WO2005038030A1 - Rekombinate impfstoffe und deren verwendung - Google Patents

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mhc
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Özlem TÜRECI
Ugur Sahin
Sebastian Kreiter
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Definitions

  • the present invention relates to fusion molecules of antigens, the nucleic acids coding therefor and the use of such fusion molecules and nucleic acids.
  • the invention provides fusion molecules, or comprise an antigen and 'the transmembrane region and cytoplasmic region of an MHC Mo ⁇ eküls the cytoplasmic region of an MHC molecule or a SNARE relates.
  • Fusion molecules of the invention are useful in a variety of applications, including in methods of inducing an immune response in a mammal.
  • Antigen-specific T cell responses are mediated by antigenic peptides attached to the binding pit of glycoproteins of the major
  • MHC Histocompatibility complex
  • MHC class II molecules are heterodimeric glycoproteins composed of ⁇ and ⁇ chains. The ⁇ 1 and ⁇ 1 domains of these molecules fold together to form a peptide binding groove. Antigenic peptides bind to the MHC molecule through interaction between anchor amino acids on the peptide and the ⁇ 1 and ⁇ 1 domains.
  • the crystal structure of the human class II HLA-DR1 complex with an influenza virus peptide shows that the N- and C-terminal ends of the bound peptide extend from the binding groove such that the C-terminus of the peptide is close to the N-terminus of the ⁇ -peptide.
  • MHC class I molecules have domain organizations other than MHC class II molecules, but generally have a similar structure with a peptide binding site or trenches remote to the membrane domains [cf. eg Rudensk, AY et al., 1991, Nature 353: 622-627].
  • the initial step in the presentation of a foreign protein antigen is the binding of the native antigen to an antigen presenting cell (APC).
  • APC antigen presenting cell
  • antigens Upon binding to APCs, antigens enter the cells, either by phagocytosis, receptor-mediated endocytosis or pinocytosis.
  • Such internalized antigens are located in intracellular membrane-bound vesicles called endosomes.
  • the antigens After an endosome-lysosome fusion, the antigens are processed into small peptides by cellular proteases located in the lysosomes. The peptides associate with the ⁇ and ⁇ chains of MHC class II molecules within these lysosomes.
  • MHC class II molecules previously synthesized in the rough endoplasmic reticulum, are sequentially transported to the Golgi complexes and then to the lysosomal compartment.
  • the peptide-MHC complex is presented on the surface of APCs for T and B cell activation. Therefore, the accessibility of proteolytic processing sites in the antigen, the stability of the resulting peptides in the lysosomes and the affinities of the peptides for MHC molecules are factors determining the immunogenicity of a specific epitope.
  • Recombinant vaccines are of particular importance in human and veterinary medicine as active ingredients and medicaments for the prophylaxis and therapy of infectious and cancerous diseases.
  • Target of vaccination with A recombinant vaccine is to induce against a defined antigen a specific immune response that is preventive or therapeutically effective against defined diseases.
  • recombinant vaccines An important factor in the effectiveness of a recombinant vaccine is the optimal stimulation of T lymphocytes of the immunized organism. For example, a series of animal studies has shown that the optimal stimulation of both CD8 + and CD4 + lymphocytes is necessary for effective immunotherapy of tumors.
  • the known major forms of recombinant vaccines are based on recombinant proteins, synthetic peptide fragments, recombinant viruses and nucleic acid vaccines based on DNA or RNA. In recent years, vaccines based on DNA and RNA nucleic acid have become increasingly important. However, for very many targets, including tumor antigens, recombinant nucleic acid-based vaccines can achieve very poor to no stimulation of CD4 + lymphocytes.
  • vaccines that significantly increase antigen presentation and thus immunogenicity to a particular antigen. It would further be desirable to be able to systematically modify vaccines such that maximum immune response results from CD4 + and CD8 + lymphocytes without having to introduce foreign epitopes.
  • fusion molecules comprising antigen molecules and parts of histocompatibility antigens, when used as vaccines, exhibit> 100-fold increased immunogenicity over the unmodified antigens and, surprisingly, both immune responses of CD4 + and CD8 + T lymphocytes in previously not yet described manner be increased.
  • the present invention relates generally to fusion molecules of antigen molecules and to the use of such fusion molecules.
  • the invention relates to a fusion molecule comprising an antigen and the cytoplasmic region of a chain of an MHC molecule Antigen, a transmembrane region and the cytoplasmic region of a chain of an MHC molecule.
  • both the transmembrane region and the cytoplasmic region are derived from an MHC molecule.
  • the fusion molecule preferably does not comprise an MHC binding domain.
  • the invention further relates to a fusion molecule comprising an antigen and a chain of an MHC molecule or a part thereof, which part comprises at least the transmembrane region and the cytoplasmic region of the chain of the MHC molecule.
  • the portion of the chain of an MHC molecule does not include the MHC binding domain or portions thereof.
  • a fusion molecule comprising an antigen and the portion of a chain of an MHC molecule substantially corresponding to the sequence of the transmembrane region in association with the cytoplasmic region of an MHC molecule
  • the term "transmembrane region associated with the cytoplasmic region Region” refers to the portion of a chain of an MHC molecule which begins with the N-terminal end of the transmembrane region and terminates with the C-terminal end of the cytoplasmic region, in particular the C-terminal end of the entire chain of the MHC molecule
  • Embodiment corresponds to the connection of the transmembrane region with the cytoplasmic region of the naturally occurring compound between these regions.
  • a fusion molecule comprising an antigen and a chain of an MHC molecule or a portion thereof, wherein the portion lacks substantially all of the N-terminal extracellular domains of the MHC molecule.
  • the fusion molecules of the invention consist of a fusion of an antigen, optionally with a leader sequence at its N-terminal end a transmembrane region, preferably a transmembrane region of a chain of an MHC molecule, at the C-terminal end of the antigen and a cytoplasmic region of a chain of an MHC molecule at the C-terminal end of the transmembrane region.
  • the fusion molecules according to the invention comprise a leader sequence, preferably a peptide sequence with properties of a secretion signal, which in particular is able to control the translocation of a protein or peptide through a membrane.
  • the leader sequence may be the secretion signal of any type I transmembrane protein, the term "type I transmembrane protein" refers to those transmembrane proteins whose C-terminus is located in the cytoplasm
  • the leader sequence is derived from a chain of an MHC molecule
  • the leader sequence is at the N-terminal end of the fusion molecules of the invention.
  • the invention relates to a fusion molecule wherein substantially all of the N-terminal extracellular domains of an MHC molecule are replaced by an antigen having a leader sequence at its N-terminal end.
  • the antigen at its N-terminus is covalently linked to the C-terminus of a leader sequence, and the C-terminus of the antigen molecule is linked to the N-terminus of the transmembrane region, which in turn is at the C-terminus with the N-terminus the cytoplasmic region of an MHC molecule is connected.
  • the fusion molecule of the invention preferably has the following arrangement: N-terminus leader / antigen / transmembrane region / cytoplasmic region C-terminus.
  • the fusion molecule according to the invention consists essentially of the leader sequence, the antigen, the transmembrane region and the cytoplasmic region.
  • the antigen is a peptide, polypeptide or protein and the fusion molecule of the invention is a protein or polypeptide.
  • multiple antigens which may be the same or different, are present in the fusion molecule of the invention, i. at least 2, preferably 2 to 10, more preferably 2 to 5, even more preferably 2 to 3, in particular 2 antigens.
  • These multiply coupled antigens may be present as tandem constructs separately or in series, optionally separated by a linker. Preferably, this will trigger an immune response to various antigens upon administration.
  • the antigen may be complete or shortened, i. it contains only part of the natural protein or polypeptide that serves as the antigen.
  • the leader sequence and / or the transmembrane region of the fusion molecules of the invention are derived from MHC molecules, in particular class I or II. More preferably, the leader sequence and / or the transmembrane region and / or the cytoplasmic region of the fusion molecules of the invention are derived from MHC molecules, especially class I or II.
  • one or more, preferably flexible, linker sequences can also be present in the fusion molecule, which can be present between the guide sequence and the antigen, between the antigen and the transmembrane region and / or between the Transmembrane region and the cytoplasmic region.
  • a linker sequence comprises about 7 to 20 amino acids, more preferably about 8 to 16 amino acids, and in particular about 8 to 12 amino acids.
  • the linker sequence is preferably flexible and thus does not retain the associated peptide in a single, undesired conformation.
  • the linker preferably comprises especially amino acids with small side chains such as glycine, alanine and serine to allow flexibility.
  • the linker sequence does not contain a proline residue which could inhibit flexibility.
  • the leader sequence, the antigen, the transmembrane region and / or the cytoplasmic region are directly linked together without a linker.
  • the leader sequence preferably has the sequence shown in SEQ ID NO: 2 or a sequence derived therefrom or is encoded by the sequence shown in SEQ ID NO: 1 or a sequence derived therefrom.
  • the transmembrane cytoplasmic region preferably has the sequence shown in SEQ ID NO: 4 or 6 or a sequence derived therefrom or is encoded by the sequence shown in SEQ ID NO: 3 or 5 or a sequence derived therefrom.
  • the transmembrane cytoplasmic or exclusively cytoplasmic region of sequence-related MHC molecules (inter alia HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-E, HLA-F, HLA-DRa, HLA-DRb, HLA-DQa, HLA-DQb, HLA-DPa, HLA-DPb, CDla, CDlb, CDlc).
  • Preferred transmembrane cytoplasmic regions have a sequence selected from the group consisting of those shown in SEQ ID NO: 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41 Sequences and sequences derived therefrom.
  • the exclusively cytoplasmic regions comprise a sequence selected from the group consisting of those shown in SEQ ID NO: 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42 Sequences and sequences derived therefrom.
  • modified sequences such as modified or orthologous sequences from other organisms, is provided.
  • sequences which have more than 60% homology at the C-terminal end to those shown in SEQ ID NO: 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42 have shown sequences.
  • the fusion molecule according to the invention comprises the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 12 or 14 or a sequence derived therefrom.
  • the invention relates to a fusion molecule comprising an antigen and a SNARE protein (especially cis-golgi SNARE p28, VTIII, Membrin, pallidine, Syntaxin-5, Syntaxin-6, Syntaxin-7, Syntaxin-8, Syntaxin-10, SYNTAXIN -10A, Syntaxin-11, Syntaxin-12, Syntaxin-17, VAMP-2, VAMP-3, VAMP-4, VAMP-7, VAMP8, VTIla-beta, XP350893, LIP5 (SEQ ID NO: 43-63) ) or a sequence containing one or more SNARE motifs.
  • SNARE protein especially cis-golgi SNARE p28, VTIII, Membrin, pallidine, Syntaxin-5, Syntaxin-6, Syntaxin-7, Syntaxin-8, Syntaxin-10, SYNTAXIN -10A, Syntaxin-11, Syntaxin-12, Syntaxin-17, VAMP-2, VAMP-3, VAMP
  • the transport of the antigen can be targeted to a defined compartment (e.g., lysosomes and endosomes).
  • a defined compartment e.g., lysosomes and endosomes.
  • SNARE proteins are membrane-bound proteins whose common feature is the 60-70 amino acid SNARE motif. SNARE proteins are functional in the transport and fusion of vesicles in involved in the cell. Eukaryotic organisms have a wide variety of SNARE proteins associated with different vesicle membranes in the cell (including endosome, lysosomal, golgi, and plasma membranes). The cytoplasmic regions of the SNARE proteins perform a dual function.
  • the domains can contribute to the fusion of different vesicles (eg endosomes with lysosomes) through hetero and homoassociation.
  • the SNARE-antigen fusion molecules may also include linker sequences between the SNARE portion and the antigen portion. Further, regarding the antigen and the linker sequence of the SNARE-antigen fusion molecules, all the embodiments described above are included.
  • a linker preferably comprises 80-120 amino acids.
  • the linker includes a transmembrane region.
  • the invention relates to fusion molecules comprising a SNARE protein or a SNARE motif fused to an antigen or a transmembrane region and an antigen. Such fusion molecules are shown in Figure 7, for example.
  • nucleic acid also includes the derivatives thereof.
  • the nucleic acid which codes for a fusion molecule according to the invention comprises the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 11 or 13 or a sequence derived therefrom.
  • the invention also relates to host cells which contain a nucleic acid according to the invention.
  • the host cell may further comprise a nucleic acid encoding an HLA molecule.
  • the host cell expresses the HLA molecule endogenously.
  • the host cell expresses the HLA molecule recombinantly.
  • the host cell is non-proliferative.
  • the host cell is an antigen-presenting cell, in particular a dendritic cell, a monocyte or a macrophage.
  • the invention relates to a pharmaceutical composition, in particular a vaccine, which comprises one or more of the fusion molecules according to the invention and / or one or more of the nucleic acids coding therefor and / or one or more of the host cells according to the invention.
  • the invention provides a method for increasing the amount of MHC / peptide complexes in a cell, the method comprising providing a fusion molecule according to the invention or a nucleic acid coding therefor for the cell.
  • the cell is in a subject and the method comprises administering to the subject a fusion molecule or nucleic acid encoding the subject invention.
  • the cell is an antigen-presenting cell, in particular a dendritic cell, a monocyte or a macrophage.
  • the present invention provides a method of enhancing the presentation of cell surface molecules to cells capable of presenting antigens (such as B cells and macrophages, generally called "APC")
  • Antigen-presenting activity of such cells is achieved by providing a fusion molecule according to the invention or a nucleic acid coding therefor for the cells.
  • Such enhancement of antigen-presenting activity preferably enhances the primary activation of T cells, particularly CD4 + and CD8 + lymphocytes, which react with the antigen.
  • the cell is in a subject and the method comprises administering to the subject a fusion molecule or nucleic acid encoding the subject invention.
  • the invention provides a method for triggering an immune reaction in a living being, which method comprises the administration of a fusion molecule according to the invention and / or a nucleic acid coding for it and / or a host cell according to the invention to the living being.
  • the invention provides a method for stimulating or activating T cells, in particular CD4 + and CD8 + lymphocytes, in vitro or in a subject, in particular a patient, the method providing the T cells or administration to the living being of a fusion molecule according to the invention and / or a nucleic acid coding for it and / or a host cell according to the invention.
  • Such stimulation or activation preferably manifests itself in an expansion, cytotoxic reactivity and / or cytokine secretion of the T cells.
  • a method for the treatment, vaccination or immunization of a living being comprises the administration of a fusion molecule according to the invention and / or a nucleic acid coding for it and / or a host cell according to the invention to the living being.
  • a fusion molecule according to the invention and / or a nucleic acid coding for it and / or a host cell according to the invention to the living being.
  • antigens in the fusion molecule according to the invention or for it nucleic acid which, without the alteration according to the invention, are known to be effective for the intended treatment, vaccination or immunization.
  • the methods described above are particularly suitable for the treatment or prophylaxis of infectious diseases caused for example by bacteria or viruses.
  • the antigen used in the present invention is derived from an infectious agent such as hepatitis A, B, C, HIV, mycobacteria, malaria, SARS, herpesvirus, influenza virus, poliovirus, and bacterial agents such as chlamydia and mycobacteria.
  • an infectious agent such as hepatitis A, B, C, HIV, mycobacteria, malaria, SARS, herpesvirus, influenza virus, poliovirus, and bacterial agents such as chlamydia and mycobacteria.
  • a particularly useful application of the present invention is in cancer immunotherapy or vaccination, where in particular activation of tumor antigen-reactive T cells is enhanced, thereby improving the chances of T cell immunotherapy or vaccination against tumor cells.
  • the antigen used according to the invention is selected from the group consisting of the following antigens: p53, preferably encoded by the sequence shown in SEQ ID NO: 66, ART-4, BAGE, ss-catenin / m, Bcr-abL CAMEL, CAP-1, CASP-8, CDC27 / m, CDK4 / m, CEA, CLAUDIN-12, c-MYC, CT, Cyp-B, DAM, ELF2M, ETV6-AML1, G250, GAGE, GnT-V, Gap100, HAGE, HER-2 / neu, HPV-E7, HPV-E6, HAST-2, hTERT (or hTRT), LAGE, LDLR / FUT, MAGE-A, preferably MAGE-Al, MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE -A4, MAGE-A5, MAGE-A6, MAGE-A7, MAGE-A8, MAGE-
  • domain refers to a particular part of an amino acid sequence, which may be preferably associated with a particular function or structure.
  • the ⁇ and ⁇ polypeptides of an MHC class II molecule have two domains, ⁇ 1, ⁇ 2 and ⁇ 1, ⁇ 2, a transmembrane region and a cytoplasmic region, respectively.
  • the ⁇ chain of MHC class I molecules has three domains, ⁇ 1, ⁇ 2 and ⁇ 3, a transmembrane region and a cytoplasmic region.
  • the entire domain or region is included.
  • the sequence of the domain or region in question may be extended to include portions of a linker or even portions of the adjacent domain or region.
  • the term "substantially” with respect to a domain or region is to be understood in this sense.
  • transmembrane region refers to the portion of a protein which substantially constitutes the portion present in a cellular membrane and preferably serves to anchor the protein in the membrane
  • a transmembrane region is an amino acid sequence with a single passage through the membrane
  • a transmembrane region may also be used that has more than one passage through the membrane
  • the transmembrane region will generally have 15-25, preferably hydrophobic, uncharged amino acids, for example, adopting an ⁇ -helical conformation
  • the transmembrane region is a protein , selected from the group consisting of MHC molecules, immunoglobulins, CD4, CD8, the CD3 ⁇ chain, the CD3 ⁇ chain, the CD3 ⁇ chain and the CD3 ⁇ chain.
  • the transmembrane region consists of about 20 hydrophobic amino acids linked to the carboxy terminal end of the antigen. These residues allow protein spanning of the membrane: the transmembrane region terminates with about 6-32 residues comprising the cytoplasmic tail at the carboxy-terminal end of each of these chains. It has been shown that these transmembrane and cytoplasmic regions can be replaced by sequences signaling GPI binding and that the chimeric GPI-anchored class II molecules are membrane-bound (Wettstein, DA, JJ Boniface, PA Reay, H. Schild and MM Davis, 1991, J. Exp. Med. 174: 219-228).
  • GPI-linked membrane anchor domains have been defined in a variety of proteins, including decay accelerating factor (DAF), CD59, and human placental alkaline phosphatase (HPAP) (Wettstein, Vol. DA, JJ et al., 1991, J. Exp. Med. 174: 219-228)
  • DAF decay accelerating factor
  • HPAP human placental alkaline phosphatase
  • the 38 carboxy-terminal amino acids of HPAP are sufficient for a signal sequence function for GPL binding DNA sequence is joined to a secreted molecule, such as the soluble portion of the MHC class II ⁇ or ⁇ chain, forming a membrane-bound chimeric molecule (Wettstein, DA et al., 1991, J. Exp. Med 174: 219-228) and such a method can be used for anchoring fusion molecules of the invention to a cell membrane.
  • MHC major histocompatibility complex
  • TCR T cell receptors
  • MHC proteins or molecules function in signaling between Lymphocytes and antigen presenting cells in normal immune responses by binding peptides and presenting them for potential recognition by T cell receptors (TCR).
  • TCR T cell receptors
  • MHC molecules bind peptides in an intracellular processing compartment and present these peptides on the surface of antigen-presenting cells to T cells.
  • the human MHC region also referred to as HLA, is located on chromosome 6 and includes the class I region and the class II region.
  • MHC class I refers to the major histocompatibility complex class I proteins or genes. Within the MHC class I region in humans are the HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-E, HLA-F, CDla, CDIb and CDIC subregions.
  • Class I ⁇ -chains are glycoproteins with a molecular weight of about 44 kDa.
  • the polypeptide chain is just over 350 amino acid residues long. It can be divided into three functional regions: an external, a transmembrane and a cytoplasmic region.
  • the external region is 283 amino acid residues long and divided into three domains, ⁇ l, ⁇ 2 and ⁇ 3.
  • the domains and regions are usually encoded by separate exons of the class I gene.
  • the transmembrane region spans the lipid bilayer of the plasma membrane. It consists of 23 mostly hydrophobic amino acid residues, which are arranged in an ⁇ -helix.
  • the cytoplasmic region i.
  • the cytoplasmic portion that joins the transmembrane region is typically 32 amino acid residues long and has the ability to interact with the elements of the cytoskeleton.
  • the ⁇ chain interacts with ⁇ 2 microglobulin to form ⁇ - ⁇ 2 dimers on the cell surface.
  • MHC class II refers to the major histocompatibility complex class II proteins or genes.
  • DP, DQ and DR Subregions for class II ⁇ chain and ⁇ chain genes ie DP ⁇ , DP ⁇ , DQ ⁇ , DQ ⁇ , DR ⁇ and DR ⁇ .
  • Class II molecules are heterodimers consisting of one ⁇ - and one ⁇ -chain. Both chains are glycoproteins with a molecular weight of 31-34 kDa ( ⁇ ) or 26-29 kDa ( ⁇ ). The total length of the ⁇ chains varies from 229 to 233 amino acid residues, that of the ⁇ chains from 225 to 238 residues. Both ⁇ and ⁇ chains consist of an external region, a linking peptide, a transmembrane region and a cytoplasmic tail. The external region consists of two domains, ⁇ l and ⁇ 2 or ⁇ l and ⁇ 2. The connecting peptide is 13 or 9 residues long in ⁇ - and ⁇ -chains.
  • the length of the cytoplasmic region i. the portion facing the cytoplasm, which adjoins the transmembrane region, varies from 3 to 16 residues in ⁇ -chains and from 8 to 20 residues in ⁇ -chains.
  • the term "chain of an MHC molecule” refers to the ⁇ -chain of an MHC class I molecule or to the ⁇ and ⁇ chains of an MHC class II molecule, and the ⁇ -chains of an MHC class I molecule from which the fusion molecules of the invention may be derived include the HLA-A, -B and C- ⁇ chains
  • the ⁇ -chains of an MHC class II molecule from which the fusion molecules of the invention may be derived include HLA-DR, -DP and -DQ- ⁇ chains, in particular HLA-DRI, HLA-DR2, HLA-DR4, HLA-DQ1, HLA-DQ2 and HLA-DQ8- ⁇ chains and in particular ⁇ -chains which are encoded by DRA * 0101, DRA * 0102, DQA 1 * 0301 or DQA1 * 0501 alleles
  • the ⁇ -chains of an MHC class II molecule from which the fusion molecules according to the invention are derived may include HLA-DR,
  • MHC binding domain refers to the "MHC class I binding domain” and "MHC class II binding domain”.
