DE19638313A1 - Pharmazeutische Zusammensetzung für die Immunmodulation - Google Patents
Pharmazeutische Zusammensetzung für die ImmunmodulationInfo
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Description
Die Erfindung bezieht sich auf das Gebiet der
Immunmodulation.
Die Erfindung ist eine Weiterentwicklung einer
therapeutischen Vakzine auf der Grundlage von
Tumorzellen. Diese beruht im wesentlichen auf den
folgenden Voraussetzungen: es bestehen qualitative oder
quantitative Unterschiede zwischen Tumorzellen und
normalen Zellen; das Immunsystem hat prinzipiell die
Fähigkeit, diese Unterschiede zu erkennen; das
Immunsystem kann - durch aktive spezifische Immunisierung
mit Vakzinen - dazu stimuliert werden, Tumorzellen anhand
dieser Unterschiede zu erkennen und deren Abstoßung
herbeizuführen
Um eine Anti-Tumorantwort herbeizuführen, müssen
zumindest zwei Voraussetzungen erfüllt sein: erstens
müssen die Tumorzellen Antigene exprimieren, die auf
normalen Zellen nicht oder nur derart begrenzt vorkommen,
daß eine qualitative Unterscheidung zwischen Normal- und
Tumorgewebe durch das Immunsystem möglich ist. Zweitens
muß das Immunsystem entsprechend aktiviert werden, um auf
diese Antigene zu reagieren. Ein wesentliches Hindernis
bei der Immuntherapie von Tumoren ist deren geringe
Immunogenizität, vor allem im Menschen.
In jüngerer Zeit wurden Tumor-assoziierte und Tumor-spezifische
Antigene entdeckt, die solche Neo-Epitope
darstellen und somit potentielle Ziele für einen Angriff
des Immunsystems sein sollten. Daß es dem Immunsystem
dennoch nicht gelingt, Tumoren zu eliminieren, die diese
Neo-Epitope exprimieren, dürfte demnach offensichtlich
nicht am Fehlen von Neo-Epitopen gelegen sein, sondern
daran, daß die immunologische Antwort auf diese Neo-Antigene
unzureichend ist.
Für die Immuntherapie von Krebs auf zellulärer Basis
wurden zwei allgemeine Strategien entwickelt: Einerseits
die adoptive Immuntherapie, die sich der in vitro
Expansion von tumorreaktiven T-Lymphozyten und deren
Wiedereinführung in den Patienten bedient; andererseits
die aktive Immuntherapie, welche Tumorzellen verwendet,
in der Erwartung, daß damit entweder neue oder verstärkte
Immunantworten gegen Tumorantigene hervorgerufen werden,
die zu einer systemischen Tumorantwort führen.
Tumorvakzine auf der Grundlage der aktiven Immuntherapie
wurden auf verschiedene Arten hergestellt; ein Beispiel
dafür sind bestrahlte Tumorzellen, die mit
immunstimulierenden Adjuvantien wie Corynebacterium
parvum oder Bacillus Calmette Guerin (BCG) versetzt
werden, um Immunreaktionen gegen Tumorantigene
hervorzurufen (Oettgen und Old, 1991).
In den letzten Jahren wurden vor allem genetisch
modifizierte Tumorzellen für eine aktive Immuntherapie
gegen Krebs verwendet. Eine Übersicht über diese
verschiedenen Ansätze, bei denen Tumorzellen im Hinblick
auf eine verstärkte Immunogenizität durch Einführung
verschiedener Gene verfremdet werden, wird von Zatloukal
et al., 1993, gegeben. Eine der bisher eingesetzten
Strategien verwendet Tumorzellen, die genetisch
modifiziert werden, um Zytokine zu produzieren.
Die Identifizierung und Isolierung von Tumorantigenen und
Tumor-assoziierten Antigenen (TAs) bzw. davon abgleiteter
Peptide (z. B. von Wölfel et al., 1994 a) und 1994 b);
Carrel et al., 1993, Lehmann et al., 1989, Tibbets et
al., 1993, oder in den veröffentlichten internationalen
Anmeldungen WO 92/20356, WO 94/05304, WO 94/23031, WO
95/00159 beschrieben), war die Voraussetzung für eine
weitere Strategie, bei der Tumorantigene als Immunogene
für Tumorvakzine verwendet werden, und zwar sowohl in
Form von Proteinen als auch von Peptiden. Mit einer
Tumorvakzine in Form von Tumorantigenen als solchen wurde
jedoch bisher keine ausreichende Immunogenizität
erreicht, um eine zelluläre Immunantwort auszulösen, wie
sie zur Eliminierung von Tumorantigen tragenden
Tumorzellen erforderlich wäre; auch die co-Applikation
von Adjuvantien verstärkte die Immunantwort nur bedingt
Oettgen und Old, 1991).
Eine dritte Strategie der aktiven Immuntherapie zur
Steigerung der Wirksamkeit von Tumorvakzinen basiert auf
xenogenisierten (verfremdeten) autologen Tumorzellen.
Diesem Konzept liegt die Annahme zugrunde, daß das
Immunsystem auf Tumorzellen reagiert, die ein
Fremdprotein exprimieren und daß im Zuge dieser Reaktion
auch eine Immunantwort gegen diejenigen Tumorantigene
hervorgerufen wird, die von den Tumorzellen der Vakzine
präsentiert werden.
Eine zentrale Rolle bei der Regulierung der spezifischen
Immunantwort spielt ein trimolekularer Komplex, bestehend
aus den Komponenten T-Zell-Antigenrezeptor, MHC ("Major
Histocompatibility Complex")-Molekül und dessen Liganden,
der ein von einem Protein abgeleitetes Peptidfragment
ist.
MHC-Moleküle (bzw. die entsprechenden humanen Moleküle,
die HLAs) sind Peptidrezeptoren, die bei stringenter
Spezifität die Bindung zahlreicher verschiedener Liganden
erlauben. Die Voraussetzung dafür stellen Allel-spezifische
Peptidmotive dar, die folgende
Spezifitätskriterien aufweisen: Die Peptide haben, in
Abhängigkeit vom MHC-Haplotyp, eine definierte Länge,
beim MHC-I Haplotyp in der Regel acht bis zehn
Aminosäurereste. Typischerweise stellen zwei der
Aminsoäurepositionen sog. "Anker" dar, die nur durch eine
einzige Aminosäure oder durch Aminosäure-Reste mit eng
verwandten Seitenketten besetzt werden können. Die genaue
Lage der Ankeraminosäuren im Peptid und die Anforderungen
an deren Eigenschaften variieren mit den MHC-Haplotypen.
Der C-Terminus der Peptid-Liganden ist häufig ein
aliphatischer oder ein geladener Rest. Solche MHC-I-Peptid-Ligandenmotive
sind bisher u. a. für H-2Kd, Kb, Kk,
Kkm1 Db, HLA-A*0201, A*0205 und B*2705 Haplotypen
bekannt.
Im Rahmen des Proteinumsatzes innerhalb der Zelle werden
reguläre, entartete und fremde Genprodukte, z. B. virale
Proteine oder Tumorantigene, in kleine Peptide zerlegt;
einige davon stellen potentielle Liganden für MHC-Moleküle
dar. Damit ist die Voraussetzung für deren
Präsentation durch MHC-Moleküle und als Folge davon die
Auslösung einer zellulären Immunantwort gegeben, wobei
noch nicht im einzelnen aufgeklärt ist, wie die Peptide
als MHC-Liganden in der Zelle produziert werden.
Fremde oder verfremdete Proteine und deren Bruchstücke
können auch durch Immunglobuline, die die humorale
Immunantwort darstellen, erkannt, gebunden und beseitigt
werden. Das gilt auch für sämtliche Tumorantigene: am
Beispiel der Tumor-assoziierten Antigene MUC1, CEA und
HER2/neu hat man bewiesen, daß Imunglobuline, welche für
diese Proteine Spezifizität aufweisen, die
proteintragenden Zellen erkennen und abtöten können. Um
eine Tumorantigen-spezifische humorale Immunantwort
auszulösen, wurden deshalb verschiedene Formen von MUCI
und CEA als Immunogene (z. B. in rekombinanten
Poxvektoren; Bronte at al., J.Immunol. 154: 5282 1995) in
Tiermodellen und klinischen Vorversuchen erprobt.
Der vorliegenden Erfindung lag die Aufgabe zugrunde, eine
neue pharmazeutische Zusammensetzung zur Immunmodulation
bereitzustellen, mit Hilfe derer eine wirksame zelluläre
und/oder humorale Immunantwort ausgelöst werden kann.
Zur Lösung der gestellten Aufgabe wurden Überlegungen
weitergeführt, die bei der Entwicklung einer zellulären
Tumorvakzine angestellt wurden: während nicht-maligne,
normale Körperzellen vom Immunsystem toleriert werden,
reagiert der Körper auf eine normale Zelle, wenn sie,
z. B. aufgrund einer Virusinfektion, körperfremde Proteine
synthetisiert, mit einer Immunabwehr. Die Ursache dafür
ist darin gelegen, daß die MHC-Moleküle Fremdpeptide
präsentieren, die von den körperfremden Proteinen
stammen. Als Folge davon registriert das Immunsystem, daß
etwas Unerwünschtes, Fremdes mit dieser Zelle geschehen
ist. APCs (Antigen präsentierende Zellen) werden
aktiviert, eine neue, spezifische Immunität generiert und
die Zelle eliminiert.
Tumorzellen enthalten zwar die jeweiligen
tumorspezifischen Tumorantigene, sind aber als solche
unzulängliche Vakzine, weil sie aufgrund ihrer geringen
Immunogenizität vom Immunsystem ignoriert werden. Belädt
man nun eine Tumorzelle nicht mit einem Fremdprotein,
sondern mit einem Fremdpeptid, so werden zusätzlich zu
den Fremdpeptiden auch die zelleigenen Tumorantigene von
dieser Zelle als fremd wahrgenommen. Durch die
Verfremdung mit einem Peptid kann erreicht werden, daß
sich die durch die Fremdpeptide ausgelöste zelluläre
Immunantwort gegen die Tumorantigene richtet.
