WO2005043146A1

WO2005043146A1 - バイオセンサおよびその製造方法

Info

Publication number: WO2005043146A1
Application number: PCT/JP2004/016085
Authority: WO
Inventors: Hideaki Yamaoka; Tomomichi Tsujimoto
Original assignee: Arkray, Inc.
Priority date: 2003-10-30
Filing date: 2004-10-29
Publication date: 2005-05-12
Also published as: JP4088312B2; ATE475085T1; EP1679508B1; US20070034512A1; EP1679508A1; CN100456032C; JPWO2005043146A1; CN1875265A; KR20060063996A; DE602004028267D1; KR100814193B1; EP1679508A4

Abstract

　メディエータに対する酸素の影響を回避し、かつ試料溶液中の測定対象物を、迅速かつ簡便に、高精度で測定できるバイオセンサを提供する。電極を有する基板を準備し、前記電極表面に、メディエータと界面活性剤と緩衝剤と層状無機化合物とを含有する溶媒を塗布して、前記メディエータの自然酸化を防止する無機ゲル層を形成し、さらに、前記層上に、酸化還元酵素を含む酵素試薬層を形成してバイオセンサを製造できる。このバイオセンサは、前記無機ゲル層によって、測定対象物と酸化還元酵素との反応によって還元されたメディエータが、溶存酸素等により再酸化されることなく、電気化学的に測定される。

Description

明細書

バイオセンサおよびその製造方法

技術分野

[0001] 本発明は、試料中の測定対象物を電気化学的に測定するバイオセンサに関する _c 背景技術

[0002] 従来、特定の測定対象物を含む試料液について、例えば、試料液の希釈や攪拌等を行わずに、簡便かつ迅速に前記測定対象物を定量できるバイオセンサが広く使用されている。このようなバイオセンサは、例えば、電気絶縁性の基板上に、スクリーン印刷等の方法によって作用極 (測定極ともいう）と対極とを有する電極系を形成し、その上に、前記測定対象物と反応する酸化還元酵素およびメディエータ (電子伝達物質)等を含む試薬層を形成することにより作製できる (例えば、特許文献 1参照)。この試薬層に、前記測定対象物を含む試料液を接触させると、前記酸化還元酵素の触媒作用によって、例えば、前記測定対象物が酸化され、前記メディエータが還元される。この還元されたメディエータ（以下、「還元型メディエータ」という）を、前記電極系を用いた電気化学的手法により再酸化し、これにより得られた酸化電流値から前記試料液中の測定対象物の濃度が算出できる。

[0003] しかしながら、反応雰囲気中に酸素が存在したり、試料液中に溶存酸素が存在する場合、前記還元型メディエータは、前述のように電気化学的に再酸ィ匕されるだけでなぐ前記酸素によっても再酸ィ匕されてしまう。このため、電気化学的な再酸化による酸ィ匕電流値に誤差が生じ、測定精度が低下するという問題があった。

[0004] このような問題を回避する方法として、例えば、窒素雰囲気下での測定等が考えられるが、これでは手間が力かり操作も煩雑となる。また、全く酸素が無い条件下では、酵素反応に酸素を必要とする酸ィ匕還元酵素を使用することができないという問題もあり、適用範囲が非常に狭くなる。

特許文献 1 :特開平 1 -291153号公報

発明の開示

発明が解決しょうとする課題 [0005] そこで、本発明の目的は、メディエータに対する酸素の影響を回避し、かつ試料液中の測定対象物を、迅速かつ簡便に、高精度で測定できるバイオセンサの提供である。

課題を解決するための手段

[0006] 前記目的を達成するために、本発明のバイオセンサの製造方法は、電極を有する基板を準備し、前記電極表面に、少なくともメディエータと界面活性剤と緩衝剤と層状無機化合物とを含有する無機ゲル層を形成する工程を含む製造方法である。

[0007] また、本発明のバイオセンサは、前記本発明の製造方法により製造したバイオセンサである。

発明の効果

[0008] 本発明者らは、ノィォセンサについて、試料中の測定対象物と酸化還元酵素との反応によって還元されたメディエータ (還元型メディエータ）が自然酸化されることを防止すベぐ鋭意研究を行った。その結果、一般に、例えば、層状無機化合物によつて無機ゲル層が形成されることは知られている力無機ゲル層がさらに界面活性剤および緩衝剤を含有することによって、前記還元型メディエータの自然酸化を防止する効果を発揮する無機ゲル層を形成できることを見出した。このような方法によって、前記自然酸ィ匕防止の効果が得られることは、本発明者らが初めて見出した事である。前述のような方法で無機ゲル層を形成すれば、試料中の測定対象物を間接的に測定するための前記還元型メディエータが、例えば、測定雰囲気中の酸素や試料中の溶存酸素等によって再酸ィ匕されることを防止できる。このため、前記還元型メディエータの再酸ィ匕による測定誤差が解消された、測定精度に優れるバイオセンサを提供できる。なお、本発明において、「前記メディエータの自然酸化」とは、例えば、ノィォセンサの使用時における液体試料中の溶存酸素や、空気中の水分に吸収された酸素（例えば、保存時に空気中水分が空気中酸素を吸収する）によって、前記メディエータが酸ィ匕されることをヽぅ。

[0009] 界面活性剤および緩衝剤存在下で無機ゲル層を形成することによって、酸化防止機能が発揮されるのは、おそらく以下に示すメカニズムによると推測される。

[0010] 例えば、前記メディエータと界面活性剤と緩衝剤と層状無機化合物とを含有する分散液を塗布して形成された前記無機ゲル層内におヽては、前記メディエータが前記層状無機化合物のシート内にしつ力りとはまり込んだ複合体を形成し、前記メデイエータが液体試料等に含まれる溶存酸素と接触するのを防止していると考えられる。通常、試料液中には酸素が溶存しているため、前述のように層状無機化合物が水をシャットアウトすることにより、前記メディエータに対する前記溶存酸素の攻撃を防止できるのである。そして、前述のようにさらに界面活性剤が存在することによって、層状無機化合物とメディエータとが重合して不溶化することなぐこれらの複合体が分散された状態となり、前記効果を十分に発揮できる無機ゲル層を形成できるのである。

[0011] また、前記分散液が緩衝剤を含むことによって、均一な無機ゲル層の形成が可能になり、酸ィ匕防止機能をより一層向上することができるのである。これは、前記緩衝剤力前記メディエータと層状無機化合物との複合体を形成する際にバインダーとして作用するためと考えられる。このノインダ一としての作用によって、メディエータと層状無機化合物との結合がより一層強固となった複合体が形成されるため、例えば、溶存酸素を含む液体をさらにシャットアウトでき、酸素によるメディエータの再酸ィ匕が防止できる。一方、この場合、前記界面活性剤は、前記緩衝剤と、層状無機化合物およびメディエータとが、重合体を形成して分散不可能になることを防止する、いわゆるブロック剤としての機能も果たすと考えられる。

[0012] 本発明のバイオセンサは、前述のような方法で製造することによって、例えば、メデイエータが、測定雰囲気中の酸素や試料中の溶存酸素等によって再酸化されることを防止できる。このため本発明のバイオセンサは、前記還元型メディエータの再酸ィ匕による測定誤差が解消され、測定精度に優れる。

[0013] 本発明の製造方法によって得られるバイオセンサは、酸化還元酵素からメディエータへの電子の授受は、水ではなぐ前記層状無機化合物の層間、つまり電気二重層を介して行われると考えられる。このため、水分が前記無機ゲル層によってシャットァゥトされる本発明のバイオセンサによれば、例えば、高湿度環境等においても劣化を防止できるという効果を奏するのである。また、前記層状無機化合物の電気二重層は、水よりも電子を通し易いため、反応速度の増大にもつながると考えられる。

[0014] また、本発明の製造方法によるバイオセンサは、上述のような酸素の遮断によって、例えば、酸ィ匕による電極の鲭の発生等も防止できる。

[0015] なお、本発明において、前記メディエータの自然酸ィ匕を防止する無機ゲル層を、「酸化防止層」ともいう。

図面の簡単な説明

[0016] [図 1]図 1は、本発明の実施形態において、バイオセンサの製造方法の一例を示す工程図であり、 (A)一 (F)は、それぞれ、各工程を示す。

[図 2]図 2は、前記実施形態におけるバイオセンサの断面図である。

[図 3]図 3は、本発明の実施例において、グルコースセンサで試料を測定した場合の電流値の経時変化を示すグラフであって、同図 (A)が実施例、同図（B)が比較例の結果をそれぞれ示す。

[図 4]図 4は、本発明のその他の実施例において、試料中における溶存酸素濃度と変化率 (％)との関係を示すグラフである。

[図 5]図 5は、本発明のさらにその他の実施例において、試料中における溶存酸素濃度と変化率 (％)との関係を示すグラフである。

[図 6]図 6は、本発明のさらにその他の実施例において、試料中における溶存酸素濃度と変化率 (％)との関係を示すグラフである。

発明を実施するための最良の形態

[0017] 本発明において、前記層状無機化合物は、層状粘土鉱物であることが好ましぐ特に好ましくは膨潤性粘土鉱物である。

[0018] 前記層状無機化合物とは、例えば、無機物の多面体が平面状に連なってシート構造を形成し、このシート構造がさらに層状に重なって結晶構造を形成したものということができる。前記多面体の形状としては、例えば、四面体シート、八面体シート等があり、具体的には、例えば、 Si四面体、 A1八面体等があげられる。このような層状無機化合物としては、例えば、層状粘土鉱物、ノ、イド口タルサイト、スメクタイト、ハロイサイト、カオリン鉱物、雲母等が含まれる。

[0019] 前記層状粘土鉱物とは、一般に、粘土 (細かい土状の無機粒状物で、水で湿った状態において可塑性を示すもの）の大半を占めるアルミニウムケィ酸塩鉱物があげられ、これは、通常、 Siが 4つの酸素原子（O)に囲まれた Si四面体と、 A1または Mgが 6 つの水酸基（OH基）あるいは 6つの酸素原子に囲まれた Al八面体または Mg八面体とを最小構成単位として、る。

