WO2005035563A1 - アンチトロンビンⅲ組成物の製造方法 - Google Patents

アンチトロンビンⅲ組成物の製造方法 Download PDF

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WO2005035563A1
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dna
seq
cells
antithrombin iii
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PCT/JP2004/015324
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Tsuyoshi Yamada
Mitsuo Satoh
Yutaka Kanda
Kazuya Yamano
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Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd.
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    • C12Y501/03—Racemaces and epimerases (5.1) acting on carbohydrates and derivatives (5.1.3)
    • C12Y501/03018—GDP-mannose 3,5-epimerase (5.1.3.18)

Definitions

  • the present invention relates to a composition comprising an antithrombin III molecule having an N-glycoside-linked complex-type sugar chain, wherein the N-glycoside-linked complex-type sugar chain is modified with N-acetylglycosamine at the reducing end of the sugar chain.
  • the present invention relates to a method for producing an antithrombin III composition which is a sugar chain that is not cross-linked.
  • Thrombus formation carries the risk of stopping blood flow. Since the blockage of blood flow due to the formation of a thrombus is a lethal factor, the living body has several control and regulation mechanisms for blood coagulation. That is, the direct inactivation of activated coagulation factor by serine protease [The Thrombin Vokuoae KMacliovicti R "ed.) Pp. 1-21, CRC Press, Boca Raton, 1982], by activated protein C Regulatory mechanisms based on degradation of factors V and VIII (Progress in Hemostasis and Thrombosis Volume 7 (Spaet T.
  • antithrombin There are various inhibitors to serine proteases in the blood, the amount of which is up to 10% of the total plasma protein.
  • four inhibitors antithrombin .. ⁇ proteinase inhibitor (otl proteinase inhibitor), ⁇ 2 macroglobulin, and heparin cofactor II. It is known to be important in controlling blood coagulation.
  • antithrombin III is particularly important, accounting for 70% of the antithrombin activity in plasma.
  • Antithrombin III is a glycoprotein consisting of 432 amino acids and having a molecular weight of about 59,000 to 65,000, and has three disulfide bonds, Cys8-Cysl28, Cys21-Cys95, and Cys247-Cys430 in the molecule (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80, 1845, (1983)]. With this combination, A large loop structure is formed at the terminal side, and the active center, Arg393-Ser394 bond, is present in this loop structure (Fig. 1). The isoelectric point of human antithrombin III is 5.11.
  • Antithrombin III has N-terminal ninety-sixth, thirteenth, thirteenth, and nineteenth asparagines (each denoted as Asn96, Asnl3'5, Asnl55, and Asnl92) from the N-terminus. -A glycoside-linked sugar chain is added.
  • Antithrombin III which is present in human plasma, is available in two forms: ⁇ -form, which has four N-glycoside-linked sugar chains, and ⁇ -form, which has no additional sugar chains to Asnl35 and has only three sugar chains. Although there is an isoform [Pathophysiol Haemost Thromb 32, 143 (2002)], 90-95% of antithrombin III in human plasma is ⁇ -type, and the remaining 5-10% is ⁇ -type.
  • the complex sugar chain of ⁇ -glycosidic bond added to antithrombin III is composed of ⁇ -acetyltilcosamine, sialic acid, galactose and mannose (Fig. 2).
  • Fig. 2 One of the characteristics of antithrombin III present in human plasma is that its sugar chain structure is not modified with fucose.
  • Antithrombin III was developed as a blood coagulation inhibitor and is based on congenital antitito-Dombin III deficiency. It is widely used worldwide for the treatment of generalized intravascular coagulation syndrome with thrombosis and reduced antithrombin III.
  • Blood products such as antithrombin III are manufactured from pooled human Jfil plasma.
  • pooled plasma is produced and supplied at the Japanese Red Cross Plasma Fractionation Center by mixing plasma from about 5,000 to 10,000 people after storage for 6 months.
  • dried concentrate human blood coagulation factor ⁇ ⁇ Cross Eight M Japanese Red Cross
  • cryoprecipitate obtained from the pooled plasma described above was required.
  • Several batches are required, and about 80,000 plasma is used (Japanese Journal of Transfusion Medicine 48.27, 2002).
  • Human parvovirus B19 is a direct 18- to 26-nm small virus with no envelope, and is subjected to heat treatment at 60 ° C for 30 minutes, acid treatment at about pH 3, lip mouth form treatment, surfactant treatment, etc.
  • the virus cannot be removed by the usual virus removal methods because it is resistant (Science 262, 114, 1993).
  • human palpovirus B19 requires a filtration step using a virus removal membrane with a pore size of several to several tens of nanometers that has been specially developed.
  • a virus removal membrane with a pore size of several to several tens of nanometers that has been specially developed.
  • it has been considered difficult to introduce a filtration process using such a small pore size, that is, a nanofiltration process, in the production process of many plasma derivatives Japanese Journal of Transfusion Medicine 48> 27, 2002.
  • Human parvovirus B19 is responsible for infectious erythema and, in healthy individuals without anti-B19 antibodies, generally presents only transient cold-like symptoms, but in some cases chronic hemolysis Causes sexual anemia. In immunocompromised patients, it is sometimes said to cause severe acute erythroblastosis.
  • Raw materials for the production of antithrombin III blood products such as Neuart (Mitsubishi Pharmaceuticals; t®) and Anthrobin P (produced by Appentice Behring) include hepatitis B virus negative, hepatitis C virus negative, and human immunodeficiency. Using pooled plasma that is negative for viruses I and II, the presence or absence of human parvovirus B19 in the raw material is not confirmed.
  • Antithrombin ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ In the process of producing blood products, virus inactivation treatment at a temperature of 60 ° C for 10 hours, that is, passivation treatment, is performed, but the protein antithrombin III is altered, AIDS virus, human There are problems such as the inability to completely remove the parvovirus, the prion that causes Eagle-type Creutzfeldt-Jakob disease, and the like.
  • Fucose is bound to N-acetylglycosamine on the reducing end side of the N-glycoside-linked complex type sugar chain that binds to antithrombin III.
  • the ratio of the produced recombinant antithrombin III to the total N-glycoside-linked complex glycans to which N-glycoside-linked complex glycans to which fucose is bound differs depending on the host cell, It is estimated at 39-95%.
  • the present invention relates to the following (1) to (24).
  • An antithrombin III composition comprising an oral umbin III molecule, wherein the ⁇ -glycoside-linked complex-type sugar chain is a sugar chain in which fucose is not bonded to ⁇ ⁇ -acetyldarcosamine at the reducing end of the sugar chain.
  • a method for producing an antithrombin III composition comprising: collecting and accumulating the antithrombin III thread from the culture.
  • the host cell is linked to the enzyme involved in the synthesis of intracellular sugar nucleotide GDP-fucose, or the 1-position of fucose to the 6-position of ⁇ ⁇ -acetylglucosamine at the reducing end of ⁇ -glycoside-linked complex type sugar chain. All of the genomic alleles of enzymes involved in glycosylation are knocked out host cells,
  • the enzymes involved in the synthesis of intracellular sugar nucleotide GDP-fucose are GDP-mannose 4,6-dehydrase (GMD) and GDP-4-keto-6-deoxy-D-mannose-3,
  • GMD GDP-mannose 4,6-dehydrase
  • Fx 5-epimerase
  • GDP-mannose 4,6-dehydratase is a protein encoded by a DNA selected from the group consisting of the following (a) and (b): (a) DNA consisting of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 7;
  • one or more amino acids are composed of an amino acid sequence in which deletion, substitution, insertion, Z or addition has been performed, and which has GDP-mannose 4,6-dehydrase activity. Having protein;
  • GDP-4-keto-6-deoxy-D-mannose-3,5-epimelase is a protein encoded by a DNA selected from the group consisting of the following (a) and (b): 5) The production method according to the above.
  • one or more amino acids are composed of an amino acid sequence with deletion, substitution, insertion and / or addition, and GDP-4-keto-6-dexoxy-D A protein having -mannose-3,5-epimerase activity;
  • 6-fucosyltransferase is an enzyme involved in sugar chain modification in which the 1-position of fucose is ⁇ -linked to the 6-position of N-acetylglycine at the reducing end of the N-glycoside-linked complex type sugar chain (3 ) Or the production method according to (4).
  • (12) al, 6-fucosyltransferase is a protein selected from the group consisting of the following (a), (b), (c), (d), (e) and (£): 10. The method according to item 10).
  • a protein comprising an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 13 in which one or more amino acids are deleted, substituted, inserted, Z or added, and which has al, 6-fucosyltransferase activity ;
  • a kagura substance consisting of an amino acid sequence having 80% or more homology with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 13 and having al, 6-fucosyltransferase activity;
  • the host cell is selected from the group consisting of the following (a), (b), (c), (d), (e), (0, ( g ), (h), (0 and ⁇ )
  • the antithrombin III composition has an N-glycoside-linked complex type ⁇ chain, and the N-glycoside-linked complex type sugar chain has fucose bound to N-acetylglycosamine at the reducing end of the sugar chain.
  • the production method according to any one of (1) to (14), which has no sugar chain.
  • the N-glycoside-linked complex-type sugar chain is a sugar chain in which the 1-position of fucose is not bonded to the 6-position of N-acetyldarcosamine at the reducing end of the sugar chain, (1) to (15) )).
  • antithrombin III is a polypeptide represented by the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4.
  • Antithrombin III has an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 in which one or more amino acids have been deleted, substituted, inserted and / or added, and has heparin binding activity.
  • Antithrombin III a polypeptide comprising an amino acid sequence having 80% or more homology with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 and having heparin binding activity, The production method according to any one of the preceding claims.
  • Antithrombin III is a polypeptide encoded by DNA selected from the following (a) or (b): The production method according to any one of (1) to (19), which is a tide.
  • a medicament comprising the antithrombin III composition according to (22) as an active ingredient.
  • the present invention relates to a composition comprising a recombinant anti-tomtobin III molecule having an N-glycoside-linked complex type sugar chain, wherein the N-glycoside-linked complex type sugar chain is an N-glycan at the reducing end of the sugar chain.
  • the present invention relates to a method for producing an antithrombin III compound, which is a sugar chain in which fucose is not bound to cetyldarcosamine, and a medicament containing the antithrombin III composition.
  • antithrombin III includes the following (a), (b), (c), (d), (e) or (a protein encoded by DNA of 0, or (g), (h), (i (j), (k), (1), (m), (n) or (o) protein and the like.
  • a protein consisting of an added amino acid sequence and having heparin binding activity
  • a protein comprising an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6 in which one or more amino acids have been deleted, substituted, inserted and / or added, and has heparin binding activity;
  • a protein comprising an amino acid sequence having 80% or more homology with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 and having heparin binding activity;
  • White matter comprising an amino acid sequence having at least 80% homology to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6, and having heparin binding activity.
  • -DNA encoding the amino acid sequence of antithrombin III includes DNA having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1, 2 or 3, DNA having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1, 2 or 3. And DNA encoding a protein that hybridizes under stringent conditions and has heparin binding activity.
  • DNA that hybridizes under stringent conditions refers to, for example, a colony hybridizer using a DNA such as a DNA having a base sequence represented by SEQ ID NO: 1, 2 or 3 or a fragment thereof as a probe.
  • Plaque DNA obtained by using the hybridization method or the Southern blot hybridization method, specifically, a filter in which colony- or plaque-derived DNA is immobilized.
  • After performing hybridization at 65 ° C in the presence of 0.7 to 1.0 M sodium chloride use a 0.1 to 2 times concentration of SSC solution (1 time concentration).
  • the composition of the SSC solution is composed of ⁇ 50 mM sodium chloride and 15 mM sodium citrate), and the DNA that can be identified by washing the filter at 65 ° C is obtained.
  • Hybridization is described in Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989) (hereinafter abbreviated as Molecular 'Cloning 2nd Edition), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, ( 1987-1997) (hereinafter abbreviated as current 'protocols' in 'molecular' biology), DNA Cloning 1: Core Techniques, A Practical Approach, Second Edition, Oxford University (1995), etc. It can be done in accordance with it.
  • the hybridizable DNA specifically, a DNA having at least 60% or more homology with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1, 2, or 3, preferably 70% or more, more preferably 8% or more. DNAs having 0% or more, more preferably 90% or more, particularly preferably 95% or more, and most preferably 98% or more homology can be mentioned.
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4, 5 or 6 has an amino acid sequence in which one or more amino acids have been deleted, substituted, inserted and / or added, and has substantially heparin binding activity. Proteins having the same activity are described in Molecular 'Cloning 2nd Edition, Current Protocols. In' Molecular 'Biology, Nucleic Acids Research, 10, 6487 (1982), Proc. Natl. Acad. Sci., USA , 79, 6409 (1982), Gene, 34, 315 (1985), Nucleic Acids Research, 13, 4431 (1985), Proc. Natl. Acad. Sci USA, 82, 488 (1'985).
  • a protein that can be obtained by introducing a site-specific mutation into a DNA encoding a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4, 5, or 6 using a specific mutagenesis method is one or more, and the number thereof is not particularly limited.
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4, 5 or 6 has a homology of 80% or more.
  • proteins having substantially the same activity as heparin-binding activity include BLAS TCJ.Mol.Biol., 215, 403 (1990)) and FASTA (Metiiods in Enzymology 183, 63 (1990)).
  • the homology with the protein having the amino acid sequence described in Sequence Listing 4, 5 or 6 is at least 80% or more, preferably 85% or more, more preferably Means that the protein is 90% or more, more preferably 95% or more, particularly preferably 97% or more, and most preferably 99% or more.
  • a sugar chain in which fucose is not bound to N-acetylglycosamine at the reducing end of an N-glycoside-linked complex type sugar chain is substantially the same as the reducing end of the N-glycoside-linked complex type sugar chain.
  • a sugar chain in which fucose is not bound to N-acetyldarcosamine Preferably, the content of fucose bound to N-acetyldarcosamine at the reducing end of a complex N-glycoside-linked sugar chain is 0%.
  • the antithrombin composition of the present invention specifically refers to a case where fucose is not substantially detectable in the sugar chain analysis described in 4 below. Substantially undetectable means below the detection limit of the measurement.
  • N-glycoside-linked sugar chains bound to glycoproteins such as antithrombin III have various structures, but in each case, the common core structure represented by the following structural formula (I) It is known to have ⁇
  • the terminus of the sugar chain that binds to asparagine is called the reducing end, and the opposite side is the non-reducing end.
  • N-glycoside-linked sugar chains include high-mannose monosaccharides, in which only mannose is attached to the non-reducing end of the core structure, and galactose-N-acetyltyldarcosamine (hereinafter 1 ⁇ . , Gal-GlcNAc) and one or more branches in parallel, and a non-reducing end of Gal-GkNAc having a structure such as sialic acid or pi-secting N-acetylglucosamine.
  • Hybrid sugar chains having both high mannose and complex branches on the non-reducing terminal side of the sugar chain core structure are exemplified.
  • the antithrombin III molecule has asparagine residues at the 96th, 135th, 15th and 19th second positions from the N-terminus as amino acid residues to which N-glycoside-linked sugar chains are attached. Group is present.
  • antithrombin III (/? Type) is bound.
  • the ⁇ -glycosidic bond complex-type sugar chain that binds to the antithrombin III molecule includes any sugar chain having the core structure represented by the structural formula (I). There will be many combinations of sugar chains in the ⁇ -glycoside-linked sugar chains of the book.
  • the antithrombin III composition obtained by the production method of the present invention is composed of antithrombin III molecule having a single sugar chain structure as long as it is qualitatively equivalent to the biological activity of naturally occurring antithrombin III. Or may be composed of antithrombin molecules having a plurality of different sugar chain structures.
  • the naturally occurring antithrombin III refers to antithrombin III obtained from natural materials such as plasma. .
  • Such an antithrombin III composition is a composition comprising an antithrombin III molecule having a ⁇ -glycoside-linked complex type sugar chain, wherein the ⁇ -glycoside-linked complex type sugar chain is -An antithrombin III composition, which is a sugar chain in which fucose is not bound to acetylglycosamine, is provided.
  • the structure of the sugar chain at the non-reducing end may be diverse.
  • Analysis of the sugar chain structure in a composition consisting of an antithrombin III molecule having a complex ⁇ ⁇ -glycoside-linked sugar chain can be performed by a known method such as hydrazinolysis or enzymatic digestion from the antithrombin III molecule.
  • host cells modified by genetic recombination can be used.
  • the host cell modified by genetic recombination refers to a host cell in which the properties of the cell have been changed by artificially recombining the gene.
  • artificially recombining genes include gene-targeted gene destruction, enzyme dominant-negative transduction, enzyme sudden mutation, enzyme transduction Techniques for suppressing the transcription or translation of DNA.
  • a method for artificially selecting cells in which the gene has been recombined is also included in the operation for artificially recombining the gene. _
  • host cells include yeast, animal cells, insect cells, plant cells, and the like, and specific examples of these cells include those described in 2. below.
  • animal cells include CHO cells derived from Chinese hamster ovary tissue, rat myeloma cell line YB2 / 3HL.P2.Gll.l6Ag.20 cell, mouse myeloma cell line NS0 cell, mouse myeloma cell line SP2 / 0-Agl4 cells, Syrian hamster kidney tissue-derived BHK cells, human leukemia cell line Namalba cells, embryonic stem cells, fertilized egg cells, and the like. '.
  • Examples of the above host cells include host cells having the following properties (a) or (b).
  • Enzymes involved in the synthesis of intracellular sugar nucleotide GDP-fucose include GDP-mannose 4,6-dehydrase (GMD), GDP-4-keto-6-deoxy-D-mannose-3,5- Epimelase (FX) and others.
  • GMD GDP-mannose 4,6-dehydrase
  • FX GDP-4-keto-6-deoxy-D-mannose-3,5- Epimelase
  • the GDP-mannose 4,6-dehydrase is a protein encoded by the DNA of the following (a) or (b), or a protein of the following (c), (d) or (e): can give.
  • the 3 ⁇ -4-keto-6-deoxymannose-3,5-epimerase is a protein encoded by the DNA of the following (a) or (b), or the following (c), (d) ) Or the protein of (e).
  • one or more amino acids are composed of an amino acid sequence in which one or more amino acids have been deleted, substituted, inserted and / or added, and is GDP-4-keto-6-dexoxy.
  • al, 6-fucosyltransferase and the like are examples of enzymes involved in sugar chain modification in which the 1-position of fucose is ⁇ -linked to the 6-position of N-acetyldarcosamine at the reducing end of the N-glycoside-linked complex type sugar chain.
  • al, 6-fucosyltransferase includes the following (a), (b), (c) or (a protein encoded by the DNA of, or (e), (g), (h), (i) ) Or (j).
  • one or more amino acids consist of an amino acid sequence in which one or more amino acids have been deleted, substituted, inserted and Z or added, and al, 6-fucosyltransferase An active protein;
  • amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 14 one or more amino acids consist of a deletion, substitution, insertion, Z or addition of an amino acid sequence, and al, 6-fucosyltransferase.
  • the DNA encoding the amino acid sequence of GDP-mannose 4,6-dehydratase is a stringent DNA such as a DNA having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 7 and a DNA having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 7.
  • DNA encoding a protein that hybridizes under the conditions and has GDP-mannose 4,6-dehydratase activity is a stringent DNA such as a DNA having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 7 and a DNA having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 7.
  • the DNA encoding the amino acid sequence of GDP-4-keto-6-dexoxy-D-mannose-3,5-epimerase is a DNA having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 9, represented by SEQ ID NO: 9
  • Examples of the DNA include a DNA that hybridizes with a DNA having a base sequence under stringent conditions and encodes a protein having GDP-4-keto-6-deoxy-D-mannose-3,5-epimerase activity.
  • Examples of the DNA encoding the amino acid sequence of al, 6-fucosyltransferase include a DNA having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 11 or 12, a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 11 or 1'2. And DNA encoding a protein having an ⁇ 1,6-fucosyltransferase activity, which hybridizes with a DNA having the same under stringent conditions.
  • DNA that hybridizes under stringent conditions refers to, for example, a DNA such as a DNA consisting of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 7, 9, 11, or 12 or a fragment thereof as a probe.
  • Hybridization method, plaque means DNA obtained by using the hybridization method or the Southern hybridization method, and specifically, DNA derived from colonies or plaques. Using the immobilized filter, hybridization was performed at 65 ° C in the presence of 0.7 to 1.0 ⁇ ⁇ of sodium chloride, and then 0.1 to 2 times the concentration of 33C.
  • DNA that can be identified by washing the filter at 65 ° C using a solution (the composition of a 1x SSC solution consists of 150 mM sodium chloride and 15 mM sodium citrate) To give It can be.
  • Hybridization is described in Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 (hereinafter abbreviated as Molecular 'Cloning 2nd Edition), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, 1987. -1997 (hereafter, Karen G. 'protocols' in 'molecular' biology), DNA Cloning 1: Core Techniques, A Practical Approach, Second Edition, Oxford University (1995), and the like.
  • DNA that can hybridize under stringent conditions include a DNA having at least 60% or more homology with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 7, 9, 11, or 12, preferably 7 DNA having a homology of 0% or more, more preferably 80% or more, further preferably 90% or more, particularly preferably 95% or more, and most preferably 98% or more can be mentioned.
  • a protein comprising an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted, inserted and / or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8, and having GDP-mannose 4,6-dehydratase activity
  • a protein consisting of an acid sequence and having al, 6-fucosyltransferase activity was prepared by molecular cloning, 2nd edition, Current Protocols, Molecular Biology. Natl. Acad. Sci "USA, 79, 6409 (1982), Gene, 34, 315 (1985), Nucleic Acids Research, 13, 4431 (1985), Proc. Natl. Acad. Sci USA, 82, 488 (1985), etc., using, for example, a DNA having a base sequence represented by SEQ ID NO: 8, 10, 13, or 14.
  • the number of amino acids to be deleted, substituted, inserted and Z or added is one or more, and the number is not particularly limited.
  • the amino acid sequence has 80% or more homology with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8, 10, 13, or 14, and has a GDP-mannose 4,6-dehydratase activity.
  • SEQ ID NO: 8, 10, 13, or 1 In order to have GDP-4-keto-6-dexoxy-D-mannose-3,5-epimerase activity or al, 6-fucosyltransferase activity, SEQ ID NO: 8, 10, 13, or 1 respectively.
  • host cells lacking the above-mentioned enzymatic activities that is, enzymes involved in the synthesis of intracellular sugar nucleotide GDP-fucose, or N-glycidyl glucosamine at the 6-position of the N-glycoside-linked complex type sugar chain reducing terminal
  • the enantiomer of the present invention can be obtained.
  • a transformant producing the thrombin III composition can be obtained.
  • Enzyme involved in the synthesis of intracellular sugar nucleotide GDP-'fucose, or sugar chain modification in which position 1 of fucose is ⁇ -linked to position 6 of ⁇ ⁇ -acetyldarcosamine at the reducing end of ⁇ -glycoside-linked complex type glycan The term "genome modified to inactivate the given enzyme” means that a mutation is introduced into the expression control region of the gene so that the expression of the enzyme is deleted, or the function of the enzyme is deleted. This refers to introducing a mutation into the amino acid sequence of the gene. Introduction of mutation refers to deletion, substitution, insertion and And / or addition of a base sequence, which is called knockout to completely suppress the expression or function of a modified genomic gene.
  • a specific example in which a genomic gene is knocked out is an example in which all or a part of a target gene has been deleted from the genome.
  • the exon genomic region containing the start codon of the target gene can be removed from the chromosome to obtain a noquart state.
  • any method can be used as long as the desired genome can be modified.
  • a method of deleting the above enzyme activity is a method of deleting the above enzyme activity.
  • any lectin that can recognize the sugar chain structure can be used.
  • Lectins can also be used. Specific examples thereof include lentil lectin LCA (Lentil Agglutinin from Lens Culinaris) Endoma lectin PSA (Pea Lectin from Pisum sativum), Broad bean lectin VFA Agglutinin from YVicia faba YU. Lectin from AleTiria aurantia can be mentioned.
  • Lectin-resistant cells are cells whose growth is not inhibited even when an effective concentration of lectin is given.
  • the effective concentration is a concentration at which cells before the genomic gene is modified (hereinafter also referred to as “parent cell”) cannot grow normally, and preferably a concentration at which the cells before the genomic gene is modified cannot grow. , More preferably 2 to 5 times, further preferably 10 times, most preferably 20 times or more. .
  • the effective concentration of the lectin that does not inhibit the growth may be appropriately determined depending on the cell line, but is usually 10 g / ml to 10 ing / ml, preferably 0.5 mg / m! ⁇ 2.0 mg / ml.
  • the cell before the genomic gene is modified is the enzyme involved in the synthesis of the intracellular sugar nucleotide GDP-fucose, or the N-glycidyl-linked complex type sugar chain reducing terminal N-acetyldarcosamine at position 6.
  • cells before applying a method for altering the genomic gene of an enzyme involved in sugar chain modification in which position 1 of fucose is ⁇ -linked are not particularly limited, but for example, the following cells are good examples.
  • NS0 cells before the genomic gene is modified include Bio / Technology (BIO / TECHNOLOGY), 10, 169 (1992), and Biotechnology (Bioteclmol. Bioeng.), 73, 261. , (2001) and the like.
  • NS0 cell lines RB0213 registered with the RIKEN Cell Development Bank, or sublines obtained by transforming these strains into various serum-free media.
  • ATCC American Type Culture Collection
  • ATCC CRL-1581 American Type Culture Collection
  • Rui obtained by naturalizing these strains in various serum-free media Sub-strain (ATCC CRL-1581.1) and the like.
  • Parental cells of CHO cells derived from Chinese hamster ovary tissue before the genomic gene is modified include Journal of Experimental Medicine, 108, 945 (1958), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 60, 1275 (1968), Genetics, 55, 513 (1968), Chromosoma, 41, 129 (1973), Methods in Cell Science, 18, 115 (1996), Radiation Research, 148, 260 (1997), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 4216 (1980), Proc. Natl. Acad. Sci.
  • CHO-K1 strains ATCC CCL-61
  • CHO / dhfr- strains ATCC CRL-9096
  • Pro-5 strains ATCC CRL-1781 registered with ATGC
  • commercially available CHOS strains Ltfetechiiologies Cat # 11619
  • BHK-21 strains (ATCC CCL-10) registered with the ATCC, or substrains obtained by adapting these strains to various serum-free media.
  • a transformant obtained by introducing a gene encoding antithrombin III into a CHO cell in which a gene encoding al, 6-fucosyltransferase is knocked out is used.
  • PKAN-ATIIIl GMDKO strain which is a strain adapted to a serum medium, and the like.
  • antithrombin III mutant Asparagine at position 135 in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 which is a mutant having the same biological activity as the naturally occurring antithrombin III compound of the present invention (hereinafter referred to as antithrombin III mutant)
  • cells that produce a mutant in which glutamine is substituted for glutamine include CHO cells in which the gene encoding al, 6-fucosyltransferase has been knocked out.
  • P KAN-ATinN135Q AFMS705 a strain obtained by adapting a transformant into which a gene encoding a thrombin III mutant was introduced into a serum-free medium, and a gene encoding GDP-mannose 4,6-dehydratase were knocked out.
  • a PKAN-ATIIIN135Q6 GMDKO strain which is a strain obtained by transforming a transformed CHO cell into which a gene encoding the antithrombin III mutant represented by SEQ ID NO: 40 has been introduced into a serum-free medium, can be mentioned.
  • pKAN-ATIIIN135Q AFMS705 strain and the pKAN-A niNl35Q6 GMDKO strain were filed on August 10, 2004, under the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Organism Depositary (Tsukuba-Higashi 1-1, Tsukuba, Higashi, Ibaraki, Japan) FERM BP-10089 and FERM BP-1008 have been deposited at Address 1 Central No. 6). '
  • an antithrombin III composition having a biological activity equivalent to that of naturally occurring antithrombin III can be produced.
  • fucose is not bound to N-acetylglucosamine at the reducing end of the N-glycoside-linked complex type sugar chain of the antithrombin III composition means that fucose cannot be substantially detected in the sugar chain analysis described below. About the case.
  • substantially undetectable refers to a level below the detection limit of measurement.
  • the biological activities of antithrombin III include heparin binding activity, anticoagulant activity and the like. ⁇
  • the binding activity of the antithrombin III composition to heparin and the anticoagulant activity can be determined by in vitro tests such as a known antithrombin activity measurement method or heparin cofactor 1 activity measurement method, or generalized intravascular blood coagulation.
  • Group Dissectionated intravascular coagulation syndrome j can be measured using in vivo tests using moal animals, etc.
  • the Second Series of Pharmaceutical Research and Development Volume 20 Blood Product Ikuo Suzuki, ed., Hirokawa Publishing Company, Tokyo , Japan, 1992; History of Medicine, 120, 1147, 1982; Pharmacology and Therapy, 5843, 1989; Clinical and Research 62, 3573, 1985; Clinical and Research fi3 ⁇ 43688, 1985; Applied Pharmacology 30, 589, 1985).
  • Host cells used to produce the antithrombin III composition can be prepared by the method described below.
  • the host cell used to prepare the antithrombin III composition may be an enzyme involved in the synthesis of an intracellular sugar nucleotide, GDP-fucoses, or N-acetylglucosamine, an N-glycoside-linked complex type sugar chain reducing end.
  • the target is a gene of an enzyme involved in sugar chain modification in which position 1 of fucose is ⁇ -linked (hereinafter referred to as “enzymes related to fucose modification”) and is prepared by using a gene disruption method. be able to.
  • the enzymes involved in the synthesis of intracellular sugar nucleotide GDP-fucose include, specifically, GDP-mannose 4,6-dehydratase (hereinafter referred to as “GMD”), GDP-4-keto-6-dexoxy- D-mannose-3,5-epimerase (hereinafter referred to as “Fx”).
  • GMD GDP-mannose 4,6-dehydratase
  • Fx GDP-4-keto-6-dexoxy- D-mannose-3,5-epimerase
  • N-glycoside-linked complex type sugar chain Enzymes involved in sugar chain modification in which fucose at position 6 is a-linked to position 6 of N-acetylglucosamine at the reducing end are specifically al, 6-fucosyltransferase, ⁇ -L-fucosidase and the like.
  • the gene includes DNA or RNA.
  • the method for gene disruption includes any method capable of disrupting the gene of the target enzyme. Examples include the antisense method, the ribozyme method, the homologous recombination method, the NA-DNA oligonucleotide method (hereinafter referred to as “RDO method”), the RNA interference method (hereinafter “RNAi method”). Notation), a method using a retrovirus, a method using a transposon, and the like. These are described below in detail. '
  • the host cells used to produce the antithrombin III composition target various enzyme genes related to fucose modification, and are described in Cell Engineering, 12, 239 (1993), BIO / TECHNOLOGY, 17 , 1097 (1999), Human Molecular Genetics (Hum. Mol. Genet.), 5, 1083 (1995), Cytology, IS, 255 (1994), Proceedings of the National Academy. Natl. Acad. Sci. USA, 96, 1886 (1999) and the like, using the antisense method or the ribozyme method, for example, can be prepared as follows. -'
  • an appropriate length antisense gene or ribozyme construct containing a DNA portion encoding various enzymes involved in fucose modification, a non-translated region portion or an intron portion is designed.
  • a recombinant DNA vector is prepared by inserting the prepared DNA fragment or full length downstream of the promoter of an appropriate expression vector.
  • a transformant is obtained by introducing the recombinant vector into a host cell suitable for the expression vector.
  • a host cell used for producing the antithrombin III composition By selecting a transformant using the activity of various enzymes related to fucose modification as an index, a host cell used for producing the antithrombin III composition can be obtained. Further, by selecting a transfection using the sugar chain structure of the glycoprotein on the cell membrane or the sugar chain structure of the produced glycoprotein molecule as an index, a host cell used for producing the antithrombin III composition of the present invention can be obtained. You can also.
  • Antithrombin ⁇ Host cells used to produce the composition 'include yeast, animal cells, insect cells, plant cells, etc. that have genes for various enzymes related to the targeted fucose modification. Any of them can be used. Specific examples include the host cells described in 2 below.
  • the expression vector should be capable of autonomous replication in the host cell described above, or be capable of integration into the chromosome, and contain a promoter at a position where the designed antisense gene or lipozyme can be transcribed. Is used. Specific examples include the expression vector described in 2 below. As a method for introducing a gene into various host cells, the method for introducing a recombinant vector suitable for various host cells described in 2 below can be used. '
  • Examples of a method for selecting a transformant based on the activity of various enzymes related to fucose modification include the following methods.
  • Methods for selecting cells lacking the activity of various enzymes related to fucose modification include: Laboratory Course 3—Glycoprotein I, Glycoprotein (Tokyo Kagaku Dojin), The Biochemical Society of Japan (1988)], Literature [Cell Engineering, Separate Volume, Experimental Protocol Series, Glycobiology Experimental Protocol, Glycoprotein 'Glycolipid / Proteoglycan (Hidejune ⁇ ) Naoyuki Taniguchi, Akemi Suzuki, Kiyoshi Furukawa, Supervised by Kazuyuki Sugawara (1996)], Molecular 'Cloning 2nd Edition, Current' Protocols 'in' Molecular Biology, etc.
  • the method of measuring the activity of enzymes related to fucose modification using a simple method or a genetic engineering method includes, for example, a method of evaluating enzyme activity using an enzyme-specific substrate.
  • biochemical methods include, for example, a method of evaluating enzyme activity using an enzyme-specific substrate.
  • genetic engineering method include Northern analysis for measuring the mRNA amount of an enzyme gene and RT-PCR.
  • a method for selecting a transformant using the sugar chain structure of a glycoprotein on a cell membrane as an index includes, for example, the method described in 1 (5) below.
  • Examples of a method for selecting a transformant using the sugar chain structure of the produced glycoprotein molecule as an index include the method described in 3 below in 4 or 5 below.
  • Methods for preparing cDNAs encoding enzymes related to fucose modification include, for example, the methods described below. -Preparation of cDNA
  • Total RNA or mRNA is prepared from tissues or cells of various host cells.
  • a gene is prepared that produces a degenerative primer and uses the prepared cDNA library as a type III gene to encode various enzymes related to fucose modification by PCR. Get the fragment.
  • a cDNA library can be screened to obtain DNAs encoding enzymes related to fucose modification.
  • the mRNA of a human or non-human animal tissue or cell may be a commercially available product (for example, manufactured by Clontech), or may be prepared from a human or non-human animal tissue or cell as follows.
  • Methods for preparing total RNA from human or non-human animal tissues or cells include the guanidine thiocyanate-cesium trifluoroacetate method (Methods in Enzymology, 154, 3 (1987) 1, acidic Guanidine cyanate phenol, 'clo mouth' form (AGPC) method [Analytical Biochemistry, 162, 156 (1987); Experimental gology, 1937 (1991)].
  • mRNA can be prepared by using a commercially available kit such as Fast Track mRNA Isolation Kit (Invitrogen) or Quick Prep mRNA Purification Kit (Pharmacia).
  • a cDNA library is prepared from the prepared human or non-human animal 'tissue or cell mRNA.
  • the methods for preparing a cDNA library include the methods described in Molecular 'Cloning 2nd edition, Current, Protocols' in' Molecular Biologics, A Laboratory Manual, 2nd Ed. (1989), or commercially available.
  • phage vector or plasmid vector As a cloning vector for preparing cDNA libraries, self-supporting Any phage vector or plasmid vector can be used as long as it can be produced. Specifically, ZAP Express [STRATAGE E, Strategies, 58 (1992)], pBluescript II SK (+) [Nucleic Acids Research, 17, 9494 (1989)] , ⁇ II
  • any microorganism can be used, but Escherichia coli is preferably used. Specifically, Escherichia coli XLl-Blue MRF '
  • This cDNA library may be used as is for subsequent analyses, but in order to reduce the proportion of incomplete-length cDNAs and obtain full-length cDNAs as efficiently as possible, the oligocap method developed by Sugano et al. Gene, 138, 171 (1994); Gene, 200, 149 (1997); Protein nucleic acid enzyme, 41, 603 (1996); Experimental medicine, 11, 2491 (1993); cDNA cloning (sheep Sat 3 ⁇ 4) (1996); Preparation of Gene Library (Yodosha) (1994)].
  • a diene-enriched primer specific to the nucleotide sequence at the 5 ′ end and 3 ′ end of the nucleotide sequence predicted to encode the amino acid sequence was prepared.
  • amplifying the DNA using PCR method [PC Protocols (PCR Protocols), Academic Press (1990)]
  • the enzymes related to fucose modification can be identified.
  • An encoding gene fragment can be obtained. '
  • the fact that the obtained gene fragment is a DNA encoding enzymes related to fucose modification can be determined by a commonly used nucleotide sequence analysis method, for example, the dideoxy method of Sanger et al. [Proceedings-Ob the National Analysis by using a nucleotide sequence analyzer such as Academy of Sciences (Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 74, 5463 (1977)] or ABI PRISM377 DNA Sequencer (Applied Biosystems). You can check.
  • colony hybridization or plaque hybridization can be performed from cDNA or a cDNA library synthesized from mRNA contained in tissues or cells of human or non-human animals. 2nd edition) can be used to obtain DNA of various enzymes related to fucose modification.
  • a cDNA or cDNA library synthesized from mRNA contained in human or non-human animal tissues or cells is used as a type I cDNA.
  • cDNAs of various enzymes related to fucose modification can be obtained by amplification using PCR.
  • the nucleotide sequence of the obtained DNA encoding various enzymes related to fucose modification can be determined by a commonly used nucleotide sequence analysis method, for example, the dideoxy method of Sanger et al. [Proceedings' ob 'the' national academy. O Bed. Science (p roc. Natl. Acad. Sci. USA), 74, 5463 (1977)] there have is by analyzing using a base sequence analysis apparatus such as ABI PRISM377DNA Shikuensa one (Applied Biosystems, Inc.) The nucleotide sequence of the DNA can be determined.
  • a base sequence database such as Genbank, EMBL and DDBJ is searched using a homology search program such as BLAST, so that the obtained DNA is included in the genes in the database. It can also be confirmed that the gene encodes various enzymes related to fucose modification.
  • the nucleotide sequence of a gene encoding an enzyme involved in the synthesis of intracellular sugar nucleotid GDP-fucose obtained by the above method includes, for example, the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 7 or 9.
  • nucleotide sequence of a gene encoding an enzyme involved in sugar chain modification in which the 1-position of fucose is ⁇ -linked to the 6-position of N-acetyldarcosamine at the reducing end of N-glycoside-linked complex type sugar chain obtained by the above method Is, for example, the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 11 or 12.
  • various DNAs related to fucos modification can be chemically synthesized using a DNA synthesizer such as ⁇ model 392 (Perkin Elmer) using the phosphoramidite method. Enzyme cDNA can also be obtained.
  • Examples of a method for preparing genomic DNA of various enzymes related to fucose modification include the methods described below.
  • genomic DNAs of enzymes related to fucose modification can also be obtained.
  • the obtained salt tomb sequence of the DNA encoding the enzymes related to the fucose modification can be obtained by a commonly used nucleotide sequence analysis method, for example, the dideoxy method of Sanger et al. [Proceedings of the National Academy of Sciences]. Natl. Acad. Sci. USA, 24, 5463 (1977)] or ABI PRISM377 DNA sequencer (Applied Biosystems) or other base sequence analyzer.
  • the nucleotide sequence of the DNA can be determined.
  • a homology search program such as BLAST is used to search the base sequence database such as Genbank, EMBL and DDBJ, and the obtained DNA is found in the database. It can also be confirmed that the gene encodes enzymes related to fugose modification among the above genes.
  • the genome of various enzymes related to fucose modification can be obtained by chemically synthesizing DNA using a phosphoramidite method using a DNA synthesizer such as ⁇ model 392 (manufactured by Perkin Elmer). DNA can also be obtained.
  • nucleotide sequence of the genomic DNA of the enzyme involved in the synthesis of the intracellular sugar nucleotide GDP-fucose obtained by the above method include, for example, the ume group sequence described in SEQ ID NOS: 15, 16, 17, and 18.
  • the base sequence of the genomic DNA of the enzyme involved in the modification of the sugar chain in which the 1-position of fucose is ⁇ -linked to the 6-position of N-acetylglycosamine at the reducing end of N-glycoside-linked complex type sugar chain obtained by the above method Is for example, the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 19.
  • ⁇ Anti-thrombin III composition can be obtained by directly introducing antisense oligonucleotides or ribozymes designed based on the base sequences of enzymes involved in fucose modification without using an expression vector into host cells. A host cell used for producing a product can also be obtained.
  • the antisense oligonucleotide or ribozyme can be prepared by a conventional method or a DNA synthesizer. Specifically, of the nucleotide sequences of cDNA and genomic DNA encoding various enzymes related to fucose modification, continuous 5 to 150 bases, preferably 5 to 60 bases, more preferably 10 to 40 bases Based on the sequence information of an oligonucleotide having a sequence corresponding to a base, an oligonucleotide corresponding to a sequence complementary to the oligonucleotide (antisense oligonucleotide) or a ribozyme containing the sequence of the oligonucleotide is synthesized and prepared. be able to.
  • Oligonucleotides include oligo RNA and derivatives of the oligo nucleotide (hereinafter referred to as oligo nucleotide derivatives) and the like.
  • Oligonucleotide derivatives include oligonucleotide derivatives in which the phosphodiester bond in the oligonucleotide has been converted to a phosphorothioate bond, and phosphodiester bonds in the oligonucleotide in which the N 3 ′ -P 5 ′ phosphoramidate Oligonucleotide derivatives converted to bonds, oligonucleotide derivatives in which ribose and phosphodiester bonds in oligonucleotides are converted to peptide nucleic acid bonds, and oligonucleotides in which peracyl in oligonucleotides are substituted with C-5 propynyl peracyl Reotide derivatives, derivatives in which peracyl in oligonucleotides is replaced by C-5 thiazole peracyl Oligonucleotides, in oligonucleotides!
  • Oligonucleotide derivative in which syn is substituted with C-5 propynylcytosine oligonucleotide derivative in which cytosine in oligonucleotide is substituted with phenoxazine-modified cytosine, ribose in oligonucleotide is 2'-0- Oligonucleotide derivatives substituted with propylribose, or oligonucleotide derivatives in which ribose in the oligonucleotide is replaced with 2′-methoxyethoxyribose, etc. [Cell Engineering, 16, 1463 (1997)].
  • Genome DNA of enzymes related to fucose modification.
  • the target gene to be modified (for example, Prepare a target vector for homologous recombination of the enzyme structural gene or promoter gene).
  • the anti-thrombin III composition can be prepared.
  • any of yeast, animal cells, insect cells, plant cells, and the like can be used as long as they have genes of various enzymes related to the target fucose modification. Specific examples include the host cells described in 2 below.
  • Examples of the method for preparing genomic DNA of various enzymes related to fucose modification include the method for preparing genomic DNA described in (1) (a) above.
  • the nucleotide sequence of the genome of the enzyme involved in the synthesis of the intracellular sugar nucleotide GDP-fucose obtained by the method described above is, for example, the nucleotide sequence of SEQ ID NOS: 15, 16, 17, and 18. It is. '-As the base sequence of the genomic DNA of the enzyme involved in sugar chain modification in which the position 1 of fucose is ⁇ -linked to the 6-position of N-acetylglucosamine at the reducing end of N-glycoside-linked complex type sugar chain obtained by the above method For example, the base sequence of SEQ ID NO: 19 can be mentioned. .
  • any of a replacement type and an insertion type can be used. .
  • the method for introducing a recombinant vector suitable for various host cells described in 2 below can be used.
  • Methods for efficiently selecting homologous recombinants include, for example, Gene Targeting, A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press (1993), Biomanual Series 8, Gene Gating, Mutant Mouse Using ES Cells. Methods such as positive selection, promoter selection, negative selection, and poly A selection described in Production (Yodosha) (1995) can be used. Methods for selecting the desired homologous recombinant from the selected cell lines include the Southern hybridization method for genomic DNA (Molecular 'Cloning 2nd edition) and the PCR method [PCR] ⁇ Protocols (PCR Protocols), Academic Press (1990)].
  • the host cells used to prepare the antithrombin III composition can be prepared as follows using the RD0 method, targeting genes of enzymes related to fucose modification.
  • CDNAs or genomic DNAs of various enzymes related to fucose modification are prepared by the method described in the above (1) (a) (1).
  • an RD0 construct of appropriate length, including portions encoding various enzymes involved in fucose modification, untranslated regions, or introns. Introduce the synthesized RDO into host cells and target the enzymes, that is, enzymes related to fucose modification By selecting a transformant in which a mutation has occurred, a host cell for preparing an antithrombin III composition can be prepared.
  • any of yeast, animal cells, insect cells, plant cells, and the like can be used as long as they have genes of various enzymes involved in the fucose modification to be targeted. Specific examples include the host cells described in 2 below. '
  • Examples of the method for preparing genomic DNA of various enzymes related to fucose modification include the method for preparing genomic DNA described in (a) of (1) above.
  • the DNA base sequence is digested with an appropriate restriction enzyme or the like, and then subcloned into a plasmid such as pBluescript S (-) (manufactured by Stratagene), followed by a commonly used base sequence analysis method, for example, Sanger et al.
  • a reaction such as the dideoxy method [Proceedings of the National Academy of Sciences' Ob Science (Proc. Natl. Acad. Sci., USA), 74, 5463 (1977)], etc.
  • a base sequence analyzer such as ABI PRISM377 DNA Sequencer (manufactured by Applied Biosystems).
  • RDO can be prepared by a conventional method or by using a DNA synthesizer.
  • Methods for introducing RDO into host cells and selecting cells in which genes for the target enzyme and various enzymes related to fucose modification have been mutated include Molecular 'Cloning 2nd Edition, Current' Protocols in ' Methods for directly detecting mutations in the gene on the chromosome described in Molecular Biology, Biology, etc.
  • a method for selecting a transformant using the activity of various enzymes related to the introduced fucose modification as described in the above (1) (a) (1);
  • a method for selecting a transformant using the sugar chain structure of a glycoprotein as an index, or a method for selecting a transformant using the sugar chain structure of a production-converted protein molecule described in 4 or 5 below as an index can also be used.
  • the RDO construct is described in Science, 273, 1386 (1996); Nayya's Medicin (Nature Medicine), 4, 285 (1998); Hepatology, 25, 1462 (1997); 'Therapy! ⁇ 1 (Gene Therapy), 5, 1960 (1999); Gene Therapy, 5, 1960 (1999); Journal of' Molecular 'Medicein (J. Mol. Med.), 75 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96, 8774 (1999); Procedin's 'ob' the. ⁇ National 'Academy' of Science '(Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 96, 8768 (1999); Nucleic Acids Research (Nuc. Acids. Res.), 27, 1323 (1999); Invest.
  • RNAi method Preparation of host cells used to prepare antithrombin III composition by RNAi method
  • the target gene can be prepared using the RNAi method, for example, as follows. 'Prepare cDNA using the method described in (1) (a) of (1) above for enzymes related to fucose modification.
  • RNAi gene construct of an appropriate length, including a part encoding various enzymes related to fucose modification or a part of an untranslated region.
  • a recombinant vector is prepared by inserting the prepared cDNA fragment or its full length downstream of the promoter of an appropriate expression vector.
  • a transformant is obtained by introducing the recombinant vector into a host cell suitable for the expression vector.
  • an antithrombin III composition by selecting transformants based on the activity of various enzymes related to the introduced fucose modification or the sugar chain structure of the produced glycoprotein molecule or the glycoprotein on the cell surface. Can be obtained. .
  • any of yeast, animal cells, insect cells, plant cells, and the like can be used as long as they have genes of various enzymes related to the target fucose modification. Specific examples include the host cells described in 2 below.
  • the expression vector those which can replicate autonomously in the above-mentioned host cells or can be integrated into the chromosome, and which contain a promoter at a position where the designed RNAi gene can be transcribed are used. Specifically, the expression vector described in 2 below can be mentioned.
  • the method for introducing a recombinant vector suitable for various host cells described in 2 below can be used.
  • Examples of a method for selecting a transformant using an activity of various enzymes related to fucose modification as an index include the method described in (a) of (1) of this section (1).
  • a method for selecting a transformant using the sugar chain structure of a glycoprotein on a cell membrane as an index for example, the method described in (5) of this section 1 can be mentioned.
  • Examples of a method for selecting a transformant using the sugar chain structure of the produced glycoprotein molecule as an index include the methods described in 4 or 5 below.
  • an antithrombin III composition can be prepared by directly introducing into a host cell an siRNA (short interfering RNA) gene designed based on the nucleotide sequences of enzymes related to fucose modification without using an expression vector. Can be obtained.
  • siRNA short interfering RNA
  • the siRNA gene can be prepared by a conventional method or a DNA synthesis.
  • siRNA gene can be found in [Nature, 391, 806 (1998); Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, Proc. 15502 (1998); Nature, S2S, 854 (1998); Proceedings of the National Academy of Sciences (Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 96 , 5049 (1999); Cell, 95, 1017 (1998); Procedures, 'Ob the National', 'Academy', 'Science' Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, 13959 (1998); Proceedings of the National Academy's Science, 95, 13959 (1998); Cell Biol.), 270 (2000)].
  • the host cells used to prepare the antithrombin III composition are prepared by using the transposon system described in Nature Genet., 25, 35 (2000), etc.
  • a host cell used for preparing the antithrombin III composition can be prepared by selecting a mutant using the produced glycoprotein molecule or the sugar chain structure of the glycoprotein on the cell membrane as an index.
  • the transposon system is a system that induces mutation by introducing a foreign gene into a chromosome at random, and is generally used as a vector to induce mutation in a foreign gene contained in a transposon.
  • a transposase expression vector for randomly inserting this gene into a chromosome is simultaneously introduced into cells. .
  • transposase Any transposase can be used as long as it is suitable for the sequence of the transposon to be used.
  • any gene can be used as long as it can induce mutation in the DNA of the host cell.
  • any of yeast, animal cells, insect cells, plant cells, and the like can be used as long as they have genes of various enzymes related to the target fucose modification. Specific examples include the host cells described in 2 below.
  • the method for introducing a recombinant vector suitable for various host cells described in 2 below can be used.
  • Examples of a method for selecting a mutant using the activity of various enzymes related to fucose modification as an index include the method described in (a) of (1) of this section 1.
  • 'A a method for selecting a mutant using the sugar chain structure of a glycoprotein on a cell membrane as an index
  • the method described in (5) of this section 1 can be mentioned.
  • Examples of a method for selecting a mutant using the sugar chain structure of the produced glycoprotein molecule as an index include the methods described in 4 or 5 below.
  • Host cells used to prepare the antithrombin III composition can be prepared by targeting the genes of enzymes related to fucose modification and introducing a dominant negative form of the enzymes.
  • Specific examples of enzymes involved in the synthesis of intracellular sugar nucleotide GDP-fucose include GMD and Fx.
  • Enzymes 1-position of fucose to 6-position of the N- Darikoshido binding complex type sugar chain of N- Asechirugurukosa Min is involved in sugar chain modification to bind alpha, specifically, alpha 1, 6- off glycosyltransferases , ⁇ -L fucosidase and the like.
  • These enzymes are enzymes that catalyze a specific reaction having substrate specificity, and by destroying the active center of a catalytic enzyme having such substrate specificity, dominant of these enzymes is obtained. Negative bodies can be produced.
  • GMD is used as an example, and its production in a dominant negative form is specifically described below.
  • GMD GMD (SEQ ID NO: 8) derived from CHO cells
  • the dominant negative form can be prepared by substituting threonine at position 155, glutamic acid at position 157, tyrosine at position 179, and lysine at position 183 with another amino acid.
  • Such an amino acid-substituted gene can be prepared using the site-directed mutagenesis method described in Molecular Cloning, 2nd Edition, Current 'Protocols'in' Molecular Biology. it can.
  • the host cell used to prepare the antithrombin III composition uses a gene encoding a dominant negative form of the target enzyme prepared as described above (hereinafter abbreviated as a dominant-negative form gene), Cloning 2nd edition, current 'protocols' in' molecula 1 'biology, manipulation ⁇ Mouse' enprio 2nd edition, etc. it can.
  • a DNA fragment of an appropriate length containing a portion encoding the protein is prepared, if necessary.
  • a recombinant vector is prepared by inserting the DNA fragment or the full-length DNA downstream of a suitable expression vector.
  • a transformant is obtained by introducing the recombinant vector into a host cell suitable for the expression vector.
  • Hosts used to produce antithrombin III products by selecting transformants based on the activity of various enzymes related to fucose modification or the sugar chain structure of the produced glycoprotein molecule or glycoprotein on the cell membrane Cells can be made.
  • any of yeast, animal cells, insect cells, plant cells, and the like can be used as long as they have genes of various enzymes related to the target fucose modification. Specific examples include the host cells described in 2 below.
  • An expression vector that is capable of autonomous replication in the above-mentioned host cells or capable of integration into the chromosome, and that contains a promoter at a position capable of transcribing the DNA encoding the dominant negative body of interest is used.
  • Can be Specific examples include the expression vectors described in 2 below.
  • the method for introducing a recombinant vector suitable for various host cells described in 2 below can be used.
  • Examples of a method for selecting a transformant based on the activity of various enzymes related to fucose modification include the method described in (1) (a) of (1) below.
  • a method for selecting a transformant using the sugar chain structure of a glycoprotein on a cell membrane as an index includes, for example, the method described in 1 (5) below.
  • Examples of a method for selecting a transformant using the sugar chain structure of the produced glycoprotein molecule as an index include the methods described in 4 or 5 below.
  • the host cells used to produce the antithrombin composition are prepared by introducing mutations into the genes of enzymes related to fucose modification and selecting a desired cell line in which the enzymes have been mutated. It can be manufactured by the following.
  • enzymes involved in the synthesis of intracellular sugar nucleotide GDP-fucose include GMD and Fx.
  • N-glycoside-linked complex-type sugar chain As an enzyme involved in sugar chain modification in which position 1 of fucose is ⁇ -linked to position 6 of N-acetyldarcosamine at the reducing end, specifically, ⁇ ⁇ , 6- Fucosyltransferrase, ⁇ -L-fucosidase, etc. ⁇
  • Methods for introducing mutations into various enzymes related to fucose modification include: 1) various mutations related to fucose modification from mutants obtained by treating the parent strain by mutagenesis treatment or spontaneously occurring mutants.
  • any treatment can be used as long as it induces a point mutation, deletion or frameshift mutation in the DNA of the cell line of the parent strain.
  • Spontaneously occurring mutants include those that occur spontaneously by continuing subculturing under normal cell culture conditions without special mutagenesis treatment. it can.
  • Examples of a method for measuring the activity of various enzymes related to fucose modification include the method described in (a) of (1) of this section 1.
  • Methods for identifying the sugar chain structure of the produced glycoprotein molecule include, for example, the methods described in 4 and 5 below.
  • As a method for identifying the sugar chain structure of the glycoprotein on the cell membrane for example, the method described in 1 (5) of this section can be mentioned.
  • the host cells used to produce the anthrombin III composition of the present invention target the genes of enzymes related to fucose modification, and use antisense RNA / DNA technology [Bioscience and Industry, 322 (1992), Danigaku, 681 (1991), Biotechnology, 9, 358 (1992), Trends in BiotechnologylO, 87 (1992), Trends in BiotecloiologylO, 152 (1992), Cell engineering, 16, 1463 (1997)], Triple 'helix Using the technology [Trends in Biotechnology 10, 132 (1992)] and the like, it can be produced by suppressing the transcription or translation of the target gene.
  • N-glycoside-linked complex type sugar chain As an enzyme involved in sugar chain modification in which the 6-position of fucose is ⁇ -linked to the 6-position of N-acetylglucosamine at the reducing end, specifically, ⁇ ⁇ , 6-fucosylt Transferase, ⁇ -L-fucosidase and the like.
  • the host cell used to prepare the antithrombin III composition is a lectin that recognizes the sugar chain structure in which the 6-position of ⁇ ⁇ -acetylglycosamine at the reducing end of ⁇ -glycoside-linked glycan and the 1-position of fucose are ⁇ -linked. It can be prepared by using a technique for selecting a strain that is resistant.
  • Methods for selecting strains that are resistant to lectins that recognize a sugar chain structure in which the 6-position of ⁇ ⁇ -glycolamine at the reducing end of ⁇ -glycoside-linked sugar chain and the 1-position of fucose are ⁇ -linked include, for example, A method using a lectin described in Somatake-Cell 'and' Molecular Genetics (Somatic Cell Mol. Genet.), 12, 51 (1986). '
  • any lectin can be used as long as it recognizes a sugar chain structure in which the 6-position of ⁇ ⁇ -glycidyl-linked glycan at the reducing end of ⁇ -glycoside-linked sugar chain and the 1-position of fucose are ⁇ -linked.
  • Specific examples include lentil lectin LCA (Lentil Agglutinin from LensCulinaris) Endumame lectin PSA (Bea Lectin from Pisum sativum), Zebra bean lectin VFA (Vicia faba from Agglutinin Hylochawanta lectin AAL) (Lectin from Aleuriaaurantia).
  • surviving cells cultured in a medium containing the above lectin at a concentration of 1 pg / mL to 1 mg / mL for 1 day to 2 weeks, preferably for 1 day to 1 strain are passaged.
  • the 6-position of fucose and the 6-position of N-acetylglycosamine at the reducing end of the N-glycoside-linked sugar chain of the present invention are A strain that is resistant to a lectin that recognizes an ⁇ -linked sugar chain structure at position 1 can be selected.