Die Ursache für die geringe Immunogenizität von
Tumorzellen kann nicht ein qualitatives, sondern ein
quantitatives Problem sein. Für ein von einem
Tumorantigen abgeleitetes Peptid kann das bedeuten, daß
es zwar von MHC-Molekülen präsentiert wird, jedoch in
einer Konzentration, die zu gering ist, um eine zelluläre
tumorspezifische Immunantwort auszulösen. Eine Erhöhung
der Zahl von tumorspezifischen Peptiden auf der
Tumorzelle sollte somit ebenfalls eine Verfremdung der
Tumorzelle bewirken, die zur Auslösung einer zellulären
Immunantwort führt. Es wurde vorgeschlagen, das
Tumorantigen bzw. das davon abgeleitete Peptid dadurch
auf der Zelloberfläche zu präsentieren, daß es mit einer
für das betreffende Protein bzw. Peptid kodierenden DNA
transfiziert wird, wie in den internationalen
Veröffentlichungen WO 92/20356, WO 94/05304, WO 94/23031
und WO 95/00159, beschrieben.
In der deutschen Patentanmeldung P 195 43 649.0 ist eine
zelluläre Vakzine geoffenbart, die als aktive Komponente
Tumorzellen enthält, die mit einem oder mehreren Peptiden
derart beladen sind, daß die Tumorzellen im Kontext mit
den Peptiden vom Immunsystem des Patienten als fremd
erkannt werden und eine zelluläre Immunantwort auslösen.
Ein wesentliches Merkmal der Peptide ist, daß sie
Liganden für den MHC-Haplotyp des Patienten sind. Die
Peptide werden deshalb vom Immunsystem des Patienten als
fremd erkannt, weil sie einerseits "Fremdpeptide" oder
"Xenopeptide" sein können, d. h. sie sind verschieden von
Peptiden, die abgeleitet von Proteinen sind, die von
Tumorzellen des Patienten exprimiert werden. Eine andere
Kategorie von Peptiden ist von Tumorantigenen abgeleitet,
die von Zellen des Patienten exprimiert werden. Diese
bewirken eine Steigerung der Immunogenizität dadurch, daß
sie in einer Konzentration auf den Tumorzellen der
Vakzine vorliegen, die höher ist als die Konzentration
eines Peptids, das von demselben Tumorantigen abgeleitet
ist wie das auf den Tumorzellen des Patienten
exprimierte.
Der vorliegenden Erfindung lag die Aufgabe zugrunde, eine
immunmodulatorisch wirkende pharmazeutische
Zusammensetzung, insbesondere eine Vakzine,
bereitzustellen, die bei einfacherer Herstellung eine
effiziente Immunantwort auslöst.
In Weiterführung des Konzepts der in der deutschen
Patentanmeldung P 195 43 649.0 geoffenbarten zellulären
Vakzine wurde im Rahmen der vorliegenden Erfindung eine
pharmazeutische Zusammensetzung entwickelt, die
immunmodulatorisch wirkende Peptide nicht im Kontext mit
Zellen, sondern zusammen mit einem Adjuvans enthält, um
eine zelluläre und/oder humorale, vorzugsweise eine
systemische, Immunantwort gegen pathogene Erreger bzw.
eine Anti-Tumorantwort auszulösen bzw. zu verstärken oder
eine Toleranz gegen autoimmun wirkende Proteine
hervorzurufen.
Die Erfindung betrifft eine pharmazeutische
Zusammensetzung, enthaltend ein oder mehrere
immunmodulatorisch wirkende Peptide zusammen mit einem
Adjuvans. Die Zusammensetzung ist dadurch gekennzeichnet,
daß das Adjuvans die Fähigkeit aufweist, die Bindung des
Peptids an die Zellen bzw. dessen Eintritt in die Zellen
des zu behandelnden Individuums zu steigern.
Unter "immunmodulatorischer Wirkung" wird einerseits die
Auslösung oder Verstärkung einer zellulären und/oder
humoralen, vorzugsweise systemischen Immunreaktion
verstanden. In dieser Ausführungsform wirkt die
erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung als
Vakzine.
In einer bevorzugten Ausführungsform sind die Peptide
Liganden für mindestens ein MHC-Molekül, das vom zu
behandelnden Individuum exprimiert wird.
Die humanen MHC-Moleküle werden, gemäß den
internationalen Gepflogenheiten, im folgenden auch als
"HLA" ("Human Leucocyte Antigen") bezeichnet.
Unter "zelluläre Immunantwort" ist vor allem die
zytotoxische T-Zellimmunität zu verstehen, die als Folge
der Generierung von zytotoxischen CD8-positiven T-Zellen
und CD4-positiven Helfer-T-Zellen die Zerstörung der
Tumorzellen oder der vom pathogenen Erreger befallenen
Zellen bewirkt.
Unter "humorale Immunantwort" ist die Produktion von
Imunglobulinen zu verstehen, die selektiv Tumorzellen
oder von pathogenen Erregern abgeleitete Strukturen
erkennen und in der Folge zusammen mit anderen Systemen,
wie z. B. Komplement, ADCC (Antibody dependent
Cytotoxicity) oder Phagozytose, die Zerstörung dieser
Tumorzellen bzw. der pathogenen Erreger oder der davon
befallenen Zellen bewirken.
Das in der Vakzine enthaltene Peptid ist abgeleitet von
einem Antigen, gegen das eine zelluläre und/oder humorale
Immunantwort ausgelöst werden soll. Damit wird bewirkt,
daß T-Zellen bzw. andere zytotoxische Effektorzellen, die
den Krankheitserreger bzw. die Tumorzellen, die das
Antigen aufweisen, erkennen, und/oder Antikörper
generiert werden.
Für die Immunisierung gegen pathogene Krankheitserreger,
wie Bakterien, Viren, Parasiten, werden Peptide
verwendet, die abgeleitet sind von einem Protein des bzw.
der jeweiligen Erreger. Geeignet sind dabei vor allem
Proteine, die von der hohen allgemeinen Mutationsrate
dieser Erreger verschont bleiben. Publizierte Beispiele
sind HPV16/17 (Human Papilloma Virus; Feltkamp et al.,
1995), Hepatitis B Virus Core Antigen (Vitiello et al.,
1995), Plasmodium Bergheii (Widmann et al., 1992.),
Influenzavirus Nucleoprotein, Hepatitis C Virus.
In einer Ausführungsform der Erfindung ist das Peptid, im
Hinblick auf die Auslösung einer Anti-Tumorantwort, von
einem Tumorantigen abgeleitet, dabei wird die
pharmazeutische Zusammensetzung als Tumorvakzine
verwendet. In diesem Fall ist, bei therapeutischer
Anwendung der Vakzine, das Peptid von einem Tumorantigen
abgeleitet, das von den Tumorzellen des Patienten
exprimiert wird.
Die Tumorantigene des Patienten werden im allgemeinen im
Zuge der Erstellung von Diagnose und Therapieplan mit
Standardmethoden, z. B. mit Hilfe von Assays auf der
Grundlage von CTLs mit Spezifität für das zu bestimmende
Tumorantigen bestimmt. Derartige Assays wurden u. a. von
Herin et al, 1987; Coulie et al., 1993; Cox et al., 1994;
Rivoltini et al., 1995; Kawakami et al., 1995; sowie in
der WO 94/14459 beschrieben; diesen Literaturstellen sind
auch verschiedene Tumorantigene bzw. davon abgeleitete
Peptidepitope entnehmbar. Auf der Zelloberfläche
auftretende Tumorantigene können auch mit Hilfe von
Antikörpern nachgewiesen werden. Wenn die Tumorantigene
Enzyme sind, z. B. Tyrosinasen, können sie mit Enzymassays
nachgewiesen werden. Bei bekannten Sequenzen kann auch die
RT-PCR-Methode herangezogen werden. Boon, T., et al.,
1994; Coulie, P.G., et al., 1994; Weynants, P., et
al., 1994.
Eine Tumorvakzine, die von einem Tumorantigen abgeleitete
Peptide enthält, kann, außer therapeutisch, auch
prophylaktisch verabreicht werden. Bei der
prophylaktischen Anwendung wird zweckmäßig eine Mischung
von Peptiden eingesetzt, die abgeleitet sind von
Vertretern häufig auftretender Tumorantigene. Bei der
therapeutischen Anwendung der erfindungsgemäßen
Tumorvakzine werden ein oder mehrere Peptide verwendet,
von denen zu erwarten ist, daß sie in Tumorantigen(en)
des Patienten enthalten sind.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird
das Peptid, im Hinblick auf die Auslösung einer
zellulären Immunantwort, auf den MHC-I- oder MHC-II-Subtyp
des zu vakzinierenden Individuums abgestimmt; das
Peptid weist also eine Sequenz auf bzw. enthält eine
Sequenz, die seine Bindung an ein MHC-Molekül
gewährleistet.
In einer weiteren Ausführungsform enthält die
pharmazeutische Zusammensetzung, in der Anwendungsform
als Tumorvakzine, außerdem ein ein immunstimulatorisch
wirkendes Polypeptid, insbesondere ein Zytokin. In einer
bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird als
Zytokin Interleukin 2 (IL-2) oder GM-CSF verwendet, z. B.
in einer Dosierung von ca. 1000 Einheiten; weitere
Beispiele für Zytokine sind IL-4, IL-12, IFN-γ, TNF-α,
sowie Kombinationen davon, z. B. IL-2 + IFN-γ, IL-2 + IL-4,
IL-2 + TNF-α oder TNF-α + IFN-γ.
In einer Ausführungsform der Erfindung dient die
pharmazeutische Zusammensetzung dazu, eine Toleranz gegen
Proteine bzw. deren Fragmente herbei zuführen, die
autoimmun induzierte Erkrankungen auslösen, also zur
Therapie von Autoimmunerkrankungen. Die in dieser
Ausführungsform der Erfindung verwendeten Peptide sind
von Proteinen abgeleitet, die Autoimmunerkrankungen
verursachen.
Im Gegensatz zu der Anwendung der Erfindung als
Tumorvakzine oder als Vakzine gegen pathogene Erreger,
bei der die Peptide mit einem Abschnitt des
Ursprungproteins (Tumorantigen bzw. Protein des
Pathogens) im wesentlichen derart übereinstimmen, daß das
Peptid als das "Original-Antigen" erkannt wird, werden
bei der Anwendung der Erfindung zur Behandlung von
Autoimmunerkrankungen u. a. Peptide verwendet, die zur
Aminosäuresequenz des Ursprungproteins kritische
Unterschiede aufweisen. Diese Peptide binden zwar
aufgrund ihrer Ankerpositionen an das MHC-Molekül, weisen
jedoch in ihrer Sequenz Mutationen auf, die bewirken, daß
diese Peptide als Antagonisten funktionieren, welche die
aktivierten, spezifischen T-Zellen wieder abschalten
(Kersh und Allen, 1996).