[0020] 前記層状粘土鉱物の構造としては、例えば、前記 Si四面体が他の Si四面体と 1つの面を共有して、残る頂点の酸素原子を同方向に向けて六角網状のシートを形成し (以下「四面体シート」という）、一方、 A1八面体または Mg八面体が他の八面体と稜角を共有してシートを形成し (八面体シート）、前記四面体シートと前記八面体シートとが層状に積層された構造があげられる。具体的には、例えば、前記四面体シートと前記八面体シートとが 1枚ずつ重なった 1： 1層が、さらに何層も積層された構造の鉱物を 1： 1型鉱物； 2枚の四面体シートで 1枚の八面体シートを挟んだ 2： 1層が、さらに何枚も積層された構造の鉱物を 2 : 1型鉱物；前記 2 : 1層の層間に、さらにもう一枚の八面体シートが挟まれた構造の鉱物を 2 : 1： 1型鉱物と、それぞれ呼ばれている。また、例えば、八面体シートが、 Mg (OH)で全ての八面体位置に金属イオンを有する

2

ものを 3八面体型（Trioctahedral)といい、八面体シートが、 Al(OH)で 1Z3が空孔

3

になっているものを 2八面体型（Dioctahedral)という。この中でも、本発明における前記層状無機化合物としては、 2 : 1型鉱物が好ましい。

[0021] 前記層状無機化合物を構成する元素としては、例えば、リチウム、ナトリウム、力リウム、マグネシウム、アルミニウム、ケィ素、酸素、水素、フッ素、炭素等があげられ、いずれか一種類でもよいし、二種類以上で構成されてもよい。特に制限されないが、具体例として、例えば、下記式（1)一（9)に示すィ匕合物等があげられ、これらの化合物は、例えば、結晶水を含んでもよい。これらの下記式は、鉱物学的または化学的に純粋な化合物としての式であるが、実際には、例えば、ケィ酸ナトリウムなどの不純物を含む場合がある。このため、元素分析等によって化学式を定めた場合、これらの式と必ずしも一致しないことは、例えば、文献（D. W, Thompson, J. T. Butterworth, J. Colloid Interf. Sci., 151, 236- 243(1992))等においても記載されている。

[0022] M Si (Al Mg ) 0 X · · · (1)

x 4 2-x x 10 2

前記式（1)において、好ましくは、 Mは、 H、 Li、 Naおよび Kからなる群から選択された少なくとも一つであって、 Xは ΟΗおよび Fの少なくとも一方であって、は 2未満の正数である。 [0023] M (Si A1 )A1 O X · · · (2)

x 4-x x 12 10 2

前記式（2)において、好ましくは、 Mは、 H、 Li、 Naおよび Kからなる群から選択された少なくとも一つであって、 Xは ΟΗおよび Fの少なくとも一方であって、は 4未満の正数である。

[0024] M Si (Mg Li ) 0 X …（3)

x 4 3-x x 10 2

前記式（3)において、好ましくは、 Mは、 H、 Li、 Naおよび Kからなる群から選択された少なくとも一つであって、 Xは ΟΗおよび Fの少なくとも一方であって、は 3未満の正数である。

[0025] M (Si Al ) Mg O X · · · (4)

x 4-x x 3 10 2

前記式 (4)において、好ましくは、 Mは、 H、 Li、 Naおよび Kからなる群から選択された少なくとも一つであって、 Xは ΟΗおよび Fの少なくとも一方であって、は 4未満の正数である。

[0026] MSi Mg O X …（5)

4 2.5 10 2

前記式（5)において、 Mは、好ましくは Liおよび Naの少なくとも一方であり、より好ましくは Naであり、 Xは、好ましくは OHおよび Fの少なくとも一方であり、より好ましくは Fである。

[0027] M Si Mg O X · · · (6)

2 4 2 10 2

前記式（6)において、 Mは、好ましくは Liおよび Naの少なくとも一方であり、より好ましくは Liであり、 Xは、好ましくは OHおよび Fの少なくとも一方であり、より好ましくは F である。

[0028] Mg Al (OH) X · · · (7)

6 12 16 x

前記式（7)において、 Xは、好ましくはハロゲン、 NO、 SO、 COおよび OHからなる

3 4 3

群力選択された少なくとも一つの基およびァ-オン型有機酸の少なくとも一方であつて、より好ましくは COであり、は、 Xがハロゲン、 OH、 NOまたは一価有機酸のと

3 3

き、好ましくは 2であって、 Xが SO、 COまたは二価の有機酸のとき、好ましくは 1で

4 3

める。

[0029] Na Si (Mg Li ) 0 X · · · (8)

0.33 4 2.67 0.33 10 2

前記式（8)において、 Xは、好ましくは OHおよび Fの少なくとも一方であって、好ましくは OHである。

[0030] Na (Si Al ) (Mg A1 ) 0 X · · · (9)

a-b 4-a a 3-b b 10 2

前記式（9)において、 Xは、好ましくは OHおよび Fの少なくとも一方であり、好ましくは OHであり、は、好ましくは 4未満の正数であり、は、好ましくは 3未満の正数であり a b

、 a— b>0であることが好ましい。

[0031] 前記層状無機化合物の具体例としては、例えば、カオリナイト、ハロイサイト、蛇紋石等の 1 : 1型粘土鉱物；タルク、ノイロフィライト、スメクタイト、バーミキユライト (前記式 (2)で表されるもの、以下同様)、フッ素四ケィ素雲母 (前記式 (5) )やテニォナイト (前記式 (6) )を含む雲母等の 2： 1型粘土鉱物；クロライト等の 2： 1： 1型粘土鉱物； 2： 1一 2 : 1 : 1型の中間鉱物;ィモゴライト等の準晶質粘土鉱物;ァロフェン等の非晶質粘土鉱物;ハイド口タルサイト (前記式 (7) )等が挙げられる。

[0032] また、スメクタイトには、例えば、同型置換された四面体、八面体格子中のイオン種によってモンモリロナイト（前記式（1) )、モンモリロナイトが 40— 80%含まれる天然物であるベントナイト、パイデライト (前記式 (2) )等の 2八面体型；ヘクトライト (前記式 (3 )、好ましくは前記式 (8) )、サボナイト (前記式 (4)、好ましくは前記式（9) )、ノントロナイト等の ₃八面体型等が含まれる。

[0033] ハイド口タルサイトは、例えば、前記式（7)で表わされる。具体的には、例えば、 Mg

6

Al (OH) CO ·4Η Οで表される層状鉱物であって、 Mg (OH) (ブルーサイト：中

2 16 3 2 2

心に Mg²⁺を持つ酸素八面体の層が積み重なった構造を持つ）の Mg²⁺の一部力 A1 3⁺に同型置換している。これは正電荷を有するが、層間の CO ²によって電気的中性

3

を保っており、陰イオン交換能をもつものである。なお、ケィ酸塩鉱物ではないが、通常、粘土鉱物として取り扱われる。

[0034] 前述のような層状無機化合物の組成の例を、下記表 1に示す。なお、下記表 1において、「MI」は、 1価陽イオンで代表させた交換性陽イオンを示し、例えば、 H+、 Na+、

K+、 Li+等である。

[0035] [表 1] 鉱物名組成

力オリナイト（Kaolinite) Si ₂A1₂0₅ (OH) ₄

八ロイサイト Si₂Al₂0₅ (OH) ₄ · 2H₂0 蛇紋石 Si₂ (Mg²⁺,Fe ^{2 +}) ₃0₆ (OH) タルク (Talc) Si₄Mg₃ (OH) ₀

パイロフイライト（Pyrophyllite) S i ₄ Al ₂ (OH) ₂0

モンモリロナイト (Montmori 1 loni te) Mし S i ₄ (Al ₂— _x Mg_x ) 0 (OH) ₂ · nH₂0 パイデライト（Beidellite) MI _; (Si₄__xAl_x)Al₂0! (OH) ₂ · nH₂0 ヘクトライト（Hectori te) MI Si₄ (Mg₃— xLijO! (OH, F) • nH₂0 サボナイト（Saponite) MI _: (Si₄__xAl_x)Mg₃0₁ (OH) , ■ nH₂0 ノントロナイト（Nontronitc) MI (Si₄__xAl_x)Fe₂0₁₀ (OH) nH₂0 ノ一ミキユライト（Vcrmicul i te) MI (Si₄__xAl_x) Al (OH) nH,0 ハイド口タルサイト（Hydrotalci te) g₆Al ₂ (OH) j ₆C0₃ - 4H₂0

[0036] 前記層状無機化合物の平均孔径は、特に限定されないが、例えば、溶媒に対して均一に分散できる程度の粒径であることが好ましい。前記層状無機化合物は、一般に板状の粒子であり、かつ、複数個の粒子が凝集と劈開を繰り返す動的平衡にあるため、平均粒径を定義すること自体が困難であるが、例えば、光散乱法や電子顕微鏡を用いた観察等の手段により測定した場合に、水中に分散させた状態で、 lnm— 20 μ mの範囲であることが好ましぐより好ましくは lOnm— 2 μ mの範囲である。

[0037] これら粘土鉱物等の層状無機化合物は、例えば、 4級アンモニゥム塩等のピラーを立てて、層間距離や層間の電荷や極性をあらかじめ調整することもできる。

[0038] 前述のような層状無機化合物のうち、より好ましくは 2:1型粘土鉱物であり、特に好ましくはイオン交換能を有する膨潤性粘土鉱物である。

[0039] 前記膨潤性粘土鉱物のうち、より好ましくはベントナイト、スメクタイト、バーミキユラィト、合成フッ素雲母等であり、特に好ましくは合成へクトライトや合成サボナイト等の合成スメクタイト;合成フッ素雲母に代表される膨潤性合成雲母; Na型雲母等の合成雲母 (天然の雲母は、通常、非膨潤性の粘土鉱物である)等である。これらの層状無機化合物は、単独で使用してもよいし、 2種以上を併用してもよい。

