WO2004104196A1 - 緩衝剤組成物 - Google Patents

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WO2004104196A1
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nucleic acid
region
oligonucleotide
salt
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Joji Oshima
Ken Nemoto
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G & G Science Co Ltd
G&G Science Co Ltd
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G & G Science Co Ltd
Adgene Co Ltd
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]

Definitions

  • the present invention relates to a buffer composition useful for a nucleic acid synthesis reaction.
  • the complementary strand synthesis reaction of nucleic acid using DNA synthase and RA synthase is known.
  • the c- phase capture synthesis reaction is based on the base constituting ⁇ type at the 3 and 3 ends of primers annealed to ⁇ type nucleic acid. This is a reaction for adding a base complementary to.
  • a double-stranded nucleic acid having a base sequence complementary to type I and type II is generated.
  • the complementary strand synthesis reaction has been applied to various operations for isolating and analyzing genes.
  • Gene analysis is one of the major uses of complementary strand synthesis.
  • primer annealing is required for the complementary strand synthesis reaction. In other words, unless the primer is annealed, the complementary strand synthesis reaction does not proceed.
  • a nucleic acid detection method and identification method using a complementary strand synthesis reaction product as an index have been put to practical use (Japanese Patent Publication No. 4-67957 ⁇ ).
  • a method for detecting a gene based on the PCR method is known as a method for detecting a gene having excellent sensitivity and specificity.
  • an oligonucleotide having a base sequence complementary to a base sequence to be detected is used as a primer.
  • the nucleotide sequence assumed to be detected is referred to as a target nucleotide sequence. If a nucleic acid containing the target base sequence is present in the sample, the primer annealing and the complementary strand synthesis reaction proceed. However, if no nucleic acid containing the target base sequence is present, neither anneal nor complementary strand synthesis reaction occurs. Therefore, when a PCR reaction product is detected, the presence of the target base sequence can be proved. PCR is a powerful analysis tool when the target nucleotide sequence is known.
  • the PCR method exhibits excellent sensitivity and specificity when proving the existence of a specific base sequence. This means that in order to identify similar nucleic acids by PCR, a base sequence capable of discriminating between them must be selected as a target base sequence. Therefore, in order to distinguish the differences between unknown nucleic acids and nucleic acids with extremely high similarity by PCR, the design of primers that enable such differences has been a major issue.
  • the present inventors have developed a GP method (Geno-Patern technology) as a method for solving the problem of the PCR method.
  • the GP method is a nucleic acid analysis method that can clearly distinguish differences between nucleic acids having high similarity.
  • complementary strands are synthesized for a plurality of regions of a test nucleic acid.
  • the primer and the phase-trapping synthesis reaction are designed so that each complementary strand is synthesized as a single strand as much as possible.
  • a state in which nucleic acids without complementary strands are mixed in one reaction system is created.
  • each nucleic acid Since each nucleic acid is derived from a different region, it contains a different base sequence. If any contains a partially complementary base sequence, they hybridize to each other. But because they are not perfectly complementary, hybridization is only a partial phenomenon. Similarly, if a nucleic acid has a complementary base sequence, it may hybridize to itself. In this way, a complex entangled nucleic acid aggregate is formed.
  • the aggregate in the GP method is schematically shown in FIG. Figure
  • phase capture chain is synthesized by using the primers shown in “Waveform generation primers” with a plurality of regions of the test nucleic acid as ⁇ . This synthetic product constitutes the aggregate.
  • an aggregate of nucleic acids thus constructed is to be analyzed. That is, a nucleic acid is identified by comparing the melting curves of the aggregate. Collection of nucleic acids in GP method Since the coalescence contains various combinations of double-stranded nucleic acids, multiple melting temperatures are recorded in the melting curve. If the conditions of the complementary strand synthesis reaction are the same, the pattern of the melting curve obtained from the same test nucleic acid is the same. Since the melting curve pattern is unique to the test nucleic acid, the nucleic acid can be identified by comparing the melting curves.
  • phase capture synthesis is performed for a plurality of regions of a test nucleic acid.
  • multiple primers are required. In other words, it is only necessary to design individual plies for the area to be combined. However, if ply of shorter nucleotide sequence can be used, ply may be shared among multiple regions.
  • 7 mer primer the probabilistic, can be expected to Aniru once per 6 3 8 4 bases (4 7). That is, for example, by using one kind of primer having a length of 7 mer, it is possible to obtain (total length of the test nucleic acid 163884) kinds of synthetic products.
  • the small number of primers required for the reaction is an economic advantage. In addition, if the reaction is composed of a small number of primers, it is easy to keep the conditions for annealing primers between each region constant, which should contribute to improvement of reproducibility.
  • a short ply has a low melting temperature (hereinafter abbreviated as ⁇ ), so a low annealing temperature is required.
  • Tm (° C) is derived based on the Wallace equation "2 (A + T) +4 (G + C) ⁇ (Thein and Wallace, The use of synnt hetic oligo— nucleotide as specific hybridization probes in the diagnosis of genetic disorders. In human genetic deseases: A practical approach, ed. KE Davies, pp33-50. IRL Press, Oxford, U).
  • the primer's temperature for PCR and the like is set at a temperature about 5 ° C lower than the Tm of the primer. That is, if Tm is 38 ° C, 33 ° C is Ring temperature.
  • a temperature of 60 ° C or higher is usually used for annealing.
  • the phase complementary chain synthesis reaction under a low temperature condition of 50 ° C. or less involves various obstacles.
  • the lower annealing temperature causes an increase in non-specific annealing.
  • the phenomenon of annealing not only for complementary base sequences but also for base sequences with low complementarity increases.
  • annealing is less likely to occur due to a change in the structure of the primer.
  • non-specific aggregation between primers due to a decrease in temperature or a decrease in the physical flexibility of primers is thought to hinder complementary strand synthesis.
  • primers for complementary strand synthesis usually require a length of at least about 20 bases.
  • random primers are used for complementary strand synthesis of multiple regions.
  • the random primer is an aggregate of oligonucleotides having a length of about 1 Omer.
  • the oligonucleotide constituting the random primer has an arbitrary base sequence.
  • Random primers are generally used for polymorphism analysis and probe synthesis. Phase capture synthesis reactions using random primers usually do not require specificity. Therefore, complementary chain synthesis is carried out under low stringency conditions. In other words, random primers are used to actively induce non-specific annealing.
  • the reaction conditions of the random primer cannot be applied to the GP method.
  • a technology that enables a specific complementary strand synthesis reaction under low temperature conditions is required. Disclosure of the invention
  • An object of the present invention is to provide a buffer composition useful for a complementary strand synthesis reaction under low temperature conditions.
  • Stringency is governed by salt concentration in addition to temperature conditions. Furthermore, if components that influence hybridization, such as denaturing agents, coexist in the solution, the stringency will also vary depending on these components. Therefore, it is possible to adjust the stringency to some extent by adjusting the amounts of these components while maintaining a constant temperature.
  • a decrease in salt concentration acts to increase stringency.
  • annealing at a higher salt concentration is easier than at a lower salt concentration.
  • Mg 2+ ions Mg 2+ ions
  • it is often attempted to reduce the stringency by increasing the concentration of Mg 2+ ions in PCR and other methods. If the reaction does not proceed sufficiently, dimethyl sulfoxide (MS0), polyethylene glycol, or glycerin is added to enhance the reaction.
  • MS0 dimethyl sulfoxide
  • polyethylene glycol polyethylene glycol
  • glycerin is added to enhance the reaction.
  • annealing at room temperature for example, is impossible.
  • the inventors of the present invention have tentatively studied various combinations of additives in order to find a buffer that enables sufficient complementary strand synthesis while maintaining specificity under low-temperature conditions. As a result, they have found that the above problem can be solved by adding specific salts in addition to divalent or monovalent metal salts that constitute a general buffer solution for complementary strand synthesis reaction. Furthermore, it has been confirmed that sufficient complementary strand synthesis reaction efficiency can be achieved by adding a denaturant, thereby completing the present invention. That is, the present invention relates to the use of the following buffer composition as well as the buffer composition.
  • a buffer composition for nucleic acid synthesis comprising the following composition:
  • composition according to [1] wherein the buffer is a buffer that gives a pH of 7.5-9.
  • the Mg 2+ salt is MgCl 2 .
  • composition according to [4] The composition according to [1], wherein the monovalent metal salt is one or both of KC1 and NaCl.
  • sulfate, sulfite, phosphate, and carbonate is Na 2 S0 4, Na 2 S0 3, NaH 2 P0 4, and NaHC0 any salt selected from the group consisting of 3 [ [1] The composition according to [1].
  • composition according to [6] The composition according to [1], wherein the denaturing agent is selected from the group consisting of a nonionic surfactant, an anionic surfactant, and a detergent.
  • the nonionic surfactant is selected from the group consisting of polyoxyethylene ether of glycerin ester, polyoxyethylene ether of sorbitan ester, and polyoxyethylene ether of sorbitol ester.
  • the detergent is dodecyl sulfate, lauroyl sarcosine, laurylate, [6]
  • the composition according to [6] which is any compound selected from the group consisting of mercaptoacetate and mercaptoacetate.
  • composition according to [9] The composition according to [1], wherein the nucleic acid to be synthesized is a complementary strand having a plurality of regions of a nucleic acid of type III as a type II.
  • At least one salt selected from the group consisting of 0.01 -0.1M, sulfate, sulfite, phosphate, and carbonate.
  • a stabilizing agent for oligonucleotide annealing which comprises one or both of the following components d) and e) as an active ingredient.
  • the present invention relates to a buffer composition
  • a buffer composition comprising the following composition:
  • a buffer that provides a pH suitable for a phase capture synthesis reaction by a nucleic acid synthase a buffer that provides a pH suitable for a phase capture synthesis reaction by a nucleic acid synthase
  • One 20 OmM monovalent metal salt d) 0.05-0.50 of at least one salt selected from the group consisting of sulfates, sulfites, phosphates and carbonates, and
  • an oligonucleotide refers to a molecule in which a plurality of nucleotides are linked.
  • Nucleic acid on the other hand, means a polymer of multiple nucleotides.
  • Nucleic acids include DNA and RNA.
  • Oligonucleotides can also be DNA, RA, or hybrid molecules of both.
  • the primer hybridizing to type II is particularly expressed as anneal.
  • the buffer composition of the present invention for the compositions a) to c), the same components as those constituting a reaction solution for a known complementary strand synthesis reaction can be used.
  • the buffer giving suitable pH to the complementary strand synthesis reaction by a) a nucleic acid synthetase can be used a buffer to provide a P H of neutral to weakly Al force Li.
  • the optimal pH of many commercially available DNA polymerases is 7.5-9, preferably 8-8.5. Therefore, buffers that provide this pH are useful in the present invention.
  • a Tris-HCl buffer and the like can be exemplified.
  • the concentration can be, for example, 1 to 50 mM, usually 5 to 20 mM, and preferably 8 to 15 mM.
  • concentrations of the components that make up the buffer composition refer to the final concentration unless otherwise noted.
  • Mg 2+ salts in the compositions of the present invention and Mn 2+ salt is the one, also can be utilized in combination with both.
  • MgCl 2 or MnCl 2 can be used as the Mg 2+ salt and the Mn 2+ salt.
  • These salts are usually 1-5 OmM, for example 0.5-2 OmM, preferably 0.8-1 OmM can be added.
  • a monovalent metal salt of 120 OmM is generally added to control hybridization of oligonucleotides.
  • natrium and NaCl are used as monovalent metal salts.
  • the monovalent metal salt in the composition of the present invention may be used alone or in combination of plural kinds. These salts can be added usually at a concentration of 11 to 200 mM, for example, 5 to 10 OmM, preferably 10 to 8 OmM. When a plurality of salts are combined as a monovalent metal salt, the total concentration of metal ions is adjusted so as to fall within the above concentration range.
  • compositions d) and e) are components necessary for annealing the primer under low-temperature conditions, which is the subject of the present invention.
  • either selected sulfates, sulfites, phosphates, and as the carbonate was example, if Na 2 S0 4, Na 2 S0 3, NaH 2 P0 4, and from the group consisting of NaHCO 3 Salts can be used. These salts can be used alone or in combination with different salts in the buffer composition of the present invention.
  • the concentration of these salts can be usually from 0.005 to 0.5M, for example, from 0.01 to 0.1M, and more specifically from 0.03 to 0.05M.
  • Sulfates, sulfites, phosphates, and carbonates When combining multiple types of salts, adjust so that the total concentration of salts is within these concentration ranges.
  • the denaturing agent in the present invention is a compound having an action of eliminating the higher-order structure of nucleic acid.
  • a nucleic acid may have a higher-order structure, for example, even if it is a single-stranded polynucleotide. Especially at low temperatures, it is thought to have various higher-order structures instead of a simple chain structure.
  • the denaturing agent is considered to have an effect of assisting the annealing of the oligonucleotide by eliminating the higher-order structure of the nucleic acid.
  • Nonionic surfactants are classified into ether type, ether ester type, ester type, and nitrogen-containing type.
  • nonionic surfactants particularly from non-ionic surfactants are preferred c ether ester type, polyoxyethylene ether of glycerin ester, polyoxyethylene ether of Sorubita N'esuteru and sorbitol esters, Polyethylene ethylene ether can be shown as an ether ester type nonionic surfactant.
  • Ether ester type nonionic surfactants include polyoxyethylene glycerin fatty acid ester, castor oil, polyoxyethylene sorbitan fatty acid ester, polyoxyethylene sorbitol fatty acid ester, polyoxyethylene fatty acid alkanolamide sulfate, etc. .
  • a particularly preferred ether ester type nonionic surfactant is polyoxyethylene sorbitan fatty acid ester.
  • commercially available non-ionic surfactants that can be used in the composition of the present invention will be exemplified.
  • NIKKOL BL-9EX Polyoxyethylene (9) Lauryl Ether
  • NP-40 Polyoxyethylene (9) Octylphenyl Ether
  • TWEEN 20 Polyoxyethylene (20) Sorb i tan Monolaurate
  • TWEEN 80 Polyoxyethylene (20) Sorbitan Monooleate
  • TWEEN 40 Polyoxyethylene (20) Sorbitan Monopalmitate
  • TWEEN 60 Polyoxyethylene (20) Sorbitan Monostearate
  • TWEEN 85 Polyoxyethylene (20) Sorbitan Trioleate
  • anionic surfactant examples include surfactants such as a sulfonate, a carbonate, a sulfate, and a phosphate.
  • the following detergents can also be used in the composition of the present invention. These detergents can also use salts other than sodium salts.
  • the concentration of the denaturing agent in the reaction solution can be appropriately adjusted depending on the base sequence constituting the primer to be agglutinated and the temperature of the complementary strand synthesis reaction. Generally, 0.01% W / V to 10% W / V, for example, 0.5% W / V to 5% W / V, more specifically, 1% W / V to 3% W / V V can be added.
  • the buffer composition of the present invention may contain additional components used for complementary strand synthesis of nucleic acids. Examples of additional components are given below.
  • dXTP dATP, dTTP, dCTP, and dGTP
  • An enzyme protecting agent is a compound added for the purpose of protecting an enzyme that catalyzes complementary strand synthesis.
  • an inactive protein such as serum albumin or a surfactant such as DMS0 has a protective effect on the enzyme.
  • the buffer composition of the present invention may contain a substance necessary for analyzing a product of complementary strand synthesis.
  • the intercalator is an important indicator in the analysis of reaction products.
  • a compound that binds to a double-stranded nucleic acid to generate a signal is called an intercalator.
  • interlators are ethidium bromide (brominated by chemical bromide) and as an available product, cyber green (manufactured by Molecular Probe).
  • a primer for complementary strand synthesis can be added to the buffer composition of the present invention in advance.
  • the buffer composition of the present invention is useful for nucleic acid complementary strand synthesis.