Als Peptid-Antagonisten eignen sich sowohl "natürliche"
Antagonisten, die in Viren entdeckt wurden (Bertoletti et
al., 1994.), als auch Antagonisten, die durch
systematische Forschung, z. B. durch Screenen von Peptid-Libraries,
gefunden wurden. Ein Beispiel für Peptid-Antagonisten
sind Peptide, die T-Zellen ausschalten
können, welche spezifisch für Myelin Basic Protein sind,
diese wurden in Tierexperimenten auf ihre Wirksamkeit
erprobt. (Brocke et al., 1996).
Ein Peptid, das eine zelluläre Immunantwort auslösen
soll, muß an ein MHC-Molekül binden können. Damit die
Immunantwort im Patienten ausgelöst wird, muß somit das
zu behandelnde Individuum ein entsprechendes HLA-Molekül
in seinem Repertoire aufweisen. Die Bestimmung des HLA-Subtyps
des Patienten stellt somit, im Hinblick auf die
Auslösung einer zellulären Immunantwort, eine der
wesentlichen Voraussetzungen für die wirksame Anwendung
eines Peptids an diesem Patienten dar.
Der HLA-Subtyp des Patienten kann mit Standardmethoden,
wie dem Mikro-Lymphotoxizitätstest bestimmt werden
(Practical Immunol., 1989). Dieser Test beruht auf dem
Prinzip, aus Patientenblut isolierte Lymphozyten zunächst
mit Antiserum oder einem monoklonalen Antikörper gegen
ein bestimmtes HLA-Molekül in Gegenwart von Kaninchen-Komplement
(C) zu versetzen. Positive Zellen werden
lysiert und nehmen einen Indikator-Farbstoff auf, während
unbeschädigte Zellen ungefärbt bleiben.
Zur Bestimmung des HLA-I- oder HLA-II-Haplotyps eines
Patienten kann auch die RT-PCR herangezogen werden (Curr.
Prot. Mol. Biol. Kapitel 2 und 15). Dazu entnimmt man
einem Patienten Blut und isoliert daraus RNA. Diese RNA
unterwirft man zunächst einer Reversen Transkription,
wodurch cDNA des Patienten entsteht. Die cDNA dient als
Matrize für die Polymerasekettenreaktion mit
Primerpaaren, die spezifisch die Amplifikation eines DNA-Fragmentes
bewirken, das für einen bestimmten HLA-Haplotyp
steht. Erscheint nach Agarosegelelektrophorese
eine DNA-Bande, exprimiert der Patient das entsprechende
HLA-Molekül. Erscheint die Bande nicht, ist der Patient
dafür negativ. Für jeden Patienten sind in der Regel zwei
Banden zu erwarten.
Die Definition eines erfindungsgemäß verwendeten Peptids
durch ein HLA-Molekül bestimmt dieses hinsichtlich seiner
Ankeraminosäuren und seiner Länge; definierte
Ankerpositionen und Länge gewährleisten, daß ein Peptid
in die Peptid-Bindungsfurche des jeweiligen HLA-Moleküls
des Patienten paßt. Dies hat zur Folge, daß das
Immunsystem stimuliert wird und eine zelluläre
Immunreaktion erzeugt wird, die sich, im Falle der
Verwendung eines von einem Tumorantigen abgeleiteten
Peptids, gegen die Tumorzellen des Patienten richtet.
Peptide, die zur Anwendung im Rahmen der vorliegenden
Erfindung geeignet sind, sind in einer großen Bandbreite
verfügbar. Ihre Sequenz kann von natürlich vorkommenden
immunogenen Proteinen bzw. deren zellulären
Abbauprodukten, z. B. von viralen oder bakteriellen
Peptiden, von Tumorantigenen, abgeleitet sein, oder sie
können Antagonisten zu Peptiden sein, die von
Autoimmunerkrankungen induzierenden Proteinen abgeleitet
sind.
Geeignete Peptide können z. B. auf der Grundlage von
literaturbekannten Peptidsequenzen ausgewählt werden.
Im Hinblick auf die Auslösung einer zellulären
Immunantwort können die Peptide z. B. anhand der von
Rammensee et. al., 1993, Rammensee et al., 1995, Falk et
al., 1991, für die unterschiedlichen HLA-Motive
beschriebenen, von immunogenen Proteinen verschiedenen
Ursprungs abgeleiteten Peptide definiert werden, die in
die Bindungsfurchen der Moleküle der jeweiligen HLA-Subtypen
passen.
Für Peptide, die eine Teilsequenz eines Proteins mit
immunogener Wirkung aufweisen, kann anhand der bereits
bekannten oder gegebenenfalls noch zu bestimmenden
Polypeptidsequenzen durch Sequenzabgleich unter
Berücksichtigung der HLA-spezifischen Anforderungen
festgestellt werden, welche Peptide geeignete Kandidaten
darstellen. Beispiele für geeignete Peptide finden sich
z. B. bei Rammensee et al., 1993, Falk et al., 1991, und
Rammensee, 1995; sowie in der WO 91/09869 (HIV-Peptide);
von Tumorantigenen abgeleitete Peptide wurden u. a. in den
veröffentlichten internationalen Patentanmeldungen
WO 95/00159, WO 94/05304 beschrieben. Auf die Offenbarung
dieser Literaturstellen und der darin im Zusammenhang mit
Peptiden zitierten Artikel wird Bezug genommen. Zu
bevorzugten Kandidaten zählen Peptide, deren
Immunogenizität bereits gezeigt wurde, also Peptide, die
von bekannten Immunogenen, z. B. viralen oder bakteriellen
Proteinen, abgeleitet sind.
Statt die Originalpeptide zu verwenden, die in die
Bindungsfurche von MHC-I- oder MHC-II-Molekülen passen,
also Peptide, die unverändert von natürlichen Proteinen
abgeleitet sind, können anhand der auf der Grundlage der
Originalpeptidsequenz angegebenen Minimalanforderungen
bezüglich Ankerpositionen und Länge Variationen
vorgenommen werden, sofern durch diese Variationen die
effektive Immunogenizität des Peptids, die sich
zusammensetzt aus seiner Bindungsaffinität an das
MHC-Molekül und seiner Fähigkeit, T-Zell-Rezeptoren zu
stimulieren, nicht nur nicht beeinträchtigt ist, sondern
vorzugsweise verstärkt wird. In diesem Fall werden also
erfindungsgemäß künstliche Peptide verwendet, die
entsprechend den Anforderungen der Bindungsfähigkeit an
ein MHC-Molekül entworfen sind. So können z. B. ausgehend
vom H2-Kd-Liganden Leu Phe Glu Ala Ile Glu Gly Phe Ile
(LFEAIEGFI) die Aminosäuren, die keine Ankeraminosäuren
darstellen, geändert werden, um das Peptid der Sequenz
Phe Phe Ile Gly Ala Leu Glu Glu Ile (FFIGALEEI) zu
erhalten; außerdem kann die Ankeraminosäure Ile an
Position 9 durch Leu ersetzt werden. Die Bestimmung von
Epitopen von MHC-I- bzw. MHC-II-Liganden bzw. deren
Variation kann z. B. nach dem von Rammensee et al., 1995,
beschriebenen Prinzip vorgenommen werden. Die Länge des
Peptids entspricht im Falle seiner Abstimmung auf MHC-I
Moleküle vorzugsweise einer Minimalsequenz von 8 bis 10
Aminosäuren mit den erforderlichen Ankeraminosäuren. Das
MHC-II-Bindungsmotiv, das sich über neuen Aminosäuren
erstreckt, weist einen höheren Grad an Degeneration in
den Ankerpositionen auf. Es wurden kürzlich, ausgehend
von der Röntgenstrukturanalyse von MCH-II-Molekülen,
Methoden entwickelt, die die genaue Analyse der MHC-II-Bindungsmotive,
und ausgehend davon, Variationen der
Peptidsequenz erlauben (Rammensee et al., 1995, und die
dort zitierte Originalliteratur).
Gegebenenfalls kann das Peptid auch am C- und/oder am N-Terminus
verlängert sein, sofern diese Verlängerung die
Bindungsfähigkeit an das MHC-Molekül nicht beeinträchtigt
bzw. das verlängerte Peptid auf die Minimalsequenz
zellulär prozessiert werden kann.
Es können für die therapeutische Anwendung der
Tumorvakzine von Tumorantigenen abgeleitete Peptide
verwendet werden, die vom Patienten in einer
Konzentration exprimiert werden, die zu gering ist, so
daß die Tumorzellen nicht als fremd erkannt werden.
Unter den Begriff "Peptide" fallen im Rahmen der
vorliegenden Erfindung definitionsgemäß auch größere
Proteinfragmente. Im Falle ihrer Abstimmung auf ein MHC-Molekül
muß in diesem Fall gewährleistet sein, daß sie
nach ihrer Applikation von den APCs zu Peptiden
prozessiert werden, die an das MHC-Molekül passen.
In diesem Fall kann man die Identität des prozessierten
Endproduktes mittels chemischer Analyse (Edman-Abbau oder
Massenspektrometrie von prozessierten Fragmenten; vgl.
den Übersichtsartikel von Rammensee et al., 1995 sowie
die darin zitierte Originalliteratur) oder biologischen
Assays (Fähigkeit der APCs zur Stimulation von T-Zellen,
die für die prozessierten Fragmente spezifisch sind),
nachweisen.
Die Auswahl von Peptid-Kandidaten, die geeignet sind,
eine zelluläre Immunantwort auszulösen, erfolgt
prinzipiell in mehreren Stufen: Im allgemeinen werden die
Kandidaten, zweckmäßig in Serienversuchen, zunächst in
einem Peptid-Bindungstest auf ihre Bindungsfähigkeit an
ein MHC-Molekül getestet.
Eine geeignete Untersuchungsmethode ist z. B. die auf der
Durchflußzytometrie beruhende FACS-Analyse (Flow
Cytometry, 1989; FACS Vantage TM User′s Guide, 1994, CELL
Quest TMUser′s Guide, 1994). Dabei wird das Peptid mit
einem Fluoreszenzfarbstoff markiert, z. B. mit FITC
(Fluoresceinisothiocyanat) und auf Zellen aufgebracht,
die in der Lage sind, das jeweilige MHC-Molekül zu
exprimieren, aber wegen eines genetischen Defekts keine
endogenen Peptide in MHC-Kontext binden. Geeignete
Zellinien dieses Typs sind RMA-S (Maus) und T2 (human),
bzw. deren transfizierte Varianten. Im Durchfluß werden
einzelne Zellen von einem Laser einer bestimmten
Wellenlänge angeregt; die emittierte Fluoreszenz wird
gemessen, sie ist abhängig von der an die Zelle gebundene
Peptidmenge.
