Importin-α mit inaktivierter autoinhibitorischer Domäne zur
Diagnose
Die vorliegende Erfindung betrifft eine Variante von Importin-α (vorzugsweise Importin-α-ΔN) , bei der die autoinhibitorische Domäne des Importin-α inaktiviert ist, vorzugsweise durch Deletion, sowie ein diese Variante kodierendes Nukleinsauremolekul. Außerdem betrifft die vorliegende Erfindung diese Nukleinsäuremoleküle enthaltende Vektoren. Schließlich betrifft die vorliegende Erfindung Diagnoseverfahren, bei denen erfindungsgemäße Importin-α-Varianten verwendet werden und mit denen sich beispielsweise mit einem veränderten Kernproteom in Zusammenhang stehende Erkrankungen nachweisen lassen.
Die Gendiagnostik umfasst derzeit den Nachweis von Infektionskrankheiten, die Krebsvorsorge, eine Reihe von Transplantationsanalysen zur Vermeidung von Abstoßungsreaktionen, die gerichtsmedizinische Analytik, den Nachweis von Erbkrankheiten etc. So sind bereits für 500 der 7000 bekannten Erbkrankheiten Gentests verfügbar. Eine Steigerung der Diagnostik kann durch die Ermittlung eines Genexpressionsprofils (z.B. auf mRNA-Ebene mittels sogenannter DNA-Chips) oder auch auf Proteineebene (z.B. zweidimensionaler ELISA, estern-Blot etc.) erreicht werden, wobei die Über- /Unterexpression einer Vielzahl von Genen analysiert und dann in einem Profil dargestellt wird. Von diagnostischem Interesse könnte auch die Darstellung ausschließlich von im Zellkern befindlichen Proteinen (Kernproteom) sein bzw. deren unterschiedliches Profil in Abhängigkeit von bestimmten Erkrankungen. Leider gibt es bisher keine überzeugenden Möglichkeiten, ein auf Kernproteine beschränktes „Profiling" durchzuführen.
Somit liegt der Erfindung im wesentlichen das technische Problem zugrunde, Diagnosemittel bereitzustellen, die eine direkte Diagnostik des Kernproteoms erlauben.
Die Lösung dieses technischen Problems wurde durch die
Bereitstellung der in den Patentansprüchen gekennzeichneten Ausführungsformen erreicht.
Es wurde bei den zu der vorliegenden Erfindung führenden Experimenten gefunden, dass humanes Importin-α mit einer Deletion der autoinhibitorischen Domäne (Importin-α-&N) konstitutiv und spezifisch an Kernproteine bindet, somit zur direkten Diagnostik des Kernproteoms bzw. allgemein zum analytischen Nachweis von Kernproteinen oder zur Targetidentifizierung (differentielle Protein-Lokalisation im Kern) geeignet ist.
Für die Mehrheit der Kernimportprozesse in eukaryontisehen Zellen ist ein Komplex aus Importin-α und Importin-ß verantwortlich. Dabei bindet Importin-α an die sogenannten Kernlokalisationssequenzen (NLS) der Kernproteine, während Importin-ß den Transport durch den Kernporenkomplex (NPC) vermittelt. Importin-α besitzt eine eigene NLS-Sequenz als Bestandteil einer autoinhibitorischen Domäne, die seine NLS- Bindungsstelle für Kernproteine blockiert. Durch die Bindung dieser Domäne an Importin-ß wird die Blockade aufgehoben und die NLS eines Kernproteins kann mit hoher Affinität unter Bildung eines trimeren Komplexes gebunden werden. Im Zellkern findet dann der umgekehrte Prozess statt: Importin-ß dissoziiert aus dem Komplex durch Bindung an RanGTP, mit der Konsequenz, dass auch der verbleibende Komplex aus Importin-α und dem Kernprotein nicht stabil bleibt, somit dann das Kernprotein in freier Form vorliegt.
