を含む液体をさらにシャットアウトでき、酸素によるメディエータの再酸ィ匕が防止 できる。一方、この場合、前記界面活性剤は、前記緩衝剤と、層状無機化合物およ びメディエータとが、重合体を形成して分散不可能になることを防止する、いわゆるブ ロック剤としての機能も果たすと考えられる。
[0012] 本発明のバイオセンサは、前述のような方法で製造することによって、例えば、メデ イエータが、測定雰囲気中の酸素や試料中の溶存酸素等によって再酸化されること を防止できる。このため本発明のバイオセンサは、前記還元型メディエータの再酸ィ匕 による測定誤差が解消され、測定精度に優れる。
[0013] 本発明の製造方法によって得られるバイオセンサは、酸化還元酵素からメディエー タへの電子の授受は、水ではなぐ前記層状無機化合物の層間、つまり電気二重層 を介して行われると考えられる。このため、水分が前記無機ゲル層によってシャットァ ゥトされる本発明のバイオセンサによれば、例えば、高湿度環境等においても劣化を 防止できるという効果を奏するのである。また、前記層状無機化合物の電気二重層 は、水よりも電子を通し易いため、反応速度の増大にもつながると考えられる。
[0014] また、本発明の製造方法によるバイオセンサは、上述のような酸素の遮断によって 、例えば、酸ィ匕による電極の鲭の発生等も防止できる。
[0015] なお、本発明において、前記メディエータの自然酸ィ匕を防止する無機ゲル層を、「 酸化防止層」ともいう。
図面の簡単な説明
[0016] [図 1]図 1は、本発明の実施形態において、バイオセンサの製造方法の一例を示す 工程図であり、 (A)一 (F)は、それぞれ、各工程を示す。
[図 2]図 2は、前記実施形態におけるバイオセンサの断面図である。
[図 3]図 3は、本発明の実施例において、グルコースセンサで試料を測定した場合の 電流値の経時変化を示すグラフであって、同図 (A)が実施例、同図（B)が比較例の 結果をそれぞれ示す。
[図 4]図 4は、本発明のその他の実施例において、試料中における溶存酸素濃度と 変化率 (％)との関係を示すグラフである。
[図 5]図 5は、本発明のさらにその他の実施例において、試料中における溶存酸素濃 度と変化率 (％)との関係を示すグラフである。
[図 6]図 6は、本発明のさらにその他の実施例において、試料中における溶存酸素濃 度と変化率 (％)との関係を示すグラフである。
発明を実施するための最良の形態
[0017] 本発明において、前記層状無機化合物は、層状粘土鉱物であることが好ましぐ特 に好ましくは膨潤性粘土鉱物である。
[0018] 前記層状無機化合物とは、例えば、無機物の多面体が平面状に連なってシート構 造を形成し、このシート構造がさらに層状に重なって結晶構造を形成したものというこ とができる。前記多面体の形状としては、例えば、四面体シート、八面体シート等があ り、具体的には、例えば、 Si四面体、 A1八面体等があげられる。このような層状無機 化合物としては、例えば、層状粘土鉱物、ノ、イド口タルサイト、スメクタイト、ハロイサイ ト、カオリン鉱物、雲母等が含まれる。
[0019] 前記層状粘土鉱物とは、一般に、粘土 (細かい土状の無機粒状物で、水で湿った 状態において可塑性を示すもの）の大半を占めるアルミニウムケィ酸塩鉱物があげら れ、これは、通常、 Siが 4つの酸素原子（O)に囲まれた Si四面体と、 A1または Mgが 6 つの水酸基（OH基）あるいは 6つの酸素原子に囲まれた Al八面体または Mg八面体 とを最小構成単位として 、る。
[0020] 前記層状粘土鉱物の構造としては、例えば、前記 Si四面体が他の Si四面体と 1つ の面を共有して、残る頂点の酸素原子を同方向に向けて六角網状のシートを形成し (以下「四面体シート」という）、一方、 A1八面体または Mg八面体が他の八面体と稜 角を共有してシートを形成し (八面体シート）、前記四面体シートと前記八面体シート とが層状に積層された構造があげられる。具体的には、例えば、前記四面体シートと 前記八面体シートとが 1枚ずつ重なった 1： 1層が、さらに何層も積層された構造の鉱 物を 1： 1型鉱物； 2枚の四面体シートで 1枚の八面体シートを挟んだ 2： 1層が、さらに 何枚も積層された構造の鉱物を 2 : 1型鉱物；前記 2 : 1層の層間に、さらにもう一枚の 八面体シートが挟まれた構造の鉱物を 2 : 1： 1型鉱物と、それぞれ呼ばれている。ま た、例えば、八面体シートが、 Mg (OH)で全ての八面体位置に金属イオンを有する
2
ものを 3八面体型（Trioctahedral)といい、八面体シートが、 Al(OH)で 1Z3が空孔
3
になっているものを 2八面体型（Dioctahedral)という。この中でも、本発明における前 記層状無機化合物としては、 2 : 1型鉱物が好ましい。
[0021] 前記層状無機化合物を構成する元素としては、例えば、リチウム、ナトリウム、力リウ ム、マグネシウム、アルミニウム、ケィ素、酸素、水素、フッ素、炭素等があげられ、い ずれか一種類でもよいし、二種類以上で構成されてもよい。特に制限されないが、具 体例として、例えば、下記式（1)一（9)に示すィ匕合物等があげられ、これらの化合物 は、例えば、結晶水を含んでもよい。これらの下記式は、鉱物学的または化学的に純 粋な化合物としての式であるが、実際には、例えば、ケィ酸ナトリウムなどの不純物を 含む場合がある。このため、元素分析等によって化学式を定めた場合、これらの式と 必ずしも一致しないことは、例えば、文献（D. W, Thompson, J. T. Butterworth, J. Colloid Interf. Sci., 151, 236- 243(1992))等においても記載されている。
[0022] M Si (Al Mg ) 0 X · · · (1)
x 4 2-x x 10 2
前記式（1)において、好ましくは、 Mは、 H、 Li、 Naおよび Kからなる群から選択され た少なくとも一つであって、 Xは ΟΗおよび Fの少なくとも一方であって、 は 2未満の 正数である。 [0023] M (Si A1 )A1 O X · · · (2)
x 4-x x 12 10 2
前記式（2)において、好ましくは、 Mは、 H、 Li、 Naおよび Kからなる群から選択され た少なくとも一つであって、 Xは ΟΗおよび Fの少なくとも一方であって、 は 4未満の 正数である。
[0024] M Si (Mg Li ) 0 X …（3)
x 4 3-x x 10 2
前記式（3)において、好ましくは、 Mは、 H、 Li、 Naおよび Kからなる群から選択され た少なくとも一つであって、 Xは ΟΗおよび Fの少なくとも一方であって、 は 3未満の 正数である。
[0025] M (Si Al ) Mg O X · · · (4)
x 4-x x 3 10 2
前記式 (4)において、好ましくは、 Mは、 H、 Li、 Naおよび Kからなる群から選択され た少なくとも一つであって、 Xは ΟΗおよび Fの少なくとも一方であって、 は 4未満の 正数である。
[0026] MSi Mg O X …（5)
4 2.5 10 2
前記式（5)において、 Mは、好ましくは Liおよび Naの少なくとも一方であり、より好ま しくは Naであり、 Xは、好ましくは OHおよび Fの少なくとも一方であり、より好ましくは Fである。
[0027] M Si Mg O X · · · (6)
2 4 2 10 2
前記式（6)において、 Mは、好ましくは Liおよび Naの少なくとも一方であり、より好ま しくは Liであり、 Xは、好ましくは OHおよび Fの少なくとも一方であり、より好ましくは F である。
[0028] Mg Al (OH) X · · · (7)
6 12 16 x
前記式（7)において、 Xは、好ましくはハロゲン、 NO、 SO、 COおよび OHからなる
3 4 3
群力 選択された少なくとも一つの基およびァ-オン型有機酸の少なくとも一方であ つて、より好ましくは COであり、 は、 Xがハロゲン、 OH、 NOまたは一価有機酸のと
3 3
き、好ましくは 2であって、 Xが SO、 COまたは二価の有機酸のとき、好ましくは 1で
4 3
める。
[0029] Na Si (Mg Li ) 0 X · · · (8)
0.33 4 2.67 0.33 10 2
前記式（8)において、 Xは、好ましくは OHおよび Fの少なくとも一方であって、好まし くは OHである。
[0030] Na (Si Al ) (Mg A1 ) 0 X · · · (9)
a-b 4-a a 3-b b 10 2
前記式（9)において、 Xは、好ましくは OHおよび Fの少なくとも一方であり、好ましく は OHであり、 は、好ましくは 4未満の正数であり、 は、好ましくは 3未満の正数であり a b
、 a— b>0であることが好ましい。
[0031] 前記層状無機化合物の具体例としては、例えば、カオリナイト、ハロイサイト、蛇紋 石等の 1 : 1型粘土鉱物；タルク、ノイロフィライト、スメクタイト、バーミキユライト (前記 式 (2)で表されるもの、以下同様)、フッ素四ケィ素雲母 (前記式 (5) )やテニォナイト (前記式 (6) )を含む雲母等の 2： 1型粘土鉱物；クロライト等の 2： 1： 1型粘土鉱物； 2： 1一 2 : 1 : 1型の中間鉱物;ィモゴライト等の準晶質粘土鉱物;ァロフェン等の非晶質 粘土鉱物;ハイド口タルサイト (前記式 (7) )等が挙げられる。
[0032] また、スメクタイトには、例えば、同型置換された四面体、八面体格子中のイオン種 によってモンモリロナイト（前記式（1) )、モンモリロナイトが 40— 80%含まれる天然物 であるベントナイト、パイデライト (前記式 (2) )等の 2八面体型；ヘクトライト (前記式 (3 )、好ましくは前記式 (8) )、サボナイト (前記式 (4)、好ましくは前記式（9) )、ノントロ ナイト等の 3八面体型等が含まれる。
[0033] ハイド口タルサイトは、例えば、前記式（7)で表わされる。具体的には、例えば、 Mg
6
Al (OH) CO ·4Η Οで表される層状鉱物であって、 Mg (OH) (ブルーサイト：中
2 16 3 2 2
心に Mg2+を持つ酸素八面体の層が積み重なった構造を持つ）の Mg2+の一部力 A1 3+に同型置換している。これは正電荷を有するが、層間の CO 2によって電気的中性
3
を保っており、陰イオン交換能をもつものである。なお、ケィ酸塩鉱物ではないが、通 常、粘土鉱物として取り扱われる。
[0034] 前述のような層状無機化合物の組成の例を、下記表 1に示す。なお、下記表 1にお いて、「MI」は、 1価陽イオンで代表させた交換性陽イオンを示し、例えば、 H+、 Na+、
K+、 Li+等である。
[0035] [表 1] 鉱物名 組成
力オリナイ ト （Kaolinite) Si 2A1205 (OH) 4
八ロイサイ ト Si2Al205 (OH) 4 · 2H20 蛇紋石 Si2 (Mg2+,Fe 2 +) 306 (OH) タルク (Talc) Si4Mg3 (OH) 0
パイロフイライ ト （Pyrophyllite) S i 4 Al 2 (OH) 20
モンモリロナイ ト (Montmori 1 loni te) Mし S i 4 (Al 2— x Mgx ) 0 (OH) 2 · nH20 パイデライ ト （Beidellite) MI ; (Si4_xAlx)Al20! (OH) 2 · nH20 ヘクトライ ト （Hectori te) MI Si4 (Mg3— xLijO! (OH, F) • nH20 サボナイ ト （Saponite) MI : (Si4_xAlx)Mg301 (OH) , ■ nH20 ノントロナイ ト （Nontronitc) MI (Si4_xAlx)Fe2010 (OH) nH20 ノ 一ミキユライ ト （Vcrmicul i te) MI (Si4_xAlx) Al (OH) nH,0 ハイ ド口タルサイ ト （Hydrotalci te) g6Al 2 (OH) j 6C03 - 4H20
[0036] 前記層状無機化合物の平均孔径は、特に限定されないが、例えば、溶媒に対して 均一に分散できる程度の粒径であることが好ましい。前記層状無機化合物は、一般 に板状の粒子であり、かつ、複数個の粒子が凝集と劈開を繰り返す動的平衡にある ため、平均粒径を定義すること自体が困難であるが、例えば、光散乱法や電子顕微 鏡を用いた観察等の手段により測定した場合に、水中に分散させた状態で、 lnm— 20 μ mの範囲であることが好ましぐより好ましくは lOnm— 2 μ mの範囲である。
[0037] これら粘土鉱物等の層状無機化合物は、例えば、 4級アンモニゥム塩等のピラーを 立てて、層間距離や層間の電荷や極性をあらかじめ調整することもできる。
[0038] 前述のような層状無機化合物のうち、より好ましくは 2:1型粘土鉱物であり、特に好 ましくはイオン交換能を有する膨潤性粘土鉱物である。
[0039] 前記膨潤性粘土鉱物のうち、より好ましくはベントナイト、スメクタイト、バーミキユラィ ト、合成フッ素雲母等であり、特に好ましくは合成へクトライトや合成サボナイト等の合 成スメクタイト;合成フッ素雲母に代表される膨潤性合成雲母; Na型雲母等の合成雲 母 (天然の雲母は、通常、非膨潤性の粘土鉱物である)等である。これらの層状無機 化合物は、単独で使用してもよいし、 2種以上を併用してもよい。