Eine weitere Methode zur Bestimmung der gebundenen
Peptidmenge ist der Scatchard-Blot. Man benutzt dazu das
Peptid, das z. B. mit J¹²⁵ markiert ist. Man belädt die
Zellen bei 4°C mit verschiedenen definierten
Konzentrationen von Peptid für 30 bis 240 min. Zur
Bestimmung unspezifischer Wechselwirkung des Peptid mit
den Zellen wird zu einigen Proben ein Überschuß nicht
markierten Peptids zugesetzt, der die unspezifische
Interaktion des markierten Peptids unterbindet.
Anschließend wäscht man die Zellen, damit unspezifisch
Zell-assoziertes Material entfernt wird. Die Menge des
zellgebundenen Peptids wird nun entweder in einem
Szintillationszähler anhand der emittierten
Radioaktivität, oder in einem zur Messung langlebiger
Fluoreszenz geeigneten Photometer ermittelt. Die
Auswertung der so gewonnenen Daten erfolgt nach
Standardmethoden.
Eine Übersicht über Methoden zur Charakterisierung der
MHC/Peptid-Wechselwirkung, der Analyse von MHC-Liganden
und Peptid-Bindungs-Assays, die im Rahmen der
vorliegenden Erfindung verwendet werden können, wurde von
Rammensee et al., 1995, gegeben.
In einem nächsten Schritt werden Peptid-Kandidaten mit
guten Bindungsqualitäten auf ihre Immunogenizität
geprüft:
Die Auslösung einer zellulären Immunantwort kann durch
den Nachweis peptidspezifischer CTLs bestätigt werden
(Current Protocols in Immunology, Kapitel 3). Ein
weiterer Nachweis für das Vorliegen einer zellulären
Immunantwort ist dann gegeben, wenn in Abwesenheit von T-Zellen
in einem Versuchstier (welche dadurch erzielt
wird, daß man das Tier mit Antikörpern behandelt, die
CD4- oder CD8-Zellen depletieren) keine Immunantwort
auftritt (Current Protocols in Immunology, Kapitel 3).
Eine zelluläre Immunantwort kann auch durch den Nachweis
einer "delayed-type hypersensitivity" (DTH)-Reaktion in
immunisierten Tieren gezeigt werden. Hierzu werden
Peptide in die Fußsohle von Mäusen injiziert und die
Anschwellung der injizierten Stelle gemessen (Grohman et
al., 1995; Puccetti et al., 1994).
Die Induktion einer humoralen Immunantwort durch Peptide,
die Fremdantigene für den Organismus sind bzw. Antigene,
die vom zu behandelnden Organismus in geringer
Konzentration exprimiert werden, kann durch Nachweis von
spezifischen Antikörpern im Serum bestimmt werden. Eine
geeignete Methode zur Antikörpertiterbestimmung im Serum
ist der Enzyme Linked Immunoassay (ELISA). Dabei werden
die spezifischen Antikörper nach Bindung an das zur
Immunisierung verwendeten Peptids mit einer Farbreaktion
nachgewiesen. Eine alternative Methode ist der Western
Blot. Hierbei binden spezifische Serumantikörper an das
auf einer Membran immobilisierte Peptid. Gebundene
Antikörper werden schließlich wiederum mit einer
Farbreaktion nachgewiesen (Referenz für beide Methoden:
Current Protocols in Immunology. Editors: Coligan et
al., 1991).
Vor allem nach der Vakzinierung mit Fremdantigenen, z. B.
viralen Ursprungs, ist eine Bildung von Antikörpern zu
erwarten. Es ist aber auch nicht auszuschließen, daß
spezifische Antikörper auch gegen mutierte oder
überexprimierte Peptide, die von zellulären
Tumorantigenen abgeleitet sind gebildet werden. Eine
Tumorzerstörung durch solche Antikörper könnte nach
Antikörperbindung an Tumorzellen durch andere Komponenten
des Immunsystems, wie z. B. Komplement, Antikörper
abhängige Zytotoxizität (ADCC) oder Phagozytose durch
Makrophagen erfolgen (Roitt I.M., Brostoff J., Male D.K.
Immunology, Churchill Livingstone).
Die Auslösung einer zellulären Immunantwort durch
Peptide, die abgeleitet sind von Proteinen, deren
immunogene Wirkung nicht bekannt ist, kann z. B. getestet
werden, wie von Rivoltini et al. 1995, oder Kawakami et
al 1994a beschrieben. Dazu benötigt man T-Zellen, die das
gewünschte Peptid erkennen können, wenn es von MHC-Molekülen
präsentiert wird. Im Fall von Peptiden, die von
Tumorzellen herrühren, gewinnt man die entsprechenden T-Zellen
aus den Tumor-infiltrierenden Lymphozyten (TILs),
wie von Kawakami et al. 1994b beschrieben; im Fall von
Fremdpeptiden gewinnt man solche T-Zellen analog aus dem
peripheren Blut. Die T-Zellen werden mit Zellinien wie T2
(Alexander et al., 1989) oder RMA-S (Kärre et al., 1986),
die mit dem jeweiligen Peptid versetzt worden sind,
inkubiert und lysieren diese, falls es sich um ein
immunogenes Peptid handelt.
Eine weitere Möglichkeit für die Testung von MHC-bindenden
Peptidkandidaten auf ihre Immunogenizität
besteht darin, die Bindung der Peptide an T2-Zellen zu
untersuchen. Ein solcher Test beruht auf der Eigenart von
T2-Zellen (Alexander et al., 1989) oder RMA-S-Zellen
(Kärre et al., 1986), defekt im TAP-Peptid-
Transportmechanismus zu sein und erst dann stabil MHC-Moleküle
zu präsentieren, wenn man auf sie Peptide
aufbringt, die im MHC-Kontext präsentiert werden. Für den
Test werden z. B. T2-Zellen oder RMA-S-Zellen verwendet,
die stabil mit einem HLA-Gen, z. B. mit HLA-A1- und/oder
HLA-A2-Genen transfiziert sind. Werden die Zellen mit
Peptiden versetzt, die gute HLA-Liganden sind, indem sie
im HLA-Kontext so präsentiert werden, daß sie vom
Immunsystem als fremd erkannt werden können, bewirken
solche Peptide, daß die HLA-Moleküle in signifikanter
Menge auf der Zelloberfläche aufscheinen. Der Nachweis
der HLAs auf der Zelloberfläche, z. B. mittels
monoklonaler Antikörper, erlaubt die Identifizierung
geeigneter Peptide (Malnati et al., 1995; Sykulev et al.,
1994). Auch hier wird zweckmäßig ein Standardpeptid mit
bekannt guter HLA-Bindungsfähigkeit verwendet.
Im Hinblick auf eine möglichst breite Anwendbarkeit der
erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung wird
zweckmäßig eine Mischung mehrerer Peptide verwendet, von
denen jedes an ein anderes MHC-Molekül binden kann,
vorzugsweise an einen von zwei oder drei der am
häufigsten vertretenen MHC-Subtypen. Mit einer Vakzine
auf der Grundlage einer Mischung von Peptiden, die an
diese Haplotypen binden können, kann eine breite
Patientenpopulation erfaßt werden.
In einer Ausführungsform der Erfindung kann die Vakzine
mehrere Peptide unterschiedlicher Sequenz aufweisen. Die
verwendeten Peptide können sich in diesem Fall einerseits
dahingehend unterscheiden, daß sie an unterschiedliche
HLA-Subtypen binden. Damit kann erreicht werden, daß
mehrere bzw. sämtliche HLA-Subtypen eines Patienten oder
einer größeren Gruppe von Patienten erfaßt werden.
Eine weitere, gegebenenfalls zusätzliche, Variabilität
hinsichtlich der verwendeten Peptide kann darin bestehen,
daß Peptide, die an einen bestimmten HLA-Subtyp binden,
sich hinsichtlich ihrer nicht für die HLA-Bindung
maßgeblichen Sequenz unterscheiden, indem sie z. B. von
unterschiedlichen Proteinen desselben pathogenen Erregers
oder von verschiedenen Erregern abgeleitet sind. Von
einer solchen Variabilität kann eine Verstärkung der
Stimulierung der Immunantwort bzw. eine Immunisierung
gegen verschiedene Erreger erreicht werden.
Die Menge an wirksamem Peptid in der erfindungsgemäßen
Zusammensetzung kann über einen breiten Bereich
variieren. Die verabreichten Mengen an Peptid hängen im
einzelnen vom Zustand des Patienten und dessen
Körpergewicht ab, sowie von der Verabreichungsart und der
jeweiligen Formulierung. Im allgemeinen beträgt die zu
verabreichende Menge an Peptid ca. 1.0 µg bis ca. 1000 µg
pro 70 kg Körpergewicht, insbesondere ca. 10 µg bis ca.
500 µg pro 70 kg Körpergewicht. Die Verabreichung erfolgt
zweckmäßig mehrfach, z. B. dreimal in je einwöchigem
Abstand oder zweimal im Abstand von zwei Wochen.
Das in der erfindungsgemäßen Zusammensetzung enthaltene
Adjuvans hat die die Eigenschaft, den Eintritt des
Peptids in die Zellen bzw. die Bindung des Peptides an
die Zellen des Patienten zu erleichtern. Das Adjuvans
kann z. B. die Membranen von Zielzellen, in die das Peptid
gelangen soll, zumindest kurzfristig durchlässig machen,
um auf diese Weise das Peptid in die Zelle zu befördern.
Dafür dürfte es von Vorteil, aber nicht unbedingt
erforderlich sein, daß das Peptid an das Adjuvans
gebunden wird: Es kann ein Import des Peptids in die
Zelle auch dadurch bewirkt werden, daß das Peptid
aufgrund seiner räumlichen Nähe zur Zellmembran durch
diese hindurch gelangen kann, sobald das Adjuvans deren
Durchlässigkeit bewirkt hat. Die Wirkung des Adjuvans
kann auch darauf beruhen, daß es die für die Aufnahme in
die Zelle kritische Konzentration des Peptids an der
Zelloberfläche erhöht oder daß es die Phagozytose oder
den Flüssigtransport (Pinozytose) des Peptids in die
Zelle bewerkstelligt.
In einer Ausführungsform können Adjuvantien u. a.
grundsätzlich alle diejenigen Membran-permeabilisierenden
Substanzen sein, die für den Transport von Nukleinsäuren
in die Zelle verwendet werden; in diesem Zusammenhang
wird auf die Offenbarung der WO 93/19768 Bezug genommen,
wo derartige Substanzen genannt sind.