  • Primers for complementary strand synthesis are appropriately designed according to the base sequence of the nucleic acid to be type III.
  • the nucleic acid can be distributed in the buffer composition of the present invention while containing a primer for complementary strand synthesis.
  • a primer having a base sequence specified by the user can be synthesized and incorporated into the buffer composition of the present invention.
  • the buffer composition of the present invention can be supplemented with a nucleic acid synthetase that catalyzes phase capture synthesis.
  • a nucleic acid synthetase that catalyzes phase capture synthesis.
  • complementary strand synthesis can be started only by adding a type III nucleic acid.
  • a desired complementary strand synthesis reaction can be started by adding a primer and a nucleic acid to be a type II. Any of these additional components can be added at the concentrations required for the final reaction.
  • the buffer composition of the present invention can be supplied in any dosage form.
  • It can be liquid, powder, or tablet.
  • Liquid preparations include those adjusted to the final concentration and those concentrated.
  • a liquid concentrated composition containing each composition at a 10-fold concentration is diluted 10-fold before use.
  • the solid components contained in the buffer composition of the present invention can be mixed and supplied in the form of a powder or a tablet.
  • the user can obtain a buffer composition adjusted to the final concentration by dissolving the powder or tablet with the specified volume of solvent.
  • Tris-HCl is used as a buffer
  • Tris-HC1 can be specified as a solvent for dissolution.
  • the buffer composition of the present invention can be used as a reaction solution for a complementary strand synthesis reaction involving primer annealing.
  • the buffer composition of the present invention is particularly useful when an oligonucleotide having a small number of constituent bases is used as a primer.
  • annealing of the primer is performed at a temperature about 5 ° C lower than Tm.
  • oligo nucleotides with a small number of constituent bases have low Tm.
  • nonspecific annealing and the higher-order structure of the oligonucleotide prevent phase capture synthesis from proceeding. Or, even if the conditions that allow complementary strand synthesis are given, it is difficult to synthesize the target synthetic product specifically because non-specific synthetic products are conspicuous. These obstacles can be eliminated by using the buffer composition of the present invention.
  • the GP method As a method for analyzing a nucleic acid requiring a complementary strand synthesis reaction using an oligonucleotide having a small number of constituent bases as a primer, the GP method can be shown. As shown in FIG. 1, in the GP method, an aggregate of phase capture chains synthesized using a plurality of regions of a test nucleic acid as ⁇ is analyzed. One method for synthesizing a plurality of regions is to anneal a primer having a small number of constituent bases to a plurality of locations. If the number of bases constituting the primer is small, the possibility that a nucleotide sequence complementary to the primer is present in the test nucleic acid is increased. As a result, a single primer can act as a primer in multiple regions. In implementing the GP method, for example, a plurality of regions to be subjected to phase capture synthesis are selected based on the following concept.
  • the plurality of regions include regions in which it is expected that there is a difference in base sequence between nucleic acids to be compared.
  • the difference in base sequence may not be included in all of the plurality of regions. For example, suppose that three nucleic acids X, Y, and ⁇ are synthesized for three regions a-c. 'Indicates that the base sequence of each region contains a difference.
  • the nucleic acid Y has b ′ having a base sequence different from that of other nucleic acids, and the nucleic acid Z has By combining these areas, the three parties can be identified. '
  • the plurality of regions specifically extract nucleotide sequence information as diverse as possible from a test nucleic acid.
  • nucleotide sequence information as diverse as possible from a test nucleic acid.
  • the base sequences differ from each other in as many regions as possible.
  • nucleotide sequence information of the genome has already been clarified.
  • a region having a different base sequence between the species to be compared and the other species can be selected in advance. Further, even when the base sequence information of the genome is insufficient, it is possible to select a region having a different base sequence based on the genome or gene information that has already been clarified.
  • the plurality of regions are synthesized by a method having reproducibility.
  • the reproducibility of complementary strand synthesis means that the same region is used as type II of complementary strand synthesis.
  • the length of the synthesized product can be changed.
  • the reproducible complementary strand synthesis reaction in the present invention can be said to mean that a certain primer specifically initiates complementary strand synthesis. Therefore, the complementary strand synthesis reaction of the present invention is distinguished from a complementary strand synthesis reaction using a random primer.
  • each nucleic acid should be synthesized under the same conditions. Therefore, when a plurality of regions are synthesized by a complementary strand synthesis reaction using a primer and a DNA polymerase, it is desired that the specificity of hybridization of the primer be maintained.
  • the method for synthesizing a nucleic acid is not particularly limited as long as it is a type-dependent synthesis method.
  • the plurality of regions can be synthesized using a sense strand or an antisense strand as a type III. All of the plurality of regions may be synthesized with the sense strand or the antisense strand as type III, or both may be synthesized as type III.
  • an extension product for the GP method As a typical method for obtaining an extension product, a phase capture synthesis reaction using a DNA polymerase can be used.
  • a primer capable of annealing to a plurality of regions of the test nucleic acid is used in order to synthesize a plurality of regions of a test nucleic acid.
  • an extension product synthesized by a complementary strand synthesis reaction from a primer capable of annealing to a plurality of regions of a test nucleic acid is called an extension product.
  • the extension product is an aggregate of polynucleotides synthesized using a plurality of regions of the test nucleic acid as type III.
  • the nucleotide sequences of the polynucleotide chains constituting the extension product are different from each other.
  • a plurality of polynucleotide chains containing the same base sequence are generated.
  • test nucleic acids having the same nucleotide sequence in different regions are designated as type III, an extension product containing the same nucleotide sequence may be generated.
  • the base sequence of the extension product since it is desirable to obtain a versatile waveform pattern of the dissociation curve, it is desirable to design the base sequence of the extension product so as to include as much difference as possible.
  • a primer that anneals to a plurality of regions of a test nucleic acid and enables complementary strand synthesis of the plurality of regions is referred to as a waveform generation primer in the GP method.
  • the waveform generating primer of the GP method is used for complementary strand synthesis of a plurality of regions of a test nucleic acid, and gives a mixture of extension products having different base sequences as a result of phase capture chain synthesis.
  • the mixture of different extension products in the GP method preferably refers to a mixture of polynucleotides that give a plurality of Tms when a dissociation curve is analyzed.
  • the primer for waveform generation in the GP method can also be defined as follows. That is, the primer for generating a waveform in the GP method is an oligonucleotide containing a nucleotide sequence complementary to a specific nucleotide sequence region appearing at a plurality of positions on a test nucleic acid, and the nucleic acid to be detected under the same conditions. In the above plurality of regions, the mirror-dependent DNA polymerase can initiate complementary strand synthesis. At least a part of the nucleotide sequence of the waveform generating primer comprises a nucleotide sequence complementary to the specific region. The base sequence complementary to the specific region can be arranged in any region of the oligonucleotide.
  • a primer capable of annealing to a plurality of regions of a test nucleic acid for example, the following method can be shown.
  • primers By designing primers based on the following concept, primers can be synthesized more easily than simply mixing primers necessary for the synthesis of complementary strands in multiple regions.
  • a single primer can anneal to a plurality of sites of a test nucleic acid by selecting an appropriate base sequence.
  • an oligonucleotide of 20 to 50 bases is used as a primer. Oligonucleotides of this length are very unlikely to anneal to multiple sites under stringent conditions.
  • oligonucleotides with a smaller number of bases increases the possibility of annealing at multiple positions.
  • region oligonucleotide consisting 3-8 bases can Aniru is computationally will Rukoto exist at a probability of 1/64 (4 3) to 1/65536 (4 8).
  • Rukoto exist at a probability of 1/64 (4 3) to 1/65536 (4 8).
  • a short primer enables the complementary strand synthesis of multiple regions even when used alone.
  • the design of one type of primer that can be annealed to multiple regions involves searching for a short base sequence consisting of 3 to 10 or more bases that appear frequently in the target genome based on the base sequence information of the target genome. This is possible by using the top candidates in descending order of appearance frequency.
  • the genome region for which the frequency of appearance is counted may include all nucleotide sequence information or may be targeted to a specific region of interest.
  • Two or more primers that anneal to multiple regions Two or more primers that anneal to multiple regions:
  • the base sequence of the nucleic acid to be type III is known, it is easy to design a plurality of primers that anneal to each site in order to synthesize a plurality of regions.
  • phase capture chain synthesis may be necessary for more regions.
  • the number of regions to be synthesized increases, the number of required primers also increases.
  • the region to be synthesized is selected so that the base sequences between the primers are as common as possible.
  • two regions for primer annealing are selected.
  • These nucleotide sequences are composed of two types of acid-fast bacilli A ( ⁇ co 3 ⁇ 4 cterium's) and B ⁇ Mycobacterium kansasii). Even though the differences are in different positions on the genome, the base sequences have high similarity to each other (matching bases are shown in capital letters).
  • Mycobacterium A AGcTcGTAAa (SEQ ID NO: 1)
  • Mycobacteria A AGtTcGTAAt (SS column number: 2)
  • Mycobacterium B AGgTtGTAAa (SEQ ID NO: 3)
  • Mycobacterium B AGtTcGTAAa (SEQ ID NO: 4)
  • the bases at the third, fifth, and tenth bases are different, and the other bases are identical. If these different bases are represented by an ambiguity code, it will be agBtYgtaaW (SEQ ID NO: 5).
  • an ambiguous code is a symbol for assigning a plurality of bases to a certain position.
  • the oligonucleotide represented by the ambiguous code means a mixture containing a combination of all bases represented by the ambiguous code at the position of the ambiguous code.
  • the ambiguous codes used here respectively correspond to the following bases.
  • a primer having a base sequence represented by an ambiguous code is referred to as an ambiguous primer.
  • primers are required for each region in order to synthesize complementary chains of the four regions.
  • the complementary strand synthesis of four regions became possible by one kind of polysemy primer.
  • Ambiguous primers are a collection of oligonucleotides having different base sequences. However, in operation, it is synthesized by the same operation as a single oligonucleotide, and can be used as a single oligonucleotide in complementary strand synthesis.
  • nucleotide sequence candidates with a high frequency of appearance for each of a plurality of regions of interest by selecting a nucleotide sequence with a higher degree of commonality from among the nucleotide sequences between the upper candidates, a plurality of completely independent nucleotide sequences can be selected. This makes it possible to design a single type of ambiguous primer that can obtain the same information at the same time.
  • degenerate primers In general, when a part of the base sequence of a type III nucleic acid is unknown, a degenerate primer is often used.
  • the base sequence of the degenerate primer is represented in the same manner as the polysequence primer in the present invention.
  • ambiguous primers are intended for the synthesis of multiple regions having different base sequences.
  • degenerate primers used for PCR cloning and the like usually aim at synthesizing one type of nucleic acid for one type of ⁇ . For crawling (ie, gene isolation), primers that produce a variety of synthetic products are undesirable.
  • the purpose of the design is completely different between the ambiguous primer and the degenerate primer.
  • degenerate primers can be used as waveform generating primers in the GP method.
  • the design method depends on the test nucleic acid. Therefore, application may be difficult depending on the nucleotide sequences of the test nucleic acid and the nucleic acid to be compared.
  • the method described below is a method in which a plurality of primers can be designed relatively easily without being affected by the base sequences of the test nucleic acid and the nucleic acid to be compared.
  • the ambiguous primer was arranged with an ambiguous code according to the base sequence of the nucleic acid to be ⁇ -shaped.
  • a polysemy code is placed on the 5 'side of the primer to obtain a primer assembly for waveform generation that can anneal to multiple regions of the test nucleic acid. Can also be. That is, in the GP method, a primer assembly for generating a waveform containing the following specific primers and ambiguous primers can be used.
  • Specific primer Includes a complementary base sequence in the target region of type I nucleic acid
  • Ambiguous primer at least one ambiguous primer containing the following specific region and ambiguous region
  • Specific region Contains the 3 'end of the oligonucleotide and is composed of a base sequence complementary to the target region
  • Ambiguous region Includes a base sequence that is located on the 5 'side of the specific region and in which a base that constitutes a base sequence complementary to the target region is replaced with a base other than the base
  • the specific primer in the GP method comprises an oligonucleotide containing a base sequence complementary to a target region of type I nucleic acid or a derivative thereof.
  • the derivative includes an oligonucleotide having an additional base sequence or a modified oligonucleotide.
  • Oligonucleotides can be modified with fluorescent materials, radioactive materials, or binding ligands.
  • the target region in the GP method refers to a region where a primer for phase capture strand synthesis should be annealed to a type I nucleic acid.
  • the target region is a region located on the 3 ′ side of the region to be synthesized for the type III nucleic acid.
  • the type ⁇ nucleic acid to be synthesized is a region selected as a region in which a waveform pattern specific to a test nucleic acid can be expected in the nucleic acid identification method using the GP method. It is desirable. Such a region can be selected centering on a region containing a difference in base sequence from the nucleic acid to be compared.
  • a highly homologous nucleotide sequence found at a different position can be selected as a target region.
  • a primer that can anneal to a region having low homology to the target region can be provided by using a set of primers for waveform generation based on the GP method.
  • a waveform is generated that enables complementary strand synthesis of multiple regions of type I nucleic acid.
  • a primer assembly can be obtained.
  • a region that does not include the polymorphic code on the 3 ′ side is a specific region
  • a region where the polymorphic code on the 5 ′ side is arranged is a polymorphic region.
  • the specific region is composed of the same nucleotide sequence as the nucleotide sequence constituting the region including the 3 'end of the specific primer. That is, the base sequence including the 3 'end of the ambiguous primer and the specific primer is common.
  • the number of bases constituting the specific region is not limited. The length of the unique region can be set as appropriate according to the conditions of the ambiguous region.
  • the length of the specific region can be selected within the range of 20 to 90% of the total length of the ambiguous primer.
  • the polysemy code constituting the polysemy region can be, for example, a sequence of four nucleotide polysemy (N), or the polysemy code necessary as appropriate as described in the example of acid-fast bacterium according to the nucleotide sequence of the test nucleic acid. Can also be arranged. Further, as described below, the variation of the polymorphic region can be increased stepwise from the 3 'side to the 5' side of the primer.
  • the ambiguous primer designed in this manner anneals with high reproducibility to many regions of the test nucleic acid, and provides a complementary strand synthesis product of a plurality of regions.
  • the polysemy on the 3 'side which determines the reaction specificity, is reduced, but the specificity is relatively unaffected 5' the 5 C such structural features can give diversity to the base sequence of the primer at the side, can be a collection of stably primers capable and child Aniru for a variety of base sequences.
  • the individual oligonucleotides constituting the primer assembly are designed to have low 3 'diversity. As a result, it selectively anneals to a base sequence that is complementary to the base sequence of each oligonucleotide, and initiates complementary strand synthesis. In other words, complementary strand synthesis can be started specifically and stably for a wide range of base sequences.
  • the following structure is used as a polysemy primer in which the polysemy in the polysemy region is gradually changed. You can show the structure.
  • the base sequence of the ambiguous region consists of the following three regions, and an aggregate of polysemy primers containing all combinations of the substituted base sequences constituting each region is useful as a primer assembly for waveform formation in the GP method It is.
  • N region constitutes the 5 'end of the polymorphic region, and each base constituting the base sequence is selected from adenine, cytosine, guanine, and thymine instead of a base complementary to the base sequence of the target region. Is a base substituted with all three types of bases other than the base
  • each base constituting the base sequence is replaced with a base complementary to the base sequence of the target region, and is replaced with adenine, cytosine, guanine, and thymine Is a base substituted with any two types of bases other than the base selected from
  • each base constituting the base sequence is replaced with a base complementary to the base sequence of the target region, and is replaced with adenine, cytosine, guanine, and It is a base that is substituted with any one type of base other than the base selected from thymine
  • the polysemy region is designed so that the polysemy increases stepwise from the 5 ′ end to the 3 ′ end. That is, at the 5 'end, there is an N region composed of N, which is an Ambiguity Code indicating one of A (adenine), C (cytosine), G (guanine), and T (thymine). .