[0040] このような層状無機化合物としては、例えば、市販品が使用でき、コープケミカル（株)製の商品名ルーセンタイト SWN、商品名ルーセンタイト SWF (合成へクトライト）、商品名 ME (フッ素雲母)、クニミネ工業 (株)製の商品名スメクトン SA (合成サボナイト）、協和化学工業 (株)製の商品名チキソピー w (合成へクトライト）、商品名キヨーヮード 500 (合成ハイド口タルサイト）、ラボー社製の商品名ラボナイト (合成へクトライト）、（株)ナカライテスタ社製の天然ベントナイト、（株)豊順鉱業社製の商品名マルチゲル (ベントナイト)等が挙げられる。

[0041] 本発明において、前記界面活性剤としては両性界面活性剤が好ましぐより好ましくは、例えば、同一分子内に正電荷と負電荷とを有する両性界面活性剤であり、例えば、アルキルアミノカルボン酸（またはその塩）、カルボキシベタイン、スルホベタインおよびホスホべタイン等があげられる。これらの中でも、さら〖こ好ましくは、同一分子内に正電荷と負電荷とを有し、かつ、前記正電荷と負電荷とが離間している両性界面活性剤であり、例えば、カルボキシベタイン、スルホベタインおよびホスホべタイン等である。具体的には、前記カルボキシベタインとして、アルキルジメチルァミノ酢酸ベタイン等、前記スルホベタインとして、 CHAPS、 CHAPSOおよびアルキルヒドロキシスルホベタイン等が使用できる。これらの中でも好ましくは、スルホベタインであり、より好ましくは CHAPS、 CHAPSO,特に好ましくは CHAPSである。

[0042] 本発明におヽて、前記緩衝剤としては、アミン系緩衝剤が好ましぐ例えば、 Tris、 ACES, CHES、 CAPSO、 TAPS, CAPS, Bis— Tris、 TAPSO、 TES、 Tricine および AD A等があげられ、好ましくは ACES、 Trisであり、より好ましくは ACESである。これらの物質は、 1種類でもよいし 2種類以上を併用してもよい。

[0043] また、前記緩衝剤としては、カルボキシル基を有する緩衝剤も好ましぐ例えば、酢酸—酢酸 Na緩衝剤、リンゴ酸—酢酸 Na緩衝剤、マロン酸—酢酸 Na緩衝剤、コハク酸 -酢酸 Na緩衝剤等があげられ、この中でもコハク酸-酢酸 Na緩衝剤が好ま、。

[0044] 前記アミン系緩衝剤と前記界面活性剤との組み合わせとしては、例えば、 Trisと C HAPS, ACESと CHAPS、 ACESと CHAPSOの組み合わせ等があげられ、より好ましくは CHAPSと ACESである。また、カルボキシル基と有する緩衝剤と前記界面活性剤との組み合わせとしては、例えば、コハク酸酢酸 Naと CHAPSまたは CHA PSO、マロン酸酢酸 Naと CHAPS、リンゴ酸ー酢酸 Naと CHAPSまたは CHAPSO 、酢酸酢酸 Naと CHAPS等が挙げられ、好ましくはコハク酸酢酸 Naと CHAPSの組合わせである。 [0045] 本発明において、前記メディエータとしては、例えば、後述するような酸化還元酵素と測定対象物との反応によって還元型となり、電気化学的に酸化され、酸化電流によつて検出できるものが好ましぐ従来公知のものが使用できる。

[0046] 具体的には、フェリシアン化カリウム、 p—べンゾキノンおよびその誘導体、フエナジンメトサルフェート、インドフエノール、 2, 6—ジクロロフェノールインドフエノール等のィンドフエノール誘導体、 j8—ナフトキノン 4ースルホン酸カリウム、フエ口セン、フエロセンカルボン酸等のフ口セン誘導体、オスミウム錯体、ルテニウム錯体、 NAD+、 NA DP+、ピロ口キノリンキノン（PQQ)、メチレンブルー、 cytochtome c、 cytochrome b、銅錯体等が使用できる。これらの中でも、好ましくはフェリシアンィ匕カリウム、フエ口セン、オスミウム錯体、ルテニウム錯体、 NAD+、 NADP+等が使用できる。

[0047] また、この他にも、例えば、 1, 1 ' ジメチルー 4, 4' ビビリジリウム塩、 1, 1 'ージべンジルー 4, 4，一ビビリジリウム塩、 1, 4—ジァミノベンゼン、 2—メチルー 1, 4 ナフトキノン、 N メチルフエナジ-ゥム塩、 1ーヒドロキシー 5 メチルフエナジ-ゥム塩、 1ーメトキシ— 5—メチルフエナジ-ゥム塩、 9ージメチルァミノベンゾアルファフェノキサジン 7— ィゥム塩、へキサシァノ鉄（Π)塩、 7—ヒドロキシー 3H—フエノキサジン 3 オン 10—才キシド、 3, 7—ジァミノ— 5—フエ-ルフエナジ-ゥム塩、 3— (ジェチルァミノ）— 7—ァミノ 5 フエ-ルフエナジ-ゥム塩、 1, 4-ベンゼンジオール、 1, 4ージヒドロキシ—2, 3, 5—トリメチルベンゼン、 N, N, Ν' , Ν，ーテトラメチルー 1, 4 ベンゼンジァミン、 Δ 2, 2'—ビー1, 3—ジチオール、 2, 6—ジメチルベンゾキノン、 2, 5—ジメチルベンゾキノン、 2, 3, 5, 6—テトラメチルー 2, 5—シクロへキサジェンー 1, 4ージオン、 2, 6—ジクロ口 4— [ (4—ヒドロキシフエ-ル)ィミノ]— 2, 5—シクロへキサジェンー 1 オン、 2, 6—ジクロロ 4— [ (3—クロロー 4ーヒドロキシフエ-ル)ィミノ]— 2, 5—シクロへキサジェンー 1一才ン、 7— (ジェチルァミノ）— 3—ィミノ— 8—メチルー 3Η—フエノキサジン塩、 3, 7—ビス（ジメチルァミノ）フエノチアジン 5—ィゥム塩等カ^ディエータとして使用できる。

[0048] 本発明の製造方法において、前記無機ゲル層は、少なくともメディエータと界面活性剤と緩衝剤と層状無機化合物とを含有する分散液を塗布することによって、形成することが好ましい。

[0049] また、本発明においては、前記無機ゲル層の上に、酸化還元酵素を含有する層を形成し、積層体の試薬層としてもよいし、または、前記分散液にさらに酸化還元酵素を含有させ、前記酸化還元酵素を含有する無機ゲル層を電極表面に形成し、単層の試薬層としてもよい。このように単層の試薬層を形成する場合、酸化還元酵素を含有する層とメディエータを含有する層とを別途形成する必要がないため、製造が一層簡便となる。このようなバイオセンサは、例えば、グルコースデヒドロゲナーゼ（GDH) のように、酵素反応に、酸素を必要としない酵素を使用する場合、特に好ましい。

[0050] 前記酸化還元酵素としては、例えば、試料中の測定対象物および前記メディエータと酸化還元反応するものであれば特に制限されず、測定対象物の種類等に応じて適宜決定できる。

[0051] 具体的には、例えば、グルコースォキシダーゼ（GOD)、ビラノースォキシダーゼ、グルコースデヒドロゲナーゼ（GDH)、乳酸ォキシダーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、フルクトースデヒドロゲナーゼ、ガラクトースォキシダーゼ、コレステロールォキシダーゼ、コレステロ一ノレデヒドロゲナーゼ、ァノレコーノレオキシダーゼ、ァノレコーノレデヒドロゲナーゼ、ピリルビン酸ォキシダーゼ、グルコース 6—リン酸デヒドロゲナーゼ、アミノ酸デヒドロゲナーゼ、ギ酸デヒドロゲナーゼ、グリセローノレデヒドロゲナーゼ、アシノレー Co Aォキシダーゼ、コリンォキシダーゼ、 4ーヒドロキシ安息香酸ヒドロキシラーゼ、マレイン酸デヒドロゲナーゼ、サルコシンォキシダーゼ、ゥリカーゼ等があげられる。

[0052] 前記酸ィ匕還元酵素と前記メディエータとの組み合わせは、特に制限されな!、が、例えば、 GODとフェリシアン化カリウム、 GDHとルテニウム錯体、コレステロールデヒドロゲナーゼとフエ口セン、アルコールデヒドロゲナーゼと銅錯体の組み合わせ等があげられる。

[0053] (実施形態 1)

本発明の第 1のノィォセンサ製造方法の一例について、図 1および図 2に基づいて説明する。図 1 (A)— (F)は、バイオセンサを製造する一連の工程を示した斜視図である。また、図 2は、前記図 1 (F)に示すバイオセンサの I I方向断面図である。なお、図 1 (A)—（F)および図 2において、同一箇所には同一符号を付している。

[0054] 図 1 (F)および図 2に示すように、このバイオセンサ 1は、基板 11、リード部 12aを有する作用極 12とリード部 13aを有する対極 13とから構成された電極系、絶縁層 14、メディエータと層状無機化合物と界面活性剤とを含む無機ゲル層（酸化防止層） 16、酸化還元酵素を含む酵素試薬層 17、開口部を有するスぺーサー 18および貫通孔 2 0を有するカバー 19を備えている。図 1 (B)に示すように、基板 11の一方の端部（両図において右側）上には、検出部 15が設けられており、検出部 15には、作用極 12と対極 13とが、基板 11の幅方向に並行して配置されている。前記両電極の一端は、それぞれリード部 12a、 13a (両図において左側）となり、これらと、検出部 15における他端とが、垂直となるように配置されている（図 1 (A) )。また、作用極 12と対極 13との間は、絶縁部となっている。このような電極系を備えた基板 11の上には、図 1 (B)に示すように、リード部 12a、 13aおよび検出部 15を除いて、絶縁層 14が積層されており、絶縁層 14が積層されていない前記検出部 15上には、無機ゲル層 16および酵素試薬層 17がこの順序で積層されている。そして、絶縁層 14の上には、図 1 (E)に示すように、検出部 15に対応する箇所が開口部になっているスぺーサー 18が配置されている。さらにスぺーサー 18の上には、前記開口部に対応する一部に貫通孔 20 を有するカバー 19が配置されている（図 1 (F) )。このバイオセンサ 1において、前記開口部の空間部分であり、かつ、前記酵素試薬層 17および絶縁層 14とカバー 19とに挟まれた空間部分が、キヤビラリ一構造の試料供給部 21となる。そして、前記貫通孔 20が、試料を毛管現象により吸入するための空気孔となる。