Bevorzugt wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung als
Adjuvans Polylysin verwendet.
Ein weiteres im Rahmen der vorliegenden Erfindung
bevorzugtes Adjuvans ist Polyarginin.
Beispiele für weitere geeignete polykationische
Verbindungen (basische Polyaminosäuren) sind
Polyornithin, Histone, Protamin, Polyethylenimin.
Das Adjuvans ist gegebenenfalls konjugiert mit einem
zellulären Liganden (z. B. mit Transferrin, gp120, LDL
(Low Densitiy Lipoprotein), α-Fetuin, EGF(Epidermal
Growth Factor)-Peptiden oder mit einem Vertreter anderer
zellulärer Liganden, der für den Transport von DNA
mittels Rezeptor-vermittelter Endozytose in der
WO 93/07283 beschrieben sind), Kohlenhydratresten, wie
Mannose oder Fukose (Liganden für Makrophagen) oder
Antikörper(fragmente)n gegen Zelloberflächenproteine.
Gegebenenfalls liegen polykationische Adjuvantien, wie
Polylysin oder Polyarginin, die gegebenenfalls konjugiert
sind mit einem zellulären Liganden, als Bestandteil eines
Komplexes mit DNA vor, z. B. in Form von Plasmid-DNA, die
frei ist von Sequenzen, die für funktionelle Peptide
kodieren.
Ohne auf die Theorie festgelegt sein zu wollen, dürfte
die Wirkung der erfindungsgemäßen pharmazeutischen
Zusammensetzung darin bestehen, daß das Peptid mit Hilfe
des Adjuvans in die Zielzellen eindringt oder an Zellen
bindet, die im endodermalen Bereich der Haut vorkommen.
Zielzellen sind u. a. Antigen-präsentierende Zellen, von
denen das Peptid, gegebenenfalls nach Prozessierung, den
B- und/oder T-Zellen präsentiert wird. Beispiele für
Zielzellen sind Makrophagen, Fibroblasten, Keratinozyten,
Langerhanszellen, dendritische Zellen oder B-Zellen.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurde untersucht, ob
kleine Peptide in Gegenwart von basischen Polyaminosäuren
oder glykosylierten Formen von Polylkation in verstärktem
Ausmaß von Makrophagen-artigen Antigen-präsentierenden
Zellen (APCs) aufgenommen werden. Von den verwendeten
Zuckerresten ist bekannt, daß sie von Makrophagen über
Rezeptor-vermittelte Endozytose aufgenommen werden. Von
APCs wird angenommen, daß sie in vivo den Zelltyp
darstellen, der die Peptide aufnimmt und sie anderen
Immunzellen präsentiert. Ergebnisse von in vitro
Versuchen, die zeigen, daß APCs in Gegenwart der
getesteten Adjuvantien erhöhte Mengen von Peptid-Antigenen
endozytieren, sind ein Hinweis darauf, daß
diese Adjuvatien auch in vivo geeignet sind, die
Präsentation der Peptide gegenüber den zytotoxischen
Effektorzellen sowie deren Aktivierung zu verstärken, was
zu einer insgesamt verstärkten Immunantwort gegen das in
der Vakzine enthaltene Target führt.
Als Adjuvantien können auch Komponenten in Partikelform,
gegebenenfalls zusätzlich zu den oben erwähnten
Adjuvantien, verwendet werden. Für die Partikel sind
grundsätzlich Materialien geeignet, die auch für die
Herstellung von Säulenmaterial für die Peptidsynthese
verwendet werden, z. B. Kieselgel oder Kunstharze, sofern
sie physiologisch annehmbar sind und aus ihnen Partikel
herstellbar sind, die genügend klein sind, um in die
Zelle zu gelangen. Mit Hilfe von Adjuvantien in
Partikelform können hohe lokale Konzentrationen an Peptid
erreicht werden, was dessen Aufnahme in die Zellen
erleichtert.
Die Art des verwendeten Adjuvans, die Zweckmäßigkeit
seiner Modifikation mit einem zellulären Liganden bzw.
der Zusatz von DNA sowie die erforderliche Menge an
Adjuvans im Verhältnis zum Peptid können im einzelnen
empirisch bestimmt werden, z. B. kann das im einzelnen
gewählte Verhältnis von Peptid zu Adjuvans, das
prinzipiell über einen weiten Bereich schwanken kann,
mittels Titrationen ermittelt werden.
Die Fähigkeit eines Adjuvans, die Bindung und/oder
Internalisierung eines Peptids an APCs zu erhöhen, kann
gemessen werden, indem APCs mit fluoreszenzmarkierten
Peptiden und Adjuvans inkubiert werden. Eine durch das
Adjuvans bewirkte erhöhte Aufnahme bzw. Bindung kann
durch Vergleich mit Zellen, die mit Peptid allein
versetzt wurden, mittels Durchflußszytometrie bestimmt
werden.
Eine weitere Möglichkeit zur Testung der Effizienz eines
Adjuvans ist die Verwendung eines in vitro Modellsystems.
Hierbei werden APCs zusammen mit Adjuvans und Peptid
inkubiert und die relative Aktivierung eines T-Zellklons,
der das verwendete Peptid spezifisch erkennt, gemessen
(Coligan et al., 1991; Lopez et al., 1993).
Letztlich wird die Effizienz der Adjuvansformulierung im
Tierversuch gemessen. Hierzu können u. a. etablierte
Tumormodelle, bei denen von Immunzellen erkannte
Peptidsequenzen bekannt sind, eingesetzt werden. Die
Vakzine, enthaltend Peptid und Adjuvans, wird in
variierenden Verhältnissen bezogen auf Peptid zu Adjuvans
und Gesamtmenge, appliziert. Der Schutz vor Tumorwachstum
ist ein Maß für die Wirksamkeit der Vakzine.
Die pharmazeutische Zusammensetzung kann parenteral,
topisch, oral oder lokal verabreicht werden. Vorzugsweise
wird sie parenteral, z. B. subkutan, intradermal oder
intramuskulär verabreicht, vorzugsweise subkutan oder
intradermal, um vor allem Hautzellen (Keratinozyten,
Fibroblasten), dendritische Zellen, Langerhanszellen oder
Makrophagen als Zielzellen zu erreichen. Im Rahmen einer
Tumortherapie kann die Tumorvakzine auch intratumoral
verabreicht werden.
Die erfindungsgemäße Zusammensetzung für die parenterale
Verabreichung liegt im allgemeinen als Lösung oder
Suspension des Peptids und des Adjuvans in einem
pharmazeutisch annehmbaren Träger vor, vorzugsweise einem
wässerigen Träger. Als wässerige Träger können z. B.
Wasser, gepuffertes Wasser, Salzlösung (0.4%)
Glycinlösung (0.3%), Hyaluronsäure und ähnliche bekannte
Träger verwendet werden. Neben wässerigen Trägern können
auch Lösungsmittel wie Dimethylsulfoxid, Propylenglycol,
Dimethylformamid und Mischungen davon verwendet werden.
Die Zusammensetzung kann außerdem pharmazeutisch
annehmbare Hilfsstoffe enthalten, wie Puffersubstanzen
sowie anorganische Salze, um einen normalen osmotischen
Druck und/oder eine wirksame Lyophilisierung zu
erreichen. Beispiele für derartige Zusätze sind Natrium- und
Kaliumsalze, z. B. Chloride und Phosphate, Saccharose,
Glukose, Proteinhydrolisate, Dextran, Polyvinylpyrrolidon
oder Polyethylenglycol. Die Zusammensetzungen können
mittels herkömmlicher Techniken sterilisiert werden, z. B.
mittels Sterilfiltration. Die Zusammensetzung kann in
dieser Form unmittelbar abgefüllt oder auch lyophilisiert
und vor dem Gebrauch mit einer sterilen Lösung gemischt
werden.
In einer Ausführungsform liegt die erfindungsgemäße
pharmazeutische Zusammensetzung als topische
Formulierung, z. B. zur dermalen bzw. transdermalen
Applikation vor. Die pharmazeutische Zusammensetzung kann
z. B. als Hydrogel auf Polyacrylsäure- oder Polyacrylamid-Basis
vorliegen (wie z. B. Dolobene®, Merckle), als Salbe,
z. B. mit Polyäthylenglykol (PEG) als Vehikel, wie die
Standardsalbe DAB 8 (50% PEG 300, 50% PEG 1500), oder
als Emulsion, vor allem als Mikroemulsion auf Wasser-in-Öl- bzw.
Öl-in-Wasser-Basis, gegebenenfalls auch mit
Zusatz von Liposomen. Als Permeationsbeschleuniger
(Schlepper) eignen sich u. a. Sulfoxid-Derivate wie
Dimethysulfoxid (DMSO) oder Decylmethysulfoxid (Decyl-MSO)
sowie Transcutol (Diethylenglykolmonoethylether)
oder Cyclodextrine, des weiteren Pyrrolidone, z. B.
2-Pyrrolidon, N-Methy-2-pyrrolidon, 2-Pyrrolidon-5-carbonsäure
oder das biologisch-abbaubare
N-(2-Hydroxyethyl)-2-pyrrolidon und deren Fettsäureester,
Harnstoffderivate, wie Dodecylharnstoff,
1,3-Didodecylharnstoff und 1,3-Diphenylharnstoff,
Terpene, z. B. D-Limonen, Menthon, a-Terpinol, Carvol,
Limonenoxid, oder 1,8-Cineol.
Weitere Anwendungsformen sind Aerosole, z. B. zur
Verabreichung als Nasenspray oder zur Inhalation.
Die erfindungsgemäße Zusammensetzung kann auch mittels
Liposomen verabreicht werden, die in Form von Emulsionen,
Schäumen, Micellen, unlöslichen Monolayers,
Phospholipiddispersionen, Lamellarschichten und ähnlichem
vorliegen können. Diese dienen als Vehikel, um die
Peptide zielgerichtet zu einem bestimmten Gewebe, z. B.
lymphoidem Gewebe oder Tumorgewebe, zu befördern bzw. die
Halbwertszeit der Peptide zu verlängern.
Im Falle des Vorliegens der erfindungsgemäßen
Zusammensetzung als topische Formulierung kann diese auch
UV-Absorber enthalten, um z. B. bei der prophylaktischen
Anwendung gegen Melanom gleichzeitig als
Sonnenschutzmittel zu wirken.
Der Fachmann kann geeignete Hilfsstoffe und
Formulierungen Standardwerken, wie "Remington′s
Pharmaceutical Sciences", 1990, entnehmen.