  • the N region can also be said to be a region in which a base complementary to the target region has been replaced with any of the other three bases.
  • 3 ambiguity regions are arranged in which the base complementary to the target region is replaced by two other types of bases. Further, 2 ambiguity regions (2ARs) in which bases that are complementary to the target region are replaced with one other type of base are placed on the 3 ′ side of the 3AR.
  • the two Ns on the terminal side constitute the N region
  • the four bases of V, H, D, and B constitute the 3AR c.
  • the two S's on the 3 and 2 sides constitute a 2AR.
  • polysemy region polysemy can be enhanced from the 3 side to the 5 'end. In other words, such a structure can increase specificity from the 5 'end to the 3' end.
  • Table 1 shows the correspondence between the ambiguous codes used in the GP method and the actual bases.
  • the length of the N region is preferably 2 to 4 bases.
  • the number of bases in the N region is 5 or more, there is a high possibility that primer interference such as a dimer or a loop easily occurs.
  • the 3AR sequence is more stable in the order of DHVB, HDVB, VHDB, and HVDB.
  • the higher the proportion of G or C on the third side the higher the stability.
  • the 2AR sequence also needs to be designed in consideration of the base sequence of the target region.
  • the length ratio of the N region, 3AR, and 2AR is preferably 1: 2: 1, but is not limited thereto.
  • the length of the ambiguous region of the ambiguous primer constituting the primer assembly is preferably 10% to 80% of the number of bases constituting the primer.
  • the total length of the specific region and the polymorphic region of the polymorphic primer constituting the primer assembly is preferably 10 to 30 bases.
  • a primer assembly for generating a waveform by the GP method including a polymorphic primer can be designed based on the base sequence of the region by setting at least one region as the target region.
  • a plurality of target regions can be selected.
  • the types of specific primers increase, and the types of polysequence primers increase accordingly.
  • the primer assembly for waveform generation can be used simultaneously or individually for complementary strand synthesis.
  • each of the waveform generation primer aggregates has 15. If a shape pattern can be obtained, it means that 50, 625 types (15 X 15 X 15 X 15) of waveform patterns can be obtained theoretically. This means that the method of identifying nucleic acids based on the GP method can identify more than 50,000 nucleic acids by using four sets of primers for generating waveforms that can generate five types of waveform patterns. Is shown.
  • a plurality of types of waveform-generating primer aggregates designed for a plurality of regions can be used as a mixture of aggregates or independently for each aggregate for complementary strand synthesis.
  • the relationship between the waveform pattern and the set of primers can be clearly understood.
  • the primer assembly A for waveform generation designed based on a certain region A and the primer assembly B for waveform generation designed based on another region B are separately mixed without phase capture synthesis. Is preferably used.
  • the primer can be annealed to the mirror nucleic acid
  • a substrate is provided for complementary strand synthesis.
  • the buffer composition of the present invention when the number of constituent bases of the primer is small and a low Tm has to be adopted, the use of the buffer composition of the present invention is effective.
  • the components necessary to enable annealing at a particularly low temperature are the following components d) and e). Therefore, according to the present invention, there is provided a method for hybridizing an oligonucleotide to a complementary strand at a low temperature in the presence of one or both of the following components d) and e).
  • Consists of 0.11-0.1 M sulfate, sulfite, phosphate, and carbonate At least one salt selected from the group
  • the low temperature refers to, for example, a temperature at least 10 ° C lower than the Tm of the oligonucleotide to be hybridized. More specifically, the low temperature in the method of the present invention is, for example, 10 to 30 ° C., preferably 15 to 25 ° C., or 20 to 30 ° C. compared to the Tm of the oligonucleotide to be annealed. Includes temperatures 25 ° C lower.
  • the Tm of the oligonucleotide can be calculated according to the Wallace method described above.
  • Oligonucleotides requiring such low temperatures usually have a length of 5-20 bases, for example 7-15 bases. Therefore, oligonucleotides having such a length are preferred as oligonucleotides to which the method of the present invention is applied.
  • the length of Tm and the length of the oligonucleotide should be calculated based on the length of the base sequence constituting the portion that hybridizes to type III.
  • Oligonucleotides used as primers often have an additional nucleotide sequence independent of anneal.
  • a promoter or a recognition sequence for a restriction enzyme is usually a nucleotide sequence unrelated to primer anneal. Such a nucleotide sequence unrelated to anneal is not included in the number of bases subjected to Tm anneal.
  • the components d) and e) used in the method of the present invention can be used based on the conditions described above. Further, the method of the present invention is useful in a complementary strand synthesis reaction using a short primer, such as the GP method. Further, the present invention provides a stabilizer for oligonucleotide hybridization, which contains any one or both of the above-mentioned components and e) as an active ingredient. The stabilizer of the present invention is particularly useful for stabilizing the hybridization of an oligonucleotide having a small number of constituent bases. The method of the present invention or the stabilizer of the present invention Can be used for the method. For example, the short Annealing of primers is a typical example to which the method of the present invention can be applied.
  • the method of the present invention or the stabilizer can be used.
  • the method of the present invention or the stabilizing agent can also be applied when using a short oligonucleotide as a probe in various hybridization assays.
  • the method of the present invention, or the d) salts or e) denaturant constituting the stabilizer may be used alone or as a mixture of a plurality of compounds. It is considered that each of the compounds is stabilizing the primer ayur or improving the specificity by a different mechanism. Therefore, the effect of the stabilizer is enhanced by adding the surfactant, the detergent, and the salts.
  • the present invention relates to the use of the above components d) salts and e) denaturing agent in a phase capture synthesis reaction using short primers under low temperature conditions.
  • the low temperature condition in the present invention refers to a condition that is at least 10 ° C. lower than the Tm of the oligonucleotide to be hybridized. More specifically, the low temperature in the method of the present invention is, for example, 10 to 30 ° C., preferably 15 to 25 ° C., or 2 to 10 ° C. compared to the Tm of the oligonucleotide to be annealed. 0 to 25 ° C lower temperatures are included.
  • the short oligonucleotide according to the present invention usually has a length of 5 to 20 bases, for example, 7 to 15 bases.
  • FIG. 2 shows a conceptual diagram of the ambiguous primer.
  • the polysequence primer of Fig. 2 has a polysequence region at the 5 'end, so that it can anneal not only to a specific base sequence but also to a similar sequence similar to this. Can be.
  • a primer with a unique region and a unique region of 1: 1 was used at 98 ° C / 2 seconds, 40 ° CZ20 seconds, and 72 ° C / 20 seconds.
  • the protocol was carried out for 50 cycles to perform a complementary strand synthesis reaction.
  • the dissociation curve waveform of the extension product obtained by complementary strand synthesis was analyzed, and the effect of the polymorphic primer structure on the results was compared.
  • Ambiguous primers were evaluated based on two indicators of specificity and stability.
  • “highly specific” means that it is difficult to anneal to a region other than the portion selected as the target region.
  • the high specificity of the ambiguous primer causes a decrease in the diversity of extension products. As a result, the diversity of the waveform is lost. That is, it can be said that a polysemy primer having a reduced specificity is a desirable polysequence primer in the present invention.
  • the ambiguous primer is an aggregate composed of oligonucleotides having different base sequences.
  • the individual oligonucleotides that make up the aggregate The tide should anneal to the base sequence complementary to each base sequence.
  • the length of the ambiguous region is too long, the amount of the oligonucleotide corresponding to the target base sequence will decrease. That is, the possibility that sufficient complementary chain synthesis does not occur increases.
  • the specificity or stability of the primer was improved, but the diversity of the obtained dissociation curve was reduced. It was considered that the increased specificity did not sufficiently promote the phase capture synthesis reaction in a region other than the region selected as the target region.
  • the total primer length is 10 to 16 mer, the diversity of the waveform increases. However, specificity and stability have declined.
  • the total primer length was 9 mer or less, no synthesis reaction occurred. From these results, it was concluded that the range of 10 to 30 mer can be used as the primer length of the ambiguous primer of the present invention, and that the preferred length is 16 to 24 mer.
  • the ratio of the polymorphic region to the total length of the primer was 0.55 to 0.88, the waveform diversification increased but the stability decreased. If the conditions at this time are expressed in terms of the number of bases, the polymorphic region is 14 to 25 mer, and the specific region is 4 to 7 mer. In addition, when the ratio of the ambiguous region to the total primer length was 0.12 to 0.33, the diversity of the waveform was lost. If the conditions at this time are indicated by the number of bases, the polymorphic region is 4 to 7 mer, and the specific region is 14 to 25 mer.
  • the ratio of the polymorphic region to the total primer length is 0.89 or more, It was a random primer and did not undergo normal synthesis. If Shimese the conditions in the salt base, for example, ambiguous region 2 5 mer or more, and c also unique region is 3 mer or less, at a rate of ambiguous regions occupying the primer entire length to zero. 1 1 below the usual A synthesis reaction similar to the PCR primer was observed. In other words, almost only one type of complementary chain synthesis product was found. If the conditions at this time are represented by the number of bases, for example, the polymorphic region is 3 mer or less, and the unique region is 25 mer or more.
  • the ratio of the polymorphic region to the entire length of the primer is 0.333 to 0.55.
  • the specific region has a base sequence complementary to a target region selected from the test nucleic acid.
  • the length of the specific region is preferably 8 to 13 mer when the total length of the ambiguous primer is 16 to 24 mer.
  • the percentage of G C, which is occupied by G (guanine) or C (cytosine) in 5 bases including the 3 ′ end is 50% or more.
  • the stability of the terminal must be 15.5 to 19.5 kcal / mol or more.
  • annealing is possible even if there is a mismatch of 50% or less at the bases other than the 3 terminal 3 bases. At this time, if the stability of the mismatched portion is 12.0 Kcal / mol or less, the decrease in the synthesis efficiency can be ignored.
  • the ambiguous region is a region arranged to increase primers that can be annealed to a region other than the target region selected from the test nucleic acid.
  • the polysemy region has a base sequence in which a base complementary to the target region is replaced with another base.
  • the type of the base to be substituted is one to three arbitrary bases.
  • an ambiguity code shown in Table 1 is used to express the substitution of a base.
  • the structure of the ambiguous primer can be represented by a base sequence as shown in FIG. 3, for example.
  • the polysequence primer having the nucleotide sequence shown in FIG. 3 has a structure in which the polysemy in the polysemy region gradually decreases from 5 ′ to 3 ′. Length of ambiguous area
  • the primer is preferably 83mer when the total primer length is 16 to 24mer.
  • the above-mentioned aggregate of ambiguous primers including an ambiguous region is actually an aggregate of oligonucleotides having different base sequences. Therefore, the inclusion of one 2Ambiguity Code means that two kinds of oligonucleotides having different nucleotide sequences are actually contained. Therefore, the effective rate of annealing with type I nucleic acid is halved.
  • the base sequence SATT containing 2 Ambiguity Code: S (indicating C or G) means that it actually contains an oligonucleotide consisting of two types of base sequences, CATT and GATT. In this case, the amount of each effective primer is halved. Similarly, one 3 Ambiguity Code or 4 Ambiguity Code results in an effective primer amount of 1/3 or 14 respectively.
  • a sequence containing 3Ambiguity Code: B (indicating C, G or T) means that it contains an oligonucleotide consisting of three types of base sequences, CATT, GATT or TATT. I do.
  • the minimum primer amount is multiplied by the reciprocal of the effective primer amount, and this is divided by the number of bases in the polymorphic region and the mismatch rate of 4.
  • the number of bases in the ambiguous region is eight.
  • the minimum amount of primer is 1 ( ⁇ / ⁇ )
  • the method for calculating the amount of primer is an example, and is not limited to this method.
  • the Tm value refers to a temperature at which 50% of nucleic acids having complementary nucleotide sequences are in a base-paired state.
  • the Tm value of the specific region was calculated by the 2 (A + T) +4 (G + C) method, and the average of the polysemy region was calculated by the 2 (A + T) +4 (G + C) method. . These were combined to calculate the Tm value of the entire primer length.
  • the annealing temperature in the ordinary PCR method is about Tm minus 5 ° C.
  • the annealing temperature in the present invention is preferably set to a negative Tm value of about 20 ° C. in order to diversify the waveform pattern. Providing lower temperatures also makes it easier to anneal short primers. Experimentally, the divergence of the dissociation curve was significantly improved below 40 ° C. On the other hand, below 15 ° C, only random priming occurs, and almost no synthesis reaction is shown.
  • FIG. 1 is a diagram schematically illustrating a complementary strand synthesis method according to the present invention.
  • Figure 1 is a diagram schematically illustrating a complementary strand synthesis method according to the present invention.
  • (B) shows how a plurality of extension products form various mutual interference structures.
  • FIG. 2 is a diagram showing the structure of the polymorphic primer used in the present invention.
  • FIG. 3 is a diagram showing an example of the sequence of a polymorphic region of a polymorphic primer.
  • FIG. 4 shows the effect of the addition of a stabilizer on the waveform pattern in phase capture synthesis.
  • FIG. 4 (A) shows the waveform pattern without the stabilizer
  • FIG. 4 (B) shows the waveform pattern with the stabilizer added.
  • the vertical axis represents the fluorescence intensity differential value
  • the horizontal axis represents the temperature (° C).
  • FIG. 5 is a photograph showing the effect of the addition of a stabilizer in complementary strand synthesis on complementary strand synthesis.
  • FIG. 5 (A) shows the result of electrophoresis of the synthesized product when the stabilizer was not used
  • FIG. 5 (B) shows the result when the stabilizer was added.
  • the leftmost lanes of (A) and (B) are the 20 Obp ladder, and the two lanes on the right are the results of electrophoresis of sampnole (duplicate).
  • Fig. 6 schematically shows the positional relationship on the test nucleic acid of the ⁇ target region '' set for the design of the four types of waveform generation primer assemblies sPGBUP65, sPGBUPUPR, sPGBUPFX, and sPGBUPRX. .
  • stabilizers annealing stabilizers
  • Table 2 The effects of the annealing stabilizers (hereinafter referred to as “stabilizers”) shown in Table 2 will be described more specifically based on Examples.
  • stabilizers annealing stabilizers
  • Table 2 The present invention is not limited to the following embodiments, and various modifications can be made without departing from the gist of the present invention.
  • a primer, BAUP65 (SEQ ID NO: 6), that recognizes specific nucleotide sequences of bacterial DNA at multiple locations was created, and nucleic acids were identified based on the GP method.
  • the effect of the stabilizer was confirmed by comparing the waveform patterns with and without the stabilizer.
  • a reaction solution having a composition of “without stabilizer” and “with stabilizer” 50 ⁇ of each sample was added to perform a complementary strand synthesis reaction. The reaction was performed with a duplicate gate, and the waveforms of a total of four samples were observed. Using iCycler (manufactured by Biorad), a protocol of 98 ° CZ for 2 seconds, 25 ° C / 40 seconds, and 72 ° C / 10 seconds was performed for 50 cycles to synthesize a phase capture chain. After the reaction, the temperature of the temperature range of 75 to 95 ° C and the temperature step of 0.1 ° C were observed at each temperature for 8 seconds to draw the waveform of the dissociation curve of the synthesized product.
  • iCycler manufactured by Biorad
  • a buffer which enables specific annealing of a primer under low-temperature conditions. If the buffer of the present invention is used, a base-sequence-specific phase-trapping synthesis reaction can be expected even when a primer composed of a short base sequence of, for example, about 10 bases is used.
  • the use of short primers makes it possible to synthesize multiple regions of a test nucleic acid with a small number of primers.
  • the buffer of the present invention is useful for a nucleic acid analysis method that requires phase capture synthesis of a plurality of regions, such as the GP method.