  • Antithrombin III compositions are described in Molecular 'Cloning 2nd Edition, Current' Protocol 'in' Molecular and Nooroshi, Antibodies, A Laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988 (hereinafter abbreviated as Antibodies). ), Monoclonal Antibodies: principles and practice, Third Edition, Acad. Press, 1993 (hereafter abbreviated as monoclonal antibodies), Antibody Engineering, A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press, 1996 (hereafter abbreviated as antibody engineering). Can be obtained by expressing in a host cell as follows, for example.
  • a full-length cDNA of an antithrombin III molecule is prepared, and a DNA fragment of an appropriate length containing a portion encoding the antithrombin III molecule is prepared. .
  • the recombinant vector is prepared by inserting the DNA fragment or the full-length cDNA downstream of the promoter of an appropriate expression vector.
  • a transformant producing an antithrombin III molecule By introducing the recombinant vector into a host cell suitable for the expression vector, a transformant producing an antithrombin III molecule can be obtained.
  • any of yeast, animal cells, insect cells, plant cells and the like can be used as long as it can express the desired gene.
  • Select cells that lack the activity of enzymes involved in the modification of the N-glycoside-linked sugar chain that binds to the antithrombin III molecule ie, cells that lack the activity of various enzymes related to fucose modification.
  • Cells obtained by artificial techniques can also be used as host cells.
  • Expression base s Kuta one allows integration into the host cell autonomous replicable or chromosome in, those containing a promoter at a position appropriate for the transcription of DNA encoding the antithrombin ⁇ molecule of interest Used.
  • -cDNA can be obtained from human or non-human animal tissues or cells by using a probe or primer specific for the antithrombin III molecule of interest according to the method for preparing cDNA described in (a) of (1) above. It can be prepared using -When yeast is used as a host cell, examples of expression vectors include YEP13 (ATCC, 37115), YEp24 (ATCC 37051), YCp50 (ATCC 37419) and the like.
  • promoters for glycolytic genes such as hexose kinase, PH05 promoter, PGK promoter, etc. GAP promoter, ADH promoter, gal1 promoter, gal10 promoter, heat shock protein promoter, MFcil promoter, CUP1 promoter and the like. .
  • Examples of the host cell include microorganisms belonging to the genera Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Krybetia spp., Trichosporon, and Schuniomyces, such as Saccharomvces cerevisiae. Schizosaccharomyces pombe ⁇ Kluyver omyce s lactis. s aliUYill ⁇ etc.
  • any method for introducing DNA into yeast can be used.
  • an electoporation method [Methods. EnzvmoD.194.182 (1990) ]
  • the Spheroplast method [Procedings of the 'National-Academia of the Science' (Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 84, 1929 (1978)]
  • the lithium acetate method J. Bacteriology. 153.163 (1983)]
  • Proceedings of the National Academy of Sciences Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 75. , 1929 (1978)].
  • the expression vector may be, for example, pcDNAI, pcDM8 (commercially available from Funakoshi), pAGE107 [JP-A-3-22979; Cytotechnology, 3, 133, (1990). )], PAS3-3 [Purpose 2-227075], pCI) M8 [Nature, 329, 840, (1987)], pcDNAI / Am (Invitrogen), REP4 (Invitrogen), AGEl03 [Journal of Biochemistry, Arashi, 1307 (1987)], pAGE210, and the like.
  • any promoter can be used as long as it can be expressed in animal cells.
  • the promoter of the IE (immediate early) gene of cytomegalovirus (CMV) the early promoter of SV40, and the promoter of retrovirus And meta-mouth thionein promoter, heat shock promoter, SRa promoter and the like.
  • an enhancer of the IE gene of human CMV may be used together with the promoter.
  • Host cells include Namalwa cells, human cells, COS cells, monkey cells, CHO cells, Chinese hamster cells, HBT5637 (JP-A-63-299), rat myeloma cells, mouse myeloma. Cells, Syrian hamster kidney-derived cells, embryonic stem cells, fertilized egg cells, and the like.
  • Any method for introducing a recombinant vector can be used as long as it is a method for introducing DNA into animal cells.
  • the elect D method (Cytotecknology, 3, 133 (1990))
  • the calcium phosphate method Japanese Unexamined Patent Publication No. 2-27075
  • the Lipofexion method [Proceedings of the National Academy. O drive. Science (p roc. Natl. Acad. Sci. USA), 84, 7413 (1987)]
  • the injection method [Manipulating rating. The. mouse 'Enburio' ⁇ laboratory one manual]
  • particle gun hereitage [Patent No. 2606856, Patent No.
  • DEAE-Dextrassi method Bio-Manual Series 41 Gene Transfer and Expression 'Analysis method (Yodosha) Yokota Takashi-Arai Ken-ichi (1994)]
  • Virus vector method [manipulating 'mouse' embryo 2) 3 ⁇ 4] and the like.
  • insect cells for example, current 'protocols'in' Molecular Nolon Baculovirus Expression Vectors, A Laooratory Manual, WH freeman and Company, New York (1992), Bio / Teclmology), 6, 47 (1988) and the like.
  • a recombinant gene transfer vector and a baculovirus are co-transfected into insect cells to obtain a recombinant virus in an insect cell culture supernatant, and the recombinant virus is further transmitted to insect cells to express proteins.
  • a recombinant gene transfer vector and a baculovirus are co-transfected into insect cells to obtain a recombinant virus in an insect cell culture supernatant, and the recombinant virus is further transmitted to insect cells to express proteins.
  • Examples of the gene transfer vector used in the method include pVL1392, pVL1393, and pBlueBacIII (all manufactured by Invitorogen).
  • baculovirus for example, Autographa californica nuclear polyhedrosis virus, which is a virus that infects night moth insects, can be used.
  • Insect cells include Sf9 and Sf21, which are ovarian cells of Spodoptera frugiperda '[current' protocol-lesin 'in' morecu-fu 'and' northology 'Baculovirus iixpression Vectors, A Laboratory Manual, WH Freeman and Company New York (1992)], Trichoplusiani Ovarian cell High 5 (manufactured by Invitrogen) or the like can be used.
  • Methods for co-transfection of the above-mentioned recombinant gene transfer vector and the above-mentioned PacuMouth virus into insect cells to prepare a recombinant virus include, for example, the calcium phosphate method (Japanese Patent Application No. 2-227075), the lipofection method [Procedure Ding's Op The National Academy of Sciences (Pro Natl. Acad. Sci. USA), 84, 7413 (1987)].
  • examples of the expression vector include a Ti plasmid and a bacco mosaic virus vector.
  • any promoter can be used as long as it can be expressed in plant cells.
  • examples thereof include the 35S promoter of cauliflower mosaic virus (CaMV) and inactin-1 promoter. '
  • host cells include plant cells such as tobacco, potato, tomato, carrot, soybean, oilseed rape, alfalfa, rice, wheat, oats, cornflower, and duckweed.
  • any method can be used as long as it is a method for introducing DNA into plant cells.
  • Agrobacterium Japanese Patent Application Laid-Open No. 59-140885, Japanese Patent Application Laid-Open No. 60-70080
  • WO94 / 00977 elect-mouth polish method
  • a method using a particle gun (gene gun) Japanese Patent No. 2606856, Japanese Patent No.
  • a method for expressing a gene in addition to direct expression, secretory production, fusion protein expression between the Fc region and another protein, and the like can be performed according to the method described in Molecular 'Cloning, 2nd edition.
  • an antithrombin molecule with a sugar or sugar chain added by the introduced gene is obtained.
  • -An antithrombin III composition can be produced by culturing the transformant obtained as described above in a medium, producing and accumulating antithrombin III molecule in the culture, and collecting from the culture. .
  • the method for culturing the transformant in a medium can be performed according to a usual method used for culturing host cells.
  • a culture medium for culturing a transformant obtained by using a eukaryote such as yeast as a host contains a carbon source, a nitrogen source, inorganic salts, and the like that can be used by the organism to efficiently culture the transformant.
  • a natural medium or a synthetic medium can be used as long as the medium can be used in a medium.
  • the carbon source may be any one that can be assimilated by the organism, such as glucose, fructose, sucrose, molasses containing these, carbohydrates such as starch or starch hydrolysate, and organic acids such as acetic acid and propionic acid. And alcohols such as ethanol and propanol.
  • Nitrogen sources include ammonia, ammonium chloride, ammonium sulfate, ammonium acetate, ammonium phosphate and other inorganic or organic acid ammonium salts, other nitrogen-containing compounds, and peptone, meat extract, yeast extract, corn steep liquor, Casein hydrolyzate, soybean meal, soybean meal hydrolyzate, various fermented cells and digests thereof can be used.
  • potassium phosphate monobasic, potassium phosphate dibasic, magnesium phosphate, magnesium sulfate, sodium chloride, ferrous sulfate, manganese sulfate, copper sulfate, calcium carbonate and the like can be used.
  • the culture is usually performed under aerobic conditions such as shaking culture or deep aeration stirring culture.
  • the culture temperature is preferably 15 to 40 ° C, and the culture time is usually 16 hours to 7 days.
  • the pH during culture is maintained at 3.0-9.0.
  • the pH is adjusted using an inorganic or organic acid, an alkaline solution, urea, calcium carbonate, ammonia, or the like.
  • an antibiotic such as ampicillin / tetracycline may be added to the medium during the culture.
  • an inducer may be added to the medium, if necessary.
  • an inducer may be added to the medium, if necessary.
  • cultivating a microorganism transformed with isopropyl-BD-thiogalactopyranoside or the like using a recombinant vector using the trp promoter can be used.
  • indoleacrylic acid may be added to the medium.
  • a commonly used RPMI1640 medium [The Journal of the American Medical Association [The Journal of the American Medical Association] 199. 519 (1967)]
  • Eagle's MEM medium [Science. 122. 501 (1952)]
  • Dulbecco's modified MEM medium [Virology, 8, 396 (1959)]
  • 1 9 9 Medium [Proceeding of the Society for the Biological.
  • Culture is usually p H 6 ⁇ 8, 3 0 ⁇ 4 0 ° C, 5% C0 2 in matter under such presence; performed 1-7 days!.
  • antibiotics such as kanamycin and penicillin may be added to the medium during the culture.
  • TNM-FH medium Pharmingen
  • Sf900 II SFM medium Sf900 II SFM medium
  • ExCell400 ExCell405
  • All can be made by JEH Biosciences
  • Culture is usually performed under conditions of pH 6-7, 25-30 ° C, etc .; Do it for ⁇ 5 days.
  • an antibiotic such as gentamicin may be added to the medium during the culture.
  • a transformant obtained using a plant cell as a host can be cultured as a cell or after being differentiated into a plant cell or organ.
  • a medium for culturing the transformant a commonly used Murashige-and-Square (MS) medium, a white (White) medium, or a plant hormone such as auxin or cytokinin was added to these mediums.
  • MS Murashige-and-Square
  • White white
  • plant hormone such as auxin or cytokinin
  • the cultivation is usually carried out at pH 5 to 9, 20 to 40 ° C for 3 to 60 days.
  • antibiotics such as kanamycin and hygromycin may be added to the medium during the culture.
  • a transformant derived from a microorganism, animal cell, or plant cell having a recombinant vector into which DNA encoding the antithrombin III molecule has been incorporated is cultured according to a conventional culture method, and an antithrombin III composition is obtained. Is produced and accumulated, and an antithrombin III composition is collected from the culture, whereby an antithrombin III composition can be produced.
  • Methods for producing the antithrombin III composition include a method for producing it in a host cell, a method for secreting it out of the host cell, and a method for producing it on the host cell outer membrane. The method can be selected by changing the structure of the thrombin III molecule.
  • the antithrombin III composition When the antithrombin III composition is produced in the host cell or on the host cell outer membrane, the method of Poulson et al. [Journal of Biologics Chemistry (J. Biol. Cem.), 264.17619 ( 1989)], Law et al. [Proceedings of the National Academy of Sciences (Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 86, 8227 (1989); Gene Development. ), 4, 1288 (1990)] or the method described in JP-A-05-336963, WO94 / 23021, etc., whereby the antithrombin III composition can be positively secreted out of host cells. it can.
  • a DNA encoding an antithrombin III molecule and a DNA encoding a signal peptide suitable for the expression of an antithrombin III molecule are introduced into an expression vector by a gene recombination technique, and the expression is carried out.
  • the target amphetrombin III molecule By expressing the antithrombin III molecule after the introduction of the vector into the host cell, the target amphetrombin III molecule can be actively secreted out of the host cell.
  • the production amount can be increased using a gene amplification system using a dihydrofolate reductase gene or the like.
  • transgenic non-human animal or plant (transgenic plant) into which the gene has been introduced is created.
  • An antithrombin composition can also be produced using these individuals.
  • the transformant is an animal individual or plant individual
  • breeding or cultivation in accordance with a usual method to produce and accumulate an antithrombin III composition, and collecting the antithrombin III composition from the animal individual or plant individual
  • the antithrombin III composition can be produced.
  • Methods for producing an antithrombin III composition using animal individuals include, for example, known methods [American's Journal of Clinical Nutrition], 63, 639S (1996) ); American Journal of Clinical Nutrition, 63, 627S (1996); Noo Z Technology (Bio / Teclinology), 9, 830 (1991) )] To produce a desired antithrombin III ′ composition in an animal constructed by introducing a gene.
  • an antithrombin III composition is produced and accumulated in the animal, and antithrombin is contained in the animal.
  • an anti-thrombin III composition can be produced.
  • Examples of the place of production and accumulation in the animal include milk (JP-A-63-309192), eggs and the like of the animal.
  • Any promoter can be used as long as it can be expressed in animals. Examples of such promoters include ⁇ -casein promoter, ⁇ -casein promoter, and ⁇ -lactoglobulin, which are mammary cell-specific promoters. Promoters, whey acid protein promoters and the like are preferably used.
  • a transgenic plant into which DNA encoding an antithrombin III molecule has been introduced can be prepared by a known method [tissue culture, (1994); 1995); cultivated according to Trends in Biotechnology, 15, 45 (1997)], produced and accumulated an antithrombin composition in the plant, A method of producing an antithrombin III composition by collecting the in composition is mentioned.
  • An antithrombin III composition produced by a transformant into which a gene encoding an antithrombin III molecule has been introduced is, for example, when the antithrombin III composition is expressed in a lysed state in cells, after the completion of the culture, Is collected by eccentric separation, suspended in an aqueous buffer, and then crushed with an ultrasonic crusher, French press, Mannungurin homogenizer, Dynomill, etc. to obtain a cell-free extract.
  • Cation exchange chromatography method hydrophobic chromatography method using resins such as butyl sepharose and phenylsepharose, gel filtration method using molecular sieve, affinity chromatography method, chromatographies
  • a purified sample of the antithrombin III composition can be obtained by using the electrophoresis method such as the electrophoresis method or isoelectric focusing alone or in combination.
  • a specific example is a method using immobilized heparin affinity chromatography developed by Miller-Anderson et al. In 1974 (Thromb. Res.
  • the antithrombin ⁇ composition forms an insoluble substance in the cells and is expressed, the cells are similarly collected, crushed, and subjected to centrifugal separation, whereby the antithrombin III composition is insoluble as a precipitated fraction. Recover body.
  • the recovered insoluble form of the antithrombin III composition is solubilized with a protein denaturant. After diluting or dialyzing the lysate to return the antithrombin III composition to a normal three-dimensional structure, a purified sample of the antithrombin III composition is obtained by the same isolation and purification method as described above. I can do it.
  • the antithrombin III composition or a derivative thereof can be collected in the culture supernatant. That is, a culture supernatant is obtained by treating the culture by a method such as centrifugation as described above, and an antithrombin III is obtained from the culture supernatant by using the same isolation and purification method as described above. A purified preparation of the composition can be obtained.
  • an antithrombin III composition can be produced.
  • the anticoagulant activity of the purified antithrombin III composition can be determined by an in vitro test such as a well-known antithrombin activity measurement method or a heparin cofactor one activity measurement method, or disseminated intravascular coagulation (Disseminated intravascular coagulation; (Hereinafter referred to as “DIC”) It can be measured using in vivo tests using disease model animals (The Second Series of Pharmaceutical Research and Development Volume 20 Blood Product, Ikuo Suzuki, ed., Hirokawa Pubnsning Company) Tbkyo, Japan, 1992; History of Medicine, 120, 1147, 1982; Pharmacology and Therapy 17, 5843, 1989; Clinical Studies 62, 3573, 1985; Clinical Studies, 3688, 1985; Applied Pharmacology 589, 1985). The following is a specific example.
  • DIC disseminated intravascular coagulation
  • test substance such as the purified antithrombin II composition and defibrinated plasma is serially diluted with 0.05 M Tris-HCl buffer (pH 8.3) containing 0.15 M NaCl and 0.2% human serum albumin.
  • thrombin-specific chromogenic substrate attached to Verichrome Antithrombin III (Bering Perge)
  • substrate solution HD-CHA-But-Arg-pNA
  • Test substances such as the purified antithrombin III composition and defibrinated plasma were combined with 0.15 M NaCl and Serially dilute with 0.05M Tris-HCl buffer PH8.3 containing 0.2% human serum albumin.
  • Diluted sample 5 (1.0 mL of 0.3 units of thrombin solution containing 2.5 units / mL of parin in 3 ⁇ 4iL) is reacted at 37 ° C for 5 minutes. Then, adjust to 2.0 mM as described in 3 (1) above. Add 100 pL of the substrate solution and incubate for 2 minutes at 37 ° C Then stop the reaction by adding 0.5 mL of 50% acetic acid.
  • the absorbance in the reaction solution was measured at 405 nm, and the titer of the purified antithrombin III composition to defibrinated plasma was determined by the same method as described in the above (3) (1). You can do it.
  • the in vivo anticoagulant activity of the purified antithrombin III compound was determined by an acute DIG disease model using rabbits (clinical and research 62, 3573, 1985) and an acute DIC disease model using rats (clinical and research, 3688, 1985), and an acute DIC disease model using pregnant herons (Applied Pharmacology, 589, 1985).
  • the safety and therapeutic effect of the antithrombin III composition in humans can also be evaluated using animal species models relatively close to humans, such as cynomolgus monkeys. .
  • the sugar chain structure of the antithrombin III molecule expressed in various cells can be determined according to the analysis of the sugar chain structure of ordinary sugar protein.
  • the sugar chains bound to the antithrombin III molecule are composed of neutral sugars such as galactose, mannose and fucose, amino sugars such as N-acetylglycosamine, and acidic sugars such as sialic acid.
  • the analysis can be performed using techniques such as sugar composition analysis and sugar chain structure analysis using a two-dimensional sugar chain map method.
  • composition analysis of the sugar chain of the antithrombin III molecule neutral sugar or amino sugar can be released by acid hydrolysis of the sugar chain with trifluoroacetic acid or the like, and the composition ratio can be analyzed.
  • BioLC determines the sugar composition by HPAEC-PAD (high performance anion-exchange chromatography-pulsed amperometric detection) method [J. Liq. Chromatogr., 6, 1577 (1983)]. It is a device for analysis. .
  • HPAEC-PAD high performance anion-exchange chromatography-pulsed amperometric detection
  • the composition ratio can also be analyzed by a fluorescent labeling method using 2-aminoviridine. Specifically, a sample obtained by acid hydrolysis in accordance with a known method [Agical Cultural and Biological Chemistry (Agric. Biol. Cheni.), 55 (1). 283-284 (1991)] is used to prepare 2-aminopyridyl. The composition ratio can be calculated by performing fluorescence labeling by HPLC and performing HPLC analysis.
  • Structural analysis of sugar chains of antithrombin III molecule is performed by the two-dimensional sugar chain mapping method [Analytical 'Biochemistry (Anal. Biochem.), 171, 73 (1988), Biochemical experiment method 23-sugar protein sugar chain Research Method (Academic Publishing Center), edited by Reiko Takahashi (1989)].
  • the X-axis shows the sugar chain retention time or elution position by reverse phase chromatography
  • the ⁇ axis shows the sugar chain retention time or elution position by normal-phase chromatography
  • It is a method of estimating the sugar chain structure by plotting each and comparing the results with those of known sugar chains.
  • the antithrombin III composition is degraded by hydrazine to produce an antithrombin III molecule.
  • the sugar chain is released, and the sugar chain is fluorescently labeled with 2-aminoviridine (hereinafter, abbreviated as “PA”) [Journal of Biochemistry, J. Bioa em., 95, 197 (1984)]
  • PA 2-aminoviridine
  • the sugar chain is separated from the excess PA reagent by gel filtration, and reversed-phase chromatography is performed. Then, normal phase chromatography is performed on each peak of the separated sugar chain. Based on these results, the results were plotted on a two-dimensional glycan map, and glycan standards (TaKaRa), literature [Analytical 'Anal. Biochem., 171, 73 (1988)]
  • the sugar chain structure can be estimated from the comparison of the spots.
  • mass spectrometry such as MALDI-TOF-MS of each sugar chain can be performed to confirm the structure estimated by the two-dimensional sugar chain map method.
  • the antithrombin III composition is composed of antithrombin III molecules having different sugar chain structures.
  • the recombinant antithrone'bin product of the present invention is a sugar chain in which fucose is linked to ⁇ -acetylglucosamine at the terminal end of the sugar chain, of all the linked ⁇ -glycoside-linked complex-type sugar chains. Is 0%, and has a characteristic of high liquid coagulation activity.
  • Such an antithrombin III composition can be identified by using the method for analyzing the sugar chain structure of the antithrombin III molecule described in 4. above. In addition, it can be identified by using an immunological quantification method using a lectin.
  • a lectin that recognizes the sugar chain structure of the antithrombin III molecule constituting the antithrombin III composition is labeled, and the labeled lectin is reacted with the sample antithrombin III composition. Next, the amount of the complex of the labeled lectin and the antithrombin III molecule is measured.
  • Examples of lecticis used to identify the sugar chain structure of the antithrombin III molecule include, for example, WGA (wheat-germ agglutinia from T. vulgaris), ConA (concanavalin A from C. ensiformis), and RIC (from R. communis). Toxin), L-PHA (leukoagglutinin from P. vulgaris), LCA (lentil agglutinin from L. culinaris ⁇ PSA (Pea lectin from P.
  • AAL Aleuria aurantia Lectin
  • ACL Amaranthus caudatus Lectm
  • BPL Bauninia purpurea Lectiru
  • DSL Datura stramonium Lectin
  • DBA Dolichos bifloms Agglutinin
  • EBL Elderberry Balk Lectin
  • ECL Erythrina cristagalli Lectin
  • EEL Euonymus europaeus Lectin
  • GNL Galanthin
  • HPA Helix pomatia Agglutinin
  • HHL Bippeastrum Hybrid LectinX Jacalin
  • LTL Lotus tetragonolobus Lectin
  • LEL Lycopersicon esculentmn Lectin
  • a lectin that specifically recognizes the sugar chain structure in which fucose is bound to N-acetyl-darcosamine at the reducing end of the N-glucoside-linked complex-type sugar chain.
  • a lectin that specifically recognizes the sugar chain structure in which fucose is bound to N-acetyl-darcosamine at the reducing end of the N-glucoside-linked complex-type sugar chain.
  • Specific examples thereof include lentil lectin LCA (Lentil Agglutinin derived from Lens Culinaris) Endoma lectin PSA (Pea Lectin derived from Pisum sativum) 'Fava bean lectin VFA (Agglutiniii derived from Vicia faba), Japanese amberjack lectin AAL (Le.ctin derived from Aleuria aurantia) be able to.
  • the antithrombin III composition obtained by the present invention has a high heparin binding activity equivalent to that of naturally occurring antithrombin III, and is therefore useful in the prevention and treatment of diseases associated with blood coagulation.
  • thrombosis In diseases involving blood coagulation, it is known that platelets adhere to and coagulate on sites where blood coagulation occurs, for example, vascular endothelial tissue, and thrombus is formed.
  • Blood clots can be caused by a variety of causes, including trauma, arteriosclerosis, and vasculitis. These clots detach and move with the bloodstream, causing embolism when clogging other blood vessels.
  • an artery is occluded by a thrombus or embolus, the perfusion area downstream from the occlusion site becomes ischemic.
  • thrombosis Various conditions caused by such thrombosis. Therefore, the antithrombin III composition of the present invention is also useful in preventing and treating thrombosis. .
  • thrombosis examples include cerebral infarction (cerebrovascular accident), myocardial infarction, limb thromboembolism, deep venous thrombosis (thrombophlebitis), DIC, antithrombin III deficiency, and pregnancy toxemia.
  • Cerebral infarction is a disease involving obstruction of blood vessels caused by atherosclerotic lesions formed in the main cerebral arteries inside and outside the skull. Since the cerebral blood vessels are rapidly blocked by thrombus, dementia symptoms such as hemiplegia and other movement disorders, half-body perception disorders, visual field disorders, aphasia, and dysarthria appear relatively quickly.
  • Types of cerebral infarction include lacunar cerebral infarction, which is a relatively small cerebral artery thrombosis caused by occlusion of arterioles branching from the main cerebral artery, valvular heart disease such as myocardial infarction and mitral stenosis, Thrombus formed in the heart due to heart disease such as fibrillation is released, which may cause cardiogenic cerebral infarction caused by blocking cerebral blood vessels.
  • a myocardial infarction is a myocardial cell necrosis caused by impaired blood flow in the myocardium in the perfusion area due to occlusion of a coronary artery.
  • angina symptoms such as chest pain or chest compression pain have pre-existing symptoms, and they often develop suddenly without signs.
  • -Limb arterial thromboembolism includes arteriosclerosis obliterans (ASO), which is an obstructive lesion caused by arteriosclerosis of the lower limb, and vasculitis that causes thrombotic obstruction in the arteries and veins of the limb.
  • ASO arteriosclerosis obliterans
  • TAO 'Burga's disease thromboangitis obliterans
  • Deep vein thrombosis is a thrombosis that occurs due to blood flow stasis or vein damage due to surgery, long-term bed rest, infection, pregnancy, trauma, etc. ' easily develops in the left lower limb.
  • the main symptom is swelling, but symptoms such as flushing of the skin, venous distension, and pain also appear. It is more likely to occur on long flight trips, in which case it is particularly called economy class syndrome.
  • DIG is based on acute leukemia, cancer, infectious disease, obstetric disease, fulminant hepatitis, aortic aneurysm, heart aneurysm, giant hemangioma, diabetic coma, intravascular hemolysis, surgery, trauma, burns, plastic surgery, etc.
  • it is a disease that occurs as a result of excessive activation of the blood coagulation system in a living body and micro-thrombus formation in small blood vessels, resulting in ischemic organ damage.
  • the condition varies greatly depending on the underlying disease, and it is necessary to use anticoagulant therapy with the treatment of the underlying disease There is.
  • Antithrombin III deficiency is a disease associated with reduced or qualitative abnormalities of antithrombin in. Quantitative reduction or qualitative abnormalities of antithrombin II result in reduced inhibition of activated blood coagulation factors IX and X, thrombin, etc., and contribute to the occurrence of thrombosis. Antithrombin III deficiency was discovered in 1965 as a congenital hereditary disease in a family of Norwegian thrombosis. Antithrombin III deficiency is found in a few percent of patients with multiple or recurrent thrombosis. The frequency of onset increases with age in patients with antithrombin III deficiency, and is often triggered by pregnancy, infection, external surgery, trauma, or oral contraceptives. Thrombosis often occurs in deep veins of the lower extremities, and pulmonary embolism, mesenteric veins, and cerebral arteriovenous sites are also observed.
  • Toxemia of pregnancy is a disease that occurs during pregnancy, characterized by hypertension, proteinuria, and edema. Diseases in which similar symptoms are observed after childbirth are called sequelae of preeclampsia, and are broadly included in preeclampsia. The cause of preeclampsia is related to abnormalities in the coagulation and fibrinolysis system.
  • the antithrombin III composition can also be administered to a patient before the onset of the disease for the purpose of preventing thrombus formation.
  • patients include post-PTCA vascular restenosis, unstable angina, peripheral arterial occlusion, transient ischemic stroke, acute myocardial infarction, non-Q-wave myocardial infarction, .DIC.
  • Patients who are at risk of developing diseases such as thrombotic complications due to heparinic thrombocytopenia, acute pulmonary thromboembolism, deep vein thrombosis, symptomatic pulmonary embolism, and antithrombin III deficiency .
  • the antithrombin-containing drug can be administered alone as a prophylactic or therapeutic agent, it is usually admixed with one or more pharmacologically acceptable carriers. It is desirable to provide it as a pharmaceutical preparation produced by any method well known in the pharmaceutical art. '
  • the administration route is preferably the one that is most effective in the treatment, and may be oral administration or parenteral administration such as buccal, respiratory, rectal, subcutaneous, intramuscular and intravenous. In the case of a preparation III, intravenous administration can be preferably used.
  • Dosage forms include sprays, capsules, tablets, granules, syrups, emulsions, suppositories, injections, ointments, tapes and the like. ⁇ ',
  • Formulations suitable for oral administration include emulsions, syrups, capsules, tablets, powders, and granules.
  • Liquid preparations such as emulsions and syrups include water, sugars such as sucrose, sorbitol, fructose, glycols such as poly ⁇ ethylene glycol and propylene glycol, oils such as sesame oil, olive oil, soybean oil, p-sedroxy. It can be manufactured using preservatives such as benzoic acid esters and one kind of Freno such as peppermint flavor and peppermint as additives. ,
  • Capsules, tablets, powders, granules, etc. are excipients such as lactose, glucose, sucrose and mannidol; disintegrants such as starch and sodium alginate; lubricants such as magnesium stearate and talc; It can be produced using additives such as a binder such as alcohol, hydroxypropylcellulose and gelatin, a surfactant such as fatty acid ester, and a plasticizer such as glycerin.
  • Formulations suitable for parenteral administration include injections, suppositories, sprays and the like.
  • An injection is prepared using a carrier comprising a salt solution, a glucose solution, or a mixture of both.
  • a carrier comprising a salt solution, a glucose solution, or a mixture of both.
  • the antithrombin III composition is freeze-dried according to a conventional method, and sodium salt is added thereto. In this way, a powder injection can be prepared.
  • Suppositories are prepared using carriers such as lactic acid, hydrogenated fats or carboxylic acids.
  • the propellant is prepared using the antithrombin III composition itself or a carrier which does not irritate the oral and respiratory membranes of the recipient and disperses the antithrombin III composition as fine particles to facilitate absorption. You.
  • the carrier include lactose and glycerin.
  • preparations such as aerosols and dry powders are possible.
  • the components exemplified as additives for oral preparations can be added.
  • the dosage or number of administrations varies depending on the intended therapeutic effect, administration method, treatment period, age, body weight, etc., but the amount of the active ingredient is usually 10 pg / kg to 20 mg / kg per adult per day.
  • methods for examining the anticoagulant effect of the antithrombin III composition include in vitro (in vitro) methods such as an antithrombin activity measurement method and a heparin cofactor activity measurement method.
  • in vitro methods such as an antithrombin activity measurement method and a heparin cofactor activity measurement method.
  • experiments include DIC pathological model experiments using experimental animals such as egrets.
  • FIG. 1 is a diagram schematically showing the structure of human antithrombin III.
  • FIG. 2 is a diagram schematically showing N-glycoside-linked complex-type sugar chains added to human plasma-derived antithrombin III.
  • FIG. 3 is a diagram showing the construction of plasmid pKOFUT8Neo.
  • Figure 4 shows the construction of plasmid pBS-II.
  • FIG. 5 is a diagram showing the construction of plasmid ⁇ - ⁇ .
  • FIG. 6 shows the construction of plasmid pKAN-ATIIIN135Q.
  • FIG. 7 is a view showing an elution pattern of antithrombin III in heparity affinity chromatography.
  • FIG. 8 is a diagram showing the heparin coffactor activity of antithrombin.III.
  • a CHO / DG44 cell line lacking a genomic region containing the translation initiation codon of both alleles of ctl, 6-fucosyltransferase (hereinafter also referred to as “FUT8”) was constructed by the following procedure.
  • Plasmid pKOFUT8Neo was constructed as follows using plasmid pKOFUT8Puro and plasmid pKOSelectNeo (Lexicon). Plasmid pKOSelectDT (Lexicon) 1.0 zg was replaced with 16 units of restriction enzyme Asel ( (New England Biolabs) at 37 ° C for 2 hours.After agarose gel electrophoresis of the reaction solution, using a QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN), the mixture containing the neomycin resistance gene expression unit was used. A 1.6 Kb Ascl fragment was recovered.
  • the plasmid pKOFUT8Purol.Ojug was reacted at 37 ° C for 2 hours using 16 units of a restriction enzyme Asel (manufactured by New England Biolabs). After the digestion reaction, the DNA end was dephosphorylated using Alkaline Phosphatase (manufactured by Takara Shuzo) derived from Escherichia coli C15 according to the attached instruction. After the reaction, DNA fragments were recovered using phenol / chloroform-form extraction and ethanol precipitation.
  • Plasmid DNA was prepared from each transformation » and the nucleotide sequence was analyzed using BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit v2.0 and DNA sequencer ABI PRISM 377 (manufactured by Applied Biosystems). Thus, the plasmid pKOFUT8Neo shown in FIG. 3 having the desired nucleotide sequence was obtained. The plasmid was used as one of targeting vectors for preparing FUT8 gene knockout cells of CHO cells.
  • plasmid pKOFUT8Neo was added with 400 units of restriction enzyme Sail (manufactured by New England Biolabs) and reacted at 37 ° C for 5 hours to linearize. Then, 4 ⁇ g of linearized pKOFUT8Neo was added to 1.6xl0 6 Of CHO DG44 cells by electroporation [Cytoteclmology, 3, 133 (1990)] and then IMDM-dFBS (lO) -HT (l) [dialysis FBS (Invitrogen)] 10%, HT supplement (the Inbitorojiwen Co.) were suspended in IMDM medium (Inbitorojiwen Inc.
  • IMDM-dPBS IMDM medium containing 10% of dialyzed FBS
  • G418 manufactured by Nacalai Tesque
  • Neomycin-resistant clones on the repli-force plate were cultured for one week in IMDM-dFBS (lO) containing 600 ⁇ g / mL G418, and then the cells were collected. Genomic DNA of each clone was prepared according to Chemistry Chemistry (Analytical Biochemistry), 201, 331 (1992), and TE-RNase buffer (pH 8.0) [10 mmol / L Tris-HCl, lmmol / L EDTA, 200 g / mL RNase A]-dissolved in 30 pL.
  • Primers used for genomic PGR were designed as follows. First, out of the FUT8 genomic region (SEQ ID NO: 13) obtained by the method described in Example 12 of WO03 / 31140, a primer (SEQ ID NO: 20 or SEQ ID NO: 21) that binds to the sequence beyond the targeting vector homologous region ) And primers (SEQ ID NO: 22 or SEQ ID NO: 23) that bind to sequences within the vector. Using them, the following polymerase chain reaction (PCR) was performed.
  • PCR polymerase chain reaction
  • a 25 ⁇ L reaction solution containing 10 L of each of the genomic DNA solutions prepared above (DNA polymerase ExTaq (Takara Shuzo), ExTaq buffer (Takara Shuzo), p.2 mmol L dNTPs, 0.5 imol / L
  • a specific primer SEQ ID NO: 20 or SEQ ID NO: 21 for the forward primer, SEQ ID NO: 22 or SEQ ID NO: 23 for the reverse primer
  • heat at 94 ° C for 3 minutes and then heat at 94 ° C for 1 minute.
  • PCR was performed under the conditions that the reaction consisting of 1 cycle at 72 ° C and 2 minutes at 72 ° C was one cycle.
  • reaction mixture is subjected to 0.8% (w / v) agarose gel electrophoresis, and specific amplification of about 1.7 Kb including the boundary between the CHO cell genome region and the evening homology region is observed. Those were judged as positive clones. '
  • Genomic DNA of each clone was prepared from the plate according to a known method [Nucleic Acids Research (Nucleic Acids Research), 3, 2303, (1976)], and TE-RNase buffer (pH 8.0) [10 mmol / L Tris-HCl ⁇ mmol / L EDTA, 200 g / mL RNase A] was dissolved in 150 L.
  • a probe used for the Southern plot was prepared as follows. First, of the FUT8 genomic region (SEQ ID NO: 13) obtained by the method described in Example 12 of WO02 / 31140, the evening targeting vector -The following PCR was performed using primers (SEQ ID NO: 24 and SEQ ID NO: 25) that bind to the sequence beyond the homologous region.
  • a reaction solution containing 4.0 ng of plasmid P FUT8fgE2-2 constructed by the method described in Example 12 of WO02 / 31140 [DNA polymerase ExTaq (Takara Shuzo), ExTaq buffer (Takara Shuzo X 0.2 mmol L dNTPs, ⁇ . ⁇ imolfL
  • DNA polymerase ExTaq (Takara Shuzo), ExTaq buffer (Takara Shuzo X 0.2 mmol L dNTPs, ⁇ . ⁇ imolfL
  • Prepare the above gene-specific primers (SEQ ID NO: 24 and SEQ ID NO: 25)]]
  • heat at 94 ° C for 1 minute and then heat at 94 ° C for 30 seconds, 55 ° C for 30 seconds, 74 ° PCR was performed under the conditions of 25 cycles, each of which consisted of a 1 minute reaction at C.
  • probe DNA solution was subjected to 1.75% (w / v) agarose gel electrophoresis to purify a probe DNA fragment of about 230 bp.
  • the obtained probe DNA solution (3 ⁇ 4iL) was radiolabeled using [a-ssp] dCTP 1.75 MBci and Megaprime DNA Labeling system, dCTP (Amersham Pharmacia Biotech 3 ⁇ 4®).
  • Hybridization ⁇ Yong performed as follows. First, the above nylon membrane is sealed in a roller bottle, and 15 mL of hybridization solution [5xSSPE, 50xDenlialdt's solution, 0.5% (w / v) SDS, lOO zg / mL salmon sperm DNA] is added and 65 ° C. Pre-hybridization was performed at C for 3 hours. Next, the probe DNA labeled with 32 P was heat-denatured and put into a pottle, followed by heating at 65 ° C overnight.
  • hybridization solution [5xSSPE, 50xDenlialdt's solution, 0.5% (w / v) SDS, lOO zg / mL salmon sperm DNA] is added and 65 ° C. Pre-hybridization was performed at C for 3 hours. Next, the probe DNA labeled with 32 P was heat-denatured and put into a pottle, followed by heating at 65 ° C overnight.
  • the membrane was immersed in 50 mL of 2 ⁇ SSC—0.1% (w / v) SDS and heated at 65 ° C. for 15 minutes. After repeating the above washing operation twice, the membrane was immersed in 50 mL of 0.2 ⁇ SSC—0.1% (w / v) SDS, and heated at 65 ° C. for 15 minutes. After washing, the nylon film was exposed to X-ray film at -80 ° C and developed. The genomic DNA of the parental GHO DG44 cells and the positive clone 5010-104 obtained in this section (2) were analyzed by this method. In CHO / DG44 cells, only an approximately 25.5 Kb fragment from the wild-type FUT8 allele was detected.
  • the 50-10-104 strain in addition to the approximately 25.5 Kb fragment derived from the wild-type FUT8 allele, a fragment of approximately 20.0 Kb specific to the homologously recombined allele was detected. Since the ratio of the two fragments was 1: 1, it was confirmed that the 50-10-104 strain was a hemi-knockout clone in which one copy of the FUT8 allele was disrupted.
  • Plasmid pKOFUT8Puro440z was added with 800 units of restriction enzyme Sail (New England Biolabs) and reacted at 37 ° C for 5 hours to linearize, and then 4 ⁇ g was transferred to 1.6 ⁇ 10 6 cells by electroporation. After introduction by Cytotechnology, 133 (1990)], the cells were suspended in IMDM-dFBS (10) -HT (1) and seeded on a 10-cm dish (Falcon) for adherent cell culture. After culturing at 37 ° C. for 24 hours in a 5% CO 2 incubator, the medium was replaced with 10 mL of IMDM-dFBS (10) -HT (1) containing 15 g / mL of Pyuguchimycin (manufactured by SIGMA).
  • Diagnosis of homologous recombination by genomic Southern blot was performed on the drug-resistant clone obtained in this section (1) according to the following procedure.
  • the culture supernatant was removed from the 10 cm dish in which the puromycin-resistant clone appeared, and 7 mL of a phosphate buffer solution was injected, followed by transfer under a stereoscopic microscope.
  • the roller 21 was removed, sucked, and collected into a round-bottom 96-well plate (manufactured by Falcon).
  • each clone was seeded on a flat-bottom 96-well plate for adherent cells (manufactured by Asahi Techno Glass Co.), and IMDM-dFBS containing Pyuguchi Mycin (manufactured by SIGMA) at a concentration of 15 ⁇ g / mL was used. 10) Cultured for 1 week using ⁇ (1)). .
  • each of the clones on the plate was trypsinized and seeded on a flat bottomed 24-well plate for adherent cells (Greiner). Puromycin (SIGMA) After culturing for 1 week using IMDM-dFBS (10) -HT (1) containing the above concentration, the cells were seeded on a flat bottom 6-well plate for adherent cells (manufactured by Greiiier). From the plate, genomic DNA of each clone was prepared according to a known method [Nucleic Acids Research, 3, 2303, (1976)], and 150 / L of TE-RNase buffer (pH 8.0) was prepared. Nya dissolved.
  • a probe used for the Southern plot was prepared as follows. First, the following PCR was performed using primers (SEQ ID NO: 6 and SEQ ID NO: 27) that bind to the sequence of the FUT8 genomic region beyond the targeting vector homologous region.
  • the above gene-specific primers (SEQ ID NO: 26 and SEQ ID NO: 27)] were prepared and heated at 94 ° C for 1 minute, then at 94 ° C for 30 seconds, The PCR was carried out under 25 cycles of 30 seconds at 74 ° C for 1 minute.
  • the reaction solution was subjected to 1.75% (w / v) agarose gel electrophoresis to purify a probe DNA fragment of about 230 bp.
  • the obtained probe DNA solution was radiation-labeled using [ ⁇ ⁇ 32 ⁇ ] dCTP 1.75MBq and Megaprime DNA Labelling system, dCTP Amersham Pharmacia Biotech Inc.).
  • the hybridization was performed as follows. First, seal the above nylon membrane in a roller bottle, add 15 mL of hybridization solution [5xSSPE, 50xDenhaldt's solution, 0.5% (w / v) SDS, 100 ⁇ g / mL salmon sperm DNA] and add to 65 ° C. For 3 hours of pre-hybridization. Next, the probe DNA labeled with 32 P was heat-denatured and charged into a bottle, followed by hybridization at 65 ° C.
  • the membrane was immersed in 50 mL of 2 ⁇ SSC—0.1% (w / v) SDS, and heated at 65 ° C. for 15 minutes. After repeating the above washing operation twice, the membrane was immersed in 50 mL of 0.2 ⁇ SSC—0.1% (w / v) SDS, and heated at 65 ° C. for 15 minutes. After washing, the nylon film was exposed to X-ray film at -8 CTC and developed.
  • the genomic DNA of the WK704 strain which is one of the puromycin-resistant clones obtained from the 50-10-104 strain by the method described in (1) of this section, was analyzed by this method.
  • strain W704 the wild-type FUT8 allele The original fragment of about 25.5 Kb disappeared, and only a fragment of about 20.0 Kb specific for the homologously recombined allele was detected. From this result, it was confirmed that the WK704 strain was a clone in which both FUT8 alleles were disrupted.
  • Cre recombinase expression vector pBS185 manufactured by Life Technologies was introduced as follows.
  • An arbitrary clone was collected from the colony obtained by introducing the gene into the FUT8 double knockout clone prepared in Section 3 of Example 1 by the following procedure. First, the culture supernatant was removed from a 10-cm dish, 7 mL of a phosphate buffer was injected, and then transferred under a stereoscopic microscope. Next, colonies were picked up and sucked using a Pitman (manufactured by GILSON) and collected into a round-bottom 96-well plate (manufactured by Falcon).
  • each clone was seeded on a 96-well bottom plate for adherent cells (manufactured by Iwaki Glass Co., Ltd.), and cultured for one week using IMDM-dFBS (10) -HT (1).
  • each clone on the plate was trypsinized and mixed with 2 volumes of a freezing medium [20% DMSO, 40% ⁇ fetal fetal serum, 40% ⁇ ) ⁇ .
  • a freezing medium [20% DMSO, 40% ⁇ fetal fetal serum, 40% ⁇ ) ⁇ .
  • One half of this was seeded on a flat-bottom 96-well plate for adherent cells (Iwaki Glass) to make a replica plate, and the other half was frozen and stored as a master plate.
  • the replica plate was cultured for 7 days using IMDM-dFBS (10) -HT (1) containing G418 at a concentration of 600 ⁇ g / mL and puromycin at a concentration of 15 ⁇ g /: mL.
  • Positive clones in which the drug resistance genes on both alleles flanked by the ⁇ sequence have been removed by the expression of Cre recombinase will die in the presence of G418 and puromycin. Positive clones were selected by the negative selection method.
  • the positive clones found in this section (2) were diagnosed by the following procedure for the removal of drug-resistant genes by genomic Southern blotting.
  • genomic DNA of each clone was prepared according to a known method [Nucleic Acids Research, 3, 2303, (1976)], and each was diluted with 150 L of TE-RNase buffer (pH 8.0). Dissolved overnight. '12 g of the genomic DNA prepared above was digested overnight at 37 ° C with the addition of 20 units of restriction enzyme (MieK New England Biolabs). A DNA fragment was recovered from the reaction solution by the ethanol precipitation method. Thereafter, the resultant was dissolved in 20 ⁇ L of a TE buffer (pH 8.0) and subjected to 0.6% (w / v) agarose gel electrophoresis.
  • a nylon membrane is used. Genome; DNA transcribed. After the transfer, the nylon membrane was heat-treated at 80 ° C for 2 hours to immobilize it.
  • a probe used for the Southern plot was prepared as follows. First, the following PCR was carried out using primers (SEQ ID NO: 26 and SEQ ID NO: 27) that bind to the sequence of the FUT8 genomic region beyond the targeting vector homologous region.
  • DNA solution (5 L) was radiolabeled with [a- 32 P] dCTP 1.75 MBq and Megaprime DNA Labeling system, dCTP (Amersham Pharmacia Biotech 3 ⁇ 4S).
  • the hybridization was performed as follows. First, seal the above nylon membrane in a roller bottle, add 15 mL of hybridization solution [5xSSPE, 50xDenhaldt's solution, 0.5% (w / v) SDS, 100pg / mL salmon sperm DNA] and add at 65 ° C. A 3-hour prehybridization was performed. Next, the probe DNA labeled with 32 P was heat-denatured and charged into a bottle, followed by heating at 65 ° C for 10 minutes.
  • hybridization solution [5xSSPE, 50xDenhaldt's solution, 0.5% (w / v) SDS, 100pg / mL salmon sperm DNA]
  • the membrane was immersed in 50 mL of 2 ⁇ SSC—0.1% (W / V) SDS and heated at 65 ° C. for 15 minutes. After repeating the above washing operation twice, the membrane was immersed in 50 mL of 0.2 ⁇ SSC—0.1% (W / V) SDS, and heated at 65 ° C. for 15 minutes. After washing, the nylon film was exposed to X-ray film at -80 ° C and developed. The Nhel treatment with the aforementioned restriction enzyme generates a DNA fragment of about 8.0 Kb from the wild-type FUT8 allele.
  • the parent strain CHO / DG44 cells, the 50-10-104 strain described in section 2 of this example, the WK704 strain described in section 3 of this example, and the method described in (2) of this section from the WK704 strain Genomic DNA of 4-5-C3 strain, one of the obtained drug-sensitive clones, was analyzed by this method.
  • CHO DG44 cells only a DNA fragment of about 8.0 Kb derived from the wild-type FUT8 allele was detected.
  • a DNA fragment of about 9.5 Kb derived from the allele in which homologous recombination occurred was observed.
  • FUT8 gene double knockout clones from which drug resistance genes had been removed (hereinafter referred to as FUT8 gene double knockout cells) were obtained in addition to the 4-5-C3 strain.
  • Example 2 Expression of recombinant antithrombin III by FUT8 gene double knockout cells 'A FUT8 gene double noquart cell line expressing recombinant antithrombin III was prepared by the method described below.
  • Two types of primers (SEQ ID NO: 28 'and SEQ ID NO: 29) were prepared from the human antithrombin III gene sequence (UniGene: Hs. 75599) and subjected to the following PCR. That is, a 20 l reaction mixture containing human liver-derived cDNA (manufactured by Invitrogen) as a template, i.e., Pyrobest® DNA polymerase (manufactured by Takara Bio Inc.), lOxPyrobest® buffer, 0.2% ⁇ / L ⁇ dNTP mixture ⁇ Prepare a reaction mixture containing the above gene-specific primers (SEQ ID NO: 28 and SEQ ID NO: 29) at 0.5 mol / L, heat at 94 ° C for 1 minute, and then heat at 94 ° C for 30 seconds and at 55 ° C.
  • PCR was performed under the conditions of 30 cycles, in which the reaction consisting of for 1 minute and 74 ° C for 2 minutes was defined as one cycle. After the PCR, the reaction solution was subjected to 1.5% (w / v) agarose gel electrophoresis, and it was confirmed that a DNA fragment containing the human antithrombin III gene of about 1400 bp could be specifically amplified.
  • the PCR product fragment (EcoRI-BamHI) and the pBluescriptIIKS (+) fragment (EcoRI-BamHI) containing the human antithrombin III gene obtained above were subjected to 1.5% (w / v) agarose gel electrophoresis, and the The 1.4 Kb and 3.0 Kb DNA fragments were purified using QIAquick Gel Extraction Kit (manufactured by QIAGEN).
  • plasmid PKANTEX93 (WO97 / 10354) 3 / g was dissolved in 17.5 zL of sterile water. To this solution was added .10 units of EcoRI and 2 ⁇ L of 10 XH buffer to prepare a 20 ⁇ L reaction solution, which was digested at 37 ° C for 16 hours. After the reaction, phenol / chloroform-form extraction and ethanol precipitation were performed, and the recovered plasmid was dissolved in 17.5 L of sterilized water. Further, 10 units of BamHI and 2 ⁇ L of 10 ⁇ K buffer were added to the solution to prepare a 20 L reaction solution, which was digested at 37 ° C. for 16 hours.
  • PBS-- fragment obtained above (EcoRI-BamHI) and the pKA TEX'93 fragment (EcoRI-BamHI) were subjected to 1.5% (w / v) agarose gel electrophoresis, and the DNA fragments of about 1.4 Kbp and 9.0 Kbp, respectively, were subjected to QIAqui'ck Gel Extraction. Purification was performed using Kit (QIAGEN). Next, 50 ng of the purified pBS- ⁇ fragment (EcoRI-BamHI) and 30 ng of the purified pKANTEX93 (EcoM-BamHI) fragment were ligated in the presence of Ligation High (manufactured by Toyobo), and E.
  • coli DH5 was obtained using the obtained recombinant plasmid DNA. (Toyobo Co., Ltd.). Plasmid DNA was prepared from each transformant, and the nucleotide sequence was analyzed using BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit v2.0. And DNA sequencer ABI PRISM 377 (Applied Biosystems). As a result, an animal cell expression plasmid pKAN-ATIII containing the full length gene sequence of the human antithrombin III translation region was obtained (FIG. 5).
  • the plasmid ⁇ - ⁇ prepared in the preceding section was stably introduced into the CH0 / DG44 cell line obtained by double-knocking out the FUT8 gene prepared in Example 1 to prepare a transformant.
  • the introduction of the gene into the plasmid pKAN-II was carried out according to the following procedure in accordance with the electoporation method [Cytotechnology, 3, 133 (1990)].
  • a 600 p reaction mixture containing 60 ⁇ L of NEBuffer 3 (New England Biolabs) and 120 units of the restriction enzyme MluI (New England Biolabs) was prepared from the plasmid pKAN- ⁇ lOQjg, and then incubated at 37 ° C. For 5 hours to perform linearization.
  • the reaction solution was purified by a phenol / cloth form extraction treatment and ethanol precipitation to recover a linearized plasmid.
  • a K-PBS buffer 137 mmol / L KC1-2, 7 mmol / L NaCl, 8.1 t L Na 2 HP0 4, 1. 5 negation ol / L K3 ⁇ 4P0 4, to prepare a liquid 4. 0mmol / L MgCl 2) to a. suspension to 8 X 10 7 cells / mL.
  • the cells After the cell suspension 200 ⁇ L (1 .6 X 10 6 cells) was mixed with linearized bra plasmid described above, the cells - the total amount of the Gene Pulser Cuvette (inter-electrode distance 2 mm) of the DNA mixture solution (BIO-RAD And the gene was introduced using an electorific poration device Gene Pulser II (manufactured by BIO-RAD) under the conditions of a pulse voltage of 350 V and an electric capacity of 250 ° F. After gene transfer to 4 cuvettes in the same manner, the cell suspension was supplemented with 10% fetal serum (Life Technologies) 'and 50 ig / mL gentamicin (Nacalai Tesque).
  • the cells were suspended in 120 mL of IMDM medium (manufactured by Life Technologies) and seeded at 100 L / well on twelve 96-well plates (manufactured by Grainer) for culturing adherent cells. Culture in C0 2 incubator (TABAI Co.), was carried out under the conditions of 5% C0 2, 37 ° C .
  • the culture supernatant is removed, and 10% transfected fetal serum, 50 g / mL gentamicin and 50 nM methotrexate (MTX) (Sigma IMDM medium supplemented with C.I. This medium exchange was repeated every 3 to 4 days, and culturing was performed for 9 days. 'Then, the culture medium was replaced with IMDM medium supplemented with 10% dialyzed fetal serum, 50 zg / mL gentamicin and 200 nM MTX, and the culture was repeated for every 3 to 4 days. The colonies thus obtained were transplanted to 24-well plates (Sigma). In addition, 10% dialysis fetal serum,
  • a medium exchange operation using an IMDM medium supplemented with gentamicin and 500 nM MTX was repeated every 3 to 4 days, and culturing was carried out for 19 days while appropriately expanding to obtain a transformant resistant to 500 nM MTX.
  • the method was in accordance with the manual attached to the kit, and commercially available antithrombin II (manufactured by Sigma) derived from human plasma was used as a standard product.
  • antithrombin II manufactured by Sigma
  • the culture supernatant of Ms705 pKAN-ATIII 27 strain It was confirmed that human antithrombin III was expressed at this concentration.
  • the 27 strains of Ms705 pKAN-ATIII were filed on September 9, 2003 with the FERM at the Patent Organism Depositary Center, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (Tsukuba-Higashi 1-1, Ibaraki, Japan). Deposited as BP-08472. '
  • the CH0 / DG44 cell line [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 4216 (1980)] was added to a K-PBS buffer (137 tmol / L KC1, 2.7 mmol / L aCl, 8.1 mmol).
  • / L Na 2 HP0 4s 1. 5 thigh ol / L 3 ⁇ 4P0 4, it was 4.0 mmol / L was suspended in MgCl 2) with 8 x l0 7 cells / mL.
  • the culture supernatant is removed, and 10% dialyzed fetal serum, 50 ⁇ g / mL genyumycin and 50 nM methotrexate (MTX) (manufactured by Sigma)
  • MTX methotrexate
  • the IMDM medium to which was added was added in an amount of 100 ⁇ L / ⁇ l.
  • the culture was performed for 9 days while repeating this medium exchange every 3 to 4 days.
  • the medium was exchanged using IMDM medium supplemented with 10% dialyzed fetal serum, 50 ig / mL genyumycin and 200 nM MTX in the same manner, and the culture was repeated for every 3 to 4 days for 18 days.
  • the colony formed in the above was transferred to a 24-well plate (Grainer).
  • the medium was changed every 3 to 4 days using IMDM medium supplemented with 10% dialysis fetal serum, 50 ⁇ g / ml dimycin mycin and 500 nM MTX, and cultured for 19 days while expanding appropriately. Then, a transformant resistant to 500 nM MTX was obtained.
  • each 1.0 X 10 8 cells were suspended in IMDM medium supplemented with 5 mL of 10% dialyzed fetal serum, 50 zg / ml gentamicin and 500 nM MTX, The cells were seeded on a tissue culture flask and cultured. After 3 days of culture, the culture supernatant is collected, and the recombinant DNA contained in the supernatant is recovered. The amount of titrombin III was measured using an ELISA for antithrombin (ATIII) kit (manufactured by Affinity Biological), and the high producing strain was selected based on the results.
  • ATIII antithrombin
  • the method was in accordance with the manual attached to the ELISA kit, and Neuart (manufactured by Mitsubishi Pharma Corporation) was used as a standard product.
  • Neuart manufactured by Mitsubishi Pharma Corporation
  • the recombinant antithrombin III-expressing FUT8 gene double-noct cell line and the recombinant anti-thrombin III-expressing CHO / DG44 cell line prepared in Examples 2 and 3 were adjusted to a serum-free medium by the following method. .
  • Each cell line was added to 15 ml of EX-CELL302 medium (manufactured by JRH) supplemented with 4 L-Glutamine (manufactured by Invitrogen), 50 ⁇ g / ml genyumycin and 500 nM MTX (hereinafter referred to as serum-free medium).