Fig. 1 Vakzinierung von DBA/2 Mäusen gegen Mastozytom
P815
Fig. 2 Vakzinierung von DBA/2 Mäusen gegen Mastozytom
P815 mit einer Einzelpeptidvakzine
Fig. 3 Vakzinierung von DBA/2-Mäusen gegen Melanom M-3
mit einer Mischung von Peptiden
Fig. 4 Vakzinierung von DBA/2 Mäusen gegen Melamom-
M-3-Metastasen
Fig. 5 Testung der Verstärkung der Bindung von
Peptiden an APCs durch basische Polyaminosäuren
Fig. 6 Testung der Permeabilisierung der Zellmembran
durch basische Polyaminosäuren
Fig. 7 Testung der Internalisierung der Peptide durch
basische Polyaminsäuren.
In den folgenden Beispielen wurden, wenn nicht anders
angegeben, die folgenden Materialien und Methoden
verwendet:
Die Maus-Melanomzellinie Cloudman S91 (Klon M-3; ATCC No.
CCL 53.1), die Mastozytomzellinie P815 (ATCC Nr. TIB 64)
und die Monozyten-Makrophagen-Zellinie P388D1 (ATCC TIB
63) wurden von ATCC erworben.
Die Peptide wurden auf einem Peptid-Synthesizer (Modell
433 A mit Feedbackmonitor, Applied Biosystems, Foster
City, Kanada) unter Verwendung von TentaGel S PHB (Rapp,
Tübingen) als Festphase nach der Fmoc-Methode (HBTU-Aktivierung,
FastmocTM, Maßstab 0 : 25 mmol) synthetisiert.
Die Peptide wurden in 1 M TEAA, pH 7.3 aufgelöst und
mittels reverser Chromatographie auf einer Vydac C 18-Säule
gereinigt. Die Sequenzen wurden mittels
Flugzeitmassenspektrometrie auf einem MAT Lasermat
(Finnigan, San Jose, Kanada) bestätigt.
Peptidmischungen:
Peptidmischung I für M-3 Melanomvakzine:
kpep143, kpep145, kpep146, kpep150.
Peptidmischung III für Mastozytom P815 Vakzine:
kpep117, kpep118, Kpep162, Kpep163, Kpep164
kpep143, kpep145, kpep146, kpep150.
Peptidmischung III für Mastozytom P815 Vakzine:
kpep117, kpep118, Kpep162, Kpep163, Kpep164
- a) Einzelpeptidkontrollvakzine ohne Adjuvans wurden herstellt, indem das Peptid in einer Konzentration von 1 mg/ml in PBS aufgenommen wurde. Die Inkubationszeit bis zur Injektion betrug 4 h bei Raumtemperatur.
- b) Einzelpeptidvakzine mit Polylysin als Adjuvans wurden
herstellt, indem Peptid und Polylysin in den
angegebenen Mengen in HBS gemischt wurden. Die
Inkubationszeit bis zur Injektion betrug 4 h bei
Raumtemperatur.
- i) Um eine Vakzine mit einem Gehalt von 16 µg wirksamen Peptids zu erhalten, wurden 11.8 µg Polylysin mit 160 µg Peptid kpep117 in einem Gesamtvolumen von 1 ml MBS gemischt.
- ii) Um eine Vakzine mit einem Gehalt von 100 µg wirksamen Peptids zu erhalten, wurden 74 µg Polylysin mit 1 mg Peptid kpep117 in einem Gesamtvolumen von 1 ml HBS gemischt.
- c) Einzelpeptidkontrollvakzine mit Incomplete Freund′s
Adjuvans (IFA) wurden herstellt, indem Peptid und IFA
in den angegebenen Mengen emulgiert wurden. Die
Inkubationszeit bis zur Injektion betrug 30 min bei
Raumtemperatur.
- i) Für eine Kontrollvakzine, enthaltend 16 µg wirksames Peptid, wurden 192 µg Peptid kpep117 in 600 µl HBS mit 600 µl IFA emulgiert.
- ii) Für eine Kontrollvakzine, enthaltend 100 µg wirksames Peptid, wurden 1.2 mg Peptid kpep117 in 600 µl HBS mit 600 µl IFA emulgiert.
- a) Peptidmischung I als Kontrollvakzine ohne Adjuvans enthielt 250 µg jedes der Peptide kpep143, kpep145, kpep146, kpep150 in einem Gesamtvolumen von 1 ml PBS.
- b) Peptidmischung III als Kontrollvakzine ohne Adjuvans enthielt 250 µg jedes der Peptide kpep117, kpep118, Kpep162, Kpep163, Kpep164 in einem Gesamtvolumen von 1 ml PBS.
- c) Peptidmischung I als Vakzine mit Polylysin als Adjuvans wurde herstellt, indem 1 mg Peptidmischung I (enthaltend 250 µg jedes Peptides) mit 74 µg Polylysin in HBS gemischt wurden. Die Inkubationszeit bis zur Injektion betrug 4 h bei Raumtemperatur.
- d) Peptidmischung III als Vakzine mit Polylysin als Adjuvans wurde herstellt, indem 1.25 mg Peptidmischung III (enthaltend 250 µg jedes Peptides) mit 93 µg Polylysin in HBS gemischt wurden. Die Inkubationszeit bis zur Injektion betrug 4 h bei Raumtemperatur.
- e) Peptidmischung I als Kontrollvakzine mit Incomplete Freund′s Adjuvans wurde herstellt, indem 1.2 mg Peptidmischung I in 600 µl HBS (enthaltend 300 µg jedes Peptides) mit 600 µl IFA emulgiert wurden. Die Inkubationszeit bis zur Injektion betrug 30 min bei Raumtemperatur.
- f) Peptidmischung III als Kontrollvakzine mit Incomplete Freund′s Adjuvans wurde herstellt, indem 1.5 mg Peptidmischung III in 600 µl HBS (enthaltend 300 µg jedes Peptids) mit 600 µl IFA emulgiert wurden. Die Inkubationszeit bis zur Injektion betrug 30 min bei bei Raumtemperatur.
- g) Für die topische Verabreichung mit Polylysin als Adjuvans wurden 1 mg Peptidmischung I (enthaltend 250 µg jedes Peptids) mit 74 µg Polylysin 4 h lang in einem Gesamtvolumen von 400 µl HBS inkubiert. Die erhaltene Mischung wurde in 1.6 g des Hydrogels DOLOBENE (Merckle) eingerührt.
- h) Für die topische Verabreichung einer Kontrollvakzine ohne Adjuvans wurde 1 mg Peptidmischung I (enthaltend 250 µg jedes Peptids) in einem Gesamtvolumen von 200 µl HBS in 1.8 g des Hydrogels DOLOBENE (Merckle) eingerührt.
- i) Die Herstellung von Fukose-gekoppeltem Polylysin (Kettenlänge: 240) wurde nach der von MacBroom et al., 1992, beschriebenen Methode vorgenommen, wobei eine Substituierung von ca. 40% erzielt wurde.
- j) Wenn Transferrin/Polylysin-Konjugate (hergestellt, wie in der WO 93/07283 beschrieben) verwendet wurden, wurde die Menge so eingestellt, daß die absolute Menge an Polylysin 75 µg pro mg Peptid betrug. Wenn Plasmid-DNA (Leerplasmid pSP65, LPS-frei, Boehringer Mannheim) in die Komplexe integriert wurde, betrug das Verhältnis 37.5 µg DNA/75 µg Polylysin/1 µg Peptid. Im Falle der Verwendung von 160 µg statt 1 mg Peptid wurden die Mengen der anderen Komponenten um denselben Faktor (6.25) reduziert.
Vor der subkutanen Injektion wurden die Mäuse in
Gruppen von bis zu acht Tieren in einer isolierten
Luftkammer anästhesiert. Nach 3.5 min Halothan-Behandlung
(4% in O₂, Flußrate 4) waren die Mäuse ca.
1 min lang betäubt; in dieser Zeit wurde die Vakzine
subkutan injiziert.
Die intraperitoneale Injektion erfolgte ohne vorherige
Anästhesierung. Das Injektionsvolumen war für jede
Vakzine 100 µl pro Tier, das entspricht 100 µg
Einzelpeptid oder Peptidmischung I pro Tier. Im Fall
von Peptidmischung III wurden 125 µg Gesamtpeptidmenge
pro Maus appliziert.
Pro Maus wurden 200 mg Salbe, enthaltend 100 µg
Peptid oder Peptidmischung I bzw. 125 µg
Peptidmischung I, in die Haut der rasierten Tiere
eingerieben, und zwar in den gesamten Rücken und in
die Ohren. Die richtige Menge wurde mit einer Waage
kontrolliert.
Das Protokoll der Testung der Wirksamkeit der
Krebsvakzine im prophylaktischen oder im
therapeutischen Mausmodell entsprach, wenn nicht
anders angegeben, dem in der WO 94/21808
beschriebenen Prinzip, wobei als Mausmodell das
DBA/2-Modell verwendet wurde.
160 µg des Peptids der Sequenz KYQAVTTTL (kpep118),
abgeleitet von dem von Lethe et al., 1992, beschriebenen
Tumorantigen P815, einem Liganden von H2-Kd, wurden mit
11.8 µg Polylysin 300 in 500 µl HBS gemischt und 4 h bei
Raumtemperatur inkubiert. Dann wurden 500 µl EBSS (Earl′s
gepufferte Salzlösung) beigegeben. Je 100 µl der
erhaltenen Mischung wurden 8 Mäusen in einwöchigem
Abstand subkutan verabreicht. Nach dieser
Vorimmunisierung wurden nach einer weiteren Woche Tumoren
gesetzt, indem jeder Maus contralateral 5 × 10⁴ Zellen
der Mastozytomzellinie P815 (ATCC Nr. TIB 64; diese
Zellen exprimieren das Tumorantigen, von dem das Peptid
P815 abgeleitet ist) in 100 µl EBSS injiziert wurden. Das
Ergebnis dieser Versuche ist in Fig. 1 (gefüllte
Quadrate) dargestellt.
In einem Parallelversuch wurden 200 µg des Peptids mit
500 µl HBS gemischt und anschließend mit 500 µl Freund′s
Adjuvans emulgiert. Mit je 100 µl der erhaltenen Emulsion
wurden 8 Mäuse vorimmunisiert und anschließend mit P815-Zellen
Tumoren gesetzt, wie oben angegeben (Fig. 1:
gefüllte Kreise).