[0040] このような層状無機化合物としては、例えば、市販品が使用でき、コープケミカル（ 株)製の商品名ルーセンタイト SWN、商品名ルーセンタイト SWF (合成へクトライト）、 商品名 ME (フッ素雲母)、クニミネ工業 (株)製の商品名スメクトン SA (合成サボナイ ト）、協和化学工業 (株)製の商品名チキソピー w (合成へクトライト）、商品名キヨーヮ ード 500 (合成ハイド口タルサイト）、ラボー社製の商品名ラボナイト (合成へクトライト） 、（株)ナカライテスタ社製の天然ベントナイト、（株)豊順鉱業社製の商品名マルチゲ ル (ベントナイト)等が挙げられる。
[0041] 本発明において、前記界面活性剤としては両性界面活性剤が好ましぐより好まし くは、例えば、同一分子内に正電荷と負電荷とを有する両性界面活性剤であり、例え ば、アルキルアミノカルボン酸（またはその塩）、カルボキシベタイン、スルホベタイン およびホスホべタイン等があげられる。これらの中でも、さら〖こ好ましくは、同一分子 内に正電荷と負電荷とを有し、かつ、前記正電荷と負電荷とが離間している両性界 面活性剤であり、例えば、カルボキシベタイン、スルホベタインおよびホスホべタイン 等である。具体的には、前記カルボキシベタインとして、アルキルジメチルァミノ酢酸 ベタイン等、前記スルホベタインとして、 CHAPS、 CHAPSOおよびアルキルヒドロキ シスルホベタイン等が使用できる。これらの中でも好ましくは、スルホベタインであり、 より好ましくは CHAPS、 CHAPSO,特に好ましくは CHAPSである。
[0042] 本発明にお ヽて、前記緩衝剤としては、アミン系緩衝剤が好ましぐ例えば、 Tris、 ACES, CHES、 CAPSO、 TAPS, CAPS, Bis— Tris、 TAPSO、 TES、 Tricine および AD A等があげられ、好ましくは ACES、 Trisであり、より好ましくは ACESであ る。これらの物質は、 1種類でもよいし 2種類以上を併用してもよい。
[0043] また、前記緩衝剤としては、カルボキシル基を有する緩衝剤も好ましぐ例えば、酢 酸—酢酸 Na緩衝剤、リンゴ酸—酢酸 Na緩衝剤、マロン酸—酢酸 Na緩衝剤、コハク酸 -酢酸 Na緩衝剤等があげられ、この中でもコハク酸-酢酸 Na緩衝剤が好ま 、。
[0044] 前記アミン系緩衝剤と前記界面活性剤との組み合わせとしては、例えば、 Trisと C HAPS, ACESと CHAPS、 ACESと CHAPSOの組み合わせ等があげられ、より好 ましくは CHAPSと ACESである。また、カルボキシル基と有する緩衝剤と前記界面 活性剤との組み合わせとしては、例えば、コハク酸 酢酸 Naと CHAPSまたは CHA PSO、マロン酸 酢酸 Naと CHAPS、リンゴ酸ー酢酸 Naと CHAPSまたは CHAPSO 、酢酸 酢酸 Naと CHAPS等が挙げられ、好ましくはコハク酸 酢酸 Naと CHAPSの 組合わせである。 [0045] 本発明において、前記メディエータとしては、例えば、後述するような酸化還元酵素 と測定対象物との反応によって還元型となり、電気化学的に酸化され、酸化電流によ つて検出できるものが好ましぐ従来公知のものが使用できる。
[0046] 具体的には、フェリシアン化カリウム、 p—べンゾキノンおよびその誘導体、フエナジ ンメトサルフェート、インドフエノール、 2, 6—ジクロロフェノールインドフエノール等のィ ンドフエノール誘導体、 j8—ナフトキノン 4ースルホン酸カリウム、フエ口セン、フエロセ ンカルボン酸等のフ 口セン誘導体、オスミウム錯体、ルテニウム錯体、 NAD+、 NA DP+、ピロ口キノリンキノン（PQQ)、メチレンブルー、 cytochtome c、 cytochrome b、銅 錯体等が使用できる。これらの中でも、好ましくはフェリシアンィ匕カリウム、フエ口セン、 オスミウム錯体、ルテニウム錯体、 NAD+、 NADP+等が使用できる。
[0047] また、この他にも、例えば、 1, 1 ' ジメチルー 4, 4' ビビリジリウム塩、 1, 1 'ージべ ンジルー 4, 4，一ビビリジリウム塩、 1, 4—ジァミノベンゼン、 2—メチルー 1, 4 ナフトキノ ン、 N メチルフエナジ-ゥム塩、 1ーヒドロキシー 5 メチルフエナジ-ゥム塩、 1ーメトキ シ— 5—メチルフエナジ-ゥム塩、 9ージメチルァミノベンゾアルファフェノキサジン 7— ィゥム塩、へキサシァノ鉄（Π)塩、 7—ヒドロキシー 3H—フエノキサジン 3 オン 10—才 キシド、 3, 7—ジァミノ— 5—フエ-ルフエナジ-ゥム塩、 3— (ジェチルァミノ）— 7—ァミノ 5 フエ-ルフエナジ-ゥム塩、 1, 4-ベンゼンジオール、 1, 4ージヒドロキシ—2, 3, 5—トリメチルベンゼン、 N, N, Ν' , Ν，ーテトラメチルー 1, 4 ベンゼンジァミン、 Δ 2, 2'—ビー1, 3—ジチオール、 2, 6—ジメチルベンゾキノン、 2, 5—ジメチルベンゾキノン 、 2, 3, 5, 6—テトラメチルー 2, 5—シクロへキサジェンー 1, 4ージオン、 2, 6—ジクロ口 4— [ (4—ヒドロキシフエ-ル)ィミノ]— 2, 5—シクロへキサジェンー 1 オン、 2, 6—ジク ロロ 4— [ (3—クロロー 4ーヒドロキシフエ-ル)ィミノ]— 2, 5—シクロへキサジェンー 1一才 ン、 7— (ジェチルァミノ）— 3—ィミノ— 8—メチルー 3Η—フエノキサジン塩、 3, 7—ビス（ジ メチルァミノ）フエノチアジン 5—ィゥム塩等カ^ディエータとして使用できる。
[0048] 本発明の製造方法において、前記無機ゲル層は、少なくともメディエータと界面活 性剤と緩衝剤と層状無機化合物とを含有する分散液を塗布することによって、形成 することが好ましい。
[0049] また、本発明においては、前記無機ゲル層の上に、酸化還元酵素を含有する層を 形成し、積層体の試薬層としてもよいし、または、前記分散液にさらに酸化還元酵素 を含有させ、前記酸化還元酵素を含有する無機ゲル層を電極表面に形成し、単層 の試薬層としてもよい。このように単層の試薬層を形成する場合、酸化還元酵素を含 有する層とメディエータを含有する層とを別途形成する必要がないため、製造が一層 簡便となる。このようなバイオセンサは、例えば、グルコースデヒドロゲナーゼ（GDH) のように、酵素反応に、酸素を必要としない酵素を使用する場合、特に好ましい。
[0050] 前記酸化還元酵素としては、例えば、試料中の測定対象物および前記メディエー タと酸化還元反応するものであれば特に制限されず、測定対象物の種類等に応じて 適宜決定できる。
[0051] 具体的には、例えば、グルコースォキシダーゼ（GOD)、ビラノースォキシダーゼ、 グルコースデヒドロゲナーゼ（GDH)、乳酸ォキシダーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、フ ルクトースデヒドロゲナーゼ、ガラクトースォキシダーゼ、コレステロールォキシダーゼ 、コレステロ一ノレデヒドロゲナーゼ、ァノレコーノレオキシダーゼ、ァノレコーノレデヒドロゲ ナーゼ、ピリルビン酸ォキシダーゼ、グルコース 6—リン酸デヒドロゲナーゼ、アミノ酸 デヒドロゲナーゼ、ギ酸デヒドロゲナーゼ、グリセローノレデヒドロゲナーゼ、アシノレー Co Aォキシダーゼ、コリンォキシダーゼ、 4ーヒドロキシ安息香酸ヒドロキシラーゼ、マレイ ン酸デヒドロゲナーゼ、サルコシンォキシダーゼ、ゥリカーゼ等があげられる。
[0052] 前記酸ィ匕還元酵素と前記メディエータとの組み合わせは、特に制限されな!、が、例 えば、 GODとフェリシアン化カリウム、 GDHとルテニウム錯体、コレステロールデヒド ロゲナーゼとフエ口セン、アルコールデヒドロゲナーゼと銅錯体の組み合わせ等があ げられる。
[0053] (実施形態 1)
本発明の第 1のノィォセンサ製造方法の一例について、図 1および図 2に基づいて 説明する。図 1 (A)— (F)は、バイオセンサを製造する一連の工程を示した斜視図で ある。また、図 2は、前記図 1 (F)に示すバイオセンサの I I方向断面図である。なお、 図 1 (A)—（F)および図 2において、同一箇所には同一符号を付している。
[0054] 図 1 (F)および図 2に示すように、このバイオセンサ 1は、基板 11、リード部 12aを有 する作用極 12とリード部 13aを有する対極 13とから構成された電極系、絶縁層 14、 メディエータと層状無機化合物と界面活性剤とを含む無機ゲル層（酸化防止層） 16、 酸化還元酵素を含む酵素試薬層 17、開口部を有するスぺーサー 18および貫通孔 2 0を有するカバー 19を備えている。図 1 (B)に示すように、基板 11の一方の端部（両 図において右側）上には、検出部 15が設けられており、検出部 15には、作用極 12と 対極 13とが、基板 11の幅方向に並行して配置されている。前記両電極の一端は、そ れぞれリード部 12a、 13a (両図において左側）となり、これらと、検出部 15における他 端とが、垂直となるように配置されている（図 1 (A) )。また、作用極 12と対極 13との間 は、絶縁部となっている。このような電極系を備えた基板 11の上には、図 1 (B)に示 すように、リード部 12a、 13aおよび検出部 15を除いて、絶縁層 14が積層されており 、絶縁層 14が積層されていない前記検出部 15上には、無機ゲル層 16および酵素 試薬層 17がこの順序で積層されている。そして、絶縁層 14の上には、図 1 (E)に示 すように、検出部 15に対応する箇所が開口部になっているスぺーサー 18が配置さ れている。さらにスぺーサー 18の上には、前記開口部に対応する一部に貫通孔 20 を有するカバー 19が配置されている（図 1 (F) )。このバイオセンサ 1において、前記 開口部の空間部分であり、かつ、前記酵素試薬層 17および絶縁層 14とカバー 19と に挟まれた空間部分が、キヤビラリ一構造の試料供給部 21となる。そして、前記貫通 孔 20が、試料を毛管現象により吸入するための空気孔となる。
[0055] このバイオセンサ 1の大きさは、特に制限されず、供給する試料の量等により適宜 設定できるが、例えば、全体長さ 5— 50mm、全体幅 1一 50mm、最大厚み 2000— 500 μ m、最小厚み 50— 500 μ mである。なお、「長さ」とは、バイオセンサの長手方 向の長さをいい、「幅」とは、幅方向の長さをいう（以下、同じ)。
[0056] 基板 11の大きさは、例えば、長さ 5— 50mm、幅 1一 50mm、厚み 1000—
であり、絶縁層 14の大きさは、例えば、長さ 5— 50mm、幅 1一 50mm、厚み 10— 20 O /z mであり、検出部 15の大きさは、例えば、長さ 0. 1— 10mm、幅 0. 1— 10mmで あり、無機ゲル層 16の大きさは、例えば、長さ 0. 1— 10mm、幅 0. 1— 10mm、厚み 0. 001— 500 mであり、酵素試薬層 17の大きさは、長さ 0. 1— 10mm、幅 0. 1— 10mm,厚み 0. 001— 500 mである。スぺーサ一の大きさは、例えば、長さ 1一 50 mm、幅 1一 50mm、厚み 10— 1000 mであり、その開口部は、例えば、長さ 0. 1 — 10mm,幅 0. 01— 10mmである。カバー 19の大きさは、例えば、長さ 5— 50mm 、幅 1一 50mm、厚み 10— 1000 mであり、その貫通孔は、例えば、直径 0. 1— 10 mmで & >。。
[0057] 無機ゲル層 16における層状無機化合物の含有量は、供給する試料の種類やその 量、検出部 15の面積等に応じて適宜決定できるが、例えば、検出部 15の面積 lcm2 当たり、 0. 003— 30mgの範囲、好ましくは 0. 1— 10mgの範囲、より好ましくは 0. 3 一 3mgの範囲である。具体的に、前記層状無機化合物がスメクタイトの場合、例えば 、前記面積 lcm2当たり、 0. 003— 30mgの範囲、好ましくは 0. 1— 10mgの範囲、よ り好ましくは 0. 3— 3mgの範囲である。前記含有量が面積 lcm2当たり 0. 003mg以 上であれば、例えば、十分に酸素遮断効果を発揮でき、また、面積 lcm2当たり 30m g以下であれば、酵素遮断効果および再現性、反応性をより一層向上できる。なお、 前記面積当たりの層状無機化合物の量は、無機ゲル層 16の厚みに関係しており、 前述のように、層の厚みは、 0. 001— 500 mの範囲が好ましい。
[0058] また、無機ゲル層 16における界面活性剤 (例えば、両性界面活性剤）の含有量は 、例えば、前記層状無機化合物の量に応じて適宜決定できるが、層状無機化合物 3 OOmgに対して、例えば、 0. lmmol— lOOmmolの範囲、好ましくは 0. 5mmol— 1 Ommol、より好ましくは 0. 5mmol— lmmolの範囲である。
[0059] また、無機ゲル層 16におけるメディエータの含有量は、例えば、測定試料の種類、 測定対象物の種類、後述する酵素試薬層における酸ィヒ還元酵素の量等によって適 宜決定できる力 例えば、検出部 15の面積 lcm2当たり、 lOmmol— lOOmolが好ま しぐより好ましくは lOmmol— 50mmol、特に好ましくは 15mmol— 20mmolの範囲 である。