  • the cells were suspended at 5 ⁇ 10 5 cells / ml, inoculated into a 125 ml Erlenmeyer flask (manufactured by Koning Co., Ltd.), and cultured in batch. Culture, 35 ° C, the rotational speed is carried out at 90 ⁇ 100 rpm, the time of passage and vent to the medium's upper air containing 4 times or more 5% C0 2 in the culture vessel volume, .XI square flasks The air inside was replaced. After 3 days, the medium was changed, and on the 6th day, the cells were passaged at 5 ⁇ 10 5 cells / fill. Thereafter, the passage was repeated every 3 to 4 days for 2 weeks to acclimate to a serum-free medium.
  • the transformant pKAN-ATIII AFMS705 derived from the FUT8 gene double knockout cell line and capable of growing in serum-free medium and the CH0 / DG44 cell line, and grown in serum-free medium A transformed transformant ⁇ - ⁇ AFDG44 having the ability was obtained.
  • the obtained strain was suspended at a concentration of 3.0 ⁇ 10 5 cells / mL in 15 mL of a serum-free medium, inoculated into a 125 mL flask, and cultured. After 3 days of culture, the culture supernatant was collected, and the amount of recombinant antithrombin III contained in the supernatant was measured using ELISA for antithrombin ATIII) kit (Aff inity
  • pM- ⁇ was 18 g / mL in the culture supernatant of the AFMS705 strain, and 28 ⁇ g / mL in the culture supernatant of the pKAN-ATIII AFDG44 strain. It was confirmed that transgenic strains expressed recombinant antithrombin III at almost the same concentration.
  • the MS) ⁇ - ⁇ AFMS705 strain is the name of pKAN-ATIII AFMS705, and was deposited on August 10, 2004 by the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology It has been deposited as FERM BP-10088 at 1-chome No. 1 1 Central No. 6). , '
  • the two types of serum-free conditioned cell lines obtained in the previous section were each suspended at 3 ⁇ 10 5 cells / ml in 450 ml of serum-free medium, and the suspension was poured into a 2 L roller bottle ( (Becton Dickinson Co., Ltd.), and air containing 5% CO 2, which was at least 4 times the volume of the culture vessel, was passed through the upper surface of the medium to replace the air in the Erlenmeyer flask.
  • the culture was performed at 35 ° C and the rotation speed was 5 to 10 rpm.On the fifth day of the culture, 37.5 ml of feed medium and 1.8 ml of 50% glucose solution were added to supplement consumed nutrients such as amino acids. .
  • the feed medium contained amino acids (L-alanine 0.22 g / L, L-arginine monohydrochloride 0.74 g ZL, L-asparagine monohydrate 0.22 g / L, L-aspartic acid 0.2 6 g / L, L-cystine dihydrochloride 0.80 g / L, L-glutamic acid 0.66 g / L, L-glutamine 7.3 g / L, glycine 0.26 g / L, L- Histidine monohydrochloride dihydrate 0.37 g / L, L monoiso mouth, isine 0.92 g / L, L-leucine 0.92 g / L, L-lysine monohydrochloride 1.29 g
  • ATIIIMS705 the recombinant antithrombin III produced by the pKAN- ⁇ AFMS705 strain
  • ATIIIDG44 the recombinant antithrombin III produced by the pKAN-ATIII AFDG44 strain
  • ATIIIDG44 the recombinant antithrombin III produced by the pKAN-ATIII AFDG44 strain
  • ATIIIDG44 the recombinant antithrombin III produced by the pKAN-ATIII AFDG44 strain.
  • the culture supernatant equivalent to about 250 mg of recombinant antithrombin III is composed of 50 mM Tris, 14 mM citrate, and 0.15 M NaCl (pH 7.4).
  • the solution was passed through a heparin column (Heparin Separose 6 Fast Flow, 250 ml, manufactured by Amersham Bioscience) equilibrated with a buffer solution. Subsequently, after washing the heparin column with the equilibration buffer 10CV, the recombinant antithrombin III was eluted using a linear gradient elution method (12CV) up to a 3M NaCl concentration.
  • Each of the desalted peak fractions was passed through a DEAE Sepharose Fast Flow column (480 ml, manufactured by Amersham) to be adsorbed.
  • the recombinant antithrombin was used at a flow rate of 40 ml / min using a linear gradient eluate (86 CV) up to a concentration of 1.0 M NaCl. III was eluted.
  • the elution pattern was measured by absorbance (A280 nm).
  • the eluted fractions containing the recombinant antithrombin III were combined, and the buffer was replaced with PBS using the Pericon XL (manufactured by Millipore) and BiomaxlO Lipoa) by the diafiltration method.
  • quantification was performed using an ELISA for antithrombin (ATIII) kit (made by Affinity Biologica), and it was confirmed that the concentrations were equal by the absorbance method and the ELISA method.
  • Example 4 The neutral sugar / amino sugar composition analysis was performed on the evaluation sample obtained in Section 4 of Example 4. Each of the recombinant antithrombin III evaluation samples was hydrolyzed in the presence of 4.0 mol / 1 trifluoroacetic acid for 10 (TC, 2 hours) to release neutral sugar and amino sugar from the protein.
  • TC trifluoroacetic acid
  • the sugar chain structure of human plasma-derived antithrombin I II is known to be a complex double-stranded sugar chain that does not contain fucose. (Arch. Biochem. Biophys., 203.458 (1980)) (Fig. 2.)
  • the composition ratio of ⁇ -acetylglucosamine was assumed to be 4
  • Monosaccharide components (fucose, galactose, man
  • fucose was detected in the glycan component of ATIII DG44
  • ⁇ the fucose content in the glycan component of MS705 was human plasma-derived antithrombin III
  • the main glycan structure of all samples was not a hybrid-type hybrid but a complex double-chain sugar. Suggested to be a chain.
  • Example 4 The composition ratio of the ⁇ -form and the ⁇ -form of the evaluation sample obtained in Section 3.3 was determined with reference to the method of Goran Karlsson and Stefan Winge [Protein Expression and Purification 28, 196-201 (2003)]. And analyzed by hydroxyapatite chromatography. As a result, in the ATIII MS705 peak II fraction and the ATIII DG44 peak II fraction, as in the case of human plasma-derived noart, mainly the type was contained. The ATIII MS705 peak 3 fraction mainly contained /? The ATIIIDG44 peak fraction contained ⁇ -type and y5-type in almost the same ratio. Table 1 summarizes the results of neutral sugar-amino sugar analysis and hydroxyapatite chromatography analysis. , 3 ⁇ 43 ⁇ 4 ⁇ — ' ⁇ ⁇
  • ATIII DG44 had fucose in the sugar chain, and had a different sugar chain structure from human plasma-derived antithrombin III.
  • sugar chain structures of the ATIII MS705 peakIII fraction and the ATIII MS7.05 peak3 fraction3 are similar to those of human plasma-derived ⁇ -type and type 3 antithrombin III, respectively. It has become.
  • ATIII MS705 was purified from human plasma-derived antithrombin III by a purification method using heparin affinity as described in the literature [J. Biol. Chem., 268, 17588 (1993)]. Type 5 could be separated. However, the ATIII DG44 peak II fraction could not be separated by the same purification. From the above, it was clarified that ATIII MS705 had properties equivalent to human plasma-derived antithrombin III.
  • heparin dissociation constant-Heparin dissociation constant is determined by the binding of antithrombin III to heparin, which changes the three-dimensional structure of antithrombin III molecule. It can be measured by utilizing the change in fluorescence intensity.
  • the following relational expression 1) holds between the antithrombin III concentration and the thrombin concentration (Meth. Enzymol., 222, 525, 1993). (Equation 1)
  • n stoichiometry
  • a buffer solution pH 7.4 consisting of 20 mM Na 2 HPO 4 , 0.1 M NaCl, O. lmM EDTA-SHA 0.1% PEG6000 was prepared. This buffer was used for sample dilution. Heparin (manufactured by Sigma) is added in an amount of 0 to 20 equivalents to 50 nM antithrombin III to stimulate the fluorescence intensity of each solution. The measurement was performed at an emission wavelength of 280-nm and a fluorescence wavelength of 340 dishes.
  • the dissociation constant was analyzed with the analysis software GraphPad prism 4 (manufactured by Graphpad) using equation 1).
  • Table 4 shows the results of measuring the heparin dissociation constant (value, unit: nM) of the sample for evaluation obtained in Example 4, paragraph 3.
  • the binding power of ⁇ to heparin is stronger as the Kd value is smaller. Therefore, the highest binding strength was in the ATIII MS705 peak 3 fraction, then the ATIII MS705 peak fraction and the ATIII DG44 'peak 2 fraction, and the weakest binding force was in ⁇ DG44 peak1 fraction. there were.
  • Table 2 shows the results of measuring the heparin dissociation constant (value, unit: nM) of the sample for evaluation obtained in Example 4, paragraph 3.
  • the binding power of ⁇ to heparin is stronger as the Kd value is smaller. Therefore, the highest binding strength was in the ATIII MS705 peak 3 fraction, then the ATIII MS705 peak fraction and the ATIII DG44 'peak 2 fraction
  • thrombin inhibition rate of antithrombin III is significantly increased in the presence of beparin.
  • the binding reaction between thrombin and antithrombin III occurs at a molar ratio of 1 to 1 and loses their activities after the reaction, the antithrombin reaction of antithrombin is completed in a very short time in the presence of heparin.
  • Heparin cofactor 1 activity is expressed by the residual thrombin activity at the end of the antithrombin reaction.In other words, heparin cofactor 1 activity reduces the amount of the active antithrombin III at the end of the antithrombin reaction. Measurement [continued drug development, 20, 185, 1992].
  • heparin cofactor To measure the activity of heparin cofactor, first, 0.15M NaCU 0.05M Tris-HCl, 0.2 ° /. A buffer solution consisting of albumin (PH8.3) was prepared. This buffer was used for diluting the sample and preparing the enzyme solution. To the antithrombin III solution, add 1.0 ml of an enzyme solution consisting of 2.5 units / ml thrombin (Enzyme Research Laboratories) and 0.6 units / ml heparin (Sigma), and react at 37 ° C for 5 minutes. I let it.
  • Example 4 The activity of heparin cofac in the evaluation sample obtained in Section 3 was measured, and the obtained activity value was expressed in terms of the activity per unit mass (unit / g). Indicated.
  • the peak III fraction of ATIII MS705 and the peak III fraction of ATIII MS705 had the same activity as the human plasma-derived neat (manufactured by Mitsubishi Pharma Corporation), but ATI II DG44 peak II fraction and ATIII DG44 The peak II fraction showed a lower value than Neuart.
  • [AT] antithrombin III concentration Accordingly, in order to measure the thrombin inhibition secondary rate constant First, firstly, 20mM Na 2 HP0 4, 0.1M NaCl, O.lmMEDTA ⁇ 23 ⁇ 40, buffer consisting of 0.1% PEG8000 (pH7. 4) was prepared. This buffer was used for dilution of the sample and preparation of the enzyme solution. An enzyme solution consisting of ⁇ ⁇ antithrombin III and ⁇ thrombin was prepared and reacted at 25 ° C for 1 to 40 minutes.
  • the second-order rate constant for thrombin inhibition in the absence of heparin was slightly lower in the fraction of ATIII DG44 peak II, but was comparable to that of human plasma-derived antithrombin III neurate in all other evaluation samples. It was shown to exhibit the activity of 3rd 3 ⁇ 4s
  • Example 4 The second rate constant of thrombin inhibition in the presence of heparin in the sample for evaluation obtained in the third section was measured by the following method according to the literature [Biochem. J., 286.793, 1992]. First, a buffer solution (pH 7.4) composed of 20 mM Na 2 HPO 4 , 0.1 M NaCl, O.lmM EDTA ⁇ 23 ⁇ 40, '0.1% PEG8000 was prepared. This buffer is It was used for dilution of the pull and preparation of the enzyme solution.
  • Example 4 shows the results of measuring the thrombin inhibition second-order rate constant (unit / M / sec) of each of the evaluation samples obtained in Section 3 in the presence of heparin.
  • the numerical notation for example, 2.5E + 07 indicates 2.5 ⁇ 10 7 .
  • S.D. indicates standard deviation.
  • the second-order rate constant the peak III fraction of ATIII MS705 and the peak 3 fraction of ATIII MS705 showed the same activity as that of Neutral, but the ATIII DG44 peak 2 fraction showed a remarkably low value.
  • the DG44 peak II fraction also showed a slightly lower value.
  • the recombinant antithrombin III produced in the FUT8 double-quad cell was Compared with III, has the same properties as antiplasmin III derived from human plasma It was shown to be a protein.
  • the results showed that the recombinant antithrombin 111 produced in the FUT8 gene double knockout cell was suitable as a substitute for human plasma-derived antithrombin 111. .
  • ATIIIN135Q mutant human antithrombin II
  • ATIIIN135Q mutant human antithrombin II
  • gluminin residue located at the 135th position from the N-terminus of mature human antithrombin III has been substituted with a gluminin residue.
  • Cells were prepared by the following method.
  • ATIIIN135Q composition has three sites for adding a ⁇ -linked sugar chain, all of the expressed recombinant antithrombin III are in the form of?.
  • oligo-DNA primers for introducing two types of site mutations that replace the 167th asparagine residue from the N-terminus with a glutamine residue are added to the antithrombin III gene sequence (UniGene: Hs.75599, SEQ ID NO: 1). (SEQ ID NO: 30 and SEQ ID NO: 31).
  • SEQ ID NO: 30 and SEQ ID NO: 31 Example 2 A site-specific mutation was introduced into the antithrombin III cDNA sequence using the above primer and Quick Change® Site-Directed mutagenesis Kit (manufactured by STRATAGENE) using the pBS-II prepared in section 2 as type ⁇ . did. The method followed the manual attached to the kit.
  • Plasmid DNA was prepared from the obtained transformant using QIAprep® Spin Miniprep Kit (QIAGEN), BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit v2.0 (Applied Biosystems) and DNA sequencer ABI PRISM 377 (Applied The base sequence was analyzed using Biosystems). As a result, a plasmid pBS-ATIIIN135Q containing the full-length cDNA sequence of the mutant antithrombin III (ATIIIN135Q) was obtained (FIG. 6).
  • a reaction solution 20 ⁇ 1 containing 50 ng of the purified pBS-ATIIIN135Q fragment (EcoRI-BamHI), 30 ng of the purified pKANTEX93 (EcoRI-BamHI) fragment, and Ligation High (manufactured by Toyobo) was prepared, and ligated at 16 ° C for 16 hours. The reaction was performed. Using the obtained plasmid DNA, Escherichia coli DH5 strain (manufactured by Toyobo) was transformed by a heat shock method.
  • Plasmid DNA was prepared from the transformant using QIAprep® Spin Miniprep Kit (manufactured by QIAGEN) to obtain a mutant AT antithrombin III expression plasmid pKAN-ATIIIN135Q for animal cells (FIG. 6).
  • the plasmid was linearized by performing a digestion reaction at 16 ° C for 16 hours. After the reaction, the reaction solution was purified by phenol / mouth opening extraction and ethanol precipitation to recover the linearized plasmid.
  • examples FUT8 gene-double Nodzu quaterphenyl ⁇ preparative cells K-PBS buffer obtained in 1 (137 thigh ol / l KC1, 2. 7mmol / l NaCl, 8. 1mmol / l Na 2 HP0 4, 1. 5mmol / l K3 ⁇ 4P0 4, was 4. 0 mmol / l were suspended in MgCl 2) and 8 X 10 7 cells / ml.
  • the suspension was suspended in 30 mL (manufactured by Life Technologies), and the cells were seeded at 100 ⁇ 1 / ⁇ in three 96-well plates (manufactured by Grainer) in adherent cell culture. Culture was carried out under the conditions of 5% C0 2, 37 ° C .
  • IMDM medium supplemented with 10% dialyzed fetal serum, gentamicin, and 50 nM methotrexate (MTX) (Sigma) was added. 100 L / well was added. The culture was performed for 9 days while repeating this medium exchange operation every 3 to 4 days. Then, the culture medium was replaced with IMDM medium supplemented with 10% dialysed fetal serum, 50 g / ml gentamicin and 200 nM MTX, and the culture was repeated for every 3 to 4 days. The colonies thus obtained were transplanted to 24-well plates (Grainer).
  • the medium was changed every 3 to 4 days using IMDM medium supplemented with 10% dialyzed fetal serum, 50 g / ml genyumycin and 500 nM MTX, and cultured for 19 days with appropriate expansion. A 500 nM MTX resistant strain was obtained.
  • each 1.0 X 10 6 cells were suspended in IMDM medium supplemented with 5 mL of 10% dialysed fetal serum, 50 g / ml gentamicin and 500 nM MTX, The cells were inoculated into a culture flask (manufactured by Glyna) and cultured. After 3 days of culture, the culture supernatant was collected, and the amount of ATII IN135Q contained in the supernatant was measured using an ELISA for antithrombin (ATIII) kit (manufactured by Affinity Biologica), and high-producing strains were selected. The method was in accordance with the manual attached to the ELISA kit, and Neuart (manufactured by Mitsubishi Pharma Corporation) was used as a standard product.
  • ATIII antithrombin
  • Example 4 Cells were suspended at 5 ⁇ 10 5 cells / ml in 15 ml of the serum-free medium described in item 1 and seeded in a 125 ml Erlenmeyer flask (manufactured by Koninita), followed by batch culture. Culture, 35 ° C, the rotational speed is carried out at 90 ⁇ 100Rpm, during subculturing bubbled with air containing 5% C0 2 for 4 or more times of the incubator volume medium top, in Erlenmeyer flasks The air was replaced.
  • the medium was changed, and on the sixth day, the cells were passaged at a seeding density of 5 ⁇ 10 5 cells / ml. Thereafter, passage is repeated every 3 to 4 days for 2 weeks, and cells are Habitually. A cell line that grows in serum-free medium by this culture and does not cause aggregation
  • PKAN-ATIIIN135Q AFMS705 was obtained.
  • the obtained strain was suspended in 15 mL of a serum-free medium at a concentration of 3.0 ⁇ 10 5 cells / mL, and inoculated into a 125 mL flask and cultured. After 3 days of culture, the culture supernatant was collected, and the amount of recombinant antithrombin III contained in the supernatant was measured using ELISA for antitrombin (ATIII) kit (manufactured by Affinity Biological). It was confirmed that it was expressed at a concentration of 6 ⁇ g / niL in the medium.
  • ATIII antitrombin
  • the pKAN-ATI ⁇ N135QAFMS705 strain is the pKAN-ATI ⁇ N135Q AFMS705 ⁇ strain name, and the Patent Organism Depositary Center, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST), on August 10, 2004 (1-1-1, Tsukuba-Higashi, Ibaraki, Japan 1 It has been deposited with Central No. 6) as FERM BP-10089.
  • Example 4 by the method described in Example 4, a mutant recombinant antithrombin ⁇ ⁇ ⁇ having a complex type sugar chain in which fucose is not bonded to N-acetylglycosamine at the reducing end was obtained, and the N-glycoside-linked type was obtained. It was confirmed that the number of sugar chains was 3. Furthermore, as a result of measuring the biological activity of the antithrombin III by the method described in Example 5, the heparin dissociation constant was significantly lower than that of the mutant recombinant antithrombin III expressed in CH0 / DG44 cells. It was confirmed that the small, heparin cofactor-one activity and thrombin inhibition second-order rate constant were significantly higher.
  • Example 7 Obtaining a cell line that does not express the gene for the enzyme that catalyzes the dehydration reaction that converts GDP-mannose to GDP-4-keto and 6-deoxy-GDP-mannose
  • PBS Dulbecco's PBS
  • trypsin Invitrogen
  • the SUPER SCRIPT First-Strand synthesis system for RT-PCR in vitro Single-stranded cDNA was synthesized from 5 ⁇ g of each RNA in a 20 AdL reaction solution according to the attached instruction manual.
  • the expression level of the GDP-mannose 4,6-dehydratase gene of each lectin-resistant CH0 / DG44 cell line obtained in this section (1) was analyzed.
  • the cDNA sequence of the cDNA of GDP-mannose 4,6-dehydratase derived from CH0 cell shown in SEQ ID NO: 38 was obtained.
  • a 26-mer synthetic oligo DNA primer having the base sequence represented by 34 and a 28-mer synthetic oligo DNA primer having the base sequence represented by SEQ ID NO: 35 were produced.
  • a 20 / L reaction solution (lxEX Taq Buffer (Takara Shuzo) containing 0.5 L of single-stranded cDNA from each cell line prepared in this section (1) as type I, 0.2 mM dNTP mixture, 0.5 units of Ex Taq polymerase (Takara); synthetic DNA primers of ⁇ . ⁇ , ⁇ ⁇ SEQ ID NOs: 34 and 35] were prepared, and DNA Thermal Cycler 480 (Perkin Elmer) was used. After heating at 94 ° C for 5 minutes, 30 cycles of 1 minute at 94 ° C and 2 minutes at 68 ° C were performed.
  • the CH0 SM strain When the resistance of the obtained CH0 SM strain to various lectins was examined, the CH0 SM strain showed a lectin that recognizes the same sugar chain structure as that recognized by LCA, that is, the N-glycoside-linked sugar chain reducing terminal. It also showed resistance to other lectins recognizing a sugar chain structure in which the 6th position of N-acetyltyl darcosamine residue and the 1st position of fucose were added by ⁇ -linkage.
  • a medium supplemented with endum bean lectin (Pisum sativum Agglutinin; hereinafter, referred to as PSA, manufactured by Vector) having a final concentration of lmg / mL, or a final concentration of Aleuria aurantia Lectin; , And AAL (manufactured by Vector) were added to the culture medium.
  • the membrane was transferred to a nylon membrane according to the method described in the literature [Procedings of the National Academy 'Ob' Science (Pro Natl, Acad. Sci. USA), 76, 3683, (1979.)]. Genomic DNA was transcribed. After the transfer, the nylon film was heat-treated at 80 ° C for 2 hours. Next, in order to confirm the quality of the genomic DNA transcribed on the nylon membrane, Southern hybridization using the 1,6-fucosyltransferase (FUT8) gene, which is considered to be uniformly present in the genome regardless of the cell line, was used. Did a demonstration. A probe for detecting the FUT8 gene was prepared as follows.
  • the plasmid mfFUT8-pCR2.1 containing the mouse FUT8 cDNA described in Example 11 of WO02 / 31140 was dissolved in an M buffer (manufactured by Takara Shuzo) and digested with the restriction enzyme HiMIII (manufactured by Takara Shuzo) overnight. Thereafter, the reaction solution was replaced with H buffer (Takara Shuzo), and digestion reaction was further performed overnight with the restriction enzyme EcoRI (Takara Shuzo). After completion of the reaction, the reaction solution was subjected to 2% agarose electrophoresis to purify a 156 bp EcoRI-Hindlll fragment containing FUT8 gene exon 2.
  • radiolabeling was performed using 1.75 MBq of [a- 2 P] dCTP and Megaprime DNA labeling system, dCTP (manufactured by Amersham Bioscience).
  • hybridization was performed as follows. First, the nylon membrane was sealed in a roller bottle, and hybridization solution [4 X SSPE, 5 x Denhaldt's solution, 0.5% (w / v) SDS, 0.1 mg / mL salmon sperm DNA] 15 mL was added and prehybridization was performed at 65 ° C for 3 hours. Next, the 32 P-labeled probe DNA was heat-denatured and put into a bottle, and heated at 65 ° C. for 1 B.
  • the nylon membrane was immersed in 50 mL of 2 x SSC-0.1% (w / v) SDS, 65. After the above washing operation was repeated twice, the membrane was immersed in 50 mL of 0.233 (-0.1%) SDS and heated at 65 ° C for 15 minutes. The nylon film was exposed to X-ray film at -80 ° C and developed, after which the probe was peeled off by boiling the nylon film in stripping solution [1% SDS, O.lx SSC]. Using the above method, fragments specific to FUT8 gene exon 2 were detected in both genomic DNAs of CH0 / DG44 and CH0SM strains. From the above results, it was shown that the genomic DNAs derived from the CH0SM strain and the CH0 / DG44 strain transcribed on the nylon membrane had the same quality.
  • a probe specific to GMD gene exon 5 was prepared as follows. First, based on the known human GMD genomic DNA sequence (NCBI accession number NT_034880), oligo DNA primers (SEQ ID NO: 36 and SEQ ID NO: 37) that specifically bind to exon 5 were designed. This region corresponds to nucleotide numbers 346 to 538 of the human GMD cDNA sequence described in SEQ ID NO: 39.
  • a reaction solution of lOO ⁇ dL containing 10 ng of plasmid pAGE249GMD described in Example 15 of WO02 / 31140 [ExTaq buffer (manufactured by Takara Shuzo), 0.2 t ⁇ / LdNTPs, 2.5 zmol / L Primers (SEQ ID NO: 36 and SEQ ID NO: 37)] were prepared and subjected to polymerase chain reaction (PCR). PCR was carried out under the conditions of heating at 94 ° C for 5 minutes, followed by 30 cycles in which a reaction consisting of 94 ° C for 1 minute, 58 ° C for 2 minutes, and 72 ° C for 3 minutes was defined as one cycle.
  • the reaction solution was subjected to 2% agarose electrophoresis to purify a DNA fragment of about 200 bp. 25 ag of the obtained DNA fragment was radiated using [a- 32 P] dCTP 1, 75 MBq and Megaprime DNA labeling system, dCTP (manufactured by Amersham Bioscience). Labeled. The probe was hybridized to the nylon membrane shown above. As a result, a specific fragment of GMD gene exon 5 was found in genomic DNA derived from CH0 / DG44 cells, whereas a specific fragment of GMD gene exon 5 was detected in genomic DNA derived from CHO SM strain. Did not. The above results indicate that the CHO SM strain is a GMD noquart cell lacking at least the region containing exon 5 after the genomic region encoding GMD.
  • the plasmid pKAN- ⁇ prepared in Example 3, paragraph 3 was stably introduced into the CHO SM strain prepared in Example 7.
  • the transfer of these ⁇ genes was carried out according to the following procedure by the well-known elect opening method [Cytotechnology, 3, 133 (1990)].
  • a 200 pL reaction solution containing 20 L of NEBuffer 3 (manufactured by New England Biolabs) and 100 units of the restriction enzyme MluI (manufactured by New England Biolabs) was prepared by ligating 30 ⁇ g of the plasmid pKAN-ATIII. It was linearized by performing a digestion reaction for 16 hours.
  • Example 7 CH0 SM strains obtained in K-PBS buffer (137mmol / L KCl, 2.7mmol / L NaCl, 8.1mmol / L Na 2 HP0 4, 1.5mm.l / L K3 ⁇ 4P0 4, 4.0 thigh ol / L MgCl 2 ) to give 8 ⁇ 10 7 cells / mL.
  • Cell suspension 200 ⁇ L (1.
  • IMDM IMDM supplemented with 10% dialyzed ⁇ fetal serum, 50 g / mL gentamicin and 50 nM MTX (manufactured by Sigma) was added.
  • the medium was added at 100 L / well.
  • the culture was performed for 9 days while repeating this medium exchange operation every 3 to 4 days.
  • the medium was exchanged using IMDM medium supplemented with 10% dialyzed fetal serum, 50 g / mL gentamicin and 200 nM MTX, and the culture was repeated for every 3 to 4 days.
  • the colonies thus obtained were transplanted to 24-well plates (Grainer).
  • the medium exchange operation using IMDM medium supplemented with 10% dialyzed fetal serum, 50 g / mL gentamicin and 500 nM MTX was repeated every 3 to 4 days.
  • MTX resistant strain was obtained.
  • each 1.0 ⁇ 10 6 cells were suspended in IMDM medium supplemented with 5 mL of 10% dialyzed fetal serum, 50 g / mL gentamicin and 500 nM MTX, The cells were inoculated into a T25 flask and cultured. After 3 days of the culture, the culture supernatant was recovered, and the amount contained in the supernatant was measured using ELISA for antitrombin (ATIII) kit (Affinity Biological).
  • ATIII antitrombin
  • fucose was bound to N-acetylglucosamine at the reducing end by the method described in Example 4.
  • a recombinant antithrombin III having no sugar chain was obtained.
  • the biological activity of the antithrombin III was measured by the method described in Example 5, and the recombinant antithrombin expressed in the GMD knockout cells was expressed in the recombinant antithrombin III expressed in CH0 / DG44 cells. It was confirmed that the heparin dissociation constant was significantly smaller than that of, and that the heparin cofactor activity and the second-order thrombin inhibition rate constant were significantly higher.
  • the reaction was linearized by performing a digestion reaction for 16 hours. After the reaction, the reaction solution was purified by phenol / chloroform extraction and ethanol precipitation to recover a linearized brassmid.
  • a CHO SM strain obtained in Example 7 K-PBS buffer (137mmol / l KC1, 2.7mmol / l NaCl, 8. lmmol / 1 Na 2 HP0 4, 1.5 thigh ol / l K3 ⁇ 4P0 4, 4.0 negation ol / l MgCl 2 ) to give 8 ⁇ 10 7 cells / ml.
  • the cell suspension (1. 6 X 10 6 cells) was mixed with the linearized plasmid 9 ⁇ G above, the cells - the total amount of the Gene Pulser Cuvette (inter-electrode ⁇ 2 mm) of the DNA mixture solution (BI0-RAD Co.
  • the gene was introduced using an electoral porosion device Gene Pulser (manufactured by BIO-MD) under the conditions of a pulse voltage of 350 V and an electric capacity of 250 F. After transfection, the cell suspension was suspended in 30 mL of IMDM medium (Life Technologies II) supplemented with 10% fetal serum (Life Technologies) and 50 g / ml gentamicin (Nacalai Tesque). The cells were seeded at 100/1 / ⁇ to three 96-well plates (manufactured by GRAINER, Inc.). The culture was performed under the conditions of 5% CO 2 and 37 ° C.
  • the colonies that were finally formed were replanted into 24-well plates (Grainer).
  • the medium was changed every 3 to 4 days using IMDM medium supplemented with 10% dialysed fetal serum, 50 ⁇ ff / ml dimycin and 500 nM MTX, and cultured for 19 days with appropriate expansion.
  • a 500 nM MTX resistant strain was obtained.
  • each 1.0 ⁇ 10 6 cells were suspended in IMDM medium supplemented with 5 mL of 10% dialyzed fetal serum, 50 ⁇ g / ml genyumycin and 500 nM MTX, The cells were inoculated into a T25 flask and cultured. After 3 days of culture, the culture supernatant was collected, and the amount of ATIIIN135Q contained in the supernatant was measured using ELISA for antithrombin (ATIII) kit (manufactured by Affinity Biological) to establish a high-producing strain.
  • ATIII antithrombin
  • the method was in accordance with the attached manual, and Neuart (manufactured by Mitsubishi ELPHARMA) was used as a standard product. As a result, it was confirmed that antithrombin III was expressed at a concentration of 45 ng / mL in the culture supernatant of the obtained antithrombin III-expressing strain, and this transformant was named pKAN-ATIIIN135Q6 GMDK0 strain. Was. ⁇
  • Example 4 a mutant recombinant antithrombin III having a sugar chain in which fucose is not bound to N-acetyldarcosamine at the reducing end was obtained, and an N-linked sugar chain was obtained. It was confirmed that the number was three.
  • Example 10 Expression of Recombinant Antithrombin II I by Yeast
  • yeasts Although many types of yeasts are known, typical yeasts often used as hosts for expressing recombinant proteins include yeasts of the genus Pichia and the genus Saccaromyces. Usually, the main structure of the N-linked sugar chain added to the recombinant protein expressed by these yeasts is that the core part on the reducing end side has N-acetylglycosamine of I residue and the non-reducing end It is known to be a high-mannose sugar chain with 9 to tens of mannose residues and a few to tens of mannose 6-phosphate residues at the side branch ([]) ⁇ 35 ⁇ , 1191 (2002)). A high-mannose sugar chain having such a structure is often referred to as a hypermannose sugar chain.
  • a hybrid type sugar chain which is an intermediate structure between a high mannose type sugar chain and a complex type sugar chain, is mainly added.
  • a method for producing a Pichia yeast strain and a Saccharomyces yeast strain expressing the expressed antithrombin III will be described.
  • Genomic DNA from a Pichia yeast strain for example, Pichia past oris GTS115 strain (manufactured by Invitrogen), was type III, and the PN01 (phosphomannosylation of N-linked 'oligosaccharides 1) gene (GenBank Amplify the full-length sequence of the translation region (session number: AB099514).
  • the amplified PN01 gene sequence of about 3200 bases length has its 5 'terminal half sequence replaced with the orotidine-5'-phosphate decarboxylase (thigh 3) gene derived from the yeast (GenBank Accession No. 1: AF321098).
  • a vector such as pCR2.1-T0P0 vector (manufactured by Invitrogen) to prepare a plasmid for PN01 gene disruption.
  • the gene is stably introduced into, for example, Pichia yeast such as the GTS115 strain by the electroporation method described in Pichia Expression Kit (Invitrogen).
  • the transfected yeast is cultured at room temperature in a YPD medium (manufactured by Invitrogen) lacking Peracil, and genomic DNA is extracted from each proliferating colony.
  • the yeast PN01 locus sequence is amplified by the PCH method using this genomic DNA as type III, and yeast clones in which the PN01 locus has been disrupted by homologous recombination are selected.
  • the structure of the main N-linked sugar chain expressed by Pichia yeast has two residues of N-acetyldarcosamine in the core portion on the reducing end side and 9 Can be modified to a high mannose type sugar chain having a structure in which several tens of mannose 'residues are bonded.
  • Genomic DNA from a Pichia yeast strain for example, Pichia pastoris X-33 strain (manufactured by Invitrogen), was used as a type I, and the ⁇ -1,6-mannose transferase (0CH1) gene (GenBank DNA) of Pichia yeast was obtained by PCR. Session number: AF540063).
  • the amplified 0CH1 gene sequence of about 2800 bases has its 5, terminal half sequence transferred to yeast oroUdine-5 by phosphate decarboxylase (URA3).
  • the vector After replacement with the gene (GenBank accession number: AF321098), the vector is inserted into a vector such as pCR2.1-TOP0 vector (manufactured by Invitrogen) to produce a vector for disrupting the 0CH1 gene. .
  • pCR2.1-TOP0 vector manufactured by Invitrogen
  • the vector lOOzg was formed into a fountain with restriction enzyme I (manufactured by New England Pio Labs), and then subjected to the electoporation method described in Pichia Expression Kit (manufactured by Invitrogen). Perform stable gene transfer into the described PN01 gene-disrupted strain and Pichia pastoris JCm strain.
  • the transfected yeast is cultured at room temperature in a YPD medium (manufactured by Invitrogen) lacking Peracil, and genomic DNA is extracted from each of thecultivated cotyledons.
  • a yeast strain with the 0CH1 locus disrupted by homologous recombination is selected.
  • the structure of the main N-linked sugar chain expressed by Pichia yeast can be changed to a structure in which two cores of N-acetyl glucosamine are present at the reducing end side core and at the non-reducing end side. It can be modified to a Man8 type high mannose type sugar chain having a structure in which eight mannose residues are bonded.
  • the amplified cDNA is ligated with a cDNA sequence encoding the leader peptide of the yeast or mannosidase (MNS1) gene (GenBank accession number: M63598) at its 5, terminal end, and then the expression vector pPICZ for yeast is used. (Invitrogen) to prepare a vector for expressing ⁇ -1,2-mannosidase in the endoplasmic reticulum of yeast. Next, this vector is stably introduced by electroporation into a Pichia yeast strain in which both the PN01 gene and the 0CH1 gene described in the preceding section have been disrupted by homologous recombination.
  • MNS1 mannosidase
  • yeast After transfection, the yeast is cultured at room temperature in a YPD medium (manufactured by Invitrogen) lacking peracyl and containing zeocin (manufactured by Invitrodin), and total RNA is extracted from each proliferating colony.
  • a yeast clone in which expression of the recombinant quinula-type ⁇ -l, 2-mannosidase was observed was selected by PCR using the 'first-strand cDNA prepared from this total RNA as type III. .
  • the structure of the main ⁇ -linked sugar chain expressed by Pichia yeast was changed to a structure in which two residues of ⁇ -acetylglycosamine were present on the reducing end side of the core, and 5 To a Man5 type high mannose type sugar chain having a structure in which a mannose residue of.
  • RNeasy Mini K manufactured by Qiagen.
  • the cDNA (GenBank accession number: AF106080) encoding the entire translation region of the enzyme S-UDP-N-acetylglucosamine transporter is specifically amplified.
  • a cDNA of about 3700 bases in length is placed downstream of the alcoholoxygenase promoter sequence in a vector such as the yeast expression vector pPIC3.5K (manufactured by Invitrogen). Insertion between restriction enzyme coR I cleavage site and ⁇ 3 ⁇ 4 ⁇ I cleavage site, and UDP- UDP-acetyl in yeast Golgi A vector for expressing the glucosamine transporter is prepared.
  • this vector is stably introduced into the Pichia yeast strain into which the ⁇ -1,2-mannosidase enzyme gene has been introduced, as described in the preceding section, by the electoporation method.
  • the yeast is cultured at room temperature in a YPD medium containing the drug G418 (manufactured by Nacalai Tesque), and total RNA is extracted from each proliferating colony.
  • a yeast clone strain in which the expression of the recombinant UDP-N-acetyldarcosamine transporter has been confirmed is selected by a PCR method using a CDNA prepared from the total RNA as type III.
  • the amplified cDNA is ligated with a cDNA sequence encoding the leader peptide of the yeast mannose transferase (MNN9) gene (GenBank accession number: L23752) at the 5 'end, and then expressed for yeast. Ku Yuichi PAUR123 (Yukara Bio Inc.), etc., inserted between the restriction enzyme Kpn I cleavage site and the Xba I cleavage site located downstream of the alcohol dehydrogenase promoter sequence of the vector, and inserted into the yeast Golgi.
  • a vector for expressing cetylglucosamine transferase-1 is prepared.
  • this vector is introduced into the Pichia yeast strain into which the UDP-N-acetyldarcosamine transport gene described above has been introduced by the lithium acetate method described in the manual attached to the expression vector PAUR123. .
  • the yeast is cultured at room temperature in a YPD medium containing the drug o-Robrazin A (Yukarapaio), and total RNA is extracted from each proliferating colony.
  • a yeast closi strain in which the expression of recombinant N-acetylglucosamine transferase-1 has been confirmed is selected by PCR fe using the cDNA prepared from the total RNA as type III.
  • the structure of the main N-linked sugar chain expressed by Pichia yeast has two residues of N-acetylglucosamine in the core part on the reducing end side and five on the non-reducing end side.
  • a method for producing a Pichia yeast strain that mainly expresses a hybrid type sugar chain as an N-linked type sugar chain which is an intermediate structure between an i-mannose type sugar chain and a complex type sugar chain
  • yeast of the genus Saccharoayces is often used as a host for expressing a recombinant protein.
  • a method for producing a Saccharomyces yeast strain that mainly expresses a hybrid-type sugar chain as an N-linked sugar chain will be described.
  • a yeast strain in which the 0CH1 locus has been disrupted by homologous recombination is selected.
  • the resulting Saccharomyces yeast strain in which the 0CH1 gene was disrupted was transformed into ⁇ -1, 3-mannose after inducing haploid cells according to the method of Sherman et al. (Methods in Enzymology 1 194, 21 (1991)).
  • Diploid zygotes can be obtained by mixing with haploid cells of mutant yeast strain LB1-10B (Yeast Genetic Stock Center), which has a transferase ( ⁇ N1) gene disrupted, and culturing them under nitrogen-deficient conditions. Let it form.
  • yeast 0CH1 locus GenBank Accession By amplifying the sequence of the MNN1 locus and the sequence of the MNN1 locus (GenBank accession number: AF540063L23753), yeast clones in which both the 0CH1 locus and the MNN1 locus are disrupted are selected.
  • the structure of the main N-linked sugar chain expressed by Saccharomyces yeast was changed to a structure in which two cores of N-acetylglycosamine were present on the reducing end side and eight N-acetylglycosamines were located on the non-reducing end side. It can be modified to a Man8 type high mannose type sugar chain having a structure in which a mannose residue is bonded.
  • cDNA was extracted from mold (Aspergillus sai toi) using the RNeasy Mini Kit (Qiagen).
  • cDNA was transformed into type I, and PCR was performed using specific primers and K0D polymerase (manufactured by Toyobo Co., Ltd.) to obtain a cDNA encoding the full length translation region of Rabbit-1,2-mannosidase.
  • the amplified cD dish which is approximately 1500 bases in length, has a yeast ⁇ endoplasmic reticulum-localized signal peptide (Embojournal 7, 913 (1988)), ie, histidine monospartate, at the 3 'end, which has its translation termination codon deleted.
  • yeast expression vector pPICZ manufactured by Invitrogen
  • ⁇ -1 prepared a vector that expresses 2-mannosidase.
  • this vector was subjected to the electroporation method against the S.
  • yeast strain in which the ⁇ -1,6-mannose transferase gene and the 1,3-mannose transferase gene were disrupted as described in the preceding section. Introduce stably. After transfection, the yeast is cultured at room temperature in a YPD medium (manufactured by Invitrogen) containing Zeracin (manufactured by Invitrogen) deficient in peracil, and total RNA is extracted from each of the grown colonies. Next, a yeast clone strain in which expression of the recombinant quinula type ⁇ -1,2-mannosidase has been recognized is selected by PCR using cDNA prepared from the total RNA as type III.
  • the structure of the major N-linked sugar chain expressed by Saccharomyces yeast has two residues of N-acetyldarcosamine in the core at the reducing end and 5% at the non-reducing end. It can be modified to a Man5 type high mannose type sugar chain having a structure in which two mannose residues are bonded.
  • the amplified cDNA of about 3700 bases in length was placed downstream of the alcoholoxygenase promoter sequence in a vector such as the yeast expression vector PPIC3.5K (manufactured by Invitrodin). Insert between the ⁇ oR I cleavage site and the ⁇ 3 ⁇ 4 ⁇ I cleavage site to create a vector that expresses the UDP-N-acetyl darcosamine transporter in the Golgi of yeast.
  • this vector is stably introduced into the Saccharomyces yeast strain into which the -1,2-mannosidase gene has been introduced, as described in the preceding section, by an electroporation method.
  • yeast After transfection, the yeast was cultured at room temperature in a YPD medium containing a drug (M18 (manufactured by Nacalai Tesque)) at room temperature, and total RNA was extracted from each proliferating colony. Recombinant UDP-N-Acetylglucosamine tra A yeast clone strain in which the expression of the transporter is observed is selected.
  • yeast After transfection, the yeast is cultured at room temperature in a YPD medium containing the drug ⁇ bite brassin A (Yukara Bio Inc.), and total RNA is extracted from each proliferating colony.
  • a yeast-clone strain in which the expression of the recombinant N-acetylglucosamine transferase-1 is recognized is selected by a PCR method using the cDNA prepared from the total RNA as type III.
  • the structure of the major N-linked sugar chain expressed by Saccharomyces yeast was changed to a structure in which two cores of N-acetyldarcosamine were present at the reducing end core and five were located at the non-reducing end.
  • a Pichia yeast strain that mainly expresses a hybrid-type sugar chain in which one N-acetylglucoseamine residue is added to the non-reducing end of a Man5 type high-mannose type sugar chain as an N-linked sugar chain
  • a method for producing a Saccharomyces yeast strain was described.
  • a method for preparing recombinant human antithrombin III having a hybrid sugar chain as a J-linked sugar chain using these yeast strains as a host will be described.
  • the vector pPIC6a / hATIII100g for secreting and expressing the above-mentioned mature human antithrombin III is cleaved in the HIS4 gene with a restriction enzyme ⁇ 3 ⁇ 4 ⁇ (manufactured by New England Biolabs), and extracted by phenol chloroform and ethanol precipitation. Prepare a linearized vector. Next, according to the method of Mochizuki et al. (Protein Expression and Purification 23, 55 (2001)), this linearized antithrombin III expression vector was subjected to N-bonding as described in item 5 of the present Example.
  • Hybrid mainly as a type sugar chain Into a Pichia yeast strain that expresses glycan-type sugar chains or a Saccharomyces yeast strain that mainly expresses hybrid-type glycans as N-linked glycans, as described in Section 9 of this Example Collection. .
  • the yeast after the introduction of the gene is cultured at room temperature in a YPD medium (Invitrogen) containing the drug plastosidine (Invitrogen) to obtain blasticidin-resistant colonies.
  • the blasticidin-resistant uroney is transplanted to a liquid YPD medium (manufactured by Invitrogen), and batch culture is performed at 30 ° C for 24 hours or more.
  • the culture supernatant obtained after the cultivation is prepared using human plasma-derived antithrombin III drug Neuart (manufactured by YELLOW Pharmaceutical Co., Ltd.) as a standard, and using human antithrombin gel ELISA kit (manufactured by Affinity Biologics). analyse. By this analysis, recombinant human antithrombin III contained in the culture supernatant can be detected and its concentration can be measured. Recombinant antithrombin III having a hybrid type sugar chain containing no fucose as an N-linked sugar chain secreted in the yeast culture supernatant (and purified by the method described in Example 4). The sugar chain structure of the purified antithrombin III protein can be analyzed by the method described in Example 4 above.
  • a Pichia yeast strain mainly expressing a hybrid-type sugar chain in which one N-acetylglycosamine residue is added to the non-reducing terminal side of a Man5 type high mannose type sugar chain
  • a recombinant S. calomyces yeast strain similarly modified as a host can be used to prepare a recombinant human antithrombin III having a hybrid type sugar chain containing no fucose as an N-linked type sugar chain.
  • liver-derived cDNA (Clontech) as type III, and performing PCR using specific primers and K0D polymerase (Toyobo), ⁇ -mannosidase II (GenBank accession number: The cDNA encoding the active domain of U31520) is specifically amplified.
  • the amplified cDNA is ligated with a cDNA sequence encoding the leader peptide of the yeast mannose transferase (M ⁇ 9) gene (GenBank Accession Number: L23752) at the 5 'end, and then expressed for yeast.
  • a vector is inserted downstream of the promoter sequence of the vector to express ⁇ -mannosidase II in the Golgi of yeast.
  • this vector was stably used against the yeast strain expressing recombinant human antithrombin III mainly having a hybridized sugar chain as a ⁇ -linked sugar chain as described in Section 11 of this Example. Introduce. After transfection of the yeast, clones are selected based on auxotrophy and drug resistance, and the expression of chimeric ⁇ -mannosidase II is confirmed by RT-PCR.
  • tissue-derived cDNA such as liver-derived cDNA (manufactured by Clontech) as type III, and performing PCR using specific primers and K0D polymerase (manufactured by Toyobo Co., Ltd.), N-acetylglucosamine transferase- Amplify the cDNA encoding the active domain of II (GenBank Accession Number: U15128) specifically.
  • the amplified cDNA is ligated to the 5'-end of the cDNA sequence encoding the leader peptide of the yeast mannose transferase (MN9) gene (GenBank accession number: L23752).
  • MN9 yeast mannose transferase
  • a vector for expressing luglucosamine transferase-II is prepared. Next, this vector is stably transfected with a chimeric human mannosidase II into a yeast strain that expresses recombinant human antithrombin III mainly having a hybrid-type sugar chain as an N-linked sugar chain as described in the preceding section. Introduce stably into the obtained yeast strain. After transfection of the yeast, clones are selected using auxotrophy and drug resistance as indices, and the expression of chimeric N-acetylglucosamine transferase-II is confirmed by RT-PCR.
  • the structure of the major N-linked sugar chain of the recombinant gene antithrombin III expressed by the yeast strain stably integrated with the chimeric N-acetyldarcosamine transferase-II Has two residues of N-acetylglucosamine in the core portion on the reducing end side, and three mannose residues are linked to the non-reducing end side in a bifurcated structure. It can be modified to a complex double-stranded sugar chain containing fucose, to which one N-acetylglycosamine residue is added.
  • cDNA derived from human tissue for example, liver (Clontech) as type III, and performing PCR using specific primers and K0D polymerase (Toyobo Co., Ltd.), UDP-galactose transporter (GenBank Accession number: AB042425) to specifically amplify the cDNA encoding the entire translation region.
  • the amplified cDNA is inserted downstream of the promoter sequence of an expression vector for yeast to prepare a vector for expressing the UDP-galactose transporter in the Golgi of the yeast.
  • this vector was stably used against the yeast strain expressing recombinant human antithrombin III mainly having an immature complex double-stranded sugar chain as an N-linked sugar chain as described on page ⁇ . Introduce. After transfection, the yeast is selected for its clones based on auxotrophy and drug tolerance, and the expression of UDP-galactose transporter is confirmed by RT-PCR.
  • human-derived cDNA for example, liver-derived cDNA (Clontech) as type III, and performing PCR using specific primers and K0D polymerase (Toyobo), 51,4 galactose transferase (GenBank Amplify the cDNA encoding the active domain of the session number: M22921) specifically.
  • the amplified cDNA is ligated with a cDNA sequence encoding the leader peptide of the yeast mannose transferase (MNN9) gene (GenBank accession number: L23752) at the 5 'end, and then the expression vector for the yeast is ligated.
  • MNN9 yeast mannose transferase
  • a vector is inserted downstream of the promoter sequence to express the ⁇ 1,4 galactosyltransferase in the Golgi of yeast.
  • this vector was transformed into a chimeric /? 1 yeast strain expressing recombinant human antithrombin III mainly having an immature complex double-stranded sugar chain as an N-linked sugar chain as described in the preceding section.
  • 4 Stably introduces into yeast strains into which galactose transferase has been stably introduced. After transfection of the yeast, clones are selected using auxotrophy and drug resistance as indices, and the expression of chimeric 51,4 galactosyltransferase is confirmed by RT-PCR.
  • the structure of the major N-linked sugar chain of the recombinant antithrombin III expressed by the yeast strain stably integrated with the chimeric 1,4 galactosyltransferase was changed to the reducing terminal side. It has two residues of N-acetyl glucosamine in the core part, three mannose residues are linked to the non-reducing end side in a bifurcated structure, and N-acetyl glucosamine is attached to each of the two non-reducing ends. It can be modified into an immature complex double-stranded sugar chain to which one samin residue and one galactose residue are added.
  • CDNA derived from human tissue, for example, liver (Clontech) is designated as type II, and specific primers and By performing PCR using KOD polymerase (manufactured by Toyobo Co., Ltd.), the cDNA encoding the entire translation region of CMP-sialic acid transport residue-(GenBank accession number: D87969) is specifically amplified. Let it.
  • the amplified cDNA is inserted downstream of the promoter sequence of a yeast expression vector to prepare a vector that expresses the CMP-sialic acid transporter in the yeast Golgi.
  • this vector was stably used against the yeast strain expressing recombinant human antithrombin III having an immature complex double-stranded sugar chain as an N-linked sugar chain as described in the preceding section. Introduce. After transfection, the yeast is selected for its clones based on nutritional requirements and drug resistance, and the expression of CMP-sialic acid transporter is confirmed by RT-PCR.
  • the ⁇ 2,3 sialyltransferase (GenBank Specific amplification of the cDNA encoding the active domain of Accession Number: L23768) or 2,6 Sialyltransferase (GenBank Accession Number: X62822).
  • the amplified cDNA is ligated with a cDNA sequence encoding the leader peptide of the yeast mannose transferase (MNN9) gene (GenBank Accession Nampa 1: L23752) at the 5 'end, and then an expression vector for yeast is used. This vector is inserted downstream of the promoter sequence to produce a vector for expressing sialyltransferase in the yeast Golgi.
  • this vector was transformed with a chimeric sialyltransferase into a yeast strain expressing a recombinant human antithrombin III having a predominantly complex double-stranded sugar chain as an N-linked sugar chain as described in the preceding section. Introduce stably into yeast strains that have been introduced stably. After transfection of the yeast, clones are selected based on auxotrophy and drug resistance, and the expression of the chimeric sialyltransferase is confirmed by ET-PCR.
  • the structure of the major N-linked sugar chain of the genetically engineered anti-Tombin III expressed by the yeast strain in which the chimeric sialyltransferase is stably incorporated is changed to the reducing terminal side. It has two residues of N-acetyl glucosamine in the core part, and three non-reducing ends are linked to each other in a bifurcated structure with three mannose residues. It can be modified into a mature complex double-stranded sugar chain to which one glucosamine residue, one galactose residue and one sialic acid are added.
  • Example 4 Genetically engineered antithrombin III, which has a complex double-stranded sugar chain containing no fucose as an N-linked sugar chain secreted into yeast culture supernatant, is described in Example 4. Purification is possible by the method described above. The sugar chain structure of the purified antithrombin III protein can be analyzed by the method described in Example 4.
  • a yeast strain expressing a recombinant antithrombin III having mainly a complex type sugar chain containing no fucose as an N-glycoside-linked sugar chain was prepared, and the N-glycoside was cultured by culturing the yeast. It was shown that recombinant antithrombin III having mainly a complex type sugar chain containing no fucose as a linked sugar chain can be prepared.
  • the antithrombin III expressed in yeast in this example is a protein having the same biological activity as antithrombin III expressed in FUT8 double knockout cells and antithrombin III derived from human plasma. is there.
  • a composition comprising a recombinant antithrombin III molecule having an N-glycoside-linked complex-type sugar chain, wherein the N-glycoside-linked complex-type sugar chain has N-acetyltyl glucosamine at the reducing end of the sugar chain.
  • a method for producing an antithrombin III composition having a sugar chain to which no fucose is bound.