Für einen weiteren Parallelversuch wurde eine zelluläre
Tumorvakzine wie folgt hergestellt:
160 µg Peptid kpep 118 wurden mit 3 µg Transferrin-Polylysin
(TfpL), 10 µg pL und 6 µg psp65 (LPS frei) in
500 µl HBS-Puffer gemischt. Nach 30 min bei
Raumtemperatur wurde die obige Lösung in eine T 75
Zellkulturflasche mit 1.5 × 10⁶ Zellen der allogenen
Fibroblastenzellinie NIH3T3 (ATCC Nr. CRL 1658) in 20 ml
DMEM-Medium (10% FCS, 20 mM Glukose) gegeben und bei
37°C inkubiert. Nach 3 h wurden die Zellen mit 15 ml
frischem Medium versetzt und über Nacht bei 37°C und 5%
CO₂ inkubiert. 4 h vor der Applikation wurden die Zellen
mit 20 Gy bestrahlt. Die Aufarbeitung der Vakzine
erfolgte, wie in der WO 94/21808 beschrieben. Die
Vorimmunisierung mit dieser Vakzine wurde in einwöchigem
Abstand mit 10⁵ Zellen vorgenommen; nach einer weiteren
Woche wurde die Tumorsetzung durchgeführt, wie oben
beschrieben (Fig. 1: gefüllte Dreiecke). Es zeigte sich,
daß die Vakzine, die das Peptid mit Polylysin vereinigt
enthielt, die Mäuse am besten vor Tumorbildung schützte.
Drei Einzelpeptid-Vakzine, enthaltend entweder Peptid
kpep117 allein in PBS (Fig. 2a), Peptid kpep117, emulgiert
in IFA (Fig. 2b), oder Peptid kpep117 mit Polylysin
(Kettenlänge: 240) als Adjuvans (Fig. 2c), wurden auf
ihre protektive Wirkung gegen eine P815-Tumorchallenge
getestet. Die Vakzine wurden, wie oben in Abschnitt D
beschrieben, hergestellt. Das Injektionsvolumen betrug
jedesmal 100 µl; die Injektion wurde subkutan (sc) oder
intraperitoneal (ip) vorgenommen. Naive Mäuse dienten als
Negativkontrolle, eine Ganzzellvakzine, bestehend aus GM-CSF
sekretierenden P815 Zellen als Positivkontrolle
(P815-GM-CSF; 10⁵ Zellen in 100 µl wurden pro Tier
subkutan injiziert). Jede Versuchsgruppe bestand aus acht
Tieren, es wurden drei Vakzinierungen in siebentägigen
Abständen vorgenommen. Eine Woche nach der letzten
Vakzinierung erhielten die Tiere eine contralaterale
Tumorchallenge mit 5 × 10⁴ P815-Zellen. Die Tiere wurden
täglich inspiziert, das Auftreten von Tumoren wurde in
wöchentlichem Abstand kontrolliert.
Das Peptid kpep117 mit Polylysin als Adjuvans erzielte
die beste Anti-Tumorwirkung, wenn 100 µg pro Tier
subkutan injiziert wurden (drei von acht Tieren
geschützt). Dieser Effekt war annähernd so gut wie der
mit der Ganzzellvakzine erzielte (vier von acht Tieren
geschützt). 16 µg Peptid zusammen mit Polylysin pro Tier
war weniger wirksam (zwei Tiere geschützt), aber deutlich
besser als 100 µg Peptid in PBS (Fig. 2a, keine
Schutzwirkung). Auch emulgiert in IFA erzielte das Peptid
nicht die Wirkung, die es zusammen mit Polylysin leistet
(Fig. 2c).
Für die Herstellung der Vakzine wurden die folgenden
Peptide verwendet:
kpep118 (100 µg pro Injektion)
Peptidmischung III (kpep117, kpep118, kpep162, kpep163, kpep164) diese Peptidmischung enthielt alle bisher bekannten P815-Peptide; pro Injektion wurden 25 µg jedes Peptids verabreicht).
Peptidmischung III (kpep117, kpep118, kpep162, kpep163, kpep164) diese Peptidmischung enthielt alle bisher bekannten P815-Peptide; pro Injektion wurden 25 µg jedes Peptids verabreicht).
Als positive Kontrolle wurden GM-CSF sekretierende
P815-Zellen verwendet.
In Vorversuchen hatte sich kpep117 als das Peptid mit der
besten Schutzwirkung gegen eine P815-Tumorsetzung
erwiesen, wenn 100 µg Peptid zusammen mit Polylysin
(7.5 µg Polylysin/100 µg Peptid, entsprechend dem
Standardverhältnis; Polylysin: Kettenlänge = 200)
verwendet wurden. Eine geringere Menge (16 µg) kpep117
war weniger wirksam gewesen. In diesem Beispiel wurden
100 µg kpep118 pro Tier injiziert, und zwar einmal nur
mit Polylysin (Gruppe B), einmal mit Transferrin-Polylysin
(Gruppe C) und einmal mit Transferrin-Polylysin/DNA
(Gruppe D). Als Kontrolle wurde kpep118 mit
IFA verwendet. In diesem Experiment zeigte kpep118 allein
keine Schutzwirkung gegen die Tumorsetzung.
In den in Beispiel 4 durchgeführten Versuchen wurde, daß
eine Vakzine, enthaltend eine Peptidmischung aus
Melanompeptiden, eine Schutzwirkung gegen Melanom
aufweist. Es wurde daher in diesem Beispiel getestet, ob
sich das Konzept der Peptidmischung auch für P815 eignet.
Die Peptidmischung III wurde einmal nur mit Polylysin
(Gruppe E), einmal mit Transferrin-Polylysin (Gruppe F)
und einmal mit Transferrin-Polylysin/DNA (Gruppe G)
verabreicht. Als Kontrolle wurde Peptidmischung III in
IFA verwendet. Als Negativkontrolle wurden naive Mäuse
verwendet; als positive Kontrolle GM-CSF-transfizierte
P815-Zellen (10⁵ Zellen pro Maus).
Die in diesem Beispiel durchgeführten Versuche
entwickelten sich, im Vergleich zu den anderen Versuchen,
eher untypisch: in der positiven Kontrollgruppe (GM-CSF
sekretierende Zellen) entwickelten alle Tiere bald nach
der Tumorsetzung Tumoren, wobei die meisten dieser
Tumoren ebenso schnell verschwanden, wie sie entstanden
waren. Eine mögliche Erklärung dafür ist, daß der Tumor
eine Weile wuchs, bevor er zerstört wurde. Eine zweite
mögliche Erklärung wäre, daß die als Tumor
diagnostizierte Schwellung nicht vom Tumorwachstum
herrührte, sondern von einem starken Immunzellinfiltrat
(Granulom). Da die Tiere nicht seziert wurden, konnte die
Ursache nicht definitiv festgestellt werden; jedenfalls
wurden die gesetzten Tumoren letztlich zerstört. Ein
weiteres interessantes Ergebnis wurde in Gruppe G
erhalten, in der die Tiere mit einer Kombination aus
Peptidmischung III und Polylysin behandelt wurden. Alle
Tiere entwickelten Tumoren, aber in zwei der Tiere war
die Größe der Schwellung des Tumors (bzw. des
Immunzellinfiltrats) relativ gering, nahm nicht zu, und
die Mäuse sahen nicht ungesund aus. Diese beiden Tiere
wurden nicht getötet, sondern weiter unter Beobachtung
gehalten. Überraschenderweise waren die Tumoren neun
Wochen nach der Tumorsetzung nicht mehr nachweisbar, ein
bisher nicht beobachtetes Ergebnis. Zwei von acht Tieren
zerstörten schließlich ihre Tumorlast. Die Zerstörung der
Tumoren dürfte auf den Gehalt an kpep117 in der
Peptidmischung zurückzuführen sein, was in Analogie zu
Beispiel 2 stünde, wo zwei von acht Tieren mit 16 µg
kpep117 und drei von acht Tieren mit 100 µg kpep117
geschützt waren. Die Schutzwirkung könnte jedoch auch
durch mehr als ein Peptid der Mischung hervorgerufen
worden sein.
Es wurde eine prophylaktische Vakzine verwendet, die eine
Mischung von Melanompeptiden (Peptidmischung I, Abschnitt
D2) enthielt.
Das Protokoll der Vorimmunisierung mit der Vakzine sowie
die Setzung der Tumoren entsprach dem in Beispiel 2
beschriebenen Protokoll, mit dem Unterschied, daß die
Tumorsetzung mit M3-Zellen (10⁵ Zellen pro Tier)
vorgenommen wurde. Als Kontrollvakzine wurde
Ganzzellvakzine aus M-3-Zellen benutzt, die IL-2
sekretieren und hergestellt wurden, wie von Schmidt et.
al. 1995 beschrieben. Unter den gewählten
Versuchsbedingungen erzielte diese Vakzine einen 100%igen
Schutz (Fig. 3a-c).
Fig. 3 illustriert den Schutzeffekt der Peptidvakzine mit
Polylysin als Adjuvans; 50% der behandelten Mäuse waren
gegen die M-3 Tumorchallenge geschützt. Diese Wirkung
konnte erzielt werden, wenn die Peptid-Polylysin-Vakzine
subkutan injiziert oder als Hydrogel auf die Haut
aufgetragen wurde (Fig. 3a und b). Kein Schutz wurde
unter den gewählten Versuchsbedingungen erzielt, wenn die
Peptidvakzine mit Polylysin als Adjuvans intraperitonal
verabreicht wurde. Alle Mäuse entwickelten Tumoren,
allerdings mit einer zeitlichen Verzögerung, verglichen
mit Tieren der naiven Kontrollgruppe, die keine
Behandlung vor der Tumorchallenge erfuhren. Der gleiche
marginale Effekt wurde beobachtet, wenn die
Peptidmischung I als IFA-Vakzine eingesetzt wurde. Es
ergab sich lediglich eine zeitliche Verzögerung beim
Auftreten der Tumoren, die nach sechs Wochen bei allen
Tieren manifest waren, sowohl in der subkutan als auch in
der intraperitonal behandelten Gruppe (Fig. 3c).
Es wurde eine therapeutische Vakzine verwendet, die eine
Mischung von Melanompeptiden (Peptidmischung 1,
beschrieben in Abschnitt D2) enthielt. Es wurden drei
Vakzinierungen in einwöchigem Abstand verabreicht. Die
erste Vakzinierung erfolgte fünf Tage nach der
Metastasensetzung, es wurde demnach gegen eine
Fünftagesmetastase geimpft. 1.2 × 10⁴ M-3 Zellen wurden
für die Metastasensetzung injiziert, es wurde das in der
WO 94/21808 und bei Schmidt et al., 1996, beschriebene
Protokoll verwendet.