[0060] この無機ゲル層 16は、さらに緩衝剤を含有してもよ ヽ。無機ゲル層 16における前 記緩衝剤の含有量は、例えば、前記層状無機化合物の量に応じて適宜決定でき、 層状無機化合物 0. 3gに対して、緩衝剤は、例えば、 0. lmmol— lOOmmolが好ま しぐより好ましくは lmmol— 50mmol、特に好ましくは lOmmol— 20mmolの範囲 である。
[0061] 前記酵素試薬層 17における酸ィ匕還元酵素の含有量は、特に制限されず、試料の 種類やその量、測定対象物の種類や量等に応じて適宜決定できる。具体的には、検 出部 15の面積 lcm2当たり、例えば、 0. 1U— 100KUの範囲であり、好ましくは、 1 U— 10KUの範囲であり、より好ましくは 1U— 100Uの範囲である。
[0062] また、酵素試薬層 17中の酵素量と前記無機ゲル層 16中のメディエータとの割合は 、例えば、酵素 1000Uあたり、メディエータ 0. 01— 1Mの範囲、好ましくは 0. 01— 0 . 5Mの範囲、より好ましくは 50mM— 200mMの範囲である。
[0063] このようなバイオセンサは、例えば、以下のようにして作製できる。
[0064] まず、電極系を形成するための基板 11を準備する。前記基板 11の材料としては、 電気絶縁性材料が好ましぐ例えば、プラスチック、ガラス、紙、セラミックス、ゴム等が あげられる。前記プラスチックとしては、例えば、ポリエチレンテレフタレート（PET)、 ポリスチレン（PS)、ポリメタタリレート（PMMA)、ポリプロピレン（PP)、ァクリノレ榭脂、 ガラスエポキシ等があげられる。
[0065] つぎに、図 1 (A)に示すように、基板 11上にリード部 12aを有する作用極 12および リード部 13aを有する対極 13からなる電極系を形成する。なお、電極の形状は、図 1 (A)に示す形状には何ら制限されない。前記電極としては、カーボン電極、金電極、 ノラジウム電極、白金電極等が好ましぐその種類に応じて、例えば、スクリーン印刷 、コーティング法、蒸着法等の公知の方法により形成できる。
[0066] カーボン電極の場合は、例えば、カーボンインキを前記基板 11上にスクリーン印刷 する手段、コーティングする手段等により形成できる。
[0067] また、前記金電極は、例えば、蒸着法、メツキ法、スパッタ法、金箔貼付法等により 形成できる。前記蒸着法は、例えば、イオンプレーティング法により、真空度 1. 33 X 10— 4Pa、入力パワー 300W、レート 5 X 10— nmZ秒、時間 2分の条件で、例えば、 P ETなどのプラスチックシート上に金を蒸着して、さらにキスカット装置を用いて、前記 シート上に蒸着された金箔層に切れ目を入れる方法である。これにより、切れ目部分 が絶縁部となり、作用極および対極力ゝらなる電極系が形成できる。
[0068] 続いて、図 1 (B)に示すように、前記電極系 12、 13を形成した基板 11上に絶縁層 14を形成する。この絶縁層は、電極のリード部 12a、 13a (図 1 (B)において左側）と、 後述する無機ゲル層等を形成する検出部 15を除いた基板 11上に形成する。 [0069] 前記絶縁層 14は、例えば、絶縁性榭脂を溶媒に溶解した絶縁ペーストを前記基板 11上に印刷し、これを加熱処理または紫外線処理して形成することができる。
[0070] 前記絶縁性榭脂としては、例えば、ポリエステル、プチラール榭脂、フエノール榭脂 等があげられ、前記溶媒としては、例えば、カルビトールアセテート、二塩基酸エステ ル系混合溶剤（DBEソルベント)等があげられる。前記ペーストにおける前記絶縁性 榭脂の濃度は、例えば、 65— 95重量％の範囲が好ましぐより好ましくは 75— 90重 量％の範囲であり、特に好ましくは 80— 85重量％の範囲である。
[0071] 前記加熱処理の条件は、使用する前記絶縁性榭脂の種類に応じて適宜決定でき る。
[0072] なお、前記絶縁層 14は、前記印刷法以外に、例えば、コーティング、膜はりつけ、 エッチング等の方法によっても形成できる。
[0073] 次に、図 1 (C)に示すように、絶縁層 14が形成されていない検出部 15において、 基板 11および電極 12、 13上に、無機ゲル層 16を形成する。無機ゲル層 16は、例え ば、メディエータおよび界面活性剤を含み、かつ前記層状無機化合物が分散された 分散液を調製し、これを前記検出部 15に分注して、乾燥することによって形成できる 。なお、この無機ゲル層 16は、必ずしも常時ゲル状である必要はなぐ使用前は、前 記乾燥工程によって乾燥した状態であってもよぐ液体試料等を含浸した場合に、ゲ ル状となることが好ましい。
[0074] 前記分散液の調製に使用する溶媒としては、例えば、水、緩衝液アルコール、 N, N—ジメチルホルムアミド（DMF)、ジメチルスルホキシド（DMSO)等が使用でき、こ の中でも好ましくは超純水である。
[0075] 前記分散液における前記層状無機化合物の濃度は、例えば、 0. 1-lOOmg/m Lの範囲であり、好ましくは 1一 lOOmgZmLの範囲であり、より好ましくは 10— 30m gZmLの範囲である。また、前記分散液における前記界面活性剤の濃度は、例えば 、 1一 200mMの範囲であり、好ましくは 1一 lOOmMの範囲であり、より好ましくは 1 一 10mMの範囲である。
[0076] また、分散液における層状無機化合物と界面活性剤との添加割合としては、前記 層状無機化合物 300mgに対して、界面活性剤力 例えば、 0. Immol-lOOmmol の範囲、好ましくは 0. 5mmol— lOmmol、より好ましくは 0. 5mmol— lmmolの範 囲である。
[0077] また、前記分散液における前記メディエータの濃度は、例えば、 1一 lOOOmMの範 囲であり、好ましくは 100— 800mMの範囲であり、より好ましくは 200— 500mMの 範囲であり、特に好ましくは 300mM付近である。
[0078] 前記分散液は、さらに、前述のようなアミン系等の緩衝剤を含むことが好ましぐこの 場合、前記緩衝剤の濃度は、例えば、 1一 lOOOmMの範囲であり、好ましくは 10— 5 OOmMの範囲であり、より好ましくは 50— 200mMの範囲である。また、層状無機化 合物に対する前記緩衝剤の添加割合としては、前記層状無機化合物 0. 3gに対して 、前記緩衝剤力 例えば、 0. lmmol— lOOmmolが好ましぐより好ましくは lmmol 一 50mmol、特に好ましくは lOmmol— 20mmolの範囲である。
[0079] また、前記界面活性剤と前記緩衝剤の添加量は、例えば、前述のように無機微粒 子に対する割合で決定できるため、前記界面活性剤と前記緩衝剤の添加割合 (モル 比 A: B)は、特に制限されな!、が、例えば、 A: B= 1： 1— 1： 250の範囲であり、好ま しくは 1： 10-1 : 100の範囲であり、より好ましくは 1： 25— 1： 50の範囲である。
[0080] 前記溶媒に対する、前記メディエータ、前記層状無機化合物および界面活性剤等 の各成分の添加順序は特に制限されないが、例えば、まず、前記溶媒に層状無機 化合物を添加し、十分に攪拌した後、界面活性剤を添加する。そして、さらに前記緩 衝剤を添加してから、最後にメディエータを溶解することが好ましい。この順序による と、メカニズムは不明であるが、より一層均一で、酸素との接触が防止される無機ゲル 層を形成することができる。なお、前記緩衝剤は、界面活性剤と共に添加してもよい 力 特に好ましくは、界面活性剤の添加後である。
[0081] また、前記分散液の調製方法は特に制限されないが、例えば、使用するメディエー タの種類等に応じて、 pHの調整や使用する緩衝剤の種類を選択することが好ま ヽ 。以下に、メディエータの種類に応じた具体的な例をあげる。
[0082] まず、中性付近での使用が好ましいメディエータを使用する場合の例を説明する。
一般に、スメクタイトのような層状無機化合物 (無機ゲル）は、水等の溶媒に溶解する と透明化する力 その分散液の pHは高アルカリ性 (pHIO付近)である。一方、中性 付近での使用が好ましいメディエータゃ酵素等は、安定な pH条件下、すなわち、中 性付近で添加することが好ましい。ところが、無機ゲルは、中性付近で白濁したり沈 殿が生じる場合がある。この場合に、緩衝剤として前述のようなアミン系緩衝剤を添 加すれば、前記分散液の pHを中性付近に調整でき、且つ、メカニズムは不明である 力 中性付近であるにもかかわらず、沈殿を生じることもなぐメディエータを添加する ことができるのである。そして、結果として、前述のように、メディエータの再酸化を十 分に防止できる無機ゲル層を確実に形成できるのである。なお、両性界面活性剤の ような界面活性剤を添加してから、アミン系緩衝剤を添加することによって、調製する 分散液の白濁や沈殿を十分に防止できることも、本発明者らがはじめて見出したこと でさる。具体的な添加順序としては、層状無機化合物の分散液に、界面活性剤を添 加した後、アミン系緩衝剤を添加することが好ましい。アミノ系緩衝剤を添加した後の 分散液の pHは、例えば、 9一 5の範囲であり、好ましくは 8— 6であり、より好ましくは 7 . 5— 7である。
[0083] 中性付近での使用が好ましいメディエータとしては、例えば、フアリシアンィ匕カリウム 、シトクロム C、 PQQ、 NAD+、 NADP+、銅錯体等があげられる。
[0084] また、酸性付近での使用が好ましいメディエータを使用する場合には、以下のよう な調製方法が好ましい。前述のように、一般に、層状無機化合物 (無機ゲル)を溶媒 に溶解すると透明化し、その分散液の pHは強アルカリ性となる。この場合、酸性付近 での使用が好ましいメディエータを添加するためには、例えば、前記分散液に HC1の ような酸を添加して、前記分散液の pHを酸性側に調整し、前記界面活性剤を添加し た後に、前述のようなカルボキシル基を有する緩衝剤を添加して pH調整を行い、メ ディエータを添加することが好まし 、。
[0085] このような方法が好ましいのは以下の理由による。スメクタイトのような無機層状ィ匕合 物は、その分散液に HC1等の酸を添加して、強酸性条件とすると (例えば、 pH2付近 )、一旦は白濁して凝集を生じるが、さらに攪拌を続けることによって (例えば、 24時 間程度)、酸性側であっても分散液を透明化できることを、本発明者らは見出した。し かし、この状態の分散液では、前述のようにバインダーとなる緩衝剤が入っておらず 、緩衝剤による効果が得られない上に、酵素を使用することを考慮すると、 pH2等の 強酸性では、酵素が失活するおそれがある。そこで、さらなる検討によって、本発明 者らは、強酸性付近で透明化している分散液に、両性界面活性剤のような界面活性 剤を添加した後、カルボキシル基を有する緩衝剤を添加して、メディエータゃ酵素の 各成分に支障をきたさない pH (例えば、 pH4. 5付近）に設定することで、沈殿の発 生を十分に防止し、メディエータゃ酵素を十分に安定な状態で使用できることを見出 したのである。
[0086] 前記分散液の pHは、はじめに 1一 3の強酸性とすることが好ましぐより好ましくは 1 . 5— 2である。使用する酸としては、特に制限されないが、例えば、塩酸、リン酸、酢 酸等である。強酸性下での前記分散液の攪拌条件は、特に制限されないが、攪拌時 間力 例えば、 12— 72時間であり、好ましくは 18— 48時間であり、特に好ましくは 2 4一 30時間である。また、カルボキシル基を有する緩衝剤の添カ卩によって、前記分散 液の pHは、 3— 6に設定することが好ましぐより好ましくは 4一 5であり、特に好ましく は 4. 5—4. 8である。
[0087] 酸性付近での使用が好まし!/ヽメディエータとしては、例えば、ルテニウム錯体、ォス ミゥム錯体、フエ口セン、フエナジンメトサルフェート、インドフエノール、メチレンブルー 等が挙げられる。
[0088] 前記溶媒に、層状無機化合物、界面活性剤および緩衝剤を添加した後は、一時静 置しておくことが好ましぐ静置時間は、例えば、 24時間以上が好ましぐより好ましく は 3日以上である。
[0089] この分散液の検出部 15への注入割合は、例えば、検出部 15の大きさ、分散液に おける前記層状無機化合物等の含量、前記層状無機化合物の種類等によって適宜 決定できる。具体的には、検出部 15の面積当たり（cm2)、例えば、前記層状無機化 合物 0. 003— 30mgの範囲になるように前記分散液を注入することが好ましぐより 好ましくは 0. 1— lOmgの範囲であり、特に好ましくは 0. 3— 3mgの範囲である。した がって、分散液の層状無機化合物の濃度が、 0. 3重量％の場合、検出部の面積当 たり（cm2)、例えば、 0. 001— 10mLの範囲を注入することが好ましぐより好ましくは 0. 03—3. 3mLの範囲であり、特に好ましくは 0. 1— lmLの範囲である。
[0090] また、前記分散液を検出部 15に注入する方法は、特に制限されないが、例えば、 自動駆動式分注機等を用いて行うことができる。