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Abstract

本発明は、N-グリコシド結合複合型糖鎖を有する遺伝子組換えアンチトロンビンIII分子からなる組成物であって、N-グリコシド結合複合型糖鎖が該糖鎖の還元末端のN-アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖を有するアンチトロンビンIII組成物の製造方法を提供する。

Description

'明細書
アンチトロンビン in組成物の製造方法
技術分野
本発明は、 N-グリコシド結合複合型糖鎖を有するアンチトロンビン III分子からなる組成物であ つて、 N-グリコシド結合複合型糖鎖が該糖鎖の還元末端の N-ァセチルグルコサミンにフコてスせ 結合していない糖鎖であるアンチトロンビン III組成物の製造方法に関する。
背景技術
血栓形成は血流を停止させる危険性を伴う。血栓の形成による血流の遮断は致死要因となるため、 生体は、 血液凝固に対するいくつかの制御調節機構を有している。 すなわち、 セリンプロテア一ゼ による活性化凝固因子の直接的な不活性ィ匕 [The Thrombin VokuoaeKMacliovicti R" ed.) pp. 1-21, CRC Press, Boca Raton, 1982]、 活性化プ Πテイン Cによる第 V及び第 VIII因子の分解に基づく 調節機構 (Progress in Hemostasis and Thrombosis Volume 7 (Spaet T. H" ed.) pp25-54, Grune & Stratton, New York, 1984) 及び血中各種セリンプロテアーゼインヒビ夕一による活性化凝固因子 の阻害機構である。さらに、 活性化第 X因子依存的に第 VII因子の活性化を阻害する組織因子イン ヒビ夕一の存在も明らかとなっている （日本血栓止血学会誌， 2， 550, 1991)。 これらの中で最も重 要な機構としては、 血中各種セリンプロテアーゼインヒビターによる活性化凝固因子の阻害機構で ある。
血中にはセリンプロテアーゼに対する種々のィンヒビ夕一が存在し、 その量は全血漿蛋白質の 10%にも及んでいる。 これらインヒビタ一のうち、 アンチトロンビン ΠΙ (antithrombin ΠΙ). αΐ プロティナーゼィンヒビ夕一（otl proteinase inhibitor)、 α2マクログロプリン（α2 macroglobulin) 及びへパリンコファクター II (heparin cofactor II)の 4つのィンヒビターが血液凝固の制御に重要 であることが知られている。 これらインヒビターの中でも、 アンチトロンビン IIIが特に重要であ り、 血漿中の抗トロンビン活性の 70%を占めている。
アンチトロンビン IIIは、 432アミノ酸よりなる分子量約 59,000〜65,000の糖蛋白質であり、分 子内に 3個のジスルフィド結合、 Cys8-Cysl28、 Cys21-Cys95、 Cys247-Cys430を有している [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80, 1845， （1983)]。 この結合により、 。末端側に大きなループ構造が形成 されており、このループ構造の中に活性中心である Arg393-Ser394結合が存在している（第 1図)。 ヒトのアンチトロンビン IIIの等電点は 5.11である。 アンチトロンビン IIIには、 N末端から 9 6 番目、 1 3 5番目、 1 5 5番目および 1 9 2番目のァスパラギン（それそれ Asn96、Asnl3'5、Asnl55、 Asnl92と表記する） の 4箇所に N-グリコシド結合糖鎖が付加している。 ヒト血漿中に存在するァ ンチトロンビン IIIは、 4本の N-グリコシド結合糖鎖を有する α型、 Asnl35への糖鎖の付加がな く 3本の糖鎖しか有さない β型の 2種類のァイソフォームが存在するが [Pathophysiol Haemost Thromb 32, 143 (2002)]、 ヒト血漿中のアンチトロンビン IIIのうち 90〜95%が α型、 残りの 5〜 10%が β型である。
アンチトロンビン IIIに付加されている Ν-グリコシド結合複合型糖鎖は、 Ν-ァセチルダルコサミ ン、 シアル酸、 ガラクト一ス及びマンノースから構成されている （第 2図）。 ヒト血漿中に存在する アンチトロンビン IIIは、 その糖鎖構造にフコースの修飾を受けていないことが一つの特徴となつ ている。
アンチトロンビン IIIは血液凝固阻害剤として開発され、先天性ァンチト Dンビン III欠乏に基づ く血栓症及びアンチトロンビン III低下を伴う汎発性血管内血液凝固症候群の治療に世界で広く用 いられている。
アンチトロンビン IIIなどの血液製剤は、プールされたヒト Jfil漿を原材料として製造されている。 プール血漿は、 国内では日本赤十字社血漿分画センターにおいて、 6ヶ月間の貯留保管を終えた約 5000人から 10000人分の血漿を混合することにより作製、 供給されている。実際に、 血液製剤、 た とえば乾燥濃縮人血液凝固第珊因子製剤クロスエイト M (日本赤十字社） の.1ロヅト分を製造する ためには、上述のプール血漿より得られたクリオプレシピテート数バッチ分が必要であり、約 80000 人分の血漿が使用されている （Japanese Journal of Transfusion Medicine 48. 27 , 2002)。 プール血漿は献血者から提供される血液を原料とするが、 日本の献血者におけるヒトパルボウイ ルス B19陽性率は推定 0.6ないし 0.8%と報告されている （日本輸血学会誌 1, 231 , 1996) 。 し たがって、 上述のクロスエイト Mの 1口ヅト分中には、 概算で 480から 640人分のヒトパルボウイ ルス B19陽性の血液が混入していることとなる。 ヒトパ 'ルポウィルス B19は、 エンベロープを持た ない直系 18ないし 26nmの小型ウィルスで、 60°Cにて 30分間の加熱処理、 pH3程度の酸処理、 ク口 口ホルム処理、 界面活性剤処理などを行っても耐性を有するため （Science 262 , 114, 1993) 、 通 常のウィルス除去方法では除去することが出来ない。 このため、 ヒトパルポウィルス B19の除去に は、 専用に開発された孔径数ないし数十ナノメートルのウィルス除去膜でろ過する工程等が必要と なる。 しかしながら、 多くの血漿分画製剤の製造工程においては、 このような小さい膜孔径を用い るろ過工程、 すなわちナノフィルトレーシヨン工程を導入するのは困難とされている （Japanese Journal of Transfusion Medicine 48> 27, 2002) 。 ヒトパルボウイルス B19は、 伝染性紅斑の原 因とされ、 健常人で抗 B19抗体を持たない場合、 一般的には一過性の風邪様症状を呈するのみであ るが、 場合により、 慢性溶血性貧血を引き起こすとされる。 また、 免疫不全な患者では、 時に重篤 な急性赤芽球癆を引き起こすといわれる。 さらに、 抗 M9抗体を持たない妊婦では流産に至る場合 や、 胎児が水腫を起こすことがあり、 子宮内死亡胎児の 15%が B19の DM検査結果が陽性だったと いう報告もある （Lancet , 1494, 2001) 。 乾燥濃縮人血液凝固第 因子製剤クロスエイト M (日 本赤十字社） において、 本製剤の投与による一過性のヒトパルポウィルス B19感染が疑われた事例 がー例、 平成 9年 9月に報告されている （日本小児血液学会誌 11, '289， 1997)。'
ノィアート （三菱ゥエルファーマネ; t®) やアンスロビン P (ァペンテイスべ一リング社製） など のアンチトロンビン III血液製剤の製造原料には、 B型肝炎ウィルス陰性、 C型肝炎ウィルス陰性、 ヒ ト免疫不全ウィルス Iおよび II型陰性であるプール血漿を用いるが、 原料におけるヒトパルボウイ ルス B19の有無は確認されない。
アンチトロンビン ΙΠ血液製剤の製造工程において、 温度 60°Cで 10時間のウィルス不活化処理、 すなわちパスヅリゼ一シヨン処理を行っているが、 タンパク質であるアンチトロンビン IIIが変'性 する、 AIDSウィルス、 ヒトパルボウイルス、 奕異型クロイツフェルト ·ャコブ病の原因となるプ リオンなどを完全に除去することができない、 などの問題がある。
以上のように、 血液製剤を用いる場合、 ウィルス感染のリスクがあること、 現在の技術ではその リスクを完全に排除することができないなどの欠点がある。 したがって、 安全性の向上したアンチ トロンビン ΠΙ製剤が求められる現状がある。
そのため、 ヒト血漿を原料とせず、 ヒトアンチトロンビン III を供給するために遺伝子組換え体 への切り替えが考えられている。 しかしながら、 遺伝子組換え技術を用いて作製した遺伝子組換え アンチトロンビン IIIの活性は血漿等の天然材料から得られたアンチトロンビン IIIの活性に及ばな い。 これは、 遺伝子組換え体に付加される糖鎖構造が血漿から取得されたアンチトロンビン III と 異なることに起因していると考えられており、 具体的には、 遺伝子組換えアンチトロンビン IIIに 付加する N-グリコシド結合複合型糖鎖にフコースが結合しているため、へパリンとの親和性が低く なり十分な抗血液凝固活性が発揮されないことが想定されている [Journal of Biological Chemistry 268, 17588 (1993), Biochemistry35, 8881 (1996)] 0 これまでに、 ペイビー 'ハムスタ 一腎臓由来の BHK細胞 [Journal of Biological Chemistry 17588 (1993)、 Biocliemistry35, 8881 (1996)]、 チャイニーズハムスター卵巣由来の CHO細胞 （WO02/02793)、 あるいはトランス ジエニックャギ （US2003096974) で生産した遺伝子組換えアンチトロンビン IIIに関する報告が. あるが、 いずれの場合にも遺伝子組換えアンチトロンビン IIIに結合する N-グリコシド結合複合型 糖鎖の還元末端側 N-ァセチルグルコサミンにフコースが結合している。生産された遺伝子組換えァ ンチトロンビン IIIの、 フコースが結合している N-グリコシド結合複合型糖鎖の全 N-グリコシド 結合複合型糖鎖に占める割合は、 宿主細胞ごとに異なっているが、 39〜95%と見積もられている。 培養方法の改良などの様々な工夫により、 N-グリコシド結合複合型糖鎖へフコースが結合している 糖鎖の割合を下げる試みがなされているが、 天然由来のアンチトロンビン III と同等の糖鎖構造を 有する遺伝子組換えアンチトロンビン IIIの生産には未だ成功していない。
発明の闢示
本発明は、 以下の （1 ) ~ ( 2 4 ) に関する。
( 1 ) 遺伝子組換えにより改変された宿主にアンチトロンビン IIIをコードする DNAを導入し て βられた形質転換体を培地に培養し、培養物中に Ν-グリコシド結合複合型糖鎖を有するァンチト 口ンビン III分子からなる組成物であつて、 Ν-グリコシド結合複合型糖鎖が該糖鎖の還元末端の Ν- ァセチルダルコサミンにフコースが結合していない糖鎖であるアンチトロンビン III組成物を生成 蓄積させ、 該培養物から該アンチトロンビン III糸誠物を採取することを特徴とする、 アンチトロ ンビン III組成物の製造方法。
( 2 ) ： Ν-グリコシド結合複合型糖鎖が、 該糖鎖の還元末端の Ν-Τセチルダルコサミンの 6位に フコースの 1位が結合していない糖鎖である、 （1 ) 記載の製造方法'。
( 3 ) 宿主細胞が、 細胞内糖ヌクレオチド GDP-フコースの合成に関与する酵素、 または Ν-ダリ コシド結合複合型糖鎖還元末端の Ν-ァセチルグルコサミンの 6位にフコースの 1位が α結合する 糖鎖修飾に関与する酵素が失活するようにゲノムが改変された宿主細胞である （1 ) または （2 ) 記載の製造方法。
( 4 ) 宿主細胞が、 細胞内糖ヌクレオチド GDP-フコースの合成に関与する酵素、 または Ν-グリ コシド結合複合型糖鎖還元末端の Ν-ァセチルグルコサミンの 6位にフコースの 1位が α結合する 糖鎖修飾に関与する酵素のゲノム上め対立遺伝子のすべてがノックアウトされた宿主細胞である、
( 1 )〜（3 ) のいずれか 1項に記載の製造方法。
( 5 ) 細胞内糖ヌクレオチド GDP-フコースの合成に関与する酵素が、 GDP-マンノース 4,6-デ ヒドラ夕ーゼ （GMD)及び GDP-4-ケト -6-デォキシ -D-マンノース- 3,5-ェピメラーゼ （Fx) からな る群から選ばれる酵素である、 （3 ) または （4 ) に記載の製造方法。
( 6 ) GDP-マンノース 4，6-デヒドラターゼが、 以下の (a)及び (b)からなる群から選ばれる DNA がコードする蛋白質である、 （5 ) に記載の製造方法。 (a)配列番号 7で表される塩基配列からなる DNA；
(b) 配列番号 7で表される塩基配列からなる DNAとストリンジヱントな条件でハイブリダィズし、 かつ GDP-マンノース 4，6-デヒドラターゼ活性を有する蛋白質をコ一ドする DNA。
( 7 ) GDP-マンノース 4,6-デヒドラ夕ーゼが、 以下の （a；)、 （b)及び (c) 'からなる群から選ばれる 蛋白質である、 （5 ) に記載の製造方法。
(a) 配列番号 8で表されるァミノ酸配列からなる蛋白質-;
(b) 配列番号 8で表されるアミノ酸配列において、 1 以上のアミノ酸が欠失、 置換、 挿入および Z または付加されたアミノ酸配列からなり、 かつ GDP-マンノース 4,6-デヒドラ夕ーゼ活性を有する 蛋白質；
(c)配列番号 8で表されるアミノ酸配列と 80%以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、 かつ GDP-マンノース 4,6-デヒドラ夕ーゼ活性を有する蛋白質。
( 8 ) GDP-4-ケト -6-デォキシ -D-マンノース- 3,5-ェピメラ一ゼが、 以下の （a) 及び (b)からなる 群から選ばれる DNAがコードする蛋白質である、 （ 5 ) に記載の製造方法。
(a)配列番号 9で表される塩基配列からなる DNA；
(b)配列番号 9で表される塩基配列からなる DNAとストリンジェントな条件でハイプリダイズし、 かつ GDP-4-ケト -6-デォキシ -D-マンノース- 3，5-ェピメラ一ゼ活性を有する蛋白質をコードする
( 9 ) GDP-4-ケト廿デォキシ -D-マンノース- 3,5-ェピメラーゼカ s、以下の （a)、 (b) および（c) か らなる群から選ばれる蛋白質である、 （5 ) に記載の製造方法。
(a) 配列番号 1 0で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質；
(b)配列番号 1 0で表されるアミノ酸配列において、 1 以上のアミノ酸が欠失、 置換、 挿入および /または付加されたァミノ酸配列からなり、かつ GDP-4-ケト -6-デォキシ -D-マンノース- 3，5-ェピメ ラーゼ活性を有する蛋白質；
(c)配列番号 1 0で表されるアミノ酸配列と 80%以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、 か つ GDP-4-ケト -6-デォキシ -D-マンノース- 3,5-ェピメラーゼ活性を有する蛋白質。
( 1 0 ) N-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端の N-ァセチルグ コ ミンの 6位にフコースの 1位が α結合する糖鎖修飾に関与する酵素が al,6-フコシルトランスフェラーゼである （3 ) また は （4 ) に記載の製造方法。
( 1 1 ) al,6-フコシルトランスフェラーゼが、 以下の （a)、 （b)、 （c)及び (d)からなる群から選ば れる DNAがコードする蛋白質である、 （1 0 ) に記載の製造方法。
(a)配列番号 1 1で表される塩基配列からなる DNA；
(b)配列番号 1 2で表される塩基配列からなる DNA；
(c)配列番号 1 1で表される塩基配列からなる DNA とストリンジェントな条件でハイプリダイズ し、 かつ al,6-フコシルトランスフヱラーゼ活性を有する蛋白質をコードする DNA；
(d)配列番号 1 2で表される塩基配列からなる DNA とストリンジェントな条件でハイプリダイズ し、 かつ al,6-フコシルトランスフヱラーゼ活性を有する蛋白質をコードする DNA。 ,
( 1 2 ) al,6-フコシルトランスフヱラーゼが、 以下の （a)、 (b)、 （c)、 （d)、 （e)および (£)からなる 群から選ばれる蛋白質である、 （1 0 ) に記載の製造方法。
(a)配列番号 1 3で表されるァミノ酸配列からなる蛋白質； (b)配列番号 14で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質；
(c)配列番号 13で表されるアミノ酸配列において、 1以上のアミノ酸が欠失、 置換、 挿入および Z または付加されたアミノ酸配列からなり、 かつ al，6-フコシルトランスフヱラーゼ活性を有する蛋 白質；
(d)配列番号 14で表されるアミノ酸配列において、 1以上のアミノ酸が欠失、 置換、 挿入および /または付加されたァミノ酸配列からなり、 かつ al，6:フコシルトランスフェラーゼ活性を有する 蛋白質；
(e)配列番号 13で表されるアミノ酸配列と 80%以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、 か つ al,6-フコシルトランスフ ラ一ゼ活性を有する舉白質；
(£)配列番号 14で表されるアミノ酸配列と 80%以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、 か つ al，6-フコシルトランスフヱラーゼ活性を有する蛋白質。
(13) 形質転換体が FERM BP-08472、 FERM BP-10083, FERM BP-10084S FERM- 10088 または FERMBP-10089である、 （1) 〜 （4) のいずれか 1項に記載の製造方法。
(14) 宿主細胞が、 下記の (a)、 （b)、 （c)、 （d)、 （e)、 （0、 （g)、 （h)、 （0及び φからなる群から選ば れる細胞である （ 1 ) 〜 （ 12 ) のいずれか 1墳に記載の製造方法。
(a) チヤィニーズハムス夕一卵巣組織由来 CHO細胞；
(b) ラヅトミエローマ細胞株 YB2/3HL.P2.Gll.l6Ag.20細胞；
(c)マウスミエローマ細胞株 NS0細胞；
(d)マウスミエ口一マ細胞株 SP2/0-Agl4細胞；
(e) シリアンハムスター腎臓組織由来; BHK細胞；
( ) ヒト白血病細胞株ナマルパ細胞；
(g)胚性幹細胞；
(h)受精卵細胞；
(i)植物細胞；
φ酵母。
( 15 )アンチトロンビン III組成物が、 N-グリコシド結合複合型耱鎖を有し、 かつ N-グリコシド 結合複合型糖鎖が該糖鎖の還元末端の N-ァセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖 である、 （1) 〜 （14) のいずれか 1項に記載の製造方法。
(16) N-グリコシド結合複合型糖鎖が、 該糖鎖の還元末端の N-ァセチルダルコサミンの 6位に フコースの 1位が結合していない糖鎖である、 （1) 〜 （15) のいずれか 1項に記載の製造方法。
(17) アンチトロンビン IIIが、 配列番号 4に示されるアミノ酸配列で表されるポリペプチド である、 （1) 〜 （16) のいずれか 1項に記載の製造方法。
(18) アンチトロンビン IIIが、 '配列番号 4に示されるアミノ酸配列において、 1以上のアミ ノ酸が欠失、 置換、 揷入および/または付加されたアミノ酸配列からなり、 かつへパリン結合活性 を有するポリペプチドである、 （1) 〜 （17) のいずれか 1項に記載の製造方法。
(19) アンチトロンビン IIIせ、 配列番号 4に示されるアミノ酸配列と 80 %以上の相同性を 有するアミノ酸配列からなり、かつへパリン結合活性を有するポリペプチドである、（1)〜（18) のいずれか 1項に記載の製造方法。
(20) アンチトロンビン IIIが、 以下の (a)または (b)から選ばれる DNAがコードするポリぺプ チドである、 （1 ) 〜 （1 9 ) のいずれか 1項に記載の製造方法。
(a) 配列番号 1で表される塩基配列からなる DNA；
(b) 配列番号 1で表される塩基配列からなる DNAとストリンジェントな条件でハイプリダイズし、 かつへパリン結合活性を有する蛋白質をコ一ドする DNA。
( 2 1 ) アンチトロンビン IIIか、 哺乳動物由来である、 （1 ) 〜 （2 0 ) のいずれか 1項に記載の 製造方法。 -
( 2 2 ) ( 1 ) 〜 （2 1 ) のいずれか 1項に記載の製造方法により得られる、 アンチトロンビン III 組成物。
( 2 3 ) ( 2 2 ) 記載のアンチトロンビン III組成物を有効成分として含有する医薬。
( 2 4 ) 医薬が、 血液凝固を伴う疾患に対する診断薬、 予防薬又は治療薬である、 （2 3 ) に記載の 以下、 本発明を詳細に説明する。"本願は、 2003 年 10 月 9 日に出願された日本国特許出願 2003-350164号の優先権を主張するものであり、 当該特許出願の明細書及び Zまたは図面に記載さ れる内容を包含する。
本発明は、 N-グリコシド結合複合型糖鎖を有する遺伝子組換えアンチト口ンビン III分子からな る組成物であって、 N-グリコシド結合複合型糖鎖が該糖鎖の還元末端の N-ァセチルダルコサミン にフコースが結合していない糖鎖であるアンチトロンビン III 物の製造方法及び該アンチトロ ンビン ΙΠ組成物を含有する医薬に関する。
本発明において、アンチトロンビン IIIとしては、下記 (a)、（b)、（c)、（d)、（e)あるいは (0の DNA がコードする蛋白質、 または下記 (g)、 （h)、 (i (j)、 （k)、 （1)、 （m)、 （n)あるいは (o)の蛋白質などが あげられる。
(a) 配列番号 1で表される塩基配列からなる DNA
(b) 配列番号 2で表される塩基配列からなる DNA
(c) 配列番号 3で表される塩基配列からなる DNA
(d) 配列番号 1で表される塩基配列からなる DNA とストリンジヱントな条件でハイプリダイズ し、 かつへパリン結合活性を有する蛋白質をコードする DNA ; '
(e) 配列番号 2で表される塩基配列からなる DNA とストリンジェントな条件でハイブリダィズ し、 かつへパリン結合活性を有する蛋白質をコードする DNA；
( ) 配列番号 3で表される塩基配列からなる DNA とストリンジェントな条件でハイブリダィズ し、 かつへパリン結合活性を有する蛋白質をコードする DNA ;
(g) 配列番号 4で表されるァミノ配列からなる蛋白質；
(h) 配列番号 5で表されるァミノ配列からなる蛋白質；
(i) 配列番号 6で表されるァミノ配列からなる蛋白質；
配列番号 4で表されるアミノ酸配列において、 1以上のアミノ酸が欠失、 置換、 揷入および/ または付加され'たアミノ酸配歹』からなり、 かつへパリン結合活性を有する蛋白質；
(k) 配列番号 5で表されるァミノ酸配列において、 1 以上のァミノ酸が欠失、 置換、 揷入および
/または付加されたアミノ酸配列からなり、 かつへパリン結合活性を有する蛋白質；
(1) 配列番号 6で表されるアミノ酸配列において、 1以上のアミノ酸が欠失、 置換、 揷入および/ または付加されたアミノ酸配列からなり、 かつへパリン結合活性を有する蛋白質； (m) 配列番号 4で表されるァミノ酸配列と 80%以上の相同性を有するァミノ酸配列からなり、か つへパリン結合活性を有する蛋白質； ；：
(n) 配列番号 5で表されるァミノ酸配列と 80%以上の相同性を有するァミノ酸配列からなり、 か つへパリン結合 ts性を有する蛋白質； '
(0) 配列番号 6で表されるァミノ酸配列と 80%以上の相同' f生を有するァミノ酸配列からなり、 か つへパリン結合活性を有する ¾白質。 - また、 アンチトロンビン IIIのアミノ酸配列をコードする DNAとしては、 配列番号 1、 2また は 3で表される塩基配列を有する DNA、配列番号 1、 2または 3で表される塩基配列を有する DNA とストリンジヱントな条件でハイブリダィズし、 かつへパリン結合活性を有する蛋白質をコードす る DNAなどがあげられる。
本発明において、 ストリンジェントな条件下でハイブリダィズする D N Aとは、 例えば配列番号 1、 2または 3で表される塩基配列を有する D N Aなどの D N Aまたはその一部の断片をプローブ として、 コロニー .ハイブリダィゼーシヨン法、 プラーク .ハイプリダイゼーシヨン法あるいはサ ザンブロットハイブリダィゼーシヨン法等を用いることにより得られる D N Aをいい、具体的には、 コロニ一あるいはプラーク由来の D N Aを固定化したフィルターを用いて、 0 . 7〜1 . 0 Mの塩 化ナトリウム存在下、 6 5 °Cでハイブリダィゼーシヨンを行った後、 0 . 1〜2倍濃度の S S C溶 液 （1倍濃度の S S C溶液の組成は、 Γ 5 O mM塩化ナトリウム、 1 5 mMクェン酸ナトリウムよ りなる） を用い、 6 5 °C条件下でフィルターを洗浄することにより同定できる D N Aをあげること ができる。,ハイブリダイゼ一シヨンは、 Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989) (以下、モレキュラー 'クローニング第 2版と略す）、 Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, (1987- 1997) (以下、 カレント 'プロ トコールズ 'イン 'モレキュラー 'バイオロジーと略す）、 DNA Cloning 1: Core Techniques, A Practical Approach, Second Edition, Oxford University (1995)等に記載されている'方法に準じて 行うことができる。 ハイブリダィズ可能な D N Aとしては、 具体的には、 配列番号 1、 2または 3 で表される塩基配列と少なくとも 6 0 %以上の相同性を有する D N A、 好ましくは 7 0 %以上、 よ り好ましくは 8 0 %以上、 さらに好ましくは 9 0 %以上、 特に好ま くは 9 5 %以上、 最も好まし くは 9 8 %以上の相同性を有する D N Aをあげることができる。
本発明において、 配列番号 4、 5または 6で表されるアミノ酸配列において 1以上のアミノ酸が 欠失、 置換、 揷入および/または付加されたアミノ酸配列からなり、 かつへパリン結合活性と実質 的に同一の活性を有する蛋白質とは、 モレキュラー 'クローニング第 2版、 カレント ·プロトコ一 ルズ.イン 'モレキュラー 'バイオロジー、 Nucleic Acids Research, 10, 6487 (1982)、 Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 79, 6409 (1982)、 Gene, 34, 315 (1985)、 Nucleic Acids Research, 13, 4431 (1985)、 Proc. Natl. Acad. Sci USA, 82, 488 (1'985)等に記載の部位特異的変異導入法を用いて、 例えば、 配 列番号 4、 5または 6で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードする D N Aに部位特異的変 異を導入することにより取得することができる蛋白質をいう。 欠失、 置換、 挿入および/または付 加されるアミノ酸の数は 1個以上でありその数は特に限定されないが、 上記の部位特異的変異導入 法等の公知の技術により、 欠失、 置換もしくは付加できる程度の数であり、 例えば、 1〜数十個、 好ましくは 1〜2 0個、 より好ましくは 1〜1 0個、 さらに好ましくは 1〜5個である。
また、 本発明において、 配列番号 4、 5または 6で表されるアミノ酸配列と 8 0 %以上の相同性 を有し、かつへパリン結合活性と実質的に同一の活性を有する蛋白質とは、 B L A S TCJ. Mol. Biol., 215, 403 (1990)〕 や F A S T A 〔Metiiods in Enzymology 183, 63 (1990)〕 等の解析ソフトを用い て計算したときに、 配列審号 4、 5または 6に記載のアミノ酸配列を有する蛋白質との相同性が少 なくとも 8 0 %以上、好ましくは 8 5 %以上、より好ましくは 9 0 %以上、さらに好ましくは 9 5 % 以上、 特に好ましくは 9 7 %以上、 最も好ましくは 9 9 %以上である蛋白質であることをいう。 本発明において、 N-グリコシド結合複合型糖鎖の還元末端の N-ァセチルグルコサミンにフコ一 スが結合していない糖鎖とは、 実質的に N-グリコシド結合複合型糖鎖の還元末端の N-ァセチルダ ルコサミンにフコースが結合していない糖鎖をいい、好ましくは N-グリコシド結合複合型糖鎖の還 元末端の N-ァセチルダルコサミンに結合するフコースの含有率が 0 %であることをいう。本発明の アンチトロンビン ΙΠ組成物としては、 具体的には、 後述の 4に記載の糖鎖分析において、 フコー スが実質的に検出できない程度である場合をいう。 実質的に検出できないとは、 測定の検出限界以 下であることをいう。
アンチトロンビン IIIなどの糖蛋白質に結合している N-グリコシ-ド結合糖鎖は、 様々な構造を有 しているが、 いずれの場合にも以下の構造式（I) に示す共通のコア構造を有することが知られてい る。 ·
土 Fuc Of l
±Gal S l + 4GICNAC )8 1 + 2Man a 1 、
6 6
±GlcNAc β 1 4Man 1 4GlcNAc β 1 ^GIcNAc
3 土 Gal j8 1 4GlcNAc β 1 2Man a 1
構造式（I) において、 ァスパラギンと結合する糖鎖の末端が還元末端、 反対側が非還元末端とい •5。
' N-グリコシド結合糖鎖としては、 コア構造の非還元末端にマンノースのみが結合するハイマンノ 一ス型糖鎖、 コア構造の非還元末端側にガラク トースー N-ァセチルダルコサミン （以 1^.、 Gal-GlcNAcと表記する） の枝を並行して 1ないしは複数本有し、 更に Gal-GkNAcの非還元末端 側にシアル酸、パイセクティングの N-ァセチルグルコサミンなどの構造を有する複合型糖鎖 コア 構造の非還元末端側にハイマンノース型と複合型の両方の枝を持つハイプリヅド型糖鎖などがあげ られる。
アンチトロンビン III分子には、 N-グリコシド結合糖鎖が結合するァミノ酸残基として N末端か ら 9 6番目、 1 3 5番目、 1 5 5番目および 1 9 2番目の 4力所のァスパラギン残基が存在する。 これらすべての残基に N-グリコシド結合糖鎖が結合しているアンチトロンビン III ( α型)、 または 9 6番目、 1 5 5番目および 1 9 2番目のァスパラギン残基に Ν-グリコシド結合糖鎖が結合してい るアンチトロンビン III (/?型） がある。
アンチトロンビン IIIに結合する Ν-グリコシド結合糖鎖としては、 具体的には、 上述の Ν-グリ コシ,ド結合複合型糖鎖をあげることができる。
アンチトロンビン III分子に結合する Ν-グリコシド結合複合型糖鎖としては、 前記構造式 （I) で示されるコア構造を含むいかなる糖鎖も包含されるので、 アンチトロンビン IIIに結合する 3本 または 4本の Ν-グリコシド結合糖鎖には多数の糖鎖の組み合わせが存在することになる。
したがって、 本発明の製造方法で得られるアンチトロンビン ΠΙ組成物は、 天然由来のアンチト ロンビン IIIの生物活性と質的に同等であれば、単一の糖鎖構造を有するァンチトロンビン III分子 から構成されていてもよいし、 複数の異なる糖鎖構造を有するアンチトロンビン ΠΙ分子から構成 されていてもよい。 天然由来のアンチトロンビン III とは、 血漿等の天然材料から得られたアンチ トロンビン IIIをいう。 .
そのようなアンチトロンビン III組成物としては、 Ν-グリコシド結合複合型糖鎖を有するァンチ トロンビン III分子からなる組成物であって、 Ν-グリコシド結合複合型糖鎖が該糖鎖の還元末端の Ν-ァセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖であるアンチトロンビン III組成物があ げられる。
Ν-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端の Ν-ァセチルグルコサミンにフコースが結合していない 糖鎖とは、 フコースの 1位が Ν-グリコシド結合複合型糖鎖の還元末端に位置する Ν-ァセチルグル コサミンの 6位に α結合していない糖鎖であれば、 いかなるものも包含される。 非還元末端の糖鎖 の構造は多様性があっても構わない。 '
Ν-グリコシド結合複合型糖鎖を有するアンチトロンビン III分子からなる組成物中の糖鎖構造の 解析は、 アンチトロンビン III分子からヒドラジン分解や酵素消化などの公知の方法 [^物ィ匕学実験 法 23—糖タンパク質糖鎖研究法 （学会出版センタ一） 高橋禮子編 （1989) ]を用い、 糖鎖を遊離さ せ、 遊離させた糖鎖を蛍光標識又は同位元素標識し、 標識した糖鎖をクロマトグラフィー法にて分 離することによつて決定することができる。また、遊離きせた糖鎖を HPAED-PAD法 [ジャーナル - ォブ. リキッド .クロマトグラフィー （J. Liq. Chromatogr.) , 6, 1577 (1983)]で分析することによ り決定することもできる。
本発明の製造方法においては、 遺伝子組換えにより改変された宿主細胞を用いることができる。 遺伝子組換えにより改変された宿主細胞とは、 人為的に遗伝子を組み換える操作により'細胞の性 質を変化させた宿主細胞をいう。 人為的に遺伝子を組み換える操作としては、 遺伝子を標的した遺 伝子破壊の手法、 酵素の遺伝子のドミナントネガティブ体を導入する手法、 酵素についての突然変 異を導入する手法、 酵素の造伝子の転写又は翻訳を抑制する手法、 などがあげられる。 また、 遺伝 子が組み換えられた細胞を人為的に選択してくる方法も人為的に遺伝子を組み換える操作に包含さ れる。 _
本発明において、 宿主細胞としては、 酵母、 動物細胞、 昆虫細胞、 植物細胞などがあげられ、 こ れらの細胞の具体的な例としては、 後述の 2 . に記載のものがあげられる。 動物細胞の具体例とし， ては、 チャイニーズハムスター卵巣組織由来の CHO 細胞、 ラヅ ト ミエローマ細胞株 YB2/3HL.P2.Gll.l6Ag.20細胞、 マウスミエローマ細胞株 NS0 細胞、 マウスミエローマ細胞株 SP2/0-Agl4細胞、 シリアンハムスター腎臓組織由来 BHK細胞、 ヒト白血病細胞株ナマルバ細胞、 胚性幹細胞、 受精卵細胞などがあげられる。 ' .
上述の宿主細胞としては、 以下の (a)または (b)などの性質を有する宿主細胞があげられる。
(a)細胞内糖ヌクレオチド GDP-フコースの合成に関与する酵素の活性が欠失するようにゲノム が改変された細胞； '
(b) N-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端の N-ァセチルグルコサミンの 6位にフコースの 1位が α結合する糖鎖修飾に関与する酵素の活性が欠失するようにゲノムが改変された細胞。
細胞内糖ヌクレオチド GDP-フコースの合成に関与する酵素としては、 GDP-マンノース 4，6-デ ヒドラ夕ーゼ （GMD)、 GDP-4-ケト -6-デォキシ -D-マンノース- 3,5-ェピメラ一ゼ （FX) などがあ げられる。 ·
本発明において、 GDP-マンノース 4,6-デヒドラ夕一ゼとしては、 下記 (a)あるいは (b)の DNAが コードする蛋白質、 または下記 (c)、 （d)あるいは (e)の蛋白質などがあげられる。
(a)配列番号 7で表される塩基配列からなる DNA； -
(b)配列番号 7で表される塩基配列からなる DNA とストリンジェントな条件でハイプリダイズ し、 かつ GDP-マンノース 4,6-デヒドラターゼ活性を有する蛋白質をコードする DNA ;
(c)配列番号 8で表されるァミノ酸配列からなる蛋白質；
(d)配列番号 8で表されるアミノ酸配列において、 1 以上のアミノ酸が欠失、 置換、 揷入および /または付加されたアミノ酸配列からなり、 かつ GDP-マンノース 4,6-デヒドラ夕ーゼ活性を有す る蛋白質； '
(e)配列番号 8で表されるァミノ酸配列と 80%以上の相同性を有するナミノ酸配列からなり、 か つ GDP-マンノース 4，6-デヒドラターゼ活性を有する蛋白質。
本発明において、 3Ρ-4-ケト -6-デォキシ マンノース- 3,5-ェピメラーゼとしては、下記 (a)ある いは (b)の DNAがコ一ドする蛋白質、 または下記 (c)、 （d)あるいは (e)の蛋白質などがあげられる。
(a)配列番号 9で表される塩基配列からなる DNA；
(b)配列番号 9で表される塩基配列からなる DNA とストリンジヱン卜な条件でハイブリダィズ し、かつ GDP-4-ケト -6-デォキシ -D-マンノース- 3,5-ェピメラーゼ活性を有する蛋白質をコードする DNA ;
(c)配列番号 1 0で表されるァミノ酸配列からなる蛋白質、；
(d)配列番号 1 0で表されるアミノ酸配列において、 1 以上のアミノ酸が欠失、 置換、 揷入およ び/または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ GDP-4-ケト -6-デォキシ -D-マンノース- 3,5-ェピ メラーゼ活性を有する蛋白質；
(e)配列番号 1 0で表されるアミノ酸配列と 80%以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、 かつ GDP-4-ケト -6-デォキシ -D-マンノース- 3,5-ェピメラ一ゼ活性を有する蛋白 。 '
N-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端の N-ァセチルダルコサミンの 6位にフコースの 1位が α 結合する糖鎖修飾に関与する酵素としては、 al,6-フコシルトランスフェラーゼなどがあげられる。 本発明において、 al,6-フコシルトランスフェラーゼとしては、 下記 (a)、 （b)、 （c)あるいは ( の DNAがコードする蛋白質、 または (e)、 、 （g)、 （h)、 （i)あるいは (j)の蛋白質などがあげられる。
(a)配列番号 1 1で表される塩基配列からなる DNA；
(b) 配列番号 1 2で表される塩基配列からなる DNA； (c) 配列審号 1 1で表される塩基配列からなる DNA とストリンジヱントな条件でハイプリダイ ズし、 かつ al,6-フコシルトランスフェラ一ゼ活性を有する蛋白質をコードする DNA；
(d) 配列番号 1 2で表される塩基配列からなる DNA とストリンジェントな条件でハイブリダィ ズし、 かつ al,6-フコシルトランスフェラ一ゼ活性を有する蛋白質をコードする DNA；
(e)配列番号 1 3で表されるァミノ酸配列からなる蛋白質；
(£)配列番号 1 4で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質；
(g) 配列番号 1 3で表されるアミノ酸配列において、 1以上のアミノ酸が欠失、 置換、 揷入およ び Zまたは付加されたァミノ酸配列からなり、 かつ al,6-フコシルトランスフエラーゼ活性を有す る蛋白質；
(h) 配列番号 1 4で表されるアミノ酸配列において、 1以上のアミノ酸が欠失、 置換、 挿入およ び Zまたは付加されたァミノ酸配列からなり、.かつ al,6-フコシルトランスフエラーゼ活性を有す る蛋白質；
(i)配列番号 1 3で表されるアミノ酸配列と 8 0 %以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、 かつ al,6-フコシルトランスフェラ一ゼ活性を有する蛋白質；
(j)配列番号 1 4で表されるアミノ酸配列と 8 0 %以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、 かつ cil,6-フコシルトランスフヱラーゼ活性を有する蛋白質。
また、 GDP-マンノース 4，6-デヒドラターゼのアミノ酸配列をコードする DNA としては、 配列 番号 7で表される塩基配列を有する DNA、配列番号 7で表される塩基配列を有する DNAとストり ンジェントな条件でハイブリダィズし、 かつ GDP-マンノース 4,6-デヒドラターゼ活性を有する蛋 白質をコードする DNAなどがあげられる。
GDP-4-ケト -6-デォキシ -D-マンノース- 3,5-ェピメラーゼのアミノ酸配列をコードする DNAとし ては、配列番号 9で表される塩基配列を有する DNA、配列番号 9で表される塩基配列を有する DNA とストリンジェントな条件でハイブリダィズし、 かつ GDP-4-ケト -6-デォキシ -D-マンノース- 3,5- ェピメラーゼ活性を有する蛋白質をコードする DNAなどがあげられる。
al,6-フコシルトランスフェラーゼのアミノ酸配列をコードする DNAとしては、 配列番号 1 1ま たは 1 2で表される塩基配列を有する DNA、 配列番号 1 1または 1' 2.で表される塩基配列を有す る DNAとストリンジェントな条件でハイブリダィズし、かつ α1,6-フコシルトランスフェラーゼ活 性を有する蛋白質をコードする DNAなどがあげられる。
本発明において、 ストリンジヱントな条件下でハイブリダィズする DNAとは、 例えば配列番号 7、 9、 1 1または 1 2で表される塩基配列かちなる DNAなどの DNAまたはその一部の断片を プローブとして、 コロニー .ハイブリダィゼーシヨン法、 プラーク 'ハイプリダイゼーシヨン法あ るいはサザンハイプリダイゼ一シヨン法等を用いることにより得られる DNAを意味し、 具体的に は、 コロニーあるいはプラーク由来の' DNAを固定化したフィル夕一を用いて、 0 . 7 ~ 1 . 0 Μ の塩化ナトリウム存在下、 6 5 °Cでハイブリダィゼーシヨンを行った後、 0 . 1〜2倍濃度の3 3 C溶液 ( 1倍濃度の S S C溶液の組成は、 1 5 0 mM塩化ナトリウム、 1 5 mMクェン酸ナトリウ ムよりなる） を用い、 6 5 °C条件下でフィル夕一を洗浄することにより同定できる DNAをあげる ことができる。 ハイブリダィゼーシヨンは、 Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 (以下、 モレキュラー 'クロ一ニング第 2版 と略す）、 Current Protocols inMolecular Biology, John Wiley & Sons, 1987-1997 (以下、 カレン ト 'プロトコ一ルズ 'イン'モレキュラー 'バイオロジーと略す）、 DNA Cloning 1: Core Techniques, A Practical Approach, Second Edition, Oxford University (1995)等に記載されている方法に準じ て行うことができる。ストリンジェントな条件下でハイプリダイズ可能な DNAとして具体的には、 配列番号 7、 9、 1 1または 1 2で表される塩基配列と少なくとも 6 0 %以上の相同性を有する DNA、 好ましくは 7 0 %以上、 より好ましくは 8 0 %以上、 さらに好ましくは 9 0 %以上、 特に好 ましくは 9 5 %以上、 最も好ましくは 9 8 %以上の相同性を有する DNAをあげることができる。 本発明において、 配列番号 8で表されるアミノ酸配列において 1以上のアミノ酸が欠失、 置換、 揷入および/または付加されたアミノ酸配列からなり、 かつ GDP-マンノース 4,6-デヒドラターゼ 活性を有する蛋白質、 配列番号 1 0で表され ¾アミノ酸配^において 1以上のアミノ酸が欠失、 置 換、揷入および/または付加されたアミノ酸配列からなり、 かつ GDP-4-ケト -6-デォキシ -D-マンノ ース -3,5-ェピメラーゼ活性を有する蛋白質、 および配列番号 1 3または 1 4で表されるアミノ酸配 列において 1以上のァミノ酸が欠失、置換、揷入および/または付加されたァミノ酸配列からなり、 かつ al,6-フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質は、 モレキュラー .クローニング第 2 版、 カレント ·プロトコールズ'イン 'モレキュラー'バイオロジ'一、 Nucleic Acids Research, 10, 6487 (1982)、 Proc. Natl. Acad. Sci" USA, 79, 6409 (1982)、 Gene, 34, 315 (1985)、 Nucleic Acids Research, 13, 4431 (1985)、 Proc. Natl. Acad. Sci USA,82, 488 (1985)等に記載の部位特異的変異 導入法を用いて、 例えば、 配列番号 8、 1 0、 1 3または 1 4で表される塩基配列を有する DNA に部位特異的変異を導入することにより取得することができる。 欠失、 置換、 揷入および Zまたは 付加されるアミノ酸の数は 1個以上でありその数は特に限定されないが、 上記の部位特異的変異導 入法等の周知の技術により、欠失、置換もしくは付加できる程度の数であり、例えば、 1〜数十個、 好ましくは 1 ~ 2 0個、 より好ましくは 1 ~ 1 0個、 さらに好ましくは 1 ~ 5個である。
また、 本発明において、 配列番号 8、 1 0、 1 3または 1 4で表されるアミノ酸配列と 8 0 %以 上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、 かつ GDP-マンノース 4,6-デヒドラターゼ活性、 GDP-4-ケト -6-デォキシ -D-マンノース- 3,5-ェピメラーゼ活性または al，6-フコシルトランスフェラ ーゼ活性を有するためには、 それぞれ配列番号 8、 1 0、 1 3または 1 4で表されるアミノ酸配列. と B L A S Τ 〔 J. Mol. BioL' 215, 403 (1990)〕 や F A S T A 〔Methods in Enzymology, 183, 63 (1990)〕等の解析ソフトを用いて計算したときに、少なくとも 8 0 %以上、好ましくは 8 5 %以上、 より好ましくは 9 0 %以上、 さらに好ましくは 9 5 %以上、 特に好ましくは 9 7 %以上、 最も好ま しくは 9 9 %以上の相同性を有する蛋白質であることをいう。
また、 上述の酵素活性が欠失した宿主細胞、 すなわち細胞内糖ヌクレオチド GDP-フコースの合 成に関与する酵素、 または N-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端の N-ァセチルグルコサミンの 6 位にフコースの 1位が α結合する糖鎖修飾に関与する酵素が失活するようにゲノムが改変された宿 主細胞に、 アンチトロンビン III分子'をコードする DNAを導入することによって、 本発明のアン チトロンビン III組成物を生産する形質転換体を得ることができる。
細胞内糖ヌクレオチド GDP-'フコースの合成に関与する酵素、 または Ν-グリコシド結合複合型糖 鎖還元末端の Ν-ァセチルダルコサミンの 6位にフコースの 1位が α結合する糖鎖修飾に閧与する 酵素が失活するようにゲノムが改変されたとは、 該酵素の発現を欠失させるように該遺伝子の発現 調節領域に変異を導入したり、 あるいは該酵素の機能を欠失させるように該遺伝子のァミノ酸配列 に変異を導入することをいう。 変異を導入するとは、 ゲノム上の塩基配列に欠失、 置換、 挿入およ び/または付加といった塩基配列の改変を行うことをいい、 改変したゲノム遺伝子の発現または機 能を完全に抑制することをノヅクアウトするという。 ゲノム遺伝子がノックアウトされた具体的な 例としては、 標的となる遺伝子のすべてまたは一部がゲノムから欠失された例があげられる。 標的 となる遺伝子の開始コドンを含むェクソンのゲノム領域を染色体上から除くことでノヅクァゥト状 態とすることができる。
このような細胞を取得する方法としては、 目的とするゲノムの改変を行うことができれば、 いず れの手法でも用いることができる。 上述の酵素活性を欠失させる手法として、
(a) 酵素の遺伝子を標的とした遺伝子破壊の手法；
( b ) 酵素の遺伝子のドミナントネガティプ体を導入する手法；
( c ) 酵素についての突然変異を導入する手法；
( d ) 酵素の遺伝子の転写又は翻訳を抑制する手法；
( e ) N-グリコシド結合糖鎖還元末端の N-ァセチルグルコサミンの 6位とフコースの 1位が α 結合した糖鎖構造を認識するレクチンに耐性である株を選択する手法；
などがあげられる。 ' .
Ν-グリコシド結合糖鎖還元末端の Ν-ァセチルグルコサミンの 6位とフコースの 1位が α結合し た糖鎖構造を認識するレクチンとしては、 該糖鎖構造を認識できるレクチンであれば、 いずれのレ クチンでも用いることができる。 その具体的な例としては、 レンズマメレクチン LCA (Lens Culinaris由夹の Lentil Agglutinin) エンドゥマメレクチン PSA (Pisum sativum由夹の Pea Lectin), ソラマメレクチン VFA iVicia faba 由夹の Agglutinin). ヒィロチャワン夕ケレクチン AAL (AleTiria aurantia由籴の Lectin 等をあげることができる。
レクチンに耐性な細胞とは、 レクチンを有効濃度与えたときにも、 生育が阻害されない細胞をい う。有効濃度とは、 ゲノム遺伝子が改変される以前の細胞 （以下、 「親株細胞」 とも称す） が正常に 生育できない濃度以上であり、 好ましくは、 ゲノム遺伝子が改変される以前の細胞が生育できない 濃度と同濃度、 より好ましくは 2〜5倍、 さらに好ましくは 10倍、 最も好ましくは 20倍以上の濃 度である。 .
本発明において、 生育が阻害されないレクチンの有効濃度は、 細胞株に応じて適宜定めればよい が、 通常 10 g/ml〜10ing/ml、 好ましくは 0.5mg/m！〜 2.0mg/mlである。
ゲノム遺伝子が改変される以前の細胞、 すなわち親株細胞とは、 細胞内糖ヌクレオチド GDP-フ コースの合成に関与する酵素、 または N-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端の N-ァセチルダルコ サミンの 6位にフコースの 1位が α結合する糖鎖修飾に関与する酵素のゲノム遺伝子を改変させる ための手法を施す前の細胞を包含する。 ゲノム遺伝子が改変される以前の細胞としては、 特に限定 はないが、 例えば、 以下の細胞が好例としてあげられる。
ゲノム遺伝子が改変される以前の NS0 細胞の親株細胞としては、 バイオ/テクノロジー (BIO/TECHNOLOGY), 10, 169 (1992)、バイォテクノロジ一'バイォエンジニアリング (Bioteclmol. Bioeng.), 73, 261, (2001)等の文献に記載されている NS0細胞があげられる。 また、 理化学研究所 細胞開発銀行に登録されている NS0細胞株 (RCB0213), あるいはこれらの株を様々な無血清培地 に劇 I化させた亜株などもあげられる。
ゲノム遺伝子が改変される以前の SP2/0-Agl4細胞の親株細胞としては、 ジャーナル .ォブ ·ィ ムノロジー (J. Inmmnol. lMS, 317, (1981)、 ネイチヤー (Nature), 22£， 269, (1978) 、 ヒューマン · アンチイボディズ'アンド'ハイブリドーマズ (Human Antibodies and Hybridomas), 3, 129， (1992) 等の文献に記載されている SP2/0-Ag14 細胞があげられる。 また、 American Type Culture Collection (以下、 ATCCと表記する） に登録されている SP2/0-Ag14細胞 （ATCC CRL-1581) あ, るいはこれらの株を様々な無血清培地に馴化させた亜株 (ATCC CRL-1581.1)などもあげられる。
ゲノム遺伝子が改変される以前のチャイニーズハムスター卵巣組織由来 CHO細胞の親株細胞 としては、 Journal of Experimental Medicine, 108, 945 (1958)、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 60, 1275 (1968)、 Genetics, 55, 513 (1968)、 Chromosoma, 41, 129 (1973)、 Methods in Cell Science, 18, 115 (1996)、 Radiation Research, 148, 260 (1997)、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 4216 (1980)、 Proc. Natl. Acad. Sci. 60, 1275 (1968)、 Cell, 6, 121 (1975)、 Molecular Cell Genetics, Appendix Ι,Π (p883-900)、 Somatic Cell and Molecular Genetics 12, 555 (1986)等の文献に記載されている CHO 細胞があげられる。 また、 ATGCに登録されている CHO-K1株 （ATCC CCL-61)、 CHO/ dhfr-株 (ATCC CRL-9096)、 Pro-5株 （ATCC CRL-1781) や、 市販の CHOS株 （Ltfetechiiologies社製 Cat#11619)、 あるいはこれらの株を様々な無血清培地に馴化させた亜株などもあげられる。
ゲノム遺伝子が改変される以前のシリアンハムスター腎臓組織由来 BHK細胞の親株細胞として は、 Proc R Soc Med. 56, 1062 (1963)や、 Nature. 203, 1355 (1964)の文献に記載されている ΒΗΚ 細胞があげられる。 また、 ATCCに登録されている BHK-21株（ATCC CCL-10)、 あるいはこれら の株を様々な無血清培地に馴化させた亜株などもあげられる。
ゲノム遺伝子が改変される以前のラヅトミエローマ細胞株 YB2/,3HL.P2.Gll.l6Ag.20細胞の親 株細胞としては、 Y3/Ag1.2.3細胞 （ATCC CRL-1631) から樹立された株化細胞が包含される。 そ の具体的な例としては、 J. Cell. Biol., 93, 576 (1982)、 Methods Enzymol. 73B, 1 (1981)等の文献 に記載されている YB2/3HL.P2.Gll.l6Ag.20細胞があげられる。 また、 ATCCに登録されている YB2/3HL.P2.Gll.l6Ag.20細胞 （ATCC CRL-1662) あるいはこれらの株を様々な無血清培地に馴 化させた亜株などもあげられる。 '
本発明のアンチトロンビン IIIを生産する細胞としては、具体的には、 a l，6-フコシルトランスフ エラーゼをコードする遺伝子がノヅクアウトされた CHO細胞にアンチトロンビン IIIをコード る遺伝子を導入した形質転換株である Ms705 pKAN-ATIII 27株、 & 1,6-フコシルトランスフェラ. ーゼをコードする遺伝子がノックアウトされた CHO細胞にアンチトロンビン IIIをコードする造 伝子を導入した形質転換株を無血清培地に馴化した株である pKAN-ATIII APMS705株、 GDP-マ ンノース 4，6-デヒドラ夕ーゼをコードする遺伝子がノヅクアウトされた CHO細胞にアンチトロン ビン IIIをコードする遺伝子を導入した形質転換株を無血清培地に馴化した株である pKAN-ATIIIl GMDKO株等があげられる。
Ms705 pKAN-ATIII 27株は平成 15年 9月 9 日付けで、 pKAN-ATIII APMS705株および pKAN-ATIIIl GMDKO株は平成 16年 8月 10日付けで、独立行政法人産業技術総合研究所特許生 物寄託センタ一 （日本国茨城県つくば巿東 1丁目 1番地 1中央第 6 ) に FERMBP-08472、 FERM BP- 10088および FERM BP- 10083としてそれそれ寄託されている。
また、本発明の天然由来のアンチトロンビン III組 物と同等の生物活性を有する変異体（以下、 アンチトロンビン III変異体と称す） である配列番号 4で示されるアミノ酸配列の 135番目のァス パラギンをグルタミンに置換した変異体を生産する細胞としては、 具体的には、 a l,6-フコシルト ランスフェラーゼをコードする遺伝子がノックアウトされた CHO細胞に配列番号 40記載のアンチ トロンビン III変異体をコ一ドする遺伝子を導入した形質転換株を無血清培地に馴化した株である p KAN-ATinN135Q AFMS705株、 GDP-マンノース 4,6-デヒドラタ一ゼをコードする遺伝子がノ ヅクアウトされた CHO細胞に配列番号 40記載のアンチトロンビン III変異体をコードする遺伝子 を導入した形質転»を無血清培地に瞓化した株である PKAN-ATIIIN135Q6 GMDKO株があげ られる。
p KAN-ATIIIN135Q AFMS705株および pKAN-A niNl35Q6 GMDKO株は平成 16年 8月 10 日付けで、 独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託セン夕ー （日本国茨城県つくば巿東 1丁 目 1番地 1中央第 6 ) に FERM BP-10089および FERM BP-1008 としてそれそれ寄託されてい る。 '
上述の形質転換体を用いて製造することにより、 天然由来のアンチトロンビン III と同等の生物 活性を有するアンチトロンビン III組成物を製造することができる。
アンチトロンビン III組成物の N-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端の N-ァセチルグルコサミンに フコースが結合していないとは、 後述に記載の糖鎖分析において、 フコースが実質的に検出できな い程度である場合をいう。実質的に検出できない程度とは、測定の検出限界以下であることをいう。 アンチトロンビン IIIの生物活性としては、 へパリンに対する結合活性、 抗血液凝固活性などが あげられる。 ·
アンチトロンビン III組成物のへパリンに対する結合活性、'抗血液凝固活性は、 公知の抗トロン ビン活性測定法やへパリンコファクタ一活性測定法などの in vitro試験あるいは汎発性血管内血液 凝固 候群 (Disseminated intravascular coagulation syndrome j モアル動物を用いた in vivo試 験などを用いて測定することができる （The Second Series of Pharmaceutical Research and Development Volume 20 Blood Product, Ikuo Suzuki, ed., Hirokawa Publishing Company, Tokyo, Japan, 1992； 医学のあゆみ， 120, 1147, 1982； 薬理と治療 , 5843, 1989； 臨床と研究 62, 3573, 1985； 臨床と研究 fi¾ 3688, 1985；応用薬理 30, 589， 1985)。
以下、 本発明のアンチト口ンビン III組成物の製造方法を具体的に説明する。
1 . アンチトロンビン III組成物を生産するために用いる宿主細胞の作製
アンチトロンビン III組成物を生産するために用いる宿主細胞は、'以下に述べる手法により作製 することができる。
( 1 ) 酵素の遺伝子を標的とした遗伝子破壊の手法
アンチトロンビン III組成物作製のために用いる宿主細胞は、 細胞内糖ヌクレオチド GDP-フコ —スの合成に関与する酵素または N-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端の N-ァセチルグルコサミ ンの 6位にフコースの 1位が α結合する糖鎖修飾に関与する酵素 （以下、 「フコース修飾に関連す る諸酵素」 と表記する） の遺伝子を標的とし、 遺伝子破壊の方法を用いることにより作製すること ができる。細胞内糖ヌクレオチド GDP-フコースの合成に関与する酵素としては、具体的には、 GDP- マンノース 4,6-デヒドラターゼ （以下、 「GMD」 と表記する）、 GDP-4-ケト -6-デォキシ -D-マンノ ース -3,5-ェピメラ一ゼ （以下、 「Fx」 と表記する） などがあげられる。 N-グリコシド結合複合型糖 鎖還元末端の N-ァセチルグルコサミンの 6位にフコースの 1位が a結合する糖鎖修飾に関与する 酵素としては、 具体的には、 al，6-フコシルトランスフェラーゼ、 α-L-フコシダ一ゼなどがあげられ る。
ここでいう遺伝子とは、 DNAまたは RNAを含む。 遺伝子破壊の方法としては、 標的とする酵素の遺伝子を破壊することができる方法であればいか なる方法も包含される。その例としては、アンチセンス法、 リボザィム法、相同組換え法、 NA-DNA ォリゴヌクレオチド法（以下、「RDO法」と表記する）、 RNAィンターフェアレンス法（以下、「RNAi 法」 と表記する)、 レ'トロウィルスを用いた方法、 トランスポゾンを用いた方法等があげられる。以 下これらを具体的に説明する。 '
( a ) アンチセンス法又はリポザィム法による本発明のアンチトロンビン III組成物を作製するた めの宿主細胞の作製
アンチトロンビン III組成物作製のために用いる宿主細胞は、 フコース修飾に関連する諸酵素遺 伝子を標的とし、細胞工学， 12, 239 (1993)、バイォ /テクノ口ジー (BIO/TECHNOLOGY), 17, 1097 (1999)、 ヒューマン ·モレキュラー ·ジエネテイクス (Hum. Mol. Genet.), 5, 1083 (1995)、 細胞ェ 学, IS, 255 (1994)、 プロシ一ディングス .ォブ ·ザ .ナショナル ·アカデミー .ォブ .サイエンス (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.), 96, 1886 (1999)等に記載されたアンチセンス法またはリボザィム 法を用いて、 例えば、 以下のように作製することができる。 - '
フコース修飾に関連する諸酵素をコードする cDNAあるいはゲノム DNAを調製する。 .