Im sogenannten „Far Western Blot", bei dem anstelle der Interaktion eines Antikörpers mit einem Antigen die interaktion des Importin-α mit NLS analysiert wurde, konnte gezeigt werden, dass ein erfindungsgemäßes Importin-α-^N, das mit einem nachweisbaren Protein (Glutathion-S-Transferase; GST) fusioniert war, an Kernproteine bindet, jedoch nur eine Minderheit der in einem cytoplasmatischen Extrakt vorliegenden Proteine. Der Nachweis erfolgte über sekundäre Antikörper gegen den GST-tag oder durch direkte Markierung von Importin-α~&N) . Dieses Protein
lasst sich somit zu einem sehr empfindlichen Nachweis von Kernproteinen z.B. auf Western-Blot-Membranen verwenden.
Eine Vielzahl von grundlegenden Regulationsprozessen in einer eukaryotischen Zelle beruht auf dem exakt regulierten Kernimport bestimmter Signalproteine. Äußere Signale, wie die Bindung eines Wachstumsfaktors an seinen Rezeptor auf der Zelloberfläche können so über eine Kaskade von Protein- Protein-Interaktionen die Transkription von Zielgenen im Kern beeinflussen. Bis zum Auftreten eines solchen Signals ist die Kernlokalisationssequenz entsprechender Proteine für das Importin-α nicht zugänglich oder durch einen cytoplasmatischen Inhibitor kompensiert (Beispiele: MAP-Kinase, NF-kappaB, Protein Kinase A, STAT) . Die Verteilung dieser Proteine zwischen Cytoplasma und Zellkern lässt eine Aussage über das Maß der Aktivierung der zugehörigen Signaltransduktionswege zu. So sind z.B. mindestens zehn verschiedene Tu orsuppressor- Proteine sind in durch ihre subzelluläre Lokalisation in ihrer Aktivität reguliert. Von den Tumorsuppressoren BRCAl (Brustkrebs) , VHL (Nierenzellkrebs) und p53 ist bekannt, dass sie in entsprechenden Krebszellen eine abweichende Lokalisation aufweisen. (Fabbro and Henderson, Exp. Cell Res . 282 (2003), 59-69). Der Signalweg des Transkriptionsfaktor NF- kappaB, der einen Kernimportprozess beinhaltet, spielt in einer Vielzahl von menschlichen Krankheiten eine Rolle, beispielsweise Entzündungen, Asthma, Atherosklerose, Arthritis und Krebs (Garg and Aggarwal, Leukemia 16 (2002), 1053-1068) .
Die erfindungsgemäße Importin-α-Variante kann daher als ein allgemeines Werkzeug zur Charakterisierung von Zellen Anwendung finden und hat somit generelles diagnostisches Potential, z.B. zur Diagnose von Krankheiten, die mit einer gestörten Verteilung von Kernproteinen zwischen Cytoplasma und Zellkern in Zusammenhang stehen oder ein von dem Normalzustand abweichendes Kernproteinprofil aufweisen.
Somit betrifft eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ein Nukleinsauremolekul, das eine Variante eines Proteins mit
einer biologischen Aktivität von humanem Importin-α kodiert, das dadurch gekennzeichnet ist, dass die Nukleinsäuresequenz des Nukleinsäuremoleküls gegenüber der das native Protein kodierenden Nukleinsäuresequenz eine Mutation aufweist, die zu einer Inaktivierung der autoinhibitorischen Domäne des humanen Importin-α bei der Variante führt. Bei dem Importin-α handelt es sich vorzugsweise um humanes Importin-α, mehr bevorzugt humanes Importin-α-1, dessen Aminosäuresequenz z.B. in O'Neill and Palese, Virology 206 (1) (1995), 116-125 beschrieben ist.
Der hier verwendete Ausdruck „Importin-α" bezieht sich sowohl auf Importin-α-1 (=Karyopherin-α-l; Gen: KPNA1) als auf andere, z.T. bereits beschriebene Typen von Importin-α (bzw. den entsprechenden Genen) , die eine nahezu gleiche Funktion wie Importin-α-1 haben, sich jedoch bezüglich der Spezifität für manche NLS unterscheiden können. Somit betrifft der hier verwendete Ausdruck "Protein mit einer biologischen Aktivität von humanem Importin-α" jedes Protein, das mindestens eine der biologischen Eigenschaften von Importin-α-1 aufweist, jedenfalls die Fähigkeit zur spezifischen Bindung an die NLS der Kernproteine .