[0091] 注入した前記分散液を乾燥する手段は、特に制限されないが、例えば、自然乾燥 、風乾、減圧乾燥、凍結減圧乾燥等の方法が採用できる。また、これらの手段を組み 合わせてもよい。その処理温度は、 10— 60°Cの範囲が好ましぐより好ましくは 25— 50°Cの範囲であり、特に好ましくは 30— 40°Cの範囲である。また、相対湿度 RHは、 5— 40%の範囲が好ましぐより好ましくは 10— 20%の範囲であり、特に好ましくは 1 0— 15%の範囲である。なお、処理時間は、例えば、乾燥手段に応じて適宜決定で きるが、 1一 60分の範囲が好ましぐより好ましくは 5— 30分の範囲であり、特に好ま しくは 5— 10分の範囲である。
[0092] さら〖こ、図 1 (D)に示すように、前記無機ゲル層 16の上に、酵素試薬層 17を形成 する。この酵素試薬層 17は、前記酸化還元酵素を含有する酵素液を調製して、これ を前記無機ゲル層 16上に注入し、乾燥することによって形成できる。また、前記酸ィ匕 還元酵素としては、例えば、前述のようなものが使用できる。
[0093] 前記酵素液は、例えば、酵素を溶媒に十分に溶解させて調製できる。前記溶媒とし ては、特に制限されないが、例えば、水、緩衝液、エタノール、メタノール、ブタノール 、ジメチルスルホキシド (DMSO)およびテトラヒドロフラン等の有機溶剤等が使用で きる。前記緩衝液としては、例えば、リン酸緩衝液、クェン酸緩衝液、酢酸緩衝液、ト リス塩酸緩衝液、グッド緩衝液等があげられ、その pHは、酵素の種類に応じて適宜 決定できるが、例えば、 5— 10の範囲が好ましぐより好ましくは 6— 9の範囲、特に好 ましくは 7— 8の範囲である。また、水としては、例えば、精製水、蒸留水、超純水等が あげられ、この中でも不純物が極めて少なく高精度のバイオセンサが作製可能であ ることから超純水が好ま 、。
[0094] 前記酵素液中の試薬の濃度は、特に制限されないが、例えば、 1一 lOKUZmLの 範囲が好ましぐより好ましくは 3— 6KUZmLの範囲である。
[0095] また、前記酵素液は、さらに界面活性剤を含むことが好ましぐ特に両性界面活性 剤を含むことが好ましい。前記両性界面活性剤としては、例えば、前述と同様のもの が使用できる。
[0096] この酵素液は、酸化還元酵素の他に、例えば、酸化還元酵素の基質とならな!/、糖 類や、アミノ酸およびその誘導体、イミダゾール等のアミンィ匕合物、ベタイン等を含ん でもよい。前記糖類としては、例えば、スクロース、ラフイノース、ラタチトール、リビトー ル、ァラビトール等があげられる。これらの中でも、前記糖類は、例えば、酵素の安定 性向上に、前記アミノ酸、その誘導体およびべタインは、例えば、試薬の乾燥による 固化の防止、イミダゾールは、例えば、メディエータの安定化等の目的で添加するこ とがでさる。
[0097] 前記酵素液の注入量は、形成する酵素試薬層 17の大きさ、試薬の濃度、試料の 量、測定対象物の種類等により適宜決定できる。
[0098] 注入した前記酵素液の乾燥手段は、特に制限されないが、例えば、自然乾燥、風 乾、減圧乾燥、凍結減圧乾燥等の方法が採用でき、これらの手段を組み合わせても よい。乾燥条件としては、例えば、温度 10— 60°Cの範囲、相対湿度 RH5— 40%の 範囲、時間 1一 60分の範囲である。また、試薬として酵素を使用する場合には、酵素 の種類に応じて、失活しな ヽように適宜温度を設定すればょ ヽ。
[0099] つぎに、図 1 (E)に示すように、絶縁層 14上にスぺーサー 18を配置する。図示のよ うに、スぺーサー 18は、前記酵素試薬層 17に対応する箇所が開口部となっている。
[0100] 前記スぺーサー 18の材料としては、例えば、榭脂製フィルムやテープ等が使用で きる。また、両面テープであれば、前記絶縁膜 14との接着だけでなぐ後述するカバ 一 19も容易に接着できる。この他にも、例えば、レジスト印刷等の手段によりスぺー サーを形成してもよい。
[0101] つぎに、図 1 (F)に示すように、前記スぺーサー 17上にカバー 19を配置する。前記 カバー 19の材料としては、特に制限されないが、例えば、各種プラスチック等が使用 でき、好ましくは、 PET等の透明樹脂があげられる。
[0102] このようにして作製したノィォセンサ 1は、長期間保存する場合、湿気の影響を防ぐ ため、例えば、モレキュラーシーブ、シリカゲル、酸ィ匕カルシウム等の乾燥剤と共に密 封保存することが好ましい。
[0103] このバイオセンサ 1は、例えば、ある一定の時間で所定の電圧を加える手段、前記 バイオセンサから伝達される電気信号を測定する手段、前記電気信号を測定対象物 濃度に演算する演算手段等の種々の手段を備えた測定機器と組み合わせて使用で きる。
[0104] このバイオセンサ 1の使用方法について、試料が全血、測定対象物がグルコース、 酸ィ匕還元酵素が GDH、メディエータがフェリシアンィ匕カリウムである例をあげて説明 する。
[0105] まず、全血試料をバイオセンサ 1の開口部 21の一端に接触させる。この開口部 21 は、前述のようにキヤビラリ一構造となっており、その他端に対応するカバー 19には 空気孔 20が設けられて 、るため、毛管現象によって前記試料が内部に吸引される。 吸引された前記試料は、検出部 15上に設けられた酵素試薬層 17に浸透し、酵素試 薬層 17中の GDHを溶解して、さらに酵素試薬層 17の下層である無機ゲル層 16表 面に達する。そして、表面に達した試料中のグルコースと、 GDHと、無機ゲル層 16 中のフェリシアン化カリウムとが反応する。具体的には、測定対象物であるグルコース は GDHにより酸ィ匕され、その酸ィ匕反応により移動した電子によって、フェリシアンィ匕 カリウムが還元され、フエロシアン化カリウム（フエロシアンイオン）が生成される。
[0106] この際、試料は酵素試薬層 17を通過して無機ゲル層 16に達する力 無機ゲル層 1 6を通過して電極表面に到達することはない。このため、還元されたフエロシアン化力 リウムが試料中の溶存酸素によって再酸ィ匕することが防止できると考えられ、これによ つて測定精度の低下が抑制される。なお、電極表面に水分が到達していないことは、 電子顕微鏡によって確認されている。また、前記試料中に含まれる赤血球等の不純 物も、層状無機化合物の間を通過することができないため、この無機ゲル層 16を通 過することなぐ電極 12、 13表面への吸着も防止される。
[0107] そして、無機ゲル層 16中で還元されたフ ロシアン化カリウムと、無機ゲル層 16の 下に位置する電極との間で、電子授受が行われ、これによつてグルコース濃度が測 定できるのである。具体的には以下のように行うことができる。
[0108] 全血試料の供給から一定時間経過後、前記電圧を加える手段により対極 13と作用 極 12との間に電圧を印加して、電極と接触している前記還元型のフエロシアンィ匕カリ ゥム（フエロシアンイオン)を電気化学的にフェリシアンィ匕カリウムに酸ィ匕し、その際の 酸ィ匕電流を、作用極 12のリード部 12aを介して前記電気信号を測定する手段等によ つて検出する。この酸ィ匕電流の値は、試料中のグルコース濃度に比例するため、これ を前記演算手段によりダルコース濃度に演算すれば、試料中のダルコース濃度を求 めることができる。
[0109] このようなバイオセンサによれば、前述のように溶存酸素等の影響による、還元型メ ディエータの再酸ィ匕が防止され、測定の精度や再現性が向上できる。
[0110] 本実施形態においては、本発明のバイオセンサをグルコース測定に適用する例を 示したが、これには制限されず、例えば、測定対象物に応じて試薬を適宜決定し、各 種測定対象についてのバイオセンサとすることができる。具体的には、例えば、乳酸 測定用バイオセンサの場合はラタテートォキシダーゼ、アルコール測定用バイオセン サの場合はアルコールォキシダーゼ、コレステロール測定用センサの場合はコレステ ロールォキシダーゼ等が使用できる。また、グルコース測定用バイオセンサの場合、 例えば、ビラノースォキシダーゼやグルコースォキシダーゼ等も試薬として使用でき る。
[0111] また、前記無機ゲル層と酵素試薬層とを積層する代りに、前述の層状無機化合物 等を分散した分散液に、さらに酸化還元酵素を添加して、検出部 15に、酵素試薬層 と無機ゲル層を兼ねる単層を形成してもよい。この場合、前記分散液における酸ィ匕 還元酵素量等は特に制限されず、例えば、前述のような添加量を参考にできる。 実施例 1
[0112] 以下に示すようにして、前記図 1 (F)と同じ構造のグルコースセンサを作製した。
[0113] まず、グルコースセンサの絶縁基板 11として、 PET製基板（長さ 50mm、幅 6mm、 厚み 250 m)を準備し、その一方の表面に、スクリーン印刷により、リード部をそれ ぞれ有する作用極 12および対極 13からなるカーボン電極系を形成した。
[0114] つぎに、以下に示すようにして前記電極上に絶縁層 14を形成した。まず、絶縁性 榭脂ポリエステルを、濃度 75重量％になるように溶媒カルビトールアセテートに溶解 させて絶縁性ペーストを調製し、これを前記電極上にスクリーン印刷した。印刷条件 は、 300メッシュスクリーン、スキージ圧 40kgであり、印刷する量は、電極面積 lcm2 当たり 0. 002mLとした。なお、検出部 15上と、リード部 12a、 13a上には、スクリーン 印刷を行わなかった。そして、 90°Cで 60分間加熱処理することによって絶縁層 14を 形成した。 [0115] 続いて、前記絶縁層 14を形成しなかった前記検出部 15に、以下に示すようにして 無機ゲル層 16を形成した。まず、合成スメクタイトである商品名「ルーセンタイト SWN 」（コープケミカル社製) 0. 6gを精製水 lOOmLに懸濁し、約 8— 24時間攪拌した。こ の合成スメクタイト懸濁液の pHは、約 10であった。この合成スメクタイト懸濁液 10mL に、 10% (wZv) CHAPS (同仁化学研究所製）水溶液 0. lmL、 1. OM ACES緩 衝液 (pH7. 4 :同仁ィ匕学研究所製） 5. OmLおよび精製水 4. OmLをこの順序で添 加し、さらにメディエータとして [Ru(NH ) ]C1 (アルドリッチ社製） 1. Ogを混合した。
3 6 3
この混合液を無機ゲル層形成液とする（PH7. 5)。なお、この無機ゲル形成液にお ける組成物の最終濃度を以下に示す。
[0116] ル一センタイト S W N 0 . 3 % (w/ v )
C H A P S 0 . 3 % (w/ v )
A C E S緩衝液 （ p H 7 . 5 ) 1 0 0 m M
[ R u ( N H J J C 1 , 5 . 0 % (w/ v )
[0117] この無機ゲル形成液 1. O /z Lを、検出部 15に分注した。なお、検出部 15の表面積 は約 0. 1cm2であり、前記検出部 15における電極 12、 13の表面積は約 0. 12cm2で あった。そして、これを、 30°C、相対湿度 10%の条件下で 10分間乾燥させて、無機 ゲル層 16を形成した。
[0118] さらに、前記無機ゲル層 16の上に、酵素試薬層 17を形成した。これは、 5000UZ mL GDH水溶液 1. 0 Lを、検出部 15の前記無機ゲル層 16の上に分注して、 30 °C、相対湿度 10%の条件下で 10分間乾燥させて形成した。
[0119] 最後に、開口部を有するスぺーサー 18を絶縁層 14上に配置し、さらに、前記スぺ ーサー 18上に空気孔となる貫通孔 20を有するカバー 19を配置してバイオセンサ 1 を作製した。前記カバー 19と絶縁層 14とに挟まれたスぺーサー 18の開口部の空間 が、キヤビラリ一構造となるため、これを試料供給部 21とした。
[0120] なお、比較例 1としては、無機ゲル層形成液の調製において、前記合成スメクタイト 懸濁液の代りに精製水を用いた以外は、実施例 1と同様にしてグルコースセンサを作 製した。 実施例 2
[0121] 前記実施例 1で作製したグルコースセンサを用いて、グルコース濃度に応じた応答 電流の経時変化を測定した例である。
[0122] 液体試料としては、ヒト全血を用いた。まず、採血後の全血を 37°Cで約 1日放置し て、グルコース濃度 OmgZlOOmLに調整した。つぎに、これにグルコースを添カロし て、各種グルコース濃度（約 200、 400、 600mgZl00mL)の試料を調製した。なお 、グルコース無添力卩の全血をグルコース濃度 OmgZlOOmLとした。そして、実施例 2 として、前記グルコースセンサ 1に 200mVの電圧を印加してから、試料を試料供給 部 21に点着し、その点着 5秒後の応答電流のタイムコースを測定した。比較例 2とし て、比較例 1のグルコースセンサについても同様にして測定を行った。なお、実施例 および比較例ともに、計 3回ずつ測定を行った (n= 3)。これらの結果を図 3 (A) (B) に示す。図 3は、グルコースセンサで試料を測定した場合の電流値の経時変化を示 すグラフであって、同図 (A)が実施例 2、同図 Bが比較例 2の結果をそれぞれ示す。