調製した cDNAあるいはゲノム DNAの塩基配列を決定する。 ·
決定した DNAの配列に基づき、 フコース修飾に関連する諸酵素をコードする DNA部分、 非翻 訳領域の部分あるいはィントロン部分を含む適当な長さのアンチセンス遺伝子またはリボザィムの コンストラクトを設計する。
該アンチセンス遺伝子、またはリポザィムを細胞内で発現させるために、調製した DNAの断片、 または全長を適当な発現ベクターのプロモー夕一の下流に揷入することにより、 組換えベクターを 作製する。
該組換えベクターを、 該発現ベクターに適合した宿主細胞に導入することにより形質転換体を得 る。
フコース修飾に関連する諸酵素の活性を指標として形質転換体を選択することにより、 アンチト ロンビン ΠΙ組成物を作製のために用いる宿主細胞を得ることができる。 また、 細胞膜上の糖蛋白 質の糖鎖構造または産生糖蛋白質分子の糖鎖構造を指標として形質 ife換体を選択することにより、 本発明のアンチトロンビン III組成物作製のために用いる宿主細胞を得ることもできる。
アンチトロンビン ΙΠ組成物を作製するために用いられる宿主細胞'としては、 酵母、 動物細胞、 昆虫細胞、 植物細胞など、 標的とするフコース修飾に関連する諸酵素の遺伝子を有しているもので あればいずれも用いることができる。 具体的には、 後述の 2に記載の宿主細胞があげられる。
発現べクタ一としては、 上記宿主細胞において自立複製が可能であるか、 ないしは染色体中への 組み込みが可能で、 設計したアンチセンス遺伝子、 またはリポザィムを転写できる位置にプ Πモー 夕一を含有しているものが用いられる。 具体的には、 後述 2に記載の発現べクタ一があげられる。 各種宿主細胞への遺伝子の導入方法としては、 後述 2に記載の各種宿主細胞に適した組換えべク ターの導入方法を用いることができる。 '
フコース修飾に関連する諸酵素の活性を指標として形質転換体を選択する方法としては、例えば、 以下の方法があげられる。
形質転換体を選択する方法
フコース修飾に関連する諸酵素の活性が欠失した細胞を選択する方法としては、 文献 [新生化学 実験講座 3—糖質 I，糖タンパク質 (東京化学同人)日本生化学会編 (1988)]、 文献 [細胞工学， 別冊， 実 験プロトコールシリーズ，グライコバイオロジー実験プロトコール,糖タンパク質 '糖脂質 ·プロテ ォグリカン (秀潤ネ ±)谷口直之 ·鈴木明美 ·古川清 ·菅原一幸監修 （1996) ]、 モレキュラー'クロー ニング第 2版、 カレント 'プロトコールズ 'イン 'モレキュラー ·バイオロジー等に記載された生 化学的な方法あるいは遺伝子工学的な方法などを用いて、 フコース修飾に関連する諸酵素の活性を 測定する方法があげられる。 生化学的な方法としては、.例えば、 酵素特異的な基質を用いて酵素活 性を評価する方法があげられる。 遺伝子工学的な方法としては、 例えば、 酵素遺伝子の mRNA量 を測定するノ一ザン解析や RT-PCR法等があげられる。
細胞膜上の糖蛋白質の糖鎖構造を指標として形質転換体を選択する方法としては、 例えば、 後述 1の （5 ) に記載の方法があげられる。 産生糖蛋白質分子の糖鎖構造を指標として形質転換体を選 択する方法としては、 例えば、 後述 4または後述 5に言 3載の方法があげられる。
フコース修飾に関連する諸酵素をコードする cDNAを調製する方法としては、例えば、 下記に記 載の方法があげられる。 - cDNAの調製方法
各種宿主細胞の組織又は細胞から全 RNA又は mRNAを調製する。
調製した全 UNA又は mRNAから cDNAラィブラリ一を作製する。
フコース修飾に関連する諸酵素のァミノ酸配列に基づいて、 デジエネレイティブプライマ一を作 製し、 作製した cDNAライブラリーを錶型として PCR法でフコース修飾に関連する諸酵素をコー ドする遺伝子断片を取得する。
取得した遺伝子断片をプローブとして用い、 cDNAライブラリ一をスクリーニングし、 フコース 修飾に関連する諸酵素をコードする DNAを取得することができる。
ヒト又は非ヒト動物の組織又は細胞の mRNAは市販のもの (例えば Clontech社製)を用いてもよ いし、 以下のようにしてヒト又は非ヒト動物の組織又は細胞から調製してもよい。
ヒト又は非ヒト動物の組織又は細胞から全 RNAを調製する方法としては、 チォシアン酸グァニ ジン-トリフルォロ酢酸セシウム法 [メソヅズ'イン ·ェンザィモロジ一 (Methods in Enzymology), 154, 3 (1987)1、 酸性チォ.シアン酸グァニジン ·フエノール 'クロ口'ホルム （A G P C ) 法 [アナリ ティカル ·バイオケミストリ一(Analytical Biochemistry), 162, 156 (1987)； 実験 g学、 1937 (1991)] などがあげられる。
また、 全 RNAから poly(A)+RNAとして mRNAを調製する方法としては、 ォリゴ （dT) 固定化 セルロースカラム法 （モレキュラー 'タローニング第 2版） 等があげられる。
さらに、 Fast Track mRNA Isolation Kit (Invitrogen社製)、 Quick Prep mRNA Purification Kit ■ (Pharmacia社製） などの市販のキヅトを用いることにより mRNAを調製することができる。 次に、調製したヒト又は非ヒト動物'の組織又は細胞 mRNAから cDNAライブラリーを作製する。， cDNAライブラリ一作製法としては、 モレキュラー 'クロ一ニング第 2版、 カレント、プロトコ一 ルズ 'イン 'モレキュラー ·バイォロジ一、 A Laboratory Manual, 2nd Ed.(1989)等に記載された 方法、 あるいは市販のキット、 例えば Superscript Plasmid System for cDNA Synthesis and Plasmid CloniQg (Life Technologies社製)、 ZAP-cDNA Synthesis Kit (STRATAGE E社製） を 用いる方法などがあげられる。 '
cDNAライプラリーを作製するためのクローニングベクターとしては、大腸菌 K12株中で自立複 製できるものであれば、 ファージベクター、 プラスミドベクター等いずれでも使用できる。 具体的 には、 ZAP Express [STRATAGE E社、 ストラテジーズ (Strategies), ， 58 (1992)]、 pBluescript II SK (+) [ヌクレイック 'アシッド -リサーチ (Nucleic Acids Research), 17, 9494 (1989)]、 λΖΑΡ II
(STRATAGENE社製)、 AgtlO, Agtll [ディーェヌエー ·クローニング ·ァ ·プラクティカル · アプローチ (DNA cloni g, A Practical Approach), 1, 49 (1985)], ATriplEx (Clontech社製)、 AExCell
(Pharmacia社製)、 pT7T318U (Pharmacia社製)、 p.cD2 [モレキュラー 'セルラー 'バイオ口 ジ一 (Mol. Cell. Biol.), 3, 280 (1983)] および pUCl8 [ジーン (Gene), 33, 103 (1985)] 等をあげる ことができる。
cDNAライプラリーを作製するための宿主微生物としては、 微生物であればいずれでも用いるこ とができるが、 好ましくは大腸菌が用いられる。 具体的には、 Escherichia coli XLl-Blue MRF'
[STRATAGENE社、 ストラテジーズ (Strategies), , 81 (1992)]、 Escherichia coli C600 [ジエネ テイクス（Genetics), 39, 440 (1954)]、 Escherichia coliY1088 [サイエンス（Science), 222, 778 (1983)]、 Escherichia coliYl090 [サイエンス (Science), 222, 778 (1983)]、 Escherichia coHNM522
[ジャーナル ·ォブ 'モレキュラー ·バイオロジー (J. Mol. Biol.), l≤g， 1 (1983)]、 Escherichiacoli K802 [ジャーナル ·ォブ ·モレキュラー ·バイオロジー (J. Mol. Biol), 16, 118 (1966)] および Escherichiacoli JM105 [ジーン (Gene), 38, 275 (1985)] 等が用いられる。
' この cDNAライブラリーは、 そのまま以降の解析に用いてもよいが、 不完全長 cDNAの割合を 下げ、 なるべく完全長 cDNAを効率よく取得するために、 菅野らが開発したオリゴキャップ法 [ジ ーン (Gene), 138, 171 (1994)； ジーン (Gene), 200, 149 (1997)； 蛋白質核酸酵素， 41, 603 (1996); 実 験医学, 11, 2491 (1993)； cDNAクローニング (羊土 ¾)(1996)； 遺伝子ライブラリ一の作製法 (羊土社) (1994)] を用いて調製して以下の解析に用いてもよい。
フコース修飾に関連する諸酵素のァミノ酸配列に基づいて、 該ァミノ酸配列をコードすることが 予測される塩基配列の 5'末端および 3'末端の塩基配列に特異的なデジエネレイティププライマーを 作製し、作製した cDNAライブラリーを錶型として PCR法 [ピーシーアール 'プロトコールズ (PCR Protocols), Academic Press (1990)] を用いて DNAの増幅を行うことにより、 フコース修飾に関連 する諸酵素をコードする遺伝子断片を取得することができる。 '
取得した遺伝子断片がフコース修飾に関連する諸酵素をコードする DNAであることは、 通常用 いられる塩基配列解析方法、 例えばサンガー （Sanger) らのジデォキシ法 [プロシーディングス - ォブ ·ザ ·ナショナル ·アカデミー ·ォブ ·サイエンス (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.), 74, 5463 (1977)] あるいは ABI PRISM377DNAシークェンサ一 （Applied Biosystems社製） 等の塩基配列 分析装置を用いて分析することにより、 確認することができる。
'該遺伝子断片をプローブとして、 ヒト又は非ヒト動物の組織又は細胞に含まれる mRNAから合 成した cDNAあるいは cDNAライブラリーからコロニーハイブリダィゼーシヨンやプラークハイ ブリダィゼーシヨン （モレキュラー 'クローニング第 2版） 等を用いて、 フコース修飾に関連する 諸酵素の DNAを取得することができる。
また、 フコース修飾に関連する諸酵素をコードする遺伝子断片を取得するために用いたプライマ 一を用い、 ヒト又は非ヒト動物の組織又は細胞に含まれる mRNAから合成した cDNAあるいは cDNAライブラリーを铸型として、 PCR法を用いて増幅することにより、 フコース修飾に関連する 諸酵素の cDNAを取得することもできる。 取得したフコース修飾に関連する諸酵素をコードする DNAの塩基配列は、 通常用いられる塩基 配列解析方法、 例えばサンガ一 （Sanger) らのジデォキシ法 [プロシーディングス 'ォブ 'ザ 'ナ ショナル .ァカデミー.ォブ.サイエンス (proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.), 74, 5463 (1977)] あるい は ABI PRISM377DNAシークェンサ一（Applied Biosystems社製）等の塩基配列分析装置を用い て分析することにより、 該 DNAの塩基配列を決定することができる。
決定した cDNAの塩基配列をもとに、 BLAST等の相同性検索プログラムを用いて、 Genbank、 EMBLおよび DDBJなどの塩基配列データベースを検索することにより、取得した DNAがデータ ベース中の遺伝子の中でフコース修飾に関連する諸酵素をコードしている遺伝子であることを確認 することもできる。
上記の方法で得られる細胞内糖ヌクレオチ GDP-フコースの合成に関与する酵素をコードする 遺伝子の塩基配列としては、 例えば、 配列番号 7または 9に記載の塩基配列があげられる。
上記の方法で得られる N-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端の N-ァセチルダルコサミンの 6位 にフコースの 1位が α結合する糖鎖修飾に関与する酵素をコードする遺伝子の塩基配列としては、 例えば、 配列番号 1 1または 1 2に記載の塩基配列があげられる。 ' 決定された DNAの塩基配列に基づいて、フォスフォアミダイト法を利用した DNA合 β model 392 (Perkin Elmer社製） 等の DNA合成機で化学合成することにより、 フコ一ス修飾に関連する 諸酵素の cDNAを取得することもできる。
フコース修飾に関連する諸酵素のゲノム DNAを調製する方法としては、 例えば、 以下に記載の 方法があげられる。
ゲノム DNAの調製方法
ゲノム DNAを調製ずる方法としては、 モレキュラー ·クローニング第 2版やカレント ·プロト コールズ ·ィン ·モレキュラー ·バイオロジー等に記載された公知の方法があげられる。 また、 ゲ ノム DNA ライブラリースクリーニングシステム （Genome Systems 社製） や Universal GenomeWalkerTMKits (CLON ECH社製）などを用いることにより、 フコース修飾に関連する諸 酵素のゲノム DNAも取得することもできる。
取得したフコース修飾に関連する諸酵素をコードする DNAの塩墓配列は、 通常用いられる塩基 配列解析方法、 例えばサンガー （Sanger) らのジデォキシ法 [プロシーディングス 'ォブ ·ザ ·ナ ショナル ·アカデミー ·ォブ'サイエンス (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.), 24, 5463 (1977)] あるい は ABI PRISM377DNAシークェンサ一（Applied Biosystems社製）等の塩基配列分析装置を用い て分析することにより、 該 DNAの塩基配列を決定することができる。
決定したゲノム DNA の塩基配列をもとに、 BLAST 等の相同性検索プログラムを用いて、 Genbank、EMBLおよび DDBJなどの塩基配列デ一夕ベースを検索することにより、取得した DNA がデー夕ベース中の遺伝子の中でフゴース修飾に関連する諸酵素をコードしている遺伝子であるこ とを確 することもできる。
決定された DNAの塩基配列に基づいて、フォスフォアミダイト法を利用した DNA合 β model 392 (Perkin Elmer社製） 等の DNA合成機で化学合成することにより、 フコース修飾に関連する 諸酵素のゲノム DNAを取得することもできる。
上記の方法で得られる細胞内糖ヌクレオチド GDP-フコースの合成に関与する酵素のゲノム DNAの塩基配列としては、 例えば配列番号 1 5、 1 6、 1 7および 1 8に記載の梅基配列があげ られる。
上記の方法で得られる N-グリ シド結合複合型糖鎖還元末端の N-ァセチルグルコサミンの 6位 にフコースの 1位が α結合する糖鎖修飾に閧与する酵素のゲノム DNAの塩基配列としては、 例え ば配列番号 1 9に記載の塩基配列があげられる。 · ' また、 発現べクタ一を用いず、 フコース修飾に関連する諸酵素の塩基配列に Sづいて設計したァ ンチセンスオリゴヌクレオチドまたはリボザィムを、 直接宿主細胞に導入することで、 アンチトロ ンビン III組成物作製のために用いる宿主細胞を得ることもできる。
アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはリボザィムは、 常法または DNA合成機により調製する ことができる。具体的には、フコース修飾に関連する諸酵素をコードする cDNAおよびゲノム DNA の塩基配列のうち、 連続した 5〜 1 5 0塩基、 好ましくは 5 ~ 6 0塩基、 より好ましくは 1 0 ~ 4 0塩基に相当する配列を有するオリゴヌクレオチドの配列情報に基づき、 該ォリゴヌクレオチドと 相補的な配列に相当するオリゴヌクレオチド （アンチセンスオリゴヌクレオチド） または該オリゴ ヌクレオチドの配列を含むリボザィムを合成して調製することができる。
ォリゴヌクレオチドとしては、 ォリゴ RNAおよび該ォリゴヌクレオチドの誘導体 （以下、 ォリ ゴヌクレオチド誘導体という） 等があげられる。
ォリゴヌクレオチド誘導体としては、 ォリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がホスフォ ロチォエート結合に変換されたォリゴヌクレオチド誘導体、 オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエス テル結合が N 3 '- P 5 'ホスフォアミデート結合に変換されたォリゴヌクレオチド誘導体、 ォリゴヌ クレオチド中のリボースとリン酸ジエステル結合がぺプチド核酸結合に変換されたォリゴヌクレオ チド誘導体、オリゴヌクレオチド中のゥラシルが C - 5プロピニルゥラシルで置換されたオリゴヌク レオチド誘導体、ォリゴヌクレオチド中のゥラ.シルが C - 5チアゾールゥラシルで置換された誘導体 オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のシ！ シンが C - 5プロピニルシトシンで置換されたォ リゴヌクレオチド誘導体、 オリゴヌクレオチド中のシトシンがフエノキサジン修飾シトシン (phenoxazine -modified cytosine) で置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、 オリゴヌクレオチド 中のリボースが 2 '- 0 -プロピルリボースで置換されたォリゴヌクレオチド誘導体、 あるいはォリゴ ヌクレオチド中のリボースが 2 '-メトキシエトキシリボースで置換ざれたォリゴヌクレオチド誘導 体等があげられる [細胞工学, 16, 1463 (1997)]。
( b ) 相同組換え法によるアンチトロンビン III 物作製のために用いる宿主細胞の作製 アンチトロンビン ΙΠ組成物作製のために用いる宿主細胞は、 フコース修飾に関連する諸酵素の 遺伝子を標的とし、 染色体上の標的遺伝子を相同組換え法を用いて改変することによって作製する ことができる。
染色体上の標的遺伝子の改変は、 Manipulating the Mouse Embryo A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor' Laboratory Press (1994) (以下、 「マニピュレイティング · ザ 'マウス '： tンブリオ'ァ ·ラボラトリー'マニュアル」 と略す）、 Gene Targeting, A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press (1993)、 パイォマニュアルシリーズ 8 ジーン夕 ーゲヅティング， E S細胞を用いた変異マウスの作製,羊土社 (1995) (以下、 「E S細胞を用いた変 異マウスの作製」 と略す） 等に記載の方法を用い、 例えば以下のように行うことができる。
フコース修飾に関連する諸酵素のゲノム： DNAを調製する。
ゲノム DNAの塩基配列にも基づき、 改変する標的遺伝子 （例えば、 フコース修飾に関連する諸 酵素の構造遺伝子、 あるいはプロモーター遺伝子） を相同組換えするためのターゲットベクターを 作製する。 ·
作製した夕ーゲットベクターを宿主細胞に導入し、 染色体上の標的遺伝子と夕一ゲットべク夕一 の間で相同組換えを起こした細胞を選択することにより、 アンチトロンビン III組成物作製のため に用いる宿主細胞を作製することができる。
宿主細胞としては、 酵母、 動物細胞、 昆虫細胞、 植物細胞等、 標的とするフコース修飾に関連す る諸酵素の遺伝子を有しているものであればいずれも用いることができる。 具体的には、 後述 2に 記載の宿主細胞があげられる。
フコース修飾に関連する諸酵素のゲノム DNAを調製する方法としては、 上記 1の （1 ) の （a ) に記載のゲノム DNAの調製方法などがあげられる。
上記の方法で得られる細胞内糖ヌクレオチド GDP-フコースの合成に関与する酵素のゲノム 'DNAの塩基配列として、 例えば配列番号 1 5、 1 6、 1 7および 1 8に記載の塩基配列があげら れる。 ' - 上記の方法で得られる N-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端の N-ァセチルグルコサミンの 6位 にフコースの 1位が α結合する糖鎖修飾に関与する酵素のゲノム DNAの塩基配列として、 例えば 配列番号 1 9に記載の塩基配列があげられる。 .
染色体上の標的遺伝子を相同組換えするための夕ーゲヅトぺク夕一は、 Gene Targeting, A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press (1993)、 バイォマニュアルシリーズ 8 ジーン夕ーゲヅティング， E S細胞を用いた変異マウスの作製 (羊土社) (1995)等に記載の方法にし たがって作製することができる。 ターゲットベクターは、 リプレースメント型、 インサーシヨン型 いずれでも用いることができる。 . .
各種宿主細胞への夕一ゲットベクターの導入には、 後述の 2に記載の各種宿主細胞に適した組換 えベクターの導入方法を用いることができる。
相同組換え体を効率的に選別する方法として、 例えば、 Gene Targeting, A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press (1993)、 バイォマニュアルシリーズ 8 ジーン夕ーゲヅティ ング， E S細胞を用いた変異マウスの作製 (羊土社) (1995)等に記載のポジティブ選択、プロモーター 選択、 ネガティブ選択、 ポリ A選択などの方法を用いることができる。選別した細胞株の中から目 的とする相同組換え体を選択する方法としては、 ゲノム DNAに対するサザンハイプリダイゼーシ ヨン法 （モレキュラー'クロ一ニング第 2版） や; PCR法 [ピーシ一アール ·プロトコールズ (PCR Protocols), Academic Press (1990)] 等があげられる。
( c ) RD0方法によるアンチトロンビン III組成物を作製するために用いる宿主細胞の作製
' アンチトロンビン III組成物を作製するために用いる宿主細胞は、 フコース修飾に関連する諸酵 素の遺伝子を標的とし、 RD0法を用い、 例えば、 以下のように作製することができる。
フコース修飾に関連する諸酵素の cDNAあるいはゲノム DNAを上記 1の （1 ) の （a ) に記載 の方法を用い、 調製する。
調製した cDNAあるいはゲノム DNAの塩基配列を決定する。
決定した DNAの配列に基づき、 フコース修飾に関連する諸酵素をコードする部分、 非翻訳領域 の部分あるいはイントロン部分を含む適当な長さの RD0のコンストラクトを設計し合成する。 合成した RDOを宿主細胞に導入し、 標的とした酵素、 すなわちフコース修飾に関連する諸酵素 に変異が生じた形質転換体を選択することにより、 アンチトロンビン III組成物作製のための宿主 細胞を作製することができる。
宿主細胞としては、 酵母、 動物細胞、 昆虫細胞、 植物細胞等、 標的とするフコース修飾に鬨連す る諸酵素の遺伝子を有しているものであればいずれも用いることができる。 具体的には、 後述 2に 記載の宿主細胞があげられる。 '
各種宿主細胞への RDOの導入には、 後述 2に記載の各種宿主細胞に適した組換えベクターの導 入方法を用いることができる。
フコース修飾に関連する諸酵素の cDNAを調製する方法としては、例えば、上記 1の（ 1 )の（a ) に記載の cDNAの調製方法などがあげられる。
フコース修飾に関連する諸酵素のゲノム DNAを調製する方法としては、 例えば、 上記 1の （1 ) の （a ) に記載のゲノム DNAの調製方法などがあげられる。
DNAの塩基配列は、 適当な制限酵素などで切断後、 pBluescript S (-) (Stratagene社製） 等の プラスミドにサブクローエングし、通常用いられる塩基配列解析方法、例えば、サンガー（Sanger) らのジデォキシ法 [プロシーディングス ·ォブ ·ザ ·ナショナル ·アカデミー 'ォブ ·サイエンス (Proc. Natl. Acad. Sci.,U.S.A.), 74, 5463 (1977)]等の反応を行い、塩基配列自動分析装置、例えば、 ABI PRISM377DNAシークェンサ一 （Applied Biosystems社製） 等の塩基配列分析装置を用いて 分析することにより、 確認することができる。
RDOは、 常法または DNA合成機を用いることにより調製.することができる。
RDO を宿主細胞に導入し、 標的とした酵素、 フコース修飾に関連する諸酵素の遺伝子に変異が 生じた細胞を選択する方法としては、 モレキュラー 'クローニング第 2版、 カレント 'プロトコ一 ルズ ·イン 'モレキユラ一 ·バイオロジ一等に記載された染色体上の遗伝子の変異を直接検出する 方法があげられる。
また、 前記 1の （1 ) の （a ) に記載の、 導入したフコース修飾に関連する諸酵素の活性を指標 として形質転換体を選択する方法、 後述 1の （5 ) に記載の細胞膜上の糖蛋白質の糖鎖構造を指標 として形質転換体を選択する方法、 あるいは、 後述 4または後述 5に記載の産生轉蛋白質分子の糖 鎖構造を指標として形質転換体を選択する方法も用いることができあ。 '
RDO のコンストラクトは、 サイエンス (Science), 273, 1386 (1996)； ネイチヤー'メデイシン (Nature Medicine), 4, 285 (1998); へパト口ジー (Hepatology), 25, 1462 (1997); ジ一ン 'セラ!^一 (Gene Therapy), 5, 1960 (1999)； ジーン ·セラピー (Gene Therapy), 5, 1960 (1999); ジャーナル · ォブ 'モレキュラー'メデイシン (J. Mol. Med.), 75, 829 (1997)； プロシーディングス 'ォブ 'ザ . ナショナル .ァカデミ一 ·ォブ ·サイエンス (Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 96, 8774 (1999); プロシ 一ディンダス 'ォブ ·ザ ·ナショナル 'アカデミー'ォブ'サイエンス (Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 96, 8768 (1999)； ヌクレイヅク ·ァシッド · リサーチ (Nuc. Acids. Res.), 27, 1323 (1999); ィンべス ティゲーション 'ォブ'ダーマト口ジー (Invest. Dematol.), Ill, 1172 (1998); ネイチヤー -バイオ テクノロジー (Nature Biotech.), 16, 1343 (1998); ネィチヤ一 ·バイオテクノロジー (Nature Biotech.), 18, 43 (2000)； ネイチヤー'パイォテクノロジー (Nature Biotech.), 18, 555 (2000)等の記 載に従って設計することができる。
( d ) RNAi法によるアンチトロンビン III組成物を作製するために用いる宿主細胞の作製 アンチトロンビン III組成物を作製するために用いる宿主細胞は、 フコース修飾に関連する諸酵 素の遺伝子を標的とし、 RNAi法を用い、 例えば、 以下のように作製することができる。' フコース修飾に関連する諸酵素の上記 1の （1 ) の （a ) に記載の方法を用い、 cDNAを調製す る。
調製した cDNAの塩基配列を決定する。
決定した cDNAの配列に基づき、 フコース修飾に関連する諸酵素をコードする部分あるいは非翻 訳領域の部分を含む適当な長さの RNAi遺伝子のコンストラクトを設計する。 ' 該 RNAi遺伝子を細胞内で発現させるために、調製した cDNAの断片、 または全長を適当な発現 ベクターのプロモーターの下流に揷入することにより、 組換えべク夕一を作製する。
該組換えベクターを、 該発現ベクターに適合した宿主細胞に導入することにより形質転換体を得 る。
導入したフコース修飾に関連する諸酵素の活性、 あるいは産生糖蛋白質分子または細胞表面上の 糖蛋白質の糖鎖構造を指標に形質転換体を選択することで、 アンチトロンビン III組成物を作製す るために用いる宿主細胞を得ることができる。 .
宿主細胞としては、 酵母、 動物細胞、 昆虫細胞、 植物細胞等、 標的とするフコース修飾に関連す る諸酵素の遺伝子を有しているものであればいずれも用いることができる。 具体的には、 後述 2に 記載の宿主細胞があげられる。
発現ベクターとしては、 上記宿主細胞において自立複製可能ないしは染色体への組み込みが可能 で、 設計した RNAi遺伝子を転写できる位置にプロモーターを含有しているものが用いられる。 具 体的には、 後述 2に記載の発現べクタ一があげられる。
各種宿主細胞への遺伝子の導入には、 後述 2に記載の各種宿主細胞に適した組換えベクターの導 入方法を用いることができる。
フコース修飾に関連する諸酵素の活性を指標として形質転換体を選択する方法としては、例えば、 本項 1の （1 ) の （a ) に記載の方法があげられる。
細胞膜上の糖蛋白質の糖鎖構造を指標として形質転換体を選択する方法としては、 例えば、 本項 1の （5 ) に記載の方法があげられる。 産生糖蛋白質分子の糖鎖構造を指標として形質転換体を選 択する方法としては、 例えば、 後述 4または後述 5に記載の方法があげられる。
フコース修飾に関連する諸酵素の cDNAを調製する方法としては、例えば、本項 1の（ 1 )の（a) に記載された cDNAの調製方法などがあげられる。
また、 発現ベクターを用いず、 フコース修飾に関連する諸酵素の塩基配列に基づいて設計した siRNA (short interfering RNA)遺伝子を、 直接宿主細胞に導入することで、 アンチトロンビン III 組成物を作製するために用いる宿主細胞を得ることもできる。
siRNA遺伝子は、 常法または DNA合^ «を用いることにより調製することができる。
siRNA遺伝子のコンストラクトは； [ネイチヤー (Nature), 391, 806 (1998); プロシーディング ス .ォブ.ザ-ナショナル ·アカデミー.ォブ.サイエンス (Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 95, 15502 (1998)； ネイチヤー (Nature), S2S， 854 (1998)； プロシ一ディングス ·ォブ ·ザ ·ナショナル ·ァカ デミ一'ォプ ·サイエンス (Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 96, 5049 (1999); セル (Cell), 95, 1017 (1998)； プロシーディンダス 'ォブ ·ザ ·ナショナル 'アカデミー'ォブ 'サイエンス (Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 96, 1451 (1999)； プロシーディングス ·ォブ ·ザ ·ナショナル ·アカデミー 'ォブ.サ ィエンス (Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 95, 13959 (1998)； ネイチヤー 'セル'バイオロジー (Nature Cell Biol.), 2 70 (2000)]等の記載に従つて設計することができる。
( e ) トランスポゾンを用いた方法による、 アンチトロンビン 'III組成物を作製するために用い る宿主細胞の作製
アンチトロンビン III組成物を作製するために用いる宿主細胞は、 ネイチヤー ·ジエネテイクス (Nature Genet.), 25, 35 (2000)等に記載のトランスポゾンのシステムを用い、 フコース修飾に関連 する諸酵素の活性、 あるいは産生糖蛋白質分子または細胞膜上の糖蛋白質の糖鎖構造を指標に突然 変異体を選択することで、 アンチトロンビン III組成物を作製するために用いる宿主細胞を作製す ることができる。
トランスポゾンのシステムとは、 外来遺伝子をランダムに染色体上に揷入させることで突然変異 を誘発させるシステムであり、 通常、 トランスポゾンに揷まれた外来遺伝子に突然変異を誘発させ るべク夕一として用い、 この遺伝子を染色体上にランダムに挿入させるためのトランスポゼースの 発現ベクターを同時に細胞の中に導入する。 . .
トランスポゼースは、 用いるトランスポゾンの配列に適したものであればいかなるものも用いる ことができる。
外来遺伝子としては、 宿主細胞の DNAに変異を誘起するものであればいかなる'遺伝子も用いる ことができる。
宿主細胞としては、 酵母、 動物細胞、 昆虫細胞、 植物細胞等、 標的とするフコース修飾に関連す る諸酵素の遺伝子を有しているものであればいずれも用いることができる。 具体的には、 後述 2に 記載の宿主細胞があげられる。 各種宿主細胞への遗伝子の導入には、 後述 2に記載の各種宿主細胞 に適した組み換えべクタ一の導入方法を用いることができる。
フコース修飾に関連する諸酵素の活性を指標として'突然変異体を選択する方法としては、例えば、 本項 1の （1 ) の （a ) に記載の方法があげられる。
' 細胞膜上の糖蛋白質の糖鎖構造を指標として突然変異体を選択する方法としては、 例えば、 本項 1の （5 ) に記載の方法があげられる。 産生糖蛋白質分子の糖鎖構造を指標として突然変異体を選 択する方法としては、 例えば、 後述 4または後述 5に記載の方法があげられる。
( 2 ) 酵素の遺伝子のドミナントネガティブ体を導入する手法 '
アンチトロンビン III組成物を作製するために用いる宿主細胞は、 フコース修飾に関連する諸酵 素の遺伝子を標的とし、 該酵素のドミナントネガティブ体を導入する手法を用いることにより作製 することができる。 細胞内糖ヌクレオチド GDP-フコースの合成に関与する酵素としては、 具体的 には、 GMD、 Fxなどがあげられる。 N-ダリコシド結合複合型糖鎖還元末端の N-ァセチルグルコサ ミンの 6位にフコースの 1位が α結合する糖鎖修飾に関与する酵素としては、 具体的には、 α 1 , 6—フ シルトランスフェラーゼ、 α-L·フコシダ一ゼなどがあげられる。
これらの酵素は、 基質特異性を有したある特定の反応を触媒する酵素であり、 このような基質特 異性を有した触媒作用を有する酵素の活性中心を破壊することで、 これらの酵素のドミナントネガ ティブ体を作製することができる。 標的とする酵素のうち、 GMD を例として、 そのドミナントネ ガティブ体に作製について具体的に以下に述べる。
大腸菌由来の GMDの立体構造を解析した結果、 4つのアミノ酸 （133番目のトレオニン、 135 番目のグルタミン酸、 157番目のチロシン、 161番目のリシン） が酵素活性に重要な機能を担って いることが明らかにされている （Structure, S， 2, 2000)。 すなわち、 立体構造の情報にもとづきこ れら 4つのアミノ酸を異なる他のアミノ酸に置換した変異体を作製した結果、 いずれの変異体にお いても有意に酵素活性が低下していたことが示されている。一方、 GMDの補酵素 NADPや基質で ある GDP-マンノースとの結合能に関しては、 いずれの変異体においてもほとんど変化が観察され ていない。 従って、 GMD の酵素活性を担うこれら 4つのアミノ酸を置換することによりドミナン トネガティブ体を作製することができる。 大腸菌由来の GMDのドミナントネガティブ体の作製の 結果に基づき、 ァミノ酸配列情報をもとにした相同性比較や立体構造予測を行うことにより、 例え ば、 CHO細胞由来の GMD (配列番号 8 )では、 155番目のトレオニン、 157番目のグルタミン酸、 179番目のチロシン、 183番目のリシンを他のアミノ酸に置換することによりドミナントネガティ プ体を作製することができる。このようなァミノ酸置換 導入した遺伝子の作製は、モレキュラー- クローニング第 2版、 カレント 'プロトコールズ 'イン 'モレキュラー ·バイオロジ.一等に記載さ れた部位特異的変異導入法を用いて行うことができる。
アンチトロンビン III組成物を作製するために用いる宿主細胞は、 上述のように作製した標的酵 素のドミナントネガティブ体をコードする遺伝子 （以下、 ドミナン-トネガティブ体遺伝子と略記す る） を用い、 モレキュラー ·クローニング第 2版、 カレント 'プロトコールズ 'イン 'モレキユラ 一 'バイオロジー、 マニピユレ一ティング ·マウス 'ェンプリオ第 2版等に記載された遺伝子導入 の方法に従って、 例えば、 以下のように作製することができる。
フコース修飾に関連する諸酵素のドミナントネガティブ体遺伝子を調製する。
調製したドミナントネガティブ体遺伝子の全長 DNAをもとにして、 必要に応じて、 該蛋白質を コードする部分を含む適当な長さの DNA断片を調製する。
該 DNA断片、 または全長 DNAを適当な発現ベクターのプロモー夕一の下流に揷入することに より、 組換えベクターを作製する。
該組換えベクターを、 該発現べクタ一に適合した宿主細胞に導入することにより、 形質転換体を 得る。
フコース修飾に関連する諸酵素の活性、 あるいは産生糖蛋白質分子または細胞膜上の糖蛋白質の 糖鎖構造を指標に形質転換体を選択することで、 アンチトロンビン III «物を作製するために用 いる宿主細胞を作製することができる。 '
宿主細胞としては、 酵母、 動物細胞、 昆虫細胞、 植物細胞等、 標的とするフコース修飾に関連す る諸酵素の遺伝子を有しているものであればいずれも用いることができる。 具体的には、 後述 2に 記載の宿主細胞があげられる。
' 発現ベクターとしては、 上記宿主細胞において自立複製可能ないしは染色体中への組み込みが可 能で、 目的とするドミナントネガティブ体をコードする DNAを転写できる位置にプロモー夕一を 含有しているものが用いられる。 具体的には、 後述 2に記載の発現ベクターがあげられる。
各種宿主細胞への遺伝子の導入には、 後述 2に記載の各種宿主細胞に適した組換えベクターの導 入方法を用いることができる。
フコース修飾に関連する諸酵素の活性を指標として形質転換体を選択する方法としては、例えば、 後述 1の （1 ) の （a) に記載の方法があげられる。
細胞膜上の糖蛋白質の糖鎖構造を指標として形質転換体を選択する方法としては、 例えば、 後述 1の （5 ) に記載の方法があげられる。 産生糖蛋白質分子の糖鎖構造を指標として形質転換体を選 択する方法としては、 例えば、 後述 4または後述 5に記載の方法があげられる。 ( 3 ) 酵素に突然変異を導入する手法
アンチトロンビン ΙΠ組成物を作製するために用いる宿主細胞は、 フコース修飾に関連する諸酵 素の遺伝子に突然変異を導入し、 該酵素に突然変異を生じた所望の細胞株を選択する手法を用いる ことにより作製できる。
細胞内糖ヌクレオチド GDP-フコースの合成に関与する酵素としては、 具体的には、 GMD、 Fx などがあげられる。 N-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端の N-ァセチルダルコサミンの 6位にフ コースの 1位が α結合する糖鎖修飾に関与する酵素としては、 具体的には、 α ΐ , 6—フコシルト ランスフエラーゼ、 α-L-フコシダーゼなどがあげられる ο
フコース修飾に関連する諸酵素に突然変異を導入する方法としては、 1 ) 突然変異誘発処理で親 株を処理した突然変異体あるいは自然発生的に生じた突然変異体から、 フコース修飾に関連する諸 酵素の活性を指標として所望の細胞株を選択する方法、 2 ) 突然変異誘発処理で親株を処理した突 然変異体あるいは自然発生的に生じた突然変異体から、 生産糖蛋白質分子の糖鎖構造を指標として 所望の細胞株を選択する方法、 3 ) 突然変異誘発処理で親株を処理した突然変異体あるいは自然発 生的に生じた突然変異体から、 該細胞の細胞膜上の糖蛋白質の糖鎖構造を指標として所望の細胞株 を選択する方法などがあげられる。 ·
突然変異誘発処理としては、 親株の細胞の DNAに点突然変異、 欠失あるいはフレームシフト突 然変異を誘起するものであればいかなる処理も用いることができる。
具体的には、 ェチルニトロソゥレア、 ニトロソグァ二ジン、 ベンゾピレン、 ァクリジン色素によ る処理、 放射線の照射などがあげられる。 また、 種々のアルキル化剤や発癌物質も突然変異誘発物 質として用いることができる。 突然変異誘発物質を細胞に作用させる方法としては、 例えば、 組織 培養の技術第三版 （朝倉書店） 日本組織培養学佘編 (1996)、 ネイチヤー ·ジエネテイクス (Nature Genet.), 24, 314, (2000)等に言 B«の方法をあげることができる。
自然発生的に生じた突然変異体としては、 特別な突然変異誘発処理を施さないで、 通常の細胞培 養の条件で継代培養を続けることによって自然発生的に生じる突然変異体をあげることができる。 フコース修飾に関連する諸酵素の活性を測定する方法としては、 例えば、 本項 1の （1 ) の （a ) に記載の方法があげられる。 産生糖蛋白質分子の糖鎖構造を識別す^方法としては、 例えば、 後述 4または後述 5に記載の方法があげられる。 細胞膜上の糖蛋白質の糖鎖構造を識別する方法として は、 例えば、 本項の 1の （5 ) に記載の方法があげられる。
( 4 ) 酵素の遺伝子の転写又は翻訳を抑制する手法
本発明のアントトロンビン III組成物を作製するために用いる宿主細胞は、 フコース修飾に関連 する諸酵素の遺伝子を標的とし、 アンチセンス RNA/DNA技術 [バイオサイエンスとインダスト リー， 322 (1992)、 ィ匕学， ， 681 (1991)、 Biotechnology,9, 358 (1992)、 Trends in BiotechnologylO, 87 (1992)、 Trends in BiotecloiologylO, 152 (1992)、細胞工学， 16, 1463 (1997)]、 トリプル 'ヘリックス技術 [Trends in Biotechnology 10, 132 (1992)] 等を用い、 標的とする遺伝 子の転写または翻訳を抑制することで作製することができる。
細胞内糖ヌクレオチド GDP-フコースの合成に関与する酵素としては、 具体的には、 GMD、 Fx などがあげられる。 N-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端の N-ァセチルグルコサミンの 6位にフ コースの 1位が α結合する糖鎖修飾に関与する酵素としては、 具体的には、 α ΐ , 6—フコシルト ランスフェラーゼ、 α-L-フコシダーゼなどがあげられる。 ( 5 ) N-グリコシド結合糖鎖還元末端の N-ァセチルダルコサミンの 6位とフコースの 1位が α結 合した糖鎖構造を認識するレクチンに耐性である株を選択する手法
アンチトロンビン III組成物を作製するために用いる宿主細胞は、 Ν-グリコシド結合糖鎖還元末 端の Ν-ァセチルグルコサミンの 6位とフコースの 1位が α結合した糖鎖構造を認識するレクチン に耐性である株を選択する手法を用いることにより作製することができる。
Ν-グリコ.シド結合糖鎖還元末端の Ν-ァセチルグルコサミンの 6位とフコースの 1位が α結合し た糖鎖構造を認識するレクチンに耐性である株を選択する手法としては、 例えば、 ソマテイク -セ ル 'アンド 'モレキュラー ·ジエネティクス （Somatic Cell Mol. Genet.) , 12, 51 (1986)等に記載 のレクチンを用いた方法があげられる。 '
レクチンとしては、 Ν-グリコシド結合糖鎖還元末端の Ν-ァセチルダルコサミンの 6位とフコー スの 1位が α結合した糖鎖構造を認識するレクチンであればいずれのレクチンでも用いることがで きるが、 その具体的な例としては、 レンズマメレクチン LCA (LensCulinaris 由夹の Lentil Agglutinin) エンドゥマメレクチン PSA (Pisum sativum由来の Bea Lectin), ゾラマメレクチン VFA (Vicia faba由夹の Agglutinin ヒィロチャワンタケレクチン AAL (Aleuriaaurantia由夹 の Lectin) 等をあげることができる。 ·
具体的には、 1 pg/mL〜 1 mg/mLの濃度の上述のレクチンを含む培地で 1日〜 2週間、好ましく は 1日〜 1竭間培養し、 生存している細胞.を継代培養あるいはコロニーをピックアップし別の培養 容器に移し、 さらに引き続きレクチンを含む培地で培養を続けることによって、本発明の N-グリコ シド結合糖鎖還元末端の N-ァセチルグルコサミンの 6位とフコースの 1位が α結合した糖鎖構造 を認識するレクチンに耐性である株を選択することができる。
2 . 本発明のア チトロンビン III組成物の製造方法
アンチトロンビン III組成物は、 モレキュラー 'クローニング第 2版、 カレント 'プロトコ一ル ス 'イン 'モレキユラ一 ·ノ イォロシ一、 Antibodies, A Laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988 (以下、アンチボディズと略す)、 Monoclonal Antibodies: principles and practice, Third Edition, Acad. Press, 1993 (以下、 モノクローナルアンチボディズと略す）、 Antibody Engineering, A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press, 1996 (以下、 アンチ ボディエンジニアリングと略す） 等に記載された方法を用い、 例えば、 以下のように宿主細胞中で 発現させて取得することができる。
アンチトロンビン III分子の全長 cDNAを調製し、 該アンチトロンビン III分子をコードする部 分を含む適当な長さの DNA断片を調製する。 .
該 DNA断片、 または全長 cDNAを適当な発現べクタ一のプロモーターの下流に挿入することに より、 組換えべクタ一を作製する。
該組換えベクターを、 該発現べクタ一に適合した宿主細胞に導入することにより、 アンチトロン ビン III分子を生産する形質転換体を得ることができる。
宿主細胞としては、 酵母、 動物細胞、 昆虫細胞、 植物細胞等、 目的とする遗伝子を発現できるも のであればいずれも用いることができる。 ，
アンチトロンビン III分子に結合する N-グリコシド結合糖鎖の修飾に係わる酵素、 すなわちフコ —ス修飾に関連する諸酵素の活性が欠失した細胞を選択するか、 または前述 1に示された種々の人 為的手法により得られた細胞を宿主細胞として用いることもできる。 発現べ sクタ一としては、上記宿主細胞において自立複製可能ないしは染色体中への組込が可能で、 目的とするアンチトロンビン ΙΠ分子をコードする DNAを転写できる位置にプロモーターを含有 しているものが用いられる。
- cDNAは、 前記 1 · の （1 ) の （a ) に記載の cDNAの調製方法に従い、 ヒト又は非ヒト動物の 組織又は細胞より、 目的とするアンチトロンビン III分子に特異的なプローブやプライマー等を用 いて調製することができる。 - 酵母を宿主細胞として用いる場合には、発現べクタ一として、例えば、 YEP13 (ATCC , 37115)、 YEp24 (ATCC 37051), YCp50 (ATCC 37419) 等をあげることができる。
プロモータ一としては、 酵母菌株中で発現できるものであればいずれのものを用いてもよく、 例 えば、 へキソースキナーゼ等の解糖系の遺伝子のプロモーター、 PH05 プロモーター、 PGK プロ モ一夕一、 GAPプロモー夕一、 ADHプロモータ一、 gal 1プロモータ一、 gal 10プロモー夕二、 ヒートショックタンパク質プロモーター、 MFcil プロモータ一、 CUP 1プロモーター等をあげるこ とができる。 . .
宿主細胞としては、 サヅカロミセス属、 シゾサヅカロミセス属、 クリュイべ口ミセス属、 トリコ スポロン属、 シュヮニォミセス属等に属する微生物、 例えば、 Saccharomvces cerevisiae. Schizosaccharomyces pombe^ Kluyver omyce s lactis. Trichosporon pullulansゝ Schwanniomyce s aliUYill^等をあげることができる。
組換えベクターの導入方法としては、 酵母に DNAを導入する方法であればいずれも用いること ができ、 例えば、 エレクト口ポレーシヨン法 [メソヅズ 'イン 'ェンザィモロジ一 (Methods. EnzvmoD.194. 182 (1990)]、 スフエロプラスト法 [プロシ一ディングス .ォブ 'ザ .ナショナル - ァカデミ一 ·ォブ'サイエンス (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A), 84, 1929 (1978)]、酢酸リチウム法 [ジ ヤーナル 'ォブ ·パクテリォロジ一 (J. Bacteriology).153. 163 (1983)]、プロシーディングス ·ォブ · ザ .ナショナル ·アカデミー .ォブ .サイエンス (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A), 75, 1929 (1978)] に記載の方法等をあげることができる。
動物細胞を宿主として用いる場合には、 発現べク夕一として、 例えば、 pcDNAI、 pcDM8 (フナ コシ社より市販）、 pAGE107 [特開平 3-22979；サイトテクノロジー (Cytotechnology), 3, 133， (1990) ]、 pAS3-3 [特閧平 2-227075 ]、 pCI)M8 [ネイチヤー (Nature), 329, 840, (1987) ]、 pcDNAI/Am (Invitrogen社製）、 REP4 (Invitrogen社製)、 AGEl03 [ジャーナル ·ォブ ·パ ィォケミストリ一 (J. Biochemistry),嵐， 1307 (1987)]、 pAGE210等をあげ.ることができる。
プロモーターとしては、 動物細胞中で発現できるものであればいずれも用いることができ、 例え ぱ、 サイトメガロウィルス （CMV) の IE (immediate early) 遺伝子のプロモーター、 SV40の初 期プロモーター、 レトロウイルスのプロモーター、 メタ口チォネインプロモーター、 ヒートショヅ クプロモーター、 SRaプロモーター等をあげることができる。 また、 ヒト CMVの IE遺伝子のェ ンハンサーをプロモータ一と共に用いてもよい。
宿主細胞としては、ヒトの細胞であるナマルバ（Namalwa)細胞、サルの細胞である COS細胞、 チャイニーズ.ハムスターの細胞である CHO細胞、 HBT5637 (特開昭 63-299)、 ラットミエロー マ細胞、 マウスミエローマ細胞、 シリアンハムスター腎臓由来細胞、 胚性幹細胞、 受精卵細胞等を あげることができる。
組換えベクターの導入方法としては、 動物細胞に DNAを導入する方法であればいずれも用いる ことができ、 例えば、 エレクト Dポレーシヨン法 [サイトテクノロジー (Cytotecknology), 3, 133 (1990)]、 リン酸カルシウム法 [特開平 2- 27075]、 リポフエクシヨン法 [プロシーディングス ·ォ ブ ·ザ ·ナショナル.アカデミー.ォブ.サイエンス (proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.), 84, 7413 (1987)]、 インジェクション法 [マニピュレイティング.ザ.マウス 'ェンブリオ 'ァ ·ラボラトリ一 ·マニュ アル]、パーティクルガン （遺ィ云子銃） を用いる方法 [特許第 2606856、 特許第 2517813]、 D E A E -デキストラシ法 [バイオマニュアルシリーズ 4一遺伝子導入と発現 '解析法 （羊土社） 横田崇 - 新井賢一編 (1994)]、 ウィルスベクター法 [マニピユレ一ティング 'マウス 'ェンブリオ第 2 )¾]等を あげることができる。 - 昆虫細胞を宿主として用いる場合には、例えばカレント 'プロトコールズ 'イン 'モレキュラー · ノ ォロン一 Baculovirus Expression Vectors, A Laooratory Manual, W. H. freeman and Company, New York (1992)、 バイ才 /テクノ口ジー (Bio/Teclmology), 6, 47 (1988)等に記載された 方法によって、 タンパク質を発現することができる。
即ち、 組換え遺伝子導入ベクターおよびバキュロウィルスを昆虫細胞に共導入して昆虫細胞培養 上清中に組換えウィルスを得た後、 さらに組換えウィルスを昆虫細胞に感染させ、 タンパク質を発 現させることができる。
該方法において用いられる遺伝子導入べクタ一としては、 例えば、 pVL1392、 pVL1393、 pBlueBacIII (ともに Invitorogen社製） 等をあげることができる。
バキュロウィルスとしては、 例えば、 夜盗蛾科昆虫に感染するウィルスであるアウトラファ -カ リフォルニ力 · ヌクレア一 · ポリへドロシス · ウィルス (Autographa californica nuclear polyhedrosis virus)等を用いることができる。
昆虫細胞としては、 Spodoptera frugiperda'の卵巣細胞である Sf9、 Sf21 [カレント 'プロトコ一 レズ 'イン 'モレキュフー 'ノ ォロジ一 Baculovirus iixpression Vectors, A Laboratory Manual, W. H. Freeman and Company New York (1992)]、 Trichoplusiani の卵巣細胞である High 5 (Invitrogen社製） 等を用いることができる。
組換えウイルスを調製するための、 昆虫細胞への上記組換え遺伝子導入ベクターと上記パキュ口 ウィルスの共導入方法としては、 例えば、 リン酸カルシウム法 （特阖平 2-227075)、 リポフエクシ ョン法 [プロシーディングス ·ォプ ·ザ ·ナショナル ·アカデミー ·ォブ ·サイエンス (Pro Natl. Acad. Sci. U.S.A.), 84, 7413 (1987)] 等をあげることができる。
植物細胞を宿主細胞として用いる場合には、 発現べクタ一として、 例えば、 T iプラスミド、 夕 バコモザイクウィルスベクター等をあげることができる。
プロモー夕一としては、 植物細胞中で発現できるものであればいずれのものを用いてもよく、 例 えば、 カリフラワーモザイクウィルス (CaMV) の 35Sプロモーター、 ィネアクチン 1プロモー夕 一等をあげることができる。 '
宿主細胞としては、 タバコ、 ジャガイモ、 トマト、 ニンジン、 ダイズ、 アブラナ、 アルファルフ ァ、イネ、 コムギ、ォォムギ、 ヒメヅリガネゴケ、 ゥキクサ等の植物細胞等をあげることができる。 組換えベクターの導入方法としては、 植物細胞に DNAを導入する方法であればいずれも用いる ことができ、例えば、ァグロバクテリウム（Agrobacterium) [特閧昭 59-140885、特開昭 60-70080、 WO94/00977], エレクト口ポレ一シヨン法 [特開昭 60-251887]、 パーティクルガン （遺伝子銃） を用いる方法 [日本特許第 2606856、 日本特許第 25Γ7813] 等をあげることができる。 遺伝子の発現方法としては、 直接発現以外に、 モレキュラー'クローニング第 2版に記載されて いる方法等に準じて、分泌生産、 Fc領域と他のタンパク質との融合タンパク質発現等を行うことが できる。
糖鎖の合成に関与する遺伝子を導入した、 酵母、 動物細胞、 昆虫細胞または植物細胞により発現 させた場合には、'導入した遺 子によって糖あるいは糖鎖が付加されたアンチトロンビン ΙΠ分子 を得ることができる。 - 以上のようにして得られる形質転換体を培地に培養し、 培養物中にアンチトロンビン III分子を 生成蓄積させ、 該培養物から採取することにより、 アンチトロンビン ΠΙ組成物を製造することが できる。 形質転換体を培地に培養する方法は、 宿主細胞の培養に用いられる通常の方法に従って行 うことができる。
酵母等の真核生物を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、 該生物が資化し得 る炭素源、 窒素源、 無機塩類等を含有し、 形質転換体の培養を効率的に行える培地であれば天然培 地、 合成培地のいずれを用いてもよい。 - 炭素源としては、 該生物が資化し得るものであればよく、 グルコース、 フラクトース、 スクロー ス、 これらを含有する糖蜜、 デンプンあるいはデンプン加水分解物等の炭水化物、 酢酸、 プロピオ ン酸等の有機酸、 エタノール、 プロパノールなどのアルコール類等を用いることができる。
窒素源としては、 アンモニア、 塩化アンモニゥム、 硫酸アンモニゥム、 酢酸アンモニゥム、 リン 酸アンモニゥム等の無機酸もしくは有機酸のアンモニゥム塩、 その他の含窒素化合物、 ならびに、 ペプトン、 肉エキス、 酵母エキス、 コーンスチープリカー、 カゼイン加水分解物、 大豆粕および大 豆粕加水分解物、 各種発酵菌体およびその消化物等を用いることができる。
無機塩類としては、 リン酸第一カリウム、 リン酸第二カリウム、 リン酸マグネシウム、 硫酸マグ ネシゥム、 塩化ナトリウム、 硫酸第一鉄、 硫酸マンガン、 硫酸銅、 炭酸カルシウム等を用いること ができる。
培養は、 通常振盪培養または深部通気攪拌培養などの好気的条件下で行う。 培養温度は 1 5〜4 0 °Cがよく、 培養時間は、 通常 1 6時間〜 7日間である。 培養中の p Hは 3 . 0 - 9 . 0に保持す る。 p Hの調製は、 無機または有機の酸、 アルカリ溶液、 尿素、 炭酸カルシウム、 'アンモニアなど を用いて行う。
また、 培養中必要に応じて、 アンピシリンゃテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加しても ' よい。
プロモーターとして誘導性のプロモータ—を用いた組換えベクターで形質転換した微生物を培養 するときには、 必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。 例えば、 lac プロモーター を用いた組換えべクタ一で形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル- B- D -チォガラク トピラノシド等を、 trp プロモーターを用いた組換えベクターで形質転換した微生物を培養すると きにはィンドールァクリル酸等を培地に添加してもよい。
動物細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、 一般に使用されている RPMI1640培地 [ザ ·ジャーナル 'ォブ 'ザ 'アメリカン ·メディカル'ァソシエイション (The Journal of the American Medical Association).199. 519 (1967)]、 Eagle の MEM培地 '[サイエンス (Science).122. 501 (1952)]、ダルべッコ改変 MEM培地 [ヴュゥロロジー (Virology), 8, 396 (1959)]、 1 9 9培地 [プロシーディング ·ォブ'ザ ·ソサイエティ ·フォア ·ザ ·バイオロジカル .メディ スン (Proceeding of the Society for the Biological Medicine), 73, 1 (1950)]、 Whitten培地 [発生ェ 学実験マニュアル-トランスジエニック 'マウスの作り方 （講談社） 勝木元也編 （1987) ]またはこ れら培地に牛胎児血清等を添加した培地等を用いることができる。
培養は、 通常 p H 6〜8、 3 0〜4 0 °C、 5 %C02存在下等の 件下で；!〜 7日間行う。
また、 培養中必要に応じて、 カナマイシン、 ペニシリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。 昆虫細胞を宿主として得られた形質転換体を培養す-る培地としては、 一般に使用されている TNM-FH培地 （Pharmingen社製)、 Sf900 II SFM培地 （Life Technologies社製)、 ExCell400、 ExCell405 (いずれも JEH Biosciences社製）、 Grace's Insect Medium「ネイチヤー (Nature). 195. 788 (1962)] 等を用いることができる。
培養は、 通常 p H 6〜7、 2 5〜 3 0 °C等の条件下で、 ；！〜 5 .日間行う。
また、 培養中必要に応じて、 ゲンタマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
植物細胞を宿主として得られた形質転換体は、 細胞として、 または植物の細胞や器官に分化させ て培養することができる。該形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているムラシゲ - アンド ·スク一グ (MS)培地、 ホワイト (White)培地、 またはこれら培地にオーキシン、 サイトカイ ニン等、 植物ホルモンを添加した培地等を用いることができる。 ·
培養は、 通常 p H 5 ~ 9、 2 0〜4 0 °Cの条件下で 3〜6 0日間行う。
また、 培養中必要に応じて、 カナマイシン、 ハイグロマイシン等の抗生物質を培地に添加しても よい。
上記のとおり、 アンチトロンビン III分子をコードする DNAを組み込んだ組換え体ベクターを 保有する微生物、 動物細胞、 あるいは植物細胞由来の形質転換体を、 通常の培養方法に従って培養 し、アンチトロンビン ΙΠ組成物を生成蓄積させ、該培養物よりアンチトロンビン ΠΙ組成物を採取 することにより、 アンチトロンビン III組成物を製造することができる。
アンチトロンビン III組成物の生産方法としては、 宿主細胞内に生産させる方法、 宿主細胞外に 分泌させる方法、 あるいは宿主細胞外膜上に生産させる方法があり、 使用する宿主細胞や、 生産さ せるアンチトロンビン III分子の構造を変えることにより、 該方法を選択することができる。
アンチトロンビン III組成物が宿主細胞内あるいは宿主細胞外膜上に生産される場合、 ポールソ ンらの方法 [ジャーナル'ォブ'バイオロジカル 'ケミストリー (J. Biol. C em.), 264. 17619 (1989)]、 ロウらの方法 [プロシーディングス ·ォブ ·ザ ·ナショナル ·アカデミー ·ォブ ·サイエンス (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.), 86, 8227 (1989); ジーン ·デベロヅプメント（Genes Develop.), 4, 1288 (1990)]、 または特開平 05-336963、 WO94/23021等に記載の方法を準用することにより、 該アン チトロンビン III組成物を宿主細胞外に積極的に分泌させることができる。
すなわち、 遺伝子組換えの手法を用いて、 発現ベクターに、 アンチトロンビン III分子をコード する DNA、 およびアンチトロンビン III分子の発現に適切なシグナルぺプチドをコ一ドする DNA を揷入し、 該発現ベクターを宿主細胞へ導入の後にアンチトロンビン III分子を発現させることに より、 目的とするアンヂトロンビン III分子を宿主細胞外に積極的に分泌させることができる。 また、 特開平 2-227075に記載されている方法に準じて、 ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子等を用い た遺伝子増幅系を利用して生産量を上昇させることもできる。
さらに、 遺伝子導入した動物または植物の細胞を再分化させることにより、 遺伝子が導入された 動物個体（トランスジエニック非ヒト動物）または植物個体（トランスジエニック植物）を造成し、 これらの個体を用いてァンチトロンビン ΙΠ組成物を製造することもできる。
形質転換体が動物個体または植物個体の場合は、 通常の方法に従って、 飼育または栽培し、 アン チトロンビン III 組成物を生成蓄積させ、 該動物個体または植物個体より該アンチトロンビン III 組成物を採取することにより、 該アンチトロンビン III組成物を製造することができる。
動物個体を用いてアンチトロンビン III組成物を製造する方法としては、 例えば公知の方法 [ァ メリカン ' ジャーナル ·ォブ · クリ二カル ·ニュート.リション（American Journal of Clinical Nutrition), 63, 639S (1996); アメリカン . ジャーナル ·ォブ ·クリ二カル ·ニュートリシ ン (American Journal of Clinical Nutrition), 63, 627S (1996); ノ ィ ォ Zテク ノ ロ ジー (Bio/Teclinology), 9, 830 (1991)] に準じて遺伝子を導入して造成した動物中に目的とするアンチト ロンビン III '組成物を生産させる方法があげられる。
動物個体の場合は、 例えば、 アンチトロンビン III分子をコードする DNAを導入したトランス ジエニック非ヒト動物を飼育し、 アンチトロンビン III組成物を該動物中に生成 ·蓄積させ、 該動 物中よりアンチトロンビン III組成物を採取することにより、アンチ.トロンビン III組成物を製造す ることができる。該動物中の生成'蓄積場所としては、例えば、該動物のミルク（特開昭 63-309192)、 卵等をあげることができる。 この際に用いられるプロモーターとしては、 動物で発現できるもので あればいずれも用いることができるが、 例えば、 乳腺細胞特異的なプロモータ一である αカゼイン プロモー夕一、 β カゼインプロモータ一、 β ラクトグロプリンプロモーター、 ホエー酸性プロティ ンプロモーター等が好適に用いられる。
植物個体を用いてアンチトロンビン III組成物を製造する方法としては、 例えばアンチトロンビ ン ΠΙ 分子をコードする DNA を導入したトランスジエニック植物を公知の方法 [組織培養， (1994)； 組織培養， 21 (1995)； トレンド 'イン,バイオテクノロジー (Trends in Biotechnology), 15, 45 (1997)] に準じて栽培し、 アンチトロンビン ΠΙ組成物を該植物中に生成'蓄積させ、 該植物中 より該アンチトロンビン in組成物を採取することにより、アンチトロンビン III組成物を生産する 方法があげられる。
アンチトロンビン III分子をコードする遺伝子を導入した形質転換体により製造されたアンチト ロンビン III組成物は、例えばァンチトロンビン ΙΠ組成物が、細胞内に溶解状態で発現した場合に は、 培養終了後、 細胞を違心分離により回収し、 水系緩衝液にけん濁後、 超音波破碎機、 フレンチ プレス、 マン十ンガウリンホモゲナイザー、 ダイノミル等により細胞を破砕し、 無細胞抽出液を得 る。該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られる上清から、通常の酵素の単離精製法、即ち、 溶媒抽出法、硫安等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジェチルァミノェチル（DEAE) -セファロース、 DIAIONHPA-75' (三菱化学 （株） 製） 等レジンを用いた陰イオン交換クロマトグ ラフィ一法、 S-Sepharose FF (Pharmacia社製） 等のレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラ フィ一法、 プチルセファロース、 フエ二ルセファロース等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフ ィ一法、 分子篩を用いたゲルろ過法、 ァフィ二ティ一クロマトグラフィー法、 クロマトフオーカシ ング法、 等電点電気泳動等の電気泳動法等の手法を単独あるいは組み合わせて用い、 アンチトロン ビン III組成物の精製標品を得ることができる。具体的には、 1974年に Miller-Andersonらによつ て開発された固定化へパリンァフィ二ティークロマ hグラフィ一を用いた方法をあげることができ る（Thromb. Res. 439, 1974； 続生化学実験講座 8; 血液下卷（日本生化学会編） pp.569-574., 東 京化学同人， 1985) o また、 アンチトロンビン ιϊι組成物が細胞内に不溶体を形成して発現した場合は、 同様に細胞を 回収後破碎し、 瑋心分離を行うことにより、 沈殿画分としてアンチトロンビン III組成物の不溶体 を回収する。 回収したアンチトロンビン III組成物の不溶体をタンパク質変性剤で可溶化する。 該 可溶化液を希釈または透析することにより、 該アンチトロンビン III組成物を正常な立体構造に戻 した後、 上記と同様の単離精製法により該アンチトロンビン III組成物の精製標品を得ることがで きる。
アンチトロンビン III組成物が細胞外に分泌された場合には、培養上清に該アンチトロンビン III 組成物あるいはその誘導体を回収することができる。 即ち、 該培養物を上記と同様の遠心分離等の 手法により処理することにより培養上清を取得し、 該培養上清から、 上記と同様の単離精製法を用 いることにより、 アンチトロンビン III組成物の精製標品を得ることができる。
すでに宿主細胞がアンチトロンビン III分子を発現する能力を有する場合には、 上記 1に記載し た方法を用いてアンチトロンビン III分子を発現する能力を有する細胞を調製した後に、 該細胞を 培養し、 該培養物から目的とするアンチトロンビン III組成物を精製することにより、 アンチトロ ンビン III組成物を製造することができる。
3 . アンチトロンビン III組成物の活性評価
精製したァンチトロンビン III組成物の抗血液凝固活性は、 既に公知の抗トロンビン活性測定法 やへパリンコファクタ一活性測定法などの in vitro 試験あるいは汎発性血管内血液凝固症 (Disseminated intravascular coagulation; 以下、 「DIC」 と表記する） 病態モデル動物を用いた in vivo試験などを用いて測定することができる （The Second Series of Pharmaceutical Research and Development Volume 20 Blood Product, Ikuo Suzuki, ed., Hirokawa Pubnsning Company' Tbkyo, Japan, 1992； 医学のあゆみ， 120, 1147, 1982； 薬理と治療 17, 5843, 1989； 臨床と研究 62, 3573, 1985； 臨床と研究 ， 3688, 1985；応用薬理 589, 1985)。 以下に、 その具体的な例を示 す。
( 1 ) 抗トロンビン活性測定法
精製したアンチトロンビン ΙΠ 組成物及び脱繊維素血漿などの被検物質を、 0.15 M NaCl及び 0.2%ヒト血清アルブミンを含む 0.05 Mトリス塩酸緩衝液 pH8.3を いて段階希釈する。
希釈検体 100pLに、 7.5単位/ mLのトロンビン液 500pLを加えて 37°Cで 10分間反応させた後、 ベリクロームアンチトロンビン III (ベーリングペルゲ社製）に添付されているトロンビン特異的発 色性基質（HD-CHA-But-Arg-pNA)を希釈液にて 0.25 Mとした基質液 2 mLを加えてさらに 37°C で 5分間反応させる。 その後、 50%酢酸 0.5 mLを加えて反応を停止させる。
反応液中の吸光度を 405 nmで測定し、 被検物質であるアンチト口ンビン IIIを加えていない対 照反応溶液の吸光度から各希釈段階の被検物質を加えた反応溶液の吸光度を差し引いた値を得る。 この値を不活性ィ匕トロンビン量として縦軸に、 被検物質の希釈率を横軸にして片対数グラフにプロ ヅトする。プロットした測定値より不活性化トロンビン量と被検物質の希釈率の関係を直線近似し、 精製したアンチトロンビン III組成物と脱繊維素血漿の測定の結果求められた近似式を比較するこ とで、 精製したアンチトロンビン ΠΙ組成物の脱繊維素血漿に対する倍率を求めることができ、 そ の力価を決定することができる。
( 2 ) へパリンコファクター活 f生測定法
精製したアンチトロンビン III組成物及び脱繊維素血漿などの被検物質を、 0.15 M NaCl及び 0.2%ヒト血清アルブミンを含む 0.05 Mトリス塩酸緩衝液 PH8.3を用いて段階希釈する。
希釈検体 5(¾iLに、 2.5単位/ mLへパリンを含む 0.3単位のトロンビン液 1.0 mLを加えて 37°C で 5分間反応させる。次に、 2.0 mMに調製した上記 3の （ 1 ) に記載の基質液を 100pL加え 37°C で 2分間反応させる。 その後、 50%酢酸 0.5 mLを加えて反応を停止させる。
反応終了後、 反応液中の吸光度を 405 nmで測定し、 上記 3の （1 ) に記載した方法と同様の方 法により、 精製したアンチトロンビン III組成物の脱繊維素血漿に対する力価を決定することがで ぎる。
( 3 ) DIC病態モデル動物を用いた in vivo試験
■ 精製したアンチトロンビン III 物の in vivoでの抗血液凝固活性は、ゥサギを用いた急性 DIG 病態モデル （臨床と研究 62, 3573, 1985)、 ラヅトを用いた急性 DIC病態モデル （臨床と研究 ， 3688, 1985)、 妊娠ゥサギを用いた急性 DIC病態モデル （応用薬理 ， 589, 1985) などを用いて 調べることができる。
また、 アンチトロンビン ΠΙ組成物のヒトでの安全性、 治療効果は、 力二クイザル等のヒトに比 較的近い動物種モデルを用いて評価することもできる。 .