  • MHC class I binding domain refers to the region of an MHC class I molecule or an MHC class I chain that is necessary for binding to an antigenic peptide
  • An MHC class I binding domain is primarily characterized by Although the ⁇ 3 domain of the ⁇ chain and ⁇ 2 microglobulin are not essential parts of the binding domain, they are believed to stabilize the overall MHC class structure I molecule important and therefore the term "MHC class I binding domain” preferably includes these regions.
  • An MHC class I binding domain can also be essentially defined as the extracellular domain of an MHC class I molecule, which distinguishes it from the transmembrane and cytoplasmic regions.
  • MHC class II binding domain refers to the region of an MHC class II molecule or an MHC class II chain necessary for binding to an antigenic peptide
  • An MHC class II binding domain is primarily characterized by The ⁇ 1 and ⁇ 1 domains of MHC class II ⁇ and ⁇ chains are believed to be formed, but the ⁇ 2 and ⁇ 2 domains of these proteins are believed to be important in stabilizing the overall structure of the MHC binding groove, and therefore the The term "MHC class II binding domain” according to the invention preferably these regions.
  • An MHC class II binding domain can also be essentially defined as the extracellular domain of an MHC class II molecule, which distinguishes it from the transmembrane and cytoplasmic domain.
  • the exact number of amino acids in the various MHC molecule domains or regions will vary depending on the mammalian species as well as between gene classes within a species. In choosing the amino acid sequence of a particular domain or region, it is more important to maintain the function of the domain or region than the exact structural definition based on the number of amino acids. Furthermore, it is known to those skilled in the art that the function can be maintained even if slightly less than the entire amino acid sequence of the selected domain or region is used.
  • the term “antigen” refers to an agent against which an immune reaction is to be generated.
  • the term “antigen” includes in particular proteins, peptides, polysaccharides, nucleic acids, in particular RNA and DNA, and nucleotides.
  • the term “antigen” also includes derivatized antigens as the first by conversion (eg intermediately in the molecule, by completion with Cincinnatieiticians) becoming antigenic - and sensitizing - secondary substance and conjugated antigens by artificial incorporation of atomic groups (eg isocyanates, diazonium salts) a new constitutive
  • the antigen is a tumor antigen, ie a constituent of cancer cells which can originate from the cytoplasm, the cell surface and the nucleus, in particular those antigens that are produced intracellularly or as surface antigens on tumor cells, examples being the carcinoembryonic one Antigen, ⁇ 1-fetoprotein, isoferritin and fetal sulfoglycoprotein,
  • MHC-binding peptide refers to a peptide that binds to an MHC class I and / or an MHC class II molecule.
  • the binding peptides are typically 8-10 amino acids in length, although longer or shorter peptides may be effective.
  • the binding peptides are typically 10-25 amino acids long, and more preferably 13-18 amino acids long, although longer and shorter peptides may be effective.
  • Fusion molecules according to the invention and the nucleic acids coding therefor can generally be prepared by recombinant DNA techniques such as production of plasmid DNA, cleavage of DNA with restriction enzymes, ligation of DNA, transformation or transfection of a host, cultivation of the host and isolation and purification of the expressed fusion molecule , Such methods are known and e.g. in Sambrook et al., Molecular Cloning, (2nd edition, 1989).
  • DNA encoding the antigen can be obtained by isolating DNA from natural sources or by known synthetic methods such as the phosphate triester method; see. e.g. Oligonucleotide Synthesis, IRL Press (M.J. Gait, ed., 1984). Synthetic oligonucleotides can also be made using commercially available automatic oligonucleotide synthesizers.
  • the proportions of MHC molecules of the fusion molecules according to the invention correspond in a suitable manner with respect to the amino acid sequence naturally occurring MHC molecules of human, mouse or other rodents or other mammals, or are derivatives thereof.
  • DNA sources encoding MHC proteins are known, such as human lymphoblastoid cells. After isolation, the gene coding for the MHC molecule or a part of interest thereof can be amplified by polymerase chain reaction (PCR) or other known methods. Suitable PCR primers for the amplification of the gene for the MHC peptide may add restriction sites to the PCR product.
  • PCR polymerase chain reaction
  • DNA constructs are prepared which comprise nucleic acid sequences encoding the leader, transmembrane and cytoplasmic regions and which contain a restriction site between the leader and the transmembrane region such that substantially any nucleotide sequence encoding an antigen of interest is incorporated into the construct can.
  • DNA sequences are arranged such that the C-terminal end of the leader sequence is linked to the N-terminal end of the antigen, the C-terminal end of the antigen to the N-terminal end of the transmembrane region, and the C-terminal end of the transmembrane region is bound to the N-terminal end of the cytoplasmic region.
  • restriction sites are incorporated between the tail of the leader sequence and the beginning of the transmembrane region so that substantially any nucleic acid encoding an antigen of interest can be linked to the nucleic acid sequence for the transmembrane region.
  • An expressed fusion molecule according to the invention can be isolated and purified in a manner known per se. Typically that will Centrifuged culture medium and the supernatant then purified by affinity or immunoaffinity method, comprising the use of monoclonal antibodies that bind to the expressed fusion molecule.
  • the fusion molecule may also contain a sequence that supports purification, eg, a 6xHis tag.
  • T cells are provided for testing by transformed T cell lines, such as T cell hybridomas or T cells isolated from a mammal, such as a human, or a rodent, such as a mouse.
  • Suitable T cell hybridomas are freely available or can be prepared in a manner known per se.
  • T cells can be isolated from a mammal in a manner known per se; see. e.g. Shimonkevitz, R. et al., 1983, J. Exp. Med. 158: 303.
  • T cells suitably express a marker that can be tested and that indicates T cell activation or modulation of T cell activity upon activation.
  • the mouse T cell hybridoma DO 11.10 which expresses interleukin-2 (IL-2) upon activation, can be used.
  • IL-2 concentrations can be measured to determine if a specific presenting peptide is capable of modulating the activity of this T cell hybridoma.
  • T cells are obtained, for example, from a T-cell hybridoma of interest or by isolation from a mammal. 2. The T cells are cultured under conditions that allow for propagation.
  • the growing T cells are contacted with antigen-presenting cells, which in turn are contacted with an inventive
  • Fusion molecule or a nucleic acid coding for it were brought into contact.
  • T cells are assayed for a label, e.g. the IL-2 production is measured.
  • T cells used in the assays are incubated under conditions suitable for proliferation.
  • a DO ll. lO-T cell hybridoma is suitably incubated at about 37 ° C and 5% CO2 in complete medium (RPMI 1640 supplemented with 10% FBS, penicillin / streptomycin, L-glutamine and 5 x 10 -5 M 2-mercaptoethanol).
  • RPMI 1640 supplemented with 10% FBS, penicillin / streptomycin, L-glutamine and 5 x 10 -5 M 2-mercaptoethanol.
  • Serial dilutions of the fusion molecule of the invention can be tested.
  • T cell activation signals are provided by antigen presenting cells that have been loaded with the appropriate antigenic peptide.
  • the modulation of T cell activation can be suitably determined by altering the proliferation of antigen-dependent T cells, as measured by known radiolabelling methods.
  • a labeled (such as tritiated) nucleotide can be introduced into a test culture medium. The introduction of such a labeled nucleotide into the DNA serves as a measure of T cell proliferation. This test is not suitable for T cells that do not require antigen presentation for growth, such as T cell hybridomas.
  • the assay is suitable for measuring the modulation of T-cell activation by fusion molecules in the case of untransformed T cells isolated from mammals.
  • a fusion molecule of the invention to induce an immune response, including vaccination against a target disease, can be readily determined by an in vivo assay.
  • a fusion molecule of the invention or a nucleic acid encoding it can be administered to a mammal such as a mouse and blood samples from the mammal at the time of the first administration and several times thereafter (such as 1, 2, 5 and 8 weeks after administration of the fusion molecule or the nucleic acid coding for it) are taken. Serum is obtained from the blood samples and tested for the appearance of antibodies produced by the immunization. Antibody concentrations can be determined.
  • T-lymphocytes can be isolated from the blood or from lymphatic organs and can be functionally tested for reactivity against the antigen or epitopes derived from the antigen. All "readout" systems known to the person skilled in the art, inter alia proliferation assay, cytokine secretion, cytotoxic activity, tetramer analysis can be used here.
  • Methods of the present invention for inducing an immune response may be used in combination with known methods for the induction of an immune response.
  • a fusion molecule of the invention or a nucleic acid encoding it can be administered to a subject in an array or combination with the administration of a vaccine composition to enhance or prolong the desired effect of such a vaccine composition.
  • derived means according to the invention that a particular object, in particular a specific sequence, is present in the object from which it is derived, in particular an organism or molecule
  • Case of nucleic acid and amino acid sequences, in particular specific sequence regions also means “derived” that the respective nucleic acid or amino acid sequence is derived in accordance with the following definitions from a nucleic acid or amino acid sequence present in the object
  • MHC molecule derived sequence or region is meant that the sequence or region is present in an MHC molecule or derived from a sequence or region present in an MHC molecule in accordance with the definitions below.
  • a nucleic acid is preferably according to the invention
  • Nucleic acids according to the invention comprise genomic DNA, cDNA, mRNA, recombinantly produced and chemically synthesized molecules. According to the invention, a nucleic acid can be present as a single-stranded or double-stranded and linear or covalently circular closed molecule.
  • a sequence derived from a nucleic acid sequence or the term "sequence derived from a nucleic acid sequence” according to the invention relates to homologous sequences and derivatives of the former sequence.
  • Homologous nucleic acid sequences according to the invention have at least 40%, in particular at least 50%, at least 60%, at least 70%, at least 80%, at least 90% and preferably at least 95%, at least 98 or at least 99% identity of the nucleotides.
  • a nucleic acid is in particular "homologous" to another nucleic acid if the two sequences of the complementary strands can hybridize to one another and form a stable duplex, the hybridization preferably taking place under conditions which permit specific hybridization between polynucleotides (stringent conditions) Conditions are for example in Molecular Cloning: A Laboratory Manual, J. Sambrook et al., Eds., 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989 or Current Protocols in Molecular Biology, FM Ausubel et al., Eds.
  • hybridization buffer 3.5x SSC, 0.02% Ficoll, 0.02% polyvinylpyrrolidone, 0.02% bovine serum albumin, 2, 5 mM NaH 2 PO 4 (pH 7), 0.5% SDS, 2 mM EDTA.
  • SSC is 0.15 M sodium chloride / 0.15 M sodium citrate, pH 7.
  • the membrane to which the DNA has been transferred is, for example, in 2 ⁇ SSC at room temperature and then in 0.1 ⁇ 0.5 ⁇ SSC / 0, 1 x SDS at temperatures up to 68 ° C washed.
  • derivatives of a nucleic acid is meant according to the invention that single or multiple nucleotide substitutions, deletions and / or additions are present in the nucleic acid Furthermore, the term “derivative” also includes a chemical derivatization of a nucleic acid on a base, a sugar or a phosphate nucleotide. The term “derivative” also includes nucleic acids containing non-naturally occurring nucleotides and nucleotide analogs.
  • isolated nucleic acid means that the nucleic acid (i) was amplified in vitro, for example by polymerase chain reaction (PCR), (ii) was produced recombinantly by cloning, (iii) was purified, for example by cleavage and gel electrophoresis separation, or (iv) was synthesized, for example, by chemical synthesis
  • PCR polymerase chain reaction
  • isolated nucleic acid is a nucleic acid available for manipulation by recombinant DNA techniques.
  • Nucleic acids which code for fusion molecules can be present according to the invention alone or in combination with other nucleic acids, in particular heterologous nucleic acids.
  • a nucleic acid is operably linked to expression control sequences or regulatory sequences that may be homologous or heterologous relative to the nucleic acid.
  • a coding sequence and a regulatory sequence are then "operably linked” if covalently linked such that the expression or transcription of the coding sequence is under the control or under the influence of the regulatory sequence Protein is to be translated, results in a functional connection of a regulatory sequence with the coding sequence, an induction of the regulatory sequence to a transcription of the coding sequence, without causing a frame shift in the coding sequence or an inability of the coding sequence, in the desired protein or peptide to be translated.
  • expression control sequence or “regulatory sequence” according to the invention comprises promoters, enhancers and other control elements which control the expression of a gene.
  • the expression control sequences are regulatable.
  • the precise structure of regulatory sequences may vary species-dependent or cell-type-dependent, but generally includes 5 'untranscribed and 5' untranslated sequences involved in the initiation of transcription, such as TATA box, capping sequence , CAAT sequence and the like.
  • 5 'untranscribed regulatory sequences include a promoter region that includes a promoter sequence for a transcriptional control of the functionally linked gene.
  • Regulatory sequences may also include enhancer sequences or upstream activator sequences.
  • the nucleic acid according to the invention is a vector, optionally with a promoter containing the Expression of a nucleic acid, for example a nucleic acid which codes for a fusion molecule of the invention controls.
  • the promoter is a T7, T3 or SP6 promoter.
  • vector is used in its most general meaning and encompasses any intermediary vehicles for a nucleic acid which, for example, make it possible to introduce the nucleic acid into prokaryotic and / or eukaryotic cells and, if appropriate, to integrate it into a genome replicated and / or expressed in the cell
  • An intermediate vehicle may be adapted, for example, for use in electroporation, microprojectile bombardment, liposomal delivery, Agrobacterium transfer or insertion via DNA or RNA viruses include plasmids, phagemids, bacteriophages or viral genomes.
  • nucleic acids which code for a fusion molecule according to the invention can be used for transfection of host cells.
  • nucleic acids is meant both recombinant DNA and RNA.
  • Recombinant RNA can be made by in vitro transcription from a DNA template. It can also be modified prior to application by stabilizing sequences, capping and polyadenylation.
  • the term “host cell” refers to any cell that is transformable or transfectable with an exogenous nucleic acid.
  • the term “host cells” includes according to the invention prokaryotic (eg E. coli) or eukaryotic (eg dendritic cells, B cells, CHO cells, COS Cells, K562 cells, yeast cells and insect cells). Particularly preferred are mammalian cells such as human, mouse, hamster, pig, goat and primate cells.
  • the cells can be derived from a variety of tissue types and include primary cells and cell lines. Specific examples include keratinocytes, peripheral blood leukocytes, stem cells of the Bone marrow and embryonic stem cells.
  • the host cell is an antigen-presenting cell, in particular a dendritic cell, a monocyte or macrophage.
  • a nucleic acid may be present in the host cell in a single or multiple copies and is expressed in an embodiment in the host cell.
  • RNA or of RNA and protein also includes a partial expression of nucleic acids
  • the expression can be transient or stable Preferred expression systems in mammalian cells include pcDNA3. 1 and pRc / CMV (Invitrogen, Carlsbad, CA) containing a selectable marker such as a gene conferring resistance to G418 (thus allowing selection of stably transfected cell lines) and the cytomegalovirus enhancer-promoter sequences (CMV ).
  • CMV cytomegalovirus enhancer-promoter sequences
  • a nucleic acid coding for a fusion molecule according to the invention may also comprise a nucleic acid sequence which codes for an MHC molecule, preferably for an HLA molecule.
  • the nucleic acid sequence encoding an MHC molecule may be on the same expression vector as the nucleic acid encoding the fusion molecule, or both nucleic acids may be on different expression vectors. In the latter case, the two expression vectors can be cotransfected into a cell.
  • a sequence derived from an amino acid sequence or the term "sequence derived from an amino acid sequence” according to the invention relates to homologous sequences and derivatives of the former sequence.
  • Homologous amino acid sequences according to the invention have at least 40%, in particular at least 50%, at least 60%, at least 70%, at least 80%, at least 90% and preferably at least 95%, at least 98 or at least 99% identity of the amino acid residues.
  • “Derivatives” of a protein or polypeptide or of an amino acid sequence for the purposes of this invention include amino acid insertion variants, amino acid deletion variants and / or amino acid derivatives.
  • Amino acid insertion variants include amino- and / or carboxy-terminal fusions, as well as insertions of single or multiple amino acids in a particular amino acid sequence.
  • amino acid sequence variants with one insertion one or more amino acid residues are introduced into a predetermined site in an amino acid sequence, although random insertion with appropriate screening of the resulting product is also possible.
  • Amino acid deletion variants are characterized by the removal of one or more amino acids from the sequence.
  • Amino acid substitution variants are characterized in that at least one residue in the sequence is removed and another residue is inserted in its place. Preferably, the modifications are at positions in the amino acid sequence that are not conserved between homologous proteins or polypeptides.
  • amino acids are replaced by others having similar properties, such as hydrophobicity, hydrophilicity, electronegativity, side chain volume, and the like (conservative substitution).
  • conservative substitutions refer to the replacement of one amino acid by another, both amino acids being listed in the same group below:
  • amino acid variants described above can be readily synthesized by known peptide synthesis techniques such as e.g. through "Solid Phase
  • Inserting substitution mutations at predetermined sites in DNA having a known or partially known sequence are well known and include e.g. M13 mutagenesis.
  • “Derivatives” of proteins or polypeptides according to the invention also include single or multiple substitutions, deletions and / or additions of any molecules associated with the protein or polypeptide, such as carbohydrates, lipids and / or proteins or polypeptides.
  • derivatives of proteins or polypeptides include those modified analogs that have been synthesized by glycosylation, acetylation, phosphorylation, amidation, palmitoylation, myristolylation, isoprenylation, lipidation, alkylation, derivatization, protection / blocking groups, proteolytic cleavage, or attachment to a protein Antibody or to another cellular ligand arise.
  • Derivatives of proteins or polypeptides may also be prepared by other methods, such as, for example, by chemical cleavage with cyanogen bromide, trypsin, chymotrypsin, papain, V8 protease, NaBH 2 , acetylation, formylation, oxidation, reduction, or by metabolic synthesis in the presence of tunicamycin.
  • compositions according to the invention can be used therapeutically for the treatment of an already existing disease or prophylactically as vaccines for immunization.
  • the term "vaccine” relates to an antigenic preparation which comprises, for example, a protein, a peptide, a nucleic acid or a polysaccharide and which is administered to a recipient in order to stimulate its humoral and / or cellular immune system against one or more antigens which
  • the terms "vaccination” or “immunization” refer to the process of administering a vaccine and stimulating an immune response to an antigen.
  • the term “immune response” refers to the activities of the immune system, including activation and proliferation of specific cytotoxic T cells. Cells after contact with an antigen.
  • Animal models may be useful for testing an immunizing effect against, for example, cancer using a tumor-associated antigen Be used antigen.
  • human cancer cells can be introduced into a mouse for the creation of a tumor, and a nucleic acid according to the invention which codes for a fusion molecule according to the invention comprising the tumor-associated antigen can be administered.
  • the effect on the cancer cells e.g., reduction in tumor size
  • one or more fusion molecules are administered with one or more adjuvants for induction of an immune response or enhancement of an immune response.
  • An adjuvant is a substance that is incorporated into or coadministered with an antigen and enhances the immune response
  • Adjuvants can enhance the immune response by providing an antigen reservoir (extracellular or in macrophages), activating macrophages and stimulating certain lymphocytes.
  • Adjuvants include, but are not limited to, monophosphoryl lipid-A (MPL, SmithKline Beecham), saponins such as QS21 (SmithKline Beecham), DQS21 (SmithKline Beecham, WO 96/33739), QS7, QS17, QS18, and QS-L1 (So et al., Mol.
  • the fusion molecules are administered in a mixture with DQS21 / MPL.
  • the ratio of DQS21 to MPL is typically about 1:10 to 10: 1, preferably about 1: 5 to 5: 1 and most preferably about 1: 1.
  • DQS21 and MPL are typically in a vaccine formulation in a range of about 1 ⁇ g to about 100 ⁇ g.
  • Other substances that stimulate a patient's immune response may also be administered.
  • cytokines are useful in vaccination because of their regulatory properties on lymphocytes.
  • cytokines include, for example, interleukin-12 (IL-12), which has been shown to enhance the protective effects of vaccines (see Science 268: 1432-1434, 1995), GM-CSF and IL-18.
  • the method according to the invention for the induction of an immune reaction in a mammal generally comprises the administration of an effective amount of a fusion molecule according to the invention and / or a nucleic acid coding therefor, in particular in the form of a vector.
  • DNA or RNA encoding a fusion molecule of the invention is administered to a mammal along with a DNA sequence encoding a T cell co-stimulating factor, such as a gene encoding B7-1 or B7-2.
  • T-cell co-stimulatory factor refers to a molecule, particularly a peptide, which is capable of providing a co-stimulatory signal and thereby enhances an immune response, particularly the proliferation of T cells in the presence of one or more Such activation of T cell proliferation can be determined by well-known tests.
  • co-stimulatory molecules provided in the form of proteins or nucleic acids.
  • co-stimulatory molecules are, for example, B7-1 and B7-2 (CD80 or CD86), which are expressed on dendritic cells (DC) and interact with the CD28 molecule expressed on the T cells.
  • This interaction provides co-stimulation (signal 2) for an antigen / MHC / TCR-stimulated (signal 1) T cell, thereby enhancing T cell proliferation and effector function.
  • B7 also interacts with CTLA4 (CD 152) on T cells and studies involving CTLA4 and B7 ligands, show that B7-CTLA4 interaction can enhance anti-tumor immunity and CTL proliferation (Zheng, P. et al., Proc. Natl. Acad. See U.S.A. 95 (II): 6284-6289 (1998)).
  • B7 is typically not expressed on tumor cells, so they are not effective antigen presenting cells (APCs) for T cells. Induction of B7 expression would allow tumor cells to more effectively stimulate proliferation of cytotoxic T lymphocytes and effector function. Co-stimulation by a combination of B7 / IL-6 / IL-12 showed induction of the IFN gamma and Th1 cytokine profile in a T cell population, resulting in further enhanced T cell activity (Gajewski et al., J. Immunol., 154: 5637-5648 (1995)).
  • cytotoxic T lymphocytes and complete effector function requires involvement of T helper cells through the interaction between the CD40 ligand on T helper cells and the CD40 molecule expressed by dendritic cells (Ridge et al. Nature 393: 474 (1998), Bennett et al., Nature 393: 478 (1998), Schonberger et al., Nature 393: 480 (1998)).
  • the mechanism of this co-stimulatory signal is probably related to the enhancement of B7 and associated IL-6 / IL-12 production by the dendritic cells (antigen presenting cells).
  • the CD40-CD40L interaction thus complements the interactions of signal 1 (antigen / MHC-TCR) and signal 2 (B7-CD28).
  • nucleic acids nucleic acids, polypeptides or proteins and / or cells
  • Administration of DNA and RNA is preferred.
  • a viral vector for the administration of a nucleic acid encoding a fusion molecule of the invention is selected from the group consisting of adenoviruses, adeno-associated viruses, poxviruses, including vaccinia virus and attenuated poxviruses, Semliki forest virus, retroviruses, Sindbis virus and Tyrosus-like particles. Particularly preferred are adenoviruses and retroviruses.