  • the buffer of the present invention can be used in a phase capture synthesis reaction using a short primer. Low temperatures are required for annealing of short primers.
  • the buffer of the present invention has made it possible to efficiently perform annealing and complementary strand synthesis reaction under low temperature conditions.
  • Short primers are advantageous when specifically synthesizing multiple regions with a small number of primers. By mixing and using specific primers for each region, it is possible to synthesize multiple regions in one reaction system. However, synthesizing multiple primers causes an increase in cost. Also, a plurality of primers having a large number of constituent bases may have different Tm. In such a case, the stringency cannot be matched among a plurality of primers.
  • the effect provided by short primers can be expected.
  • the PCR method it may not always be possible to design primers of sufficient length. That is, if the base sequence information to be synthesized is insufficient, it is not possible to design a primer having a sufficient length.
  • the number of bases for a complementary strand synthesis reaction in the primer may be limited due to a base sequence incorporated for a purpose other than the phase capture synthesis reaction.
  • primers that incorporate a promoter or restriction enzyme recognition sequence are often used. In such a case, a small number of bases are required as primers for the phase capture synthesis reaction. If the buffer of the present invention is used, even with such primers, the PCR method can be performed efficiently.
  • the buffer of the present invention By using the buffer of the present invention to synthesize complementary strands in a plurality of regions with short primers, the stringency between primers can be easily matched. In addition, when the primer is short, it is expected that a plurality of regions may share a primer having the same nucleotide sequence. As described above, the significance of the present invention which enables specific complementary chain synthesis using short primers is significant.

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Abstract

硫酸塩、亜硫酸塩、リン酸塩、および炭酸塩からなる群から選択される少なくとも１種類の塩、および変性剤を組成に含む緩衝剤が提供された。本発明の緩衝剤は、低温条件下においてもプライマーのアニールと相補鎖合成を可能とする。本発明により、たとえば１０merのような短いプライマーを利用した、部位特異的な相補鎖合成が可能となる。本発明は、GP法に有用である。

Description

緩衝剤組成物 技術分野
本発明は、 核酸の合成反応に有用な緩衝液組成物に関する。 背景技術
DNA合成酵素や R A合成酵素を利用した、 核酸の相補鎖合成反応は公知である c 相捕鎖合成反応は、 铸型となる核酸にァニールしたプライマーの 3，末端に、 铸型 を構成する塩基と相補的な塩基を付加する反応である。 反応の結果、 铸型と鑤型 に相補的な塩基配列からなる 2本鎖核酸が生成される。 相補鎖合成反応は、 遺伝 子の単離や解析のための様々な操作に応用されている。
遺伝子の解析は、 相補鎖合成反応の主要な用途の一つである。 相補鎖合成反応 には、 まずプライマーのァニールが必要である。 言い換えれば、 プライマーがァ ニールしなければ相補鎖合成反応は進行しない。 この原理を利用して、 相補鎖合 成反応生成物を指標とする核酸の検出方法や同定方法が実用化されている （特公 平 4-67957·号公報） 。 たとえば PCR法に基づく遺伝子の検出方法は、 感度と特異 性に優れた遺伝子の検出方法として知られている。
PCR法に基づく遺伝子の検出方法においては、 検出対象の塩基配列に相補的な 塩基配列を有するオリゴヌクレオチドがプライマーとして利用される。 以下、 検 出対象として想定された塩基配列を標的塩基配列と記載する。 試料中に標的塩基 配列を含む核酸が存在すれば、 プライマーのァニールと相補鎖合成反応が進行す る。 しかし標的塩基配列を含む核酸が存在しなければ、 ァニールも相補鎖合成反 応も起こらない。 したがって、 PCR反応産物が検出されたときには、 標的塩基配 列の存在を証明することができる。 PCR法は、 標的塩基配列が明らかな場合には、 強力な解析ツールとなる。 その 反面、 たとえば、 比較すべき塩基配列が必ずしも明確でない場合には、 適切なプ ライマーをデザインすることができない。 更に PCR法は、 ある特定の塩基配列の 存在を証明する場合には、 優れた感度と特異性を発揮する。 このことは、 類似の 核酸を PCR法によって識別するためには、 両者の識別が可能な塩基配列を標的塩 基配列として選択しなければならないことを意味する。 そのため、 未知の核酸や、 きわめて類似性の高い核酸の間の相違を、 PCR法によって区別するには、 それを 可能とするプライマーのデザインが大きな課題となっていた。
PCR法の課題を解決するために様々な方法が提案されている。 本発明者らは、 P CR法の課題を解決するための方法として、 GP法 (Geno - Patern technology)を開発 した。 GP法は、 類似性の高い核酸の間の相違を明瞭に識別することができる核酸 の解析方法である。 GP法においては、 被検核酸の複数の領域について、 相補鎖が 合成される。 このとき、 各相補鎖はできるだけ 1本鎖として合成されるようにプ ライマーと相捕鎖合成反応がデザインされる。 その結果、 1つの反応系に相補鎖 を伴わない核酸が混在する状態が作り出される。
それぞれの核酸は、 異なる領域に由来しているため、 それぞれ異なる塩基配列 を含んでいる。 もしも部分的に相補的な塩基配列を含んでいるものがあれば、 両 者は互いにハイブリダィズする。 しかし完全な相補鎖ではないため、 ハイブリダ ィズは部分的な現象に過ぎない。 同様に、 一つの核酸の中でも、 相補的な塩基配 列があれば、 自身にハイブリダィズする場合もある。 こうして、 複雑に絡み合つ た核酸の集合体が構成される。 GP法における集合体を図 1に模式的に示した。 図
1においては、 「波形生成用プライマー」 で示したプライマーによって、 被検核 酸の複数の領域を铸型として相捕鎖が合成されている。 そしてこの合成産物が集 合体を構成する。
GP法は、 こうして構成された核酸の集合体を解析の対象とする。 すなわち、 こ の集合体の融解曲線の比較によって、 核酸が同定される。 GP法における核酸の集 合体は、 様々な組み合わせの 2本鎖核酸を含むため、 融解曲線には複数の融解温 度が記録される。 相補鎖合成反応の条件が同一であれば、 同じ被検核酸から得ら れる融解曲線のパターンは同一である。 融解曲線のパターンは被検核酸にュニー クなので、 融解曲線の比較により核酸の同定が可能となる。
さて、 GP法においては、 被検核酸の複数の領域について、 相捕鎖合成が行われ る。 そのためには複数のプライマーが必要である。 つまり、 合成すべき領域に対 してそれぞれ個別のプライ をデザインすればよい。 し力 し、 もしもより短い 塩基配列のプライ を利用することができれば、 複数の領域の間でプライ を共有できる可能性がある。 たとえば 7 merのプライマーは、 確率的には、 1 6 3 8 4塩基 ( 4 7) に 1回の割合でァニールすると期待できる。 すなわち、 たとえ ば 7 merの長さを有する 1種類のプライマーの利用によって、 （被検核酸の全長 1 6 3 8 4 ) 種類の合成産物を得ることができる。 反応に必要なプライマーの 種類が少ないことは、 経済的なメリットである。 また少ないプライマーで反応を 構成すれば、 各領域間のプライマーのアニーリングの条件を一定に保つことが容 易なので、 再現性の向上にも貢献するはずである。
しかし実際には、 相補鎖合成反応において、 短いプライ を铸型にァ させるためには様々な問題を伴う。 まず、 短いプライ は融解温度 （以下 Τπιと 省略する） が低いため、 低いアニーリング温度が必要である。 Tm (°C) は Wallac eの式" 2 (A+T) +4 (G+C)〃に基づいて導かれる（Thein and Wallace, The use ofsynt hetic oligo— nucleotide as specific hybridization probes in the diagnosis of genetic disorders. In human genetic deseases : A practical approach, ed. KE Davies, pp33- 50. IRL Press, Oxford, U )。
たとえば実施例に用いたプライ BAUP65 ; 5' -GGAAGGTGGGG-3' (配列番号： 6 / 1 1 mer) の Tmは、 3 8 °Cである（2 (2 [a]+l [t] ) +4 (0 [c]+8 [g] ) =38)。 PCR法な どにおけるプライマーのァ リング温度は、 一般的にはプライマーの Tmより 5 °C程度低い温度に設定される。 すなわち Tmが 3 8 °Cであれば、 3 3 °Cがァ リング温度となる。 PCRなどの一般的な相補鎖合成反応は、 通常 6 0 °C以上の温 度がアニーリングに利用される。 たとえば 5 0 °C以下といった低温条件下での相 補鎖合成反応には、 さまざまな障害が伴うことが知られている。
まずァニーリング温度の低下は、 非特異的なアニーリングの増加の原因となる。 つまり了ニーリング温度の低下に伴って、 相補的な塩基配列のみならず、 相補性 の低い塩基配列に対してもアニーリングしてしまう現象が増えてくる。 一方で、 低温条件下では、 プライマーの構造変化によってアニーリングが起こりにくくな ることが知られている。 たとえば、 温度の低下によるプライマー間の非特異的な 凝集、 あるいはプライマーの物理的な自由度 (flexibility)の低下などが、 相補鎖 合成を妨げると考えられている。 いずれにせよ、 1 0塩基前後という短いプライ マーを用いて相補鎖を合成することは、 現状では困難である。 そのため、 通常、 相補鎖合成のためのプライマーは、 少なくとも 2 0塩基前後の長さが必要とされ ている。
一方、 複数の領域の相補鎖合成のために、 ランダムプライマーが利用されてい る。 ランダムプライマーは、 1 O mer前後の長さを有するオリゴヌクレオチドの 集合体である。 ランダムプライマーを構成するオリゴヌクレオチドは、 任意の塩 基配列からなっている。 ランダムプライマーは、 一般には、 多型解析やプローブ の合成などに利用されている。 ランダムプライマーを使った相捕鎖合成反応には、 通常、 特異性が要求されない。 そのため低いストリンジエンシー条件の下で、 相 補鎖合成が行われる。 言い換えれば、 非特異的なアニーリングを積極的に誘導す るときに、 ランダムプライマーが利用されている。
GP法では、 複数の領域が、 特異的に再現性を維持して合成されることが望まし レ、。 相捕鎖が特異的に合成されなければ、 融解曲線の再現性の維持が難しくなる 可能性がある。 したがって、 ランダムプライマーの反応条件を GP法に応用するこ とはできない。 GP法のためには、 低温条件下での特異的な相補鎖合成反応を可能 とする技術が必要である。 発明の開示
本発明は、 低温条件における相補鎖合成反応に有用な緩衝剤組成物の提供を課 題とする。
PCR法などの相補鎖合成反応のために利用されている一般的な緩衝液の糸且成の
Figure imgf000006_0001
iMoleculer Cloning 3rd ed. Vol. 3 Appendix 1. 9, Joseph Sambr ook and David W. Russell, 2001, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NewYork) 0
lOx Amplification Buffer
500mM KC1
lOOmM Tris-HCl (pH 8. 3 at room temparature)
15mM MgCl2
ストリンジエンシーは、 温度条件に加えて、 塩濃度にも支配されている。 更に もしも溶液中に変性剤などのハイブリダィズに影響する成分が共存するときには、 これらの成分によってもス トリンジエンシーは変動する。 したがって、 温度を一 定に維持しつつ、 これらの成分の使用量を調節することによって、 ある程度、 ス トリンジエンシーを調節することは可能である。
たとえば、 塩濃度の低下はス トリンジエンシーを強める方向に作用する。 つま り塩濃度が高い条件は、 低い条件に比べてアニーリングが容易になる。 この現象 を利用して、 PCR法などでは、 しばしば Mg2+イオンの濃度を上げてストリンジ工ン シーを弱めることが試みられる。 反応が十分に進まないときには、 更にジメチル スルホキシド（dimethyl sulfoxide ;MS0)、 ポリエチレングリコール、 あるいはグ リセリンなどが反応増強のために添加される。 しかし、 これらの手法を組み合わ せても、 たとえば室温でのアニーリングは不可能である。
本発明者らは、 低温条件下で特異性を維持しつつ、 十分な相補鎖合成を可能と する緩衝剤を見出すために、 様々な添加剤の組み合わせについて見当を重ねた。 その結果、 一般的な相補鎖合成反応用の緩衝液を構成する 2価あるいは 1価の金 属塩に加えて、 特定の塩類を添加することで、 前記課題を解決できることを見出 した。 更に、 変性剤を添加することによって、 十分な相補鎖合成反応効率を達成 できることを確認して本発明を完成した。 すなわち本発明は、 以下の緩衝剤組成 物ならぴにその使用に関する。
〔1〕 下記の組成を含む、 核酸合成用緩衝剤組成物。