[0055] このバイオセンサ 1の大きさは、特に制限されず、供給する試料の量等により適宜設定できるが、例えば、全体長さ 5— 50mm、全体幅 1一 50mm、最大厚み 2000— 500 μ m、最小厚み 50— 500 μ mである。なお、「長さ」とは、バイオセンサの長手方向の長さをいい、「幅」とは、幅方向の長さをいう（以下、同じ)。

[0056] 基板 11の大きさは、例えば、長さ 5— 50mm、幅 1一 50mm、厚み 1000—

であり、絶縁層 14の大きさは、例えば、長さ 5— 50mm、幅 1一 50mm、厚み 10— 20 O /z mであり、検出部 15の大きさは、例えば、長さ 0. 1— 10mm、幅 0. 1— 10mmであり、無機ゲル層 16の大きさは、例えば、長さ 0. 1— 10mm、幅 0. 1— 10mm、厚み 0. 001— 500 mであり、酵素試薬層 17の大きさは、長さ 0. 1— 10mm、幅 0. 1— 10mm,厚み 0. 001— 500 mである。スぺーサ一の大きさは、例えば、長さ 1一 50 mm、幅 1一 50mm、厚み 10— 1000 mであり、その開口部は、例えば、長さ 0. 1 — 10mm,幅 0. 01— 10mmである。カバー 19の大きさは、例えば、長さ 5— 50mm 、幅 1一 50mm、厚み 10— 1000 mであり、その貫通孔は、例えば、直径 0. 1— 10 mmで & >。。

[0057] 無機ゲル層 16における層状無機化合物の含有量は、供給する試料の種類やその量、検出部 15の面積等に応じて適宜決定できるが、例えば、検出部 15の面積 lcm² 当たり、 0. 003— 30mgの範囲、好ましくは 0. 1— 10mgの範囲、より好ましくは 0. 3 一 3mgの範囲である。具体的に、前記層状無機化合物がスメクタイトの場合、例えば、前記面積 lcm²当たり、 0. 003— 30mgの範囲、好ましくは 0. 1— 10mgの範囲、より好ましくは 0. 3— 3mgの範囲である。前記含有量が面積 lcm²当たり 0. 003mg以上であれば、例えば、十分に酸素遮断効果を発揮でき、また、面積 lcm²当たり 30m g以下であれば、酵素遮断効果および再現性、反応性をより一層向上できる。なお、前記面積当たりの層状無機化合物の量は、無機ゲル層 16の厚みに関係しており、前述のように、層の厚みは、 0. 001— 500 mの範囲が好ましい。

[0058] また、無機ゲル層 16における界面活性剤 (例えば、両性界面活性剤）の含有量は、例えば、前記層状無機化合物の量に応じて適宜決定できるが、層状無機化合物 3 OOmgに対して、例えば、 0. lmmol— lOOmmolの範囲、好ましくは 0. 5mmol— 1 Ommol、より好ましくは 0. 5mmol— lmmolの範囲である。

[0059] また、無機ゲル層 16におけるメディエータの含有量は、例えば、測定試料の種類、測定対象物の種類、後述する酵素試薬層における酸ィヒ還元酵素の量等によって適宜決定できる力例えば、検出部 15の面積 lcm²当たり、 lOmmol— lOOmolが好ましぐより好ましくは lOmmol— 50mmol、特に好ましくは 15mmol— 20mmolの範囲である。

[0060] この無機ゲル層 16は、さらに緩衝剤を含有してもよヽ。無機ゲル層 16における前記緩衝剤の含有量は、例えば、前記層状無機化合物の量に応じて適宜決定でき、層状無機化合物 0. 3gに対して、緩衝剤は、例えば、 0. lmmol— lOOmmolが好ましぐより好ましくは lmmol— 50mmol、特に好ましくは lOmmol— 20mmolの範囲である。

[0061] 前記酵素試薬層 17における酸ィ匕還元酵素の含有量は、特に制限されず、試料の種類やその量、測定対象物の種類や量等に応じて適宜決定できる。具体的には、検出部 15の面積 lcm²当たり、例えば、 0. 1U— 100KUの範囲であり、好ましくは、 1 U— 10KUの範囲であり、より好ましくは 1U— 100Uの範囲である。

[0062] また、酵素試薬層 17中の酵素量と前記無機ゲル層 16中のメディエータとの割合は、例えば、酵素 1000Uあたり、メディエータ 0. 01— 1Mの範囲、好ましくは 0. 01— 0 . 5Mの範囲、より好ましくは 50mM— 200mMの範囲である。

[0063] このようなバイオセンサは、例えば、以下のようにして作製できる。

[0064] まず、電極系を形成するための基板 11を準備する。前記基板 11の材料としては、電気絶縁性材料が好ましぐ例えば、プラスチック、ガラス、紙、セラミックス、ゴム等があげられる。前記プラスチックとしては、例えば、ポリエチレンテレフタレート（PET)、ポリスチレン（PS)、ポリメタタリレート（PMMA)、ポリプロピレン（PP)、ァクリノレ榭脂、ガラスエポキシ等があげられる。

[0065] つぎに、図 1 (A)に示すように、基板 11上にリード部 12aを有する作用極 12およびリード部 13aを有する対極 13からなる電極系を形成する。なお、電極の形状は、図 1 (A)に示す形状には何ら制限されない。前記電極としては、カーボン電極、金電極、ノラジウム電極、白金電極等が好ましぐその種類に応じて、例えば、スクリーン印刷、コーティング法、蒸着法等の公知の方法により形成できる。

[0066] カーボン電極の場合は、例えば、カーボンインキを前記基板 11上にスクリーン印刷する手段、コーティングする手段等により形成できる。

[0067] また、前記金電極は、例えば、蒸着法、メツキ法、スパッタ法、金箔貼付法等により形成できる。前記蒸着法は、例えば、イオンプレーティング法により、真空度 1. 33 X 10— ⁴Pa、入力パワー 300W、レート 5 X 10— nmZ秒、時間 2分の条件で、例えば、 P ETなどのプラスチックシート上に金を蒸着して、さらにキスカット装置を用いて、前記シート上に蒸着された金箔層に切れ目を入れる方法である。これにより、切れ目部分が絶縁部となり、作用極および対極力ゝらなる電極系が形成できる。

[0068] 続いて、図 1 (B)に示すように、前記電極系 12、 13を形成した基板 11上に絶縁層 14を形成する。この絶縁層は、電極のリード部 12a、 13a (図 1 (B)において左側）と、後述する無機ゲル層等を形成する検出部 15を除いた基板 11上に形成する。 [0069] 前記絶縁層 14は、例えば、絶縁性榭脂を溶媒に溶解した絶縁ペーストを前記基板 11上に印刷し、これを加熱処理または紫外線処理して形成することができる。

[0070] 前記絶縁性榭脂としては、例えば、ポリエステル、プチラール榭脂、フエノール榭脂等があげられ、前記溶媒としては、例えば、カルビトールアセテート、二塩基酸エステル系混合溶剤（DBEソルベント)等があげられる。前記ペーストにおける前記絶縁性榭脂の濃度は、例えば、 65— 95重量％の範囲が好ましぐより好ましくは 75— 90重量％の範囲であり、特に好ましくは 80— 85重量％の範囲である。

[0071] 前記加熱処理の条件は、使用する前記絶縁性榭脂の種類に応じて適宜決定できる。

[0072] なお、前記絶縁層 14は、前記印刷法以外に、例えば、コーティング、膜はりつけ、エッチング等の方法によっても形成できる。

[0073] 次に、図 1 (C)に示すように、絶縁層 14が形成されていない検出部 15において、基板 11および電極 12、 13上に、無機ゲル層 16を形成する。無機ゲル層 16は、例えば、メディエータおよび界面活性剤を含み、かつ前記層状無機化合物が分散された分散液を調製し、これを前記検出部 15に分注して、乾燥することによって形成できる。なお、この無機ゲル層 16は、必ずしも常時ゲル状である必要はなぐ使用前は、前記乾燥工程によって乾燥した状態であってもよぐ液体試料等を含浸した場合に、ゲル状となることが好ましい。

[0074] 前記分散液の調製に使用する溶媒としては、例えば、水、緩衝液アルコール、 N, N—ジメチルホルムアミド（DMF)、ジメチルスルホキシド（DMSO)等が使用でき、この中でも好ましくは超純水である。

[0075] 前記分散液における前記層状無機化合物の濃度は、例えば、 0. 1-lOOmg/m Lの範囲であり、好ましくは 1一 lOOmgZmLの範囲であり、より好ましくは 10— 30m gZmLの範囲である。また、前記分散液における前記界面活性剤の濃度は、例えば、 1一 200mMの範囲であり、好ましくは 1一 lOOmMの範囲であり、より好ましくは 1 一 10mMの範囲である。

[0076] また、分散液における層状無機化合物と界面活性剤との添加割合としては、前記層状無機化合物 300mgに対して、界面活性剤力例えば、 0. Immol-lOOmmol の範囲、好ましくは 0. 5mmol— lOmmol、より好ましくは 0. 5mmol— lmmolの範囲である。

[0077] また、前記分散液における前記メディエータの濃度は、例えば、 1一 lOOOmMの範囲であり、好ましくは 100— 800mMの範囲であり、より好ましくは 200— 500mMの範囲であり、特に好ましくは 300mM付近である。

[0078] 前記分散液は、さらに、前述のようなアミン系等の緩衝剤を含むことが好ましぐこの場合、前記緩衝剤の濃度は、例えば、 1一 lOOOmMの範囲であり、好ましくは 10— 5 OOmMの範囲であり、より好ましくは 50— 200mMの範囲である。また、層状無機化合物に対する前記緩衝剤の添加割合としては、前記層状無機化合物 0. 3gに対して、前記緩衝剤力例えば、 0. lmmol— lOOmmolが好ましぐより好ましくは lmmol 一 50mmol、特に好ましくは lOmmol— 20mmolの範囲である。