  • the retroviruses are usually replication-deficient (i.e., they are unable to produce infectious particles).
  • nucleic acids in cells in vitro or in vivo. Such methods include transfection of nucleic acid-calcium phosphate precipitates, transfection of nucleic acids associated with DEAE, transfection or infection with the above viruses carrying the nucleic acids of interest, liposome-mediated transfection, and the like.
  • control of the nucleic acid to particular cells is preferred.
  • a carrier used to deliver a nucleic acid to a cell eg, a retrovirus or a liposome
  • a carrier used to deliver a nucleic acid to a cell may be used will have a bound targeting molecule.
  • a molecule such as an antibody specific for a surface membrane protein on the target cell or a ligand for a receptor on the target cell can be incorporated into or bound to the nucleic acid carrier.
  • proteins that bind to a surface membrane protein associated with endocytosis may be incorporated into the liposome formulation to facilitate targeting and / or uptake.
  • proteins include capsid proteins or fragments thereof that are specific for a particular cell type, antibodies to proteins that are internalized, proteins that target an intracellular site, and the like.
  • the nucleic acids are administered together with stabilizing substances such as RNA-stabilizing substances.
  • administration of nucleic acids is by ex vivo methods, i. by removing cells from a patient, genetically altering the cells, and reintroducing the altered cells into the patient.
  • This generally involves introducing a functional copy of a gene into the cells of a patient in vitro and returning the genetically altered cells to the patient.
  • the functional copy of the gene is under functional control of regulatory elements that allow expression of the gene in the genetically engineered cells. Transfection and transduction methods are known in the art.
  • administration of nucleic acids in vivo through the use of vectors such as viruses and targeted liposomes.
  • patient means according to the invention human, non-human primate or other animal, in particular mammal such as cow, horse, pig, sheep, goat, dog, cat, birds such as chicken or rodent such as mouse and Rat
  • patient, the individual or the animal is a human.
  • compositions of the invention can be administered in pharmaceutically acceptable formulations.
  • Such preparations may ordinarily contain pharmaceutically acceptable concentrations of salts, poisons, preservatives, carriers, supplemental immunity enhancing agents such as adjuvants (e.g., CpG oligonucleotides) and cytokines and optionally other therapeutic agents.
  • supplemental immunity enhancing agents such as adjuvants (e.g., CpG oligonucleotides) and cytokines and optionally other therapeutic agents.
  • the therapeutic agents of the present invention can be administered by any conventional route, including injection or infusion.
  • the administration may be, for example, orally, intravenously, intraperitoneally, intramuscularly, subcutaneously, intracutaneously, transdermally, intralymphatically, preferably by injection into lymph nodes, in particular inguinal lymph nodes, lymphatic vessels and / or into the spleen.
  • compositions of the invention are administered in effective amounts.
  • An "effective amount” refers to the amount which, alone or in conjunction with other doses, produces a desired response or effect: in the case of treatment of a particular disease or condition, the desired response is inhibition of disease progression Progression of the disease, and in particular an interruption in the progression of the disease.
  • the desired response to treatment of a disease or condition may also be the delay of the onset or prevention of the onset of the disease or condition.
  • compositions of the invention will depend on the condition being treated, the severity of the disease, the individual parameters of the patient, including age, physiological condition, height and weight, duration of treatment, type of concomitant therapy (if any) specific route of administration and similar factors.
  • compositions of the invention are preferably sterile and contain an effective amount of the therapeutically active substance for the production of the desired reaction or effect.
  • compositions of the present invention administered may depend on various parameters such as mode of administration, condition of the patient, desired administration period, etc. In the event that a patient's response is insufficient at an initial dose, higher doses (or effectively higher doses achieved by a different, more localized route of administration) may be employed.
  • doses of the tumor-associated antigen are formulated and administered from 1 ng to 1 mg, preferably from 10 ng to 100 ⁇ g. If administration of nucleic acids (DNA as well as RNA) is desired, doses of 1 ng to 0.1 mg are formulated and administered.
  • compositions of the invention are generally administered in pharmaceutically acceptable amounts and in pharmaceutically acceptable compositions.
  • pharmaceutically acceptable refers to a non-toxic material which does not interfere with the action of the active ingredient of the pharmaceutical composition
  • Such preparations may usually contain salts, buffers, preservatives, carriers and optionally other therapeutic agents
  • non-pharmaceutically acceptable salts may be used in the preparation of pharmaceutically acceptable salts thereof and are encompassed by the present invention.
  • Such pharmacologically and pharmaceutically acceptable salts include, but are not limited to, those made from the following acids: hydrochloric,
  • salts may also be prepared as alkali metal or alkaline earth metal salts such as sodium, potassium or calcium salts.
  • a pharmaceutical composition of the invention may comprise a pharmaceutically acceptable carrier.
  • pharmaceutically acceptable carrier refers to one or more compatible solid or liquid fillers, diluents or capsule substances suitable for administration to a human
  • carrier refers to an organic or inorganic ingredient, natural or synthetic, in U.S. Pat the active ingredient is combined to facilitate an application.
  • the components of the pharmaceutical composition according to the invention are usually such that no interaction occurs which substantially impairs the desired pharmaceutical activity.
  • the carriers are sterile liquids such as water or oils, including those derived from petroleum, animals or plants or of synthetic origin, such as peanut oil, soybean oil, Mineral oil, sesame oil, sunflower oil and the like. Salt solutions and aqueous dextrose and glycerol solutions can also be used as aqueous carrier substances.
  • sterile liquids such as water or oils, including those derived from petroleum, animals or plants or of synthetic origin, such as peanut oil, soybean oil, Mineral oil, sesame oil, sunflower oil and the like.
  • Salt solutions and aqueous dextrose and glycerol solutions can also be used as aqueous carrier substances.
  • excipients and carriers are acrylic and methacrylic derivatives, alginic acid, sorbic acid derivatives such as ⁇ -octadecyl- ⁇ -hydroxypoly (oxyethylene) -5-sorbic acid, amino acids and derivatives thereof, in particular amine compounds such as choline, lecithin and phosphatidylcholine, gum arabic, flavorings, Ascorbic acid, carbonates such as sodium, potassium, magnesium and calcium carbonate and bicarbonate, hydrogen phosphates and phosphates of sodium, potassium, calcium and magnesium, carmellose sodium, dimethicone, dyes, flavoring agents, buffering agents, preservatives, thickeners, plasticizers, gelatin, glucose syrups , Malt, fumed silica, hydromellose, benzoates, especially sodium and potassium benzoate, macrogol, skimmed milk powder, magnesium oxide, fatty acids and their derivatives and salts such as stearic acid and stearates, in particular magnesium and calcium stearate
  • the pharmaceutical compositions may additionally contain wetting agents, emulsifiers and / or pH buffering agents.
  • the pharmaceutical compositions may contain a absorption enhancer. These absorption enhancers may, if desired, replace an equimolar amount of the carrier in the composition. Examples of such absorption enhancers include, but are not limited to, eucalyptol, N, N-diethyl-m-toruamide, polyoxyalkylene alcohols (such as propylene glycol and polyethylene glycol), N-methyl-2-pyrrolidone, isopropyl myristate,
  • DMF Dimethylformamide
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • DMA dimethylacetamide
  • urea diethanolamine, triethanolamine, and the like (see, e.g., Percutaneous Penetration Enhancers, ed., Smith et al., (CRC Press, 1995)).
  • the amount of absorption enhancer in the composition may depend on the desired effects to be achieved.
  • a protease inhibitor can be incorporated into the composition of the invention to avoid degradation of a peptide or protein drug and thereby increase bioavailability.
  • protease inhibitors include, but are not limited to, aprotinin, leupepsin, pepstatin, ⁇ 2-macroglobulin and trypsin inhibitor. These inhibitors may be used alone or in combination.
  • compositions of the invention may be provided with one or more coatings.
  • the solid oral dosage forms are provided with an enteric coating or are in the form of an enteric-coated, hardened soft gelatin capsule.
  • the pharmaceutical compositions of the invention may contain suitable buffers such as acetic acid in a salt, citric acid in a salt, boric acid in a salt, and phosphoric acid in a salt.
  • suitable buffers such as acetic acid in a salt, citric acid in a salt, boric acid in a salt, and phosphoric acid in a salt.
  • suitable preservatives such as benzalkonium chloride, chlorobutanol, parabens and thimerosal.
  • compositions are usually presented in a unit dosage form and can be prepared in a manner known per se.
  • compositions may be in the form of capsules, tablets, lozenges, solutions, suspensions, syrups, elixirs or as an emulsion.
  • compositions suitable for parenteral administration usually comprise a sterile aqueous or nonaqueous preparation of the active ingredient which is preferably isotonic with the blood of the recipient.
  • Compatible carriers and solvents include Ringer's solution and isotonic sodium chloride solution.
  • sterile, fixed oils are usually used as the solution or suspension medium.
  • FIG. 1 Schematic representation of a fusion protein according to the invention.
  • the fusion protein consists of an N-terminal secretion signal, a C-terminal localized transmembrane and cytoplasmic domain of a histocompatibility antigen and an integrated complete or partial sequence of an antigen.
  • Figure 2 Schematic representation of the cassettes for the expression of fusion proteins.
  • SP signal peptide
  • MCS multiple cloning site
  • TM transmembrane domain
  • MHC tail cytoplasmic tail of an MHC molecule
  • Antigen Sequence coding for an antigen against which immune responses are to be induced
  • Figure 3 Testing the effect of different doses of RNA on the frequency of antigen-specific CD4 + T lymphocytes.
  • 1 ⁇ 10 6 purified CD4 + lymphocytes were cocultivated for 1 week with 2 ⁇ 10 5 DC, which had been transfected with RNA in the indicated amounts (0, 1-10 ug RNA) by electroporation.
  • an ELISPOT was performed under standard conditions to detect interferon-gamma-secreting T lymphocytes.
  • As antigen-presenting cells DC from the same donor loaded with overlapping pp65 peptides (1.75 ⁇ g / ml) or an irrelevant control peptide were used.
  • 3 x 10 4 2 x 10 4 DC effectors were co-incubated for 16 h.
  • the number of IFN-gamma-secreting T lymphocytes was determined by software-based video analysis. Compared to the CMVpp65 standard RNA, massive expansion of CD4 + lymphocytes is demonstrated by both the CMVpp65-TM1 and CMVpp65-TM2 constructs.
  • Figure 4 Testing the effect of different doses of RNA on the frequency of interferon-gamma-secreting CD8 + T lymphocytes.
  • 1 ⁇ 10 6 purified CD8 + lymphocytes were cocultivated for 1 week with 2 ⁇ 10 5 DC, which had been transfected with RNA in the indicated amounts (0, 1-10 ug RNA) by electroporation.
  • a standard ELISPOT was performed to detect IFN-gamma-secreting T lymphocytes against DC of the same donor overlaying with overlapping pp65 peptides (1.75 ⁇ g / ml) or irrelevant ControUpeptid had been loaded.
  • 3 ⁇ 10 4 2 ⁇ 10 4 DC effectors were co-incubated for 16 h.
  • the number of IFN-gamma-secreting T lymphocytes was determined by means of a software-based video evaluation.
  • CD8 + lymphocytes There was a massive expansion of CD8 + lymphocytes by the CMV ⁇ 65-TM1 and CMVpp65-TM2 constructs.
  • the frequency of pp65-specific CD8 + lymphocytes is still above background after stimulation with NYESO RNA transfected DC (data not shown).
  • Stimulation by the CMVpp65 standard construct only showed an expansion of pp65-specific lymphocytes above the background level above 2.5 ⁇ g.
  • FIG. 5 Dose-response profile for the expansion capacity of different immunogens on antigen-specific lymphocytes.
  • the immunogens modified according to the invention have a markedly increased potency (> 100 ⁇ ) and a higher maximum effect.
  • Figure 6 Comparative test of the effect of modified immunogens and standard immunogens according to the invention on the generation of cytotoxic immune responses.
  • 1 ⁇ 10 6 purified CD8 + lymphocytes were cocultivated for 1 week with 2 ⁇ 10 5 DC, which had been transfected with 10 ⁇ g of RNA by electroporation.
  • CD8 + lymphocytes were expanded which showed significant specific lysis but did not reach the levels of CMVpp65-TMl and -TM2. Only a weak stimulation of pp65-specific cytotoxic T cells could be achieved by the CMVpp65 standard construct.
  • Figure 7 Schematic representation of the cassettes for the expression of fusion proteins.
  • CS cloning site
  • TM transmembrane domain
  • SNARE SNARE protein or motif
  • Antigen Sequence coding for an antigen against which immune responses are to be induced
  • FIG. 8 Sequences used in the examples HLA class I TM CM: transmembrane cytoplasmic region of an HLA class I molecule; HLA class II-TM-CM: transmembrane cytoplasmic region of an HLA class II molecule
  • Figure 9 Sequences of transmembrane cytoplasmic regions or cytoplasmic regions of MHC molecules.
  • Sequences show the transmembrane cytoplasmic region or only the cytoplasmic region of different HLA molecules.
  • the transmembrane region is underlined and fat
  • Figure 10 Sequences of SNARE proteins. These sequences are suitable for construction of the SNARE-antigen fusion molecules of the invention (N-SNARE antigen)
  • FIG. 11 Stimulation of naive CD8 + T lymphocytes by fusion constructs according to the invention.
  • Microliter plates were used to stimulate 1 ⁇ 10 5 CD8 + lymphocytes per well against 2 ⁇ 10 4 DC transfected with 20 ⁇ g CMVpp65-TM1 or control RNA.
  • the medium was supplemented with IL-6 (1000 U / ml) and IL-12 (10 ng / ml).
  • IL-6 1000 U / ml
  • IL-12 10 ng / ml
  • a cassette was first prepared in an expression vector which allows the transcription of RNA, which allows the expression of fusion genes.
  • the nucleic acid which codes for a signal peptide of an HLA molecule was first amplified from human lymphocytes and the fragment was cloned into a vector as cDNA (SEQ ID NO: 1 and 2).
  • the cloning was carried out in such a way that there were various restriction enzyme cleavage sites behind the signal of the signal peptide and additional fragments could be cloned into the expression cassette "in frame.”
  • vectors plasmids were selected which had a 5 'RNA polymerase promoter T3, T7, and SP6, respectively, allow expression of RNA in vitro
  • the next fragment was a cDNA cloned into this vector, which contains a transmembrane domain and the cytoplasmic domain of HLA class I (SEQ ID NOS: 3 and 4) and a Class II (SEQ ID NO: 5 and 6) encoded molecule, including stop codon
  • the cloning was performed such that the resulting plasmid between the two fragments still contains restriction enzyme cleavage sites for antigens (SEQ ID NOS: 7 and 8 and 6)
  • the model antigen for the human cytomegalovirus phosphoprotein 65 (pp65) coding sequence SEQ ID NO: 9 and
  • CMVpp65 standard unmodified CMVpp65 sequence, standard immunogen
  • CMVpp65-TM1 fusion nucleic acid from the following fragments: HLA class I secretion signal, pp65 ORF and HLA class I transmembrane and cytoplasmic domain (modified immunogen).
  • CMVpp65-TM2 fusion nucleic acid from the following fragments: HLA class I secretion signal, pp65 ORF and HLA class II transmembrane and cytoplasmic domain (modified immunogen).
  • CMVpp65standard CMVpp65TMl
  • CMVpp65TM2 The three nucleic acids (CMVpp65standard, CMVpp65TMl, CMVpp65TM2) were used as an immunogen in s stimulation experiments with autologous DC 'antigen-positive donors.
  • CD4 and CD8 immune responses separately, purified CD4 + and CD8 + lymphocytes were used.
  • the read-out was the enzyme-linked immuno-spot assay
  • ELISPOT which is recognized as the standard assay for quantifying IFN- ⁇ secreting T cells.
  • CD8 + T lymphocytes were subjected to a standard chromium release assay.
  • Stimulation control were 's loaded DC with overlapping peptides of pp65 and with KontroUpeptid. The so treated DC 's were over
  • Example 3 Stimulation of naive CD8 + T lymphocytes by HLA fusion antigens
  • dendritic cells of a CMV-negative donor were included RNA of the unmodified CMVpp65, or transfected with CMV ⁇ p65-TMl-RNA or with a control RNA (NY-Eso-1).
  • the transfected dendritic cells were used to stimulate autologous CD8 + lymphocytes. Two restimulations were performed at weekly intervals with frozen transfected dendritic cells.
  • Example 4 Use of HLA fusion antigens for stimulating tumor cell-reactive T lymphocytes
  • the tumor antigen TPTE tumor antigen
  • Tumor antigen WT1 as variant C SEQ ID NO: 65
  • tumor antigen p53 SEQ ID NO: 66
  • WT1-HLA-TM1 RNA with unmodified WT1 RNA or irrelevant
  • HLA-TM1 transfected dendritic cells by a factor of secretion 6-9 was higher compared to co-incubation after transfection with unmodified WT1.
  • the modified immunogens lead to significantly increased stimulation and expansion of antigen-specific CD4 + lymphocytes (increased proliferation of CD4 + lymphocytes)
  • the modified immunogens lead to significantly increased stimulation and expansion of antigen-specific CD8 + lymphocytes (increased proliferation of CD8 + lymphocytes)
  • the modified immunogens lead to a significantly increased cytotoxic reactivity of antigen-specific CD8 + lymphocytes (increased cytotoxic effect)
  • the modified immunogens are 100 times more potent with respect to the
  • the modified immunogens have a greater effect on the expansion of antigen-specific CD4 + lymphocytes than standard immunogens, even at 100 times lower dose
  • the modifications according to the invention of an antigen result in a potency increased over 100 times (left shift of the dose-response curve) and a drastically increased biological effectiveness.
  • An important result of the invention is that at the same time antigen-specific CD4 + and CD8 + lymphocytes are optimally stimulated and expanded. Stimulation of the CD8 + and CD4 + lymphocytes is of crucial importance for the efficacy, especially of therapeutic vaccines.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft Fusionsmoleküle von Antigenen, die dafür kodierenden Nukleinsäuren und die Verwendung derartiger Fusionsmoleküle und Nukleinsäuren. Insbesondere betrifft die Erfindung Fusionsmoleküle, die ein Antigen und die Transmembranregion und cytoplasmatische Region eines MHC-Moleküls bzw. die cytoplasmatische Region eines MHC oder eines SNARE-Moleküls umfassen.

Description

Rekombinante Impfstoffe und deren Verwendung
Die vorliegende Erfindung betrifft Fusionsmoleküle von Antigenen, die dafür kodierenden Nukleinsäuren und die Verwendung derartiger Fusionsmoleküle und Nukleinsäuren. Insbesondere betrifft die Erfindung Fusionsmoleküle, die ein Antigen und' die Transmembranregion und cytoplasmatische Region eines MHC-Moϊeküls bzw. die cytoplasmatische Region eines MHC- oder eines SNARE-Moleküls umfassen.
Erfindungsgemäße Fusionsmoleküle sind für eine Vielzahl von Anwendungen verwendbar, einschließlich in Verfahren zur Induktion einer Immunreaktion in einem Säuger.
Antigen-spezifische T-Zell- Reaktionen werden durch antigene Peptide, die an die Bindungsgrube von Glykoproteinen des Haupt-
Histokompatibilitätskomplexes (MHC) gebunden sind, als Teil des Mechanismus des Immunsystems hervorgerufen, bei dem fremde Antigene identifiziert und eine Reaktion gegen sie ausgelöst wird. Die gebundenen antigenen Peptide interagieren mit T- Zeil-Rezeptoren und modulieren so eine Immunreaktion. Die antigenen Peptide sind nicht-kovalent an bestimmte „Bindetaschen" gebunden,, die von polymorphen Resten der Bindungsgrube des MHC-Proteins gebildet werden.
MHC Klasse II-Moleküle sind heterodimere Glykoproteine, die aus α- und ß- Ketten bestehen. Die αl- und ß l-Domänen dieser Moleküle falten sich zusammen und bilden eine Peptid-Bindungsgrube. Antigene Peptide binden an das MHC-Molekül durch Interaktion zwischen Anker-Aminosäuren auf dem Peptid und den αl- und ßl-Domänen. Die Kristallstruktur des menschlichen Klasse II-HLA-DR1 -Komplexes mit einem Influenzavirus- Peptid zeigt, dass sich die N- und C-terminalen Enden des gebundenen Peptids aus der Bindungsgrube erstrecken, so dass der C-Terminus des Peptids nahe zum N-Terminus der ß-Kette liegt [Brown, J.H. et al., 1993, Nature 364:33-39; Stern, L.J. et al., 1994, Nature 368:215-221]. MHC Klasse I-Moleküle besitzen andere Domänen-Organisationen als MHC Klasse II-Moleküle, jedoch im Allgemeinen eine ähnliche Struktur mit einer Peptid- Bindestelle oder -grübe, die zu den Membrandomänen entfernt liegt [vgl. z.B. Rudensk , A.Y. et al., 1991 , Nature 353:622-627].
Der anfängliche Schritt bei der Präsentation eines fremden Protein-Antigens ist die Bindung des nativen Antigens an eine Antigen-präsentierende Zelle (APC). Nach Bindung an APCs dringen Antigene in die Zellen ein, entweder durch Phagozytose, Rezeptor-vermittelte Endozytose oder Pinozytose. Derartige internalisierte Antigene sind in intrazellulären Membrangebundenen Vesikeln, die Endosome genannt werden, lokalisiert. Nach einer Endosomen-Lysosomen-Fusion werden die Antigene in kleine Peptide durch in den Lysosomen gelegene zelluläre Proteasen prozessiert. Die Peptide assoziieren mit den α- und ß-Ketten von MHC Klasse II-Molekülen innerhalb dieser Lysosomen. Diese MHC Klasse II-Moleküle, die zuvor im rauen endoplasmatischen Retikulum synthetisiert worden waren, werden sequentiell an die Golgi-Komplexe und sodann an das lysosomale Kompartiment transportiert. Der Peptid-MHC-Komplex wird auf der Oberfläche von APCs für eine T- und B -Zeil- Aktivierung präsentiert. Daher sind die Zugängigkeit von proteolytischen Prozessierungsstellen in dem Antigen, die Stabilität der resultierenden Peptide in den Lysosomen und die Affinitäten der Peptide für MHC-Moleküle bestimmende Faktoren für die Immunogenität eines spezifischen Epitops.