[0123] 同図 (A)に示すように、実施例 1のグルコースセンサによれば、同図（B)に示す比 較例 1のグルコースセンサよりも、応答電流値のピークがより早い時間で現れ、かつピ ーク電流値も高い値が得られた。このように高いピーク電流値が得られたのは、実施 例 1のグルコースセンサによれば、無機ゲル層において酸素が遮断されるため、ダル コースと GDHとの反応によって還元されたメディエータカ 酸素によって再酸化され ることなく、電気化学的に酸化され、その酸ィ匕電流を測定できた力 であると考えられ る。また、電流値のピークが早い時間で現れたのは、電極上の無機ゲル層中におい て、スメクタイトのシート内にメディエータである [Ru(NH ) ]C1がはまり込んで強固
3 6 3
に固定ィ匕されているため、電極表面にスメクタイトを介してメディエータがゆるく固定 化された状態となり、電極近傍のメディエータ濃度が大きくなつて、反応速度が増大 したちのと考免られる。
実施例 3
[0124] 本発明のグルコースセンサを用いて、試料の点着から一定時間経過後の応答電流 値の再現性を確認した例である。
[0125] ヒト全血【こグノレコースを添カロして、グノレコース濃度 0、 103、 415、 616、 824mg/l OOmLの試料をそれぞれ調製した。
[0126] 実施例 3として、前記無機ゲル層形成液におけるスメクタイト濃度 (ルーセンタイト S WN)を 0. 24% (wZv)とした以外は、前記実施例 1と同様にしてグルコースセンサ を作製した。前記グルコースセンサの電極間に 200mVの電圧を印加してから、試料 を点着し、点着 5秒後の応答電流値を測定した。前記測定は、同じグルコースセンサ を用いて、各試料について、それぞれ計 10回 (n= 10)行った。また、比較例 3として 、前記比較例 1のグルコースセンサを用いて、前記実施例 3と同様にして測定を行つ た（n= 10)。
[0127] 測定した実施例 3および比較例 3の応答電流値 (n= 10)から、測定の再現性を示 す CV値を求めた。これらの結果を下記表 2に示す。
[0128] [表 2] 試料屮のグルコース濃度
103mg/100mL 41 5mg/100mL 61 6mg/10QmL 824mg/100mL
実施例 3 3. 02% 2. 34¾ 2. 90 2. 33¾
比較例 3 3. 84% 3. 31 3. 35 7. 30¾
[0129] 前記表 2の結果から、比較例 3は、特に試料中のグルコース濃度を 824mgZl00 mLに増加させたことによって、 CV値が 7. 30と大幅に変化したのに対し、実施例 3 によれば、 CV値は 2. 34-3. 02の間で安定しており、前記グルコース濃度の増加 に拘わらず、再現性よく測定できることがわかる。この結果から、実施例のグルコース センサによれば、スメクタイトを含まな 、比較例のバイオセンサよりも高！、再現性で測 定できるといえる。
実施例 4
[0130] 前記実施例 3で作製したグルコースセンサについて、一定湿度および温度に曝露 することによる影響を確認した例である。
[0131] 前記グルコースセンサを、相対湿度 80%、温度 40°Cに維持した室内に 17時間放 置して曝露した後、電極間に 200mVの電圧を印加した。そして、グルコース濃度 0、 600mgZl00mLとなるようにグルコースを添カ卩したヒト全血試料を点着し、点着 5秒 後の応答電流値を測定した。これを実施例 4とする。また、比較例 4として、前記比較 例 1のグルコースセンサについても同様にして測定を行った。なお、実施例 4および 比較例 4のコントロールとして、それぞれ前記グルコースセンサを用いて、前記通常 の室温湿度 (約 25°C、約 60%Rh)条件下で、前記試料についての応答電流値を測 定した。そして、コントロールの電流値を 100%とした場合の、前記実施例 4および比 較例 4の感度（％)を求めた。以下の表 3に結果を示す。
[0132] [表 3]
― 感度 （％)
実施例 4 7 4 . 2 %
比較例 4 2 7 . 6 %
[0133] 前記表 3に示すように、実施例 3のグルコースセンサによれば、高湿度条件に曝露 しても、比較例 1のグルコースセンサに比べて曝露後の感度低下が小さいことがわか つた。つまり、実施例 3のグルコースセンサは、前述のように、無機ゲル層によって、 例えば、空気中の水分や試料中の溶存酸素が遮断され、メディエータが酸素と接す ることを防止できるため、湿度に対する耐性を有して 、ると 、える。
実施例 5
[0134] 本発明のダルコースセンサについて、試料中の溶存酸素による影響を確認した例 である。
[0135] ヒト全血にグルコースを添カ卩して、グルコース濃度を 11 lmgZlOOmLになるように 試料を調製し、さらに溶存酸素が 25. ImmHg付近 (未調整）、 92. OmmHg付近、 および 171. 6mmHg付近になるようにそれぞれ調節した。溶存酸素濃度は、溶存酸 素未調整（25. ImmHg)の前記試料を、試験管内で酸素と混和することによって、 高濃度（92. OmmHg, 171. 6mmHg)に調整した。
[0136] 実施例 5として、前記無機ゲル層形成液におけるスメクタイト濃度 (ルーセンタイト S WN)を、 0. 12%、 0. 24%、 0. 36%、 0. 48% (w/v)とした以外は、前記実施 f列 1 と同様にして 4種類のグルコースセンサを作製した。そして、前記グルコースセンサの 電極間に 200mVの電圧を印加してから、前記試料を点着し、点着 5秒後の応答電 流値を測定した。これらの各グルコースセンサについて、溶存酸素未調整（25. lm mHg)の試料に対する前記応答電流値を基準として、下記式（10)より、各試料 (溶 存酸素 92. OmmHg、 171.6mmHg)の応答電流値の変化率（％)を求めた。また、 比較例 5として、前記比較例 1のグルコースセンサについても同様にして測定を行い 、変化率（％)を求めた。これらの結果を図 4に示す。図 4は、試料中における溶存酸 素濃度と変化率 (％)との関係を示すグラフであり、図において△、〇、口、▽はそれ ぞれ実施例 5であり、參は比較例 5である。なお、変化率 (％)は、絶対値が大きい程 、応答電流が変化したことになる。
[0137] 変化率 (％) = [ (A/B)-l] X 100 ··· (10)
A ： 溶存酸素調整試料の応答電流
B ： 溶存酸素未調整試料の応答電流
[0138] 図 4に示すように、実施例 5によれば、試料の溶存酸素を増加させても、比較例 5に 比べて、変化率（％)の絶対値は小さカゝつた。このことから、スメクタイトを含む実施例 のグルコースセンサによれば、溶存酸素による感度低下が小さぐ試料等の溶液中 の溶存酸素の影響を軽減できることがわかった。
実施例 6
[0139] 酸化還元酵素として GODを用 、た本発明のダルコースセンサについて、試料中の 溶存酸素による影響を確認した例である。
[0140] 無機ゲル層形成液として、以下の最終濃度となるように調製した分散液を使用し、 酵素溶液として、 GDH水溶液の代りに 1200UZmLの GOD溶液 (天野社製）を使 用し、 [Ru(NH ) ]C1の代りにフェリシアンィ匕カリウム (和光純薬工業社製)を、 ACE
3 6 3
S緩衝液の代りに Tris— HC1緩衝液 (pH7.4：同仁ィ匕学研究所製)を使用した以外 は、前記実施例 1と同様にしてグルコースセンサを作製した。
[0141]
ルーセンタイト SWN 0. 3 % (w/v)
CHAP S 0. 1 % (w/v)
T r i s - H c l緩衝液 l O OmM
フェリシアン化カリウム 3. 0 % (w/v) [0142] なお、比較例 6としては、無機ゲル層および酵素試薬層を形成する代りに、 GOD1 200UZmLおよびフェリシアン化カリウム 3. 0% (w/v)を含む溶液 1 μ Lを検出部 に注入し、乾燥する以外は、前記実施例 6と同様にしてバイオセンサを作製した。
[0143] ヒト全血にグルコースを添カ卩して、グルコース濃度を 600mgZl00mLになるように 試料を調製し、さらに溶存酸素が 48. 9mmHg (未調整）、 106. 4mmHg、および 1 80. 4mmHgになるようにそれぞれ調節した。溶存酸素濃度は、前記実施例 5と同様 に、溶存酸素未調整の前記試料を、試験管内で酸素と混和することによって、高濃 度に調整した。
[0144] ヒト全血にグルコースを添カ卩して、グルコース濃度 600mgZl00mLの試料を調製 した。そして、前記グルコースセンサの電極間に 500mVの電圧を印加し、試料点着 5秒後の応答電流値を測定した。比較例 6のグルコースセンサについても同様にして 測定を行った。そして、実施例 6および比較例 6について、前記実施例 5と同様に、 溶存酸素未調整 (48. 9mmHg)の試料に対する前記応答電流値を基準として、前 記式（10)より、各試料 (溶存酸素 106. 4mmHg、 180. 4mmHg)に対する応答電 流値の変化率（％)を求めた。これらの結果を図 5に示す。図 5は、試料中における溶 存酸素濃度と変化率 (％)との関係を示すグラフであり、同図において〇が実施例 6、 參が比較例 6の結果である。
[0145] 図 5に示すように、酸ィ匕還元酵素として GODを用いた実施例 6によっても、比較例 6 に比べて、試料中の溶存酸素による感度低下が小さぐ溶存酸素の影響を軽減でき たことがわかった。
実施例 7
[0146] 実施例 7は、界面活性剤として CHAPS (両性界面活性剤）を、アミン系緩衝剤とし て ACES緩衝液をそれぞれ用 ヽた実施例 1で作製したダルコースセンサを使用した 。一方、比較例 7としては、界面活性剤として CHAPSに代えてコール酸 (ァ-オン系 界面活性剤）を使用し、緩衝剤として ACESに代えてリン酸ナトリウムを使用した以外 は、前記実施例 1と同様にしてグルコースセンサを作製して、これを用いた。
[0147] ヒト全血にグルコースを添カ卩して、グルコース濃度 lOOmgZlOOmLの試料を調製 し、さらに溶存酸素が 34. 7mmHg (未調整）、 117. lmmHg、および 185. 3mmH g付近になるようにそれぞれ調節した。溶存酸素濃度は、前記実施例 5と同様に、溶 存酸素未調整の前記試料を、試験管内で酸素と混和することによって、高濃度に調 整した。
[0148] そして、グルコースセンサの電極間に 200mVの電圧を印加してから、前記試料を 点着し、点着 5秒後の応答電流値を測定した。これらの各グルコースセンサについて 、溶存酸素未調整の試料に対する前記応答電流値を基準として、前記式（10)より、 他の試料に対する応答電流値の変化率（％)を求めた。また、比較例 7も、前記ダル コースセンサを用いて同様にして測定を行い、変化率（％)を求めた。これらの結果を 図 6に示す。図 6は、試料中における溶存酸素濃度と変化率 (％)との関係を示すグ ラフであり、同図において〇が実施例 7、參が比較例 7の結果である。
[0149] 図 6に示すように、両性界面活性剤でなくァニオン性界面活性剤を用い、緩衝剤と してアミン系緩衝剤でなくリン酸ナトリウムを用いた比較例 7のグルコースセンサでは、 スメクタイトを含有しているにも拘わらず、実施例 7と比較して、溶存酸素の影響を多 大に受けていることがわかる。このことから、実施例のように、両性界面活性剤および アミン系緩衝剤の存在下で、スメクタイトを含む無機ゲル層を形成することによって、 試料中の酸素による影響を防止できることがわかる。また、比較例のようにァ-オン性 界面活性剤を用いた場合、分散液を電極上に載せ難ぐ作製自体が困難であった。 実施例 8
[0150] 以下に示す方法により、無機ゲル形成液を調製した以外は、前記実施例 1と同様 にしてバイオセンサを作製した。
[0151] 合成スメクタイト（商品名ルーセンタイト SWN :コープケミカル社製） 0. 6g、 10% (w Zv) CHAPS (同仁ィ匕学研究所製)水溶液 lgおよび精製水 98. 4gとを混合し (合計 lOOg)、このスメクタイト懸濁液をー晚攪拌した。攪拌後の懸濁液 40gに、 2Nの HC1 (4g)を添加して一晩 (約 24時間)攪拌した (攪拌機：商品名マグネチックスターラー HS—3E ;株式会社井内盛栄堂製)。 HC1の添カ卩によって、前記懸濁液は白濁したが 、ー晚攪拌した後、透明となった。さらに、この懸濁液に、 200mMコハク酸 酢酸 Na 緩衝液 (pH4. 5)を、 1 : 1となるように混合した。この緩衝液を混合した後の懸濁液は 、その pHが約 4. 5であった。前記緩衝剤をカ卩えた懸濁液に、さらにメディエータとし て [Ru(NH) ]C1 (アルドリッチ社製)を 5% (w/v)となるように添加して、これを無機
3 6 3
ゲル層形成液とした。なお、この無機ゲル形成液における組成物の最終濃度を以下 に示す。
[0152]
ルーセンタイト S WN 0. 3 % (w/ v )
CHAP S 0. 3 % (w/v ) コハク酸 酢酸 N a緩衝液 （p H4. 5) 1 0 0 mM
[R u (NH ,) J C 1 , 5. 0 % (w/v) 産業上の利用可能性
[0153] 以上のように、本発明のバイオセンサの製造方法によれば、例えば、試料中の測定 対象物を間接的に測定するための還元型メディエータが、測定雰囲気中の酸素や 試料中の溶存酸素等によって再酸ィ匕されることを防止できるため、前記還元型メディ エータの再酸ィ匕による測定誤差が解消され、測定精度に優れるノィォセンサを提供 できる。