a) 核酸合成酵素による相補鎖合成反応に好適な pHを与える緩衝剤、 b) 0 . 1— 5 0 mMの Mg2+塩、 および Mn2+塩の！/、ずれか、 または両方 c) 1一 2 0 O mMの 1価の金属塩
d) 0 . 0 0 5〜0 . 5 Mの、 硫酸塩、 亜硫酸塩、 リン酸塩、 および炭酸塩 力 なる群から選択される少なくとも 1種類の塩、 および
e) 0 . 0 1 - 1 0 %w/vの変性剤
〔2〕 緩衝剤が、 7 . 5— 9の pHを与える緩衝剤である 〔1〕 に記載の組成物。 〔3〕 Mg2+塩が、 MgCl2である 〔1〕 に記載の組成物。
〔4〕 1価の金属塩が、 KC1、 および NaClのいずれか、 または両方である 〔1〕 に記載の組成物。
〔5〕 硫酸塩、 亜硫酸塩、 リン酸塩、 および炭酸塩が、 Na2S04、 Na2S03、 NaH2P04、 および NaHC03からなる群から選択されるいずれかの塩である 〔1〕 に記載 の組成物。
〔6〕 変性剤が、 非イオン系界面活性剤、 陰イオン系界面活性剤、 および洗浄剤 力 らなる群から選択される 〔1〕 に記載の組成物。
〔7〕 非イオン系界面活性剤が、 グリセリンエステルのポリオキシエチレンエー テル、 ソルビタンエステルのポリオキシエチレンエーテル、 ぉょぴソルビ トールエステルのポリオキシエチレンエーテルからなる群から選択される いずれかの非イオン系界面活性剤である 〔6〕 に記載の組成物。
〔8〕 洗浄剤が、 ドデシル硫酸塩、 ラウロイルサルコシン塩、 ラウリル酸塩、 お よびメルカプト酢酸塩からなる群から選択されるいずれかの化合物である 〔6〕 に記載の組成物。
〔9〕 合成すべき核酸が、 铸型となる核酸の複数の領域を铸型とする相補鎖であ る 〔1〕 に記載の組成物。
〔1 0〕 下記の成分 d)および e)のいずれか、 または両方の存在下で、 低温でオリ ゴヌクレオチドを相補鎖にァニーリングさせる方法。
d) 0. 0 1 -0. 1Mの、 硫酸塩、 亜硫酸塩、 リン酸塩、 および炭酸塩 からなる群から選択される少なくとも 1種類の塩
e) 0. 0 1 - 10%w/vの変性剤
〔1 1〕 低温条件が、 前記ォリゴヌクレオチドの融解温度よりも 1 0〜 30 °C低 い温度である 〔10〕 に記載の方法。
〔1 2〕 オリゴヌクレオチドが、 5_ 20塩基の長さを有する 〔10〕 に記載の 方法。
〔1 3〕 オリゴヌクレオチドが、 7— 1 5塩基の長さを有する 〔1 2〕 に記載の 方法。
〔14〕 オリゴヌクレオチドが、 铸型となる核酸の複数箇所にァニールするブラ イマ一である 〔1 0〕 に記載の方法。
〔1 5〕 下記の成分 d)および e)のいずれか、 または両方を有効成分として含有す る、 オリゴヌクレオチドのアニーリングの安定剤。
d) 0. 0 1— 0. 1Mの、 硫酸塩、 亜硫酸塩、 リン酸塩、 および炭酸塩 からなる群から選択される少なくとも 1種類の塩
e) 0. 0 1 - 1 0°/ow/vの変性剤
本発明は以下の組成を含む緩衝剤組成物に関する。
a) 核酸合成酵素による相捕鎖合成反応に好適な pHを与える緩衝剤、
b) 0. 1— 5 OmMの Mg2+塩、 および Mn2+塩のいずれか、 または両方
c) 1一 20 OmMの 1価の金属塩 d) 0 . 0 0 5〜0 · 5 Μの、 硫酸塩、 亜硫酸塩、 リン酸塩、 および炭酸塩からな る群から選択される少なくとも 1種類の塩、 および
e) 0 . 0 1— 1 0 °/ow/vの変性剤
本発明において、 オリゴヌクレオチドとは、 複数のヌクレオチドが連結した分 子を言う。 一方核酸は、 多数のヌクレオチドのポリマーを意味する。 核酸には、 D NAと RNAが含まれる。 オリゴヌクレオチドも、 DNA、 R A、 あるいは両者のハイブ リッド分子であることができる。 オリゴヌクレオチドが相捕的な塩基配列を有す る核酸にハイブリダィズして相補鎖合成の基点を与えるとき、 当該オリゴヌタレ ォチドを特にプライマーという。 そしてプライマーが铸型にハイブリダィズする ことを、 特にァニールと表現する。
本発明の緩衝剤組成物において、 前記組成 a) - c)は、 公知の相補鎖合成反応用 の反応液を構成する成分と同様の成分を利用することができる。 たとえば a)核酸 合成酵素による相補鎖合成反応に好適な pHを与える緩衝剤には、 中性〜弱アル力 リの PHを与える緩衝剤を利用することができる。 より具体的には、 現在市販され ている多くの DNAポリメラーゼの至適 pHは、 7 . 5— 9、 好ましくは 8— 8 . 5 である。 したがって、 この pHを与える緩衝剤は本発明に有用である。 本発明に有 用な緩衝剤として、 Tris-HClバッファーなどを例示することができる。 Tris - HC1 バッファーを用いる場合には、 たとえば 1—5 0 mM、 通常 5— 2 0 mM、 好ましく は 8— 1 5 mMの濃度とすることができる。 緩衝剤組成物を構成する組成の濃度は、 特に断りが無ければ、 最終濃度を表す。
次に、 組成 b) 0 . 1 - 5 O mMの Mg2+塩、 および Mn2+塩についても、 公知の相補 鎖合成反応用の反応液を構成する成分と同様の成分を利用することができる。 こ れらの金属イオンは、 DNAポリメラーゼの相補鎖合成活性の維持において、 重要 である。 本発明の組成物における Mg 2+塩、 および Mn2+塩は、 そのいずれか、 また は両方を組み合わせて利用することができる。 Mg2+塩、 および Mn2+塩として、 具体 的には、 MgCl2、 あるいは MnCl2を用いることができる。 これらの塩は、 通常 1— 5 OmM、 たとえば 0. 5— 2 OmM、 好ましくは 0. 8— 1 OmMを添加するこ とができる。 Mg 2+塩、 および Mn2+塩として複数種の塩を組み合わせるときには、 Mg 2+塩、 および Mn2+塩の合計濃度がこれらの濃度範囲となるように調節する。
また c) 1一 20 OmMの 1価の金属塩は、 一般にオリゴヌクレオチドのハイブリ ダイズの調節のために添加されている。 1価の金属塩には、 たとえばな およ び NaClなどが利用されている。 本発明の組成物における 1価の金属塩は、 単独で も複数種を組み合わせても良い。 これらの塩は、 通常 1一 200mM、 たとえば 5 -10 OmM, 好ましくは 10— 8 OmMを添加することができる。 1価の金属塩と して複数の塩を組み合わせるときには、 金属ィオンの合計濃度がこれらの濃度範 囲となるように調節する。
b)の 2価の金属イオンと、 c)に示した 1価の金属イオンは、 いずれもその濃度 の上昇とともに、 ストリンジエンシーは低下する。 したがって、 これらの金属ィ オンの濃度は、 目的とするアニーリングと相補鎖合成が可能な濃度に適宜調整す ることができる。 濃度の調整に当たっては、 オリゴヌクレオチドの Tmに加えて、 後に述べる d)および e)の使用量などの条件も考慮される。
本発明の組成物において、 次の組成 d)および e)は、 本発明の課題である低温条 件下でのプライマーのアニーリングのために必要な成分である。
d) 0. 005〜0. 5Mの、 硫酸塩、 亜硫酸塩、 リン酸塩、 および炭酸塩からな る群から選択される少なくとも 1種類の塩、 および
e) 0. 01-10%w/vの変性剤
本発明において、 硫酸塩、 亜硫酸塩、 リン酸塩、 および炭酸塩としては、 たと えば Na2S04、 Na2S03、 NaH2P04、 および NaHC03からなる群から選択されるいずれか の塩を用いることができる。 これらの塩は、 単独で、 あるいは異なる塩を組み合 わせて本発明の緩衝剤組成物に利用することができる。 これらの塩の濃度は、 通 常 0· 005〜0. 5M、 たとえば 0. 01〜0. 1M、 より具体的には 0. 03 〜0. 05Mとすることができる。 硫酸塩、 亜硫酸塩、 リン酸塩、 および炭酸塩 として複数種の塩を組み合わせるときには、 塩類の合計濃度がこれらの濃度範囲 となるように調節する。
一方、 本発明における変性剤とは、 核酸の高次構造を解消する作用を有する化 合物である。 核酸は、 たとえば、 1本鎖のポリヌクレオチドであっても、 高次構 造を有する場合がある。 特に温度が低い状態では、 単純な鎖状構造ではなく、 さ まざまな高次構造を有していると考えられている。 変性剤は、 核酸の高次構造の 解消によって、 オリゴヌクレオチドのアニーリングを助ける作用を有していると 考えられる。
本発明における変性剤として、 非イオン系界面活性剤、 陰イオン系界面活性剤、 および洗浄剤を示すことができる。 非イオン系界面活性剤は、 エーテル型、 エー テルエステル型、 エステル型、 および含窒素型に分類される。 これらの非イオン 型界面活性剤の中では、 エーテルエステル型の非イオン系界面活性剤が好ましい c より具体的には、 グリセリンエステルのポリオキシエチレンエーテル、 ソルビタ ンエステルのポリオキシエチレンエーテル、 およびソルビトールエステルのポリ ォキシエチレンエーテルをエーテルエステル型の非イオン系界面活性剤として示 すことができる。 エーテルエステル型の非イオン系界面活性剤には、 ポリオキシ エチレングリセリン脂肪酸エステル、 ヒマシ油、 ポリキシエチレンソルビタン脂 肪酸エステル、 ポリオキシエチレンソルビトール脂肪酸エステル、 ポリオキシェ チレン脂肪酸アル力ノールアミド硫酸塩などが含まれる。 本発明において、 特に 好ましいエーテルエステル型の非イオン系界面活性剤は、 ポリキシエチレンソル ビタン脂肪酸エステルである。 以下に本発明の組成物に利用することができる巿 販の非ィオン系界面活性剤を例示する。
ポリオキシエチレンァノレキノレエーテノレ ：
NIKKOL BL-9EX (Polyoxyethylene (9) Lauryl Ether)
Brj35 (Polyoxyethylene (23) Lauryl Ether)
ポリオキシエチレンァノレキノレフェニノレエーテノレ ： TRITON X- 114 (Polyoxyethylene (8) Octylphenyl Ether) TRITON X- 100 (Polyoxyethylene (8) Octylphenyl Ether)
NP-40 (Polyoxyethylene (9) Octylphenyl Ether)
ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル：
TWEEN 20 (Polyoxyethylene (20) Sorb i tan Monolaurate)
TWEEN 80 (Polyoxyethylene (20) Sorbitan Monooleate)
TWEEN 40 (Polyoxyethylene (20) Sorbitan Monopalmitate)
TWEEN 60 (Polyoxyethylene (20) Sorbitan Monostearate)
TWEEN 85 (Polyoxyethylene (20) Sorbitan Trioleate)
一方本発明に利用可能な陰イオン系界面活性剤としては、 スルホン酸塩、 カル ボン酸塩、 硫酸エステル塩、 あるいはリン酸エステル塩などの界面活性剤を示す ことができる。 更に以下に示す洗浄剤も本発明の組成物に利用することができる これらの洗浄剤は、 ナトリゥム塩以外の塩を利用することもできる。
ドデシル硫酸ナトリゥム（Sodium Dodecyl Sulfate ; SDS)
ラウロイノレサノレコシンナトリウム (Sodium N-Lauroyl Sarcosinate) ラウリノレ酸ナトリウム（Sodium Laurate)
メルカプト酢酸ナトリウム （Sodium Mercaptoacetate)
変性剤の反応液における濃度は、 ァユールさせるべきプライマーを構成する塩 基配列や、 相補鎖合成反応の温度に応じて、 適宜調節することができる。 一般的 には 0 . 0 1 %W/V〜 1 0 %W/V、 例えば 0 . 5 %W/V〜 5 %W/V、 より具体的には 1 %W/ V〜 3 %W/Vとなるように添加することができる。
本発明の緩衝剤組成物には、 核酸の相補鎖合成に利用される付加的な成分を含 むことができる。 付加的な成分の例を以下に示す。
相補鎖合成のための基質
酵素の保護剤
核酸の相補鎖合成には、 dXTP (dATP、 dTTP、 dCTP、 および dGTP) が基質として 必要である。 あるいは合成の目的に応じて、 ヌクレオチド誘導体や標識されたヌ クレオチドを利用することもできる。 酵素の保護剤は、 相補鎖合成を触媒する酵 素の保護を目的として添加される化合物である。 具体的には、 ゥシ血清アルブミ ンなどの不活性蛋白質、 あるいは DMS0などの界面活性剤が、 酵素の保護作用を有 する。
また本発明の緩衝剤組成物には、 相補鎖合成の成果物の解析に必要な物質を加 えておくことができる。 たとえば遺伝子の解析方法の一つである GP法では、 ィン ター力レーターは反応産物の解析における重要な指示薬である。 2本鎖の核酸に 結合してシグナルを生成する化合物を、 インターカレーターという。 インター力 レーターとしては、 ェチジゥムブロマイド （臭化工チジゥム） 、 あるいは入手可 能な商品としてサイバーグリーン （Molecular Probe社製） が知られている。 更に、 本発明の緩衝剤組成物には、 相補鎖合成のためのプライマーをあらかじ め添加しておくこともできる。 本発明の緩衝剤組成物は、 核酸の相補鎖合成に有 用である。 相補鎖合成のためのプライマーは、 鎳型となる核酸の塩基配列に合わ せて適宜デザインされる。 予め铸型とする核酸の塩基配列が明らかな場合には、 本発明の緩衝剤組成物中に、 相補鎖合成のためのプライマーを含有させた状態で 流通させることができる。 あるいは、 ユーザーの指定する塩基配列のプライマー を合成し、 本発明の緩衝剤組成物中に組み入れることもできる。
更に本発明の緩衝剤組成物には、 相捕鎖合成を触媒する核酸合成酵素をも添カロ することができる。 基質、 プライマー、 および核酸合成酵素を含む緩衝剤組成物 には、 铸型となる核酸を加えるだけで、 相補鎖合成を開始することができる。 あ るいは、 基質と核酸合成酵素を含む緩衝剤組成物においては、 プライマーと铸型 となる核酸を加えることによって、 目的とする相補鎖合成反応を開始することが できる。 これらの付加的な成分は、 いずれも最終的な反応に必要な濃度を添加し ておくことができる。
本発明の緩衝剤組成物は、 任意の剤型で供給することができる。 具体的には、 液状、 粉末、 あるいは錠剤とすることができる。 液状製剤には、 最終濃度に調整 されたものと、 濃縮されたものが含まれる。 たとえば 1 0倍濃度で各組成を含む 液状の濃縮組成物は、 使用時に 1 0倍に希釈して利用される。 あるいは、 本発明 の緩衝剤組成物に含まれる固体成分を混合して、 粉末あるいは錠剤の形で供給す ることができる。 ユーザーは、 指定された容量の溶媒で粉末あるいは錠剤を溶解 することによって、 最終濃度に調整された緩衝剤組成物を得ることができる。 緩 衝剤として Tris-HClを用いる場合には、 溶解のための溶媒として Tris - HC1を指 定することができる。
本発明の緩衝剤組成物は、 プライマーのアニーリングをともなう相補鎖合成反 応のための反応液として利用することができる。 本発明の緩衝剤組成物は、 特に、 構成塩基数の少ないオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いる場合に有用で ある。 通常、 プライマーのァニーリングは、 Tmよりも 5 °C程度低い温度で行われ る。 しかし構成塩基数の少ないォリゴヌクレオチドは Tmが低い。 低温では非特異 的なアニーリングや、 オリゴヌクレオチドの高次構造などが原因となって、 相捕 鎖合成が進行しなくなる。 あるいは相補鎖合成が可能な条件を与えたとしても、 非特異的な合成産物が目立っため、 目的とする合成産物を特異的に合成すること が難しい。 本発明の緩衝剤組成物を用いれば、 これらの障害を解消することがで さる。
構成塩基数の少ないオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いる相補鎖合成 反応を必要とする核酸の解析方法として、 GP法を示すことができる。 図 1に示す ように、 GP法は、 被検核酸の複数の領域を铸型として合成された相捕鎖の集合体 を解析対象とする。 複数の領域を合成するための方法の一つに、 構成塩基数の少 ないプライマーを、 複数の場所にァニールさせる方法がある。 プライマーを構成 する塩基の数が少なければ、 プライマーに相補的な塩基配列が被検核酸中に存在 する可能性が高まる。 その結果、 単一のプライマーが複数の領域においてプライ マーとして作用することができる。 GP法の実施に当たっては、 たとえば以下のような考え方に基づいて、 相捕鎖合 成すベき複数の領域が選択される。