Rekombinante Impfstoffe haben in der Human- und Veterinärmedizin eine besondere Bedeutung als Wirkstoffe und Arzneimittel für die Prophylaxe und Therapie von Infektions- und Krebserkrankungen. Ziel einer Impfung mit einem rekombinanten Impfstoff ist, gegen ein definiertes Antigen eine spezifische Immunreaktion zu induzieren, die präventiv oder therapeutisch gegen definierte Krankheiten wirksam ist.
Ein für die Effektivität eines rekombinanten Impfstoffs wesentlicher Faktor ist die optimale Stimulation von T-Lymphozyten des immunisierten Organismus. So belegt eine Reihe von tierexperimentellen Untersuchungen, dass für eine effektive Immuntherapie von Tumoren sowohl die optimale Stimulation von CD8+- als auch CD4+-Lymphozyten notwendig ist. Die bekannten Hauptformen von rekombinanten Vakzinen basieren auf rekombinanten Proteinen, synthetischen Peptidfragmenten, rekombinanten Viren und Nukleinsäureimpf Stoffen auf DNA- bzw. RNA-Basis. In den letzten Jahren bekamen Impfstoffe auf DNA- und RNA-Nukleinsäurebasis eine zunehmende Bedeutung. Für sehr viele Ziele, unter anderem Tumorantigene, lässt sich jedoch mit rekombinanten Impfstoffen auf Nukleinsäurebasis eine nur sehr schlechte bis gar keine Stimulation von CD4+-Lymphozyten erreichen. Daher wurde eine Reihe gentechnischer Modifikationen entwickelt, mit der Absicht, die Immunogenität von rekombinanten Impfstoffen zu erhöhen. Hierbei sind bisher verschiedene Verfahren getestet worden, u.a. Verfremdung von Immunogenen durch Veränderung der Primärsequenz oder durch Fusion an Fremdepitope z.B. von Bakterien oder Viren [Lowenadler, B. et al., 1990, Eur. J. Immunol. 20: 1541-45; Clarke, B. E. et al., 1987, Nature 330: 381-84] und Herstellung von chimären Produkten, bestehend aus dem eigentlichen Antigen und immunmodulatorischen Proteinen wie z.B. Zytokinen [Ruckert, R. et al., 1998, Eur. J. Immunol. 28: 3312-20; Harvill, E. T., J. M. Fleming, und S. L. Morrison, 1996, J. Immunol. 157: 3165-70]. Impfstoffe, die auf Verfremdung basieren, induzieren zwar verstärkte Immunantworten, haben jedoch den großen Nachteil, dass die Immunstimulation gegen das Fremdepitop dominiert und dass Immunantworten gegen das eigentliche Vakzinetarget z.T. nur moderat bleiben. Eine weitere attraktive Möglichkeit ist die Fusion mit Sequenzen von Proteinen, die eine Translokation des Proteins in degradierende Zellkompartimente erlauben sollen. Diese Modifikationen führen jedoch, wie mittlerweile bekannt, nur zu einer mäßig verbesserten Stimulation von CD4+-Lymphozyten und kaum zu einer Verstärkung von CD8+- Immunantworten [Wu, T. C. et al., 1995, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 92: 11671-11675; Bonini, C. et al., 2001, J. Immunol. 166: 5250-57, Su, Z. et al., 2002, Cancer Res. 62: 5041-5048].
Somit wäre es wünschenswert, über Impfstoffe zu verfügen, die die Antigenpräsentation und damit die Immunogenität gegen ein bestimmtes Antigen deutlich erhöhen. Es wäre weiterhin wünschenswert, Impfstoffe systematisch so modifizieren zu können, dass eine maximale Immunantwort durch CD4+- und CD8+-Lymphozyten resultiert, ohne Fremdepitope einführen zu müssen.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß durch den Gegenstand der Patentansprüche gelöst.
Erfindungsgemäß konnte festgestellt werden, dass Fusionsmoleküle, die Antigenmoleküle und Teile von Histokompatibilitätsantigenen umfassen, bei einer Verwendung als Impfstoffe eine um > 100-fach gesteigerte Immunogenität gegenüber den unmodifizierten Antigenen aufweisen und dass überraschenderweise sowohl Immunantworten von CD4+- als auch CD8+-T-Lymphozyten in bisher noch nicht beschriebener Weise erhöht werden.
Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein Fusionsmoleküle von Antigenmolekülen und die Verwendung derartiger Fusionsmoleküle.
In einem Aspekt betrifft die Erfindung ein Fusionsmolekül, das ein Antigen und die cytoplasmatische Region einer Kette eines MHC-Moleküls, bzw. ein Antigen, eine Transmembranregion und die cytoplasmatische Region einer Kette eines MHC-Moleküls umfasst. Vorzugsweise sind sowohl die Transmembranregion als auch die cytoplasmatische Region von einem MHC- Molekül abgeleitet. Weiterhin umfasst das Fusionsmolekül vorzugsweise keine MHC-Bindedomäne.
Die Erfindung betrifft ferner ein Fusionsmolekül, das ein Antigen und eine Kette eines MHC-Moleküls oder einen Teil davon umfasst, wobei der Teil mindestens die Transmembranregion und die cytoplasmatische Region der Kette des MHC-Moleküls umfasst. Vorzugsweise umfasst der Teil der Kette eines MHC-Moleküls nicht die MHC-Bindedomäne oder Teile davon. Somit wird insbesondere ein Fusionsmolekül bereitgestellt, das ein Antigen und den Teil einer Kette eines MHC-Moleküls umfasst, der im Wesentlichen der Sequenz der Transmembranregion in Verbindung mit der cytoplasmatischen Region eines MHC-Moleküls entspricht, wobei der Begriff „Transmembranregion in Verbindung mit der cytoplasmatischen Region" den Abschnitt einer Kette eines MHC-Moleküls betrifft, der mit dem N-terminalen Ende der Transmembranregion beginnt und mit dem C-terminalen Ende der cytoplasmatischen Region, insbesondere dem C-terminalen Ende der gesamten Kette des MHC-Moleküls abschließt. In dieser Ausführungsform entspricht die Verbindung der Transmembranregion mit der cytoplasmatischen Region der natürlich auftretenden Verbindung zwischen diesen Regionen.
Weiterhin wird erfindungsgemäß ein Fusionsmolekül bereitgestellt, das ein Antigen und eine Kette eines MHC-Moleküls oder einen Teil davon umfasst, wobei bei dem Teil im Wesentlichen die gesamten N-terminalen extrazellulären Domänen des MHC-Moleküls fehlen.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform bestehen die erfindungsgemäßen Fusionsmoleküle aus einer Fusion eines Antigens, gegebenenfalls mit einer Leitsequenz an seinem N-terminalen Ende, mit einer Transmembranregion, vorzugsweise einer Transmembranregion einer Kette eines MHC-Moleküls, am C-terminalen Ende des Antigens und einer cytoplasmatischen Region einer Kette eines MHC-Moleküls am C-terminalen Ende der Transmembranregion.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform umfassen die erfindungsgemäßen Fusionsmolekule eine Leitsequenz, vorzugsweise eine Peptidsequenz mit Eigenschaften eines Sekretionssignals, das insbesondere in der Lage ist, die Translokation eines Proteins oder Peptids durch eine Membran zu steuern. Als Leitsequenz kann das Sekretionssignal jedes Typ-I Transmembranproteins genutzt werden, wobei der Begriff „Typ-I Transmembranprotein" solche Transmembranproteine betrifft, deren C- Terminus im Cytoplasma lokalisiert ist. In einer besonderes Ausführungsform ist die Leitsequenz von einer Kette eines MHC-Moleküls abgeleitet. Vorzugsweise befindet sich die Leitsequenz am N-terminalen Ende der erfindungsgemäßen Fusionsmoleküle.
In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein Fusionsmolekül, wobei im Wesentlichen die gesamten N-terminalen extrazellulären Domänen eines MHC-Moleküls durch ein Antigen mit einer Leitsequenz an dessen N- terminalen Ende ersetzt sind.
In einem erfindungsgemäßen Fusionsmolekül ist vorzugsweise das Antigen an seinem N-Terminus kovalent mit dem C-Terminus einer Leitsequenz verbunden und der C-Terminus des Antigenmoleküls ist mit dem N- Terminus der Transmembranregion verbunden, die ihrerseits am C- Terminus mit dem N-Terminus der cytoplasmatischen Region eines MHC- Moleküls verbunden ist.
Somit weist das erfindungsgemäße Fusionsmolekül vorzugsweise folgende Anordnung auf: N-Terminus-Leitsequenz/Antigen/Transmembranregion /cytoplasmatische Region-C-Terminus. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform besteht das erfindungsgemäße Fusionsmolekül im Wesentlichen aus der Leitsequenz, dem Antigen, der Transmembranregion und der cytoplasmatischen Region.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist das Antigen ein Peptid, Polypeptid oder Protein und das erfindungsgemäße Fusionsmolekül ist ein Protein oder Polypeptid.
In einer Ausführungsform sind mehrere Antigene, die gleich oder verschieden sein können, in dem erfindungsgemäßen Fusionsmolekül vorhanden, d.h. mindestens 2, vorzugsweise 2 bis 10, mehr bevorzugt 2 bis 5, noch mehr bevorzugt 2 bis 3, insbesondere 2 Antigene. Diese mehrfach gekoppelten Antigene können getrennt voneinander oder in Serie nacheinander, gegebenenfalls durch einen Linker getrennt, als Tandemkonstrukte vorliegen. Vorzugsweise wird dadurch bei Verabreichung eine Immunreaktion gegen verschiedene Antigene ausgelöst.
Das Antigen kann vollständig oder verkürzt sein, d.h. es enthält nur einen Teil des natürlichen Proteins oder Polypeptids, das als Antigen dient.
Vorzugsweise sind die Leitsequenz und/ oder die Transmembranregion der erfindungsgemäßen Fusionsmoleküle von MHC-Molekülen, insbesondere der Klasse I oder II abgeleitet. Mehr bevorzugt sind die Leitsequenz und/ oder die Transmembranregion und/ oder die cytoplasmatische Region der erfindungsgemäßen Fusionsmoleküle von MHC-Molekülen, insbesondere der Klasse I oder II abgeleitet.
Erfindungsgemäß können auch eine oder mehrere, vorzugsweise flexible Linkersequenzen (Verbindungssequenzen) in dem Fusionsmolekül vorhanden sein, die zwischen der Leitsequenz und dem Antigen, zwischen dem Antigen und der Transmembranregion und/ oder zwischen der Transmembranregion und der cytoplasmatischen Region liegen können. Vorzugsweise umfasst erfindungsgemäß eine Linkersequenz etwa 7 bis 20 Aminosäuren, besser etwa 8 bis 16 Aminosäuren, und insbesondere etwa 8 bis 12 Aminosäuren.
In erfindungs emäßen Fusionsmolekülen ist die Linkersequenz vorzugsweise flexibel und hält so das damit verbundene Peptid nicht in einer einzigen, ungewünschten Konformation. Der Linker umfasst vorzugsweise vor allem Aminosäuren mit kleinen Seitenketten wie Glycin, Alanin und Serin, um eine Flexibilität zu ermöglichen. Vorzugsweise enthält die Linkersequenz keinen Prolinrest, der die Flexibilität hemmen könnte.
In einer weiteren Ausführungsforrn sind die Leitsequenz, das Antigen, die Transmembranregion und/ oder die cytoplasmatische Region direkt ohne einen Linker miteinander verbunden.
Die Leitsequenz weist vorzugsweise die in SEQ ID NO: 2 gezeigte Sequenz oder eine davon abgeleitete Sequenz auf bzw. wird durch die in SEQ ID NO: 1 gezeigte Sequenz oder eine davon abgeleitete Sequenz kodiert. Die Transmembran-cytoplasmatische Region weist vorzugsweise die in SEQ ID NO: 4 bzw. 6 gezeigte Sequenz oder eine davon abgeleitete Sequenz auf bzw. wird durch die in SEQ ID NO: 3 bzw. 5 gezeigte Sequenz oder eine davon abgeleitete Sequenz kodiert.
In weiteren bevorzugten Ausführungsformen ist die Transmembran- cytoplasmatische bzw. die ausschließlich cytoplasmatische Region von sequenzverwandten MHC-Molekülen (u.a. HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-E, HLA-F, HLA-DRa, HLA-DRb, HLA-DQa, HLA-DQb, HLA-DPa, HLA-DPb, CDla, CDlb, CDlc) abgeleitet. Bevorzugte Transmembran-cytoplasmatische Regionen weisen eine Sequenz auf, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den in SEQ ID NO: 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41 dargestellten Sequenzen und davon abgeleiteten Sequenzen. In weiteren Ausführungsformen weisen die ausschließlich cytoplasmatischen Regionen eine Sequenz auf, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den in SEQ ID NO: 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42 dargestellten Sequenzen und davon abgeleiteten Sequenzen. In weiteren Ausführungsformen ist auch die Verwendung von abgewandelten Sequenzen, z.B. modifizierten oder orthologen Sequenzen aus anderen Organismen, vorgesehen. Besonders bevorzugt sind dabei Sequenzen, die am C-terminalen Ende eine Homologie von mehr als 60% zu den in SEQ ID NO: 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42 gezeigten Sequenzen aufweisen.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsforr umfasst das erfindungsgemäße Fusionsmolekül die in SEQ ID NO: 12 bzw. 14 gezeigte Arninosäuresequenz oder eine davon abgeleitete Sequenz.
Weiterhin betrifft die Erfindung ein Fusionsmolekül, umfassend ein Antigen und ein SNARE-Protein (insbesondere Cis-golgi SNARE p28, VTIlb, Membrin, Pallidin, Syntaxin-5, Syntaxin-6, Syntaxin-7, Syntaxin-8, Syntaxin-10, SYNTAXIN-lOa, Syntaxin- 11, Syntaxin-12, Syntaxin-17, VAMP- 2, VAMP-3, VAMP-4, VAMP-7, VAMP8, VTI l-a-beta, XP350893, LIP5 (SEQ ID NO: 43-63)) bzw. eine Sequenz, welche ein oder mehrere SNARE-Motive beinhaltet. Durch Fusion eines Antigens mit einem SNARE-Protein oder SNARE-Motiv (bevorzugt am C-Terminus des SNARE-Proteins oder -Motivs) kann der Transport des Antigens gezielt in ein definiertes Kompartiment erfolgen (z.B. Lysosomen und Endosomen) . Durch einen derartigen gezielten Transport können ferner immunogene Epitope des Antigens in einem Kompartiment generiert und präsentiert werden, was experimentell feststellbar ist.
SNARE-Proteine sind membranständige Proteine, deren gemeinsames Merkmal das 60-70 Aminosäuren umfassende SNARE-Motiv ist. SNARE- Proteine sind funktionell in dem Transport und der Fusion von Vesikeln in der Zelle involviert. Eukaryontische Organismen verfügen über eine Vielzahl verschiedener SNARE-Proteine, die mit unterschiedlichen Vesikelmembranen in der Zelle (u.a. Endosomen-, Lysosomen-, Golgi-, Plasmamembran) assoziiert sind. Die cytoplasmatischen Regionen der SNARE-Proteine üben eine Doppelfunktion aus. Zum einen dienen sie als „Trafficing"-Signale (Adressetiketten), die den Zielort des Proteins und der dazugehörigen Membran vorgeben. Zum anderen können die Domänen durch Hetero- und Homoassoziation (Zusammenlagerung) zur Verschmelzung unterschiedlicher Vesikel (z.B. Endosomen mit Lysosomen) beitragen.
Erfindungsgemäß können auch die SNARE-Antigen-Fusionsmoleküle Linkersequenzen zwischen dem SNARE-Anteil und dem Antigenanteil beinhalten. Ferner sind bezüglich des Antigens und der Linkersequenz der SNARE-Antigen-Fusionsmoleküle alle vorstehend beschriebenen Ausführungsformen umfasst. Bezüglich der SNARE-Antigen- Fusionsmoleküle umfasst ein Linker vorzugsweise 80-120 Aminosäuren. In einer besonderen Ausführungsforrn beinhaltet der Linker eine Transmembranregion. Somit betrifft die Erfindung Fusionsmoleküle, die ein SNARE-Protein oder ein SNARE-Motiv in Fusion mit einem Antigen oder einer Transmembranregion und einem Antigen umfassen. Solche Fusionsmoleküle sind beispielsweise in Abbildung 7 gezeigt.
In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung Nukleinsäuren und Derivate davon, die für die oben beschriebenen Fusionsmoleküle kodieren und vorzugsweise diese Fusionsmoleküle exprimieren können. Im folgenden umfasst der Begriff „Nukleinsäure" auch die Derivate davon.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsforrn umfasst die Nukleinsäure, die für ein erfindungsgemäßes Fusionsmolekül kodiert, die in SEQ ID NO: 11 bzw. 13 gezeigte Nukleinsäuresequenz oder eine davon abgeleitete Sequenz. Die Erfindung betrifft auch Wirtszellen, die eine erfindungsgemäße Nukleinsäure enthalten.
Die Wirtszelle kann ferner eine Nukleinsäure umfassen, die für ein HLA- Molekül kodiert. In einer Ausführungsforrn exprimiert die Wirtszelle das HLA-Molekül endogen. In einer weiteren Ausführungsforrn exprimiert die Wirtszelle das HLA-Molekül rekombinant. Vorzugsweise ist die Wirtszelle nicht-proliferativ. In einer bevorzugten Ausführungsforrn ist die Wirtszelle eine Antigen-präsentierende Zelle, insbesondere eine dendritische Zelle, ein Monozyt oder ein Makrophage.
In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung, insbesondere eine Vakzine, die ein oder mehrere der erfindungsgemäßen Fusionsmoleküle und/ oder eine oder mehrere der dafür kodierenden Nukleinsäuren und/ oder eine oder mehrere der erfindungsgemäßen Wirtszellen umfasst.
In einem weiteren Aspekt wird erfindungsgemäß eine Verfahren zur Erhöhung der Menge an MHC/Peptid-Komplexen in einer Zelle bereitgestellt, wobei das Verfahren die Bereitstellung eines erfindungsgemäßen Fusionsmoleküls oder einer dafür kodierenden Nukleinsäure für die Zelle umfasst. Vorzugsweise befindet sich die Zelle in einem Lebewesen und das Verfahren umfasst die Verabreichung eines erfindungsgemäßen Fusionsmoleküls oder einer dafür kodierenden Nukleinsäure an das Lebewesen. In einer bevorzugten Ausführungsforrn ist die Zelle eine Antigen- präsentierende Zelle, insbesondere eine dendritische Zelle, ein Monozyt oder ein Makrophage.
In einem weiteren Aspekt wird erfindungsgemäß ein Verfahren zur Steigerung der Präsentation von Zeiloberflächenmolekülen auf Zellen bereitgestellt, die in der Lage sind, Antigene zu präsentieren (wie B-Zellen und Makrophagen, im Allgemeinen „APC" genannt). Die Verstärkung der Antigen-präsentierenden Aktivität solcher Zellen erfolgt durch Bereitstellung eines erfindungsgemäßen Fusionsmoleküls oder einer dafür kodierenden Nukleinsäure für die Zellen. Eine derartige Verstärkung der Antigen- präsentierenden Aktivität verstärkt wiederum vorzugsweise die primäre Aktivierung von T-Zellen, insbesondere von CD4+- und CD8+-Lymphozyten, die gegenüber dem Antigen reagieren. Vorzugsweise befindet sich die Zelle in einem Lebewesen und das Verfahren umfasst die Verabreichung eines erfindungsgemäßen Fusionsmoleküls oder einer dafür kodierenden Nukleinsäure an das Lebewesen.
In einem weiteren Aspekt wird erfindungsgemäß ein Verfahren zum Auslösen einer Immunreaktion bei einem Lebewesen bereitgestellt, wobei das Verfahren die Verabreichung eines erfindungsgemäßen Fusionsmoleküls und/ oder einer dafür kodierenden Nukleinsäure und/ oder einer erfindungsgemäßen Wirtszelle an das Lebewesen umfasst.
In einem weiteren Aspekt wird erfindungsgemäß ein Verfahren zur Stimulierung oder Aktivierung von T-Zellen, insbesondere CD4+- und CD8+- Lymphozyten, in vitro oder in einem Lebewesen, insbesondere einem Patienten, bereitgestellt, wobei das Verfahren die Bereitstellung für die T- Zellen bzw. Verabreichung an das Lebewesen eines erfindungsgemäßen Fusionsmoleküls und/ oder einer dafür kodierenden Nukleinsäure und/ oder einer erfindungsgemäßen Wirtszelle umfasst. Eine derartige Stimulierung oder Aktivierung äußert sich vorzugsweise in einer Expansion, cytotoxischen Reaktivität und/ oder Zytokinausschüttung der T-Zellen.
In einem weiteren Aspekt wird ein Verfahren zur Behandlung, Vakzinierung oder Immunisierung eines Lebewesens bereitgestellt, wobei das Verfahren die Verabreichung eines erfindungsgemäßen Fusionsmoleküls und/ oder einer dafür kodierenden Nukleinsäure und/ oder einer erfindungsgemäßen Wirtszelle an das Lebewesen umfasst. Dabei werden insbesondere solche Antigene in dem erfindungsgemäßen Fusionsmolekül oder der dafür kodierenden Nukleinsäure eingesetzt, die ohne die erfindungsgemäße Veränderung als für die beabsichtigte Behandlung, Vakzinierung oder Immunisierung wirksam bekannt sind.
Die vorstehend beschriebenen Verfahren eignen sich insbesondere für eine Behandlung oder Prophylaxe von infektiösen Erkrankungen, die beispielsweise von Bakterien oder Viren verursacht werden. In bestimmten Ausführungsformen ist das erfindungsgemäß verwendete Antigen von einem infektiösen Erreger wie Hepatitis A, B, C, HIV, Mykobakterien, Malariaerreger, Erreger von SARS, Herpesvirus, Influenzavirus, Poliovirus bzw. von bakteriellen Erregern wie Chlamydien und Mykobakterien abgeleitet. Eine besonders nützliche Anwendung der vorliegenden Erfindung liegt in der Krebs-Immuntherapie oder -Vakzinierung, wo insbesondere eine Aktivierung von Tumorantigen-reaktiven T-Zellen verstärkt wird, wodurch die Aussicht für eine T-Zell-Immuntherapie oder -Vakzinierung gegen Tumorzellen verbessert wird.