[0079] また、前記界面活性剤と前記緩衝剤の添加量は、例えば、前述のように無機微粒子に対する割合で決定できるため、前記界面活性剤と前記緩衝剤の添加割合 (モル比 A: B)は、特に制限されな!、が、例えば、 A: B= 1： 1— 1： 250の範囲であり、好ましくは 1： 10-1 : 100の範囲であり、より好ましくは 1： 25— 1： 50の範囲である。

[0080] 前記溶媒に対する、前記メディエータ、前記層状無機化合物および界面活性剤等の各成分の添加順序は特に制限されないが、例えば、まず、前記溶媒に層状無機化合物を添加し、十分に攪拌した後、界面活性剤を添加する。そして、さらに前記緩衝剤を添加してから、最後にメディエータを溶解することが好ましい。この順序によると、メカニズムは不明であるが、より一層均一で、酸素との接触が防止される無機ゲル層を形成することができる。なお、前記緩衝剤は、界面活性剤と共に添加してもよい力特に好ましくは、界面活性剤の添加後である。

[0081] また、前記分散液の調製方法は特に制限されないが、例えば、使用するメディエータの種類等に応じて、 pHの調整や使用する緩衝剤の種類を選択することが好まヽ。以下に、メディエータの種類に応じた具体的な例をあげる。

[0082] まず、中性付近での使用が好ましいメディエータを使用する場合の例を説明する。

一般に、スメクタイトのような層状無機化合物 (無機ゲル）は、水等の溶媒に溶解すると透明化する力その分散液の pHは高アルカリ性 (pHIO付近)である。一方、中性付近での使用が好ましいメディエータゃ酵素等は、安定な pH条件下、すなわち、中性付近で添加することが好ましい。ところが、無機ゲルは、中性付近で白濁したり沈殿が生じる場合がある。この場合に、緩衝剤として前述のようなアミン系緩衝剤を添加すれば、前記分散液の pHを中性付近に調整でき、且つ、メカニズムは不明である力中性付近であるにもかかわらず、沈殿を生じることもなぐメディエータを添加することができるのである。そして、結果として、前述のように、メディエータの再酸化を十分に防止できる無機ゲル層を確実に形成できるのである。なお、両性界面活性剤のような界面活性剤を添加してから、アミン系緩衝剤を添加することによって、調製する分散液の白濁や沈殿を十分に防止できることも、本発明者らがはじめて見出したことでさる。具体的な添加順序としては、層状無機化合物の分散液に、界面活性剤を添加した後、アミン系緩衝剤を添加することが好ましい。アミノ系緩衝剤を添加した後の分散液の pHは、例えば、 9一 5の範囲であり、好ましくは 8— 6であり、より好ましくは 7 . 5— 7である。

[0083] 中性付近での使用が好ましいメディエータとしては、例えば、フアリシアンィ匕カリウム、シトクロム C、 PQQ、 NAD+、 NADP+、銅錯体等があげられる。

[0084] また、酸性付近での使用が好ましいメディエータを使用する場合には、以下のような調製方法が好ましい。前述のように、一般に、層状無機化合物 (無機ゲル)を溶媒に溶解すると透明化し、その分散液の pHは強アルカリ性となる。この場合、酸性付近での使用が好ましいメディエータを添加するためには、例えば、前記分散液に HC1のような酸を添加して、前記分散液の pHを酸性側に調整し、前記界面活性剤を添加した後に、前述のようなカルボキシル基を有する緩衝剤を添加して pH調整を行い、メディエータを添加することが好まし、。

[0085] このような方法が好ましいのは以下の理由による。スメクタイトのような無機層状ィ匕合物は、その分散液に HC1等の酸を添加して、強酸性条件とすると (例えば、 pH2付近 )、一旦は白濁して凝集を生じるが、さらに攪拌を続けることによって (例えば、 24時間程度)、酸性側であっても分散液を透明化できることを、本発明者らは見出した。しかし、この状態の分散液では、前述のようにバインダーとなる緩衝剤が入っておらず、緩衝剤による効果が得られない上に、酵素を使用することを考慮すると、 pH2等の強酸性では、酵素が失活するおそれがある。そこで、さらなる検討によって、本発明者らは、強酸性付近で透明化している分散液に、両性界面活性剤のような界面活性剤を添加した後、カルボキシル基を有する緩衝剤を添加して、メディエータゃ酵素の各成分に支障をきたさない pH (例えば、 pH4. 5付近）に設定することで、沈殿の発生を十分に防止し、メディエータゃ酵素を十分に安定な状態で使用できることを見出したのである。

[0086] 前記分散液の pHは、はじめに 1一 3の強酸性とすることが好ましぐより好ましくは 1 . 5— 2である。使用する酸としては、特に制限されないが、例えば、塩酸、リン酸、酢酸等である。強酸性下での前記分散液の攪拌条件は、特に制限されないが、攪拌時間力例えば、 12— 72時間であり、好ましくは 18— 48時間であり、特に好ましくは 2 4一 30時間である。また、カルボキシル基を有する緩衝剤の添カ卩によって、前記分散液の pHは、 3— 6に設定することが好ましぐより好ましくは 4一 5であり、特に好ましくは 4. 5—4. 8である。

[0087] 酸性付近での使用が好まし!/ヽメディエータとしては、例えば、ルテニウム錯体、ォスミゥム錯体、フエ口セン、フエナジンメトサルフェート、インドフエノール、メチレンブルー等が挙げられる。

[0088] 前記溶媒に、層状無機化合物、界面活性剤および緩衝剤を添加した後は、一時静置しておくことが好ましぐ静置時間は、例えば、 24時間以上が好ましぐより好ましくは 3日以上である。

[0089] この分散液の検出部 15への注入割合は、例えば、検出部 15の大きさ、分散液における前記層状無機化合物等の含量、前記層状無機化合物の種類等によって適宜決定できる。具体的には、検出部 15の面積当たり（cm²)、例えば、前記層状無機化合物 0. 003— 30mgの範囲になるように前記分散液を注入することが好ましぐより好ましくは 0. 1— lOmgの範囲であり、特に好ましくは 0. 3— 3mgの範囲である。したがって、分散液の層状無機化合物の濃度が、 0. 3重量％の場合、検出部の面積当たり（cm²)、例えば、 0. 001— 10mLの範囲を注入することが好ましぐより好ましくは 0. 03—3. 3mLの範囲であり、特に好ましくは 0. 1— lmLの範囲である。

[0090] また、前記分散液を検出部 15に注入する方法は、特に制限されないが、例えば、自動駆動式分注機等を用いて行うことができる。

[0091] 注入した前記分散液を乾燥する手段は、特に制限されないが、例えば、自然乾燥、風乾、減圧乾燥、凍結減圧乾燥等の方法が採用できる。また、これらの手段を組み合わせてもよい。その処理温度は、 10— 60°Cの範囲が好ましぐより好ましくは 25— 50°Cの範囲であり、特に好ましくは 30— 40°Cの範囲である。また、相対湿度 RHは、 5— 40%の範囲が好ましぐより好ましくは 10— 20%の範囲であり、特に好ましくは 1 0— 15%の範囲である。なお、処理時間は、例えば、乾燥手段に応じて適宜決定できるが、 1一 60分の範囲が好ましぐより好ましくは 5— 30分の範囲であり、特に好ましくは 5— 10分の範囲である。

[0092] さら〖こ、図 1 (D)に示すように、前記無機ゲル層 16の上に、酵素試薬層 17を形成する。この酵素試薬層 17は、前記酸化還元酵素を含有する酵素液を調製して、これを前記無機ゲル層 16上に注入し、乾燥することによって形成できる。また、前記酸ィ匕還元酵素としては、例えば、前述のようなものが使用できる。

[0093] 前記酵素液は、例えば、酵素を溶媒に十分に溶解させて調製できる。前記溶媒としては、特に制限されないが、例えば、水、緩衝液、エタノール、メタノール、ブタノール、ジメチルスルホキシド (DMSO)およびテトラヒドロフラン等の有機溶剤等が使用できる。前記緩衝液としては、例えば、リン酸緩衝液、クェン酸緩衝液、酢酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液、グッド緩衝液等があげられ、その pHは、酵素の種類に応じて適宜決定できるが、例えば、 5— 10の範囲が好ましぐより好ましくは 6— 9の範囲、特に好ましくは 7— 8の範囲である。また、水としては、例えば、精製水、蒸留水、超純水等があげられ、この中でも不純物が極めて少なく高精度のバイオセンサが作製可能であることから超純水が好ま、。

[0094] 前記酵素液中の試薬の濃度は、特に制限されないが、例えば、 1一 lOKUZmLの範囲が好ましぐより好ましくは 3— 6KUZmLの範囲である。

[0095] また、前記酵素液は、さらに界面活性剤を含むことが好ましぐ特に両性界面活性剤を含むことが好ましい。前記両性界面活性剤としては、例えば、前述と同様のものが使用できる。

[0096] この酵素液は、酸化還元酵素の他に、例えば、酸化還元酵素の基質とならな!/、糖類や、アミノ酸およびその誘導体、イミダゾール等のアミンィ匕合物、ベタイン等を含んでもよい。前記糖類としては、例えば、スクロース、ラフイノース、ラタチトール、リビトール、ァラビトール等があげられる。これらの中でも、前記糖類は、例えば、酵素の安定性向上に、前記アミノ酸、その誘導体およびべタインは、例えば、試薬の乾燥による固化の防止、イミダゾールは、例えば、メディエータの安定化等の目的で添加することがでさる。

[0097] 前記酵素液の注入量は、形成する酵素試薬層 17の大きさ、試薬の濃度、試料の量、測定対象物の種類等により適宜決定できる。

[0098] 注入した前記酵素液の乾燥手段は、特に制限されないが、例えば、自然乾燥、風乾、減圧乾燥、凍結減圧乾燥等の方法が採用でき、これらの手段を組み合わせてもよい。乾燥条件としては、例えば、温度 10— 60°Cの範囲、相対湿度 RH5— 40%の範囲、時間 1一 60分の範囲である。また、試薬として酵素を使用する場合には、酵素の種類に応じて、失活しなヽように適宜温度を設定すればょヽ。