複数の領域は、 比較すべき核酸の間で塩基配列の相違があることが期待できる 領域を含むことが望ましい。 比較の対象とする核酸が多種類である場合、 各核酸 の合成対象領域の塩基配列は、 少なくともいずれかの領域で他の核酸との相違が 含まれるようにデザインするのが好ましい。 塩基配列の相違は、 複数の領域の全 てにおいて含まれなくても良い。 たとえば、 3つの核酸 X、 Y、 および Ζについて a-cの 3つの領域について合成するとする。 各領域の塩基配列に相違が含まれる ことを'で示す。 以下の例では、 核酸 Yが他の核酸と異なる塩基配列からなる b' を、 また核酸 Zが を有している。 これらの領域を合成することにより、 3者の 識別が可能となる。 '
核酸 X： [a ] - [b ] - [c ]
核酸 Y : [a ] - [b，] - [c ]
核酸 Z： [a ] - [b ] - [c' ]
GP法に基づく核酸の同定方法において、 前記複数の領域は、 被検核酸からでき るだけ多様な塩基配列情報を特異的に取り出すことが望まれる。 つまり、 被検核 酸の間で、 できるだけ塩基配列の相違している部分が多く合成される方が好まし い。 したがって、 たとえば前記核酸 X-Zの例においては、 a- cのできるだけ多く の領域において、 相互に塩基配列が異なっている方が、 好ましい。
たとえば微生物やウィルスのようなゲノムサイズが限られている生物種では、 ゲノムの塩基配列情報が既に明らかにされているものも少なくない。 これらの生 物種については、 予め、 比較の対象となる生物種の間で、 他の種との間で、 塩基 配列が相違する領域を選択することができる。 また、 ゲノムの塩基配列情報が不 十分な場合であっても、 既に明らかにされているゲノムや、 遺伝子の情報に基づ いて、 塩基配列の相違する領域を選択することは可能である。
なお複数の領域は、 再現性を有する方法で合成されることが好ましい。 本発明 において、 相補鎖合成の再現性とは、 同じ領域が相補鎖合成の铸型として利用さ れることを言う。 相補鎖合成反応の原理によっては、 合成産物の長さの均一性を 保障できない場合があるかもしれない。 本発明においては、 铸型として同じ領域 が利用されていれば、 合成産物の長さの変動は許容できる。 本発明における再現 性を有する相補鎖合成反応とは、 あるプライマーが特異的に相補鎖合成を開始す ることであると言うこともできる。 したがって本発明の相補鎖合成反応は、 ラン ダムプライマーによる相補鎖合成反応とは区別される。
複数の核酸について複数の領域を合成する以上、 各核酸が同じ条件で合成され るべきであることは言うまでも無い。 したがってプライマーと DNAポリメラーゼ を用いた相補鎖合成反応によって複数領域を合成する場合には、 プライマーのハ イブリダイゼーションの特異性は維持されることが望まれる。
核酸の合成方法は、 铸型依存性の合成方法であれば、 特に限定されない。 被検 核酸が 2本鎖からなる場合には、 前記複数の領域は、 センス鎖、 あるいはアンチ センス鎖を鎵型として合成することができる。 複数の領域の全てが、 センス鎖あ るいはアンチセンス鎖を鎵型として合成されても良いし、 両者を铸型として合成 することもできる。
続いて、 GP法のための伸長産物を得る方法について説明する。 伸長産物を得る ための代表的な方法として、 DNAポリメラーゼを利用した相捕鎖合成反応を利用 することができる。 GP法においては、 被検核酸の複数の領域を合成するために、 被検核酸の複数の領域にァニールすることができるプライマーを利用する。 GP法 において、 被検核酸の複数の領域にァニールすることができるプライマーから、 相補鎖合成反応によつて合成された伸長生成物を伸長産物という。 伸長産物は、 被検核酸の複数の領域を铸型として合成された、 ポリヌクレオチドの集合体であ る。 したがって伸長産物を構成する各ポリヌクレオチド鎖の塩基配列は相互に異 なる。 ただし、 相捕鎖合成反応が繰り返されたときには、 同じ塩基配列を含むポ リヌクレオチド鎖が複数分子生成される。 また、 異なる領域に同じ塩基配列を有する被検核酸を錄型として場合には、 同 じ塩基配列を含む伸長産物が生成される可能性もある。 しかし本発明においては、 解離曲線の多用な波形パターンを得ることが望ましいため、 伸長産物の塩基配列 はできるだけ相違を含むようにデザィンすることが望ましい。
被検核酸の複数の領域にァニールし、 複数の領域の相補鎖合成を可能とするプ ライマーを、 GP法では波形生成用プライマーという。 GP法の波形生成用プライマ 一は、 被検核酸の複数の領域の相補鎖合成に利用されるとともに、 相捕鎖合成の 結果として、 異なる塩基配列からなる伸長産物の混合物を与える。 GP法における 異なる伸長産物の混合物とは、 好ましくは解離曲線を解析したときに複数の Tmを 与えるポリヌクレオチドの混合物を言う。
GP法における波形生成用プライマーは、 次のように定義することもできる。 す なわち GP法の波形生成用プライマーは、 被検核酸上の複数箇所に出現する特定の 塩基配列領域に相補的な塩基配列を含むオリゴヌクレオチドであって、 同一の条 件下で被検核酸上の複数の領域において、 鏡型依存性の DNAポリメ一ラーゼによ る相補鎖合成を開始することができる。 波形生成用プライマーの塩基配列の少な くとも一部は、 前記特定の領域に対して相捕的な塩基配列からなる。 前記特定の 領域に対して相補的な塩基配列は、 オリゴヌクレオチドの任意の領域に配置する ことができる。 すなわち、 たとえばオリゴヌクレオチドの 3，末端を含む領域、 末 端を含まない中間の領域、 そして 5'末端を含む領域に配置することができる。 被検核酸の複数の領域にァニールすることができるプライマーのデザィン方法 として、 たとえば次のような方法を示すことができる。 以下のような考え方に基 づいてプライマーをデザィンすれば、 単純に複数の領域の相補鎖合成に必要なプ ライマーを混合するよりも、 プライマーを容易に合成することができる。
複数の領域にァニールする 1種類のプライマー：
単一のプライマーであっても、 適当な塩基配列を選択すれば、 被検核酸の複数 の部位にァニールすることができる。 通常、 配列特異的なアニーリングのために は、 2 0— 5 0塩基のオリゴヌクレオチドがプライマーとして用いられる。 この ような長さのオリゴヌクレオチドは、 ストリンジェントな条件下では、 複数の部 位にァニールする可能性はきわめて低い。
ところが、 より少ない塩基数のオリゴヌクレオチドを用いれば、 複数の位置に ァニールする可能性が高まる。 たとえば 3〜 8塩基からなるオリゴヌクレオチド がァニールしうる領域は、 計算上は、 1/64 ( 43) 〜1/65536 ( 48) の確率で存在す ることになる。 つまり、 短いプライマーは、 単一で用いても複数領域の相補鎖合 成を可能とする。
このような複数領域にァニール可能な 1種類のプライマーの設計は、 対象とす るゲノムの塩基配列情報より、 対象ゲノム中に出現頻度の高い 3から 1 0数塩基 よりなる短い塩基配列を検索し、 出現頻度の高い順に上位候補とすることにより 可能となる。 出現頻度をカウントするゲノム領域は、 すべての塩基配列情報を対 象としてもよいし、 特定の関心領域に対象を絞ってもよい。
複数の領域にァニールする 2種類以上のプライマー：
铸型となる核酸の塩基配列が明らかであれば、 複数の領域を合成するために 各々の箇所にァニールする複数のプライマーをデザィンすることは容易である。 しかし GP法においては、 より多くの領域について相捕鎖合成が必要な場合もある。 合成すべき領域の増加に伴って、 必要なプライマーの数も増えてしまう。 一方で、 反応系に添加することができるオリゴヌクレオチドの量には上限がある。 また多 様なオリゴヌクレオチドを合成するのは経済的にも不利である。 そこで本発明者 らは、 多くの領域の相補鎖合成をできるだけ少ない種類のプライマーで合成でき る方法について、 検討した。 その結果、 以下に示すようなプライマーのデザイン が有効であることを見出した。
まず、 できるだけプライマー間の塩基配列が共通となるように、 合成すべき領 域を選択する。 たとえば以下の例においては、 プライマーをァニールさせるため の 2つの領域が選択されている。 これらの塩基配列は、 2種類の抗酸菌 A ( ^co ¾ cterium 's)および B {Mycobacterium kansasii)のゲノムから選択された。 レヽ ずれも、 ゲノム上の異なる位置にありながら、 互いに塩基配列の類似性が高い (一致している塩基を大文字で示した） 。
抗酸菌 A： AGcTcGTAAa (配列番号： 1 )
抗酸菌 A： AGtTcGTAAt (SS列番号： 2 )
抗酸菌 B ： AGgTtGTAAa (配列番号： 3 )
抗酸菌 B ： AGtTcGTAAa (配列番号： 4 )
この例では、 3、 5、 および 1 0塩基目の塩基が相違し、 それ以外の塩基は一 致している。 これらの相違している塩基を多義コード（ambiguity code)で表現す れば、 agBtYgtaaW (配列番号： 5 ) となる。 本発明において、 多義コードとは、 ある位置に複数種の塩基を割り当てるための記号である。 本発明において、 多義 コードで表現されたオリゴヌクレオチドは、 当該多義コードの位置において、 多 義コードによって表される全ての塩基の組み合わせを含む混合物であることを意 味している。 ここで用いた多義コードはそれぞれ次の塩基に対応している。
B=c. g. t Y=c, t W=a, t
すなわち、 共通性の高い塩基配列（agBtYgtaaW)の選択によって、 この例では 1 菌種当たり 2箇所の相補鎖合成を可能とできた。 本発明において、 多義コードで 表現された塩基配列を有するプライマーを多義プライマーという。
通常、 4つの領域の相補鎖合成のためには、 各領域にァユールする 4種類のプ ライマーが必要である。 ところがここに示した例においては、 1種類の多義プラ イマ一によつて 4つの領域の相補鎖合成が可能となった。 多義プライマーは、 異 なる塩基配列を有するオリゴヌクレオチドの集合体である。 しかし操作上は、 単 一のオリゴヌクレオチドと同様の操作によって合成され、 相補鎖合成においても 単一のオリゴヌクレオチドとして利用することができる。
更にこのような考え方に基づいて、 ゲノム内の複数の特定の関心領域に対し、 共通の 1種類からなる多義プライマーの設計を行うことも可能である。 上記の抗 酸菌 A， Bにおける事例を例に採れば、 A， Bの種間差をもっとも顕著に示す塩 基配列を選択することにより、 菌種同定という目的を達成した。 一方、 この設計 方法は更にまったく別の関心領域、 例えば薬剤耐性に関わる情報を、 同時に取得 するための手段を提供する。 すなわち、 複数の関心領域に対し各々出現頻度の高 い塩基配列候補を選択し、 次にそれら上位候補間の塩基配列の中から更に共通性 の高い塩基配列を選択することにより、 複数のまったく独立した情報を同時に得 ることが可能な、 1種類の多義プライマーの設計を可能とする。
さて、 一般に、 錶型となる核酸の塩基配列の一部が不明なときに、 しばしば縮 重プライマー（degenerate primer)が利用される。 縮重プライマーの塩基配列も本 発明における多義プライマーと同じように表記される。 しかし多義プライマーは 異なる塩基配列を有する複数領域の合成を目的としている。 他方、 PCRクロー二 ングなどに用いられる縮重プライマーは、 通常、 1種類の铸型に対して 1種類の 核酸の合成を目的としている。 クローユング （すなわち遺伝子の単離） を目的と する場合には、 多様な合成産物を生成するプライマーは望ましくない。 このよう に多義プライマーと縮重プライマーとでは、 そのデザインの目的がまったく異な つている。 他方、 縮重プライマーを GP法における波形生成プライマーとして利用 することは可能である。
以上の例では、 被検核酸の塩基配列から、 できるだけプライマーの種類を少な くすることが可能な領域を選び出した。 言い換えれば、 被検核酸に依存したデザ イン方法である。 したがって、 被検核酸および比較対象となる核酸の塩基配列に よっては、 適用が難しい場合もあるかもしれない。 これに対して、 以下に述べる 方法は、 被検核酸および比較対象となる核酸の塩基配列の影響を受けず、 比較的 容易に複数のプライマーをデザィンしうる方法である。
前記の多義プライマーは、 铸型となる核酸の塩基配列に合わせて多義コードを 配置した。 これに対して、 プライマーの 5'側に多義コードを配置して、 被検核酸 の複数の領域にァニールすることができる波形生成用プライマー集合体を得るこ ともできる。 すなわち GP法においては、 下記の特異プライマーおよび多義プライ マーを含む波形生成用プライマー集合体を利用することができる。
特異プライマー：铸型核酸の標的領域に相捕的な塩基配列を含む
多義プライマー：次の特異領域および多義領域を含む少なくとも 1種類の多義プ ライマー
特異領域：オリゴヌクレオチドの 3，末端を含み、 前記標的領域に対して相補的 な塩基配列で構成される
多義領域：特異領域の 5'側に配置され、 前記標的領域に対して相補的な塩基配 列を構成する塩基が当該塩基以外の塩基で置換された塩基配列を含む
GP法における特異プライマーは、 铸型核酸の標的領域に相捕的な塩基配列を含 むオリゴヌクレオチドまたはその誘導体からなる。 誘導体とは、 付加的な塩基配 列を有するオリゴヌクレオチド、 あるいは修飾されたオリゴヌクレオチドが含ま れる。 オリゴヌクレオチドは、 蛍光物質、 放射活性物質、 あるいは結合性リガン ドなどで修飾することができる。
GP法における標的領域は、 鍚型核酸に相捕鎖合成のためのプライマーがァニー ルするべき領域を言う。 つまり標的領域は、 錶型核酸の合成すべき領域の 3'側に 位置する領域である。 铸型核酸の合成すべき領域は、 先に述べたように、 GP法に よる核酸の同定方法において、 被検核酸に固有の波形パターンを生じることが期 待できる領域として選択された領域であることが望ましい。 このような領域は、 比較対象である核酸との、 塩基配列の相違を含む領域を中心として、 選択するこ とができる。 一方で、 できるだけ少ない種類のプライマーで複数の領域を合成す るためには、 たとえば異なる位置に見出される相同性の高い塩基配列を標的領域 として選択することができる。 しかしながら、 GP法に基づく波形生成用プライマ 一集合体の利用によって、 標的領域との相同性が低い領域に対してァニールする ことが可能なプライマーを提供することもできる。 その結果、 単一の標的領域を 選択した場合であっても、 铸型核酸の複数の領域の相補鎖合成が可能な波形生成 用プライマー集合体を得ることができる。
一方、 以下に述べる多義プライマーにおいて、 3'側の多義コードを含まない領 域を特異領域、 5'側の多義コードを配置した領域を多義領域という。 特異領域は、 特異プライマーの 3'末端を含む領域を構成する塩基配列と同一の塩基配列で構成 される。 すなわち、 多義プライマーと特異プライマーの 3'末端を含む塩基配列は 共通である。 特異領域を構成する塩基の数は制限されない。 特異領域の長さは、 多義領域の条件に応じて適宜設定することができる。 たとえば、 多義プライマー 全体の長さの 2 0〜 9 0 %の範囲で、 特異領域の長さを選択することができる。 多義領域を構成する多義コードは、 たとえば 4塩基多義 (N)の連続とすることも できるし、 被検核酸の塩基配列に合わせて、 抗酸菌の例で述べたように適宜必要 な多義コードを配置することもできる。 更に、 以下に述べるように、 プライマー の 3'側から 5'側にかけて多義領域のバリエーションを段階的に増やすこともでき る。
このようにしてデザインされた多義プライマーは、 被検核酸の多くの領域に対 して、 高い再現性でァニールし、 複数領域の相補鎖合成産物を与える。 多義領域 のバリエーションを段階的に変化させることにより、 相捕鎖合成において、 反応 特異性を左右する 3'側の多義性を小さくする一方で、 比較的特異性に対して影響 を与えにくい 5'側においてプライマーの塩基配列に多様性を与えることができ 5C このような構造的な特長により、 多様な塩基配列に対して安定にァニールするこ とができるプライマーの集合体とすることができる。