Als Vakzine wurde Peptidmischung I verwendet: ohne
Adjuvans (pepmix1 PBS), mit IFA als Adjuvans
(IFA pepmix1) oder mit Fukose-modifiziertem Polylysin
(fpL pepmix1). Kontrollgruppen erhielten keine Vakzine
(naive) oder die im Be6 2 aufgeführten IL-2
produzierenden M-3 Ganzzellenvakzine. Fig. 4 zeigt, daß
der beste Schutz in der Gruppe erzielt wurde, die mit
Peptidmischung I mit Fukose-modifiziertem Polylysin als
Adjuvans behandelt wurde (Fig. 4a). 50% der Mäuse
konnten die Metastasen abstoßen (4/8). Diese Behandlung
war sogar wirksamer als die mit der Ganzzellvakzine, die
nur 33% der Mäuse schützte (3/9). Die Peptidvakzine mit
IFA oder ohne Adjuvans führte lediglich zu einer
Verzögerung beim Auswachsen der Metastasen zum Tumor
(Fig. 4b).
Für diese Tests wurde ein Fluoreszenzassay verwendet: Ein
Modell-Peptidantigen der Sequenz LFEAIEGFI (MHC Kd-restringiert)
wurde mit dem Fluoreszenzfarbstoff
Fluoresceinisothiocyanat (FITC) nach Vorschrift des
Herstellers (Molecular Probes) markiert. Die Aufnahme
bzw. Bindung von FITC-markiertem Peptid allein ("pulsed")
oder zusammen mit verschiedenen Konzentrationen von
basischen Aminosäuren (Polylysin mit einer Kettenlänge
von 16 bis 490, Polyarginin mit einer Kettenlänge von 15
bis 720) durch die MHC Kd-restringierte Monozyten-Makrophagen-Zellinie
P388D1 wurde mittels
Durchflußzytometrie gemessen. Dazu wurden 1 × 10⁶ P388D1-Zellen
in einem Endvolumen von 1 ml Medium (DMEM/10%
FCS) in Zentrifugenröhrchen mit 5 µg FITC-markiertem
Peptid allein oder mit einer Mischung aus Peptid und
Polyaminosäure 30 min bei 37°C inkubiert und anschließend
intensiv gewaschen, um freies Peptid zu entfernen. Die
Polyaminosäuren wurden in einer Konzentration von 50, 25,
12, 6 und 3 µg pro ml Medium, enthaltend 5 µg FITC-markiertes
Peptid zugesetzt. Die relative
Fluoreszenzintensität der verschiedenen Proben wurde
verglichen, um die Effizienz der Aufnahme und/oder
Bindung des Peptids zu beurteilen. Das Ergebnis dieser
Versuche ist in Fig. 5 dargestellt; die Versuche wurden
mit jeweils 25 µg pL450 bzw. pArg450 durchgeführt. Unter
den gewählten Bedingungen zeigte sich Polyarginin ca.
fünfmal effizienter als Polylysin.
Peptide können von APCs durch spezifische Mechanismen wie
Makropinozytose oder Rezeptor-vermittelte Endozytose
(Lanzavecchia, 1996) aufgenommen werden. Ein alternativer
Mechanismus kann darin bestehen, daß die Polyaminosäuren
die Zellmembran durchlässig machen können und auf diese
Weise die Diffusion von Peptiden vom Medium ins
Zytoplasma ermöglichen. Die mögliche Internalisierung von
FITC-markierten Peptiden in Gegenwart oder Abwesenheit
von basischen Polyaminosäuren wurde auf der Grundlage des
von Avrameas et al., 1996, veröffentlichten Prinzips
untersucht: Von Zellen internalisierte Partikel werden in
Endosomen transportiert. Im Vergleich zum Zytoplasma oder
Zellkultur-Medium, die neutrale pH-Werte aufweisen, sind
diese Organellen mit einem-pH-Wert von ca. 5 sauer. Die
von FITC emittierte Fluoreszenz ist stark pH-abhängig. In
einer Umgebung mit pH-Bedingungen, wie sie in Endosomen
zu finden sind, wird die Fluoreszenz mit einem Faktor von
ca. 3-5 unterdrückt. Daher zeigen FITC-markierte
Peptide, die von den Zellen in die Endosomen aufgenommen
werden, eine verminderte Fluoreszenz. Bei Zugabe von
Monensin wird der niedrige pH-Wert der Endosomen
neutralisiert, was zu einer meßbaren verstärkten
Fluoreszenz der internalisierten FITC-markierten Peptide
führt.
Die mögliche Permeabilisierung der Zellmembran wurde
getestet, indem die Freisetzung des zytoplasmatischen
Enzyms Lactatdehydrogenase (LDH) nach Inkubation von
P388D1-Zellen mit Polyaminosäuren (Polylysin oder
Polyarginin) unter isotonischen Bedingungen unter
Verwendung des käuflich erhältlichen Kits (Cytotox 96,
Promega, Madison, Wisconsin, USA) nach Vorschrift des
Herstellers gemessen wurde. Es zeigte sich, daß die
Inkubation von APCs mit bestimmten basischen
Polyaminosäuren wie Polylysin (pLys) und Polyaginin
(pArg) die Aufnahme bzw. Bindung der Peptide an APCs
verstärkt. (Im durchgeführten Test zeigte sich unter
vergleichbaren Bedingungen pArg ca. fünffach effizienter
als pLys.) Aufgrund der in Fig. 6a erhaltenen Ergebnisse
ist anzunehmen, daß die Wirkung von pLys darin besteht,
daß es die Zellmembranen durchlässig macht, was sich in
hohen Konzentrationen von unter isotonischen Bedingungen
freigesetztem zytoplasmatischem Enzym äußert. Im
Gegensatz dazu wurde nach pArg-Behandlung (Fig. 6b)
praktisch kein LDH nachgewiesen. Ein signifikanter
Anstieg der Fluoreszenz nach Monensinbehandlung weist
darauf hin, daß die mit pArg bewirkte Beladung der
Peptide dazu führt, daß diese in Vesikeln innerhalb der
Zelle akkumuliert werden (Fig. 7).
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Claims (30)
1. Pharmazeutische Zusammensetzung, enthaltend mindestens
ein immunmodulatorisch wirkendes Peptid zusammen mit
einem Adjuvans, dadurch gekennzeichnet, daß das
Adjuvans die Fähigkeit aufweist, die Bindung des
Peptids an die Zellen des zu behandelnden Individuums
bzw. den Eintritt des Peptids in die Zellen zu
steigern.
2. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 1,
dadurch gekennzeichnet, daß das Peptid ein Ligand für
mindestens ein MHC-Molekül ist, das von dem zu
behandelnden Individuum exprimiert wird.
3. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 2,
dadurch gekennzeichnet, daß das Peptid ein Ligand für
ein MHC-I-Molekül ist.
4. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 2,
dadurch gekennzeichnet, daß das Peptid ein Ligand für
ein MHC-II-Molekül ist.
5. Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der
vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß
sie ein Peptid enthält, das von einem Protein eines
pathogenen Erregers abgeleitet ist.
6. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 5,
dadurch gekennzeichnet, daß das Peptid von einem
bakteriellen Protein abgeleitet ist.
7. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 5,
dadurch gekennzeichnet, daß das Peptid von einem
viralen Protein abgeleitet ist.
8. Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der
Ansprüche 1 bis 4 zur Anwendung als Tumorvakzine,
dadurch gekennzeichnet, daß das Peptid von einem
Tumorantigen abgeleitet ist.
9. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 8 für
die therapeutische Anwendung, dadurch gekennzeichnet,
daß sie ein oder mehrere Peptide enthält, die von
einem oder mehreren Tumorantigenen abgeleitet sind,
die von dem zu behandelnden Individuum exprimiert
werden.
10. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 8 für
die prophylaktische Anwendung, dadurch gekennzeichnet,
daß sie ein oder mehrere Peptide enthält, die
abgeleitet sind von Vertretern häufig auftretender
Tumorantigene.
11. Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der
Ansprüche 8 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß das
Peptid ein Melanompeptid ist.
12. Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der
Ansprüche 8 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß sie
außerdem ein Zytokin enthält.
13. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 12,
dadurch gekennzeichnet, daß das Zytokin ausgewählt ist
aus der Gruppe IL-2, IL-4, IL-12, IFN-γ, TNF-α, GM-CSF,
oder Mischungen davon.
14. Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der
Ansprüche 2 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß sie
mehrere Peptide enthält, die sich dadurch
unterscheiden, daß sie an unterschiedliche MHC-Subtypen
des zu behandelnden Individuums binden.
15. Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der
Ansprüche 2 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß das
Peptid von einem natürlich vorkommenden immunogenen
Protein oder Tumorantigen bzw. einem zellulären
Abbauprodukt davon abgeleitet ist.
16. Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der
Ansprüche 2 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß das
Peptid ein synthetisches Peptid ist.
17. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 1,
dadurch gekennzeichnet, daß das Peptid von einem
Protein abgeleitet ist, das eine Autoimmunerkrankung
verursacht.
18. Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der
vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß
das Adjuvans ein organisches Polykation ist.
19. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 18,
dadurch gekennzeichnet, daß das Adjuvans eine basische
Polyaminosäure ist.
20. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 19,
dadurch gekennzeichnet, daß das Adjuvans Polylysin
ist.
21. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 19,
dadurch gekennzeichnet, daß das Adjuvans Polyarginin
ist.
22. Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der
Ansprüche 18 bis 21, dadurch gekennzeichnet, daß das
Adjuvans mit einem zellulären Liganden konjugiert ist.
23. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 22,
dadurch gekennzeichnet, daß der Ligand ein
Kohlenhydratrest ist.
24. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 23,
dadurch gekennzeichnet, daß der Ligand Fukose ist.
25. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 22,
dadurch gekennzeichnet, daß der Ligand Transferrin
ist.
26. Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der
Ansprüche 18 bis 25, dadurch gekennzeichnet, daß sie
außerdem DNA enthält.
27. Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der
Ansprüche 1 bis 26 für die parenterale Verabreichung.
28. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 27,
dadurch gekennzeichnet, daß sie als Lösung oder
Suspension des Peptids und des Adjuvans in einem
pharmazeutisch annehmbaren Träger vorliegt.
29. Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der
Ansprüche 1 bis 26 für die topische Verabreichung.
30. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 29 in
Form eines Hydrogels.
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1996
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