4 . アンチトロンビン III組成物の糖鎖の分析
各種細胞で発現させたアンチトロンビン ΙΪΙ分子の糖鎖構造は、 通常の糖夕ンパク質の糖鎖構造 の解析に準じて行うことができる。 例えば、 アンチトロンビン III分子に結合している糖鎖はガラ クト一ス、 マンノース、 フコースなどの中性糖、 N-ァセチルグルコサミンなどのァミノ糖、 シアル 酸などの酸性糖から構成されており、 糖組成分析および二次元糖鎖マップ法などを用いた糖鎖構造 解析等の手法を用いて行うことができる。
( 1 ) 中性糖'アミノ糖組成分析 .
アンチトロンビン III分子の糖鎖の組成分析は、 トリフルォロ酢酸等で、 糖鎖の酸加水分解を行 うことにより、 中性糖またはアミノ糖を遊離し、 その組成比を分析することができる。
具体的な方法として、 Dionex社製糖組成分析装置を用いる方法があげられる。 BioLC は HPAEC-PAD ( high performance anion-exchange chromatography-pulsed amperometric detection)法 [ジャーナル ·ォブ · リキッド ·ク口マトグラフィー （J.Liq.Chromatogr.) , 6, 1577 (1983)] によって糖組成を分析する装置である。 .
また、 2-アミノビリジンによる蛍光標識化法でも組成比を分析することができる。 具体的には、 公知の方法 [ァグリカルチュラル ·アンド ·バィォロジカル ·ケミストリ一 (Agric.Biol.Cheni.), 55(1). 283-284 (1991)] に従って酸加水分解した試料を 2-ァミノピリジル化で蛍光ラベル化し、 HPLC分 祈して組成比を算出することができる。
( 2 ) 糖鎖構造解析
アンチトロンビン III分子の糖鎖め構造解析は、 2次元糖鎖マヅプ法 [アナリティカル 'バイォ ケミストリー（Anal. Biochem.) , 171, 73 (1988)、生物化学実験法 23-糖夕ンパク質糖鎖研究法（学 会出版センター） 高橋禮子編 （1989年）] により行うことができる。 2次元糖鎖マップ法は、 例え ば、 X軸には逆相クロマトグラフィーによる糖鎖の保持時間または溶出位置を、 Υ軸には順相クロ マトグラフィ一による糖鎖の保持時間または溶出位置を、 それそれプロットし、 既知糖鎖のそれら の結果と比較することにより、 糖鎖構造を推定する方法である。
具体的には、アンチトロンビン III組成物をヒドラジン分解して、アンチトロンビン III分子から 糖鎖を遊離し、 2-アミノビリジン （以下、 「PA」 と略記する） による糖鎖の蛍光標識 [ジャーナル - ォブ 'バイオケミストリ一 （J. Bioa em.) , 95, 197 (1984)] を行った後、 ゲルろ過により糖鎖を過 剰の PA化試薬などと分離し、 逆相クロマトグラフィーを行う。 次いで、 分取した糖鎖の各ピーク について順相クロマトグラフィーを行う。 これらの結果をもとに、 2次元糖鎖マップ上にプロット し、糖鎖スタンダード（TaKaRa社製)、文献 [アナリティカル 'バイオケミストリ一 (Anal. Biochem.), 171, 73 (1988)] とのスポヅトの比較より糖鎖構造を推定することができる。
さらに各糖鎖の MALDI-TOF- MSなどの質量分析を行い、 2次元糖鎖マヅプ法により推定される 構造を確認することができる。
5 . アンチトロンビン III分子の糖鎖構造を識別する免疫学的定量方法
アンチトロンビン III組成物は、糖鎖構造が異なつたアンチトロンビン III分子から構成されてい る。本発明の遺伝子組換えアンチトロン'ビン 物は、 結合している全 Ν-グリコシド結合複合 · 型糖鎖のうち、 糖鎖琿元末端の Ν-ァセチルグルコサミンにフコースが結合している糖鎖の割合が 0 %であり、 高い 液凝固活性を示す特徴を有している。 このようなアンチトロンビン III組成 物は、 上記 4 . に記載のアンチトロンビン III分子の糖鎖構造の分析法を用いることにより識別で きる。 また、 レクチンを用いた免疫学的定量方法を用いる,ことによつても識別できる。
レクチンを用いた免疫学的定量方法を用いたアンチトロンビン III分子の糖鎖構造の識別は、 文 献 [モノクローナル 'アンティボディズ：プリンシプルズ 'アンド'アプリケーションズ (Monoclonal Antibodies: Principles and Applications), Wiley-Liss, Inc., (1995); 酵素免疫測定法，第 3版， 医学 書院 （1987) ； 改訂版， 酵素抗体法， 学際企画 （1985) ] 等に記載のウエスタン染色、 RIA ( Radioimmunoassay )、 VIA ( Viroimmunoassayリ、 ιίΙΑ ( Enzymoimmunoassav )、 FIA (Fluor oimmtmoassay) ^ MA (Metalloimmunoassay) などの免疫学的定量方法に準じて、 例え ば、 以下のように行うことができる。 .
アンチトロンビン III組成物を構成するアンチトロンビン III分子の糖鎖構造を認識するレクチン を標識し、 標識したレクチンと試料であるアンチトロンビン III組成物を反応させる。 次に、 標識 したレクチンとアンチトロンビン III分子の複合体の量を測定する。
アンチトロンビン III分子の糖鎖構造を識別に用いられるレクチシとしては、 例えば、 WGA (T. vulgaris由来の wheat-germ agglutinia)、 ConA (C. ensiformis由来の concanavalin A)、 RIC (R. communis由来の毒素)、 L-PHA (P.vulgaris由来の leukoagglutinin)、 LCA (L. culinaris由来の lentil agglutinin^ PSA (P. sativum由来の Pea lectin)、 AAL (Aleuria aurantia Lectin)^ ACL (Amaranthus caudatus Lectmノ、 BPL (Bauninia purpurea Lectiru、 DSL (Datura stramonium Lectin)、 DBA (Dolichos bifloms Agglutinin)、 EBL (Elderberry Balk Lectin)、 ECL (Erythrina cristagalli Lectin)^ EEL (Euonymus europaeus Lectin)^ GNL (Galanthus nivalis Lectin)、 GSL (Griffonia simplicifolia Lectin) HPA (Helix pomatia Agglutinin) HHL (Bippeastrum Hybrid LectinX Jacalin、 LTL (Lotus tetragonolobus Lectin) ^ LEL (Lycopersicon esculentmn Lectin)s MAL (Maackia amurensis Lectin)、 MPL (Maclura pomifera Lectin)、 NPL (Narcissus pse donarcissus Lectin)、 PNA (Peanut Agglutinin) E-EHA (Phaseolus vulgaris Erythroaggl tinin) PTL (Psophocarpus tetragonolobus Lectin) RCA (Ricinus communis Agglutinin; STL (Solanum tuberosum Lecti 八 SJA (Sophora japonica Agglutinin) SBA (Soybean Agglutinin)、 UEA (Ulex emopaeus Agglutinin) WL (Vicia villosa Lectin)、 WFA (Wisteria floribunda Agglutinin)力あげられる。
N-グルコシド結合複合型糖鎖還元末端の N-ァセチルダルコサミンにフコースが結合している糖 鎖構造を特異的に認識するレクチンを用いることが好ましく、 その具体的な例としては、 レンズマ メレクチン LCA (Lens Culinaris由来の Lentil Agglutinin) エンドゥマメレクチン PSA (Pisum sativum由来の Pea Lectin) 'ソラマメレクチン VFA (Vicia faba由来の Agglutiniii)、 ヒイロチ ャワンタケレクチン AAL (Aleuria aurantia由来の Le.ctin) をあげることができる。
6 . アンチトロンビン III組成物の利用
本発明で得られたアンチトロンビン III組成物は、天然由来のァンチトロンビン III同等の高いへ パリン結合活性を有するため、 血液凝固を伴う疾患の予防及び治療において有用である。
血液凝固を伴う疾患では、 血液凝固が生じる部位、 例えば血管内皮組織に血小板が粘着凝集し血 栓が形成されることが知られている。 血栓は外傷、 動脈硬化、 血管炎など様々な原因で生じるが、 この血栓が剥離して血流により移動し、 他の血管を詰まらせた場合に塞栓を起こす。 動脈が血栓や 塞栓で閉塞されると、 閉塞部位から下流の灌流領域は虚血状態となる。 このような血栓が原因で発 症する各種病態は血栓症と呼ばれている。 したがって、 本発明のアンチトロンビン III組成物は血 栓症の予防及び治療においても有用である。.
血栓症としては、 脳梗塞（脳血管障害)、 心筋梗塞、 四肢動脈血栓塞栓、 深部静脈血栓症 （血栓性 静脈炎)、 DIC、 アンチトロンビン III欠損症、 妊娠中毒症などがあげられる。
脳梗塞 （脳血管障害） は、 頭蓋内外の主幹脳動脈に形成された粥状 （ァテローム） 硬化性病変に よって引き起こされる血管の閉塞を伴う疾患で ¾る。 脳血管が血栓によって急激に閉塞するため、 片麻痺などの運動障害、 半身の知覚障害、 視野障害、 失語、 構音障害などの神絰症状が比較的急速 に出現する。 脳梗塞の種類には、 主幹脳動脈から分枝した細動脈の閉塞によって生じる比較的小さ な脳動脈の血栓症であるラクナ脳梗塞や、 心筋梗塞、 僧帽弁狭窄などの心臓弁膜症、 心房細動など の心疾患が原因となって心臓内で形成された血栓が遊離し、 これが脳血管を閉塞するために起る心 原性脳梗塞などがある。
心筋梗塞は、 冠動脈の閉塞により灌流領域の心筋に血流障害が起きて、 心筋細胞^壊死したもの である。 胸痛あるいは胸部圧迫痛などの狭心症状が発症以前からある患者もいる力 s、 前兆症状なし で突然発症することが多い。 - 四肢動脈血栓塞栓には、 下肢の動脈硬化症による閉塞病変である閉塞性動脈硬化症 (arteriosclerosis obliterans ： ASO ) や、 四肢の動静脈に血栓性閉塞をきたす血管炎を伴う病因 不明の閉塞性血栓血管炎 （thromboangitis obliterans ： TAO 'バージャ一 （ビュルガ一） 病） な どがある。
深部静脈血栓症 （血栓性静脈炎） は、 手術、 長期臥床、 感染、 妊娠、 外傷等による血流うっ滞や 静脈損傷等で発症する血栓症である。'左下肢に発症し易く、 主症状は腫脹であるが、 皮膚紅潮、 静 脈怒脹、 疼痛等の症状もでる。 長時間の航空機旅行でも起り易く、 この場合は、 特に、 エコノミー クラス症候群と呼ばれている。
DIG は、 急性白血病、 ガン、 感染症、 産科的疾患、 劇症肝炎、 大動脈瘤、 心臓瘤、 巨大血管腫、 糖尿病性昏睡、 血管内溶血、 手術、 外傷、 火傷、 整形手術等を基礎疾患として、 生体内で血液凝固 系が過度に活性化されて細小血管内に広範に微小血栓形成が起り、 虚血性臓器障害が起きた結果生 じる疾患である。 病態は基礎疾患で大きく異なり、 基礎疾患の治療と共に抗凝固療法を行なう必要 がある。
アンチトロンビン III欠損症は、アンチトロンビン inの量的 ¾低下あるいは質的な異常を伴う疾 患である。 アンチトロンビン ΙΠの量的な低下あるいは質的な異常は、 活性化血液凝固第 IX、 X因 子及びトロンビンなどに対する阻害低下をきたし血栓症の発生の一因となる。アンチトロンビン III 欠損症は、 1965年に血栓症を多発するノルゥェ一の家系において先天的遺伝性疾患として見出され' た。 多発性あるいは再発性の血栓症を有する患者の数％にアンチトロンビン III欠損症が見いださ れる。 アンチトロンビン III欠損症の患者では、 年齢とともに発症頻度は増加し、 妊娠、 感染、 外 科手術、 外傷、 経口避妊薬の内服などが契機として発症することが多い。 血栓は下肢深部静脈で生 じることが多く、 肺塞栓症、 腸間膜静脈、 脳動静脈などの部位での発症も観察される。
妊娠中毒症は、 高血圧、 蛋白尿、 浮腫を主徴とする妊娠中に起こる疾患である。 分娩後も同様の 症状が認められる疾患を妊娠中毒後遺症といい、 広義に妊娠中毒症に含まれる。 妊娠中毒症の成因 には凝固線溶系の異常が関与している。
アンチトロンビン III組成物は、 血栓の形成を予防する目的で疾患発症以前の患者に投与するこ ともできる。 そのような患者の具体的な例としては、 PTCA後血管再狭窄、 不安定狭心症、 末梢動 脈閉塞症、 一過性脳虚血性発作、 急性心筋梗塞、 非 Q波心筋梗塞、. DIC、 へパリン性血小板減少症 による血栓合併症、 急性肺血栓塞栓症、 深部静脈血栓症、 症候性肺動脈塞栓症、 アンチトロンビン III欠損症などの疾患を発症する危険性が考えられる患者などがあげられる。
アンチトロンビン ΙΠ組成物を含有する医薬は、 予防薬あるいは治療薬として単独で投与するこ とも可能ではあるが、 通常は薬理学的に許容される一つあるいはそれ以上の担体と一緒に混合し、 製剤学の技術分野においてよく知られる任意の方法により製造した医薬製剤として提供するのが望 ましい。 '
投与経路は、治療に際して最も効果的なものを使用するのが望ましく、経口投与、または口腔内、 気道内、 直腸内、 皮下、 筋肉内および静脈内等の非経口投与をあげることができ、 アンチトロンビ ン III製剤の場合、 望ましくは静脈内投与をあげることができる。
投与形態としては、 噴霧剤、 カプセル剤、 錠剤、 顆粒剤、 シロップ剤、 乳剤、 座剤、 注射剤、 軟 膏、 テープ剤等があげられる。 · ' ,
• 経口投与に適当な製剤としては、 乳剤、 シロップ剤、 カプセル剤、 錠剤、 散剤、 顆粒剤等があげ られる。
乳剤およびシロップ剤のような液体調製物は、 水、 ショ糖、 ソルビトール、 果糖等の糖類、 ポリ ^チレングリコール、 プロピレングリコール等のグリコール類、 ごま油、 ォリーブ油、 大豆油等の 油類、 pセドロキシ安息香酸エステル類等の防腐剤、 スト口べリーフレーバー、 ペパーミント等の フレーノ 一類等を添加剤として用いて製造できる。 ，
カプセル剤、 錠剤、 散剤、 顆粒剤等は、 乳糖、 ブドウ糖、 ショ糖、 マンニドール等の賦形剤、 デ ンプン、 アルギン酸ナトリウム等の崩壊剤、 ステアリン酸マグネシウム、 タルク等の滑沢剤、 ポリ ^ニルアルコール、 ヒドロキシプロピルセルロース、 ゼラチン等の結合剤、 脂肪酸エステル等の界 面活性剤、 グリセリン等の可塑剤等を添加剤として用いて製造できる。
非経口投与に適当な製剤としては、 注射剤、 座剤、 噴霧剤等があげられる。
注射剤は、 塩溶液、 ブドウ糖溶液、 あるいは両者の混合物からなる担体等を用いて調製される。 または、 アンチトロンビン III組成物を常法に従って凍結乾燥し、 これに塩ィ匕ナトリウムを加える ことによって粉末注射剤を調製することもできる。
座剤は力力ォ脂、 水素化脂肪またはカルボン酸等の担体を用いて調製される。
また、 噴霧剤はアンチトロンビン III組成物そのもの、 ないしは受容者の口腔および気道 膜を 刺激せず、 かつアンチトロンビン ΠΙ組成物を微細な粒子として分散させ吸収を容易にさせる担体 等を用いて調製される。
担体として具体的には乳糖、 グリセリン等が例示される。 アンチトロンビン III組成物および用 いる担体の性質により、 エアロゾル、 ドライパウダー等の製剤が可能である。 また、 これらの非経 口剤においても経口剤で添加剤として例示した成分を添加することもできる。
投与量または投与回数は、 目的とする治療効果、 投与方法、 治療期間、 年齢、 体重等により異な るが、 有効成分の量として、 通常成人 1日当たり 10pg/kg〜20mg/kgである。
また、 アンチトロンビン III組成物の抗血液凝固効果を検討する方法は、 インビトロ (in vitro)実 験としては、 抗トロンビン活性測定法、 へパリンコフアクター活性測定法等があげられ、 インビボ (in vivo)実験としては、 ゥサギ等の実験動物を用いた DIC病態モデル実験等があげられる。
抗トロンビン洁性測定法、へパリンコファクタ一活性測定法、 DIG病態モデル実験は、文献 [The Second Series oi Pharmaceutical Researcn and Development Volume 20 Blood Product, 丄 kuo Suzuki, ed" Hirokawa Publishing Company, Ibkyo, Japan, 1992； 医学のあゆみ， 12Q， 1147, 1982； 薬理と治療 12, 5843, 1989； 臨床と研究 62， 3573, 1985； 臨床と研究 g¾ 3688, 1985; 応用 薬理 SQ, 589, 1985] 等記載の方法に従って行うことができる。
以下の実施例により、 本発明をより具体的に説明するが、 実施例は本発明の単なる例示を示すも のにすぎず、 本発明の範囲を限定するものではない。
図面の簡単な説明
第 1図は、 ヒトアンチトロンピン IIIの構造を模式的に示した図である。
第 2図は、 ヒト血漿由来アンチトロンビン IIIに付加されている N-グリコシド結合複合型糖鎖を 模式的に示した図である。
第 3図は、 プラスミド pKOFUT8Neoの構築を示した図である。
• 第 4図は、 プラスミド pBS-ΑΉΠの構築を示した図である。
第 5図は、 プラスミド ρΚΑΝ-ΑΤΠΙの構築を示した図である。
集 6図は、 プラスミド pKAN- ATIIIN135Qの構築を示した図である。
第 7図は、 アンチトロンビン IIIのへパリ ァフィ二ティークロマトグラフィーにおける溶出パ 夕一ンを示した図である。
第 8図は、 アンチトロンビン. IIIのへパリンコフアクター活性を示した図である。
発明を実施するための最良の形態
実施例 1 ゲノム上に存在する全ての' al,6-フコシルトランスフェラーゼ （FUT8)遺伝子を破壊し た CHO/DG44細胞の造成
ctl,6-フコシルトランスフェラーゼ （以下、 「FUT8」 とも称す）両対立遺伝子の翻訳開始コドンを 含むゲノム領域を欠失した CHO/DG44細胞株を以下の手順で造成した。
1. チャイニーズハムスター FUT8 遺伝子ェクソン 2 夕ーゲティングベクタープラスミ ド pKOFUTSNeoの構築
WO02/31140の実施例 13の 1項に記載の方法により構築したチャイニーズハムスター FUT8遺 伝子ェクソン 2 夕ーゲティ ングベクタープラスミ ド pKOFUT8Puro およびプラスミ ド pKOSelectNeo (Lexicon社 を用いて、 以下の様にしてプラスミド pKOFUT8Neoを構築した。 プラスミド pKOSelectDT (Lexicon社製） 1.0 zg を 16 単位の制限酵素 Asel (New England Biolabs社製） を用いて 37°Cで 2 時間反応させた。 該反応液をァガロースゲル電気泳動した後、 QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN社製） を用いて、 ネオマイシン耐性遺伝子発現ュニヅト を含む約 1.6Kbの Ascl断片を回収した。 .
次に、 プラスミド pKOFUT8Puro l.Ojugを 16単位の制限酵素 Asel (New England Biolabs社 製)を用いて 37°Cで 2時間反応させた。 消化反応後、 大腸菌 C15株由来 Alkaline Phosphatase (宝 酒造社製） を用いて、 添付の説明書に従い、 DNA末端を脱リン酸化させた。 反応後、 フエノール/ クロ口ホルム抽出処理およ エタノール沈殿を用いて、 DNA断片を回収した。
上記で得たプラスミ ド pKOSelectNeo 由来の Asel 断片 （約 1.6Kb)0.1〃g とプラスミ ド pKOFUT8Puro由来の Assl断片 （約 10.1Kb) O.lpgを Ligation High (東洋紡社 S)存在下で連結し、 得られた組換えプラスミド DNAを用いて大腸菌 DH5a株（東洋紡績社製）をコーェンらの方法 [プ 口シ一ディングス ·ォブ ·ザ ·ナショナル ·ァカデミー 'ォブ ·サイエンス （Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.) , 69, 2110 (1972) ]により形質転換した。 各形質転 »よりプラスミド DNAを調製し、 BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit v2.0と DNAシーケンサ ABI PRISM 377 (Applied Biosystems社製） を用いて塩基配列を解析した。 こうして目的の塩基配列を有する 第 3図に示したプラスミド pKOFUT8Neoを得た。該プラスミドは CHO細胞の FUT8遺伝子ノヅ クァゥト細胞を作製するための夕ーゲティングベクタ一として用いた。
2. ゲノム上の FUT8遺伝子の 1コピーを破壊した CHO細胞の作製
(1) タ一ゲティングべク夕一 PKOFUT8Neo導入株の取得 ' ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子 （dhfr) を欠損したチャイニーズハムスター卵巣由来 CHCMDG44 細胞 [Somatic Cell and Moleculer Genetics, 12, 555, 1986] に対し、 実施例 1の 1項で構築した チャイニーズハムスター FUT8ゲノム領域夕ーゲティングベクター pKOFUT8Neoを以下の様にし て導入した。
プラスミド pKOFUT8Neo 280^gを 400単位の制限酵素 Sail (New England Biolabs社製） を 加えて 37°Cで 5時間反応させて線状化した後、 線状化した 4〃gの pKOFUT8Neoを 1.6xl06個の CHO DG44細胞へエレクトロポレーシヨン法 [サイ トテクノロジー （Cytoteclmology) , 3, 133 (1990)]により導入後、 IMDM-dFBS (lO)-HT(l) [透析 FBS (インビトロジェン社製)を 10%、 HT supplement (ィンビトロジヱン社製)を 1倍濃度で含む IMDM培地 (ィンビトロジヱン社 に懸濁 し、接着細胞培養用 10cmデヅシュ（Falcon社製)へ播種した。 5%C02ィンキュベータ一内で 37°C、 2 時閘培養後、 G418 (ナカライテスク社製） を 600 /g/mLの濃度で含む IMDM-dPBS(lO) [透析 FBSを 10%で含む IMDM培地] lOmLに培地交換した。この培地交換作業を 3~4日毎に繰り返し ながら 15日間の培養を行い、 G418耐性クローンを取得した。
(2) ゲノム PCRによる相同組換えの診断
本項 (1)で取得した G418耐性クローンに対し、 ゲノム PCRによる相同組換えの診断を以下の様 にして行った。 .
96穴プレートに得た G418耐性クローンに対しトリプシン処理を行った後、 2倍量の凍結培地 [20% DMSO、 40% ゥシ胎児血清、 0% IMDM] を各ゥエルに添加し、 懸濁した。 各ゥエル中の 細胞懸濁液の半量を接着細胞用平底 96穴プレート （旭テクノグラス社製） へ播種してレプリカプ レ一トとする一方、 残りの半量をマス夕一プレートとして凍結保存した。
レプリ力プレート上のネオマイシン耐性クローンは、 600〃g/mL G418を含む IMDM-dFBS(lO) を用いて 1週間培養した後、 細胞を回収し、 回収した細胞から公知の方法 [アナリティカル ·バイ オケミストリ一 （Analytical Biochemistry), 201, 331 (1992)] に従って各クローンのゲノム DNA を調製し、 各々 TE-RNase緩衝液 (pH8.0) [10mmol/L Tris-HCl, lmmol/L EDTA、 200 g/mL RNase A] - 30pLにー晚溶解した。
ゲノム PGRに用いるプライマーは以下のように設計した。まず、 WO03/31140の実施例 12に記 載の方法により取得した FUT8ゲノム領域 （配列番号 13) のうち、 ターゲティングベクター相同 領域を越えた部分の配列に結合するプライマー （配列番号 20または配列番号 21) およびべク夕一 内配列に結合するプライマー （配列番号 22または配列番号 23) を調製した。 それらを用いて、 以 下のポリメラーゼ連鎖反応 (PCR) を行った。 即ち、 上記で調製したゲノム DNA溶液を各々 10 L含む 25〃L の反応液 [DNA ポリメラーゼ ExTaq(宝酒造社製)、 ExTaq buffer (宝酒造社製)、 p.2mmol L dNTPs, 0.5 imol/L上記遺伝子特異的プライマー （フォワードプライマーは配列番号 20または配列番号 21、 リバースプライマーは配列番号 22または配列番号 23) ]を調製し、 94°Cで 3分間の加熱の後、 94°Cで 1分間、 60°Cで 1分間、 72°Cで 2分間からなる反応を 1サイクルとした 条件で PCRを行った。
PCR後、 反応液を 0.8% (w/v) ァガロースゲル電気泳動に供し、 CHO細胞ゲノム領域と夕ーゲ ティングべク夕一相同領域との境界部を含む約 1.7Kbの特異的増幅が認められるものを陽性クロ一 ンと判定した。 '
(3) ゲノムサザンプロットによる相同組換えの診断
本項 (2)で陽性が確認されたクローンに対し、ゲノムサザンブロツトによる相同組換えの診断を以 下の様にして行った。
本項 (2)で凍結保存したマスタープレートのうち、 本項 (2)で見出された陽性クローンを含む 96穴 プレートを選択し、 5%C02、 37°Cの条件下で 10分間静置後、 陽性クローンに該当するゥヱルから 細胞を接着細胞用平底 24穴プレート （グライナ一社製） へ播種じた。 600pg/mL の濃度で含む IMDM-dFBS(lO)を用いて 1週間培養した後、 接着細胞用平底 6穴プレート （グライナ一社製） へ 播種した。該プレートより公知の方法 [ヌクレイック'ァシヅド'リサーチ (Nucleic Acids Research), 3, 2303, (1976)] に従って各クローンのゲノム DNA を調製し、 各々 TE-RNase 緩衝液 (pH8.0) [10mmol/L Tris-HCl^ lmmol/L EDTA, 200 g/mL RNase A] 150 Lにー晚溶解した。
上記で調製したゲノム DNA 12ju gを 25単位の制限酵素 Ea^H New England Biolabs社製)を 加えて 37°Cで一晩消ィ b反応を行った。該反応液よりェタノ一ル沈殿法を用いて DNA断片を回収し た後、 TE緩衝液 (pH8.0) [lOmmol L'Tris-HCl, lmmol/L EDTA] 20〃Lに溶解し、 0.6%(w/v) ァ ガロースゲル電気泳動に供した。 泳動後、 公知の方法 [プロシーディングス ·ォブ ·ザ ·ナショナ ル ·アカデミー ·ォブ ·サイエンス (Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 76, 3683, (1979)に従い、 ナイ口 ン膜へゲノム DNAを転写した。転写終了後、 ナイロン膜に対し 80°Cで 2時間の熱処理を行い、 固 定化した。
一方、 サザンプロットに用いるプローブを以下のように調製した。 まず、 WO02/31140の実施例 12に記載の方法により取得した FUT8ゲノム領域 （配列番号 13) のうち、 夕ーゲティングベクタ —相同領域を越えた部分の配列に結合するプライマー（配列番号 24および配列番号 25)を用いて、 以下の PCRを行った。 即ち、 WO02/31140の実施例 12に記載の方法により構築したプラスミド PFUT8fgE2-2 4.0ng を含む の反応液 [DNA ポリメラーゼ ExTaq(宝酒造社製)、 ExTaq buffer (宝酒造社 X 0.2mmol L dNTPs, Ο.δ imolfL上記遺伝子特異的プライマー （配列番号 24 および配列番号 25) ]を調製し、' 94°Cで 1分間の加熱の後、 94°Cで 30秒間、 55°Cで 30秒間、 74°C で 1分間からなる反応を 1サイクルとした 25サイクルの条件で； PCRを行った。 PCR後、 反応液 を 1.75%(w/v) ァガロースゲル電気泳動に供し、 約 230bpのプローブ DNA断片を精製した。 得ら れたプローブ DNA溶液 ¾iLに対し、 [a-ssp] dCTP 1.75MBciおよび Megaprime DNA Labelling system, dCTP (Amersham Pharmacia Biotech ¾® ) を用いて放射標識した。
ハイブリダイゼー^ヨンは以下のように行った。 まず、 上記のナイロン膜をローラーボトルへ封 入し、 ハイブリダィゼーシヨン液 [5xSSPE、 50xDenlialdt's液、 0.5%(w/v) SDS、 lOO zg/mLサ ケ精子 DNA] 15mLを加えて 65°Cで 3時間のプレハイプリダイゼーシヨンを行った。 次に、 32P 標識したプローブ DNAを熱変性してポトルへ投入し、 65°Cで一晩加温した。
ハイプリダイゼーション後、 ナイ口ン膜を 2xSSC— 0.1%(w/v) SDS 50mLに浸漬し、 65°Cで 15 分間加温した。上記の洗浄操作を 2回繰り返した後、 膜を 0.2XSSC— 0.1%(w/v) SDS 50mLに浸漬 し、 65°Cで 15分間加温した。 洗浄後、 ナイロン膜を X線フィルムへ- 80°Cで暴露し現像した。 親株である GHO DG44細胞、 および本項（2)で取得した陽性クローンである 5010-104株のゲ ノム DNAを本法により解析した。 CHO/DG44細胞では、野生型 FUT8対立遺伝子由来の約 25.5Kb の断片のみが検出された。一方、 陽性クローン 50- 10- 104株では、'野生型 FUT8対立遺伝子由来の 約 25.5Kbの断片に加え、相同組換えされた対立遺伝子に特異的な約 20.0Kbの断片が検出された。 両断片の量比は 1： 1であったことから、 50-10-104株は、 FUT8対立遺伝子のうち 1コピーが破壊 されたへミノックアウトクローンであることが確認された。
3. ゲノム上の FUT8遺伝子をダブルノヅクアウトした CHO/DG44細胞の作製
(1) タ一ゲティングベクタ— pKOFUT8Puro導入株の取得
実施例 1の 2項 (2)で得た FUT8へミノックアウトクローンのもう一方の FUT8対立遺伝子を破 壊するために、 WO02/31140の実施例 13の 1項に記載の方法により構築したチャイニーズハムス 夕一 FUT8遺伝子ェクソン 2ターザティングベクタープラスミド pKOFUT8Puroを以下の様にし て導入した。
プラスミド pKOFUT8Puro 440 z を 800単位の制限酵素 Sail (New England Biolabs社製） を 加えて 37°Cで 5時間反応させて直線状化した後、 4〃gを 1.6X106細胞へエレクト口ポレーシヨン 法 [サイトテクノロジ一 （Cytotechnology)， 133 (1990)]により導入後、 IMDM-dFBS (10)-HT(1) に懸濁し、 接着細胞培養用 10cmデッシュ （Falcon社製） へ播種した。 5%C02インキュベーター 内で 37°C、24時間培養後、ピュー口マイシン（SIGMA社製）を 15 g/mLの濃度で含む IMDM-dFBS (10)-HT(1) 10mLに培地交換した。
この培地交換作業を 7日毎に繰り返しながら 5 %C0215日間の培養を行い、ピューロマイシン耐 性クローンを取得した。
(2) ゲノムサザンプロットによる相同組換えの診断
本項 (1)で得た薬剤耐性クローンに対し、以下の手順でゲノムサザンブロヅトによる相同組換えの 診断を行った。 ピューロマイシン耐性クローンが出現した l0cm ディッシュより培養上清を除去し、 リン酸緩衝 液 7mLを注入した後、 実体顕微鏡下に移した。 次にピペットマン （GILSON社製） を用いてコロ 二一を搔き取って吸い込み、 丸底 96穴プレート （Falcon社製） へ採取した。 トリプシン処理を行 つた後、 接着細胞用平底 96穴プレート （旭テクノグラス社製） へ各クローンを播種し、 ピュー口 マイシン（SIGMA社製）を 15〃g/mLの濃度で含む IMDM-dFBS (10) Τ(1))を用いて 1週間培養 した。 .