Der hier verwendete Ausdruck "Variante von Importin-α" betrifft jede Form von Importin-α, die gegenüber der nativen Form so verändert ist, dass die autoinhibitorische Domäne biologisch inaktiv ist, d.h., die NLS-Bindungsstelle von Importin-α kann nicht mehr blockiert werden. Dies wird vorzugsweise dadurch erreicht, dass Aminosäure (n) innerhalb der autoinhibitorischen Domäne entsprechend verändert werden. Dies lässt sich durch die gezielte Einfügung von Punktmutationen in die Importin-α DNA (siehe bezüglich DNA-Sequenz und Aminosäuresequenz O'Neill and Palese, Virology 206 (1) (1995), 116-125; Accession-No. : GI:22043734) z.B. mittels der Polymerase-Kettenreaktion durchführen. Hierbei kann durch die Wahl geeigneter Oligonukleotide (Primer) mit einem oder mehreren gegenüber der Wildtyp-Sequenz veränderten Nukleotiden eine beliebige Mutation der Aminosäuresequenz gezielt erzeugt werden.
Vorzugsweise erfolgt die Inaktivierung der autoinhibitorischen Domäne dadurch, dass diese ganz oder teilweise deletiert ist. Am meisten bevorzugt ist eine vollständige Deletion, die die Aminosäuresequenz von Position 1 bis 61 umfasst (Importin-α-
Die erfindungsgemäße Importin-α-Variante kann neben diesen Veränderungen gegenüber der nativen Form noch weitere Veränderungen aufweisen, d.h. gegenüber der nativen Form Deletionen, Additionen und/oder Austausche von einer oder mehreren Aminosäuren und/oder (eine) modifizierte Aminosäure (n) aufweisen oder veränderte Oligosaccharidseitenketten, wobei ihre biologische Aktivität im wesentlichen erhalten bleibt. Zu den Austauschen zählen vorzugsweise "konservative" Austausche von Aminosäureresten, d.h. Austausche gegen biologisch ähnliche Reste, z.B. die Substitution eines hydrophoben Rests (z.B. Isoleucin, Valin, Leucin, Methionin) gegen einen anderen hydrophoben Rest, oder die Substitution eines polaren Rests gegen einen anderen polaren Rest (z.B. Arginin gegen Lysin, Glutaminsäure gegen Asparaginsäure etc . ) . Deletionen können zur Erzeugung von Molekülen führen, die eine deutlich geringere Größe aufweisen (Fragmente), d.h., denen beispielsweise Aminosäuren am N- oder C-Terminus fehlen. Die vorstehenden Varianten betreffen auch Importin-α-Varianten, die im Vergleich zu der ursprünglichen Form eine ähnliche oder bessere biologische Aktivität aufweisen. Diese biologische Aktivität kann mittels der in den nachstehenden Beispielen beschriebenen Verfahren untersucht werden. Verfahren zur Erzeugung der vorstehenden Änderungen in der Aminosäuresequenz bzw. entsprechenden Nukleinsäuresequenz sind dem Fachmann bekannt und in Standardwerken der Molekularbiologie beschrieben, beispielsweise in Sambrook et al . , Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor NY (1989) . Der Fachmann ist auch in der Lage zu bestimmen, ob eine von einer so veränderten Nukleinsäuresequenz kodierte Importin-α- Variante die Kernlokalisationssequenz (NLS) noch spezifisch binden kann.
Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle können auch in einen Vektor inseriert werden. Allgemeine, auf dem Fachgebiet bekannte Verfahren können zur Konstruktion von Expressionsvektoren, die die erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen und geeignete KontrollSequenzen enthalten, verwendet werden. Zu diesen Verfahren zählen beispielsweise in vitro- Rekombinationstechniken, synthetische Verfahren, sowie in vivo- Rekombinationsverfahren, wie sie beispielsweise in Sambrook et al . , supra, beschrieben sind. Somit umfasst die vorliegende Erfindung auch diese Nukleinsäuremoleküle enthaltende Vektoren. Die Bezeichnung "Vektor" bezieht sich auf ein Plasmid (z.B. pUC18, pBR322, pBlueScript) , auf ein Virus oder ein anderes geeignetes Vehikel . In einer bevorzugten Ausführungsform ist das erfindungsgemäße Nukleinsauremolekul im Vektor mit regulatorischen Elementen funktioneil verknüpft, die dessen Expression in prokaryotisehen oder eukaryotischen Wirtszellen erlauben. Solche Vektoren enthalten neben den regulatorischen Elementen, beispielsweise einem Promotor, typischerweise einen Replikationsursprung und spezifische Gene, die die phänotypische Selektion einer transformierten Wirtszelle erlauben. Zu den regulatorischen Elementen für die Expression in Prokaryonten, beispielsweise E.coli, zählen der lac-, trp-Promotor oder T7-Promotor, und für die Expression in Eukaryonten der A0X1- oder GALl-Promotor in Hefe, und der CMV- , SV40-, RVS-40-Promotor, CMV- oder SV40-Enhancer für die Expression in tierischen Zellen. Weitere Beispiele für geeignete Promotoren sind der Metallothionein I- und der Polyhedrin-Promotor . Zu geeigneten Vektoren zählen beispielsweise auf T7 basierende Expressionsvektoren für die Expression in Bakterien (Rosenberg et al . , Gene 56 (1987) , 125, pMSXND für die Expression in Säugerzellen (Lee und Nathans, J.Biol.Chem. 263 (1988) ,3521, und von Baculovirus abgeleitete Vektoren für die Expression in Insektenzellen.
In einer bevorzugten Ausführungsform liegt die erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz so in dem Vektor vor, dass ein Fusionsprotein kodiert wird, das eine Importin-α-
Variante sowie einen Fusionspartner (Polypeptid oder Peptid) umfasst, wobei der Fusionspartner am N- oder C-Terminus mit der Importin-α-Variante über eine Peptidbindung verknüpft ist.
Vorzugsweise handelt es sich bei dem Fusionspartner um ein nachweisbares Polypeptid/Peptid, z.B. Glutathion-S-Transferase (GST) , Strep-tag oder Hemagglutinin(HA) -tag oder ein Polypeptid/Peptid, das die Anreicherung/Isolierung der Komplexe aus der Importin-α-Variante und Kernproteinen erlaubt, z.B. Glutathion-S-Transferase (GST), Hexahistidin-tag, Calmodulin Binding Protein (CBP) -tag oder Protein A-tag, wobei Glutathion-S-Transferase bevorzugt ist.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch die vorstehend beschriebenen Vektoren enthaltende Wirtszellen. Zu diesen Wirtszellen zählen Bakterien, Hefe, Insekten- und Tierzellen, vorzugsweise Säugerzellen. Verfahren zur Transformation dieser Wirtszellen, zur phänotypischen Selektion von Transformanten und zur Expression der erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle unter Verwendung der vorstehend beschriebenen Vektoren sind auf dem Fachgebiet bekannt .
Die vorliegende Erfindung betrifft darüber hinaus die von den vorstehenden Nukleinäuremolekülen bzw. diese enthaltenden Vektoren kodierten Importin-α-Varianten (z.B. Importin-α-ΔN) und Fusionsproteine.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen Importin-α-Variante (oder des Fusionsproteins) und Gewinnung des Proteins aus der Kultur. Geeignete Verfahren zur rekombinanten Herstellung von Proteinen sind allgemein bekannt (siehe beispielsweise Holmgren, Annu.Rev.Biochem. 54 (1985), 237; LaVallie et al . , Bio/Technology ,11 (1993), 187; Wong, Curr.Opin.Biotech.6. (1995), 517; Romanos, Curr.Opin.Biotech.6 (1995), 527; Williams et al . , Curr. Opin. Biotech.6. (1995), 538; und Davies, Curr. Opin.Biotech.6. (1995), 543). Auch geeignete
Reinigungsverfahren (beispielsweise präparative
Chromatographie, Affinitätschromatographie, beispielsweise
Immunoaffinitäts-chro atographie, HPLC etc.) sind allgemein bekannt .
Schließlich betrifft die vorliegende Erfindung, die eine erfindungsgemäße Importin-α-Variante, vorzugsweise als Fusionsprotein mit einem nachweisbaren oder spezifisch anreichenbaren/isolierbaren Partner erlaubt. Die damit durchführbaren Nachweise umfassen: (a) Charakterisierung der Proteinzusammensetzung, (b) analytischer Nachweis von Proteinen, die eine Kernlokalisationssignal enthalten, (c) Target-Identifizierung (differentielle Protein-Lokalisation im Kern) und (d) direkte Diagnostik des Kernproteoms .