[0099] つぎに、図 1 (E)に示すように、絶縁層 14上にスぺーサー 18を配置する。図示のように、スぺーサー 18は、前記酵素試薬層 17に対応する箇所が開口部となっている。

[0100] 前記スぺーサー 18の材料としては、例えば、榭脂製フィルムやテープ等が使用できる。また、両面テープであれば、前記絶縁膜 14との接着だけでなぐ後述するカバ一 19も容易に接着できる。この他にも、例えば、レジスト印刷等の手段によりスぺーサーを形成してもよい。

[0101] つぎに、図 1 (F)に示すように、前記スぺーサー 17上にカバー 19を配置する。前記カバー 19の材料としては、特に制限されないが、例えば、各種プラスチック等が使用でき、好ましくは、 PET等の透明樹脂があげられる。

[0102] このようにして作製したノィォセンサ 1は、長期間保存する場合、湿気の影響を防ぐため、例えば、モレキュラーシーブ、シリカゲル、酸ィ匕カルシウム等の乾燥剤と共に密封保存することが好ましい。

[0103] このバイオセンサ 1は、例えば、ある一定の時間で所定の電圧を加える手段、前記バイオセンサから伝達される電気信号を測定する手段、前記電気信号を測定対象物濃度に演算する演算手段等の種々の手段を備えた測定機器と組み合わせて使用できる。

[0104] このバイオセンサ 1の使用方法について、試料が全血、測定対象物がグルコース、酸ィ匕還元酵素が GDH、メディエータがフェリシアンィ匕カリウムである例をあげて説明する。

[0105] まず、全血試料をバイオセンサ 1の開口部 21の一端に接触させる。この開口部 21 は、前述のようにキヤビラリ一構造となっており、その他端に対応するカバー 19には空気孔 20が設けられて、るため、毛管現象によって前記試料が内部に吸引される。吸引された前記試料は、検出部 15上に設けられた酵素試薬層 17に浸透し、酵素試薬層 17中の GDHを溶解して、さらに酵素試薬層 17の下層である無機ゲル層 16表面に達する。そして、表面に達した試料中のグルコースと、 GDHと、無機ゲル層 16 中のフェリシアン化カリウムとが反応する。具体的には、測定対象物であるグルコースは GDHにより酸ィ匕され、その酸ィ匕反応により移動した電子によって、フェリシアンィ匕カリウムが還元され、フエロシアン化カリウム（フエロシアンイオン）が生成される。

[0106] この際、試料は酵素試薬層 17を通過して無機ゲル層 16に達する力無機ゲル層 1 6を通過して電極表面に到達することはない。このため、還元されたフエロシアン化力リウムが試料中の溶存酸素によって再酸ィ匕することが防止できると考えられ、これによつて測定精度の低下が抑制される。なお、電極表面に水分が到達していないことは、電子顕微鏡によって確認されている。また、前記試料中に含まれる赤血球等の不純物も、層状無機化合物の間を通過することができないため、この無機ゲル層 16を通過することなぐ電極 12、 13表面への吸着も防止される。

[0107] そして、無機ゲル層 16中で還元されたフロシアン化カリウムと、無機ゲル層 16の下に位置する電極との間で、電子授受が行われ、これによつてグルコース濃度が測定できるのである。具体的には以下のように行うことができる。

[0108] 全血試料の供給から一定時間経過後、前記電圧を加える手段により対極 13と作用極 12との間に電圧を印加して、電極と接触している前記還元型のフエロシアンィ匕カリゥム（フエロシアンイオン)を電気化学的にフェリシアンィ匕カリウムに酸ィ匕し、その際の酸ィ匕電流を、作用極 12のリード部 12aを介して前記電気信号を測定する手段等によつて検出する。この酸ィ匕電流の値は、試料中のグルコース濃度に比例するため、これを前記演算手段によりダルコース濃度に演算すれば、試料中のダルコース濃度を求めることができる。

[0109] このようなバイオセンサによれば、前述のように溶存酸素等の影響による、還元型メディエータの再酸ィ匕が防止され、測定の精度や再現性が向上できる。

[0110] 本実施形態においては、本発明のバイオセンサをグルコース測定に適用する例を示したが、これには制限されず、例えば、測定対象物に応じて試薬を適宜決定し、各種測定対象についてのバイオセンサとすることができる。具体的には、例えば、乳酸測定用バイオセンサの場合はラタテートォキシダーゼ、アルコール測定用バイオセンサの場合はアルコールォキシダーゼ、コレステロール測定用センサの場合はコレステロールォキシダーゼ等が使用できる。また、グルコース測定用バイオセンサの場合、例えば、ビラノースォキシダーゼやグルコースォキシダーゼ等も試薬として使用できる。

[0111] また、前記無機ゲル層と酵素試薬層とを積層する代りに、前述の層状無機化合物等を分散した分散液に、さらに酸化還元酵素を添加して、検出部 15に、酵素試薬層と無機ゲル層を兼ねる単層を形成してもよい。この場合、前記分散液における酸ィ匕還元酵素量等は特に制限されず、例えば、前述のような添加量を参考にできる。実施例 1

[0112] 以下に示すようにして、前記図 1 (F)と同じ構造のグルコースセンサを作製した。

[0113] まず、グルコースセンサの絶縁基板 11として、 PET製基板（長さ 50mm、幅 6mm、厚み 250 m)を準備し、その一方の表面に、スクリーン印刷により、リード部をそれぞれ有する作用極 12および対極 13からなるカーボン電極系を形成した。

[0114] つぎに、以下に示すようにして前記電極上に絶縁層 14を形成した。まず、絶縁性榭脂ポリエステルを、濃度 75重量％になるように溶媒カルビトールアセテートに溶解させて絶縁性ペーストを調製し、これを前記電極上にスクリーン印刷した。印刷条件は、 300メッシュスクリーン、スキージ圧 40kgであり、印刷する量は、電極面積 lcm² 当たり 0. 002mLとした。なお、検出部 15上と、リード部 12a、 13a上には、スクリーン印刷を行わなかった。そして、 90°Cで 60分間加熱処理することによって絶縁層 14を形成した。 [0115] 続いて、前記絶縁層 14を形成しなかった前記検出部 15に、以下に示すようにして無機ゲル層 16を形成した。まず、合成スメクタイトである商品名「ルーセンタイト SWN 」（コープケミカル社製) 0. 6gを精製水 lOOmLに懸濁し、約 8— 24時間攪拌した。この合成スメクタイト懸濁液の pHは、約 10であった。この合成スメクタイト懸濁液 10mL に、 10% (wZv) CHAPS (同仁化学研究所製）水溶液 0. lmL、 1. OM ACES緩衝液 (pH7. 4 :同仁ィ匕学研究所製） 5. OmLおよび精製水 4. OmLをこの順序で添加し、さらにメディエータとして [Ru(NH ) ]C1 (アルドリッチ社製） 1. Ogを混合した。

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この混合液を無機ゲル層形成液とする（PH7. 5)。なお、この無機ゲル形成液における組成物の最終濃度を以下に示す。

[0116] ル一センタイト S W N 0 . 3 % (w/ v )

C H A P S 0 . 3 % (w/ v )

A C E S緩衝液（ p H 7 . 5 ) 1 0 0 m M

[ R u ( N H J J C 1 , 5 . 0 % (w/ v )

[0117] この無機ゲル形成液 1. O /z Lを、検出部 15に分注した。なお、検出部 15の表面積は約 0. 1cm²であり、前記検出部 15における電極 12、 13の表面積は約 0. 12cm²であった。そして、これを、 30°C、相対湿度 10%の条件下で 10分間乾燥させて、無機ゲル層 16を形成した。

[0118] さらに、前記無機ゲル層 16の上に、酵素試薬層 17を形成した。これは、 5000UZ mL GDH水溶液 1. 0 Lを、検出部 15の前記無機ゲル層 16の上に分注して、 30 °C、相対湿度 10%の条件下で 10分間乾燥させて形成した。

[0119] 最後に、開口部を有するスぺーサー 18を絶縁層 14上に配置し、さらに、前記スぺーサー 18上に空気孔となる貫通孔 20を有するカバー 19を配置してバイオセンサ 1 を作製した。前記カバー 19と絶縁層 14とに挟まれたスぺーサー 18の開口部の空間が、キヤビラリ一構造となるため、これを試料供給部 21とした。

[0120] なお、比較例 1としては、無機ゲル層形成液の調製において、前記合成スメクタイト懸濁液の代りに精製水を用いた以外は、実施例 1と同様にしてグルコースセンサを作製した。実施例 2

[0121] 前記実施例 1で作製したグルコースセンサを用いて、グルコース濃度に応じた応答電流の経時変化を測定した例である。

[0122] 液体試料としては、ヒト全血を用いた。まず、採血後の全血を 37°Cで約 1日放置して、グルコース濃度 OmgZlOOmLに調整した。つぎに、これにグルコースを添カロして、各種グルコース濃度（約 200、 400、 600mgZl00mL)の試料を調製した。なお、グルコース無添力卩の全血をグルコース濃度 OmgZlOOmLとした。そして、実施例 2 として、前記グルコースセンサ 1に 200mVの電圧を印加してから、試料を試料供給部 21に点着し、その点着 5秒後の応答電流のタイムコースを測定した。比較例 2として、比較例 1のグルコースセンサについても同様にして測定を行った。なお、実施例および比較例ともに、計 3回ずつ測定を行った (n= 3)。これらの結果を図 3 (A) (B) に示す。図 3は、グルコースセンサで試料を測定した場合の電流値の経時変化を示すグラフであって、同図 (A)が実施例 2、同図 Bが比較例 2の結果をそれぞれ示す。