培養後、 上記プレートの各ク D—ンに対しトリプシン処理を行い、 接着細胞用平底 24穴プレー ト （Greiner社製） へ播種した。 ピューロマイシン （SIGMA社製） を
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の濃度で含む IMDM-dFBS (10)-HT(1)を用いて 1週間培養した後、接着細胞用平底 6穴プレート（Greiiier社製） へ播種した。 該プレートより公知の方法 [ヌクレイヅク 'アシッド . リサーチ (Nucleic Acids Research), 3, 2303, (1976)] に従って各クローンのゲノム DNAを調製し、 各々 TE-RNase緩衝液 (pH8.0) 150 /Lにー晚溶解した。
上記で調製したゲノム DNA 12 gを 25単位の制限酵素 BamHKNew England Biolabs社製)を 加えて 37°Cで一!^化反応を行った。該反応液よりェタノール沈殿法を用いて DNA断片を回収し た後、 TE緩衝液 (pH8.0) 20〃Lに溶解し、 0.6%(w/v) ァガロースゲル電気泳動に供した。 泳動後、 公知の方法 [プロシーデイングス ·ォブ ·ザ ·ナショナル 'アカデミー'ォブ 'サイエンス (Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 76, 3683, (1979)] に従い、 ナイ口ン膜へゲノム DNAを転写した。 転写終了後、 ナイ口ン膜に対し 80°Cで 2時間の熱処理を行った。
一方、 サザンプロットに用いるプローブを以下のように調製した。 まず、 FUT8ゲノム領域のう ちターゲティングベクター相同領域を越えた部分の配列に結合するプライマー （配列番号 6およ び配列番号 27) を用いて、 以下の PCRを行った。 即ち、 WO02/31140の実施例 12に記載の方法 により構築したプラスミ ド pFUT8fgE2-2 4.0ng を含む 20/zL の反応液 [DNA ポリメラーゼ ExTaq (宝酒造社製)、 ExTaqbuffer (宝酒造社製)、 0.2mmol/L dNTPs, 0.5〃mol/L上記遺伝子特異 的プライマー （配列番号 26および配列番号' 27) ]を調製し、 94°Cで 1分間の加熱の後、 94°Cで 30 秒間、 55°Cで 30秒間、 74°Cで 1分間からなる反応を 1サイクルとした 25サイクルの条件で PCR を行った。 PCR後、 反応液を 1.75%(w/v) ァガロースゲル電気泳動に供し、 約 230bpのプローブ DNA断片を精製した。得られたプローブ DNA溶液 に対し、 [α·32Ρ] dCTP 1.75MBqおよび Megaprime DNA Labelling system, dCTP Amersham Pharmacia Biotech社製) を用いて放射 線標識した。
ハイプリダイゼーシヨンは以下のように行った。 まず、 上記のナイロン膜をローラーボトルへ封 入し、 ハイブリダィゼ一シヨン液 [5xSSPE、 50xDenhaldt's液、 0.5%(w/v) SDS、 100〃g/mLサ ケ精子 DNA] 15mLを加えて 65°Cで 3時間のプレハイプリダイゼ一シヨンを行った。 次に、 32P 標識したプローブ DNAを熱変性してボトルへ投入し、 65°Cでー晚ハイブリダイゼーシヨンを行な つた。
ハイブリダイゼーション後、 ナイ口ン膜を 2xSSC—0.1%(w/v) SDS 50mLに浸漬し、 65°Cで 15 分間加温した。上記の洗浄操作を 2回繰り返した後、 膜を 0.2XSSC— 0.1%(w/v) SDS 50mLに浸漬 し、 65°Cで 15分間加温した。 洗浄後、 ナイロン膜を X線フィルムへ- 8CTCで暴露し現像した。
50-10-104株から本項 (1)に記載の方法により取得したピューロマイシン耐性クローンの 1つであ る WK704株のゲノム DNAを本法により解析した。 W 704株では、 野生型 FUT8対立遺伝子由 来の約 25.5Kbの断片が消失し、 相同組換えされた対立遺伝子に特異的な約 20.0Kbの断片のみが 検出された。 この結果から WK704株は、 FUT8両対立遺伝子が破壊されたクローンであることが 確認された。
4. FUT8遺伝子をダブルノックアウトした細胞からの薬剤耐性遺伝子の除去
(1) Creリコンピナ一ゼ発現ベクターの導入 ■
実施例 1の 3項で作製した FUT8ダブルノヅクアウトクローンに対し、 Creリコンピナーゼ発現 ベクタ一 pBSl85 (Life Technologies社製） を以下の様にして導入した。
プラスミド PBS185 4 j.g を 1.6X10S細胞へエレクト口ポレーシヨン法 [サイトテクノロジー (Cytotechiiology) , 133 (1990)]により導入後、 IMDM-dFBS (10)-HT(1) 10mL に懸濁し、 さら に同 i@地を用いて.2万倍希釈した。 該希釈液を接着細胞培養用 10cmディッシュ （Falcon社製） 7 枚へ播種後、 5%C02、 37°Cの条件下で 10日間の培養を行い、 コロニーを形成させた。
(2) Creリコンピナ一ゼ発現べク夕一導入株の取得
実施例 1の 3項で作製した FUT8ダブルノヅクアウトクローンに対して遺伝子導入を行なうこと により取得したコロニーより、 任意のクローンを以下の手順で採取した。 まず、 10cm ディッシュ より培養上清を除去し、 リン酸緩衝液 7mLを注入した後、 実体顕微鏡下に移した。 次にピぺヅト . マン（GILSON社製）を用いてコロニーを接き取って吸い込み、丸底 96穴プレート （Falcon社製) へ採取した。 トリプシン処理を行った後、 接着細胞用 ¾底 96穴プレート （岩城硝子社製） へ各ク ローンを播種し、 IMDM-dFBS (10)-HT(1)を用いて 1週間培養した。
培養後、上記プレートの各クローンに対しトリプシン処理を行い、 2倍量の凍結培地 [20% DMSO、 40% ゥシ胎児血清、 40% ΙΜΪ)Μ] と混和した。 このうち半量を接着細胞用平底 96穴プレート （岩 城硝子社製） へ播種してレプリカプレートを作製する一方、 残りの半量をマスタ一プレートとして 凍結保存した。
次にレプリカプレートを、 G418 を 600〃g/mL、 ピューロマイシンを 15〃g/:mL の濃度で含む IMDM-dFBS (10)-HT(1)を用いて 7日間培養した。 Cre リコンビナーゼの発現により ΙοχΡ配列に 挟まれた両対立遺伝子上の薬剤耐性遺伝子が除去された陽性クローンは、 G418およびピューロマ ィシン存在下で死滅する。 本ネガティブ選択法により陽性クローンを選択した。
(3) ゲノムサザンプロヅトによる薬剤耐性遺伝子除去の診断
本項 (2)で見出された陽性クローンに対し、以下の手順でゲノムサザンプロヅトによる薬剤耐性遺 伝子除去の診断を行った。
本項 (2)で凍結保存したマスタープレートのうち、 上記陽性クローンを含む 96穴プレートを選択 し、 5% C02、 37°Cの条件下で 10分間静置した。 静置後、 上記クローンに該当するゥヱルから細 胞を接着細胞用平底 24穴プレート （Greiner社製） へ播種した。 10% ゥシ胎児血清 （Invitrogen 社製） および 1倍濃度の HT supplement (Invitrogen社製） を添加した IMDM培地 (Invitoogen 社製） を用いて 1週間培養した後、 接着細胞用平底 6穴プレート （Greiner社製） へ播種した。 該 プレートより公知の方法 [ヌクレイヅク ·ァシヅド · リサーチ (Nucleic Acids Research), 3, 2303, (1976)] に従って各クローンのゲノム DNAを調製し、 各々 TE-RNase緩衝液 (pH8.0) 150 Lに一 晩溶解した。 ' 上記で輝製したゲノム DNA 12 gを 20単位の制限酵素 MieKNew England Biolabs社製)を加 えて 37°Cで一晩消化反応を行つた。該反応液よりェタノ一ル沈殿法を用いて DNA断片を回収した 後、 TE緩衝液 (pH8.0) 20〃Lに溶解し、 0.6% (w/v) ァガロースゲル電気泳動に供した。泳動後、 公 知の方法 [プロシーディングス ·ォブ ·ザ ·ナショナル ·アカデミー.ォブ'サイエンス (Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 76, 3683, (1979)] 'に従い、 ナイロン膜へゲノム； DNAを転写した。 転写終了後、 ナイロン膜に対し 80°Cで 2時間の熱処理を行い、 固定化した。 、 一方、 サザンプロットに用いるプローブを以下のように調製した。 まず、 FUT8ゲノム領域のう ちターゲティングベクター相同領域を越えた部分の配列に結合するプライマー （配列番号 26およ び配列番号 27) を用いて、 以下の； PCRを行った。 即ち、 WO02/31140の実施例 12に記載の方法 により構築したプラスミ ド pFUT8fgE2-2 4.0ng を含 20〃L の反応液 [DNA ポリメラー ExTaq(宝酒造社製)、 ExTaq buffer (宝酒造社製)、 0.2mmol/L dNTPs, 0.5pmol L上記遺伝子特異 的プライマー （配列番号 26および配列番 27) ]を調製し、 94。Cで 1分間の加熱の後、 94°Cで 30 秒間、 55°Cで 30秒間、 74°Cで 1分間からなる反応を 1サイクルとした 25サイクルの条件で PCR を行った。 PCR後、 反応液を 1.75%(w/v) ァガロースゲル電気泳動に供し、 約 230bpのプローブ DNA断片を精製した。得られたプローブ: DNA溶液 5〃Lに対し、 [a-32P] dCTP 1.75MBqおよび Megaprime DNA Labelling system, dCTP (Amersham Pharmacia Biotech ¾S) を用いて放射 線標識した。
ハイブリダィゼーシヨンは以下のように行った。 まず 上記のナイロン膜をローラーボトルへ封 入し、 ハイブリダィゼーシヨン液 [5xSSPE、 50xDenhaldt's液、 0.5%(w/v) SDS、 100pg/mLサ ケ精子 DNA] 15mLを加えて 65°Cで 3時間のプレハイブリダィゼーシヨンを行った。 次に、 32P 標識したプローブ DNAを熱変性してボトルへ投入し、 65°Cで一晚加温した。
ハイブリダイゼーション後、 ナイ口ン膜を 2xSSC— 0.1%(W/V) SDS 50mLに浸漬し、 65°C * 15 分間加温した。 上記の洗浄操作を 2回繰り返した後、 膜を 0.2xSSC— 0.1%(W/V) SDS 50mLに浸 潰し、 65°Cで 15分間加温した。 洗浄後、 ナイロン膜を X線フィルムへ- 80°Cで暴露し現像した。 前述の制限酵素 Nhel処理により、野生型 FUT8対立遺伝子から約 8.0Kbの DNA断片が生じる。 また、 同制限酵素処理により、 夕ーゲティングベクターとの相同組換えが起こった対立遺伝子から 約 9.5Kbの DNA断片が生じた。 さらに、 相同組換えが起こった対立遺伝子からネオマイシン耐性 遺伝子 （約 1.6Kb) またはピューロマイシン耐性遺伝子 （約 1.5Kb)'が除去された場合には、 同処 理により約 8.0Kbの DNA断片が生じた。
親株である CHO/DG44細胞、 本実施例の 2項に記載の 50-10-104株、 本実施例の 3項に記載の WK704株、 および WK704株から本項 (2)に記載の方法により取得した薬剤感受性クローンの 1つ である 4-5-C3株のゲノム DNAを、 本法により解析した。 CHO DG44細胞では、 野生型 FUT8対 立遺伝子に由来する約 8.0Kbの DNA断片のみが検出された。 また、 50-10-104株や WK704株で は、相同組換えが起こった対立遺伝子に由来する約 9.5Kbの DNA断片が認められた。一方、 4-5-C3 株では、 相同組換えが起こつた対立遺伝子からさらにネオマイシン耐性遺伝子 （約 1.6Kb) および ピューロマイシン耐性遺伝子 （約 1.5Kb) が除去されて生じる約 8.0Kbの DNA断片のみが検出さ れた。この結果から 4-5-C3株は、 Creリコンビナーゼにより薬剤耐 f生遺伝子が除去されたことが確 認された。
薬剤耐性遺伝子の除去された FUT8遺伝子ダブルノヅクアウトクローン （以下、 FUT8遺伝子ダ ブルノックアウト細胞と表記する） は、 4-5-C3株以外にも複数株取得された。
実施例 2 . FUT8遺伝子ダブルノックアウト細胞による遺伝子組換えアンチトロンビン IIIの発現 '遺伝子組換えアンチトロンビン IIIを発現する FUT8遺伝子ダブルノヅクァゥト細胞株を以下に示 す方法で作製した。
1 . ポリメラ一ゼ連鎖反応 (PCR)
ヒトアンチトロンビン IIIの遺伝子配列 (UniGene : Hs .75599) より 2種類のプライマー （配列番 号 28'および配列番号 29) を作製し、 以下の PCRを行った。 即ち、 ヒト肝由来 cDNA (ィンビトロジ ェン社製） をテンプレートとして含む 20〃Lの反応液、 .すなわち Pyrobest® DNA polymerase (タカ ラバイオ社製） 、 lO xPyrobest® buffer, 0.2讓 οΙ/L· dNTP mixtureヽ 0.5〃mol/L上記遺伝子特異的 プライマー （配列番号 28および配列番号 29) を含む反応液を調製し、 94°Cで 1分間の加熱の後、 94°Cで 30秒間、 55°Cで 1分間、 74°Cで 2分間、 からなる反応を 1サイクルとした 30サイクルの条 件で PCRを行った。 PCR後、反応液を 1.5%(w/v) ァガロースゲル電気泳動に供し、約 1400bpのヒト アンチトロンビン III遺伝子を含む DNA断片が特異的に増幅きれたことを確認した。
2 . プラスミド pBS- ΑΤΙΠの作製 . 前項 1で作製した PCR産物に対してフヱノール/クロ口ホルム抽出処理およびエタノール沈殿を 行い、 回収した精製 DNA断片を の滅菌水に溶解した。 該液に 10単位の制限酵素 EcoRI (タカ ラバイオ社製）と 10単位の BamHI (夕カラバイオ社製)、 2〃Lの 10 XH buffer (夕カラバイオ社製）を 加えて 20 ^の反応液を調製し、 37°Cで ΐρ時間の消化反応を行った。次に、プラスミド pBluescript IIKS (+) (Strategene社製）3〃gを 17.5 ^の滅菌水に溶解した。 該液に 10単位の EcoRI、 2〃Lの 10 XH bufferを加えて 20〃Lの反応液を調製し、 37°Cで 16時間消化反応を行った。 反応後、 フヱ ノ一ル /ク口口ホルム抽出処理およびエタノール沈殿を行い、回収したプラスミドを 17.5 Lの滅菌 水に溶解した。さらに該液に 10単位の BamHIと 2〃Lの lO xK bufferを加えて' の反応液を調 製し、 37°Cで 16時間消化反応を行った。 上記で得られたヒトアンチトロンビン III遺伝子を含む PCR産物断片 (EcoRI- BamHI )および pBluescriptIIKS(+)断片 (EcoRI-BamHI)を、 1.5% (w/v)ァガロー スゲル電気泳動に供し、それそれ約 1.4Kb、 3.0Kbの DNA断片を QIAquick Gel Extraction Kit(QIAGEN 社製）を用いて精製した。 次いで、 精製 PGR産物断片 (EcoRI-BamHI ) 20ng と精製 Bluescript ll KS(+) (EcoRI-BamHI )断片 80ngを Ligation High (東洋紡社製)存在下で連結し、 得られた組換えプ ラスミド DNAを用いて大腸菌 DH5 a株 （東洋紡社製） を形質転換した。 各形質転換株よりプラスミ ド腿を調製し、 BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit v2.0 (Applied Biosystems '社製） と DNAシーケンサ ABI PRISM 377 (Applied Biosystems社製） を用いて塩基配列を解析した。 この結果、 ヒトアンチトロンビン IIIの翻訳領域全長の遺伝子配列を含むプラスミド pBS- ATIIIを 得た （第 4図） 。
3 . プラスミド ρΚΑΝ-ΑΤΙΠの作製
前項 2で作製した pBS- ATIII3〃gを 17〃1の滅菌水に溶解し、 10単位の EcoRI (夕カラバイオ社 製)、 10単位の BamHI (夕カラバイオ社製)、 2〃Lの 10 XH bufferを加えて 20〃Lの反応液を調製 し、 37°Cで 16時間消化反応を行った。
次に、 プラスミド PKANTEX93 (WO97/10354) 3 /gを 17.5 zLの滅菌水に溶解した。該液に.10単位 の EcoRIと 2〃Lの 10 XH bufferを加えて 20〃Lの反応液を調製し、 37°Cで 16時間消化反応を行つ た。反応後、 フエノール/クロ口ホルム抽出処理およびェ夕ノール沈殿を行い、 回収したプラスミド 'を 17.5〃Lの滅菌水に溶解した。 さらに該液に 10単位の BamHIと 2〃Lの 10 xK bufferを加えて 20 Lの反応液を調製し、 37°Cで 16時間消化反応を行った。 上記で得られた pBS- ΑΤΠΙ断片 (EcoRI- BamHI )および pKA TEX'93断片 (EcoRI- BamHI)を 1 . 5 % (w/v )ァガロースゲル電気泳動に供し、 それぞれ約 1 .4Kbp、 9 . 0Kbpの DNA断片を QIAqui'ck Gel Extraction Kit (QIAGEN社製）を用いて精製 した。 次いで、 精製 pBS- ΑΤΙΠ断片 (EcoRI-BamHI ) 50ngと精製 pKANTEX93 (EcoM-BamHI )断片 30ng を Ligation High (東洋紡社製） 存在下で連結し、 得られた組換えプラスミド DNAを用いて大腸菌 DH5な株 （東洋紡社製） を形質転換した。 各形質転換株よりプラスミド DNAを調製し、 BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit v2. 0.と DNAシーケンサ ABI PRISM 377 (Appl ied Biosystems社製） を用いて塩基配列を解析した。 この結果、 ヒトアンチトロンビン IIIの翻訳領域 全長の遺伝子配列を含む動物細胞発現用プラスミド pKAN-ATI IIを得た （第 5図） 。
4 . ゲノム上の FUT8遺伝子をダブルノヅクアウトした CH0/DG44細胞株へのヒトアンチトロンビン III発現プラス.ミドの安定的導入
実施例 1にて作製した FUT8遺伝子をダブルノヅクアウトした CH0/DG44細胞株に、 前項で作製し たプラスミド ρΚΑΝ- ΑΤΠΙを安定的に導入し形質転換株を作製した。 プラスミド pKAN- ΑΤΙΠの遺伝 子導入はエレクト口ポレーシヨン法 [サイトテクノロジー （Cytotechnology ) , 3 , 133 ( 1990 ) ]に準 じて以下の手順で行った。まず、プラスミド pKAN- ΑΤΙΠ l OQ j gを NEBuffer 3 (New England Biolabs 社製） 60〃Lと 120単位の制限酵素 MluI (New England Biolabs社製） を含む 600 ^の反応液を調製 し、 37°Cで 5時間消化反応を行うことにより線状化した。反応後、該反応液に対しフヱノール/クロ 口ホルム抽出処理およびエタノール沈殿により精製を行い、 線状化プラスミドを回収した。 次に、 実施例 1で取得した FUT8遺伝子ダブルノヅクアウト CH0/DG44細胞クローンのうち 1株を、 K- PBS 緩衝液（137mmol/L KC1ヽ 2 , 7mmol/L NaCl, 8 . 1腿 ol/L Na2HP04、 1 . 5匪 ol/L K¾P04、 4. 0mmol/L MgCl2 ) に.懸濁して 8 X 107細胞/ mLの液を調製した。 細胞懸濁液 200〃L ( 1 .6 X 106個） と上記の線状化ブラ スミド を混和した後、 細胞- DNA混和液の全量を Gene Pulser Cuvette (電極間距離 2mm) (BIO- RAD社製)へ移し、 エレクト口ポレーシヨン装置 Gene Pulser II (BIO- RAD社製） を用いてパ ルス電圧 350V、 電気容量 250〃Fの条件で遺伝子導入を行った。 同様にしてキュベット 4本分に対 し遺伝子導入を行ったのち、 細胞懸濁液を 10%ゥシ胎児血清 (Life Technologies社製)'および 50 ig/mL gentamicin (ナカライテスク社製） を添加した IMDM培地（Life Technologies 社製） 120mL に懸濁し、接着細胞培養用の 96ゥエルプレート（グライナ一社製） 12枚へ 100 L/ゥエルで播種した。 培養は C02インキュベーター （TABAI社製） にて、 5%C02、 37°Cの条件下で行った。
5 . 500nM MTX耐性株の取得
前項で得た pK - ΑΤΙΠを安定的に導入した細胞を 6日間培養した後、培養上清を除去し、 10%透 析ゥシ胎児血清、 50 g/mL gentamicinおよび 50nM methotrexate (MTX) (シグマ社製）を添カ卩した IMDM 培地を 100〃L/ゥエルずつ添加した。この培地交換作業を 3〜4日毎に繰り返しながら 9日間の培養 を行った。'次いで、 10 %透析ゥシ胎児血清、 50 zg/mL gentamicinおよび 200nMの MTXを添加した IMDM培地を用いた培地交換作業を同様に 3〜4日毎に繰り返しながら 18日間培養し、最終的に形成 されたコロニーを 24ゥヱルプレート（シグマ社製)に植え替えた。 さらに、 10 %透析ゥシ胎児血清、
gentamicinおよび 500nMの MTXを添加した IMDM培地を用いた培地交換作業を 3~4日每 に繰り返し、 適宜拡大しながら 19日間培養を行い、 500nM MTXに耐性の形質転換株を取得した。
6 . アンチトロンビン II I高生産株の選別
前項で取得した複数の 500nM MTX耐性株より、各 1 . 5 x 106細胞を 5mLの 10%透析ゥシ胎児血清、 50 g/ml gentamicinおよび 500nMの MTXを添加した IMDM培地に懸濁し、 組織培養用フラスコ （培 養面積 25 cm2、 グライナ一社製 )へ播種して培養を行った。 培養 3日後に培養上清'を回収し、 上清中 に含まれるヒ トアンチトロンビン ΠΙ 量を ELISA for antithrombin(ATIII ) kit (Affinity Biological 社製）を用いて測定した。 方法はキット 添付のマニュアルに従い、 標準品には市販の ヒト血漿由来アンチトロンビン ΙΠ (シグマ社製）を用いた。 複数の 500ηΜ ΜΤΧ耐性株のうち、 Ms705 pKAN-ATIII 27株の培養上清中に
Figure imgf000048_0001
の濃度でヒトアンチトロンビン IIIが発現しているこ とを確認した。 Ms705 pKAN-ATIII 27株は平成 15年 9月 9日付け.で、 独立行政法人産業技術総合研 究所特許生物寄託センター （日本国茨城県つくば巿東 1丁目 1番地 1中央第 6) に FERM BP- 08472 として寄託されている。 '
実施例 3. CH0/DG44細胞による遺伝子組換えアンチトロンビン IIIの発現
1 . CH0/DG44細胞株へのヒトアンチトロンビン III発現プラスミドの導入
まず、 実施例 2第 3項で作製したプラスミド pKAN-ATIII 100 z を NEBuffer 3 (New England Biolabs社製) 60 zLと 120単位の制限酵素 Mlul (New England Biolabs社製） を含む 600〃Lの反応 液を調製し、 37°Cで 5時間消化反応を行うことにより線状化した。 反応後、 該反応液に対しフエノ ール /クロ口ホルム抽出処理およびエタノール沈殿により精製を行い、線状化プラスミドを回収した。
,次に、 CH0/DG44細胞株 [Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 77 , 4216 ( 1980 ) ]を K-PBS緩衝液（137腿 ol/L KC1、 2 .7mmol/L aCl, 8.1mmol/L Na2HP04s 1 . 5腿 ol/L ¾P04、 4.0mmol/L MgCl2) に懸濁して 8 x l07 細胞/ mLとした。細胞懸濁液 200 L ( 1 . 6 X 106個） と上記の線状ィヒプラスミド 9〃g を混和した後、 細胞- DM混和液の全量をジーン ·パルサー 'キュベット （Gene Pulser Cuvette ；電極間距離 2匪） (BI0-RAD社製）へ移し、 エレクト口ポレーシヨン装置 Gene Pulser (BI0-RAD社製） を用いてパルス 電圧 350V、 電気容量 250 Fの条件で遺伝子導入を行った。 エレクト口ポレーシヨンの方法は、 文 献 [サイトテクノロジ一 （Cytoteclmology) , 133 ( 1990 ) ]に従った。 遺伝子導入を行ったのち、 細胞懸濁液を 10% ゥシ胎児血清 （Life Technologies社製)および ジェンタマイシン（ナ 力ライテスク社製） を添加した IMDM培地 (Life Technologies社製) 30mLに懸濁し、 接着細胞培養 96ゥエルプレート（グライナ一社製） 3枚へ 100〃L/ゥエルで播種した。 培養は 5%C02、 37°Cの条件 下で行った。
2 . MTX耐性株の取得 '
前項で得た pKAN- ATIII導入細胞を 6日間培養した後、培養上清を除去し、 10%透析ゥシ胎児血清、 50〃g/mL ジェン夕マイシンおよび 50nM メトトレキサート（MTX) (シグマ社製）を添加した IMDM培地 を 100〃L/ゥヱルずつ添加した。この培地交換作業を 3〜4日毎に繰り返しながら 9日間の培養を行 つ,た。次いで、 10%透析ゥシ胎児血清、 50 ig/mL ジェン夕マイシンおよび 200nMの MTXを添カロした IMDM培地を用いた培地交換作業を同様に 3~4日毎に繰り返しながら 18日間培養し、最終的に形成 されたコロニーを 24ゥエルプレート（グライナ一社製）に植え替えた。さらに、 10%透析ゥシ胎児血 清、 50〃g/ml ジヱン夕マイシンおよび 500nMの MTXを添加した IMDM培地を用いた培地交換作業を 3〜4日毎に繰り返し、 適宜拡大しながら 19日間培養を行い、 500nM MTXに耐性の形質転換株を取得 した。
3 . アンチトロンビン III高生産株の選別
前項で取得した複数の 500nM MTX耐性株より、各 1 .0 X 108細胞を 5mLの 10%透析ゥシ胎児血清、 50 zg/ml ジェンタマイシンおよび 500nMの MTXを添加した IMDM培地に懸濁し、 組織培養用フラス コへ播種して培養を行った。 培養 3日後に培養上清を回収し、 上清中に含まれる遺伝子組換えアン チトロンビン III量を ELISA for antithrombin(ATIII ) kit (Affinity Biological社製）を用いて測 定し、 その結果から高生産株の選別を行なった。 方法は ELISAキヅ,トに添付のマニュアルに従い、 標準品にはヒト血漿由来製剤であるノィアート（三菱ゥエルファーマ社製）を用いた。 培養上清中に 遺伝子組換えヒトアンチトロンビン IIIの蓄積が認められたー株の形質転換株を、 pKA -ATIII DG44 と名付けた。
実施例 . 遺伝子組換えアンチトロンビン IIIの精製と糖鎖構造の解析
1. 無血清培地への馴化
実施例 2と 3で作製された遺伝子組換えアンチトロンビン III発現 FUT8遺伝子ダブルノヅクァゥ ト細胞株と、遺伝子組換えアンチト口ンビン III発現 CHO/DG44細胞株を以下の方法で無血清培地へ馴 ィ bした。各細胞株を 4 の L- Glutamine (インビトロジェン社製 )、 50〃 g/ml ジェン夕マイシンおよび 500nMの MTXを添加した EX-CELL302培地 (JRH社製）（以下、 無血清培地と称す） 15mlに 5 x 105細胞/ mlで 懸濁して 125ml三角フラスコ（コ一二ング社製)へ播種し、 回分培養を行なった。培養は、 35°C、 回転 速度は 90~100rpmで行い、継代の際には培養容器容積の 4倍量以上の 5%C02を含有する空気を培地上 面に通気し、 Ξ角フラスコ中の空気を置換した。 3日後に培地交換を行い、 6日目に 5 X 105細胞/ fill で継代を行なった。 以降、 3〜4日毎に継代を二週間繰り返し、 無血清培地に馴化させた。 この培養 により、 FUT8遺伝子ダブルノックアウト細胞株に由来し、 無血清培地中での増殖能力を有する形質 転換株 pKAN-ATIII AFMS705株と、 CH0/DG44細胞株に由来し、 無血清培地中での増殖能力を有する形 質転換株 ρΚΑΝ- ΑΤΠΙ AFDG44が得られた。 得られた株を 3.0 X 105細胞/ mLの濃度で 15mLの無血清培地 に懸濁し、 125mLフラスコへ播種して培養を行った。 培養 3日後に培養上清を回収し、 上清中に含ま れる遺伝子組換えアンチトロンビン III量を ELISA for antithrombin ATIII ) kit (Aff inity
Biological社製）を用いて測定したところ、 p M- ΑΤΙΠ AFMS705株の培養上清中に 18 g/mL、 pKAN-ATIII AFDG44株の培養上清中には 28〃g/mLと、 両方の形質転換株で、 ほぼ同等の濃度で遺伝子 組換えアンチトロンビン IIIが発現していることを確認した。 なお、 ί)ΚΑΝ- ΑΤΠΙ AFMS705株は pKAN-ATIII AFMS705の株名で、平成 16年 8月 10日付けで独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物 寄託セン夕一 (日本国茨城県つくば巿東 1丁目 1番地 1中央第 6)に FERM BP-10088として寄託されて いる。 ， '
2 . 遺伝子組換えアンチトロンビン III含有培養上清の取得
前項で得られた 2種の無血清馴化細胞株である' pKAN-ATIII AFMS705株および ρ ΑΝ- ΑΤΙΠ AFDG44 株をそれぞれ 3 X 105細胞/ mlで無血清培地 450mlへ懸濁して 2Lローラーボトル（べクトンディツキ ンソン社製)に播種し、 培養容器容積の 4倍量以上の 5%C02を含有する空気を培地上面に通気し、 三角フラスコ中の空気を置換した。 培養は 35°C、 回転速度は 5〜10rpmで行い、 培養 5日目にアミ ノ酸などの消費された栄養素を補う目的で、 フィード培地を 37. 5mlおよび 50%グルコース溶液を 1.8ml 添加した。 フィード培地は、 アミノ酸 （L—ァラニン 0 . 2 2 g/L、 L—アルギニン一塩 酸 0 . 7 4 gZL、 Lーァスパラギン一水和物 0 . 2 2 g/L、 L—ァスパラギン酸 0 . 2 6 g/ L、 L一シスチン二塩酸 0 . 8 0 g/L、 L—グルタミン酸 0 . 6 6 g/L、 L—グルタミン 7 . 3 g/L、 グリシン 0 . 2 6 g/L、 L—ヒスチジン一塩酸二水和物 0 . 3 7 g/L、 L一イソ口， イシン 0 . 9 2 g/L、 L—ロイシン 0 . 9 2 g/L、 L—リジン一塩酸 1 . 2 9 g/L、 Lーメ チォニン 0 . 2 6 g/L、 L—フエ二ルァラニン 0 . 5 8 g/L、 L—プロリン 0 . 3 5 g/L、 Lーセリン 0 . 3 7 g/L, Lースレオニン 0 . 8 4 g/L、 L一トリプトファン 0 . 1 4 g/L、 L一チロシンニナトリウムニ水和物 0. 92 g'/L、 L—パリン 0. 83 g/L) 、 ビタミン (d —ピオチン 0. 000 1 g/L、 D—パントテン酸カルシウム 0. 035 g/L、 塩化コリン 0. 035 g/L, 葉酸 0. 035 g/L, my o—イノシトール 0. 063 g/L, ナイァシンアミ ド 0. 035 gZL、 ピリドキサール塩酸 0. 035 g/L、 リボフラビン 0. 0035 g/L、 チアミン塩酸 0. 035 g/L、 シァノコバラミン 0. 00◦ 1 g/L) 、 リコンビナントヒトイ ンスリン 0. 3 1 /L (JRH社製)、 エタノールァミン 0. 025 g/L (シグマ-アルドリヅ チ社製)、 2—メルカプトエタノール 0. 0098 g/L (シグマ-アルドリツチ社製)、 大豆加水分 解物 HY— SOY8g/L (クウエストイン夕一ナショナル社製)、亜セレン酸ナトリウム 16. 8 g/L (シグマ-アルドリヅチ社製)、コレステロール脂質濃縮溶液 2 mL/L (250 X水溶液、 インビトロジェン社製)、 エチレンジァミン四酢酸第二鉄ナトリウム塩 0. 05 g/L (シグマ-ァ ルドリッチ社製） からなる培地である。 フィード以降は培養終了まで毎日通気し、 空気置換を行な つた。 生存率は、 80%以上を維持させながら、 9~10 日間の培養を行なった。 培養終了後、 培養上 清中の遺伝子組換えヒトアンチトロンビン量を ELISA for antithrombin(ATIII) kit (Affinity Biological社製）を用いて測定した。 その結果、 pKAN-ATIII AFMS705株および pKAN- ΑΤΠΙ AFDG44 株のそれぞれの培養上清には、 68〃g/mlおよび 87 g/mlの濃度で遺伝子組換えアンチト口ンビン IIIが含まれていることが確認された。 以下、 pKAN- ΑΤΠΙ AFMS705株が産生した遺伝子組換えアン チトロンビン IIIを ATIIIMS705、 pKAN-ATIII AFDG44株が産生した遺伝子組換えアンチトロンビン IIIを ATIII DG44とそれそれ略記する。 - , 3.遺伝子組換えアンチトロンビン IIIの精製 . 前項で得られた遺伝子組換えアンチトロンビン IIIを含む培養上清より、 文献 [Meth. Enzymol. , 222, 525, 1993]に記載の方法に従って遺伝子組換えアンチトロンビン IIIを以下のようにして、 精 製した。前項で得られた遺伝子組換えアンチトロンビン IIIを含む培養上清のうち、遺伝子組換えァ ンチトロンビン III約 250mg相当の培養上清を 50mM トリス、 14mMクェン酸、 0.15MNaCl (pH7.4)から なる緩衝液で平衡化したへパリンカラム （Heparin Sep arose 6 Fast Flow, 250ml, アマシャムバ ィォサイエンス社製）に通塔した。 続いて、 平衡化緩衝液 10CVでへパリンカラムを洗浄後、 3M NaCl 濃度までの直線状勾配溶出法 (12CV)を用いて、遺伝子組換えアンチト'ロンビン IIIを溶出させた。装 置は Hiloadクロマトシステム（アマシャムバイオサイエンスネ： tS)を用い、流速は 21ml/分とし、遺伝 子組換えヒトアンチトロンビン III溶出画分は 50ml每に分画した。 各画分のヒトアンチトロンビン III量を ELISA for antithrombin(ATIII) kit (Affinity Biological社製）を用いて測定したところ、 第 7図で示すように、 溶出パターンには大きく分けて 3種のピークが認められたが、 ATI II MS705と ATI II DG44との溶出パターンは異なるパターンを示した。 以下、 早く溶出したピーク画分から、 ピ 一ク①画分、 ピーク②画分、 ピーク③画分と称す。アンチトロンビン IIIをへパリンァフィニティ一 で精製を行なった際に、 複数のピークが認められることは、 以下の文献 [J. Biol. C eni., 268, 17588(1993)、 Biochem, J., 墨' 793(1992)、 J. Biol. Chem., 26i> 21153(1989)]などで報告され ている。 また、 同様にノィアートの溶出パターンを検討したところ、 ピーク②爾分に限局して溶出 が認められた。 主要ピークである ATIIIMS705ピーク②画分、 ③画分、 ATIII DG44'ピーク①画分、 ② 画分に相当する各ピーク画分は、 ペリコン XL (ミリポア社製）と BiomaxlO (ミリポア社製）を用い、 ダ ィァフィルトレーシヨン法により 5mM リン酸ナトリゥム緩衝液 (pH7.4)に脱塩した。脱塩した各ピー ク画分を、 DEAE Sepharose Fast Flowカラム（アマシャム社製、 480ml)に通塔し、 吸着させた。 続い て、 12CVの 20mMリン酸ナトリウム緩衝液 (pH7 .4 )で洗浄した後、 1 . 0M NaCl濃度までの直線状勾配溶 出毕（8 6CV)を用い、 流速 40ml/minで遺伝子組換えアンチトロンビン IIIを溶出させた。 溶出パター ンは、 吸光度 (A280nm)で測定した。次に、遺伝子組換えアンチトロンビン IIIを含む溶出画分を合わ せ、 ペリコン XL (ミリポア社製）と BiomaxlO リポア社製）を用いてダイァフィルトレーシヨン法に より緩衝液を PBSに置換し、評価用サンプルを調製した。評価用サンプルの吸光度 (A280nm)を測定し 、 A280nm 1 .0=0 . 64mg/mlとして蛋白質濃度を算出した。 .また、 ELISA for antithrombin(ATIII ) kit (Aff inity Biologica 土製）を用いた定量も行い、吸光度法と ELISA法で濃度が等しいことを確認 した。また、パジヱル SPG520L (アト一社製）を用いて還元 SDS- PAGEを行なった。電気泳動にはそれそ れ 2-メルカプトエタノールで還元した の遺伝子組換えアンチトロンビン IIIを用い、 染色は CBB 染色で行なった。その結果、 全ての評価用サンプルで、分子量約 60kDの ΑΤΠΙバンド以外のバンドは 確認されなかった。
4 . 遺伝子組換えアンチトロンビン IIIの中性糖 ·アミノ糖組成分析 ' 実施例 4第 3項で得られた評価用サンプルについて、中性糖 'ァミノ糖組成分析を行なった。各々 の遺伝子組換えアンチトロンビン III の評価用サンプルを 4. 0 mol/1 トリフルォロ酢酸存在下で 10(TC、 2 時間加水分解し、 蛋白質から中性糖 ·ァミノ糖を遊離させた。 遊離した糖は、 Michael Weitzhandler 等の文献 [Analytical Biochemistry 241 , 128-134 ( 1996 ) ]、 および DI0NEX Application Note 92 (The Determination of Sugars in Molasses by High-Performance Anion Exchange with Pulsed Amperometric Detection) に記載の方法を参考にして、 DX-500 糖分析装置 (Dionex社製）を用いて分析した。 ヒト血漿由来アンチトロンビン I IIの糖鎖構造は、 フコースを含 まない複合二本鎖型糖鎖であることが知られている [Arch . Biochem . Biophys . , 203 . 458 ( 1980 ) ] (第 2図）。 中性糖 ·アミノ糖«分析結果の解析では、 Ν-ァセチルグルコサミンの組成比を 4とし て、各単糖成分（フコース、ガラクトース、マンノース）の組成比を算出した。解析の結果、 ATIII DG44 の糖鎖成分にはフコースが検出されたのに対して、 ΑΤΙΠ MS705 の糖鎖成分におけるフコース含量 は、ヒト血漿由来アンチトロンビン IIIであるノィアートと同様に、検出限界以下であった。また、 各単糖成分の組成比より、 全てのサンプルの主要な糖鎖構造は、 ハイマンノ一ス型ゃハイブリッド 型ではなく、 複合二本鎖垫糖鎖であることが示唆された。 ' '
5 . ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー分析
実施例 4第.3項で得られた評価用サンプルの 'α型と ^型の組成比を、 Goran Karlssonおよび Stefan Wingeの方法 [Protein Expression and Purification 28， 196-201 ( 2003 ) ]を参考にして、 ハイドロキシァパタイトクロマトグラフィーで分析した。 その結果、 ATIII MS705ピーク②画分、 ATIII DG44ピーク①画分では、ヒト血漿由来のノィアートと同様に、主として 型が含まれていた。 また、 ATIII MS705ピーク③画分では、 主として/?体が含まれていた。 また、 ATIIIDG44ピ一ク②画 分には α型と y5型が、 ほぼ同じ割合で含まれていた。 以上、 中性糖-アミノ糖分析とハイド キシ アパタイトクロマトグラフィ一分析の結果を第 1表にまとめた。 、¾¾ ノ— '―人 土安な分于種
ATIII MS705ピ、 —ク② 複合二本鎖型 a
AT III MS705ピ-ーク③ 複合二本鎖型 β
ATIII DG44ピー -ク① 複合二本鎖型 + a
ATIII DG44ピー -ク② 複合二本鎖型 +
ノィアート 複合二本鎖型 a
ATIII DG44は糖鎖にフコースを有しており、 ヒト血漿由来アンチトロンビン IIIとは糖鎖構造が 異なっていた。.一方、 ATIII MS705ピーク②画分と ATIII MS7.05ピーク③画分の糖鎖構造は、 それ ぞれヒト血漿由来の α型、 3型アンチトロンビン IIIに近似した糖鎖構造であることが明らかにな つた。 また、 ATIII MS705は、 ヒト血漿由来アンチトロンビン IIIにおいて文献 [J . Biol . Chem. , 268, 17588(1993 )] で報告されているように、 へパリンァフィ二ティーを利用した精製方法で cr型 と 5型とを分離することができた。 しかしながら、 ATIII DG44ピーク②画分は同様の精製をおこな つても分離できなかった。 以上のことから、 ATIII MS705 は、 ヒト血漿由来アンチトロンビン III と同等の性質を有することが明らかとなつた。
実施例 5 . 精製した遺伝子組換えアンチトロンビン 111の生物活性の比較
1 .へノ リン解離定数の測定 - へパリン解離定数は、 アンチトロンビン IIIとへパリンとの結合により、 アンチトロンビン III 分子の立体構造が変化するため、 アンチトロンビン III蛋白質を構成するトリブトフアン残基の蛍 光強度が変化することを利用して測定することができる。 アンチトロンビン III濃度とトロンビン 濃度の間には以下の関係式 1 ) が成り立つ（Meth. Enzymol . , 222 , 525 , 1993 )。 式 1 )
AF AFmax [AH0+ n間0 +Kd-{([AT]0 +n H\o + d)2-4n [ATJ0 H\0}^
X
F„ 2 [ATI0
△F ： 蛍光変化量
AFmax 最大蛍光変化量
F。 ： へパリン非添加時の蛍光強度
[AT]。： アンチトロンビン III濃度
[H]0 : へパリン濃度
Kd： 解離定数 '
n： stoichiometry 実施例 4第 3項で得られたへパリンァフィ二ティ一で分画したアンチトロンビン IIIの各評価用 サンプルのへパリン解離定数を、以下の方法で測定した。まず、 20mM Na2HPO4、 0.1M NaCl、 O . lmM EDTA - SHA 0.1% PEG6000からなる緩衝液 (pH7.4)を調製した。本緩衝液はサンプルの希釈に用いた。 50nM アンチトロンビン IIIに対して、 へパリン（シグマ社製)を 0〜20当量加え、 各溶液の蛍光強度を励 起波長 280-nm、 蛍光波長 340皿で測定した。 解離定数は式 1 )を用いて解析ソフトウエア GraphPad prism 4 (グラフパヅド社製 )で解析した。実施例 4第 3項で得られた評価用サンプルのへパリン解離 定数 （ 値、 単位 nM) を測定した結果を第 2表に示した。 ΑΤΠΙのへパリンに対する結合力は、 Kd 値が小さいほど強い。従って、 最も結合力の強いのは ATIII MS705ピーク③画分、 次に ATIII MS705 ピ一ク②画分および ATIII DG44 'ピーク②画分、 結合力が最も弱かったのは ΑΤΠΙ DG44ピーク①画 分であった。 第 2 表
Figure imgf000053_0001
2 .へパリンコファクタ一活性の測定 '
アンチトロンビン IIIのトロンビン阻害速度は、 べパリン存在下で著しく上昇することが知られ ている。 また、 トロンビンとアンチトロンビン IIIの結合反応はモル比一対一で起こり、 反応後は 互いに活性を失うため、 へパリン存在下では、 アンチトロンビンの抗トロンビン反応は、 きわめて 短時間で終了してしまう。 へパリンコファクタ一活性は、 抗トロンビン反応終了時の残存トロンビ ン活性で表されるので、 換言すれば、 へパリンコファクタ一活性は、 抗トロンビン反応終了時の活 性体アンチトロンビン III量を測定していることになる [続 医薬品の開発， 20， 185 , 1992]。
へパリンコファクタ一活性の測定のため、 まず、 0.15M NaCU 0.05M Tris-HCl, 0.2°/。アルブミン からなる緩衝液 (PH8.3 )を調製した。本緩衝液はサンプルの希釈、酵素液の調製に用いた。アンチト ロンビン III溶液に対して 2.5単位/ mlのトロンビン（Enzyme Research Laboratories社製）と 0.6 単位/ mlのへパリン（シグマ社製）からなる酵素液 1 .0mlを加え、 37°Cで 5分間反応させた。さらに、 トロンビンの特異的基質である 2.0mM の S- 2238 (第一化学薬品社製）を 100 /L加え、 2分間発色さ せた後、 50%酢酸で反応を停止させた。 残存トロンビン活性は、 反応液中の S- 2238が分解されて生 じた P-二トロア二リンの吸光度 ( A405nm )より求めた。なお、アンチトロンビン 111は 0.15~ 4 g/mL の範囲となるように希釈し、 測定に用いた。 検量線の作製には、 標準品としてノィアートを用い、 単位体積（液量）あたりの活性 (単位/ ml )でへパリンコファクター活性を算出した。実施例 4第 3項 で得られた評価用サンプルのへパリンコファク夕一活性を測定し、 得られた活性値を単位質量あた りの活性 (単位/ g)で表した結果を第 8図に示した。 ATIII MS705のピーク②画分、 ATIII MS705のピ 一ク③画分はヒト血漿由来のノィァート（三菱ゥエルファーマ社製）と同等の活性を有していたが、 ATI II DG44ピーク①画分と ATIII DG44ピーク②画分はノィアートよりも低値を示した。
3 .へパリン非存在下におけるトロンビン阻害二次速度定数の測定
トロンビン阻害二次速度定数の測定方法は、 文献 (J . Biol . Chem. , 277 , 24460 , 2002) に準じ て行った。 トロンビン量に対して過剰量のアンチトロンビン IIIが存在する条件下では、 へパリン非存在下 における ΑΤΠΙのトロンビン阻害反応は偽一次反応に近似して考えることができるため、 以下の式 2) が成り立つ。 式 2) ln[T]t = kobs*t + ln[T]0
[T]t t 時間後のトロンビン濃度
m。 トロンビンの初濃度
kobs 偽一次速度定数
- t 時間 式 3) kobs=k[AT]
k 二次速度定数
[AT] アンチトロンビン III濃度 そこで、 まずトロンビン阻害二次速度定数を測定するために、 まず、 20mM Na2HP04、 0.1M NaCl、 O.lmMEDTA · 2¾0、 0.1%PEG8000からなる緩衝液 (pH7.4)を調製した。 本緩衝液はサンプルの希釈、 酵素液の調製に用いた。 ίθΟηΜアンチトロンビン IIIと ΙΟηΜ トロンビンからなる酵素液を調製し、 25°Cで 1 ~40分間反応させた。各時間ごとに、 卜ロンビンの特異的基質である 0.15mMの S-2238(第 一化学薬品社製）を lOO zL加え、約 2分間の吸光度 (A405 nm)を測定した。各時間における吸光度変 化から残存トロンビン濃度を求め、 上記 2)式を用いて、 偽一次速度定数を求めた。 さらに、上記 3) 式を用いてへパリン非存在下でのトロンビン阻害二次速度定数 （単位/ M/秒）を算出した。 実施例 4 第 3項で得られた評価用サンプルの二次速度定数を第 3表に示した。 S.D.は標準偏差を示す。 へパ リン非存在下でのトロンビン阻害二次速度定数は、 ATIII DG44ピーク①画分がわずかに低い値を示 したが、 他の全ての評価用サンプルでは、 ヒト血漿由来アンチトロンビン IIIノィアートと同等の 活性を示すことが示された。 第 3 ¾s
Figure imgf000054_0001
4. へパリン存在下におけるトロンビン阻害二次速度定数の測定
実施例 4第 3項で得られた評価用サンプルのへパリン存在下におけるトロンビン阻害二次速度 定数を、文献 [Biochem. J., 286.793, 1992]に準じて、以下の方法で測定した。まず、 20mMNa2HPO4、 0.1M NaCl、 O.lmM EDTA · 2¾0、' 0.1% PEG8000からなる緩衝液 (pH7.4)を調製した。 本緩衝液はサン プルの希釈、酵素液の調製に用いた。 ΙΟΟηΜアンチトロンビン IIIに対して 0.5〜lnMのトロンビン と 5〜25pMへパリン（シグマ社製）からなる酵素液を加え、 25°Cで 1〜30 分間反応、させた後、 トロン ビンの特異的基質である 0.15mMの S- 2238 (第一化学薬品社製）を 100 zL加え、 約 2分間の吸光度 (A405 nm)を測定した。各時間における吸光度変ィ匕がら残存トロンビン濃度を求め、 上記式 2 ) を用 いて、偽一次速度定数を求めた。さらに、下式 4 ) を用いてへパリン存在下におけるトロンビン阻害 二次速度定数を算出した。 式 4)
[AT]0
d+ [ATI0
kobs 偽一次速度定数
k ： 二次速度定数 '
[H]0 ： へパリンの濃度
Kd ： へパリン解離定数
[AT] n アンチトロンビン III濃度 kuncat へパリン非存在下での二次速度定数
実施例 4第 3項で得られた各評価用サンプルのへパリン存在下におけるトロンビン阻害二次速度 定数（単位/ M/秒）を測定した結果を第 4表に示した。数値の表記は、 たとえば 2.5E+07は、 2. 5 X 107 を示す。 また S .D .は標準偏差を示す。二次速度定数は、 ATIII MS705のピーク②画分と ATIII MS705 のピーク③画分は、 ノィァ一:トと同等の活性を示したが、 ATIII DG44ピーク①画分で著しく低い値 を示し、 ATIII DG44ピーク②画分もわずかに低い値を示した。 この結果より、 CH0/DGM細胞株を用 いて生産された遺伝子組換えアンチト口ンビン IIIには、 へパリン存在下での抗トロンビン活性が 低い画分が含まれることが明らかになった。一方、 FUT8遺伝子ダブルノヅクアウト細胞株を用いて 生産した遺伝子組換えアンチ _トロンビン IIIには、 主にヒト血漿由来アンチトロンビン IIIと同等 の活性を示す画分が得られることが明らかになった。
4 表
Figure imgf000055_0001
実施例 4および 5での解析の結果、 糖鎖構造および生物活性において、 FUT8遺伝子ダブルノヅク ァゥト細胞で生産された遺伝子組換えアンチトロンビン IIIは、 CH0/DG44細胞株で生産された遺伝子 組換えアンチトロンビン IIIに比較して、 ヒト血漿由来アンチト口ンビン IIIと同等の性質を有する 蛋白質であることが示された。 この結果より、 FUT8遺伝子ダブルノックアウト細胞で生産された遺 伝子組換えアンチトロンビン 111は、 ヒト血漿由来アンチトロンビン 111の代替物質として適当であ ることが示された。.
実施例 6 FUT8 遺伝子ダブルノヅクアウト細胞によるアミノ酸改変した遺伝子組換えァンチトロ ンビン IIIの発現
成熟型ヒトアンチトロンビン IIIの N末端から 135番,目に位置するァスパラギン残基をグル夕ミ ン残基にアミノ酸置換した変異型ヒトアンチトロンビン ΠΙ (以下 ATIIIN135Q と称す）を発現する FUT8遺伝子ダブルノックアウト細胞を、 以下に示す方法で作製した。 なお、 ATIIIN135Q組成物は、 Ν結合型糖鎖の付加部位が 3力所と るため、 発現された遺伝子組換えアンチトロンビン III全て ?型となる。
1 . プラスミド pBS- ATIIIN135Qの作製
まず、 アンチトロンビン III遺伝子配列 (UniGene : Hs .75599、 配列番号 1 )に対して、 N末端から 167 番目のァスパラギン残基をグルタミン残基へ置換する 2種類の部位突然変異導入用オリゴ DNA プライマーを作製した (配列番号 30および配列番号 31 )。 実施例 2第 2項で作製した pBS- ΑΤΠΙを 錶型として、 上記のプライマ一および Quick Change® Site-Directed mutagenesis Kit(STRATAGENE 社製）を用い、 アンチトロンビン IIIcDNA配列に、部位特異的変異を導入した。方法はキットに添付 のマニュアルに従った。 得られた形質転換株より QIAprep® Spin Miniprep Kit (QIAGEN社製）を用い てプラスミド DNAを調製し、 BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit v2.0 (Applied Biosystems社製）と DNAシーケンサ ABI PRISM 377 (Applied Biosystems社製）を用いて塩基配列を 解析した。その結果、 変異型アンチトロンビン III (ATIIIN135Q)の翻訳領域全長の cDNA配列を含む プラスミド pBS- ATIIIN135Qを得た（第 6図）。
2 .発現ベクター pKAN- ATIIIN135Qの作製
前項で作製した PBS-ATIIIN135Q 3〃gを 17〃1の滅菌水に溶解し、 10単位の EcoRI (夕カラバイ ォ社製)、 10単位の BamHI (夕カラバイオ社製)、 2 zLの lO xH bufferを加えて 20〃Lの反応液を調 製し、 37°Cで 16時間消化反応を行った。 次に、 プラスミ pKANTEX93 (特許 WO97/10354に記載） 3 figを 17.5〃1の滅菌水に溶解した。 該液に 10単位の EcoEI と 2〃 の lO xH'bufferを加えて 20 1の反応液を調製し、 37°Cで 16時間消化反応を行った。 反応後、 フヱノール/クロ口ホルム抽出 処理およびエタノール沈殿を行い、 回収したプラスミドを 17.5 の滅菌水に溶解した。 さらに該 攀 10単位の BamHI .と 2〃1の 10 XK bufferを加えて 20〃1の反応液を調製し、 37°Cで 16時間消 化反応を行った。 上記で得られた PBS-ATIIIN135Q 断片（EcoRI-BamHI)および pKANTEX93 断片 (EcoRI-'BaniHI) を 1.5% (w/v)ァガロースゲル電気泳動に供し、 それぞれ約 1.4Kbp、 9.0Kbpの DNA 断片を QIAquick Gel Extraction Kit(QIAGEN社製）を用いて精製した。次いで、精製 pBS-ATIIIN135Q 断片 (EcoRI- BamHI ) 50ng、 精製 pKANTEX93 (EcoRI- BamHI )断片 30ng、 Ligation High (東洋紡社製） を含む反応液 20^1を調製し、 16°Cで 16時間の連結反応を行なった。得られたプラスミド DNAを用 い、ヒートショック法により大腸菌 DH5 株 (東洋紡社製）を形質転換した。形質転換株より QIAprep® Spin Miniprep Kit (QIAGEN社製）を用いてプラスミド DNAを調製し、 動物細胞用変異型 ATアンチト ロンビン III発現プラスミド pKAN- ATIIIN135Qを得た（第 6図）。
3 . FUT8遺伝子ダブルノヅクァゥト細胞への ATIIIN135Q発現プラスミドの導入 ， 実施例 1にて作製した FUT8遺伝子ダブルノヅクァゥト細胞に、 実施例 6第 2項で作製したブラ スミド pKAN- ATIIIN135Qを安定的に導入した。遺伝子導入法はエレクトロポレーシヨン法 [サイトテ クノロジ ( Cytotechnology) , 3 , 133 ( 1990 ) ]により以下の手順で行った。 まず、 プラスミ ド PKAN-ATIIIN135Qを 30〃gを NEBuffer 3 (New England Biolabs社製） 20 z lと 100単位の制限酵素 MluI'(Ne England Biolabs社製） を含む 200 z lの反応液を調製し、 37°Cで 16時間の消化反応を行 うことによりプラスミドを線状化した。反応後、該反応液に対しフエノール /ク口口ホルム抽出処理 およびエタノール沈殿により精製を行い、 線状化プラスミドを回収した。 次に、 実施例 1で取得し た FUT8遺伝子ダブルノヅクァゥト細胞を K- PBS緩衝液（137腿 ol/l KC1、 2. 7mmol/l NaCl、 8 . 1mmol/l Na2HP04、 1 . 5mmol/l K¾P04、 4. 0mmol/l MgCl2 ) に懸濁して 8 X 107細胞/ ml とした。 細胞懸濁液 200 Pi ( 1 . 6 X 106個）と上記の線状化プラスミド 9〃g を混和した後、 細胞- DNA混和液の全量を Gene Pulser Cuvette (電極間距離 2mm ) (BI0-EAD社製)へ移し、エレクト口ポレーシヨン装置 Gene Pulser II (BI0- RAD社製） を用いてパルス電圧 350V、 電気容量 250〃Fの条件で遺伝子導入を行った。 遺伝 子導入を行ったのち、 細胞懸濁液を 10% (v/v )ゥシ胎児血清 （Life Technologies社製)および 50〃 g/ml ジヱンタマイシン（ナカライテスク社製）を添カ卩した IMDM培地（Life Technologies社製） 30mL に懸濁し、 接着細胞培養 96ゥエルプレート（グライナ一社製） 3枚へ 100〃1/ゥエルで播種した。 培 養は 5%C02、 37°Cの条件下で行った。
4 . MTX耐性株の取得
前項で得た PKAN-ATIIIN135Q導入細胞を 6日間培養した後、 培養上清を除去し、 10%透析ゥシ胎 児血清、 gentamicinおよび 50nM methotrexate (MTX) (シグマ社製）を添加した IMDM培地を lOO L/ゥエルずつ添加した。 この培地交換作業を 3〜4日毎に繰り返しながら 9日間の培養を行つ た。 次いで、 10%透析ゥシ胎児血清、 50 g/ml gentami cinおよび 200nMの MTXを添加した IMDM 培地を用いた培地交換作業を同様に 3〜4日毎に繰り返しながら 18日間培養し、 最終的に形成され たコロニーを 24ゥエルプレート（グライナ一社製)に植え替えた。 さらに、 10 %透析ゥシ胎児血清、 50 g/ml ジェン夕マイシンおよび 500nMの MTXを添加した IMDM培地を用いた培地交換作業を 3〜4 日毎に繰り返し、 適宜拡大しながら 19日間培養を行い、 500nM MTX耐性株を取得じた。
5 . ATI IIN135Q高生産株の選別 ' '
前項で取得した複数の 500nM MTX耐性株より、 各 1 . 0 X 106細胞を 5mLの 10 %透析ゥシ胎児血清、 50 g/ml gentamicinおよび 500nMの MTXを添加した IMDM培地に懸濁し、 組織培養用フラスコ （グライナ 一社製） へ播種して培養を行った。 培養 3日後に培養上清を回収し、 上清中に含まれる ATII IN135Q 量を ELISA for antithrombin(ATIII ) kit (Affinity Biologica 土製）を用いて測定し、 高生産株を 選別した。 方法は ELISAキットに添付のマニュアルに従い、 標準品にはノィアート（三菱ゥエルファ 一マ社製）を用いた。
6 . 無血清培地への馴化 '
前項で作製した ATI IIN135Q発現 FUT8遺伝子ダブルノヅクァゥト細胞株を、 実施例 4第 1項と同様 の方法で、 無血清培地へ馴化した。 実施例 4第 1項に記載した無血清培地 15mlに、 細胞を 5 X 105 cells/mlで懸濁して 125ml三角フラスコ（コ一ニンタ社製)へ播種し、 回分培養を行なった。 培養は、 35°C、 回転速度は 90〜100rpmで行い、 継代の際には培養器容積の 4倍量以上の 5 %C02を含有する空気 を培地上面に通気し、 三角フラスコ中の空気を置換した。 3日後に培地交換を行い、 6日目に播種密 度 5 X 105細胞/ mlで継代を行なった。 以降、 3〜4日毎に継代を二週間繰り返し、 細胞を無血清培地 に馴化させた。 この培養により無血清培地中で増殖し、 且つ凝集を起こさない細胞株
PKAN-ATIIIN135Q AFMS705を得た。 得られた株を 3. 0 X 105細胞/ mLの濃度で 15mLの無血清培地に懸濁 し、 125mLフラスコへ播種して培養を行った。 培養 3日後に培養上清を回収し、 上清中に含まれる遺 伝子組換えアンチトロンビン III量を ELISA for antit rombin(ATIII ) kit(Affinity Biological社 製）を用いて測定したところ、 培養上清中に 6〃g/niLの濃度で発現していることを確認した。 なお、 pKAN-ATIΠN135QAFMS705株はpKAN-ATIΠN135Q AFMS705©株名で、 平成 16年 8月 10日付けで独立行政 法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター (日本国茨城県つくば巿東 1丁目 1番地 1中央第 6)に FERM BP- 10089として寄託されている。
以下、 実施例 4に記載した方法で、 還元末端の N-ァセチルグルコサミンにフコースが結合してい ない複合型糖鎖を有する変異型の遺伝子組換えアンチトロンビン ΠΙを取得し、 N-グリコシド結合型 糖鎖の本数が 3本であることを確認した。 さらに、 実施例 5に記載した方法で該アンチトロンビン IIIの生物活性を測定した結果、 CH0/DG44細胞で発現させた変異型の遺伝子組換えアンチトロンビン IIIに比較してへパリン解離定数が有意に小さく、へパリンコファクタ-一活性およびトロンビン阻害 二次速度定数が有意に高いことが確認された。
実施例 7 GDP-マンノースを GDP- 4-ケト， 6-デォキシ- GDP -マンノースに変換する脱水反応を触媒 する酵素の遺伝子が発現していない細胞株の取得
1 . レクチン耐性 CH0/DG44株の取得 '
CH0/DG44細胞 （Pro Natl , Acad. Sci . USA, 77 , 4216 ( 1980)) を、 IMDM-FBS (IO ) - HT(1 )培地 [ゥシ胎児血清 (FBS) (インビトロジェン社製） を 10%、 HT supplement (インビトロジヱン社製）を 1 倍濃度で含む IMDM培地 （インビトロジェン社製)] にて接着培養用フラスコ 75cm2 (グライナ一社製 ) 中で培養し、 コンフルェント直前まで増殖させた。 5mLのダルベッコ PBS (以下、 PBSと表記する） (インビトロジェン社製）にて細胞を洗浄後、 PBSで希釈した 0.05%トリプシン（インビトロジェン 社製） を 1.5mL添加して 37°Cにて 5分間放置し、 細胞を培養器底面から剥離させた。 剥離させた細胞 を通常の細胞培養で行われる遠心分離操作により回収し、 1 X 105細胞/ mLの密度になるように IMDM-FBS( IO)- HT( 1 )培地を添加して懸濁後、 未添加又は 0.1〃g/mLのアルキル化剤である MNNG (シ ダマ社製） を添加した。 C02インキュベーター (TABAI製)内で 37°Cにて 3日間放置後、 培養上清を除き 、再び上述した操作と同様の操作で細胞を洗浄、剥離、回収し、 IM腿- FBS(IO )- HT( 1 )培地に懸濁後、 接着培養用 96穴プレート（旭テクノグラス社製）に 1000細胞/ゥヱルの密度で播種した。各ゥヱルには 培地中終濃度で lmg/mLのレンズマメレクチン（Lens culinaris agglutinin ;以下、 LCAと表記、 Vector 社製）を添加した。 C02インキュベータ内で 37°Cにて 2週間培養後、 出現したコロニーをレクチン耐性 CH0/DG44細胞株として取得した。
2 . 取得したレクチン耐性 CH0/DG44細胞株の GDP-マンノース 4， 6-デヒドラターゼ mRNAの定量 前項で取得した各レクチン耐性 CH0/DG44細胞株における、 GDP-マンノースを GDP- 4-ケト , 6-デォキ シ- GDP-マンノースに変換する脱水反応を触媒する酵素である GDP-マンノース 4, 6-デヒドラターゼ の発現量を、 RT-PCR法を用いて以下の様に解析した。
( 1 ) レクチン耐性 CH0/DG44細胞株からの RNA調製と一本鎖 cDNAの調製
親株である CH0/DG44細胞、および本実施例の 1項で取得した各レクチン耐性 CH0/DG44細胞株それぞ れ 1 X 107細胞より、 RNeasy Protect Mini kit (キアゲン社製）を用いて、 添付の使用説明書に従って RNAを調製した。 続いて、 SUPER SCRIPT First-Strand synthesis system for RT-PCR (インビトロ ジェン社製） を用い、 添付の使用説明書に従って各 RNA5〃gより 20AdLの反応液中にて一本鎖 cDNAを 合成した。
( 2 ) RT- PCR法を用 ヽた ?-ァクチン遺伝子の発現量解析
本項の（ 1 )で作製した各細胞株由来の一本鎖 cDNAの品質を確かめる目的で、 ? -ァクチン cDNAが PCR 法によって増幅されるかを、 以下の様に検討した。