Claims

請求の範囲
[I] ノィォセンサの製造方法であって、
電極を有する基板を準備し、前記電極表面に、少なくともメディエータと界面活性 剤と緩衝剤と層状無機化合物とを含有する無機ゲル層を形成する工程を含むバイオ センサの製造方法。
[2] 前記界面活性剤が両性界面活性剤である請求項 1記載の製造方法。
[3] 前記両性界面活性剤が、同一分子内に正電荷と負電荷とを有する界面活性剤で ある請求項 2記載の製造方法。
[4] 前記両性界面活性剤が、アルキルアミノカルボン酸塩、カルボキシベタイン、スルホ ベタインおよびホスホベタインカ なる群力 選択された少なくとも一つの界面活性剤 である請求項 3記載の製造方法。
[5] 前記両性界面活性剤が、同一分子内に正電荷と負電荷とを有し、かつ、前記正電 荷と負電荷とが離間している界面活性剤である請求項 2記載の製造方法。
[6] 前記両性界面活性剤が、カルボキシベタイン、スルホベタインおよびホスホべタイン 力 なる群力 選択された少なくとも一つの界面活性剤である請求項 5記載の製造方 法。
[7] 前記両性界面活性剤が、アルキルジメチルァミノ酢酸べタインである請求項 2記載 の製造方法。
[8] 前記両性界面活性剤が、 CHAPS, CHAPSOおよびアルキルヒドロキシスルホべ タイン力 なる群力 選択された少なくとも一つのスルホベタインである請求項 2記載 の製造方法。
[9] 前記緩衝剤がアミン系緩衝剤である請求項 1または 2記載の製造方法。
[10] 前記アミン系緩衝剤力 Tris、 ACES, CHES、 CAPSO、 TAPS, CAPS, Bis— T ris、 TAPSO、 TES、 Tricineおよび AD Aからなる群から選択された少なくとも一つ の物質である請求項 9記載の製造方法。
[I I] 前記緩衝剤がカルボキシル基を有する緩衝剤である請求項 1または 2記載の製造 方法。
[12] 前記カルボキシル基を有する緩衝剤力 酢酸 酢酸 Na緩衝剤、リンゴ酸ー酢酸 Na 緩衝剤、マロン酸 酢酸 Na緩衝剤およびコハク酸一酢酸 Na緩衝剤力もなる群力も選 択された少なくとも一つの緩衝剤である請求項 11記載の製造方法。
[13] 少なくともメディエータと界面活性剤と緩衝剤と層状無機化合物とを含有する分散 液を塗布することによって、前記無機ゲル層を形成する請求項 1または 2記載の製造 方法。
[14] 界面活性剤と層状無機化合物とを分散媒に分散させた後、緩衝剤を添加し、さらに 、メディエータを添加することによって前記分散液を調製する請求項 13記載の製造 方法。
[15] 層状無機化合物を分散媒に分散させた後、界面活性剤を添加し、続いて、ァミン 系緩衝剤を添加してから、さらに、メディエータを添加することによって前記分散液を 調製する請求項 14記載の製造方法。
[16] 前記メデイエータが、フアリシアン化カリウム、シトクロム C、 PQQ、 NAD+、 NADP+、 銅錯体およびルテニウム錯体力 なる群力 選択された少なくとも一つの物質である 請求項 15記載の製造方法。
[17] 前記アミン系緩衝剤を添加した後の分散液の pH力 5— 9の範囲である請求項 15 記載の製造方法。
[18] 層状無機化合物を分散媒に分散させ、強酸性条件下で攪拌した後、界面活性剤 を添カ卩し、続いてカルボキシル基を有する緩衝剤を添カ卩してから、さらに、メディエー タを添加することによって前記分散液を調製する請求項 14記載の製造方法。
[19] 前記メディエータが、ルテニウム錯体、オスミウム錯体、フエ口セン、フエナジンメトサ ルフェート、インドフエノールおよびメチレンブルーからなる群から選択された少なくと も一つの物質である請求項 18記載の製造方法。
[20] 前記強酸性条件が、 pHl— 3の範囲である請求項 18記載の製造方法。
[21] カルボキシル基を有する緩衝剤を添カ卩した後の分散液の pH力 3— 6の範囲であ る請求項 18記載の製造方法。
[22] 前記無機ゲル層が、前記メディエータの自然酸化を防止する層である請求項 1記 載の製造方法。
[23] 前記無機ゲル層の上に、さらに酸化還元酵素を含有する層を形成する請求項 1記 載の製造方法。
[24] 前記分散液に、さらに酸化還元酵素を含有させ、前記酸化還元酵素を含有する無 機ゲル層を形成する請求項 13記載の製造方法。
[25] 前記層状無機化合物が、層状粘土鉱物である請求項 1記載の製造方法。
[26] 前記層状粘土鉱物が、膨潤性層状粘土鉱物である請求項 25記載の製造方法。
[27] 前記分散液における層状無機化合物と界面活性剤との添加割合が、層状無機化 合物 0. 3gに対して、界面活性剤 1一 200mmolの範囲である請求項 13記載の製造 方法。
[28] 前記分散液における層状無機化合物と緩衝剤との添加割合が、層状無機化合物 0 . 3gに対して、緩衝剤 1一 lOOOmMの範囲である請求項 13記載の製造方法。
[29] 前記酸化還元酵素が、グルコースォキシダーゼ（GOD)、ビラノースォキシダーゼ、 グルコースデヒドロゲナーゼ（GDH)、乳酸ォキシダーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、フ ルクトースデヒドロゲナーゼ、ガラクトースォキシダーゼ、コレステロールォキシダーゼ 、コレステロ一ノレデヒドロゲナーゼ、ァノレコーノレオキシダーゼ、ァノレコーノレデヒドロゲ ナーゼ、ピリルビン酸ォキシダーゼ、グルコース 6—リン酸デヒドロゲナーゼ、アミノ酸 デヒドロゲナーゼ、ギ酸デヒドロゲナーゼ、グリセローノレデヒドロゲナーゼ、アシノレー Co Aォキシダーゼ、コリンォキシダーゼ、 4ーヒドロキシ安息香酸ヒドロキシラーゼ、マレイ ン酸デヒドロゲナーゼ、サルコシンォキシダーゼおよびゥリカーゼからなる群力 選択 された少なくとも一つの酵素である請求項 23または 24記載の製造方法。
[30] 前記メディエータが、フェリシアン化カリウム、 p—べンゾキノンならびにその誘導体、 インドフエノール誘導体、 j8—ナフトキノン 4ースルホン酸カリウム、フエ口セン誘導体 、オスミウム錯体、ルテニウム錯体、 NAD+、 NADP+、ピロ口キノリンキノン（PQQ)、メ チレンブルー、 cytochrome c、 cytochrome bおよび銅錯体からなる群から選択された 少なくとも一つの物質である請求項 1記載の製造方法。
[31] 請求項 1記載のバイオセンサの製造方法により製造したバイオセンサ。
PCT/JP2004/016085 2003-10-30 2004-10-29 バイオセンサおよびその製造方法 WO2005043146A1 (ja)