[0123] 同図 (A)に示すように、実施例 1のグルコースセンサによれば、同図（B)に示す比較例 1のグルコースセンサよりも、応答電流値のピークがより早い時間で現れ、かつピーク電流値も高い値が得られた。このように高いピーク電流値が得られたのは、実施例 1のグルコースセンサによれば、無機ゲル層において酸素が遮断されるため、ダルコースと GDHとの反応によって還元されたメディエータカ酸素によって再酸化されることなく、電気化学的に酸化され、その酸ィ匕電流を測定できた力であると考えられる。また、電流値のピークが早い時間で現れたのは、電極上の無機ゲル層中において、スメクタイトのシート内にメディエータである [Ru(NH ) ]C1がはまり込んで強固

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に固定ィ匕されているため、電極表面にスメクタイトを介してメディエータがゆるく固定化された状態となり、電極近傍のメディエータ濃度が大きくなつて、反応速度が増大したちのと考免られる。

実施例 3

[0124] 本発明のグルコースセンサを用いて、試料の点着から一定時間経過後の応答電流値の再現性を確認した例である。

[0125] ヒト全血【こグノレコースを添カロして、グノレコース濃度 0、 103、 415、 616、 824mg/l OOmLの試料をそれぞれ調製した。

[0126] 実施例 3として、前記無機ゲル層形成液におけるスメクタイト濃度 (ルーセンタイト S WN)を 0. 24% (wZv)とした以外は、前記実施例 1と同様にしてグルコースセンサを作製した。前記グルコースセンサの電極間に 200mVの電圧を印加してから、試料を点着し、点着 5秒後の応答電流値を測定した。前記測定は、同じグルコースセンサを用いて、各試料について、それぞれ計 10回 (n= 10)行った。また、比較例 3として、前記比較例 1のグルコースセンサを用いて、前記実施例 3と同様にして測定を行つた（n= 10)。

[0127] 測定した実施例 3および比較例 3の応答電流値 (n= 10)から、測定の再現性を示す CV値を求めた。これらの結果を下記表 2に示す。

[0128] [表 2] 試料屮のグルコース濃度

103mg/100mL 41 5mg/100mL 61 6mg/10QmL 824mg/100mL

実施例 3 3. 02% 2. 34¾ 2. 90 2. 33¾

比較例 3 3. 84% 3. 31 3. 35 7. 30¾

[0129] 前記表 2の結果から、比較例 3は、特に試料中のグルコース濃度を 824mgZl00 mLに増加させたことによって、 CV値が 7. 30と大幅に変化したのに対し、実施例 3 によれば、 CV値は 2. 34-3. 02の間で安定しており、前記グルコース濃度の増加に拘わらず、再現性よく測定できることがわかる。この結果から、実施例のグルコースセンサによれば、スメクタイトを含まな、比較例のバイオセンサよりも高！、再現性で測定できるといえる。

実施例 4

[0130] 前記実施例 3で作製したグルコースセンサについて、一定湿度および温度に曝露することによる影響を確認した例である。

[0131] 前記グルコースセンサを、相対湿度 80%、温度 40°Cに維持した室内に 17時間放置して曝露した後、電極間に 200mVの電圧を印加した。そして、グルコース濃度 0、 600mgZl00mLとなるようにグルコースを添カ卩したヒト全血試料を点着し、点着 5秒後の応答電流値を測定した。これを実施例 4とする。また、比較例 4として、前記比較例 1のグルコースセンサについても同様にして測定を行った。なお、実施例 4および比較例 4のコントロールとして、それぞれ前記グルコースセンサを用いて、前記通常の室温湿度 (約 25°C、約 60%Rh)条件下で、前記試料についての応答電流値を測定した。そして、コントロールの電流値を 100%とした場合の、前記実施例 4および比較例 4の感度（％)を求めた。以下の表 3に結果を示す。

[0132] [表 3]

― 感度（％)

実施例 4 7 4 . 2 %

比較例 4 2 7 . 6 %

[0133] 前記表 3に示すように、実施例 3のグルコースセンサによれば、高湿度条件に曝露しても、比較例 1のグルコースセンサに比べて曝露後の感度低下が小さいことがわかつた。つまり、実施例 3のグルコースセンサは、前述のように、無機ゲル層によって、例えば、空気中の水分や試料中の溶存酸素が遮断され、メディエータが酸素と接することを防止できるため、湿度に対する耐性を有して、ると、える。

実施例 5

[0134] 本発明のダルコースセンサについて、試料中の溶存酸素による影響を確認した例である。

[0135] ヒト全血にグルコースを添カ卩して、グルコース濃度を 11 lmgZlOOmLになるように試料を調製し、さらに溶存酸素が 25. ImmHg付近 (未調整）、 92. OmmHg付近、および 171. 6mmHg付近になるようにそれぞれ調節した。溶存酸素濃度は、溶存酸素未調整（25. ImmHg)の前記試料を、試験管内で酸素と混和することによって、高濃度（92. OmmHg, 171. 6mmHg)に調整した。

[0136] 実施例 5として、前記無機ゲル層形成液におけるスメクタイト濃度 (ルーセンタイト S WN)を、 0. 12%、 0. 24%、 0. 36%、 0. 48% (w/v)とした以外は、前記実施 f列 1 と同様にして 4種類のグルコースセンサを作製した。そして、前記グルコースセンサの電極間に 200mVの電圧を印加してから、前記試料を点着し、点着 5秒後の応答電流値を測定した。これらの各グルコースセンサについて、溶存酸素未調整（25. lm mHg)の試料に対する前記応答電流値を基準として、下記式（10)より、各試料 (溶存酸素 92. OmmHg、 171.6mmHg)の応答電流値の変化率（％)を求めた。また、比較例 5として、前記比較例 1のグルコースセンサについても同様にして測定を行い、変化率（％)を求めた。これらの結果を図 4に示す。図 4は、試料中における溶存酸素濃度と変化率 (％)との関係を示すグラフであり、図において△、〇、口、▽はそれぞれ実施例 5であり、參は比較例 5である。なお、変化率 (％)は、絶対値が大きい程、応答電流が変化したことになる。

[0137] 変化率 (％) = [ (A/B)-l] X 100 ··· (10)

A ：溶存酸素調整試料の応答電流

B ：溶存酸素未調整試料の応答電流

[0138] 図 4に示すように、実施例 5によれば、試料の溶存酸素を増加させても、比較例 5に比べて、変化率（％)の絶対値は小さカゝつた。このことから、スメクタイトを含む実施例のグルコースセンサによれば、溶存酸素による感度低下が小さぐ試料等の溶液中の溶存酸素の影響を軽減できることがわかった。

実施例 6

[0139] 酸化還元酵素として GODを用、た本発明のダルコースセンサについて、試料中の溶存酸素による影響を確認した例である。

[0140] 無機ゲル層形成液として、以下の最終濃度となるように調製した分散液を使用し、酵素溶液として、 GDH水溶液の代りに 1200UZmLの GOD溶液 (天野社製）を使用し、 [Ru(NH ) ]C1の代りにフェリシアンィ匕カリウム (和光純薬工業社製)を、 ACE

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S緩衝液の代りに Tris— HC1緩衝液 (pH7.4：同仁ィ匕学研究所製)を使用した以外は、前記実施例 1と同様にしてグルコースセンサを作製した。

[0141]

ルーセンタイト SWN 0. 3 % (w/v)

CHAP S 0. 1 % (w/v)

T r i s - H c l緩衝液 l O OmM

フェリシアン化カリウム 3. 0 % (w/v) [0142] なお、比較例 6としては、無機ゲル層および酵素試薬層を形成する代りに、 GOD1 200UZmLおよびフェリシアン化カリウム 3. 0% (w/v)を含む溶液 1 μ Lを検出部に注入し、乾燥する以外は、前記実施例 6と同様にしてバイオセンサを作製した。

[0143] ヒト全血にグルコースを添カ卩して、グルコース濃度を 600mgZl00mLになるように試料を調製し、さらに溶存酸素が 48. 9mmHg (未調整）、 106. 4mmHg、および 1 80. 4mmHgになるようにそれぞれ調節した。溶存酸素濃度は、前記実施例 5と同様に、溶存酸素未調整の前記試料を、試験管内で酸素と混和することによって、高濃度に調整した。

[0144] ヒト全血にグルコースを添カ卩して、グルコース濃度 600mgZl00mLの試料を調製した。そして、前記グルコースセンサの電極間に 500mVの電圧を印加し、試料点着 5秒後の応答電流値を測定した。比較例 6のグルコースセンサについても同様にして測定を行った。そして、実施例 6および比較例 6について、前記実施例 5と同様に、溶存酸素未調整 (48. 9mmHg)の試料に対する前記応答電流値を基準として、前記式（10)より、各試料 (溶存酸素 106. 4mmHg、 180. 4mmHg)に対する応答電流値の変化率（％)を求めた。これらの結果を図 5に示す。図 5は、試料中における溶存酸素濃度と変化率 (％)との関係を示すグラフであり、同図において〇が実施例 6、參が比較例 6の結果である。

[0145] 図 5に示すように、酸ィ匕還元酵素として GODを用いた実施例 6によっても、比較例 6 に比べて、試料中の溶存酸素による感度低下が小さぐ溶存酸素の影響を軽減できたことがわかった。

実施例 7

[0146] 実施例 7は、界面活性剤として CHAPS (両性界面活性剤）を、アミン系緩衝剤として ACES緩衝液をそれぞれ用ヽた実施例 1で作製したダルコースセンサを使用した。一方、比較例 7としては、界面活性剤として CHAPSに代えてコール酸 (ァ-オン系界面活性剤）を使用し、緩衝剤として ACESに代えてリン酸ナトリウムを使用した以外は、前記実施例 1と同様にしてグルコースセンサを作製して、これを用いた。

[0147] ヒト全血にグルコースを添カ卩して、グルコース濃度 lOOmgZlOOmLの試料を調製し、さらに溶存酸素が 34. 7mmHg (未調整）、 117. lmmHg、および 185. 3mmH g付近になるようにそれぞれ調節した。溶存酸素濃度は、前記実施例 5と同様に、溶存酸素未調整の前記試料を、試験管内で酸素と混和することによって、高濃度に調整した。