本項の（1 )で作製した各細胞株由来の一本鎖 cDNA 0.5 Lを踌型として含む 20〃Lの反応液 [l x EX Taq Buffer (宝酒造社製）、 0.2mMの dNTP' s、 0.5単位の EX Taq polymerase (宝酒造社製)、 0 . 5〃M の配列番号 32と 33の合成オリゴ DNAプライヤー]を調製し、 DNAサーマルサイクラ一 480 (パーキンェ ルマ一社製） を用いて、 94°Cにて 5分間加熱した後、 94°Cにて 1分間、 68°Cにて 2分間のサイクルを 14 サイクル行なった。上記の該 PCR反応液 10 Lをァガロース電気泳動した後、 サイバーグリーン（BMA 社製） を用いて DNA断片を染色し、 予想される約 800bpの DNA断片量を Fluor Imager SI (モレキユラ —ダイナミクス社製） を用いて鄉定した。 その結果、 調製したいずれの細胞株由来の一本鎖 cDNAを 用いても、 同程度の 3-ァクチンの発現を検出することができた。 -
( 3 ) RT- PCR法を用いた GDP-マンノース 4 , 6-デヒドラターゼ遺伝子の発現量解析
次に、 本項（1 )で取得したそれぞれのレクチン耐性 CH0/DG44細胞株の GDP-マンノース 4， 6-デヒド ラターゼ遺伝子の発現量解析を行った。 GDP-マンノース 4 , 6-デヒドラタ一ゼ遺伝子の cDNAを PCR法 によって増幅するために、 配列番号 38で示される CH0細胞由来の GDP-マンノース 4, 6-デヒドラ夕一 ゼの cDNA配列より、 配列番号 34で示される塩基配列を有する 26merの合成オリゴ DNAプライマーと、 配列番号 35で示される塩基配列を有する 28merの合成オリゴ DNAプライマーを作製した。 続いて、 本 項（1 )で作製した各細胞株由来の一本鎖 cDNA 0.5 Lを錶型として含む 20 /Lの反応液 [l xEX Taq Buffer (宝酒造社製）、 0.2mMの dNTP mixture、 0 . 5単位の Ex Taq polymerase (宝酒； 社製）、 Ο . δ, Μ の配列番号 34と 35の合成 DNAプライマー]を調製し、 DNAサーマルサイクラ一 480 (パーキンエルマ一 社製） を用いて、 94°Cにて 5分間加熱した後、 94°Cにて 1分間、 68°Cにて 2分間のサイクルを 30サイク ル行なった。 上記の該 PCR反応液 10〃Lをァガロース電気泳動した後、 サイバーグリーン （BMA社製） を用いて DNA断片を染色し、 予想される約 430bpの DNA断片量を Fluor Imager SI (モレキュラーダイ ナミクス社製） を用いて測定した。 その結果、 取得したレクチン耐性 CH0/DG44細胞株の中に、 GDP- マンノース 4 , 6-デヒドラ夕ーゼ遺伝子の発現が観察されない細胞株が存在することを確認した。こ の GDP-マンノース 4，6-デヒドラ夕一ゼ遗伝子の発現が観察されない株を CH0 SM株と名付けた。なお 、 取得した CH0 SM株の各種レクチンに対する耐性を調べたところ、 CH0 SM株は、 LCAが認識する糖鎖 構造と同じ糖鎖構造を認識するレクチン、 すなわち、 N-グリコシド結合糖鎖還元末端の N-ァセチル ダルコサミン残基の 6位とフコースの 1位が α結合で付加された糖鎖構造を認識する他のレクチン に対しても耐性を示した。 具体的には、 終濃度 lmg/mLのエンドゥマメレクチン （Pisum sativum Agglutinin；以下、 PSAと表記、 Vector社製） が添加された培地、 あるいは終濃度 のヒイロチ ャワンタケレクチン （Aleuria aurantia Lectin；以下、 AALと表記、 Vector社製） が添加された培 地でも W生を有していた。
3 . GDP-マンノースを GDP- 4-ケト， 6-デォキシ- GDP-マンノースに変換する脱水反応を触媒する酵素 の遺伝子が発現していない細胞株のゲノム解析
CH0/D(}44細胞、 および前項で取得した CH0 SM株を IMDM- FBS ( IO )- HT( 1 )培地を用いて接着細胞培養 用 T75フラスコ （グライナ一社製） でコンフルェントに到達する直前まで培養した後、 文献 [ヌクレ イツク ·ァシヅド · リサーチ (Nuccleic Acid Research) , 3 , 2303 , ( 1976 ) ]に記載の方法従ってゲ ノム DNAを調製し、取得したゲノム DNAを TE-RNase緩衝液（pH8 .0) [ 10mmol/l Tris-HCl, 1腿 ol/l EDTA 、 200 g/ml RNase A] 300〃1にー晚溶解させた。 上記で調製したゲノム DNA 12 gを、 3種の異な る制限酵素、 EcoRI (宝酒造社製)、 Hindi II (宝酒造社製)、 Bglll (宝酒造社製） でそれぞれ消化し 、ェ夕ノール沈殿法を用いて DNA断片を回収した後、 TE緩衝液（pH8 . 0) [ 10腿 ol八 Tris- HC1、 lmmol/1 EDTA ] 20〃 1に溶解し、 0 .8% ( w/v ) 'ァガロースゲル電気泳動に供した。 泳動後、 文献 [プロシーディ ングス ·ォブ ·ザ ·ナショナル ·アカデミー'ォブ'サイエンス（Pro Natl , Acad. Sci . USA) , 76 , 3683 , ( 1979.) ]に記載の方法に従い、 ナイロン膜へゲノム DNAを転写した。 転写終了後、 ナイロン膜 に対して 80°Cで 2時間の熱処理を行った。 次に、 ナイロンメンブレンに転写されたゲノム DNAの品質 を確認する目的で、 細胞株を問わずゲノム中に均等に存在すると考えられる 1， 6-フコシルトラン スフエラーゼ （FUT8) 遺伝子をプローブとしたサザンハイブリダィゼーシヨンを行った。 FUT8遺伝 子を検出するためのプローブは以下のように調製した。 まず、 WO02/31140の実施例 11に記載のマウ ス FUT8 cDNAを含むプラスミド mfFUT8- pCR2. 1 を の M buffer (宝酒造社製） に溶解し、 制限酵素 HiMIII (宝酒造社製） で一晩消化した後、 反応液を H buffer (宝酒造社製） に置換し、 制 限酵素 EcoRI (宝酒造社製） でさらに一晩消化反応を行った。 反応終了後、 該反応液を 2%ァガロー ス電気泳動に供し、 FUT8遺伝子ェクソン 2を含む 156bpの EcoRI- Hindlll断片を精製した。得られた DNA 断片 25ngに対し、 [ a- 2P]dCTP 1 .75MBqおよび Megaprime DNA labeling system, dCTP (アマシャ ムバイオサイエンス社製） を用いて放射標識した。 次に、 ハイブリダィゼ一シヨンを以下のように 行った。 まず、 上記ナイロン膜をローラーボトルへ封入し、 ハイブリダィゼーシヨン液 [4 X SSPE、 5 xDenhaldt' s液、 0. 5%(w/v)SDS、 0. lmg/mLサケ精子 DNA] 15mLを加えて 65°Cで 3時間のプレハイブ リダィゼーションを行った。 次に32 P標識したプローブ DNAを熱変性してボトルへ投入し、 65°Cで一 B免加温した。 ハイブリダィゼーシヨン後、 ナイロン膜を 2 x SSC-0. 1%(w/v) SDS 50mLに浸漬し、 65 。(で 15分間加温した。 上記の洗浄操作を 2回繰り返した後、 膜を0.2 33( -0. 1% ） SDS 50mLに浸 漬し、 65°Cで 15分間加温した。 洗浄後、 ナイロン膜を X線フィルムへ- 80°Cでニ晚暴露し現像した。 現像後、ナイロン膜をストリッピング液 [ 1%SDS、 O . l x SSC]中で煮沸するこ.とにより、 プローブを 剥離させ、 再度異なるプローブでのハイブリダイゼ一ションに供することとした。 上記の方法によ り、 CH0/DG44株および CH0 SM株いずれのゲノム DNAにおいても、 FUT8遺伝子ェクソン 2に特異的な断 片が検出された。 以上の結果よりナイロン膜上に転写された CH0 SM株および CH0/DG44株由来のゲノ ム DNAは等しい品質を有していることが示された。
一方、 GMD 伝子ェクソン 5に特異的なプローブを以下のように調製した。 まず、 公知であるヒト GMD ゲノム DNA配列（NCBI ァクセッション番号 NT_034880) を基に、 ェクソン 5 に特異的に結合する オリゴ DNAプライマ一（配列番号 36および配列番号 37) を設計した。該領域は配列番号 39に記載のヒ ト GMD cDNA配列の塩基番号 346から塩基番号 538に相当する。 次に、 WO02/31140の実施例 15に記載の プラスミド pAGE249GMDを 10ng含む lOO^dLの反応液 [ExTaq buffer (宝酒造社製)、 0.2腿 οΙ/L· dNTPs、 2. 5 zmol/L上記遺伝子特異的プライマー （配列番号 36および配列番号 37) ]を調製し、 ポリメラー ゼ連鎖反応 （PCR) を行った。 PCRは、 94°Cで 5分間の加熱の後、 94°Cで 1分間、 58°Cで 2分間、 72°Cで 3分間からなる反応を 1サイクルとした 30サイクルの条件で行った。 PCR後、 反応液を 2%ァガロース 電気泳動に供し、約 200bpの DNA断片を精製した。得られた DNA断片 25ngに対し、 [ a-32P]dCTP 1 , 75MBq および Megaprime DNA labeling- system, dCTP (アマシャムバイオサイエンス社製) を用いて放射 標識した。 該プローブを上記で示したナイロン膜に対してハイブリダィゼーシヨンを行った。 その 結果、 CH0/DG44細胞由来のゲノム DNAでは GMD遺伝子ェクソン 5の特異的断片が見出されたのに対し、 CHO SM株由来のゲノム DNAにおいては GMD遺伝子ェクソン 5の特異的断片が全く検出されなかった。以 上の結果から CHO SM株は GMDをコードするゲノム領域の ち、 少なくともェクソン 5を含む領域を欠 損した GMDノヅクァゥト細胞であることが示された。
実施例 8 CHO SM株による遺伝子組換えアンチトロンビン IIIの発現
1 . CHO SM株への ΑΤΙΠ発現プラスミドの ¾入
実施例 7で作製された CHO SM株に、 実施例 2第 3項で作製したプラスミド pKAN- ΑΤΠΙを安定的 に導入した。 これら φ遺伝子導入は公知のエレクト口ポレーシヨン法 [サイ トテクノロジー (Cytotechnology) , 3 , 133 (1990 ) ] により以下の手順で行った。 まず、 プラスミド pKAN - ATIII30 〃gを NEBuffer 3 (New England Biolabs社製） 20 Lと 100単位の制限酵素 MluI (New England Biolabs 社製） を含む 200 /Lの反応液を調製し、 37°Cで 16時間消化反応を行うことにより線状化した。 反 応後、 該反応液に対しフエノール/クロ口ホルム抽出処理およびエタ-ノール沈殿により精製を行い、 線状化プラスミドを回収した。次に、実施例 7で取得した CH0 SM株を K- PBS緩衝液（137mmol/L KCl、 2.7mmol/L NaCl、 8.1mmol/L Na2HP04、 1.5mm。l/L K¾P04、 4.0腿 ol/L MgCl2 ) に懸濁して 8 x l07細胞 /mLとした。 細胞懸濁液 200〃L (1. 6 X 106個） と上記の線状化プラスミド 9〃g を混和した後、 細 胞 -DNA混和液の全量を Gene Pulser Cuvette (電極間距離 2腿） （BIO- RAD社製)へ移し、 エレクト口 ポレーシヨン装置 Gene Pulser (BIO- RAD,社製） を用いてパルス電圧 350V、 電気容量 250 Fの条件 で遺伝子導入を行った。 遺伝子導入を行ったのち、 細胞懸濁液を 10 % ゥシ胎児血清 （Life Technologies社製）および 50 /g/mL ジェンタマイシン （ナカライテスク社製） を添加した IMDM培 地 (Life Technologies社製） 30mLに懸濁し、 接着細胞培養 96ゥエルプレート（グライナ一社製） 3枚 へ lOO zL/ゥエルで播種した。 培養は 5%C02、 37°Cの条件下で行った。
2 . MTX耐性株の取得 '
前項で得た ρ Ν-ΑΤΠΙ導入細胞を 6日間培養した後、培養上清を除去し、 10%透析ゥシ胎児血清、 50 g/mL ジェンタマイシンおよび 50nM MTX (シグマ社製）を添加した IMDM培地を lOO^L/ゥエルず つ添加した。 この培地交換作業を 3~4日毎に繰り返しながら 9日間の培養を行った。次いで、 10% 透析ゥシ胎児血清、 50 g/mL gentamicinおよび 200nMの MTXを添加した IMDM培地を用いた培地交 換作業を同様に 3〜4日毎に繰り返しながら 18日間培養し、最終的に形成されたコロニーを 24ゥェ ルプレート（グライナ一社製）に植え替えた。 さらに、 10%透析ゥシ胎児血清、 50 g/mL gentamicin および 500nMの MTXを添加した IMDM培地を用いた培地交換作業を 3~4日 に繰り返し、 適宜摅大 しながら 19日間培養を行い、 500nM MTX耐性株を取得した。
3 . アンチトロンビン III高生産株の選別
前項で取得した複数の 500nM MTX B性株より、各 1 .0 X 106細胞を 5mLの 10%透析ゥシ胎児血清、 50 g/mL gentamicinおよび 500nMの MTXを添加した IMDM培地に懸濁し、 T25フラスコへ播種して 培養を行った。 培養 3 日後に培養上清を回収し、 上清中に含まれる ΑΤΠΙ 量を ELISA for antit rombin(ATIII ) kit(Affinity Biological社製）を用いて測定した。 その結果、 培養上清中に 513ng/mLの濃度で遺伝子組換えヒトアンチトロンビン IIIが発現していることを確認し、 この形質 転換株を pKAN-ATIIIl GMDK0株と名付けた。
以下、 実施例 4に記載した方法で、 還元末端の N-ァセチルグルコサミンにフコースが結合してい ない糖鎖を有する遺伝子組換えアンチトロンビン IIIを取得した。さらに、実施例 5に記載した方法 により該アンチトロンビン IIIの生物活性を測定し、 GMDノックアウト細胞で発現させた遺伝子組換 えアンチトロンビンは、 CH0/DG44細胞で発現させた遺伝子組換えアンチトロンビン IIIに比較してへ パリン解離定数が有意に小さく、 へパリンコフアクター活性とトロンビン阻害二次速度定数が有意 に高いことを確認した。
実施例 9 CHO SM株によるアミノ酸改変した遺伝子組換えァンチトロンビン IIIの発現
1 . CHO SM株への ATIIIN135Q発現プラスミドの導入 '
実施例 7で作製した CHO SM株に、 ¾gS例 6第 2項で作製したプラスミド PKAN-ATIIIN135Qを導 入した。 これらの遺伝子導入は公知のエレク ト口ポレーシヨン法 [サイ トテクノロジー (Cytotechnology) , 3, 133 (1990 ) ] により以下の手順で行った。まず、 プラスミド KAN-ATIIIN135Q 30 z を NEBuffer 3 (New England Biolabs社製） 20〃1 と 100単位の制限酵素 M (New England Biolabs社製） を含む 200〃1の反応液を調製し、 37°Cで 16時間消化反応を行うことにより線状化 した。反応後、該反応液に対しフヱノール/クロ口ホルム抽出処理およびエタノール沈殿により精製 を行い、線状化ブラスミドを回収した。次に、実施例 7で取得した CHO SM株を K- PBS緩衝液（ 137mmol/l KC1、 2.7mmol/l NaCl, 8. lmmol/1 Na2HP04、 1.5腿 ol/l K¾P04、 4.0匪 ol/l MgCl2) に懸濁して 8 x l07 細胞/ mlとした。細胞懸濁液 (1. 6 X 106個） と上記の線状化プラスミド 9〃g を混和した後、 細胞- DNA混和液の全量を Gene Pulser Cuvette (電極間距鳞 2mm) (BI0-RAD社製)へ移し、 エレクト 口ポレーシヨン装置 Gene Pulser (BIO- MD社製） を用いてパルス電圧 350V、 電気容量 250 Fの条 件で遺伝子導入を行った。 遺伝子導入を行ったのち、 細胞懸^液を 10 % ゥシ胎児血清 （Life Technologies社製）および 50 g/ml gentamicin (ナカライテスク社製) を添加した IMDM培地（Life Technologies ¾ )30mLに懸濁し、 接着細胞培養 96ゥエルプレート（グライナ一社製） 3枚へ 100 / 1/ゥエルで播種した。 培養は 5%C02、 37°Cの条件下で行った。
2 . MTX耐性株の取得
前項で得た pKAN- ATIIIN135Q導入細胞を 6日間培養した後、 培養上清を除去し、 10%透析ゥシ胎 児血清、 50 g/ml ジェンタマイシンおよび 50nM MTX (シグマ社製）を添加した IMDM培地を 100〃L/ ゥエルずつ添加した。この培地交換作業を 3〜4日毎に繰り返しながら 9日間の培養を行った。次い で、' 10%透析ゥシ胎児血清、 50〃g/ml ジェンタマイシンおよび 20dnMの MTXを添加した IMDM培地 を用いた培地交換作業を同様に 3〜4日毎に繰り返しながら 18日間培養し、 最終的に形成されたコ ロニーを 24 ゥエルプレート（グライナ一社製）に植え替えた。 さらに、 10%透析ゥシ胎児血清、 50 ^ff/ml ジヱン夕マイシンおよび 500nMの MTXを添加した IMDM培地を用いた培地交換作業を 3~4 日毎に繰り返し、 適宜拡大しながら 19日間培養を行い、 500nM MTX耐性株を取得した。
3 . ATIIIN135Q高生産株の選別
前項で取得した複数の 500nM MTX耐性株より、各 1.0 X 106細胞を 5mLの 10%透析ゥシ胎児血清、 50〃g/ml ジェン夕マイシンおよび 500nMの MTXを添加した IMDM培地に懸濁し、 T25フラスコへ播 種して培養を行った。培養 3日後に培養上清を回収し、上清中に含まれる ATIIIN135Q量を ELISA for antithrombin(ATIII ) kit(Affinity Biological社製）を用いて測定し、 高生産株を樹立した。 方法 は添付マニュアルに従い、 標準品にはノィアート（三菱ゥエルファ一マ社製）を用いた。 その結果、 得られたアンチトロンビン III発現株の培養上清中に 45. ng/mLの濃度でアンチトロンビン IIIが 発現していることを確認し、 この形質転換株を pKAN- ATIIIN135Q6 GMDK0株を名付けた。 ■ 以下、実施例 4に記載した方法で、還元末端の N-ァセチルダルコサミンにフコースが結合してい ない糖鎖を有する変異型の遺伝子組換えアンチトロンビン IIIを取得し、 N結合型糖鎖の本数が 3 本であることを確認した。 さらに、 実施例 5に記載した方法で該アンチトロンビン IIIの生物活性 を測定し、 GMDK0細胞で発現させた変異型の遺伝子組換えアンチトロンビン' IIIは、 CH0/DG44細胞 で発現させた変異型の遺伝子組換えアンチト口ンビン IIIに比較してへパリン解離定数が有意に小 さく、 へパリンコファクタ一活性とトロンビン阻害二次速度定数が有意に高いことを確認した。 実施例 1 0 . 酵母による遺伝子組換えアンチトロンビン II Iの発現
酵母には多くの種類が知られて'いるが、 組換え蛋白質を発現させる宿主としてしばしば用いられ る代表的な酵母として、 ピキア (Pichia~) 属とサヅカロマイセス Saccaromyces) 属の酵母が挙げ られる。 通常、 これらの酵母が発現する組換え蛋白質に付加される N-結合型糖鎖の主要な構造は、 還元末端側のコア部分に I残基の N-ァセチルグルコサミンを有し、非還元末端側の分岐部分に 9個 から数十個のマンノース残基と、 数個から十数個のマンノース 6-リン酸残基を有する、 ハイマンノ —ス型糖鎖であることが知られている （]¾35έ ϋ, 1191 ( 2002 ))。 また、 このような構造を有する ハイマンノ一ス型糖鎖は、 しばしばハイパーマンノ一ス型糖鎖とも呼ばれる。
以下に記載する実 Jfe例ではまず、 主に付加される N-結合型糖鎖の構造として、 ハイマンノース型 糖鎖と複合型糖鎖の中間の構造である、 ハイプリヅド型糖鎖が主に付加されたアンチトロンビン IIIを発現するピキア酵母株とサッカロマイセス酵母株の作製方法について記載する。
1 . ゲノム上に存在する PN01酵素遺伝子を破壊したピキア酵母株の作製
ピキア酵母株、 たとえば Pichia past oris GTS115株 （インビトロジェン社製） などのゲノム DNA を錶型と し、 PCR 法に.よって、 ピキア酵母の PN01 (phosphomannosylation of N-linked' oligosaccharides 1 )遺伝子 (GenBankァクセッションナンバー： AB099514) の翻訳領域全長の配列 を増幅させる。 増幅させた約 3200塩基長の PN01遺伝子配列は、 その 5 ' 末端側半分の配列を、 酵 母由来の orotidine-5 ' - phosphate decarboxylase (腿 3) 遺伝子 (GenBankァクセッションナンノ、、 一： AF321098) に置換した後、 pCR2. 1-T0P0ベクター （インビトロジェン社製） などのベクタ一に 揷入することにより、 PN01 遺伝子破壊用のプラスミドを作製する。 次に、 このプラスミド を制限酵素で線状化した後、 Pichia Expression Kit (インビトロジ ン社製） 記載のェレクトロポ レ一シヨン法によって、 たとえば GTS115株などのピキア酵母に安定的に遺伝子導入を行う。 次に、 遺伝子導入した酵母を、 ゥラシルを欠損させた YPD培地 （インビトロジェン社製） を用いて室温に て培養し、 増殖してきた各コロニーからゲノム DNAを抽出する。 次に、 このゲノム DNAを铸型とし た PCH法によって、 酵母 PN01遺伝子座の配列を増幅させることにより、 相同組換えによって PN01 遺伝子座が破壊された酵母クローンを選択する。 上記の方法により、 ピキア酵母が発現する主要な N-結合型糖鎖の構造を、 還元末端側のコア部分に 2残基の N-ァセチルダルコサミンを有し、 非還元 末端側に 9個から数十個のマンノース'残基が結合した構造を有したハイマンノース型糖鎖に改変す ることができる。
2 . ゲノム上に存在する α- 1 , 6-マンノース転移酵素遺伝子を破壊したピキア酵母株の作製
ピキア酵母株、 たとえば Pichia pastoris X-33株 （インビトロジヱン社製） などのゲノム DNA を錶型とし、 PCR法によって、 ピキア酵母の α- 1 , 6-マンノース転移酵素 （0CH 1 ) 遺伝子 （GenBank ァクセッションナンバー： AF540063) を増幅させる。 増幅させた約 2800塩基長の 0CH1遺伝子配列 は、 その 5， 末端側半分の配列を、 酵母由来の oroUdine-5に phosphate decarboxylase (URA3) 遺 伝子 （GenBankァクセッションナンバー： AF321098) に置換した後、 pCR2 . 1- TOP0ベクター （インビ トロジェン社製）などのべクターに挿入することにより、 0CH1遺伝子破壊用べク夕一が作製される。 次に、 このベクター lOO zgを制限酵素 I (ニューイングランドパイオラブズ社製） で糸泉状化し た後、 Pichia Expression Kit (インビトロジェン社製）記載のェレクト口ポレーシヨン法によって、 ピキア酵母株、例えば前項に記載した PN01遺伝子破壊株や、 Pichia pastoris JCm株などに対し、 安定的な遺伝子導入を行う。 次に、 遺伝子導入した酵母を、 ゥラシルを欠損させた YPD培地 （イン ビトロジェン社製）を用いて室温にて培養し、増殖してきた各コ口ニーからゲノム DNAを抽出する。 次に、 このゲノム DNAを錄型とした PCR法によって、酵母 0CH1遺伝子座の配列を増幅さ^ることに より、相同組換えによって 0CH1遺伝子座が破壊された酵母ク口一ン株を選択する。上記の方法によ り、 ピキア酵母が発現する主要な N-結合型糖鎖の構造を、還元末端側のコア部分に 2残基の N-ァセ チルグルコサミンを有し、非還元末端側に 8個のマンノース残基が結合した構造を有した Man8型ハ イマンノ一ス型糖鎖に改変することができる。
3 . 組換えキヌラ型 - 1 , 2 -マンノシダーゼ遺伝子を導入したピキア酵母株の作製
線虫 Caenorhabditis elegans) から RNeasy Mini Kit (キアゲン社製） を用.いて全 RNAを抽出 し、 次にこの RNAを铸型として Superscript™ first-strand cDNA synthesis kit (ィン.ビトロジェ ン社製） を用いて first- strand cDNAを調製する。次に、 この cDNAを錶型とし、 特異的プライマー と K0Dポリメラーゼ（東洋紡績社製） を用いた PCRを行うことにより、線虫 or- 1 , 2-マンノシダーゼ (GenBankァクセッションナンバー : 'NM_073594) の活性ドメインをコードする cDNAを特異的に増 幅させる。増幅させた cDNAは、その 5， 末端側に、酵母の orマンノシダーゼ（MNS1)遺伝子（GenBank ァクセッションナンバー： M63598)のリーダーペプチドをコードする cDNA配列を連結した後に、酵 母用め発現ベクター pPICZ (インビトロジェン社製）などのベクターに揷入し、酵母の小胞体内に α -1 , 2-マンノシダーゼを発現させるベクターを作製する。次にこのベクターを、前項に記載した PN01 遺伝子と 0CH1遺伝子の両方の遺伝子を相同組換えで破壊したピキア酵母株に対し、エレクトロポレ ーシヨン法により安定的に導入する。 遺伝子導入後の酵母は、 ゥラシルを欠損しゼォシン （インビ トロジヱン社製） を含有する YPD培地 （インビトロジヱン社製） で室温にて培養し、 増殖してきた 各コロニーから全 RNAを抽出する。 次に、 この全 RNAから調製した' f irst- strand cDNAを铸型とし た PCR法によつて、組換えキヌラ型 α-l， 2-マンノシダーゼの発現が認められた酵母クローン株を選 択する。上記の方法により、 ピキア酵母が発現する主要な Ν-結合型糖鎖の構造を、 還元末端側のコ ァ部分に 2残基の Ν-ァセチルグルコサミンを有し、非還元末端側に 5個のマンノース残基が結合し . た構造を有した Man5型ハイマンノース型糖鎖に改変できる。
4 . 組換え UDP- N-ァセチルグルコサミントランスポーター遺伝子を導入したピキア酵母株の作製 酵母 (Jlwvejromyces lactis から RNeasy Mini K (キアゲン社製） を用いて全 RNAを抽出し、 次にこの RNAを錶型として Superscript™ f i rst-strand cDNA synthesis kit (インビトロジェン社 製） を用いて cDNAを調製する。 次に、 この cDNAを铸型とし、 特異的プライマーと K0Dポリメラー ゼ （東洋紡績社製） を用いた PCRを行うことにより、 酵 S UDP- N-ァセチルグルコサミントランスポ 一夕一の翻訳領域全長をコードする cDNA (GenBankァクセヅシヨンナンバー： AF106080) を特異的 に増幅させる。 次に、 増幅させた約 3700塩基長の cDNAを、 酵母用の発現ベクター pPIC3 . 5K (イン ビトロジェン社製） などのベクターのアルコールォキシゲナーゼプロモー夕一配列の下流に位置す る制限酵素 coR I切断部位と Λ¾ί I切断部位の間に挿入し、 酵母のゴルジ体内に UDP- Ν-ァセチル グルコサミントランスポーターを発現させるベクターを作製する。 次にこのベクターを、 前項に記 載した、 《-1 , 2-マンノシダ一ゼ遺伝子を導入したピキア酵母株に対し、エレクト口ポレーシヨン法 により安定的に導入する。遺伝子導入後の酵母は、薬剤 G418 (ナカライテスク社製）を含有する YPD 培地で室温にて培養し、 増殖してきた各コロニーから全 RNAを抽出する。 次に、 この全 RNAから調 製した CDNAを錶型とした PCR法によって、 組換え UDP-N-ァセチルダルコサミントランスポーター の発現が認められた酵母クローン株を選択する。
5 . 組換えキメラ型 N-ァセチルグルコサミン転移酵素- 1遺伝子を導入したピキア酵母株の作製 ヒト肝臓 cDNA (クロンテック社製） を錶型とし、 特異的プライマーと K0Dポリメラーゼ （東洋紡 績社製） を用いた PCRを行うことにより、 N-ァセチルグルコサミン転移酵素- 1 (GenBankァクセヅ シヨンナンパ一： M55621) の活性ドメインをコードする cDNA を特異的に増幅させる。 増幅させた cDNAは、 その 5， 末端側に、 酵母のマンノース転移酵素 （MNN9) 遺伝子 （GenBankァクセッション ナンバー： L23752)のリーダ一ペプチドをコードする cDNA配列を連結した後に、酵母用の発現べク 夕一 PAUR123 (夕カラバイオ社製）,などのベクターのアルコールデヒドロゲナーゼプロモー 一配列 の下流に位置する制限酵素 Kpn I切断部位と Xba I切断部位の間に挿入し、 酵母のゴルジ体内に N- ァセチルグルコサミン転移酵素- 1を発現させるベクターを作製する。次にこのベクターを、 前項に 記載した、 UDP-N-ァセチルダルコサミントランスポー夕一遺伝子を導入したピキア酵母株に対し、 発現ベクター PAUR123 に添付のマニュアルに掲載された酢酸リチウム法により導入する。 遺伝子導 入後の酵母は、 薬剤ォ一ロブラシジン A (夕カラパイォ社製） を含有する YPD培地で室温にて培養 し、増殖してきた各コロニーから全 RNAを抽出する。次に、 この全 RNAから調製した cDNAを鐯型と した PCR法 feよって、組換え N-ァセチルグルコサミン転移酵素- 1の発現が認められた酵母クローシ 株を選択する。上記の方法により、 ピキア酵母が発現する主要な N-結合型糖鎖の構造を、 還元末端' 側のコア部分に 2残基の N-ァセチルグルコサミンを有し、非還元末端側に 5個のマンノース残基が 結合した Man5型ハイマンノース型糖鎖の非還元末端側に、 N-ァセチルダルコサミン残基が 1個付加 された構造を有する、 ハイプリヅド型糖鎖に改変することができる。
以上、 N-結合型糖鎖として、 ノ、ィマンノース型糖鎖と複合型糖鎖の中間の構造である、 ハイプリ ヅド型糖鎖を主要に発現するピキア酵母株の作製方法について記載 た。上述のピキア酵母以外に、 組換え蛋白質を発現させる宿主としてしばしば用いられる酵母として、'サヅカロマイセス (Saccharoayces)属の酵母が挙げられる。以下、 N-結合型糖鎖としてハイプリヅド型糖鎖を主要に 発現するサヅカロマイセス酵母株の作製方法について述べる。
6 . ゲノム上に存在する - 1 , 6-マンノース転^酵素遺伝子とひ- 1 , 3-マンノース転移酵素遺伝子を 破壊したサヅカロマイセス酵母株の作製
Nakayamaらの方法 (EMBO Journal , 11 , 2511 ( 1992 ) ) に従い、 相同組換えによって 0CH1遺伝子 座が破壊された酵母ク口一ンを選択する。得られた 0CH1遺伝子が破壊されたサヅカロマイセス酵母 株は、 Shermanらの方法 （メソヅズ 'イン ·ェンザィモロジ一 194 , 21 ( 1991 ) ) に従い、 半数体細 胞を誘導した後、 α - 1 , 3-マンノース転移酵素 （丽 N1) 遺伝子が破壊された変異酵母株 LB1- 10B (力 リフォルニァ大学 Yeast Genetic Stock Center) の半数体細胞と混合し、 窒素欠乏条件で培養する ことにより、 二倍体の接合子を形成させる。 次に、 得られた接合子を、 ゥラシルとロイシンを欠損 させた YPD培地で室温にて培養し、 増殖してきた各コロニーからゲノム DNAを抽出する。 次に、 こ のゲノム DNAを鎵型とした PCR法によって、 酵母 0CH1遺伝子座の配列（GenBankァクセヅシヨンナ ンバー： AF540063) と、 MNN1遺伝子座の配列 （GenBankァクセッションナンバー： AF540063L23753) をそれそれ増幅させることにより、 0CH1遺伝子座と MNN1遺伝子座の両方が破壊された酵母クロー ン株を選択する。上記の方法により、 サッカロマイセス酵母が発現する主要な N-結合型糖鎖の構造 を、還元末端側のコア部分に 2残基の N-ァセチルグルコサミンを有し、 非還元末端側に 8個のマン ノース残基が結合した構造を有する、 Man8型ハイマンノース型糖鎖に改変できる。
7 . 組換えキメラ型な- 1 , 2-マンノシダーゼ遺伝子を導入したサヅカロマイセス酵母株の作製 カビ (Aspergillus sai toi) から RNeasy Mini Kit (キアゲン社製） を用いて全 RNAを抽出し、 次にこの RNAを銪型として Superscript™ first-strand cDNA synthesis kit (インビトロジェン社 製） を用いて cDNAを調製する。 次に、 この, cDNAを錶型とし、 特異的プライマーと K0Dポリメラー ゼ（東洋紡績社製） を用いた PCRを行うことにより、 力ビな- 1 , 2-マンノシダーゼの翻訳領域全長を コードする cDNA (GenBankァクセッションナンバー： M9827) を特異的に増幅させる。 増幅させた 約 1500塩基長の cD皿は、 その翻訳終止コドンを削除した 3 ' 末端側に、 酵母 ©小胞体局在シグナ ルペプチド （ェンボジャーナル 7 , 913 (1988 ) )、 すなわちヒスチジン一ァスパラギン酸ーグル夕ミ ン酸一口イシンをコードする cDNA配列と翻訳終止コドンを連結した後に、 酵母用の発現ベクター pPICZ (インビトロジェン社製） などのベクターに揷入し、 酵母の小胞体内に α- 1 , 2-マンノシダ一 ゼを発現させるベクターを作製する。次にこのベクターを、前項に記載した、 α-1 , 6-マンノース転 移酵素遺伝子と 1 , 3-マンノース転移酵素遺伝子を破壊したサヅ力ロマイセス酵母株に対し、エレ クトロポレーシヨン法により安定的に導入する。 遺伝子導入後の酵母は、 ゥラシルを欠損しゼオシ ン （インビトロジェン社製） を含有する YPD培地 （インビトロジヱン社製） で室温にて培養し、 増 殖してきた各コロニーから全 RNAを抽出する。 次に、 この全 RNAから調製した cDNAを錶型とした PCR法によって、組換えキヌラ型《-1 , 2-マンノシダーゼの発現が認められた酵母ク口一ン株を選択 する。上記の方法により、 サヅカロマイセス酵母が発現する主要な N-結合型糖鎖の構造を、 還元末 端側のコア部分に 2残基の N-ァセチルダルコサミンを有し、非還元末端側に 5個のマンノース残基 が結合した構造を有する、 Man5型ハイマンノース型糖鎖に改変することができる。
8 .組換え UDP-N-ァセチルグルコサミントランスポーター遺伝子を導入したサヅカロマイセス酵母 株の作製 '
母 VHuyveroinyces lactis) から RNeasy Mini Kit (キアゲン社製） を用いて全 RNAを抽出し、 次にこの RNAを錶型として Superscript™ first-strand cDNA synthesis kit (インビトロジェン社 製） を用いて cDNAを調製する。 次に、 この cDNAを錶型とし、 特異的プライマーと K0Dポリメラー ゼ （東洋紡績社製） を用いた. PCRを行うことにより、 酵母 UDP-N-ァセチルダルコサミントランスポ 一夕一の翻訳領域全長をコードする cDNA (GenBankァクセッションナンバー： AF106080) を特異的 に増幅させる。 次に、 増幅させた約 3700塩基長の cDNAを、 酵母用の発現べクタ一 PPIC3. 5K (イン 'ビトロジヱン社製） などのベクタ一のアルコールォキシゲナーゼプロモーター配列の下流に位置す る制限酵素 ^oR I切断部位と Λ¾ί I切断部位の間に挿入し、 酵母のゴルジ体内に UDP-N-ァセチル ダルコサミン ランスポーターを発現させるベクタ一を作製する。 次にこのベクターを、 前項に記 載した、 - 1 , 2-マンノシダーゼ遺伝子を導入したサヅカロマイセス酵母株に対し、エレクトロポレ ーシヨン法により安定的に導入する。遺伝子導入後の酵母は、 薬剤 (M18 (ナカライテスク社製） を 含有する YPD培地で室温にて培養し、 増殖してきた各コロニーから全 RNAを抽出する。 次に、 この 全 Aから調製した cDNAを銪型とした PCR法によって、 組換え UDP-N-ァセチルグルコサミントラ ンスポーターの発現が認められた酵母クローン株を選択する。
9 .組換えキメラ型 N-ァセチルグルコサミン転移酵素- 1遺伝子を導入したサヅカロマイセス酵母株 の作製 ， ヒト肝臓 c丽 A (クロンテヅク社製） を鎳型とし、 特異的プライマーと K0Dポリメラーゼ （東洋紡 績社製） を用いた PCR 行うことにより、 N-ァセチルダルコサミン転移酵素- 1 (GenBankァクセヅ シヨンナンパ一： M55621) の活性ドメインをコードする cDNA を特異的に増幅させる。 增幅させた cDNAは、 その 5， 末端側に、 酵母のマンノース転移酵素 （MNN9) 遺伝子 （GenBankァクセッション ナンバー： L23752)のリーダーペプチドをコードする cDNA配列を連結した後に、酵母用の発現べク 夕一 PAUR123 (夕カラバイオ社製）などのベクターのアルコールデヒドロゲナーゼプロモーター配列 の下流に位置する制限酵素 Kpn I切断部位と Xba I切断部位の間に挿入し、 酵母のゴルジ体内に N- ァセチルダルコサミン転移酵素- 1を発現させるベクターを作製する。次にこのベクターを、 前項に 記載した、 UDP-N-ァセチルグルコサミントランスポー夕一遺伝子を導入したサッカロマイセス酵母 株に対し、発現ベクター PAUR123に添付のマニュアルに掲載された酢酸リチウム法により導入する。 遺伝子導入後の酵母は、 薬剤ォ一口ブラシジン A (夕カラバイオ社製） を含有する YPD培地で室温 にて培養し、 増殖してきた各コロニーから全 RNAを抽出する。次に、 この全 RNAから調製した cDNA を銪型とした PCR法によって、組換え N-ァセチルグルコサミン転移酵素- 1の発現が認められた酵母― クローン株を選択する。上記の方法により、 サッカロマイセス酵母が発現する主要な N-結合型糖鎖 の構造を、 還元末端側のコア部分に 2残基の N-ァセチルダルコサミンを有し、 非還元末端側に 5個 のマンノース残基が結合した構造を有する Man5型ハイマンノース型糖鎖の非還元末端側に、 N-ァセ チルダルコサミン残基が 1個付加された、 ハイプリヅド型糖鎖に改変できる。
以上の通り、 N-結合型糖鎖として Man5型ハイマンノース型糖鎖の非還元末端側に N-ァセチルグ . ルコサミン残基が 1個付加された、 ハイプリッド型糖鎖を主要に発現するピキア酵母株、 あるいは サッカロマイセス酵母株の作製方法について述べた。 次に、 これらの酵母株を宿主として用い、 J - 結合型糖鎖としてハイプリヅド型糖鎖を主要に有する組換えヒトアンチトロンビン IIIの調製方法 について述べる。
1 0 . 組換えヒトアンチトロンビン I II発現ベクターの作製 '
Yamauchi らの方法 (Bioscience, Biotechnology and Biochemistry 56 , 600 ( 1992 ) ) に従 、、 ヒト肝臓, cDNA (ク口ンテヅク社製） を錡型とし、 増幅用酵素として K0Dポリメラーゼ （東洋紡績社 製）を用いた PC 反応により、成熟型ヒトアンチトロンビン IIIの全長をコードする cDNAを特異的 に增幅させる。 次に、 得られた cMAを、 酵母用の発現ベクター pPIC6 a (インビトロジェン社製） などのベクタ一のアルコールォキシゲナーゼプロモーター配列の下流に位置する制限酵素 CM 切 断部位と [切断部位の間に挿入し、成熟型ヒトアンチトロンビン II Iを分泌発現させるベクタ一 pPIC6 a /MTII Iを作製する。 '
1 1 . 組換えヒトアンチトロンビン I II遺伝子を導入した酵母株の作製
上述の成熟型ヒトアンチトロンビン IIIを分泌発現させるベクター pPIC6 a /hATI II lOO gを、 制限酵素 <¾Π (ニューイングランドバイオラブズ社製） で HIS4遺伝子内を切断し、 フエノールク ロロホルム抽出とエタノール沈殿によって、 線状化ベクターを調製する。 次に Mochizukiらの方法 {Protein Expression and Purifica tion 23 , 55 ( 2001 ) ) に従い、 この線状化したアンチトロンビ ン III発現べクタ一を、 上述の本実施例第 5項に記載した、 N-結合型糖鎖として主にハイブリッド 型糖鎖を発現するピキア酵母株、 もしくは本 ¾例集 9項に記載した、 N-結合型糖鎖として主にハ イブリツド型糖鎖を発現するサッカロマイセス酵母株に対し、 酢酸リチウム法により導入する。 遺 伝子導入後の酵母は、 薬剤プラストシジン （インビトロジェン社製） を含有する YPD培地 （ィンビ トロジェン社製） で室温にて培養し、 ブラストシジン耐性コロニーを取得する。 次に、 ブラストシ ジン耐性ュロニーを液体 YPD培地（インビトロジェン社製）に移植し、 30°Cにて 24時間以上の回分 培養を行う。 培養後に得られる培養上清は、 ヒト血漿由来アンチトロンビン III医薬品ノィアート (Ξ菱ゥエルファーマ社製） などを標準品とし、 ヒトアンチトロンビン ΙΠェライザキヅト （ァフ ィニティーパイォロジカルズ社製） を用いて分析する。 この分析により、 培養上清中に含まれる組 換えヒトアンチトロンビン IIIを検出し、 その濃度を測定することが可能である。 この酵母培養上 清中に分泌された、 N-結合型糖鎖としてフコースを含まないハイプリッド型糖鎖を有する遺伝子遺 伝子組換えアンチトロンビン III (ま、 実施例 4に記載した方法で、 精製が可能である。 また、 精製 されたアンチトロンビン III蛋白質は、 上記実施例 4に記載した方法で、 糖鎖構造の解析が可能で ある。 .
以上の通り、 N-結合型糖鎖として、 Man5型ハイマンノース型糖鎖の非還元末端側に N-ァセチルグ ルコサミン残基が 1個付加されたハイプリッド型糖鎖を主要に発現するピキア酵母株、 あるいは同 様に改変されたサヅカロマイセス酵母株を宿主として用い、 N-結合型糖鎖としてフコースを含まな いハイプリヅド型糖鎖を主要に有する組換えヒトアンチトロンビン IIIを調製できることを述 た。 次に、 この N-結合型糖鎖としてハイブリッド型糖鎖を主要に有する組換えヒトアンチトロンビン III を発現する酵母株を用いて、 N-結合型糖鎖としてフコースを含まない複合二本鎖型糖鎖を主要 に有する組換えヒトアンチトロンビン IIIを発現する酵母株を作製する方法について以下に記載す る。 · ·
1 2 . 組換えキヌラ型 マンノシダ一ゼ II遺伝子を導入した酵母株の作製
ヒト組織由来、 たとえば肝臓由来の cDNA (クロンテック社製） を铸型とし、 特異的プライマーと K0Dポリメラーゼ（東洋紡績社製） を用いた PCRを行うことにより、 αマンノシダーゼ II (GenBank ァクセッションナンバー： U31520)の活性ドメインをコードする cDNAを特異的に増幅させる。增幅 させた cDNAは、 その 5' 末端側に、 酵母のマンノース転移酵素 （M丽 9) 遺伝子 （GenBankァクセヅ シヨンナンバー： L23752)のリーダーペプチドをコードする cDNA配列を連結した後に、酵母用の発 現ベクターのプロモーター配列の下流に揷入し、酵母のゴルジ体内に αマンノシダーゼ IIを発現さ せるベクターを作製する。 次にこのベクターを、 本実施例第 1 1項に記載した、 Ν-結合型糖鎖とし てハイプリヅド型糖鎖を主要に有する組換えヒトアンチトロンビン IIIを発現する酵母株に対し、 安定的に導入する。 遺伝子導入後の酵母は、 栄養要求性と薬剤耐性を指標にしてクローンを選抜し た後、 RT- PCRによって、 キメラ型 αマンノシダーゼ IIの発現を確認する。
1 3 . 組換えキメラ型 Ν-ァセチルグルコサミン転移酵素- II遺伝子を導入した酵母株の作製
ヒト組織由来、 たとえば肝臓由来の cDNA (クロンテック社製） を铸型とし、 特異的プライマーと K0Dポリメラ一ゼ （東洋紡績社製） を用いた PCRを行うことにより、 N-ァセチルグルコサミン転移 酵素- II (GenBankァクセッションナンバー： U15128) の活性ドメインをコードする cDNAを特異的 に増幅させる。増幅させた cDNAは、 その 5' 末端側に、 酵母のマンノース転移酵素 （MN 9) 遺伝子 (GenBankァクセッションナンバー： L23752) のリーダ一ぺプチドをコードする cDNA配列を連結し た後に、 酵母用の発現ベクターのプロモーター配列の下流に挿入し、 酵母のゴルジ体内に N-ァセチ ルグルコサミン転移酵素- II を発現させるベクターを作製する。 次にこのべクタ一を、 前項に記載 した、 N-結合型糖鎖としてハイプリヅド型糖鎖を主要に有する組換えヒトアンチトロンビン IIIを 発現する酵母株にキメラ型ひマンノシダーゼ IIを安定的に導入した酵母株に対し、安定的に導入す る。遺伝子導入後の酵母は、 栄養要求性と薬剤耐性を指標にしてクローンを選抜した後、 RT- PCRに よって、 キメラ型 N-ァセチルグルコサミン転移酵素- IIの発現を確認する。 上記の方法により、 キ メラ型 N-ァセチルダルコサミン転移酵素- IIが安定的に組み込まれた酵母株が発現する遺伝子遺伝 子組換えアンチトロンビン IIIが有する主要な N-結合型糖鎖の構造を、 還元末端側のコア部分に 2 残基の N-ァセチルグルコサミンを有し、その非還元末端側に 3個のマンノース残基が二分岐する構 造で結合し、 二つの非還元末端のそれぞれに N-ァセチルグルコサミン残基が 1個ずつ付加された、 フコースを含まな ヽ複合二本鎖型糖鎖に改変できる。
1 . 組換え UDP-ガラクトーストランスポーター遺伝子を導入した酵母株の作製
ヒト組織由来、 たとえば肝臓由来の cDNA (クロンテック社製） を銪型とし、 特異的プライマーと K0Dポリメラーゼ （東洋紡績社製） を用いた PCRを行うことにより、 UDP-ガラクトーストランスポ 一夕一（GenBankァクセッションナンバー： AB042425) の翻訳領域全長をコードする cDNAを特異的 に増幅させる。増幅させた cDNAは、酵母用の発現ベクターのプロモーター配列の下流に揷入し、酵 母のゴルジ体内に UDP-ガラクトーストランスポーターを発現させるベクターを作製する。次にこの ベクターを、 前 Ϊ頁に記載した、 N-結合型糖鎖として未熟な複合二本鎖型糖鎖を主要に有する組換え ヒトアンチトロンビン IIIを発現する酵母株に対し、 安定的に導入する。 遺伝子導入後の酵母は、 栄養要求性と薬剤耐注を指標にしてクローンを選抜した後、 RT- PCRによって、 UDP-ガラクトースト ランスポー夕一の発現を確認する。
1 5 . 組換えキメラ型 51 , 4ガラクトース転移酵素遺伝子を導入した酵母株の作製
ヒト組織由来、 たとえば肝臓由来の cDNA (クロンテック社製) を錶型とし、 特異的プライマーと K0Dポリメラーゼ （東洋紡績社製） を用いた PCRを行うことにより、 51 , 4ガラクトース転移酵素 (GenBankァクセッションナンバー： M22921) の活性ドメインをコードする cDNAを特異的に増幅さ せる。増幅させた cDNAは、 その 5' 末端側に、 酵母のマンノース転移酵素 (MNN9)遺伝子（GenBank ァクセッ ョンナンバー： L23752)のリーダ一ペプチドをコードする cDNA配列を連結した後に、酵 母用の発現ベクターのプロモーター配列の下流に挿入し、 酵母のゴルジ体内に ^ 1 , 4 ガラクトース 転移酵素を発現させるベクターを作製する。 次にこのベクターを、 上述の前項に記載した、 N-結合 型糖鎖として未熟な複合二本鎖型糖鎖を主要に有する組換えヒトアンチトロンビン IIIを発現する 酵母株にキメラ型/ ? 1, 4 ガラクトース転移酵素を安定的に導入した酵母株に対し、 安定的に導入す る。遺伝子導入後の酵母は、 栄養要求性と薬剤耐性を指標にしてクローンを選抜した後、 RT- PCRに よって、 キメラ型 51 , 4 ガラクトース転移酵素の発現を確認する。 以上の方法により、 キメラ型 1 , 4 ガラクトース転移酵素が安定的に組み込まれた酵母株が発現する遺伝子遺伝子組換えアンチト ロンビン IIIが有する主要な N-結合型糖鎖の構造を、還元末端側のコア部分に 2残基の N-ァセチル グルコサミンを有し、 その非還元末端側に 3個のマンノース残基が二分岐する構造で結合し、 二つ の非還元末端のそれぞれに N-ァセチルダルコサミン残基とガラクトース残基が 1個ずつ付加され た、 未熟な複合二本鎖型糖鎖に改変することができる。
1 6 . 組換え CMP-シアル酸トランスポーター遺伝子を導入した酵母株の作製
ヒト組織由来、 たとえば肝臓由来の cDNA (クロンテック社製） を錶型とし、 特異的プライマーと KODポリ ラーゼ （東洋紡績社製） を用いた PCRを行うことに丄り、 CMP-シアル酸トランスポー夕 ― (GenBankァクセッションナンバー： D87969) の翻訳領域全長をコードする cDNAを特異的に増幅 させる。増幅させた cDNAは、酵母用の発現ベクターのプロモーター配列の下流に挿入し、酵母のゴ ルジ体内に CMP-シアル酸トランスポーターを発現させるベクターを作製する。次にこのベクターを、 上述の前項に記載した、 N-結合型糖鎖として未熟な複合二本鎖型糖鎖を主要に有する組換えヒトァ ンチトロンビン IIIを発現する酵母株に対し、 安定的に導入する。 遺伝子導入後の酵母は、 栄養要 求性と薬剤耐性を指標にしてクローンを選抜した後、 RT-PCRによって、 CMP-シアル酸トランスポー 夕一の発現を確認する。
1 7 . 組換えキメラ型シアル酸転移酵素遺伝子を導入した酵母 ¾の作製
ヒト組織由来、 たとえば肝臓由来の cDNA (クロンテヅク社製） を铸型とし、 特異的プライマーと K0Dポリメラーゼ（東洋紡績社製）を用いた PCRを行うことにより、 α 2，3シアル酸転移酵素 (GenBank ァクセヅシヨンナンバー： L23768)、 もしくは、 2 , 6シアル酸転移酵素 （GenBankァクセヅシヨン ナンバー： X62822)、 の活性ドメインをコードする cDNA を特異的に増幅させる。増幅させた cDNA は、 その 5， 末端側に、 酵母のマンノース転移酵素 （MNN9)遺伝子（GenBankァクセッションナンパ 一： L23752)のリーダーペプチドをコードする cDNA配列を連結した後に、酵母用の発現ベクターの プロモーター配列の下流に挿入し、 酵母のゴルジ体内にシアル酸転移酵素を発現させるベクターを 作製する。 次にこのベクターを、 前項に記載した、 N-結合型糖鎖として未熟な複合二本鎖型糖鎖 ¾ 主要に有する組換えヒトアンチトロンビン IIIを発現する酵母株にキメラ型シアル酸転移酵素を安 定的に導入した酵母株に対し、 安定的に導入する。 遺伝子導入後の酵母は、 栄養要求性と薬剤耐性 を指標にしてクローンを選抜した後、 ET- PCRによって、 キメラ型シアル酸転移酵素の発現を確認す る。 上記の方法により、 キメラ型シアル酸転移酵素が安定的に組み込まれた酵母株が発現する遺伝 子遺伝子組換えアンチト口ンビン IIIが有する主要な N-結合型糖鎖の構造を、還元末端側のコア部 分に 2残基の N-ァセチルグルコサミンを有し、その非還元末端側に 3個のマンノース残基が二分岐 する構造で結合し、 二つの非還元末端のそれそれに N-ァセチルグルコサミン残基、 ガラクトース残 基とシアル酸が 1個ずつ付加された、 成熟した複合二本鎖型糖鎖に改変することが可能である。
1 8 . 酵母を用いた遺伝子組換えアンチトロンビン III蛋白質の調製
前項で作製した、 還元末端側にフコース残基を持たず非還元末端側にシアル酸が付加された複合 二本鎖型糖鎖を主に有する遺伝子組換えアンチトロンビン IIIを発現する酵母株は、 液体 YPD培地
(インビトロジェン社製）に播種し、 30°Cにて 24時間以上の回分培養を行うことにより、 培養上清 中に遺伝子組換えアンチトロンビン IIIを分泌させることが可能である。 培養後に得られる培養上 清は、 ヒト血漿由来アンチトロンビン IIIノィアート （三菱ゥエルファーマ社製） などを標準品と し、 ヒトアンチトロンビン IIIェライザキヅト (ァフィニティーバイオロジカルズ社製） を用いて 分析する。 この分析により、 培養上清中に含まれる組換えヒトアンチトロンビン IIIを検出し、 そ の濃度を測定することが可能である。 また、 ごの酵母培養上清中に分泌された、 N-結合型糖鎖とし てフコースを含まない複合二本鎖型糖鎖を有する遺伝子遺伝子組換えアンチトロンビン IIIは、 実 施例 4に記載した方法で、 精製が可能である。 また、 精製されたアンチトロンビン III蛋白質は、 実施例 4に記載した方法で、 糖鎖構造の解析が可能である。
以上の通り、 N-グリコシド結合糖鎖としてフコースを含まない複合型糖鎖を主要に有する遺伝子 組換えアンチトロンビン IIIを発現する酵母株を作製し、 その酵母の培養によって、 N-グリコシド 結合糖鎖としてフコースを含まない複合型糖鎖を主要に有する遺伝子組換えアンチトロンビン III を調製可能であることを示した。なお、本実施例において酵母で発現させた該アンチトロンビン III は、 FUT8ダブルノックアウト細胞で発現させたアンチトロンビン IIIや、 ヒト血漿由来のアンチト ロンビン IIIと比較して、 同等の生物活性を有する蛋白質である。
産業上の利用可能性
本発明により、 N-グリコシド結合複合型糖鎖を有する遺伝子組換えアンチトロンビン III分子か らなる組成物であって、 N-グリコシド結合複合型糖鎖が該糖鎖の還元末端の N-ァセチルダルコサ ミンにフコースが結合していない糖鎖を有するアンチトロンビン III組成物の製造方法が提供され る。
【配列表フリーテキスト】
配列番号 20-人工配列の説明：合成 DNA
配列番号 21-人工配列の説明：合成丽 A
配列番号 22-人工配列の説明：合成 DNA
配列番号 23-人工配列の説明：合成 DNA
配列番号 24-人工配列の説明：合成 DNA
配列番号 25-人工配列の説明：合成 DNA
配列番号 26-人工配列の説明 '：合成 DNA
配列番号 27-人工配列の説明：合成 DNA
配列番号 28-人工配列の説明：合成皿 A
配列番号 29-人工配列の説明：合成 DNA
配列番号 30-人工配列の説明：合成 DNA
配列番号 31-人工配列の説明：合成 DNA
配列番号 32-人工配列の説明：合成 DNA
配列番号 33-人工配列の説明：合成 DNA
配列番号 34-人工配列の説明：合成 DNA
配列番号 35-人工配列の説明：合成 DNA
配列番号 36-人工配列の説明：合成通 A
配列番号 37-人工配列の説明：合成 DNA

Claims

請求の範囲
1 . 遺伝子組換えにより改変された宿主にアンチトロンビン ΠΙをコードする DNAを導入して 得られた形質転換体を培地に培養し、培養物中に N-グリコシド結合複合型糖鎖を有するアンチト口 ンビン III 分子からなる組成物であって、 N-グリコシド結合複合型糖鎖が該糖鎖の還元末端の N- ァセチルダルコサミンにフコースが結合していない糖鎖であるアンチトロンビン III組成物を生成 蓄積させ、 該培養物から該アンチトロンビン III糸誠物を採取することを特徴とする、 アンチトロ ンビン III組成物の製造方法。 '
2 . N-グリコシド結合複合型糖鎖が、 該糖鎖の還元末端の N-ァセチルダルコサミンの 6位にフ コースの 1位が結合していない糖鎖である、 請求項 1記載の製造方法。
3 . 宿主細胞が、 細胞内糖ヌクレオチド GDP-フコースの合成に関与する酵素、 または N-ダリコ シド結合複合型糖鎖還元末端の N-ァセチルダルコサミンの 6位にフコースの 1位が α結合する糖 鎖修飾に関与する酵素が失活するようにゲノムが改変された宿主細胞である請求項 1または 2記載 の製造方法。 . .
4 . 宿主細胞が、 細胞内糖ヌクレオチド GDP-フコースの合成に閧与する酵素、 または Ν-グリコ シド;結合複合型糖鎖還元末端の Ν-ァセチルグルコサミンの 6位にフコースの 1位が α結合する糖 鎖修飾に関与する酵素のゲノム上の対立遺伝子のすべてがノヅクアウトされた宿主細胞である、 請 求項 1〜 3のいずれか 1項に記載の製造方法。
5 . 細胞内糖ヌクレオチド GDP-フコースの合成に関与する酵素が、 GDP-マンノース 4,6-デヒ ドラターゼ (GMD) 及び GDP-4-ケト -6-デォキシ -D-マンノース- 3，5-ェピメラ一ゼ (Fx) からなる 群から選ばれる酵素である、 請求項 3または 4に記載の製造方法。
6 . GDP-マンノース 4,6-デヒドラ夕一ゼが、 以下の (a)及び (b)からなる群から選ばれる DNAが コードする蛋白質である、 請求項 5に記載の製造方法。
(a)配列番号 7で表される塩基配列からなる DNA；
(b) 配列番号 7で表される塩基配列からなる DNAとストリンジェントな条件でハイブリダィズし、 かつ GDP-マンノース 4,6-デヒドラ夕ーゼ活性を有する蛋白質をコードする DNA。
7 . GDP-マンノース 4,6-デヒドラ夕ーゼが、 以下の （a)、 (b)及び (e) からなる群から選ばれる蛋 白質である、 請求項 5に記載の製造方法。 - '
(a) 配列番号 8 表されるァミノ酸配列からナよる蛋白質；
(b)配列番号 8で表されるアミノ酸配列において、 1 以上のアミノ酸が欠失、 置換、 揷入および/ または付加されたアミノ酸配列からなり、 かつ GDP-マンノース 4,6-デヒドラターゼ活性を有する 蛋白質；
(c)配列番号 8で表されるアミノ酸配列と 80%以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、 かつ GDP-マンノース 4,6-デヒドラ夕ーゼ活性を有する蛋白質。
8 . GDP-4-ケト -6-デォキシ -D-マンノース- 3,5-ェピメラーゼカ 以下の （a)及び (b)からなる群 から選ばれる DNAがコードする蛋白質である、 請求項 5に記載の製造方法。
(a) 配列番号 9で表される塩基配列からなる DNA；
(b)配列番号 9で表される塩基配列からなる DNAとストリンジェントな条件でハイブリダィズし、 かつ GDP-4-ケト -6-デォキシ -D-マンノース- 3,5-ェピメラーゼ活性を有する蛋白質をコードする DNA。
9 . GDP-4-ケト -6-デォキシ -D-マンノース- 3,5-ェピメラーゼが、 以下の （a)、 (b) および （c) か らなる群から選ばれる蛋白質である、 請求項 5に記載の製造方法。
(a) 配列番号 1 0で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質；
(b) 配列番号 1 0で表されるアミノ酸配列において、 1 以上のアミノ酸が欠失、 置換、 揷入および /または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ GDP-4-ケト -6-デォキシ -D-マンノース- 3,5-ェピメ ラーゼ活性を有する蛋白質； '
(c)配列番号 1 0で表されるアミノ酸配列と 80%以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、 か つ GDP-4-ケト -6-デォキシ マンノース- 3，5-ェピメラーゼ活性を有する蛋白質。
1 0 . N-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端の N-ァセチルグルコサミン 6位にフコースの 1 位が α結合する糖鎖修飾に関与する酵素が al,6-フコシルトランスフェラーゼである請求項 3また は 4に記載の製造方法。
1 1 . al，6-フコシルトランスフェラーゼが、 以下の （a)、 （b)、 （c)及び (d)からなる群から選ばれ る DNAがコードする蛋白質である、 請求項 1 0に記載の製造方法。
(a) 配列番号 1 1で表される塩基配列からなる DNA ;
(b)配列番号 1 2で表される塩基配列からなる DNA；
(c)配列番号 1 1で表される塩基配列からなる DNA とストリンジェントな条件でハイブリダイズ し、 かつ al,6-フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質をコードする DNA ;
(d)配列番号 1 2で表される塩基配列からなる DNA とストリンジェントな条件でハイプリダイズ し、 かつ al,6-フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質をコードする DNA。
1 2 . al,6-フコシルドランスフェラーゼが、 以下の （a)、 (b)、 (c), (d)、 （e)および (£)からなる群 から選ばれる蛋白質である、 請求項 1 0に記載の製造方法。
(a) 配列番号 1 3で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質；
(b)配列番号 1 4で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質，'
(c)配列番号 1 3で表されるアミノ酸配列において、 1以上のァミノ酸が欠失、 置換、揷入および/ または付加されたアミノ酸配列からなり、 かつ al,6-フコシルトランスフェラ一ゼ活性を有する蛋 白質； ' ' '
(d) 配列番号 1 4で表されるアミノ酸配列において、 1 以上のアミノ酸が欠失、 置換、 揷入および /または付加されたァミノ酸配列からなり、 かつ al,6-フコシルトランスフヱラーゼ活性を有する 蛋白質； ,
(e)配列番号 1 3で表されるァミノ酸配列と 80%以上の相同性を有するァミノ酸配列からなり、 か つ al,6-フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質；
(£)配列番号 1 4で表されるアミノ酸配列と 80%以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、 か つ al,6-フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質。 ，
1 3 . 形質転換体が FERM BP-08472、' PERM BP- 10083, FERM BP- 10084, FERM-10088ま たは FERM BP- 10089である、 請求項 1 ~ 4のいずれか 1項に記載の製造方法。
1 4 . 宿主細胞が、 下記の (a)、 （b)、 （c)、 （d)、 （e)、 （£)、 （g)、 （h)、 （0及び (j)からなる群から選ばれ る細胞である請求項 1〜 1 2のいずれか 1項に記載の製造方法。
(a) チャイニーズハムスター卵巣組織由来 CHO細胞,'
(b) ラヅトミ ローマ細胞株 YB2/3HL.P2.Gll.l6Ag.20細胞； (c) マウスミエローマ細胞株 NSO細胞；
(d) マウスミエローマ細胞株 SP2/0-Agl4細胞 ,·
(e) シリアンハムス夕一腎臓組織由来 BHK細胞；
(£) ヒト白血病細胞株ナマルバ細胞；
(g)胚性幹細胞'；
( ) 受精卵細胞；
(i)植物細胞； ：
φ酵母。
1 5 . アンチトロンビン III組成物が、 N-グリコシド結合複合型糖鎖を有し、 かつ N-グリコシド結 合複合型糖鎖が該糖鎖の還元末端の N-ァセチルダルコサミンにフコースが結合していない糖鎖で ある、 請求項 1〜 1 4のいずれか 1項に記載の製造方法。
1 6 . N-グリコシド結合複合型糖鎖が、 該糖鎖の還元末端の N-ァセチルダルコサミンの 6位にフ コ一スの 1位が結合していない糖鎖である、 請求項 1〜1 5のいずれか 1項に記載の製造方法。
1 7 . アンチトロンビン IIIせ、 配列番号 4に示されるァミノ酸配列で表されるポリぺプチドで あ.る、 請求項 1〜 1 6のいずれか 1項に記載の製造方法。
1 8 . アンチトロンビン ΠΙが、 配列番号 4に示されるアミノ酸配列において、 1以上のァミノ. 酸が欠失、 置換、 挿入および/または付加されたアミノ酸配列からなり、 かつへパリン結合活性を 有するポリペプチドである、 請求項 1〜1 7のいずれか 1項に記載の製造方法。
1 9 . アンチトロンビン IIIが、 配列番号 4に示されるアミノ酸配列と 8 0 %以上の相同性を有 するアミノ酸配列からなり、 かつへパリン結合活性を有するポリペプチドである、 請求項 1〜1 8 のいずれか 1項に記載の製造方法。
2 0 . アンチトロンビン IIIが、 以下の (a)または (b)から選ばれる DNAがコードするポリぺプチ ドである、 請求項 1 ~ 1 9のいずれか 1項に記載の製造方法。
(a) 配列番号 1で表される塩基配列からなる DNA；
(b) 配列番号 1で表される塩基配列からなる DNAとストリンジェントな条件でハイプリダイズし、 かつへパリン結合活性を有する蛋白質をコードする DNA。 ' '
2 1 . アンチトロンビン IIIが、 哺乳動物由来である、 請求項 1〜2 0のいずれか 1項に記載の製 造方法。
2 2 . 請求項 1 ~ 2 1のいずれか 1項に記載の製造方法により得られる、 アンチトロンビン III組 成物。
2 3 . 請求項 2 2記載のアンチトロンビン III組成物を有効成分として含有する医薬。
2 4 . 医薬が、 血液凝固を伴う疾患に対する診断薬、 予防薬又は治療薬である、 請求項 2 3に記載 の医薬。 '
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