Priority Applications (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE602004028267T DE602004028267D1 (de) 2003-10-30 2004-10-29 Biosensor und verfahren zu dessen herstellung
US10/572,423 US20070034512A1 (en) 2003-10-30 2004-10-29 Biosensor and method for producing the same
EP04793193A EP1679508B1 (en) 2003-10-30 2004-10-29 Biosensor and method for preparation thereof
AT04793193T ATE475085T1 (de) 2003-10-30 2004-10-29 Biosensor und verfahren zu dessen herstellung
JP2005515161A JP4088312B2 (ja) 2003-10-30 2004-10-29 バイオセンサおよびその製造方法

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2003-371198 2003-10-30
JP2003371198 2003-10-30

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2005043146A1 true WO2005043146A1 (ja) 2005-05-12

Family

ID=34543937

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2004/016085 WO2005043146A1 (ja) 2003-10-30 2004-10-29 バイオセンサおよびその製造方法

Country Status (8)

Country Link
US (1) US20070034512A1 (ja)
EP (1) EP1679508B1 (ja)
JP (1) JP4088312B2 (ja)
KR (1) KR100814193B1 (ja)
CN (1) CN100456032C (ja)
AT (1) ATE475085T1 (ja)
DE (1) DE602004028267D1 (ja)
WO (1) WO2005043146A1 (ja)

Cited By (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2006349412A (ja) * 2005-06-14 2006-12-28 National Institute Of Advanced Industrial & Technology クレアチニンバイオセンサ
JP2009244012A (ja) * 2008-03-31 2009-10-22 Cci Corp バイオセンサ
JP2009247289A (ja) * 2008-04-08 2009-10-29 Toyobo Co Ltd グルコースの定量方法ならびに定量組成物
JP2010054378A (ja) * 2008-08-28 2010-03-11 Tanita Corp バイオセンサ、その製造方法、その使用方法
US20100187107A1 (en) * 2006-07-12 2010-07-29 Arkray, Inc. Enzyme electrode
JP2010256357A (ja) * 2009-04-24 2010-11-11 Lifescan Scotland Ltd 酵素試薬インクの製造方法
JP2010266434A (ja) * 2009-04-24 2010-11-25 Lifescan Scotland Ltd 分析テストストリップ
WO2012042903A1 (ja) * 2010-09-30 2012-04-05 パナソニック株式会社 試薬組成物、センサ、センサシステム及びセンサの製造方法
EP2573191A1 (en) 2011-09-26 2013-03-27 ARKRAY, Inc. Glucose sensor
JP2013083637A (ja) * 2011-09-26 2013-05-09 Arkray Inc 乳酸センサ
US8569004B2 (en) 2005-11-10 2013-10-29 Toyo Boseki Kabushiki Kaisha Method for improving heat stability of composition containing water-soluble coenzyme-bound glucose dehydrogenase (GDH)
JP2015139376A (ja) * 2014-01-27 2015-08-03 東洋紡株式会社 グルコースデヒドロゲナーゼ組成物
JP2017090429A (ja) * 2015-11-11 2017-05-25 ▲き▼芯科技股▲ふん▼有限公司 電気化学センシング試験片の製作方法
JP2018054555A (ja) * 2016-09-30 2018-04-05 アークレイ株式会社 バイオセンサ、その製造方法、グルコース又はラクテートの濃度測定方法及び濃度測定システム
EP3415634A1 (en) 2017-06-13 2018-12-19 ARKRAY, Inc. Biosensor and measuring method using the same
EP3885761A1 (en) 2020-03-27 2021-09-29 ARKRAY, Inc. Biosensor and measurement method using the same
EP4245857A1 (en) 2022-03-17 2023-09-20 ARKRAY, Inc. Method for electrochemically measuring oxidoreductase using a biosensor, and biosensor used therein
EP4266038A1 (en) 2022-04-21 2023-10-25 ARKRAY, Inc. Biosensor
EP4266037A1 (en) 2022-04-21 2023-10-25 ARKRAY, Inc. Biosensor and method for manufacturing biosensor

Families Citing this family (33)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20020048425A (ko) * 1999-09-30 2002-06-22 해리 제이. 레온 하르트 마이크로전자 어레이 상의 생체분자 부착 부위
US6960298B2 (en) 2001-12-10 2005-11-01 Nanogen, Inc. Mesoporous permeation layers for use on active electronic matrix devices
US7816025B2 (en) * 2006-08-23 2010-10-19 Canon Kabushiki Kaisha Enzyme electrode, enzyme electrode producing method, sensor and fuel cell each using enzyme electrode
US7687103B2 (en) * 2006-08-31 2010-03-30 Gamida For Life B.V. Compositions and methods for preserving permeation layers for use on active electronic matrix devices
MX2009002830A (es) 2006-09-22 2009-05-28 Bayer Healthcare Llc Sistema biosensor que tiene estabilidad y desempeño de hematocrito mejorados.
KR100890988B1 (ko) * 2007-10-29 2009-03-31 주식회사 아이센스 일정 소량의 시료를 균일하게 도입할 수 있는 시료도입부를구비한 전기화학적 바이오센서
WO2009076433A1 (en) 2007-12-10 2009-06-18 Bayer Healthcare Llc Reagents and methods for detecting analytes
ES2555215T3 (es) * 2008-12-08 2015-12-29 Bayer Healthcare Llc Composiciones de reactivo de bajo contenido salino total y sistemas para biosensores
US8956518B2 (en) * 2011-04-20 2015-02-17 Lifescan, Inc. Electrochemical sensors with carrier field
JP5834599B2 (ja) * 2011-08-01 2015-12-24 オムロンヘルスケア株式会社 センサヘッド、電気化学的センサおよび電気化学的センサの使用方法
US20130098775A1 (en) * 2011-10-20 2013-04-25 Nova Biomedical Corporation Glucose biosensor with improved shelf life
EA201491808A1 (ru) 2012-04-19 2015-03-31 Луоксис Дайэгностикс, Инк. Многослойный гель
US9606080B2 (en) 2012-09-06 2017-03-28 Amrita Vishwa Vidyapeetham Non-enzymatic glucose sensor
CN102914571B (zh) * 2012-09-13 2014-07-09 华南师范大学 一种葡萄糖检测装置及其检测方法
US9788765B2 (en) 2012-09-28 2017-10-17 Dexcom, Inc. Zwitterion surface modifications for continuous sensors
WO2014066533A2 (en) 2012-10-23 2014-05-01 Luoxis Diagnostics, Inc. Methods and systems for measuring and using the oxidation-reduction potential of a biological sample
WO2014150876A2 (en) * 2013-03-15 2014-09-25 Abbott Point Of Care Inc Biosensor structures for improved point of care testing and methods of manufacture thereof
US9737250B2 (en) 2013-03-15 2017-08-22 Dexcom, Inc. Membrane for continuous analyte sensors
WO2015020149A1 (ja) 2013-08-07 2015-02-12 アークレイ株式会社 電気化学式バイオセンサを用いた物質の測定方法及び測定装置
CN103884757A (zh) * 2014-04-18 2014-06-25 苏州怡拓生物传感技术有限公司 一种用于葡萄糖检测的酶电极连续化生产的方法
US20160017399A1 (en) * 2014-07-17 2016-01-21 Lifescan Scotland Limited Electrochemical-based analytical test strip with enzymatic reagent layer containing a naphthoquinone-based mediator and fad-gdh
JP6773406B2 (ja) * 2014-12-24 2020-10-21 アークレイ株式会社 酵素電極
GB201507507D0 (en) * 2015-04-30 2015-06-17 Inside Biometrics Ltd Electrochemical test device
EP4218566A1 (en) 2015-12-30 2023-08-02 Dexcom, Inc. Enzyme immobilized adhesive layer for analyte sensors
CN106525939B (zh) * 2016-11-04 2018-07-06 北京农业信息技术研究中心 原位实时监测植物中果糖含量的微电极生物传感器及其应用
KR101749904B1 (ko) * 2016-12-13 2017-06-23 환인제약 주식회사 바이오센서용 산화환원반응 시약조성물
US10359344B2 (en) * 2017-04-21 2019-07-23 Korea Research Institute Of Chemical Technology Composition for clearing of biotissue and clarity method for biotissue using thereof
GB2566516A (en) 2017-09-15 2019-03-20 Univ Oxford Innovation Ltd Electrochemical recognition and quantification of cytochrome c oxidase expression in bacteria
CN108802157A (zh) * 2018-06-22 2018-11-13 桂林中辉科技发展有限公司 一种总胆汁酸检测试剂、试纸及检测方法与应用
DK3947708T3 (da) * 2019-04-05 2024-03-11 Instr Laboratory Co Fremgangsmåde og system til forbedret kalibrering af kreatinin/kreatin-sensorer
CN111154126B (zh) * 2020-01-16 2022-05-24 哈尔滨工业大学 一种纳米金刚石修饰氮化硼高柔性高导热复合薄膜的制备方法
KR102411089B1 (ko) * 2020-03-06 2022-06-20 (주)케어포유 바이오 센서용 조성물 및 이를 포함하는 바이오 센서
CN116144390B (zh) * 2022-12-02 2024-06-21 西安工程大学 相间转移型油泥处理剂及其应用