In spezifischen Ausführungsformen ist das erfϊndungsgemäß verwendete Antigen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den folgenden Antigenen: p53, vorzugsweise kodiert von der in SEQ ID NO: 66 gezeigten Sequenz, ART- 4, BAGE, ss-Catenin/m, Bcr-abL CAMEL, CAP-1, CASP-8, CDC27/m, CDK4/m, CEA, CLAUDIN-12, c-MYC, CT, Cyp-B, DAM, ELF2M, ETV6-AML1, G250, GAGE, GnT-V, GaplOO, HAGE, HER-2/neu, HPV-E7, HPV-E6, HAST-2, hTERT (oder hTRT), LAGE, LDLR/FUT, MAGE-A, vorzugsweise MAGE-Al, MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A5, MAGE-A6, MAGE-A7, MAGE-A8, MAGE-A9, MAGE-Al 0, MAGE-Al 1 oder MAGE-A12, MAGE-B, MAGE-C, MART- 1/Melan-A, MC1R, Myosin/m, MUC1, MUM-1, -2, -3, NA88-A, NF1, NY-ESO-1, NY-BR-1, pl90 minor bcr-abL Pml/RARa, PRAME, Proteinase-3, PSA, PSM, RAGE, RU1 oder RU2, SAGE, SART-1 oder SART-3, SCGB3A2, SCP1, SCP2, SCP3, SSX, SURVIVIN, TEL/AML1, TPI/m, TRP-1, TRP-2, TRP- 2/INT2, TPTE und WT, vorzugsweise WT-1, insbesondere kodiert von der in SEQ ID NO: 65 gezeigten Sequenz. Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Die Begriffe „Domäne" oder „Region" betreffen einen bestimmten Teil einer Aminosäuresequenz, der vorzugsweise mit einer bestimmten Funktion oder Struktur in Zusammenhang gebracht werden kann. Zum Beispiel weisen die α- und ß-Polypeptide eines MHC-Klasse II-Moleküls zwei Domänen, αl, α2 bzw. ß l, ß2, eine Transmembranregion und eine cytoplasmatische Region auf. In ähnlicher Weise weist die α-Kette von MHC-Klasse I-Molekülen drei Domänen, αl, α2 und α3, eine Transmembranregion und eine cytoplasmatische Region auf.
In einer Ausführungsforrn wird bei einer Auswahl der Sequenz einer bestimmten Domäne oder Region für eine Deletion oder einen Einbau in ein erfϊndungsgemäßes Fusionsmolekül die gesamte Domäne oder Region umfasst. Um dieses sicherzustellen, kann die Sequenz der betreffenden Domäne oder Region verlängert sein, um Teile eines Linkers oder sogar Teile der benachbarten Domäne oder Region zu beinhalten. Der Begriff „im Wesentlichen" in Bezug auf eine Domäne oder Region ist in diesem Sinne zu verstehen.
Der Begriff „Transmembranregion" betrifft den Teil eines Proteins, der im Wesentlichen den sich in einer zellulären Membran befindlichen Anteil ausmacht und vorzugsweise einer Verankerung des Proteins in der Membran dient. Vorzugsweise ist erfindungsgemäß eine Transmembranregion eine Aminosäuresequenz mit einem einzelnen Durchtritt durch die Membran. Jedoch kann in bestimmten Ausführungsformen auch eine Transmembranregion verwendet werden, die mehr als einen Durchtritt durch die Membran aufweist. Die Transmembranregion wird im Allgemeinen 15-25 vorzugsweise hydrophobe ungeladene Aminosäuren aufweisen, die beispielsweise eine α-helikale Konformation einnehmen. Vorzugsweise ist die Transmembranregion von einem Protein, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus MHC-Molekülen, Immunglobulinen, CD4, CD8, der CD3-ζ- Kette, der CD3-γ-Kette, der CD3-δ-Kette und der CD3-ε-Kette abgeleitet.
Typischerweise besteht die Transmembranregion im Fall der α- und ß-Ketten des MHC Klasse II-Moleküls aus etwa 20 hydrophoben Aminosäuren, die mit dem Carboxy-terminalen Ende des Antigens verbunden sind. Diese Reste erlauben ein Überspannen der Membran durch das Protein: Die Transmembranregion endet mit etwa 6-32 Resten, die den cytoplasmatischen Schwanz umfassen, am Carboxy-terminalen Ende einer jeden dieser Ketten. Es wurde gezeigt, dass diese Transmembran- und cytoplasmatischen Regionen durch Sequenzen ersetzt werden können, die eine GPI-Bindung signalisieren, und dass die chimären GPI-verankerten Klasse II-Moleküle Membran-gebunden sind (Wettstein, D.A., J.J. Boniface, P.A. Reay, H. Schild und M.M. Davis, 1991, J. Exp. Med. 174:219-228). Solche Ausführungsformen sind erfindungsgernäß von dem Begriff „Transmembranregion" umfasst. GPI-gebundene Membran- Anker domänen wurden in einer Reihe von Proteinen definiert, einschließlich Verfallbeschleunigender Faktor (decay accelerating factor; DAF), CD59 und menschlicher placentaler alkalischer Phosphatase (HPAP) (Wettstein, D.A., J.J. et al., 1991, J. Exp. Med. 174:219-228). Zum Beispiel sind die 38 Carboxy-terminalen Aminosäuren von HPAP ausreichend für eine Funktion als Signalsequenz für eine Bindung von GPL Falls die für diese Domäne kodierende DNA-Sequenz mit einem sekretierten Molekül, wie dem löslichen Teil der MHC Klasse Il-α- oder -ß-Kette verbunden wird, bildet sich ein Membran-gebundenes chimäres Molekül (Wettstein, D.A. et al., 1991, J. Exp. Med. 174:219-228) und ein derartiges Verfahren kann für die Verankerung von Fusionsmolekülen der Erfindung an eine Zellmembran eingesetzt werden.
Der Begriff „Haupt-Histokompatibilitätskomplex" und die Abkürzung „MHC" betreffen einen Komplex von Genen, der in allen Vertebraten auftritt. MHC- Proteine oder -Moleküle fungieren bei einer Signalgebung zwischen Lymphozyten und Antigen-präsentierenden Zellen in normalen Immunreaktionen dadurch, dass sie Peptide binden und sie für eine mögliche Erkennung durch T-Zell-Rezeptoren (TCR) präsentieren. MHC- Moleküle binden Peptide in einem intrazellulären Prozessierungskompartiment und präsentieren diese Peptide auf der Oberfläche von Antigen-präsentierenden Zellen gegenüber T-Zellen. Die menschliche MHC-Region, auch als HLA bezeichnet, findet sich auf Chromosom 6 und beinhaltet die Klasse I-Region und die Klasse II-Region.
Der Begriff „MHC-Klasse I" oder „Klasse I" betrifft die Haupt- Histokompatibilitätskomplex-Klasse I-Proteine oder -Gene. Innerhalb der MHC-Klasse I-Region finden sich beim Menschen die HLA-A-, HLA-B-, HLA- C-, HLA-E-, HLA-F-, CDla-, CD lb- und CDlc-Unterregionen.
Die α-Ketten der Klasse I sind Glykoproteine mit einem Molekulargewicht von etwa 44 kDa. Die Polypeptidkette ist etwas über 350 Aminosäurereste lang. Sie kann in drei funktioneile Regionen unterteilt werden: eine externe, eine transmembranöse und eine cytoplasmatische Region. Die externe Region ist 283 Aminosäurereste lang und in drei Domänen, αl, α2 und α3, unterteilt. Die Domänen und Regionen werden gewöhnlich von separaten Exons des Klasse I-Gens kodiert. Die transmembrane Region umspannt die Lipid-Doppelschicht der Plasmamembran. Sie besteht aus 23 zumeist hydrophoben Aminosäureresten, die in einer α-Helix angeordnet sind. Die cytoplasmatische Region, d.h. der dem Cytoplasma zugewandte Teil, der sich an die Transmembranregion anschließt, ist typischerweise 32 Aminosäurereste lang und hat die Fähigkeit, mit den Elementen des Cytoskeletts zu interagieren. Die α-Kette interagiert mit ß2-Mikroglobulin und bildet so α-ß2-Dimere auf der Zelloberfläche.
Der Begriff „MHC-Klasse II" oder „Klasse II" betrifft die Haupt- Histokompatibilitätskomplex-Klasse II-Proteine oder -Gene. Innerhalb der MHC-Klasse II-Region finden sich im Menschen die DP-, DQ- und DR- Subregionen für Klasse II-α-Ketten- und -ß-Ketten-Gene (d.h. DPα, DPß, DQα, DQß, DRα und DRß).
Klasse II-Moleküle sind Heterodimere, die aus je einer α- und einer ß-Kette bestehen. Beide Ketten sind Glykoproteine mit einem Molekulargewicht von 31-34 kDa (α) oder 26-29 kDa (ß). Die Gesamtlänge der α-Ketten variiert von 229 bis 233 Aminosäureresten, die der ß-Ketten von 225 bis 238 Resten. Sowohl α- als auch ß-Ketten bestehen aus einer externen Region, einem verbindenden Peptid, einer transmembranösen Region und einem cytoplasmatischen Schwanz. Die externe Region besteht aus zwei Domänen, αl und α2 oder ß l und ß2. Das verbindende Peptid ist in α- und ß-Ketten 13 bzw. 9 Reste lang. Es verbindet die zweite Domäne mit der transmembranösen Region, die sowohl in α- als auch in ß-Ketten aus 23 Arninosäureresten besteht. Die Länge der cytoplasmatischen Region, d.h. der dem Cytoplasma zugewandte Teil, der sich an die Transmembranregion anschließt, variiert von 3 bis 16 Resten in α-Ketten und von 8 bis 20 Resten in ß-Ketten.
Erfindungsgemäß betrifft der Begriff „Kette eines MHC-Moleküls" die α-Kette eines MHC-Klasse I-Moleküls bzw. die α- und ß-Ketten eines MHC-Klasse II- Moleküls. Die α-Ketten eines MHC-Klasse I-Moleküls, von denen die erfindungsgemäßen Fusionsmoleküle abgeleitet sein können, umfassen die HLA-A-, -B- und -C-α-Ketten. Die α-Ketten eines MHC-Klasse II-Moleküls, von denen die erfindungsgemäßen Fusionsmoleküle abgeleitet sein können, umfassen HLA-DR-, -DP- und -DQ-α-Ketten, insbesondere HLA-DRl-, HLA- DR2-, HLA-DR4-, HLA-DQ1-, HLA-DQ2- und HLA-DQ8-α-Ketten und insbesondere α-Ketten, die von DRA*0101-, DRA*0102-, DQA 1*0301- oder DQA1*0501-Allelen kodiert werden. Die ß-Ketten eines MHC-Klasse II- Moleküls, von denen die erfindungsgemäßen Fusionsmoleküle abgeleitet sein können, umfassen HLA-DR-, -DP- und -DQ-ß-Ketten, insbesondere HLA- DRl-, HLA-DR2-, HLA-DR4-, HLA-DQ1-, HLA-DQ2- und HLA-DQ8-ß-Ketten und insbesondere ß-Ketten, die von DRB1*01-, DRB 15-, DRB l*16-: DRB5*01-, DQB1*03~ und DQB1*02-Allelen kodiert werden.
Der Begriff, „MHC-Bindedomäne" betrifft die „MHC-Klasse I-Bindedomäne" und „MHC-Klasse II-Bindedomäne".
Der Begriff „MHC-Klasse I-Bindedomäne" betrifft die Region eines MHC- Klasse I-Moleküls oder einer MHC-Klasse I-Kette, die für eine Bindung an ein antigenes Peptid notwendig ist. Eine MHC-Klasse I-Bindedomäne wird vorwiegend durch die αl- und α2-Domänen der MHC-Klasse I-α- Kette gebildet. Obwohl die α3-Domäne der α-Kette und ß2-Mikroglobulin keine essentiellen Teile der Bindedomäne darstellen, sind sie vermutlich für eine Stabilisierung der Gesamtstruktur des MHC-Klasse I-Moleküls wichtig und daher schließt der Begriff „MHC-Klasse I-Bindedomäne" diese Regionen vorzugsweise ein. Eine MHC-Klasse I-Bindedomäne kann auch im Wesentlichen als die extrazelluläre Domäne eines MHC-Klasse I-Moleküls definiert werden, was sie von den Transmembran- und cytoplasmatischen Regionen unterscheidet.
Der Begriff „MHC-Klasse II-Bindedomäne" betrifft die Region eines MHC- Klasse II-Moleküls oder einer MHC-Klasse II-Kette, die für die Bindung an ein antigenes Peptid notwendig ist. Eine MHC-Klasse II-Bindedomäne wird vorwiegend durch die αl- und ß l-Domänen der MHC-Klasse Il-α- und -ß- Ketten gebildet. Die α2- und ß2-Domänen dieser Proteine sind vermutlich jedoch auch für eine Stabilisierung der Gesamtstruktur der MHC- Bindegrube wichtig und daher schließt der Begriff „MHC-Klasse II- Bindedomäne" erfindungsgemäß vorzugsweise diese Regionen ein. Eine MHC-Klasse II-Bindedomäne kann auch im Wesentlichen als die extrazelluläre Domäne eines MHC-Klasse II-Moleküls definiert werden, was sie von der Transmembran- und cytoplasmatischen Domäne unterscheidet. Die genaue Anzahl an Aminosäuren in den verschiedenen MHC- Moleküldomänen oder -Regionen variiert abhängig von der Säugerspezies sowie zwischen Genklassen innerhalb einer Spezies. Bei einer Auswahl der Aminosäuresequenz einer bestimmten Domäne oder Region ist vielmehr die Aufrechterhaltung der Funktion der Domäne oder Region wichtig als die genaue strukturelle Definition, die auf der Anzahl von Aminosäuren basiert. Ferner ist dem Fachmann bekannt, dass die Funktion auch aufrechterhalten werden kann, wenn etwas weniger als die gesamte Aminosäuresequenz der ausgewählten Domäne oder Region verwendet wird.
Der Begriff „Antigen" betrifft ein Agens, gegen das eine Immunreaktion erzeugt werden soll. Der Begriff „Antigen" umfasst insbesondere Proteine, Peptide, Polysaccharide, Nukleinsäuren insbesondere RNA und DNA sowie Nukleotide. Der Begriff „Antigen" umfasst auch derivatisierte Antigene als erst durch Umwandlung (z.B. intermediär im Molekül, durch Komplettierung mit Körpereiweiss) antigen werdende - und sensibilisierende - Sekundärsubstanz und konjugierte Antigene, die durch künstlichen Einbau von Atomgruppen (z.B. Isocyanate, Diazoniumsalze) eine neue konstitutive Spezifität aufweisen. In einer bevorzugten Ausführungsforrn ist das Antigen ein Tumorantigen, d.h. ein Bestandteil von Krebszellen, die dem Cytoplasma, der Zelloberfläche und dem Zellkern entstammen können, insbesondere diejenigen, die intrazellulär oder als Oberflächenantigene an Tumorzellen vorzugsweise vermehrt entstehenden Antigene. Beispiele sind das karzinoembryonale Antigen, αl-Fetoprotein, Isoferritin und fetales Sulfoglykoprotein, α2-H-Ferroprotein und γ-Fetoprotein und verschiedene Virustumorantigene. In einer weiteren Ausführungsforrn ist das Antigen ein Virusantigen wie virale Ribonukleoproteine oder Hüllproteine. Insbesondere sollte das Antigen oder Peptide davon von MHC-Molekülen präsentiert werden und dadurch zur Modulation, insbesondere Aktivierung von Zellen des Immunsystems, vorzugsweise CD4+- und CD8+-Lymphozyten, insbesondere über die Modulation der Aktivität eines T-Zell-Rezeptors fähig sein und somit vorzugsweise die T-Zell- Vermehrung induzieren. Der Begriff „MHC/Peptid-Komplex" betrifft einen nicht-kovalenten Komplex der Bindedomäne eines MHC-Klasse I- bzw. MHC-Klasse II-Moleküls und eines MHC-Klasse I- bzw. MHC-Klasse II-Bindepeptids.
Der Begriff „MHC-Bindepeptid" oder „bindendes Peptid" betrifft ein Peptid, das an ein MHC-Klasse I- und/ oder ein MHC-Klasse II-Molekül bindet. Im Fall von Klasse I-MHC/Peptid-Komplexen sind die Bindepeptide typischerweise 8-10 Aminosäuren lang, obwohl längere oder kürzere Peptide wirksam sein können. Im Fall von Klasse II-MHC/Peptid-Komplexen sind die Bindepeptide typischerweise 10-25 Aminosäuren lang und insbesondere 13- 18 Aminosäuren lang, obwohl längere und kürzere Peptide wirksam sein können.
Erfindungsgemäße Fusionsmoleküle und die dafür kodierenden Nukleinsäuren können im Allgemeinen durch rekombinante DNA-Techniken wie Herstellung von Plasmid-DNA, Spaltung von DNA mit Restriktionsenzymen, Ligation von DNA, Transformation oder Transfektion eines Wirts, Kultivierung des Wirts und Isolierung und Reinigung des exprimierten Fusionsmoleküls hergestellt werden. Solche Verfahren sind bekannt und z.B. in Sambrook et al., Molecular Cloning, (2. Auflage, 1989) beschrieben.
Für das Antigen kodierende DNA kann durch Isolation von DNA aus natürlichen Quellen oder durch bekannte Syntheseverfahren wie dem Phosphattriesterverfahren erhalten werden; vgl. z.B. Oligonucleotide Synthesis, IRL Press (M.J. Gait, Hrsg., 1984). Synthetische Oligonukleotide können auch mit Hilfe käuflich erhältlicher automatischer Oligonukleotid- Synthesegeräte hergestellt werden.
Die Anteile von MHC-Moleküle der erfindungsgemäßen Fusionsmoleküle entsprechen in Bezug auf die Aminosäuresequenz in geeigneter Weise natürlich vorkommenden MHC-Molekülen von Mensch, Maus oder anderen Nagern oder anderen Säugern oder sind Derivate davon.
Für MHC-Proteine kodierende DNA-Quellen sind bekannt, wie menschliche lymphoblastoide Zellen. Nach einer Isolierung kann das für das MHC- Molekül kodierende Gen oder ein interessierender Teil davon durch Polymerase-Kettenreaktion (PCR) oder andere bekannte Verfahren amplifiziert werden. Geeignete PCR-Primer für die Amplifikation des Gens für das MHC-Peptid können Restriktionsstellen an das PCR-Produkt anfügen.
Vorzugsweise werden erfindungsgemäß DNA-Konstrukte hergestellt, die für die Leitsequenz, die Transmembranregion und die cytoplasmatische Region kodierende Nukleinsäuresequenzen umfassen und die eine Restriktionsschnittstelle zwischen der Leitsequenz und der Transmembranregion enthalten, so dass im Wesentlichen jede für ein interessierendes Antigen kodierende Nukleotidsequenz in das Konstrukt eingebunden werden kann.
In einem bevorzugten Verfahren zur Herstellung erfindungsgemäßer Fusionsmoleküle werden DNA-Sequenzen so angeordnet, dass das C- terminale Ende der Leitsequenz an das N-terminale Ende des Antigens, das C-terrninale Ende des Antigens an das N-terminale Ende der Transmembranregion, und das C-terminale Ende der Transmembranregion an das N-terminale Ende der cytoplasmatischen Region gebunden ist. Wie vorstehend erörtert, werden vorzugsweise Restriktions Schnittstellen zwischen das Ende der Leitsequenz und den Anfang der Transmembranregion ' eingebaut, so dass im Wesentlichen jede Nukleinsäure, die für ein interessierendes Antigen kodiert, an die Nukleinsäuresequenz für die Transmembranregion gebunden werden kann.
Ein exprimiertes erfindungsgemäßes Fusionsmolekül kann isoliert und in an sich bekannter Weise gereinigt werden. Typischerweise wird das Kulturmedium zentrifugiert und der Überstand sodann durch Affinitätsoder Immunoaffinitätsverfahren, umfassend die Verwendung von monoklonalen Antikörpern, die an das exprimierte Fusionsmolekül binden, gereinigt. Das Fusionsmolekül kann auch eine Sequenz enthalten, die die Reinigung unterstützt, z.B. ein 6xHis-Tag.
Die Fähigkeit eines erfindungsgemäßen Fusionsmoleküls, die Aktivität eines T-Zell-Rezeptors zu modulieren (einschließlich Inaktivierung der T-Zell- Reaktionen) kann einfach durch einen in vitro-Test bestimmt werden. Typischerweise werden T-Zellen für die Tests durch transformierte T- Zelllinien bereitgestellt, wie T-Zell-Hybridome oder T-Zellen, die aus einem Säuger wie einem Menschen oder einem Nagetier wie einer Maus isoliert werden. Geeignete T-Zell-Hybridome sind frei verfügbar oder können in an sich bekannter Weise hergestellt werden. T-Zellen können in an sich bekannter Weise aus einem Säuger isoliert werden; vgl. z.B. Shimonkevitz, R. et al., 1983, J. Exp.. Med. 158:303.
Ein geeigneter Test zur Bestimmung, ob ein erfindungsgemäßes Fusionsmolekül zur Modulation der Aktivität von T-Zellen fähig ist, erfolgt wie folgt durch die nachstehenden Schritte 1-4. T-Zellen exprimieren in geeigneter Weise einen Marker, der getestet werden kann und der T-Zell- Aktivierung oder Modulation der T-Zell-Aktivität nach Aktivierung anzeigt. So kann das Maus-T-Zell-Hybridom DO 11.10, das Interleukin-2 (IL-2) bei einer Aktivierung exprimiert, verwendet werden. IL-2-Konzentrationen können gemessen werden, um zu bestimmen, ob ein spezifisches präsentierendes Peptid zur Modulation der Aktivität dieses T-Zell-Hybridoms fähig ist. Ein derartiger geeigneter Test erfolgt durch die nachstehenden Schritte:
1. T-Zellen werden z.B. aus einem interessierenden T-Zell-Hybridom oder durch Isolierung aus einem Säuger erhalten. 2. Die T-Zellen werden unter Bedingungen kultiviert, die eine Vermehrung erlauben.
3. Die wachsenden T-Zellen werden mit Antigen-präsentierenden Zellen in Kontakt gebracht, die ihrerseits mit einem erfindungsgemäßen
Fusionsmolekül oder einer dafür kodierenden Nukleinsäure in Kontakt gebracht wurden.
4. Die T-Zellen werden auf einen Marker getestet, z.B. wird die IL-2- Produktion gemessen.
Die in den Tests verwendeten T-Zellen werden unter für eine Vermehrung geeigneten Bedingungen inkubiert. Zum Beispiel wird ein DO l l . lO-T-Zell- Hybridom geeigneterweise bei etwa 37°C und 5% CO2 im Vollmedium (RPMI 1640, supplementiert mit 10% FBS, Penicillin/ Streptomycin, L-Glutamin und 5 x 10~5 M 2-Mercaptoethanol) inkubiert. Serielle Verdünnungen des erfindungsgemäßen Fusionsmoleküls können getestet werden. T-Zell- Aktivierungs signale werden durch Antigen-präsentierende Zellen bereitgestellt, die mit dem geeigneten antigenen Peptid beladen worden waren.