Somit erlaubt die erfindungsgemäße Importin-α-Variante die Diagnose von Erkrankungen, die mit einem veränderten Kernproteom bzw. einem veränderten Kernprotein- Expressionsprofil in Zusammenhang stehen. Die Diagnose umfasst üblicherweise die folgenden Schritte: (a) Gewinnung einer Zellprobe von dem Patienten, und (b) Inkontaktbringen der so erhaltenen Zellprobe mit der vorstehend beschriebenen erfindungsgemäßen Importin-α-Variante als Sonde unter Bedingungen, die die Bindung der Importin-α-Variante an Kernproteine erlauben. Dieser Nachweis kann unter Anwendung von dem Fachmann bekannten Standardtechniken durchgeführt werden. Diesem sind auch Zellaufschlußverfahren bekannt, die die Isolierung der Proteine auf eine solche Weise erlauben, dass diese mit der Importin-α-Varianten in Kontakt gebracht werden können. Der Nachweis der gebundenen Importin-α-Variante und somit der Nachweis der gebundenen Kernproteine kann über übliche Verfahren erfolgen, vorzugsweise über Western-Blot . Schließlich können die so analysierten bzw. dargestellten Kernproteine bzw. das so ermittelte Kernprotein-Profil mit einer aus einem Kontrollgewebe des Patienten bzw. aus einer oder mehreren Kontrollpersonen gewonnenen Probe verglichen werden.
Weiter betrifft die vorliegende Erfindung Kits zur Durchführung der erfindungsgemäßen Diagnoseverfahren, die eine erfindungsgemäße Importin-α-Variante enthalten, gegebenenfalls in Kombination mit einem geeigneten Nachweismittel.
Je nach Ausgestaltung des mit den erfindungsgemäßen Kits durchzuführenden Diagnoseverfahrens kann die in dem Kit enthaltene Importin-α-Variante an einem geeigneten Träger immobilisiert sein.
Schließlich betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung der erfindungsgemäßen Importin-α-Variante zur Identifizierung oder Reinigung von NLS-tragenden Proteinen oder zur Markierung von Kernproteinen (beispielsweise in Bereich „Proteomics"). Der Fachmann kennt geeignete Techniken zur Durchführung dieser Verfahren, die Identifizierung von Kernproteinen ist auch in Beispiel 3 beschrieben.
Die Erfindung wird weiter anhand der Figuren beschrieben, welche zeigen:
Figur 1 : Schematische Darstellung der Konstruktion des GST- Importin-α-ΔN kodierenden Vektors zur heterologen Expression von Importin-α-ΔN in E.coli
Das Fusionsgen aus Glutathion-S-Transferase und der kodierenden Sequenz der Aminosäuren 62 bis 538 aus Importin-α steht unter Kontrolle des chemisch induzierbaren tac Promotors. Des weiteren sind Sequenzen für die Propagation in E.coli (ori) und die Ampicillin-Selektion in Kultur (Ampr) enthalten.
Figur 2 : Aminosäuresequenz von Importin-α und Importin-α-AN Fettgedruckt: Importin-ß bindende bzw. autoinhibitorische Domäne. Grau hinterlegt: N-terminale Deletion in Importin-α-
ΔN .
Figur 3 : Far Western Blot eines Kernextrakts aus Jurkat T- Lvmphozvten
Verdünnungsreihe eines Kernextrakts aus Jurkat T-Lymphozyten aufgetrennt mit SDS-PAGE. Im linken Bild ist eine Silberfärbung der Gesamtproteine zu sehen. Analog dazu wurde ein „Far Western Blot" mit GST-Importin-α-ΔN als Sonde durchgeführt (rechtes Bild) . Die Komplexe aus Kernprotein und Importin α-ΔN wurden mit den Antikörpern anti-GST (Ratte IgG) und anti-Ratte IgG gekoppelt mit alkalischer Phosphatase inkubiert und die Aktivität der alkalischen Phosphatase mit einer Farbreaktion sichtbar gemacht.