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH02231558A (ja) * 1989-03-03 1990-09-13 Terumo Corp グルコースセンサ
EP0884392A1 (en) 1997-06-03 1998-12-16 Matsushita Electric Industrial Co., Ltd. Cholesterol sensor
JPH112618A (ja) * 1997-06-11 1999-01-06 Matsushita Electric Ind Co Ltd コレステロールセンサおよびその製造方法
WO2001036954A1 (fr) * 1999-11-15 2001-05-25 Arkray, Inc. Biodetecteur
WO2002035222A1 (fr) * 2000-10-27 2002-05-02 Arkray, Inc. Biocapteur

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1989009397A1 (en) * 1988-03-31 1989-10-05 Matsushita Electric Industrial Co., Ltd. Biosensor and process for its production
US5205920A (en) * 1989-03-03 1993-04-27 Noboru Oyama Enzyme sensor and method of manufacturing the same
EP0860695B1 (en) * 1995-10-30 2006-01-04 Arkray, Inc. Method for measuring an analyte and corresponding device
US6258229B1 (en) * 1999-06-02 2001-07-10 Handani Winarta Disposable sub-microliter volume sensor and method of making
JP2003015168A (ja) * 2001-04-27 2003-01-15 Canon Inc 電気泳動粒子、電気泳動粒子の製造方法、および電気泳動表示素子
CN1372137A (zh) * 2002-04-05 2002-10-02 中国科学院长春应用化学研究所 用于生物化学需氧量生物传感器的微生物有机－无机杂化材料膜
JP3910148B2 (ja) * 2003-03-14 2007-04-25 アークレイ株式会社 排気口付き分析用具

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH02231558A (ja) * 1989-03-03 1990-09-13 Terumo Corp グルコースセンサ
EP0884392A1 (en) 1997-06-03 1998-12-16 Matsushita Electric Industrial Co., Ltd. Cholesterol sensor
JPH112618A (ja) * 1997-06-11 1999-01-06 Matsushita Electric Ind Co Ltd コレステロールセンサおよびその製造方法
WO2001036954A1 (fr) * 1999-11-15 2001-05-25 Arkray, Inc. Biodetecteur
EP1235068A1 (en) 1999-11-15 2002-08-28 ARKRAY, Inc. Biosensor
WO2002035222A1 (fr) * 2000-10-27 2002-05-02 Arkray, Inc. Biocapteur
EP1336839A1 (en) 2000-10-27 2003-08-20 ARKRAY, Inc. Biosensor

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
COSNIER, S. ET AL.: "A new strategy for the construction of amperometric dehydrogenase electrodes based on laponite gel-methylene blue polymer as the host matrix", JOURNAL OF ELECTROANALYTICAL CHEMISTRY, vol. 406, no. 1, 1996, pages 243 - 246, XP002983673 *
OHSAKA, T. ET AL.: "A New Amperometric Glucose Sensor Based on Bilayer Film Coating of Redox-Active Clay Film and Glucose Oxidase Enzyme Film", BULLETIN OF THE CHEMICAL SOCIETY OF JAPAN, vol. 63, no. 9, 1990, pages 2646 - 2652, XP002983672 *
POYARD, S. ET AL.: "A new method for the controlled immobilization of enzyme in inorganic gels (laponite) for amperometric glucose biosensing", SENSORS AND ACTUATORS B, vol. 33, no. 1, 1996, pages 44 - 49, XP000632923 *
ZEN, J.M. ET AL.: "A Glucose Sensor Made of an Enzymatic Clay-Modified Electrode and Methyl Viologen Mediator", ANALYTICAL CHEMISTRY, vol. 68, no. 15, 1996, pages 2635 - 2640, XP000623885 *
ZEN, J.M. ET AL.: "An Enzymatic Clay-Modified Electrode for Aerobic Glucose Monitoring with Dopamine as Mediator", ANALYTICAL CHEMISTRY, vol. 69, no. 8, 1997, pages 1669 - 1773, XP000690170 *

Cited By (29)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2006349412A (ja) * 2005-06-14 2006-12-28 National Institute Of Advanced Industrial & Technology クレアチニンバイオセンサ
US8569004B2 (en) 2005-11-10 2013-10-29 Toyo Boseki Kabushiki Kaisha Method for improving heat stability of composition containing water-soluble coenzyme-bound glucose dehydrogenase (GDH)
US20100187107A1 (en) * 2006-07-12 2010-07-29 Arkray, Inc. Enzyme electrode
US8784624B2 (en) * 2006-07-12 2014-07-22 Arkray, Inc. Enzyme electrode
JP2009244012A (ja) * 2008-03-31 2009-10-22 Cci Corp バイオセンサ
JP2009247289A (ja) * 2008-04-08 2009-10-29 Toyobo Co Ltd グルコースの定量方法ならびに定量組成物
JP2010054378A (ja) * 2008-08-28 2010-03-11 Tanita Corp バイオセンサ、その製造方法、その使用方法
JP2010266434A (ja) * 2009-04-24 2010-11-25 Lifescan Scotland Ltd 分析テストストリップ
JP2010256357A (ja) * 2009-04-24 2010-11-11 Lifescan Scotland Ltd 酵素試薬インクの製造方法
US10761045B2 (en) 2010-09-30 2020-09-01 Phc Holdings Corporation Sensor, sensor system, method of manufacturing sensor, and method of measuring concentration of target substance
US10571424B2 (en) 2010-09-30 2020-02-25 Phc Holdings Corporation Sensor, sensor system, method of manufacturing sensor, and method of measuring concentration of target substance
WO2012042903A1 (ja) * 2010-09-30 2012-04-05 パナソニック株式会社 試薬組成物、センサ、センサシステム及びセンサの製造方法
JPWO2012042903A1 (ja) * 2010-09-30 2014-02-06 パナソニック株式会社 試薬組成物、センサ、センサシステム及びセンサの製造方法
US9594044B2 (en) 2010-09-30 2017-03-14 Panasonic Healthcare Holdings Co., Ltd. Reagent composition, sensor, sensor system, and sensor manufacture process
US8999126B2 (en) 2011-09-26 2015-04-07 Arkray, Inc. Lactate sensor
JP2013083637A (ja) * 2011-09-26 2013-05-09 Arkray Inc 乳酸センサ
TWI503540B (zh) * 2011-09-26 2015-10-11 Arkray Inc 乳酸感測器、乳酸濃度之測定方法、乳酸感測器之製造方法及乳酸濃度測定系統
US8658011B2 (en) 2011-09-26 2014-02-25 Arkray, Inc. Glucose sensor
EP2573191A1 (en) 2011-09-26 2013-03-27 ARKRAY, Inc. Glucose sensor
JP2015139376A (ja) * 2014-01-27 2015-08-03 東洋紡株式会社 グルコースデヒドロゲナーゼ組成物
JP2017090429A (ja) * 2015-11-11 2017-05-25 ▲き▼芯科技股▲ふん▼有限公司 電気化学センシング試験片の製作方法
CN107884462A (zh) * 2016-09-30 2018-04-06 爱科来株式会社 生物传感器、其制造方法、葡萄糖或乳酸的浓度测定方法和浓度测定系统
US10697922B2 (en) 2016-09-30 2020-06-30 Arkray, Inc. Biosensor, production method thereof, and method and system for measuring glucose or lactate
JP2018054555A (ja) * 2016-09-30 2018-04-05 アークレイ株式会社 バイオセンサ、その製造方法、グルコース又はラクテートの濃度測定方法及び濃度測定システム
EP3415634A1 (en) 2017-06-13 2018-12-19 ARKRAY, Inc. Biosensor and measuring method using the same
EP3885761A1 (en) 2020-03-27 2021-09-29 ARKRAY, Inc. Biosensor and measurement method using the same
EP4245857A1 (en) 2022-03-17 2023-09-20 ARKRAY, Inc. Method for electrochemically measuring oxidoreductase using a biosensor, and biosensor used therein
EP4266038A1 (en) 2022-04-21 2023-10-25 ARKRAY, Inc. Biosensor
EP4266037A1 (en) 2022-04-21 2023-10-25 ARKRAY, Inc. Biosensor and method for manufacturing biosensor

Also Published As

Publication number Publication date
JP4088312B2 (ja) 2008-05-21
KR100814193B1 (ko) 2008-03-17
CN1875265A (zh) 2006-12-06
JPWO2005043146A1 (ja) 2007-05-10
EP1679508A4 (en) 2009-04-08
US20070034512A1 (en) 2007-02-15
EP1679508A1 (en) 2006-07-12
ATE475085T1 (de) 2010-08-15
DE602004028267D1 (de) 2010-09-02
CN100456032C (zh) 2009-01-28
EP1679508B1 (en) 2010-07-21
KR20060063996A (ko) 2006-06-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2005043146A1 (ja) バイオセンサおよびその製造方法
US6916410B2 (en) Biosensor
EP1336839B1 (en) Biosensor
EP2573190B1 (en) Lactate sensor
JP4464817B2 (ja) 酵素電極および製造方法
EP2573191B1 (en) Glucose sensor
EP3301183B1 (en) Biosensor, production method thereof, and method and system for measuring glucose or lactate
Seleci et al. Amine-intercalated montmorillonite matrices for enzyme immobilization and biosensing applications
Yilmaz et al. 4-aminothiophenol-intercalated montmorillonite: Organic-inorganic hybrid material as an immobilization support for biosensors
Gao et al. Hemoglobin niobate composite based biosensor for efficient determination of hydrogen peroxide in a broad pH range
Grinyte et al. Biocatalytic etching of semiconductor cadmium sulfide nanoparticles as a new platform for the optical detection of analytes
Oliveira-Brett et al. Electrochemistry of nanoscale DNA surface films on carbon
DE4241206C2 (de) Dickschicht-Bezugselektrode
JP6721442B2 (ja) アスコルビン酸応答電極およびバイオセンサ
WO2002103003A1 (en) Lipid-modified enzymes, process for producing the same and biosensor
Katsuki et al. Biosensor
Yagi et al. Biosensor
WO2007108388A1 (ja) バイオセンサの製造方法、及びバイオセンサ
JP2010233545A (ja) ポリオールの測定方法
Roy et al. Selective Detection of Cholesterol Using Carbon Nanotube Based Biochip
JP2006280360A (ja) Ｐｑｑｇｄｈの基質阻害を回避する方法

Legal Events

Date Code Title Description
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 200480032554.4

Country of ref document: CN

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2005515161

Country of ref document: JP

AK Designated states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AE AG AL AM AT AU AZ BA BB BG BR BW BY BZ CA CH CN CO CR CU CZ DE DK DM DZ EC EE EG ES FI GB GD GE GH GM HR HU ID IL IN IS JP KE KG KP KR KZ LC LK LR LS LT LU LV MA MD MG MK MN MW MX MZ NA NI NO NZ OM PG PH PL PT RO RU SC SD SE SG SK SL SY TJ TM TN TR TT TZ UA UG US UZ VC VN YU ZA ZM ZW

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): GM KE LS MW MZ NA SD SL SZ TZ UG ZM ZW AM AZ BY KG KZ MD RU TJ TM AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HU IE IT LU MC NL PL PT RO SE SI SK TR BF BJ CF CG CI CM GA GN GQ GW ML MR NE SN TD TG

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2007034512

Country of ref document: US

Ref document number: 10572423

Country of ref document: US

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 1020067007785

Country of ref document: KR

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2004793193

Country of ref document: EP

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 1020067007785

Country of ref document: KR

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 2004793193

Country of ref document: EP

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 10572423

Country of ref document: US