Alternativ zu der Messung eines exprimierten Proteins wie IL-2 kann die Modulation der T-Zell-Aktivierung geeigneter Weise durch Veränderungen der Vermehrung von Antigen- abhängigen T-Zellen, wie gemessen durch bekannte Radiomarkierungsverfahren, bestimmt werden. Zum Beispiel kann ein markiertes (wie tritiert) Nukleotid in ein Testkulturmedium eingebracht werden. Das Einbringen eines derartigen markierten Nukleotids in die DNA dient als Messgröße für die T-Zell- Vermehrung. Dieser Test ist nicht für T- Zellen geeignet, die keiner Antigen-Präsentation für das Wachstum bedürfen, wie T-Zell-Hybridome. Der Test ist für die Messung der Modulation von T- Zell-Aktivierung durch Fusionsmoleküle im Fall von nicht-transformierten T- Zellen, die aus Säugern isoliert wurden, geeignet. Die Fähigkeit eines erfindungsgemäßen Fusionsmoleküls, eine Immunreaktion zu induzieren, einschließlich eine Vakzinierung gegen eine Zielerkrankung zu ermöglichen, kann einfach durch einen in vivo-Test bestimmt werden. Zum Beispiel kann ein erfindungsgemäßes Fusionsmolekül oder eine dafür kodierende Nukleinsäure an einen Säuger wie eine Maus verabreicht werden und Blutproben aus dem Säuger zum Zeitpunkt der ersten Verabreichung und mehrfach in periodischen Zeiträumen danach (wie 1, 2, 5 und 8 Wochen nach Verabreichung des Fusionsmoleküls oder der dafür kodierenden Nukleinsäure) entnommen werden. Serum wird aus den Blutproben gewonnen und auf das Auftreten von durch die Immunisierung entstandenen Antikörpern getestet. Antikörper- Konzentrationen können bestimmt werden. Daneben können aus dem Blut bzw. aus lymphatischen Organen T-Lymphozyten isoliert werden und funktionell auf Reaktivitität gegen das Antigen bzw. von dem Antigen abgeleitete Epitope getestet werden. Alle dem Fachmann bekannten „Readout"-Systeme u.a. Proliferationsassay, Zytokinsekretion, zyto toxische Aktivität, Tetrameranalyse können hierbei verwendet werden.
Erfindungsgemäße Verfahren für die Induktion einer Immunreaktion, einschließlich der Vakzinierung eines Lebewesens gegen eine Zielerkrankung, können in Kombination mit bekannten Verfahren für die Induktion einer Immunreaktion verwendet werden. Zum Beispiel kann ein erfindungsgemäßes Fusionsmolekül oder eine dafür kodierende Nukleinsäure an ein Lebewesen in einer Anordnung oder Kombination mit der Verabreichung einer Vakzine-Zusammensetzung verabreicht werden, um die gewünschte Wirkung einer derartigen Vakzine-Zusammensetzung zu verstärken oder zu verlängern.
Der Begriff „abgeleitet" bedeutet erfindungsgemäß, dass ein bestimmter Gegenstand, insbesondere eine bestimmte Sequenz, in dem Objekt, von dem er abgeleitet ist, insbesondere einem Organismus oder Molekül, vorliegt. Im Fall von Nukleinsäure- und Aminosäuresequenzen, insbesondere bestimmten Sequenzregionen, bedeutet „abgeleitet" außerdem, dass die betreffende Nukleinsäure- bzw. Aminosäuresequenz in Übereinstimmung mit den nachstehenden Definitionen von einer Nukleinsäure- bzw. Aminosäuresequenz abgeleitet ist, die in dem Objekt vorliegt. Somit bedeutet der Begriff „von einem MHC-Molekül abgeleitete Sequenz oder Region", dass die Sequenz oder Region in einem MHC-Molekül vorliegt oder von einer Sequenz oder Region, die in einem MHC-Molekül vorliegt, in Übereinstimmung mit den nachstehenden Definitionen abgeleitet ist.
Eine Nukleinsäure ist erfindungsgemäß vorzugsweise
Desoxyribonukleinsäure (DNA) oder Ribonukleinsäure (RNA). Nukleinsäuren umfassen erfindungsgemäß genomische DNA, cDNA, mRNA, rekombinant hergestellte und chemisch synthetisierte Moleküle. Eine Nukleinsäure kann erfindungsgemäß als einzelsträngiges oder doppelsträngiges und lineares oder kovalent kreisförmig geschlossenes Molekül vorliegen.
Eine von einer Nukleinsäuresequenz abgeleitete Sequenz oder der Begriff „von einer Nukleinsäuresequenz abgeleitete Sequenz" betrifft erfindungsgemäß homologe Sequenzen und Derivate der ersteren Sequenz.
Homologe Nukleinsäuresequenzen weisen erfindungsgemäß mindestens 40%, insbesondere mindestens 50%, mindestens 60%, mindestens 70%, mindestens 80%, mindestens 90% und vorzugsweise mindestens 95%, mindestens 98 oder mindestens 99% Identität der Nukleotide auf.
Eine Nukleinsäure ist insbesondere dann zu einer anderen Nukleinsäure „homolog", wenn die beiden Sequenzen der komplementären Stränge miteinander hybridisieren und ein stabiles Duplex eingehen können, wobei die Hybridisierung vorzugsweise unter Bedingungen erfolgt, die eine spezifische Hybridisierung zwischen Polynukleotiden erlauben (stringente Bedingungen). Stringente Bedingungen sind beispielsweise in Molecular Cloning: A Laboratory Manual, J. Sambrook et al., Hrsg., 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989 oder Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel et al., Hrsg., John Wiley & Sons, Inc., New York, beschrieben und betreffen beispielsweise die Hybridisierung bei 65°C in Hybridisierungspuffer (3,5 x SSC, 0,02% Ficoll, 0,02% Polyvinylpyrrolidon, 0,02% Rinderserumalbumin, 2,5mM NaH2P04 (pH 7), 0,5% SDS, 2mM EDTA). SSC ist 0,15 M Natriumchlorid / 0, 15 M Natriumeitrat, pH 7. Nach der Hybridisierung wird die Membran, auf die die DNA übertragen wurde beispielsweise in 2 x SSC bei Raumtemperatur und sodann in 0, 1 - 0,5 x SSC/ 0, 1 x SDS bei Temperaturen bis 68°C gewaschen.
Mit „Derivat" einer Nukleinsäure ist erfindungsgemäß gemeint, dass einzelne oder multiple Nukleotidsubstitutionen, -deletionen und/ oder -additionen in der Nukleinsäure vorliegen. Weiterhin umfasst der Begriff „Derivat" auch eine chemische Derivatisierung einer Nukleinsäure an einer Base, einem Zucker oder Phosphat eines Nukleotids. Der Begriff „Derivat" umfasst auch Nukleinsäuren, die nicht in der Natur vorkommende Nukleotide und Nukleotidanaloga enthalten.
Die erfindungsgemäß beschriebenen Nukleinsäuren sind vorzugsweise isoliert. Der Begriff „isolierte Nukleinsäure" bedeutet erfindungsgemäß, dass die Nukleinsäure (i) in vitro amplifiziert wurde, zum Beispiel durch Polymerase-Kettenreaktion (PCR), (ii) rekombinant durch Klonierung produziert wurde, (iii) gereinigt wurde, zum Beispiel durch Spaltung und gelelektrophoretische Auftrennung, oder (iv) synthetisiert wurde, zum Beispiel durch chemische Synthese. Eine isolierte Nukleinsäure ist eine Nukleinsäure, die für eine Manipulierung durch rekombinante DNA- Techniken zur Verfügung steht.
Nukleinsäuren, die für Fusionsmoleküle kodieren, können erfindungsgemäß alleine oder in Kombination mit anderen Nukleinsäuren, insbesondere heterologen Nukleinsäuren, vorliegen. In bevorzugten Ausführungsformen liegt eine Nukleinsäure funktioneil in Verbindung mit Expressionskontrollsequenzen oder regulatorischen Sequenzen vor, die in Bezug zu der Nukleinsäure homolog oder heterolog sein können. Eine kodierende Sequenz und eine regulatorische Sequenz sind dann „funktionell" miteinander verbunden, falls sie derart kovalent miteinander verknüpft sind, dass die Expression oder Transkription der kodierenden Sequenz unter der Kontrolle oder unter dem Einfluss der regulatorischen Sequenz steht. Falls die kodierende Sequenz in ein funktionelles Protein translatiert werden soll, führt bei einer funktionellen Verbindung einer regulatorischen Sequenz mit der kodierenden Sequenz eine Induktion der regulatorischen Sequenz zu einer Transkription der kodierenden Sequenz, ohne dass es zu einer Leserasterverschiebung in der kodierenden Sequenz oder zu einem Unvermögen der kodierenden Sequenz kommt, in das gewünschte Protein oder Peptid translatiert zu werden.
Der Begriff „Expressionskontrollsequenz" oder „regulatorische Sequenz" umfasst erfindungsgemäß Promotoren, Enhancer und andere Kontrollelemente, die die Expression eines Gens steuern. In bestimmten erfindungsgemäßen Ausführungsformen sind die Expressionskontrollsequenzen regulierbar. Die genaue Struktur von regulatorischen Sequenzen kann speziesabhängig oder zelltypusabhängig variieren, umfasst jedoch im Allgemeinen 5'-nicht-transkribierte und 5'- nicht-translatierte Sequenzen, die an der Initiation der Transkription bzw. Translation beteiligt sind wie TATA-Box, Capping-Sequenz, CAAT-Sequenz und ähnliches. Insbesondere umfassen 5 '-nicht- transkribierte Regulationssequenzen eine Promotorregion, die eine Promotorsequenz für eine transkriptioneile Kontrolle des funktionell verbundenen Gens einschließt. Regulatorische Sequenzen können auch Enhancer-Sequenzen oder stromaufwärts gelegene Aktivatorsequenzen umfassen.
In einer bevorzugten Ausführungsforrn ist die Nukleinsäure erfindungsgemäß ein Vektor, gegebenenfalls mit einem Promotor, der die Expression einer Nukleinsäure, z.B. einer Nukleinsäure, die für ein erfindungsgemäßes Fusionsmolekül kodiert, steuert. In einer bevorzugten Ausführungsforrn ist der Promoter ein T7-, T3- oder SP6-Promoter.
Der Begriff „Vektor" wird dabei in seiner allgemeinsten Bedeutung verwendet und umfasst jegliche intermediären Vehikel für eine Nukleinsäure, die es z.B . ermöglichen, die Nukleinsäure in prokaryontische und/ oder in eukaryontische Zellen einzubringen und gegebenenfalls in ein Genom zu integrieren. Solche Vektoren werden vorzugsweise in der Zelle repliziert und/ oder exprimiert. Ein intermediäres Vehikel kann z.B. für den Gebrauch bei der Elektroporation, beim Mikroprojektilbeschuss, bei der liposomalen Verabreichung, beim Transfer mit Hilfe von Agrobakterien oder bei der Insertion über DNA- oder RNA-Viren angepasst sein. Vektoren umfassen Plasmide, Phagemide, Bacteriophage oder Virusgenome.
Die Nukleinsäuren, die für ein erfindungsgemäßes Fusionsmolekül kodieren, können für eine Transfektion von Wirtszellen eingesetzt werden. Mit Nukleinsäuren ist dabei sowohl rekombinante DNA wie auch RNA gemeint. Rekombinante RNA kann durch in vitro-Transkription von einer DNA- Matritze hergestellt werden. Sie kann des weiteren vor Applikation durch stabilisierende Sequenzen, Capping und Poly-Adenylierung modifiziert werden.
Der Begriff „Wirtszelle" betrifft erfindungsgemäß jede Zelle, die mit einer exogenen Nukleinsäure transformierbar oder transfizierbar ist. Der Begriff „Wirtszellen" umfasst erfindungsgemäß prokaryontische (z.B. E. coli) oder eukaryontische (z.B. dendritische Zellen, B-Zellen, CHO-Zellen, COS-Zellen, K562-Zellen, Hefezellen und Insektenzellen). Besonders bevorzugt sind Säugerzellen wie Zellen aus Mensch, Maus, Hamster, Schwein, Ziege und Primaten. Die Zellen können aus einer Vielzahl von Gewebetypen abgeleitet sein und umfassen primäre Zellen und Zelllinien. Spezifische Beispiele umfassen Keratinozyten, periphere Blutleukozyten, Stammzellen des Knochenmarks und embryonale Stammzellen. In weiteren Ausführungsformen ist die Wirtszelle eine Antigen-präsentierende Zelle, insbesondere eine dendritische Zelle, ein Monozyt oder Makrophage. Eine Nukleinsäure kann in der Wirtszelle in einer einzigen oder in mehreren Kopien vorliegen und wird in einer Ausführungsforrn in der Wirtszelle exprimiert.
Der Begriff „Expression" wird erfindungsgemäß in seiner allgemeinsten Bedeutung verwendet und umfasst die Produktion von RNA oder von RNA und Protein. Er umfasst auch eine teilweise Expression von Nukleinsäuren. Des weiteren kann die Expression transient oder stabil erfolgen. Bevorzugte Expressionssysteme in Säugerzellen umfassen pcDNA3.1 und pRc/CMV (Invitrogen, Carlsbad, CA), die einen selektierbaren Marker enthalten wie ein Gen, das eine Resistenz gegenüber G418 verleiht (und somit eine Selektion stabil transfϊzierter Zelllinien ermöglicht), und die Enhancer- Promotor- Sequenzen von Cytomegalovirus (CMV).
Eine für ein erfindungsgemäßes Fusionsmolekül kodierende Nukleinsäure kann auch eine Nukleinsäuresequenz umfassen, die für ein MHC-Molekül, vorzugsweise für ein HLA-Molekül kodiert. Die Nukleinsäuresequenz, die für ein MHC-Molekül kodiert, kann auf demselben Expressionsvektor wie die Nukleinsäure, die für das Fusionsmolekül kodiert, vorliegen oder beide Nukleinsäuren können auf verschiedenen Expressionsvektoren vorliegen. Im letzteren Fall können die beiden Expressionsvektoren in eine Zelle cotransfiziert werden.
Eine von einer Aminosäuresequenz abgeleitete Sequenz oder der Begriff „von einer Aminosäuresequenz abgeleitete Sequenz" betrifft erfindungsgemäß homologe Sequenzen und Derivate der ersteren Sequenz.
Homologe Aminosäuresequenzen weisen erfindungsgemäß mindestens 40%>, insbesondere mindestens 50%, mindestens 60%, mindestens 70%, mindestens 80%, mindestens 90% und vorzugsweise mindestens 95%, mindestens 98 oder mindestens 99% Identität der Aminosäurereste auf.
„Derivate" eines Proteins oder Polypeptids oder einer Aminosäuresequenz im Sinne dieser Erfindung umfassen Aminosäure-Insertionsvarianten, A inosäure-Deletionsvarianten und/ oder Aminosäure-
Sub stitutionsvarianten .
Aminosäure-Insertionsvarianten umfassen amino- und/ oder carboxyterminale Fusionen, sowie Insertionen von einzelnen oder mehreren Aminosäuren in einer bestimmten Aminosäuresequenz. Bei Aminosäure- Sequenzvarianten mit einer Insertion werden ein oder mehrere Aminosäurereste in eine vorbestimmte Stelle in einer Aminosäuresequenz eingebracht, obwohl eine zufällige Insertion mit geeignetem Screening des resultierenden Produkts auch möglich ist. Aminosäure-Deletionsvarianten sind durch das Entfernen von einer oder mehreren Aminosäuren aus der Sequenz charakterisiert. Aminosäure-Substitutionsvarianten zeichnen sich dadurch aus, dass wenigstens ein Rest in der Sequenz entfernt und ein anderer Rest an dessen Stelle eingefügt wird. Vorzugsweise befinden sich die Modifikationen an Positionen in der Aminosäuresequenz, die zwischen homologen Proteinen oder Polypeptiden nicht konserviert sind. Vorzugsweise werden Aminosäuren durch andere mit ähnlichen Eigenschaften, wie Hydrophobizität, Hydrophilizität, Elektronegativität, Volumen der Seitenkette und ähnliches, ersetzt (konservative Substitution). Konservative Substitutionen betreffen beispielsweise den Austausch einer Aminosäure durch eine andere, wobei beide Aminosäuren in derselben nachstehenden Gruppe aufgeführt sind:
1. kleine aliphatische, nicht-polare oder leicht-polare Reste: Ala, Ser, Thr (Pro, Gly)
2. negativ geladene Reste und ihre Amide: Asn, Asp, Glu, Gin
3. positiv geladene Reste: His, Arg, Lys 4. große aliphatische, nicht-polare Reste: Met, Leu, Ile, Val (Cys)
5. große aromatische Reste: Phe, Tyr, Trp.
Drei Reste sind aufgrund ihrer besonderen Rolle für die Proteinarchitektur in Klammern gesetzt. Gly ist der einzige Rest ohne eine Seitenkette und verleiht der Kette somit Flexibilität. Pro besitzt eine ungewöhnliche Geometrie, die die Kette stark einschränkt. Cys kann eine Disulfidbrücke bilden.
Die vorstehend beschriebenen Aminosäure-Varianten können leicht mit Hilfe von bekannten Peptidsynthesetechniken wie z.B. durch „Solid Phase
Synthesis" (Merrifield, 1964) und ähnliche Verfahren oder durch rekombinante DNA-Manipulation hergestellt werden. Techniken, um
Substitutionsmutationen an vorbestimmten Stellen in DNA einzubringen, die eine bekannte oder teilweise bekannte Sequenz besitzt, sind gut bekannt und umfassen z.B. M13-Mutagenese. Die Manipulation von DNA-Sequenzen zur Herstellung von Proteinen mit Substitutionen, Insertionen oder
Deletionen und die allgemeinen rekombinanten Verfahren zur Expression von Proteinen z.B. in einem biologischen System (wie Säuger-, Insekten-,
Pflanzen- und viralen Systeme) sind z.B. in Sambrook et. al. (1989) ausführlich beschrieben.
„Derivate" von Proteinen oder Polypeptiden umfassen erfindungsgemäß auch einzelne oder multiple Substitutionen, Deletionen und/ oder Additionen jeglicher Moleküle, die mit dem Protein oder Polypeptid assoziiert sind, wie Kohlenhydrate, Lipide und/ oder Proteine oder Polypeptide.
In einer Ausführungsforrn umfassen „Derivate" von Proteinen oder Polypeptiden diejenigen modifizierten Analoga, die durch Glykosylierung, Acetylierung, Phosphorylierung, Amidierung, Palmitoylierung, Myristolylierung, Isoprenylierung, Lipidierung, Alkylierung, Derivatisierung, Einbringen von Schutz- /Blockierungsgruppen, proteolytische Spaltung oder Bindung an einen Antikörper oder an einen anderen zellulären Liganden entstehen. Derivate von Proteinen oder Polypeptiden können auch durch andere Verfahren wie beispielsweise durch chemische Spaltung mit Bromcyan, Trypsin, Chymotrypsin, Papain, V8-Protease, NaBH2, Acetylierung, Formylierung, Oxidation, Reduktion oder durch metabolische Synthese in Gegenwart von Tunicamycin hergestellt werden.
Ferner erstreckt sich der Begriff „Derivat" auch auf alle funktioneilen chemischen Äquivalente der Proteine oder Polypeptide.
Die vorstehend beschriebenen Derivate von Proteinen und Polypeptiden sind erfindungsgemäß von dem Begriff „FusionsmoleküF umfasst, selbst wenn darauf nicht ausdrücklich verwiesen wird.
Die erfindungsgemäß beschriebenen pharmazeutischen Zusammensetzungen können therapeutisch für die Behandlung einer bereits bestehenden Erkrankung oder prophylaktisch als Vakzinen für die Immunisierung eingesetzt werden.
Der Begriff „Vakzine" betrifft erfindungsgemäß eine antigenische Zubereitung, die beispielsweise ein Protein, ein Peptid, eine Nukleinsäure oder ein Polysaccharid umfasst und die an einen Empfänger verabreicht wird, um dessen humorales und/ oder zelluläres Immunsystem gegenüber einem oder mehreren Antigenen zu stimulieren, die in der Vakzinezubereitung vorliegen. Die Begriffe „Vakzinierung" oder „Immunisierung" betreffen den Vorgang einer Verabreichung einer Vakzine und der Stimulierung einer Immunreaktion gegenüber einem Antigen. Der Begriff „Immunreaktion" betrifft die Aktivitäten des Immunsystems, einschließlich Aktivierung und Proliferation von spezifischen cytotoxischen T-Zellen nach Kontakt mit einem Antigen.
Tiermodelle können für ein Testen einer immunisierenden Wirkung z.B. gegenüber Krebs bei Verwendung eines Tumor-assoziierten Antigens als Antigen eingesetzt werden. Dabei können beispielsweise menschliche Krebszellen in eine Maus für die Schaffung eines Tumors eingebracht werden und eine erfindungsgemäße Nukleinsäure, die für ein erfindungsgemäßes Fusionsmolekül, umfassend das Tumor-assoziiertes Antigen, kodiert, kann verabreicht werden. Die Wirkung auf die Krebszellen (beispielsweise Verringerung der Tumorgröße) kann als Maß für die Wirksamkeit einer Immunisierung durch die Nukleinsäure gemessen werden.