[0148] そして、グルコースセンサの電極間に 200mVの電圧を印加してから、前記試料を点着し、点着 5秒後の応答電流値を測定した。これらの各グルコースセンサについて、溶存酸素未調整の試料に対する前記応答電流値を基準として、前記式（10)より、他の試料に対する応答電流値の変化率（％)を求めた。また、比較例 7も、前記ダルコースセンサを用いて同様にして測定を行い、変化率（％)を求めた。これらの結果を図 6に示す。図 6は、試料中における溶存酸素濃度と変化率 (％)との関係を示すグラフであり、同図において〇が実施例 7、參が比較例 7の結果である。

[0149] 図 6に示すように、両性界面活性剤でなくァニオン性界面活性剤を用い、緩衝剤としてアミン系緩衝剤でなくリン酸ナトリウムを用いた比較例 7のグルコースセンサでは、スメクタイトを含有しているにも拘わらず、実施例 7と比較して、溶存酸素の影響を多大に受けていることがわかる。このことから、実施例のように、両性界面活性剤およびアミン系緩衝剤の存在下で、スメクタイトを含む無機ゲル層を形成することによって、試料中の酸素による影響を防止できることがわかる。また、比較例のようにァ-オン性界面活性剤を用いた場合、分散液を電極上に載せ難ぐ作製自体が困難であった。実施例 8

[0150] 以下に示す方法により、無機ゲル形成液を調製した以外は、前記実施例 1と同様にしてバイオセンサを作製した。

[0151] 合成スメクタイト（商品名ルーセンタイト SWN :コープケミカル社製） 0. 6g、 10% (w Zv) CHAPS (同仁ィ匕学研究所製)水溶液 lgおよび精製水 98. 4gとを混合し (合計 lOOg)、このスメクタイト懸濁液をー晚攪拌した。攪拌後の懸濁液 40gに、 2Nの HC1 (4g)を添加して一晩 (約 24時間)攪拌した (攪拌機：商品名マグネチックスターラー HS—3E ;株式会社井内盛栄堂製)。 HC1の添カ卩によって、前記懸濁液は白濁したが、ー晚攪拌した後、透明となった。さらに、この懸濁液に、 200mMコハク酸酢酸 Na 緩衝液 (pH4. 5)を、 1 : 1となるように混合した。この緩衝液を混合した後の懸濁液は、その pHが約 4. 5であった。前記緩衝剤をカ卩えた懸濁液に、さらにメディエータとして [Ru(NH) ]C1 (アルドリッチ社製)を 5% (w/v)となるように添加して、これを無機

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ゲル層形成液とした。なお、この無機ゲル形成液における組成物の最終濃度を以下に示す。

[0152]

ルーセンタイト S WN 0. 3 % (w/ v )

CHAP S 0. 3 % (w/v ) コハク酸酢酸 N a緩衝液（p H4. 5) 1 0 0 mM

[R u (NH ,) J C 1 , 5. 0 % (w/v) 産業上の利用可能性

[0153] 以上のように、本発明のバイオセンサの製造方法によれば、例えば、試料中の測定対象物を間接的に測定するための還元型メディエータが、測定雰囲気中の酸素や試料中の溶存酸素等によって再酸ィ匕されることを防止できるため、前記還元型メディエータの再酸ィ匕による測定誤差が解消され、測定精度に優れるノィォセンサを提供できる。

Claims

請求の範囲

[I] ノィォセンサの製造方法であって、

電極を有する基板を準備し、前記電極表面に、少なくともメディエータと界面活性剤と緩衝剤と層状無機化合物とを含有する無機ゲル層を形成する工程を含むバイオセンサの製造方法。

[2] 前記界面活性剤が両性界面活性剤である請求項 1記載の製造方法。

[3] 前記両性界面活性剤が、同一分子内に正電荷と負電荷とを有する界面活性剤である請求項 2記載の製造方法。

[4] 前記両性界面活性剤が、アルキルアミノカルボン酸塩、カルボキシベタイン、スルホベタインおよびホスホベタインカなる群力選択された少なくとも一つの界面活性剤である請求項 3記載の製造方法。

[5] 前記両性界面活性剤が、同一分子内に正電荷と負電荷とを有し、かつ、前記正電荷と負電荷とが離間している界面活性剤である請求項 2記載の製造方法。

[6] 前記両性界面活性剤が、カルボキシベタイン、スルホベタインおよびホスホべタイン力なる群力選択された少なくとも一つの界面活性剤である請求項 5記載の製造方法。

[7] 前記両性界面活性剤が、アルキルジメチルァミノ酢酸べタインである請求項 2記載の製造方法。

[8] 前記両性界面活性剤が、 CHAPS, CHAPSOおよびアルキルヒドロキシスルホべタイン力なる群力選択された少なくとも一つのスルホベタインである請求項 2記載の製造方法。

[9] 前記緩衝剤がアミン系緩衝剤である請求項 1または 2記載の製造方法。

[10] 前記アミン系緩衝剤力 Tris、 ACES, CHES、 CAPSO、 TAPS, CAPS, Bis— T ris、 TAPSO、 TES、 Tricineおよび AD Aからなる群から選択された少なくとも一つの物質である請求項 9記載の製造方法。

[I I] 前記緩衝剤がカルボキシル基を有する緩衝剤である請求項 1または 2記載の製造方法。

[12] 前記カルボキシル基を有する緩衝剤力酢酸酢酸 Na緩衝剤、リンゴ酸ー酢酸 Na 緩衝剤、マロン酸酢酸 Na緩衝剤およびコハク酸一酢酸 Na緩衝剤力もなる群力も選択された少なくとも一つの緩衝剤である請求項 11記載の製造方法。

[13] 少なくともメディエータと界面活性剤と緩衝剤と層状無機化合物とを含有する分散液を塗布することによって、前記無機ゲル層を形成する請求項 1または 2記載の製造方法。

[14] 界面活性剤と層状無機化合物とを分散媒に分散させた後、緩衝剤を添加し、さらに、メディエータを添加することによって前記分散液を調製する請求項 13記載の製造方法。

[15] 層状無機化合物を分散媒に分散させた後、界面活性剤を添加し、続いて、ァミン系緩衝剤を添加してから、さらに、メディエータを添加することによって前記分散液を調製する請求項 14記載の製造方法。

[16] 前記メデイエータが、フアリシアン化カリウム、シトクロム C、 PQQ、 NAD+、 NADP+、銅錯体およびルテニウム錯体力なる群力選択された少なくとも一つの物質である請求項 15記載の製造方法。

[17] 前記アミン系緩衝剤を添加した後の分散液の pH力 5— 9の範囲である請求項 15 記載の製造方法。

[18] 層状無機化合物を分散媒に分散させ、強酸性条件下で攪拌した後、界面活性剤を添カ卩し、続いてカルボキシル基を有する緩衝剤を添カ卩してから、さらに、メディエータを添加することによって前記分散液を調製する請求項 14記載の製造方法。

[19] 前記メディエータが、ルテニウム錯体、オスミウム錯体、フエ口セン、フエナジンメトサルフェート、インドフエノールおよびメチレンブルーからなる群から選択された少なくとも一つの物質である請求項 18記載の製造方法。

[20] 前記強酸性条件が、 pHl— 3の範囲である請求項 18記載の製造方法。

[21] カルボキシル基を有する緩衝剤を添カ卩した後の分散液の pH力 3— 6の範囲である請求項 18記載の製造方法。

[22] 前記無機ゲル層が、前記メディエータの自然酸化を防止する層である請求項 1記載の製造方法。

[23] 前記無機ゲル層の上に、さらに酸化還元酵素を含有する層を形成する請求項 1記載の製造方法。

[24] 前記分散液に、さらに酸化還元酵素を含有させ、前記酸化還元酵素を含有する無機ゲル層を形成する請求項 13記載の製造方法。

[25] 前記層状無機化合物が、層状粘土鉱物である請求項 1記載の製造方法。

[26] 前記層状粘土鉱物が、膨潤性層状粘土鉱物である請求項 25記載の製造方法。

[27] 前記分散液における層状無機化合物と界面活性剤との添加割合が、層状無機化合物 0. 3gに対して、界面活性剤 1一 200mmolの範囲である請求項 13記載の製造方法。

[28] 前記分散液における層状無機化合物と緩衝剤との添加割合が、層状無機化合物 0 . 3gに対して、緩衝剤 1一 lOOOmMの範囲である請求項 13記載の製造方法。

[29] 前記酸化還元酵素が、グルコースォキシダーゼ（GOD)、ビラノースォキシダーゼ、グルコースデヒドロゲナーゼ（GDH)、乳酸ォキシダーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、フルクトースデヒドロゲナーゼ、ガラクトースォキシダーゼ、コレステロールォキシダーゼ、コレステロ一ノレデヒドロゲナーゼ、ァノレコーノレオキシダーゼ、ァノレコーノレデヒドロゲナーゼ、ピリルビン酸ォキシダーゼ、グルコース 6—リン酸デヒドロゲナーゼ、アミノ酸デヒドロゲナーゼ、ギ酸デヒドロゲナーゼ、グリセローノレデヒドロゲナーゼ、アシノレー Co Aォキシダーゼ、コリンォキシダーゼ、 4ーヒドロキシ安息香酸ヒドロキシラーゼ、マレイン酸デヒドロゲナーゼ、サルコシンォキシダーゼおよびゥリカーゼからなる群力選択された少なくとも一つの酵素である請求項 23または 24記載の製造方法。

[30] 前記メディエータが、フェリシアン化カリウム、 p—べンゾキノンならびにその誘導体、インドフエノール誘導体、 j8—ナフトキノン 4ースルホン酸カリウム、フエ口セン誘導体、オスミウム錯体、ルテニウム錯体、 NAD+、 NADP+、ピロ口キノリンキノン（PQQ)、メチレンブルー、 cytochrome c、 cytochrome bおよび銅錯体からなる群から選択された少なくとも一つの物質である請求項 1記載の製造方法。

[31] 請求項 1記載のバイオセンサの製造方法により製造したバイオセンサ。