—方、 プライマー集合体を構成する個々のオリゴヌクレオチドは、 3'側の多様 性が低くなるようにデザインされている。 その結果、 各オリゴヌクレオチドの塩 基配列に対して相捕的な塩基配列に選択的にァニールし相補鎖合成を開始する。 つまり、 幅広い塩基配列について、 それぞれ特異的に、 かつ安定に相補鎖合成を 開始することができるのである。
多義領域における多義性を段階的に変化させた多義プライマーとして、 次の構 造を示すことができる。 すなわち、 多義領域の塩基配列が次の 3つの領域からな り、 それぞれの領域を構成する置換塩基配列の全ての組み合わせを含む多義ブラ ィマーの集合体は GP法の波形形成用プライマー集合体として有用である。
(1) N領域：多義領域の 5'末端を構成し、 その塩基配列を構成する各塩基は前記 標的領域の塩基配列に相補的な塩基に代えて、 アデニン、 シトシン、 グァニン、 およびチミンから選択される当該塩基以外の任意の 3種類のすべての塩基で置換 された塩基である
(2) 3多義領域： N領域の 3'側に配置され、 その塩基配列を構成する各塩基は前 記標的領域の塩基配列に相補的な塩基に代えて、 アデニン、 シトシン、 グァニン、 およびチミンから選択される当該塩基以外の任意の 2種類の塩基のすべてで置換 された塩基である
(3) 2多義領域： 3多義領域の 3'側に配置され、 その塩基配列を構成する各塩基 は前記標的領域の塩基配列に相補的な塩基に代えて、 アデニン、 シトシン、 グァ ニン、 およびチミンから選択される当該塩基以外の任意の 1種類の塩基で置換さ れた塩基である
図 3に示す多義プライマー (NNVHDBSS)において、 多義領域は、 5'末端側から 3' 側にかけて段階的に多義性が高まるようにデザインされている。 すなわち、 5'末 端側には、 A (アデニン） 、 C (シトシン） 、 G (グァニン） 、 および T (チミ ン） の何れかを示す Ambiguity Codeである Nで構成される N領域が存在する。 N 領域は、 標的領域に対して相補的な塩基をそれ以外の 3種類のいずれかの塩基に 置換した領域と言うこともできる。
N領域に続いて、 標的領域に対して相補的な塩基をそれ以外の 2種類の塩基で 置換した 3多義領域（3 ambiguity region; 3AR)が配置されている。 更に 3ARの 3' 側に、 標的領域に対して相插的な塩基をそれ以外の 1種類の塩基で置換した 2 多義領域 (2 ambiguity region; 2AR)が配置されている。 図 3の例では、 5，末端側 の 2つの Nが N領域を構成し、 続く V， H, D， Bの 4塩基分が 3AR を構成する c そして、 3，側の 2つの Sが 2ARを構成する。 このような多義領域の構造により、 3， 側から 5' 末端にかけて多義性を高めることができる。 言い換えれば、 このよ うな構造によって、 5' 側から 3' 末端にかけて特異性を高めることができる。 GP 法に用いる多義コードと実際の塩基の対応は表 1にまとめた。
GP法の多義プライマーにおいて、 N領域の長さは 2 ~ 4塩基が好ましい。 N領 域の塩基数が 5塩基以上になると、 ダイマー、 ループ等のプライマー相互干渉が 出現しやすくなる可能性が高まる。 また、 3ARの配列は、 DHVB、 HDVB、 VHDB、 HVD Bの順に安定性が高い。 このように、 3，側における G又は Cの割合を高めた方が 安定性が高くなる。
次に 2ARの配列も、 標的領域の塩基配列を考慮して設計する必要がある。 なお、 N領域、 3AR、 2ARの長さの比は、 1 : 2 : 1が好ましいがこれに限定されない。 プライマー集合体を構成する多義プライマーの多義領域の長さは、 プライマー を構成する塩基数の 1 0 %〜8 0 %であることが好ましい。 またプライマー集合 体を構成する多義プライマーの特異領域おょぴ多義領域の長さの合計は、 1 0〜 3 0塩基であることが好ましい。
多義プライマーを含む GP法の波形生成用プライマー集合体は、 前記標的領域と して、 少なくとも 1つの領域を設定し、 当該領域の塩基配列に基づいてデザイン することができる。 標的領域を複数選択することもできる。 この場合、 特異ブラ イマ一の種類が増え、 それに応じて多義プライマーの種類も増えることになる。 標的領域として複数の領域を選択した場合、 波形生成用プライマー集合体は、 同 時にまたは個別に相補鎖合成に用いることができる。 波形生成用プライマ一集合 体を用いることによって、 波形の多様性を高めることができる。 すなわち、 GP法 の核酸の識別能力を高めることができる。
たとえば図 6に示した 4種類の波形生成用プライマー集合体 sPGBUP65、 sPGBUP UPR、 sPGBUPFX、 および sPGBUPRXは、 それぞれ異なる標的領域についてデザイン されている。 仮に各波形生成用プライマー集合体によって各々 1 5.種の異なる波 形パターンが得られるとすると、 理論上は、 5 0， 6 2 5種類 （1 5 X 1 5 X 1 5 X 1 5 ) の波形パターンが得られることを意味する。 このことは、 1 5種類の 波形パターンを生成することができる 4とおりの波形生成用プライマー集合体の 利用によって、 GP法に基づく核酸の同定方法が、 5万種類以上の核酸の識別でき ることを示している。
複数の領域に対してデザインされた複数種類の波形生成用プライマー集合体は、 集合体同士の混合物として、 あるいは集合体毎に独立して相補鎖合成に利用する ことができる。 独立して相補鎖合成に用いることによって、 波形パターンとブラ イマ一集合体の関係を、 明確に知ることができる。 すなわち、 ある領域 Aに基づ いてデザインされた波形生成用プライマー集合体 Aと別の領域 Bに基づいてデザ インされた波形生成用プライマー集合体 Bとは、 混合しないで個別に相捕鎖合成 に用いるのが好ましい。
上記のような、 複数の領域において相補鎖合成を開始することができるいずれ かのプライマーを、 相補鎖合成が可能な条件下で铸型核酸とインキュベートする ことにより、 相補鎖合成が開始される。 相補鎖合成が可能な条件とは、 次の条件 が満たされることを言う。
鏡型核酸に前記プライマーがァニールすることができる、
铸型依存性の DNAポリメラーゼの触媒活性が維持される、 および
相補鎖合成のための基質が供給される。
ここで、 前記プライマーの構成塩基数が少ないために、 低い Tmを採用せざるを 得ない場合、 本発明の緩衝剤組成物の利用が有効である。 本発明の緩衝剤組成物 において、 特に低温でのアニーリングを可能とするために必要な成分は、 以下の 成分 d)および e)である。 したがって本発明に基づいて、 下記の成分 d)および e) のいずれか、 または両方の存在下で、 低温でオリゴヌクレオチドを相補鎖にハイ プリダイズさせる方法が提供される。
d) 0 . 0 1 - 0 . 1 Mの、 硫酸塩、 亜硫酸塩、 リン酸塩、 および炭酸塩からなる 群から選択される少なくとも 1種類の塩
e) 0 . 0 1 - 1 0 %w/vの変性剤
本発明の方法において、 低温とは、 たとえばハイブリダィズさせるべきオリゴ ヌクレオチドの Tmよりも 1 0 °C以上低い温度を言う。 より具体的には、 本発明の 方法における低温には、 ァニールさせるべきオリゴヌクレオチドの Tmと比較して、 たとえば 1 0〜 3 0 °C、 好ましくは 1 5〜 2 5 °C、 あるいは 2 0〜 2 5 °C低い温 度が含まれる。 オリゴヌクレオチドの Tmは、 先に述べた Wallaceの方法にしたが つて計算することができる。
このような低い温度を必要とするオリゴヌクレオチドは、 通常 5— 2 0塩基、 たとえば 7— 1 5塩基の長さを有する。 したがって、 このような長さを有するォ リゴヌクレオチドは、 本発明の方法を応用するオリゴヌクレオチドとして好まし レ、。 本発明における Tmやオリゴヌクレオチドの長さは、 铸型にハイブリダイズす る部分を構成する塩基配列の長さに基づいて算出するべきである。 プライマーと して用いるオリゴヌクレオチドには、 しばしばァニールとは無関係な付加的な塩 基配列が付加される。 たとえば、 プロモーター、 あるいは制限酵素の認識配列な どは、 通常、 プライマーのァニールとは無関係な塩基配列である。 このようなァ ニールとは無関係な塩基配列については、 Tmゃァニールする塩基の数には含まれ ない。
本発明の方法に用いる成分 d)および e)は、 先に述べたような条件に基づいて利 用することができる。 また本発明の方法は、 GP法をはじめとする、 短いプライマ 一を利用した相補鎖合成反応において有用である。 更に本発明は、 上記成分 お よび e)のいずれか、 または両方を有効成分として含有するオリゴヌクレオチドの ハイブリダィゼーシヨンの安定剤を提供する。 本発明の安定剤は、 特に、 構成塩 基の少ないオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーシヨンの安定化に有用である 本発明の方法、 あるいは安定化剤は、 オリゴヌクレオチドのハイブリダイズを 必要とする任意の方法に利用することができる。 たとえば、 先に述べたような短 いプライマーのアニーリングは、 本発明の方法を応用することができる代表的な 例である。 その他、 PCR法などの公知の核酸合成反応において、 短いプライマー を利用するときに、 本発明の方法、 あるいは安定ィ匕剤を利用することができる。 あるいは、 各種のハイブリダィゼーシヨンアツセィにおいて、 短いオリゴヌクレ ォチドをプローブとして利用するときにも、 本発明の方法、 あるいは安定化剤を 応用することができる。
本発明の方法、 あるいは安定剤を構成する d)塩類、 あるいは e)変性剤は、 単独 で用いても良いし、 複数の化合物を混合して利用することもできる。 各化合物は いずれも異なる機序でプライマーのァユールの安定化、 あるいは特異性の向上を もたらしていると考えられる。 したがって、 界面活性剤、 洗浄剤、 および塩類の 各成分を添加することによって、 スタビライザーの作用は增強される。
あるいは本発明は、 上記成分 d)塩類および e)変性剤の、 低温条件下における短 いプライマーを利用した相捕鎖合成反応における使用に関する。 本発明における 低温条件とは、 ハイブリダィズさせるべきオリゴヌクレオチドの Tmよりも 1 0 °C 以上低い条件を言う。 より具体的には、 本発明の方法における低温には、 ァニー ルさせるべきオリゴヌクレオチドの Tmと比較して、 たとえば 1 0〜3 0 °C、 好ま しくは 1 5〜2 5 °C、 あるいは 2 0〜 2 5 °C低い温度が含まれる。 また本発明に おける短いオリゴヌクレオチドは、 通常 5— 2 0塩基、 たとえば 7— 1 5塩基の 長さを有する。
以下実施例に基づいて本発明を更に具体的に説明する。
(参考例 1 )
多義プライマーのデザイン
特異領域と多義領域とを有する多義プライマーを用い、 GP法における好適なプ ライマーのアニーリング条件を検討した。 図 2に多義プライマーの概念図を示し た。 図 2の多義プライマーは、 5'末端側に多義領域を有することにより、 特定塩 基配列のみならず、 これに類似するような相似性のある配列にもァニールするこ とができる。 なお、 実際にこのような構造の波形生成用プライマー集合体を用い る際には、 目的に応じて、 以下の （a) 〜 （e) に示す条件を調整することが望 ましい。
(a) プライマー長
(b) 特異領域の配列
(c) 多義領域の配列
(d) プライマー量
(e) アニーリング温度
そこで、 以下では、 この波形生成用プライマー集合体を構成する多義プライマ 一の構造及び反応条件の一例として、 上述した （a) 〜 （e) の項目を順に検討 した。
(a) プライマー長の調整
先ず、 プライマー全長が合成効率に与える影響を検討するため、 特異領域と多 義領域とが 1 ： 1であるプライマーについて、 98°C/2秒、 40°CZ20秒、 72°C/20秒のプロトコルを 50サイクル実施して相補鎖合成反応を行った。 相補鎖合成によって得られた伸長産物について、 解離曲線の波形を解析し、 多義 プライマーの構造が結果に与える影響を比較した。 多義プライマーは、 特異性と 安定性の 2つの指標に基づいて評価した。
ここで 「特異性が高い」 とは、 標的領域として選択した部分以外の領域に対し てァニールしにくいことを言う。 本発明においては、 多義プライマーの特異性が 高いことは、 伸長産物の多様性が低くなる原因となる。 その結果、 波形の多様性 は失われる。 つまり、 特異性をある程度低下させた多義プライマーが、 本発明に おける望ましい多義プライマーであると言うことができる。
一方、 安定性とは、 多義プライマーを構成する各プライマーのァニールの再現 性を言う。 多義プライマーが異なる塩基配列のオリゴヌクレオチドからなる集合 体であることは既に述べた。 しかし集合体を構成している個々のオリゴヌクレオ チドは、 それぞれの塩基配列に相補的な塩基配列に対してァニールするはずであ る。 ところが、 たとえば多義領域の長さが長すぎる場合には、 結果的に目的とす る塩基配列に対応するオリゴヌクレオチドの量が少なくなる。 つまり、 十分な相 補鎖合成が起きなくなる可能性が高まる。
この検討の結果、 プライマー全長が 1 6〜2 4 merの場合に、 好ましいプライ マーの特異性あるいは安定性が見られた。 この条件で、 伸長産物の波形の多様性 が最大となった。
一方、 プライマー全長が 2 4〜3 O merでは、 プライマーの特異性あるいは安 定性が高くなる反面、 得られる解離曲線の波形の多様性が低下した。 特異性が高 まることにより、 標的領域として選択した領域以外の領域の相捕鎖合成反応が十 分に進まなかったと考えられた。 プライマー全長が 1 0〜1 6 merでは、 波形の 多様性は高まる。 しかし一方で、 特異性と安定性は低下した。 プライマー全長が 9 mer以下では、 合成反応が起こらなかった。 これらの結果から、 本発明の多義 プライマーのプライマー長としては、 1 0〜3 O merの範囲を使用することがで き、 中でも好ましい長さは 1 6〜2 4 merであると結論した。
次に、 プライマー全長に占める特異領域と多義領域の割合を検討した。 この結 果、 プライマー全長に占める多義領域の割合が 0 . 3 3〜0 . 5 5の場合に、 安 定性と伸長産物の多様性が最大となった。 塩基数に直すと、 全長 2 4merの多義 プライマーでは、 8〜1 3 merの場合に望ましい結果が得られることになる。
一方プライマー全長に占める多義領域の割合が 0 . 5 5〜0 . 8 8の場合には、 波形の多様性は高まるが安定性が低下した。 このときの条件を塩基数で示せば、 多義領域が 1 4〜2 5 mer、 特異領域が 4〜 7 merとなる。 また、 プライマー全長 に占める多義領域の割合が 0 . 1 2〜0 . 3 3の場合には、 波形の多様性が失わ れた。 このときの条件を塩基数で示せば、 多義領域が 4〜 7 mer、 特異領域が 1 4 〜2 5 merとなる。
更に、 プライマー全長に占める多義領域の割合が 0 . 8 9以上では、 いわゆる ランダムプライマーとなり、 正常な合成が起こらなかった。 このときの条件を塩 基数で示せば、 例えば多義領域が 2 5 mer以上、 かつ特異領域が 3 mer以下となる c また、 プライマー全長に占める多義領域の割合が 0 . 1 1以下では、 通常の PCR プライマーと同じような合成反応が見られた。 つまり、 ほぼ 1種類のみの相補鎖 合成産物が見られた。 このときの条件を塩基数で示せば、 例えば多義領域が 3 mer 以下、 かつ特異領域が 2 5 mer以上となる。
なお、 以下ではプライマー全長に占める多義領域の割合を 0 · 3 3〜0 . 5 5 とするものとして説明する。
( b ) 特異領域の配列
特異領域は、 被検核酸から選択された標的領域に相補的な塩基配列からなって いる。 特異領域の長さは、 多義プライマーの全長が 1 6〜2 4 merであるときに 8〜1 3 merであることが好ましい。 また、 3' 末端を含む 5塩基中における G (グァニン） 又は C (シトシン） が占める割合である G C %は、 5 0 %以上であ ることが望ましい。 さらに、 3， 末端の安定性は、 一 5 . 5〜一 9 . 5 kcal/mol 以上が必要である。 なお、 3， 末端側の 3塩基以外において 5 0 %以内のミスマツ チがある場合にもァニール可能である。 この際、 ミスマッチ部分の安定性が一 1 2 . 0 Kcal/mol以下であれば、 合成効率の低下は無視し得る。