Als Teil der Zusammensetzung für eine Immunisierung werden ein oder mehrere Fusionsmoleküle mit einem oder mehreren Adjuvanzien für eine Induktion einer Immunreaktion oder eine Erhöhung einer Immunreaktion verabreicht. Ein Adjuvans ist eine Substanz, die in ein Antigen eingebaut oder gemeinsam mit diesem verabreicht wird und die Immunreaktion verstärkt- Adjuvanzien können die Immunreaktion durch Bereitstellen eines Antigen- eservoirs (extrazellulär oder in Makrophagen) , Aktivierung von Makrophagen und Stimulierung bestimmter Lymphozyten verstärken. Adjuvanzien sind bekannt und umfassen in nicht begrenzender Weise Monophosphoryl-Lipid-A (MPL, SmithKline Beecham), Saponine wie QS21 (SmithKline Beecham), DQS21 (SmithKline Beecham; WO 96/33739), QS7, QS17, QS 18 und QS-Ll (So et al., Mol. Cells 7: 178- 186, 1997), unvollständiges Freundsches Adjuvans, vollständiges Freundsches Adjuvans, Vitamin E, Montanid, Alaun, CpG-Oligonukleotide (vgl. Krieg et al., Nature 374:546-9, 1995) und verschiedene Wasser-in-Öl-Emulsionen, die aus biologisch abbaubaren Ölen wie Squalen und/ oder Tocopherol hergestellt werden. Vorzugsweise werden die Fusionsmoleküle in einem Gemisch mit DQS21 /MPL verabreicht. Das Verhältnis von DQS21 zu MPL beträgt typischerweise etwa 1 : 10 bis 10: 1, vorzugsweise etwa 1 :5 bis 5: 1 und insbesondere etwa 1: 1. Für eine Verabreichung an den Menschen sind DQS21 und MPL typischerweise in einer Vakzine-Formulierung in einem Bereich von etwa 1 μg bis etwa 100 μg vorhanden. Andere Stoffe, die eine Immunreaktion des Patienten stimulieren, können auch verabreicht werden. Zum Beispiel sind Zytokine bei einer Vakzinierung aufgrund ihrer regulatorischen Eigenschaften auf Lymphozyten verwendbar. Solche Zytokine umfassen z.B. Interleukin-12 (IL-12), von dem gezeigt wurde, dass es die schützenden Wirkungen von Vakzinen verstärkt (vgl. Science 268: 1432-1434, 1995), GM-CSF und IL-18.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Induktion einer Immunreaktion in einem Säuger umfasst im Allgemeinen die Verabreichung einer wirksamen Menge eines erfindungsgemäßen Fusionsmoleküls und/ oder einer dafür kodierenden Nukleinsäure, insbesondere in Form eines Vektors. Vorzugsweise wird DNA oder RNA, die für ein erfindungsgemäßes Fusionsmolekül kodiert, an einen Säuger zusammen mit einer DNA-Sequenz verabreicht, die für einen T-Zell-co-stimulierenden Faktor kodiert, wie ein für B7-1 oder B7-2 kodierendes Gen.
Der Begriff „T-Zell-co-stimulierender Faktor" betrifft hier ein Molekül, insbesondere ein Peptid, das zur Bereitstellung eines co-stimulierenden Signals fähig ist und dadurch eine Immunreaktion verstärkt, insbesondere die Vermehrung von T-Zellen in Gegenwart eines oder mehrerer erfin- dungsgemäßer Fusionsmoleküle aktiviert. Eine derartige Aktivierung der T- Zell- Vermehrung kann durch allgemein bekannte Tests bestimmt werden.
Diese Faktoren umfassen co-stimulierende Moleküle, die in Form von Proteinen oder Nukleinsäuren bereitgestellt werden. Solche co- stimulierenden Moleküle sind beispielsweise B7-1 und B7-2 (CD80 bzw. CD86), die auf dendritischen Zellen (DC) exprimiert werden und mit dem auf den T-Zellen exprimierten CD28-Molekül interagieren. Diese Interaktion stellt eine Co-Stimulierung (Signal 2) für eine Antigen/ MHC/TCR-stimulierte (Signal 1) T-Zelle bereit, wodurch die Vermehrung der T-Zelle und die Effektorfunktion verstärkt wird. B7 interagiert auch mit CTLA4 (CD 152) auf T-Zellen und Untersuchungen, die CTLA4- und B7-Liganden einbeziehen, zeigen, dass die B7-CTLA4-Interaktion eine Antitumor-Immunität und CTL- Vermehrung verstärken kann (Zheng, P. et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 95(l l):6284-6289 (1998)).
B7 wird typischerweise nicht auf Tumorzellen exprimiert, so dass diese keine wirksamen Antigen-präsentierenden Zellen (APCs) für T-Zellen sind. Eine Induktion der B7-Expression würde ermöglichen, dass Tumorzellen wirksamer eine Vermehrung von cytotoxischen T-Lymphozyten und eine Effektorfunktion stimulieren. Eine Co-Stimulierung durch eine Kombination von B7/IL-6/IL-12 zeigte eine Induktion des IFN-gamma- und Thl-Zytokin- Profils in einer T-Zell-Population, was zu einer weiter verstärkten T-Zell- Aktivität führt (Gajewski et al., J. Immunol. 154:5637-5648 (1995)).
Eine vollständige Aktivierung von cytotoxischen T-Lymphozyten und eine vollständige Effektorfunktion erfordert eine Mitwirkung von T-Helferzellen durch die Interaktion zwischen dem CD40-Liganden auf den T-Helferzellen und dem CD40-Molekül, das von dendritischen Zellen exprimiert wird (Ridge et al., Nature 393:474 (1998), Bennett et al., Nature 393:478 (1998), Schönberger et al., Nature 393:480 (1998)). Der Mechanismus dieses co- stimulierenden Signals betrifft wahrscheinlich die Steigerung der B7- und assoziierten IL-6/IL-12-Produktion durch die dendritischen Zellen (Antigen- präsentierenden Zellen). Die CD40-CD40L-Interaktion komplementiert so die Interaktionen des Signals 1 (Antigen/ MHC-TCR) und des Signals 2 (B7- CD28).
Erfindungs gemäß vorgesehen ist eine Verabreichung von Nukleinsäuren, Polypeptiden oder Proteinen und/ oder Zellen. Eine Verabreichung von DNA und RNA ist bevorzugt.
In den Experimenten konnte gezeigt werden, dass im Vergleich zu dem nicht- modifizierten Antigen erfindungsgemäß eine 100-fach geringere Dosis des Impfstoffs ausreicht, um äquivalente oder stärkere Immunantworten zu induzieren. Ein Problem bei der direkten Injektion von Nukleinsäure- Impfstoffen ist, dass die Dosis, die nötig ist, um Immunantworten zu induzieren, sehr hoch ist. Bei DNA-Impfstoffen ist die Ursache vermutlich hauptsächlich darin begründet, dass nur ein Bruchteil der Zellen injizierte DNA in den Kern aufnehmen. Bei RNA-Impfstoffen liegt das Problem vermutlich insbesondere darin, dass injizierte RNA sehr schnell durch RNAsen abgebaut wird.
Bei Verwendung der erfindungsgemäß modifizierten Impfstoffe ist zu erwarten, dass bei einer direkten Injektion von Nukleinsäuren, insbesondere RNA im Vergleich zu unmodifizierten Nukleinsäuren massiv höhere Immunantworten erhalten werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist ein viraler Vektor für die Verabreichung einer Nukleinsäure, die für ein erfindungsgemäßes Fusionsmolekül kodiert, aus der Gruppe ausgewählt bestehend aus Adenoviren, Adeno-assoziierten Viren, Poxviren, einschließlich Vacciniavirus und attenuierten Poxviren, Semliki-Forest-Virus, Retroviren, Sindbis-Virus und Ty- irus-ähnlichen Partikeln. Besonders bevorzugt sind Adenoviren und Retroviren. Die Retroviren sind üblicherweise replikationsdefizient (d.h. sie sind unfähig, infektiöse Partikel zu erzeugen).
Verschiedene Verfahren können eingesetzt werden, um erfindungsgemäß Nukleinsäuren in Zellen in vitro oder in vivo einzubringen. Solche Verfahren umfassen die Transfektion von Nukleinsäure-Kalziumphosphat-Präzipitaten, die Transfektion von Nukleinsäuren, die mit DEAE assoziiert sind, die Transfektion oder Infektion mit den vorstehenden Viren, die die interessierenden Nukleinsäuren tragen, die Liposomen-vermittelte Transfektion und ähnliches. In bestimmten Ausführungsformen ist eine Steuerung der Nukleinsäure an bestimmte Zellen bevorzugt. In solchen Ausführungsformen kann ein Träger, der für die Verabreichung einer Nukleinsäure an eine Zelle (z.B. ein Retrovirus oder ein Liposom) eingesetzt wird, ein gebundenes Zielsteuerungsmolekül aufweisen. Zum Beispiel kann ein Molekül wie ein Antikörper, der für ein Oberflächenmembran-Protein auf der Zielzelle spezifisch ist, oder ein Ligand für einen Rezeptor auf der Zielzelle in den Nukleinsäureträger eingebaut oder daran gebunden werden. Falls eine Verabreichung einer Nukleinsäure durch Liposomen erwünscht ist, können Proteine, die an ein Oberflächenmembran-Protein binden, das mit der Endozytose assoziiert ist, in die Liposomenformulierung eingebaut werden, um eine Zielsteuerung und/ oder Aufnahme zu ermöglichen. Solche Proteine umfassen Kapsid-Proteine oder Fragmente davon, die für einen bestimmten Zelltyp spezifisch sind, Antikörper gegen Proteine, die internalisiert werden, Proteine, die eine intrazelluläre Stelle ansteuern, und ähnliches.
Vorzugsweise werden die Nukleinsäuren zusammen mit stabilisierenden Substanzen wie RNA- stabilisierenden Substanzen verabreicht.
In einer Ausführungsforrn erfolgt die Verabreichung von Nukleinsäuren durch ex vivo -Verfahren, d.h. durch Entfernung von Zellen aus einem Patienten, genetische Veränderung der Zellen, und Wiedereinbringung der veränderten Zellen in den Patienten. Dies umfasst im Allgemeinen das Einbringen einer funktioneilen Kopie eines Gens in die Zellen eines Patienten in vitro und die Rückführung der genetisch veränderten Zellen in den Patienten. Die funktionelle Kopie des Gens steht unter funktioneiler Kontrolle von regulatorischen Elementen, die eine Expression des Gens in den genetisch veränderten Zellen erlauben. Transfektions- und Transduktionsverfahren sind dem Fachmann bekannt. Erfindungsgemäß vorgesehen ist auch eine Verabreichung von Nukleinsäuren in vivo durch die Verwendung von Vektoren wie Viren und zielgesteuerten Liposomen.
Eine Verabreichung von Polypeptiden und Peptiden kann in an sich bekannter Weise erfolgen. Der Begriff „Patient",„Individuum" oder „Lebewesen" bedeutet erfindungsgemälS Mensch, nicht menschlicher Primat oder ein anderes Tier, insbesondere Säugetier wie Kuh, Pferd, Schwein, Schaf, Ziege, Hund, Katze, Vögel wie Huhn oder Nagetier wie Maus und Ratte. In einer besonders bevorzugten Ausführungsforrn ist der Patient, das Individuum oder das Lebewesen ein Mensch.
Die erfindungsgemäßen therapeutischen Zusammensetzungen können in pharmazeutisch verträglichen Zubereitungen verabreicht werden. Solche Zubereitungen können gewöhnlich pharmazeutisch verträgliche Konzentrationen von Salzen, Puff er Stoffen, Konservierungsstoffen, Trägern, ergänzenden immunitätssteigernden Stoffen wie Adjuvanzien (z.B. CpG- Oligonukleotide) und Zytokine und gegebenenfalls andere therapeutische Wirkstoffe enthalten.
Die erfindungsgemäßen therapeutischen Wirkstoffe können auf jedem herkömmlichen Weg verabreicht werden, einschließlich durch Injektion oder durch Infusion. Die Verabreichung kann beispielsweise oral, intravenös, intraperitoneal, intramuskulär, subkutan, intrakutan, transdermal, intralymphatisch, vorzugsweise durch Injektion in Lymphknoten, insbesondere Leistenlymphknoten, Lymphgefäße und/ oder in die Milz, erfolgen.
Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen werden in wirksamen Mengen verabreicht. Eine „wirksame Menge" betrifft die Menge, die alleine oder zusammen mit weiteren Dosen eine gewünschte Reaktion oder eine gewünschte Wirkung erzielt. Im Fall einer Behandlung einer bestimmten Erkrankung oder eines bestimmten Zustands betrifft die gewünschte Reaktion die Hemmung des Krankheitsverlaufs. Dies umfasst die Verlangsamung des Fortschreitens der Erkrankung und insbesondere eine Unterbrechung des Fortschreitens der Erkrankung. Die gewünschte Reaktion bei einer Behandlung einer Erkrankung oder eines Zustands kann auch die Verzögerung des Ausbruchs oder eine Verhinderung des Ausbruchs der Erkrankung oder des Zustands sein.
Eine wirksame Menge einer erfindungsgemäßen Zusammensetzung wird von dem zu behandelnden Zustand, der Schwere der Krankheit, den individuellen Parametern des Patienten, einschließlich Alter, physiologischer Zustand, Größe und Gewicht, der Dauer der Behandlung, der Art einer begleitenden Therapie (falls vorhanden), dem spezifischen Verabreichungsweg und ähnlichen Faktoren abhängen.
Die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen sind vorzugsweise steril und enthalten eine wirksame Menge der therapeutisch wirksamen Substanz für die Erzeugung der gewünschten Reaktion oder der gewünschten Wirkung.
Die Dosen der erfindungsgemäßen Zusammensetzungen, die verabreicht werden, können von verschiedenen Parametern wie der Verabreichungsart, dem Zustand des Patienten, dem gewünschten Verabreichungszeitraum, usw. abhängen. Für den Fall, dass eine Reaktion bei einem Patienten bei einer anfänglichen Dosis unzureichend ist, können höhere Dosen (oder effektiv höhere Dosen, die durch einen anderen, stärker lokalisierten Verabreichungsweg erzielt werden) eingesetzt werden.
Im Allgemeinen werden für eine Behandlung oder für eine Erzeugung oder Erhöhung einer Immunreaktion Dosen des Tumor-assoziierten Antigens von 1 ng bis 1 mg, vorzugsweise von 10 ng bis 100 μg formuliert und verabreicht. Falls die Verabreichung von Nukleinsäuren (DNA sowie RNA) erwünscht ist, werden Dosen von 1 ng bis 0, 1 mg formuliert und verabreicht.
Die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen werden im Allgemeinen in pharmazeutisch verträglichen Mengen und in pharmazeutisch verträglichen Zusammensetzungen verabreicht. Der Begriff „pharmazeutisch verträglich" betrifft ein nicht-toxisches Material, das nicht mit der Wirkung des aktiven Bestandteils der pharmazeutischen Zusammensetzung wechselwirkt. Solche Zubereitungen können gewöhnlich Salze, Pufferstoffe, Konservierungsstoffe, Träger und gegebenenfalls andere therapeutische Wirkstoffe enthalten. Bei einer Verwendung in der Medizin sollten die Salze pharmazeutisch verträglich sein. Nicht-pharmazeutisch verträgliche Salze können jedoch für die Herstellung pharmazeutisch verträglicher Salze davon verwendet werden und sind erfindungsgemäß umfasst. Solche pharmakologisch und pharmazeutisch verträglichen Salze umfassen in nicht begrenzender Weise diejenigen, die aus den nachstehenden Säuren hergestellt werden: Chlorwasserstoff-,
Bromwasserstoff-, Schwefel-, Salpeter-, Phosphor-, Malein-, Essig-, Salicyl-, Citronen-, Ameisen-, Malon-, Bernsteinsäure und ähnliches. Pharmazeutisch verträgliche Salze können auch als Alkalimetall- oder Erdalkalimetallsalze wie Natrium-, Kalium- oder Calciumsalze hergestellt werden.
Eine erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung kann einen pharmazeutisch verträglichen Träger umfassen. Der Begriff „pharmazeutisch verträglicher Träger" betrifft erfindungsgemäß einen oder mehrere kompatible feste oder flüssige Füllstoffe, Verdünnungsmittel oder Kapselsubstanzen, die für eine Verabreichung an einen Menschen geeignet sind. Der Begriff „Träger" betrifft einen organischen oder anorganischen Bestandteil, natürlicher oder synthetischer Natur, in dem der aktive Bestandteil kombiniert wird, um eine Anwendung zu erleichtern. Die Bestandteile der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung sind gewöhnlich derart, dass keine Interaktion auftritt, die die gewünschte pharmazeutische Wirksamkeit wesentlich beeinträchtigt.
Vorzugsweise sind die Trägerstoffe sterile Flüssigkeiten wie Wasser oder Öle, einschließlich derjenigen, die sich von Erdöl, Tieren oder Pflanzen ableiten oder synthetischen Ursprungs sind, wie z.B. Erdnussöl, Sojabohnenöl, Mineralöl, Sesamöl, Sonnenblumenöl und dergleichen. Salzlösungen und wässrige Dextrose- und Glycerinlösungen können auch als wässrige Träger Stoffe verwendet werden.
Beispiele für Hilfs- und Trägerstoffe sind Acryl- und Methacrylderivate, Alginsäure, Sorbinsäurederivate wie α-Octadecyl-ω-hydroxypoly(oxyethylen)- 5-sorbinsäure, Aminosäuren und deren Derivate, insbesondere Aminverbindungen wie Cholin, Lecithin und Phosphatidylcholin, Gummi arabicum, Aromastoffe, Ascorbinsäure, Carbonate wie beispielsweise Natrium-, Kalium-, Magnesium- und Calciumcarbonat und -hydrogencarbonat, Hydrogenphosphate und Phosphate von Natrium, Kalium, Calcium und Magnesium, Carmellosenatrium, Dimeticon, Farbstoffe, Geschmacksstoffe, Puffersubstanzen, Konservierungsmittel, Verdickungsmittel, Weichmacher, Gelatine, Glucosesirupe, Malz, hochdisperses Siliziumdioxid, Hydromellose, Benzoate, insbesondere Natrium- und Kaliumbenzoat, Macrogol, Magermilchpulver, Magnesiumoxid, Fettsäuren und deren Derivate und Salze wie Stearinsäure und Stearate, insbesondere Magnesium- und Calciumstearat, Fettsäureester sowie Mono- und Diglyceride von Speisefettsäuren, natürliche und künstliche Wachse wie Bienenwachs, gelbes Wachs und Montanglycolwachs, Chloride, insbesondere Natriumchlorid, Polyvidon, Polyethylenglykole, Polyvinylpyrrolidon, Povidon, Öle wie Rizinusöl, Sojaöl, Kokosnussöl, Palmkernöl, Zucker und Zuckerderivate, insbesondere Mono- und Disaccharide wie Glucose, Fructose, Mannose, Galactose, Lactose, Maltose, Xylose, Saccharose, Dextrose und Cellulose und deren Derivate, Schellack, Stärke und Stärkederivate, insbesondere Maisstärke, Talg, Talkum, Titandioxid, Weinsäure, Zuckeralkohole wie Glycerin, Mannit, Sorbit und Xylit und deren Derivate, Glykol, Ethanol und Gemische derselben.
Vorzugsweise können die pharmazeutischen Zusammensetzungen zusätzlich auch Benetzungsmittel, Emulgatoren und/ oder pH-puffernde Mittel enthalten. In einer weiteren Ausführungsforrn können die pharmazeutischen Zusammensetzungen einen Resorptionsverstärker enthalten. Diese Resorptionsverstärker können, falls gewünscht, eine äquimolare Menge des Trägerstoffs in der Zusammensetzung ersetzen. Beispiele für solche Resorptionsverstärker umfassen in nicht begrenzender Weise Eucalyptol, N,N-Diethyl-m-toruamid, Polyoxyalkylenalkohole (wie Propylenglykol und Polyethylengfykol) , N-Methyl-2-pyrrolidon, Isopropylmyristat,
Dimethylformamid (DMF), Dimethylsulfoxid (DMSO), Dimethylacetamid (DMA), Harnstoff, Diethanolamin, Triethanolamin und dergleichen (siehe z.B. Percutaneous Penetration Enhancers, Hrsg. Smith et al. (CRC Press, 1995)). Die Menge an Resorptionsverstärker in der Zusammensetzung kann von den gewünschten zu erreichenden Wirkungen abhängen.
Ein Protease-Inhibitor kann in die erfindungsgemäße Zusammensetzung eingebaut werden, um einen Abbau eines Peptid- oder Proteinwirkstoffs zu vermeiden und dadurch die Bioverfügbarkeit zu erhöhen. Beispiele für Protease-Inhibitoren umfassen in nicht-begrenzender Weise Aprotinin, Leupepsin, Pepstatin, α2-Makroglobulin und Trypsin-Inhibitor. Diese Inhibitoren können alleine oder in Kombination verwendet werden.
Die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen können mit einer oder mehreren Beschichtungen versehen sein. Vorzugsweise sind die festen oralen Darreichungsformen mit einer magensaftresistenten Beschichtung versehen oder liegen in Form einer magensaftresistenten, gehärteten Weichgelatinekapsel vor.
Die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen können geeignete Pufferstoffe wie Essigsäure in einem Salz, Citronensäure in einem Salz, Borsäure in einem Salz und Phosphorsäure in einem Salz enthalten. Die pharmazeutischen Zusammensetzungen können auch gegebenenfalls geeignete Konservierungsstoffe wie Benzalkoniumchlorid, Chlorbutanol, Parabene und Thimerosal enthalten.
Die pharmazeutischen Zusammensetzungen werden gewöhnlich in einer einheitlichen Dosisform dargeboten und können in an sich bekannter Weise hergestellt werden. Erfinduήgsgemäße pharmazeutische
Zusammensetzungen können beispielsweise in Form von Kapseln, Tabletten, Lutschpastillen, Lösungen, Suspensionen, Sirupen, Elixieren oder als Emulsion vorliegen.
Zusammensetzungen, die für eine parenterale Verabreichung geeignet sind, umfassen gewöhnlich eine sterile wässrige oder nicht- wässrige Zubereitung des Wirkstoffs, die vorzugsweise mit dem Blut des Empfängers isotonisch ist. Verträgliche Träger und Lösungsmittel sind beispielsweise Ringer-Lösung und isotonische Natriumchloridlösung. Zusätzlich werden gewöhnlich sterile, fixierte Öle als Lösungs- oder Suspensionsmedium eingesetzt.