Die nachstehenden Beispiele veranschaulichen die Erfindung.
Beispiel 1
Erzeugung der Deletion der autoinhibitorischen Domäne in
Importin-α
Die Position der autoinhibitorischen Domäne wird in der Literatur unterschiedlich angegeben mit den Aminosäurepositionen 10-50 bzw. 23-49. Für die Funktion der Domäne essentiell ist die interne NLS zwischen den Resten Arg25 und Arg28. Die Deletion in Importin α-ΔN von Position 1- 61 umfasst die genannten Regionen. Sechs negativ geladene Aminosäuren zwischen Glu54 und Glu60 wurden in Importin α-ΔN ebenfalls deletiert, um unspezifische elektrostatische Wechselwirkungen des Proteins zu vermeiden. Das für die Aminosäuren 62-538 kodierende Nukleinsäure-Fragment wurde mit der Poly erase-Kettenreaktion (PCR) hergestellt. Die Sequenz der Primer-Oligonukleotide (KPNAfwd: 5' -ATA TCG ATC GCA TAT GTC AGA TGG AGG CTT TCA-3 ' ; KPNArev: 5 ' -AGC TGG ATC CTC AAA GCT GGA AAC CTT CC-3 ' ) wurde so gewählt, dass sie mit der
Sequenz ab Codon 62 bzw. bis Codon 538 hybridisieren konnten.
Beispiel 2
Konstruktion eines GST-Importin-fö-üSJ kodierenden Fa o s und rekombinante Herstellung von GST-Importin-α-ΔN
Zur Klonierung des Importin-α-ΔN Fragments wurde ein aus dem kommerziell erhältlichen Konstrukt pGEX-2T (Amersha Biosciences, Freiburg, Deutschland) abgeleiteter Vektor verwendet, wobei sich der Unterschied auf das Vorhandensein der Restriktionsschnittstellen für die Enzyme Itfel und BamHI beschränkt.
Das Importin-α-ΔN Fragment wurde mit Hilfe der Polymerase- Kettenreaktion (PCR) aus der entsprechenden cDNA amplifiziert . Die hierzu notwendigen Primer-Oligonukleotide enthielten 5' und 3 ' Ende der Kodierungssequenz für Importin α-ΔN und jeweils eine der o.g. Restriktionsschnittstellen. Das PCR- Produkt wurde nach Standardverfahren in den Vektor ligiert.
Im fertiggestellten Vektor befindet sich die Importin α-ΔN Kodierungssequenz im selben Leseraster wie die Kodierungssequenz für Gluthathion-S-Transferase und unter Kontrolle des induzierbaren tac Promotors . Die pGEX-Importin α-ΔN DNA wurde in E.coli DH5α transformiert. Die Expression des Fusionsproteins wurde in einer Großkultur der Bakterien mit IPTG induziert. Nach Expression des Protein wurde es aus dem Bakterienlysat an immobilisiertes Glutathion (Glutathion- Sepharose) gebunden und nach Waschschritten mit gelöstem Glutathion extrahiert.
Beispiel 3
Identifikation von Kernproteinen mit GST-Importin-α-ΔN
Kernproteine wurden durch Osmolyse von Jurkat T-Lymphozyten und anschließende Hochsalzextraktion der Zellkerne gewonnen (Wells et al., J.Biol.Chem. 276(3) (2001), 20482-90). Die Extrakte wurden in unterschiedlichen Mengen per SDS- Polyacrylamid-Gelelektrophorese nach Molekulargewicht aufgetrennt und auf eine PVDF-Membran transferiert. Nach Absättigen unspezifischer Bindungen mit Rinderserum-Albumin wurde GST-Importin-α-ΔN in einer Konzentration von 1,5 μg/ml aufgegeben.
Die Detektion der Proteinkomplexe erfolgte im wesentlichen nach einem Western Blot-Standardprotokoll durch sequentielle Inkubation mit den Antikörpern anti-GST (Ratte IgG) und anti- Ratte IgG-alkalische Phosphatase (Promega GmbH, Mannheim, Deutschland; Amersham Biosciences) und durch die BCIP/NBT Farbreaktion.