( c ) 多義領域の配列
多義領域は、 被検核酸から選択された標的領域以外の領域に対してもァニール 可能なプライマーを増やすために配置される領域である。 多義領域は、 前記標的 領域に対して相補的な塩基を、 それ以外の塩基に置換した塩基配列からなってい る。 置換する塩基の種類は 1〜 3種類の任意の塩基である。 本発明において、 塩 基の置換を表現するために、 表 1に示す多義コード (Ambiguity Code)を用いる。 多義プライマーの構造は、 例えば図 3に示すような塩基配列によって示すことが できる。 図 3に示した塩基配列を有する多義プライマーは、 多義領域における多 義性が 5' 〜3' 側にかけて段階的に低下する構造を有している。 多義領域の長さ は、 プライマー全長が 16〜24merであるときに 8 3merであることが好ま しい。
Ambiguity Code
Figure imgf000031_0001
(d) プライマー量
上述した多義領域を含む多義プライマーの集合体は、 実際には異なる塩基配列 を有するオリゴヌクレオチドの集合体である。 したがって、 1つの 2 Ambiguity C odeが含まれることは、 実際には異なる塩基配列からなる 2種類のオリゴヌクレ ォチドが含まれることを意味している。 そのため、 铸型核酸とァニールする有効 率は 1/2となる。
例えば、 2 Ambiguity Code: S (Cまたは Gを示す） が含まれた SATTという 塩基配列は、 実際には C A T Tおよび G A T Tの 2種類の塩基配列からなるオリ ゴヌクレオチドを含むことを意味する。 この場合、 それぞれの有効プライマー量 は 1/2となる。 同様に、 1つの 3 Ambiguity Codeまたは 4 Ambiguity Codeによ つて有効プライマー量はそれぞれ 1/3または 1 4となる。 つまり、 3Ambigui ty Code： B (C、 Gまたは Tを示す） が含まれた ΒΑΤΤという配列では、 CATT、 G ATT又は TATTの 3種類の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むことを意味 する。
したがって、 実際にプライマー量を計算する際には、 この有効プライマー量を 考慮する必要がある。 具体的には、 最低プライマー量に有効プライマー量の逆数 を乗算し、 これを多義領域の塩基数とミスマッチ率である 4とで除算する。 図 3 の例では、 2つの 4 Ambiguity Code、 4つの 3 Ambiguity Code、 そして 2つの 2 A mbiguity Codeを有するため、 有効プライマー量は、 1/5184 (= (1/ 4) 2X (1/3) 4X (1/2) 2) となる。 また、 多義領域の塩基数は 8であ る。 これにより、 最低プライマー量を 1 (ρηιοΐ/δ θ μϋ としたとき、 実際に加 えるべきプライマー量は、 1 X 5184 + 8 + 4 = 162 (pmol/50 /zL) 程度 となる。 なお、 このプライマー量の算出方法は一例であり、 この方法に限定され るものではない。
(e) アニーリング温度
アニーリング温度を検討するために、 先ずプライマーの Tm値を算出した。 Tm 値とは、 互いに相補的な塩基配列を持つ核酸の 50%が塩基対結合した状態とな る温度をいう。 具体的には、 特異領域の Tm値を 2(A+T)+4(G+C)法で計算し、 多義 領域の平均 2(A+T)+4(G+C)法で計算した。 そして、 これらを総合してプライマー 全長の Tm値を計算した。
通常の PCR法におけるアニーリング温度は、 Tm値マイナス 5°C程度である。 本 発明におけるアニーリング'温度は、 波形パターンを多様ィ匕するために、 Tm値マイ ナス 20°C程度とすることが好ましい。 低い温度を与えることで、 短いプライマ ーもァニールしやすくなる。 実験的には、 40 °C以下で解離曲線の波形多様性の 向上が顕著となった。 一方、 15°C以下ではランダムプライミングのみとなり、 殆ど合成反応を示さない。
なお本明細書において引用された全ての先行技術文献は、 参照として本明細書 に組み入れられる。 - 2, 2 - 図面の簡単な説明
図 1は、 本発明における相補鎖合成方法を模式的に説明する図である。 図 1
(A) は、 本発明によって被検核酸の複数の領域が合成される様子を示す。 図 1
(B ) は、 複数の伸長産物が種々の相互干渉構造を形成する様子を示す。
図 2は、 本発明に用いる多義プライマーの構造を示す図である。
図 3は、 多義プライマーの多義領域の配列の一例を示す図である。
図 4は、 相捕鎖合成におけるスタビライザーの添加が波形パターンに与える影 響を示す。 図 4 (A) がスタビライザー無し、 図 4 (B ) がスタビライザーを添 加した場合の波形パターンである。 図中、 縦軸は蛍光強度微分値を、 横軸は温度 (°C) を示す。
図 5は、 相補鎖合成におけるスタビライザーの添加が相補鎖合成に与える影響 を示す写真である。 図 5 (A) がスタビライザー無し、 図 5 (B ) がスタビラィ ザ一を添加した場合の、 合成産物の電気泳動の結果を示す。 （A) および （B ) の左端のレーンが 2 0 O bpラダー、 右側の 2つのレーンがサンプノレ （デュプリケ —ト） の泳動結果である。
図 6は、 4種類の波形生成用プライマー集合体 sPGBUP65、 sPGBUPUPR、 sPGBUPF X、 および sPGBUPRXのデザインのために設定した 「標的領域」 の、 被検核酸上に おける位置関係を模式的に示している。 発明を実施するための最良の形態
〔実施例 1〕
25°Cの低温アニーリングにおける 「スタビライザー」 の効果
表 2に示すアニーリングの安定剤 （以下 「スタビライザー」 を記載する） の効 果について、 実施例に基づいて本発明をさらに具体的に説明する。 本発明は以下 の実施例に限定されるものではなく、 本発明の要旨を逸脱しない範囲において 種々の変更が可能である。 (1) 方法
細菌 DNAの特定塩基配列を複数箇所で認識するプライマー、 BAUP65 (配列番 号： 6) を作成し、 GP法に基づいて核酸を同定した。 相捕鎖合成工程において、 スタビライザ一を加えた場合と加えない場合の波形パターンを比較して、 スタビ ラィザ一の効果を確認した。
細菌 DNAは大腸菌 (B. coli} DNAを用いた。 I S O G E N— L S (日本ジーン 株式会社製） を用い、 大腸菌約 1 06個からマニュアルに従って DNAを抽出した。 抽出 DNAは最終的に 0. 5 g/^uL (¾0) の濃度に調整した。 「スタビラィザ 一」 の処方を表 2に、 相補鎖合成反応液の,袓成を表 3および表 4に示す。 表 2. 「スタビライザー」 lmLの処方
Figure imgf000034_0001
表 3. 「スタビライザー無し」 の糸且成
反応液処方 処方量
検体 DNA溶液 (DNA 1 μ g含有） 2μΙ
10XPCR緩衝液 （MgCl2無し） 0 μし
25mM MgCl2 3 L
SyGreen (サイパーグリーン） 溶液 *3 5 μL
dNTP (10mM each) ΙμΙ
BAUP65プライマー （10 モル/ し） 18 μΐ
TaqDNAポリメラーゼ （5U/ L) *4 0.5 μL
滅菌蒸留水 15.5μL
計 50 μΐ 表 4. 「スタビライザー有り」 の,袓成
Figure imgf000035_0001
*1 SDS; Sodium Dodecyl Sulfate
*2 Br j35 !Polyoxyethylene (23) Lauryl Ether
*3 SyGreen溶液;原液 1000倍希釈
*4 Taq DNA polymerase； TAKARA Έχ Taq™ R-PCR
BAUP65； 5' -GGAAGGTGGGG-3' (配列番号： 6 )
「スタビライザー無し」 および 「スタビライザー有り」 の組成を有する反応液 について、 各々 1サンプル 50μίを加え相補鎖合成反応を行った。 反応は、 デュ プリゲートで実施し計 4サンプルの波形を観察した。 iCycler (Biorad社製） を 用いて 98°CZ2秒、 25°C/40秒、 72 °C/ 10秒のプロトコールを 50サ ィクル実施して相捕鎖を合成した。 反応後、 温度範囲 75〜95°C、 温度ステツ プ 0. 1°Cの条件で各温度で 8秒間観察することにより、 合成産物の解離曲線の 波形を描画した。
次に、 核酸增幅反応終了後のサンプル 1 0 /iLに 2 iLのローデイングバッファ 一を添加し、 1. 2%ァガロースゲルを使って、 45分間、 50Vで電気泳動後、 ゲルをェチジゥムブロマイドで染色して合成産物を確認した。 なお、 分子サイズ マーカとして、 200bp ladder markerを使用した。
(2) 結果
「スタビライザー」 の効果を、 図 4 (A) 「スタビライザー無し」 、 図 4
(B) 「スタビライザー有り」 の波形の差異として示す。 ここで図 4 (A) では、 核酸の合成が不十分なため波形が不明瞭である。 一方図 4 (B ) では十分な核酸 が合成されているため、 大腸菌の DNAに特徴的な波形が正常に描画されている。
「スタビライザー」 の効果は、 電気泳動分析の結果によっても裏付けられた。 す なわち、 図 5 (A) 「スタビライザー無し」 では合成産物のバンドが見られなレ、 一方図 5 (B ) 「スタビライザー有り」 では合成産物のパンドを確認することが できた。
以上の結果から、 「スタビライザー」 の添加によって、 25°Cという低温条件下 での相捕鎖合成と波形の解析が可能となることが裏付けられた。 スタビラィザ一 は、 たとえば次のような機序によって 25°Cにおけるプライマーの特異的なァニー リングと相補鎖合成を成立させていると考えられた。
プライマーおょぴ DNAの直線化維持、 あるいは高次構造形成抑制、
プライマ一一铸型 DNA間の水素結合安定化。
したがって、 低温条件下での相補鎖合成によって本発明を実施する場合には、 「スタビライザー」 の添加が有効であるといえる。 産業上の利用の可能性
本発明により、 低温条件下でのプライマーの特異的なァニーリングを可能とす る緩衝剤が提供された。 本発明の緩衝剤を利用すれば、 たとえば 1 0塩基前後の 短い塩基配列で構成されるプライマーを利用しても、 塩基配列特異的な相捕鎖合 成反応を期待できる。 短いプライマーの利用により、 被検核酸の複数の領域を少 種類のプライマーで合成することが可能となる。 本発明の緩衝剤は、 GP法のよう な、 複数の領域の相捕鎖合成を必要とする核酸解析方法に有用である。
本発明の緩衝剤は、 短いプライマーを利用した相捕鎖合成反応に利用すること ができる。 短いプライマーのアニーリングには低い温度が要求される。 本発明の 緩衝剤により、 低温条件下でのアニーリングと相補鎖合成反応を効率的に行うこ とが可能となった。 短いプライマーは、 少数のプライマーで複数の領域を特異的に合成するときに 有利である。 各領域にそれぞれ特異的なプライマーを混合して用いれば、 複数領 域を一つの反応系で合成することは可能である。 しかし複数のプライマーを合成 することはコストアップの原因である。 また、 構成塩基数の多い複数のプライマ 一は互いに異なる Tmを有する可能性がある。 このような場合は、 複数のプライマ 一間でストリンジエンシーを一致させることができなくなる。 結果として、 ブラ イマ一間で相補鎖合成反応の効率に差を生む恐れがある。 GP法のように、 複数種 の相捕鎖合成産物の集合体を解析の対象とする解析方法においては、 このような 合成効率の差は小さいほうが望ましい。
GP法以外の核酸解析方法においても、 短いプライマーによってもたらされる効 果が期待できる。 たとえば PCR法において、 必ずしも十分な長さのプライマーを デザインできない場合がある。 すなわち、 合成対象の塩基配列情報が不十分な場 合には、 十分な長さのプライマーをデザインすることができない。 あるいは、 相 捕鎖合成反応以外の目的で組み込まれる塩基配列のために、 プライマーにおける 相補鎖合成反応のための塩基数が制限される場合も考えられる。 たとえば、 プロ モーターや制限酵素認識配列などを組み込んだプライマーがしばしば利用される。 このような場合には、 相捕鎖合成反応のためのプライマーとして、 少ない塩基が 必要になる。 本発明の緩衝剤を利用すれば、 このようなプライマーであっても、 P CR法を効率的に実施することができる。
本発明の緩衝剤を利用して、 短いプライマーで複数領域の相補鎖を合成すれば、 プライマー間のストリンジエンシーを容易に一致させることができる。 またプラ イマ一が短いときには、 複数の領域の間で、 同じ塩基配列からなるプライマーを 共有できる可能性も期待できる。 このように、 短いプライマーによる特異的な相 補鎖合成を可能にした本発明の意義は大きい。

Claims

請求の範囲
1 . 下記の組成を含む、 核酸合成用緩衝剤組成物。
a) 核酸合成酵素による相補鎖合成反応に好適な pHを与える緩衝剤、 b) 0 . 1 _ 5 Ο πιΜの Mg2+塩、 および Mn2+塩のいずれか、 または両方
c) 1—2 0 O mMの 1価の金属塩
d) 0 . 0 0 5〜0 . 5 Mの、 硫酸塩、 亜硫酸塩、 リン酸塩、 および炭酸塩か らなる群から選択される少なくとも 1種類の塩、 および
e) 0 . 0 1 - 1 0 %w/vの変性剤
2 . 緩衝剤が、 7 . 5 _ 9の PHを与える緩衝剤である請求項 1に記載の組成物。
3 . Mg2+塩が、 MgCl2である請求項 1に記載の組成物。
4 . 1価の金属塩が、 KC1、 および NaClのいずれか、 または両方である請求項 1に記載の組成物。
5 . 硫酸塩、 亜硫酸塩、 リン酸塩、 および炭酸塩が、 Na2S04、 Na2S03、 Na¾P04、 および NaHC03からなる群から選択される少なくとも 1種類の塩である請求項
1に記載の組成物。
6 . 変性剤が、 非イオン系界面活性剤、 陰イオン系界面活性剤、 および洗浄剤 力 らなる群から選択される少なくとも 1種類の変性剤である請求項 1に記載 の組成物。
7 . 非イオン系界面活性剤が、 グリセリンエステルのポリオキシエチレンエー テル、 ソルビタンエステルのポリオキシエチレンエーテル、 およぴソルビト ールエステルのポリオキシエチレンエーテルからなる群から選択される少な くとも 1種類の非イオン系界面活性剤である請求項 6に記載の組成物。
8 . 洗浄剤が、 .ドデシル硫酸塩、 ラウロイルサルコシン塩、 ラウリル酸塩、 お ょぴメルカプト酢酸塩からなる群から選択される少なくとも 1種類の化合物 である請求項 6に記載の糸且成物。
9. 合成すべき核酸が、 铸型となる核酸の複数の領域を铸型とする相捕鎖であ る請求項 1に記載の組成物。
10. 下記の成分 d)および e)のいずれか、 または両方の存在下で、 低温でオリ ゴヌクレオチドを相捕鎖にァニーリングさせる方法。
d) 0. 01— 0. 1Mの、 硫酸塩、 亜硫酸塩、 リン酸塩、 および炭酸塩か らなる群から選択される少なくとも 1種類の塩
e) 0. 01-10 %w/vの変性剤
11. 低温条件が、 前記ォリゴヌクレオチドの融解温度よりも 10〜 30 °C低 い温度である請求項 10に記載の方法。
12. オリゴヌクレオチドが、 5— 20塩基の長さを有する請求項 10に記載 の方法。
13. オリゴヌクレオチドが、 7— 15塩基の長さを有する請求項 12に記載 の方法。
14. オリゴヌクレオチドが、 鋅型となる核酸の複数箇所にァニールするブラ イマ一である請求項 10に記載の方法。
15. 下記の成分 d)および e)のいずれか、 または両方を有効成分として含有す る、 オリゴヌクレオチドのアニーリングの安定剤。
d) 0. 01-0. 1 Mの、 硫酸塩、 亜硫酸塩、 リン酸塩、 および炭酸塩か らなる群から選択される少なくとも 1種類の塩
e) 0. 01— 10%w/vの変性剤
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