Die vorliegende Erfindung wird durch die nachstehenden Beispiele und Figuren ausführlich beschrieben, die ausschließlich der Erläuterung dienen und nicht begrenzend zu verstehen sind. Dem Fachmann sind aufgrund der Beschreibung und der Beispiele weitere Ausführungsformen zugänglich, die nicht über den Rahmen der Erfindung und den Umfang der anhängenden Ansprüche hinausgehen.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen:
Abbildung 1: Schematische Darstellung eines erfindungsgemäßen Fusionsproteins. Das Fusionsprotein besteht aus einem N-terminal gelegenen Sekretionssignal, einer C-terminal lokalisierten Transmembran- und cytoplasmatischen Domäne eines Histokompatibilitätsantigens und einer integrierten kompletten oder partiellen Sequenz eines Antigens. Abbildung 2: Schematische Darstellung der Kassetten für die Expression von Fusionsproteinen. SP: Signalpeptid; MCS: multiple Klonierungsstelle; TM: Transmembrandomäne; MHC Tail: cytoplasmatischer Schwanz eines MHC-Moleküls; Antigen: Sequenz kodierend für ein Antigen, gegen das Immunantworten induziert werden sollen
Abbildung 3: Testen der Auswirkung unterschiedlicher RNA-Dosen auf die Frequenz antigenspezifischer CD4+-T-Lymphozyten. 1 x 106 aufgereinigte CD4+-Lymphozyten wurden über 1 Woche mit 2 x 105 DC kokultiviert, welche mit RNA in den angegebenen Mengen (0, 1-10 μg RNA) per Elektroporation transfiziert worden waren. Am Tag 7 nach Stimulation wurde ein ELISPOT unter Standardbedingungen zum Nachweis Interferon-gamma-sezernierender T-Lymphozyten durchgeführt. Als Antigen- präsentierende Zellen wurden DC desselben Spenders, die mit überlappenden pp65-Peptiden (1,75 μg/ml) oder einem irrelevanten Kontrollpeptid beladen worden waren, verwendet. Für den Test wurden 3 x 104 Effektoren mit 2 x 104 DC für 16 h koinkubiert. Nach Standardentwicklung wurde die Anzahl der IFN-gamma-sezernierenden T- Lymphozyten mittels einer Software-basierten Videoauswertung bestimmt. Im Vergleich zu der CMVpp65standard-RNA zeigt sich eine massive Expansion von CD4+-Lymphozyten sowohl durch das CMVpp65-TMl- als auch durch das CMVpp65-TM2-Konstrukt.
Abbildung 4: Testen der Auswirkung unterschiedlicher RNA-Dosen auf die Frequenz Interferon-gamma-sezernierender CD8+-T-Lymphozyten. 1 x 106 aufgereinigte CD8+-Lymphozyten wurden über 1 Woche mit 2 x 105 DC kokultiviert, welche mit RNA in den angegebenen Mengen (0, 1-10 μg RNA) per Elektroporation transfiziert worden waren. Am Tag 7 wurde ein Standard ELISPOT zum Nachweis IFN-gamma-sezernierender T- Lymphozyten gegen DC desselben Spenders durchgeführt, welche mit überlappenden pp65-Peptiden (1,75 μg/ml) oder einem irrelevanten KontroUpeptid beladen worden waren. Es wurden 3 x 104 Effektoren mit 2 x 104 DC für 16 h koinkubiert, Nach Standardentwicklung wurde die Anzahl der IFN-gamma-sezernierenden T-Lymphozyten mittels einer Softwarebasierten Videoauswertung bestimmt. Es zeigte sich eine massive Expansion von CD8+-Lymphozyten durch das CMVρρ65-TMl- und das CMVpp65-TM2- Konstrukt. Selbst bei Verwendung von lOOx geringeren Dosen (0, 1 μg RNA) liegt die Frequenz der pp65-spezifischen CD 8+ -Lymphozyten noch über dem Hintergrund nach Stimulation durch mit NYESO-RNA transfizierten DC (Daten nicht gezeigt). Die Stimulation durch das CMVpp65standard- Konstrukt zeigte erst ab 2,5 μg eine Expansion von pp65-spezifischen Lymphozyten über das Niveau des Hintergrunds hinaus.
Abbildung 5: Dosis/Wirkungs-Profil für die Expansionskapazität verschiedener Immunogene auf Antigen-spezifische Lymphozyten. Die erfϊndungsgemäß modifizieirten Immunogene weisen eine deutlich gesteigerte Potenz (> 100x) und eine höhere maximale Wirkung auf.
Abbildung 6: Vergleichender Test der Auswirkung von erfindungsgemäß modifizierten Immunogenen und Standardimmunogenen auf die Generierung von cytotoxischen Immunantworten. 1 x 106 aufgereinigte CD8+-Lymphozyten wurden über 1 Woche mit 2 x 105 DC kokultiviert, welche mit lOμg RNA per Elektroporation transfiziert worden waren. Am Tag 7 wurde ein Standard Cytochrom-Cytotoxizitästest gegen DC desselben Spenders durchgeführt, "welche mit unterschiedlichen Konzentrationen überlappender pp65-Peptide oder einem irrelevanten KontroUpeptid beladen worden waren. Es wurden 15 x 104 Effektoren mit 0,5 x 104 DC für 4 h koinkubiert. Nach Messung des Überstandes im Counter wurde die spezifische Lyse berechnet, gemäß der Formel: Es zeigte sich eine starke Lyse durch CD8+-Lymphozyten, welche mit CMVpp65-TMl- und CMVpp65- TM2-Konstrukten stimuliert worden waren, die bis zu einer Konzentration von 10 nM des pp65-Peptid-Gemisches über dem Wert für das KontroUpeptid lag (Daten nicht gezeigt). Durch das pp65-Peptid-Gemisch wurden ebenfalls CD8+-Lymphozyten expandiert, die eine deutliche spezifische Lyse zeigten, aber nicht das Niveau von CMVpp65-TMl und -TM2 erreichten. Durch das CMVpp65standard-Konstrukt konnte nur eine schwache Stimulation pp65-spezifischer cytotoxischer T-Zellen erreicht werden.
Abbildung 7: Schematische Darstellung der Kassetten für die Expression von Fusionsproteinen. CS: Klonierungsstelle; TM: Transmembrandomäne; SNARE: SNARE-Protein oder -Motiv; Antigen: Sequenz kodierend für ein Antigen, gegen das Immunantworten induziert werden sollen
Abbildung 8: In den Beispielen verwendete Sequenzen HLA-Klasse I-TM- CM: Transmembran-cytoplasmatische Region eines HLA-Klasse I-Moleküls; HLA-Klasse II-TM-CM: Transmembran-cytoplasmatische Region eines HLA- Klasse II-Moleküls
Abbildung 9: Sequenzen von Transmembran-cytoplasmatischen Regionen bzw. cytoplasmatischen Regionen von MHC-Molekülen. Die
Sequenzen zeigen die Transmembran-cytoplasmatische Region bzw. nur die cytoplasmatische Region verschiedener HLA Moleküle. Die Transmembranregion ist unterstrichen und fett
Abbildung 10: Sequenzen von SNARE-Proteinen. Diese Sequenzen sind für eine Konstruktion der erfindungsgemäßen SNARE-Antigen- Fusionsmoleküle (N-SNARE-Antigen) geeignet
Abbildung 11: Stimulation naiver CD8+-T-Lymphozyten durch erfindungsgemäße Fusionskonstrukte. In Mikrotiterplatten wurden pro Well lxlO5 CD8+-Lymphozyten gegen 2 x 104 DC, welche mit 20 μg CMVpp65-TMl oder Kontroll-RNA transfiziert waren, stimuliert. Das Medium wurde mit IL-6 (1000 U/ml) und IL-12 (10 ng/ml) supplementiert. Am Tag +7 und +14 wurde mit aufgetauten transfizierten DC (2 x 104 / Well) restimuliert, wobei das Medium IL-2 (10 U/ml) und IL-7 (5 ng/ml) enthielt. Am Tag +21 wurden alle Populationen im ELISpot gegen Kontroll-Peptide (l,75μg/ml) und gegen pp65-überlappende Peptide (l,75μg/ml) getestet. Zwei der gegen CMVpp65-TMl stimulierten Populationen (Pop. l, Pop.2) zeigten eine deutliche pp65-Reaktivität.
Beispiele:
Beispiel 1: Herstellung der modifizierten Vakzine
Für die Herstellung der modifizierten Vakzine wurde zunächst in einem Expressionsvektor, welcher die Transkription von RNA erlaubt, eine Kassette hergestellt, die die Expression von Fusionsgenen erlaubt. Hierfür wurde zunächst die Nukleinsäure, die für ein Signalpeptid eines HLA-Moleküls kodiert, aus menschlichen Lymphozyten amplifϊziert und das Fragment als cDNA in einen Vektor Moniert (SEQ ID NO: 1 und 2). Die Klonierung wurde so durchgeführt, dass hinter der cDNA des Signalpeptids verschiedene Restriktionsenzym-Schnittstellen lagen und sich weitere Fragmente „in- frame" in die Expressionskassette Monieren lassen. Als Vektoren wurden Plasmide ausgewählt, die über einen 5'-gelegenen RNA-Polymerase-Promoter T3, T7 bzw. SP6 eine in vitro-Expression von RNA erlauben. Als nächstes Fragment wurde eine cDNA in diesen Vektor Moniert, welche eine Transmembrandomäne und die cytoplasmatische Domäne eines HLA-Klasse I (SEQ ID NO: 3 und 4) bzw. eines Klasse II (SEQ ID NO: 5 und 6) Moleküls, einschließlich Stop-Codon kodiert. Die Klonierung wurde so durchgeführt, dass das entstehende Plasmid zwischen den beiden Fragmenten noch Restriktionsenzym-Schnittstellen zur Klonierung von Antigenen (SEQ ID NO: 7 und 8 und Abbildung 1) aufweist. In diese Expressionskassetten wurde als Modellantigen die für das humane Cytomegalovirus Phosphoprotein 65 (pp65) kodierende Sequenz (SEQ ID NO: 9 und 10) so einkloniert, dass ein durchgehender ORF aus HLA-Signalsequenz, pp65 und HLA- Transmembran- und cytoplasmatischer Domäne (SEQ ID NO: 11 und 12) entstand. Für Kontrollexperimente wurde ein Vektor hergestellt, der die pp65-Sequenz mit einem STOP-Codon in demselben Ausgangsvektor ohne die besagten Fragmente enthielt. Für die weitergehenden Experimente wurden folgende Nukleinsäuren genutzt:
CMVpp65standard: unmodifizierte CMVpp65-Sequenz, Standardimmunogen
CMVpp65-TMl: Fusionsnukleinsäure aus folgenden Fragmenten: HLA- Klasse I-Sekretionssignal, pp65-ORF und HLA-Klasse I-Transmembran- und cytoplasmatische Domäne (modifiziertes Immunogen) .
CMVpp65-TM2: FusionsnuMeinsäure aus folgenden Fragmenten: HLA- Klasse I-Sekretionssignal, pp65-ORF und HLA-Klasse II-Transmembran- und cytoplasmatische Domäne (modifiziertes Immunogen) .
Beispiel 2: Testen der modifizierten Vakzine
Die drei Nukleinsäuren (CMVpp65standard, CMVpp65TMl, CMVpp65TM2) wurden als Immunogen in Stimulationsversuchen mit autologen DC's antigenpositiver Spender eingesetzt. Um CD4- und CD8-Immunantworten getrennt zu testen, wurden aufgereinigte CD4+- und CD8+-Lymphozyten genutzt. Als Read-Out wurde der Enzyme-linked-Immuno-Spot-Assay
(ELISPOT) eingesetzt, der als Standardtest zur Quantifizierung IFN-λ- sezernierender T-Zellen, anerkannt ist. Zum Testen der Effektorfunktion von
CD8+-T-Lymphozyten wurde ein Standard-Chrom-Freisetzungstest benutzt.
Autologe Monozyten oder DC's wurden mit pp65-RNA, CMVpp65-TM l- und
CMVpp65-TM2-Immunogenen transfiziert. Als Maximal-
Stimulationskontrolle wurden DC's mit überlappenden Peptiden für pp65 sowie mit KontroUpeptid beladen. Die so behandelten DC's wurden über
Nacht oder für 7 Tage mit CD4-+- oder CD-8+-Lymphozyten koinkubiert. Das
Read-Out erfolgte gegen autologe Monozyten oder DC's, die mit pp65- überlappenden Peptiden oder einem CMV-Fibroblastenlysat gepulst worden waren. Bei der Untersuchung von CD4+-Immunantworten zeigte sich überraschenderweise, dass beide modifizierten Immunogene (CMVpp65-TMl und CMVpp65-TM2) nicht nur eine gegenüber dem CMVpp65standard- Immunogen verstärkte Immunantwort auslösten, sondern auch eine maximal starke antigenspezifische IFN-gamma-Sekretion bei CD4+- Lymphozyten induzierten (Abbildung 3). Der Prozentsatz der antigenspezifischen CD4+-Zellen nach Stimulation durch die modifizierten pp65-Konstrukte war dabei gleich oder sogar höher als nach Stimulation mit pp65-überlappenden Peptiden. Wie erwartet, zeigte das CMVpp65standard- Immdnogen keine relevante Stimulation von CD4+-Lymphozyten.
Ein noch überraschenderes Ergebnis ergab sich bei der Untersuchung von CD8-Immunantworten nach Stimulation mit den Immunogenen. Es ließ sich zeigen, dass die Verwendung der modifizierten Expressionskassetten zur Stimulation von CD8+-Lymphozyten ebenfalls zu einem Anteil spezifisch IFN-λ-sezernierender Zellen führte, welcher dem nach Stimulation mit pp65- überlappenden Peptiden vergleichbar ist. Überraschenderweise waren auch hierbei die modifizierten RNA-Konstrukte den unveränderten CMVpp65standard-Immunogenen weit überlegen (Abbildungen 4 und 5). Die Ergebnisse im Zytotoxizitätsassay zeigten, dass beide Modifikationen zur einer bisher noch nicht beschriebenen drastischen Erhöhung der Cytotoxizität im Vergleich zu CMVpp65standard-RNA führten (Abbildung 6). Auch hierbei zeigte sich überraschenderweise eine Überlegenheit der modifizierten Immunogene gegenüber den überlappenden pp65-Peptiden.
Beispiel 3: Stimulation naiver CD8+-T-Lymphozyten durch HLA- Fusionsantigene
Um die Möglichkeit des Priming und der nachfolgenden Expansion von naiven CD8+-Lymphozyten durch die erfindungsgemäßen Fusionskonstrukte zu testen, wurden dendritische Zellen eines CMV-negativen Spenders mit RNA des unmodifizierten CMVpp65, oder mit CMVρp65-TMl-RNA bzw. mit einer Kontroll-RNA (NY-Eso-1) transfiziert. Die transfizierten dendritischen Zellen wurden zur Stimulation von autologen CD8+-Lymphozyten eingesetzt. Es wurden 2 Restimulationen in wöchentlichem Abstand mit eingefrorenen transfizierten dendritischen Zellen durchgeführt. Zum Read-Out wurden am Tag +21 nach der ersten Stimulation alle Zeil-Populationen in einem IFNγ- ELISpot Assay gegen autologe dendritische Zellen getestet, welche entweder mit pp65-überlappenden Peptiden oder zur Kontrolle mit irrelevanten überlappenden Peptiden beladen Λvaren. Hierbei wurde festgestellt, dass durch die Stimulation mit CMVpp65-TMl-RNA in zwei Fällen pp65-reaktive CD8+-T- Lymphozyten- Populationen generiert wurden (Abbildung 11). Stimulationen mit der dendritischen Zellen, die mit der unmodifizierten CMVpp65 RNA bzw. mit Kontroll-RJNA transfϊzierte wurden, wiesen dagegen keine signifikante pp65 -Reaktivität auf.
Beispiel 4: Nutzung von HLA-Fusionsantigenen zur Stimulation von tumorzellreaktiven T-Lymphozyten
Um CD8+- und CD4+-T-Lymphozyten gegen definierte Tumorantigene expandieren zu können, wurden folgende Antigensequenzen als Inserts in erfindungsgemäße Fusionskonstrukte Moniert: das Tumorantigen TPTE
(Koslowski et al., 2004, PMID 15342378), das Tumorantigen PRAME (Ikeda et al., 1997, PMID 9047241) in der Variante 1 (SEQ ID NO: 64), das
Tumorantigen WT1 als Variante C (SEQ ID NO: 65) sowie das Tumorantigen p53 (SEQ ID NO: 66). Für die funktioneile Validierung wurden humane dendritische Zellen eines HLA* A 0201 -positiven Spenders entweder mit
WT1-HLA-TM1-RNA, mit unmodifizierter WT1-RNA oder irrelevanter
Kontroll-RNA transfiziert und als Targetzellen benutzt. Nach Koinkubation mit WTl-reaktiven CD8+-T-Zellklonen für 8 oder 16 Stunden wurde IFNγ im Überstand quantifiziert. Es zeigte sich, dass nach Koinkubation mit WT1-
HLA-TM1 -transfizierten dendritischen Zellen die Sekretion um einen Faktor 6-9 höher lag im Vergleich zur Koinkubation nach Transfektion mit unmodifiziertem WT1.
In einer Serie von Experimenten wurden zusammenfassend mehrfach bestätigt folgende Resultate erzielt:
• Die modifizierten Immunogene führen zu einer deutlich verstärkten Stimulation und Expansion von Antigen-spezifischen CD4+-Lymphozyten (gesteigerte Vermehrung von CD4+-Lymphozyten)
• Die modifizierten Immunogene führen zu einer deutlich verstärkten Stimulation und Expansion von Antigen-spezifischen CD8+-Lymphozyten (gesteigerte Vermehrung von CD8+-Lymphozyten)
• Die modifizierten Immunogene führen zu einer deutlich verstärkten Zytokinausschüttung von Antigen-spezifischen CD4+-Lymphozyten und CD8+-Lymphozyten (gesteigerte Zytokinausschüttung=gesteigerte Aktivierung)
• Die modifizierten Immunogene führen zu einer deutlich verstärkten cytotoxischen Reaktivität von Antigen-spezifischen CD8+-Lymphozyten (gesteigerter zytotoxischer Effekt)
• Die modifizierten Immunogene sind lOOx potenter bezüglich der
Expansion von Antigen-spezifischen CD8+-Lymphozyten
• Die modifizierten Immunogene haben selbst bei lOOx niedrigerer Dosis einen stärkeren Effekt auf die Expansion von Antigen-spezifischen CD4+- Lymphozyten als Standard-Immunogene Zusammenfassend lässt sich also sagen, dass die erfindungsgemäßen Modifikationen eines Antigens in einer über 100-fach gesteigerten Potenz (Linksverschiebung der Dosis-Wirkungskurve) und einer drastisch erhöhten biologischen Wirksamkeit resultieren . Im Vergleich mit den bisher üblichen unmodifizierten Antigensequenzen lässt sich ein Immunogen generieren, das als Vakzine eine quantitativ und qualitativ höhere Wirksamkeit besitzt.
Ein wichtiges Resultat der Erfindung ist, dass gleichzeitig antigenspezifische CD4+- und CD8+-Lymphozyten optimal stimuliert und expandiert werden. Für die Wirksamkeit besonders von therapeutischen Vakzinen ist eine Stimulation der CD8+- und CD4+-Lymphozyten von entscheidender Bedeutung.

Claims

Patentansprüche
1. Fusionsmolekül, das ein Antigen, eine Transmembranregion und die cytoplasmatische Region einer Kette eines MHC-Moleküls umfasst.
2. Fusionsmolekül nach Anspruch 1, wobei das Fusionsmolekül keine Bindedomäne einer Kette eines MHC-Moleküls umfasst.
3. Fusionsmolekül nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Transmembranregion von einem MHC-Molekül abgeleitet ist.
4. Fusionsmolekül nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Transmembranregion und cytoplasmatische Region eine Sequenz umfassen, die der Transmembranregion in Verbindung mit der cytoplasmatischen Region eines MHC-Moleküls entspricht.
5. Fusionsmolekül nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das Fusionsmolekül zusätzlich eine Leitsequenz umfasst.
6. Fusionsmolekül nach Anspruch 5, wobei die Leitsequenz von einem MHC-Molekül abgeleitet ist.
7. Fusionsmolekül nach Anspruch 5 oder 6, wobei das Fusionsmolekül folgende Anordnung aufweist: N-Terminus-Leitsequenz / Antigen / Transmembranregion / cytoplasmatische Region-C-Terminus, wobei die einzelnen Regionen gegebenenfalls durch Linkersequenzen voneinander getrennt sein können.
8. Fusionsmolekül nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei das Antigen mehrere Antigene umfasst.
9. Nukleinsäure, die für ein Fusionsmolekül nach einem der Ansprüche 1 bis 8 kodiert.
10. Wirtszelle, die eine Nukleinsäure nach Anspruch 9 umfasst.
11. Pharmazeutische Zusammensetzung, die ein oder mehrere Fusionsmoleküle nach einem der Ansprüche 1 bis 8 und/ oder eine oder mehrere Nukleinsäuren nach Anspruch 9 und/ oder eine oder mehrere Wirtszellen nach Anspruch 10 umfasst.
12. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 11 in Form einer Vakzine.
13. Verfahren zur Erhöhung der Menge an MHC/ Peptid- Komplexen in einer ZeUe, wobei das Verfahren die Bereitstellung eines oder mehrerer
Fusionsmoleküle nach einem der Ansprüche 1 bis 8 und/ oder einer oder mehrerer Nukleinsäuren nach Anspruch 9 für die Zelle umfasst.
14. Verfahren zur Steigerung der Präsentation von Zelloberflächenmolekülen auf Zellen, die in der Lage sind, Antigene zu präsentieren, insbesondere B-Zellen und Makrophagen, wobei das Verfahren die Bereitstellung eines oder mehrerer Fusionsmoleküle nach einem der Ansprüche 1 bis 8 und/ oder einer oder mehrerer Nukleinsäuren nach Anspruch 9 für die Zellen umfasst.
15. Verfahren nach Anspruch 13 oder 14, wobei die Erhöhung der Menge an MHC/Peptid-Komplexen oder Steigerung der Präsentation von Zelloberflächenmolekülen ihrerseits die primäre Aktivierung von T-Zellen, insbesondere von CD4+- und CD8+-Lymphozyten, die gegenüber dem Antigen reagieren, verstärkt.
16. Verfahren zum Auslösen einer Immunreaktion bei einem Lebewesen, wobei ' das Verfahren die Verabreichung eines oder mehrerer Fusionsmoleküle nach einem der Ansprüche 1 bis 8 und/ oder einer oder mehrerer Nukleinsäuren nach Anspruch 9 und/ oder einer oder mehrerer Wirtszellen nach Anspruch 10 an das Lebewesen umfasst.
17. Verfahren zur Stimulierung oder Aktivierung von T-Zellen, insbesondere CD4+- und CD8+-Lymphozyten, vorzugsweise in einem Lebewesen, wobei das Verfahren die Bereitstellung für die T-Zellen bzw. Verabreichung an das Lebewesen eines oder mehrerer Fusionsmoleküle nach einem der Ansprüche 1 bis 8 und/ oder einer oder mehrerer Nukleinsäuren nach Anspruch 9 und/ oder einer oder mehrerer Wirtszellen nach Anspruch 10 umfasst.
18. Verfahren zur Behandlung, Vakzinierung oder Immunisierung eines Lebewesens, wobei das Verfahren die Verabreichung eines oder mehrerer Fusionsmoleküle nach einem der Ansprüche 1 bis 8 und/ oder einer oder mehrerer Nukleinsäuren nach Anspruch 9 und/ oder einer oder mehrerer Wirtszellen nach Anspruch 10 an das Lebewesen umfasst.
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