Somit
liegt der Erfindung im wesentlichen das technische Problem zugrunde,
Diagnosemittel bereitzustellen, die eine direkte Diagnostik des
Kernproteoms erlauben.
Die
Lösung
dieses technischen Problems wurde durch die Bereitstellung der in
den Patentansprüchen gekennzeichneten
Ausführungsformen
erreicht.
Es
wurde bei den zu der vorliegenden Erfindung führenden Experimenten gefunden,
dass humanes Importin-α mit
einer Deletion der autoinhibitorischen Domäne (Importin-α-ΔN) konstitutiv
und spezifisch an Kernproteine bindet, somit zur direkten Diagnostik
des Kernproteoms bzw. allgemein zum analytischen Nachweis von Kernproteinen
oder zur Targetidentifizierung (differentielle Protein-Lokalisation
im Kern) geeignet ist.
Für die Mehrheit
der Kernimportprozesse in eukaryontischen Zellen ist ein Komplex
aus Importin-α und
Importin-β verantwortlich.
Dabei bindet Importin-α an
die sogenannten Kernlokalisationssequenzen (NLS) der Kernproteine,
während
Importin-β den
Transport durch den Kernporenkomplex (NPC) vermittelt. Importin-α besitzt
eine eigene NLS-Sequenz als Bestandteil einer autoinhibitorischen
Domäne,
die seine NLS-Bindungsstelle
für Kernproteine
blockiert. Durch die Bindung dieser Domäne an Importin-β wird die
Blockade aufgehoben und die NLS eines Kernproteins kann mit hoher
Affinität
unter Bildung eines trimeren Komplexes gebunden werden. Im Zellkern
findet dann der umgekehrte Prozess statt: Importin-β dissoziiert
aus dem Komplex durch Bindung an RanGTP, mit der Konsequenz, dass
auch der verbleibende Komplex aus Importin-α und dem Kernprotein nicht stabil
bleibt, somit dann das Kernprotein in freier Form vorliegt.
Im
sogenannten „Far
Western Blot", bei
dem anstelle der Interaktion eines Antikörpers mit einem Antigen die
interaktion des Importin-α mit
NLS analysiert wurde, konnte gezeigt werden, dass ein erfindungsgemäßes Importin-α-ΔN, das mit
einem nachweisbaren Protein (Glutathion-S-Transferase; GST) fusioniert
war, an Kernproteine bindet, jedoch nur eine Minderheit der in einem
cytoplasmatischen Extrakt vorliegenden Proteine. Der Nachweis erfolgte über sekundäre Antikörper gegen
den GST-tag oder durch direkte Markierung von Importin-α-ΔN). Dieses
Protein lässt
sich somit zu einem sehr empfindlichen Nachweis von Kernproteinen
z.B. auf Western-Blot-Membranen verwenden.
Eine
Vielzahl von grundlegenden Regulationsprozessen in einer eukaryotischen
Zelle beruht auf dem exakt regulierten Kernimport bestimmter Signalproteine. Äußere Signale,
wie die Bindung eines Wachstumsfaktors an seinen Rezeptor auf der
Zelloberfläche
können
so über
eine Kaskade von Protein-Protein-Interaktionen
die Transkription von Zielgenen im Kern beeinflussen. Bis zum Auftreten
eines solchen Signals ist die Kernlokalisationssequenz entsprechender
Proteine für
das Importin-α nicht
zugänglich
oder durch einen cytoplasmatischen Inhibitor kompensiert (Beispiele:
MAP-Kinase, NF-kappaB, Protein Kinase A, STAT). Die Verteilung dieser
Proteine zwischen Cytoplasma und Zellkern lässt eine Aussage über das
Maß der
Aktivierung der zugehörigen
Signaltransduktionswege zu. So sind z.B. mindestens zehn verschiedene
Tumorsuppressor-Proteine
sind in durch ihre subzelluläre
Lokalisation in ihrer Aktivität
reguliert. Von den Tumorsuppressoren BRCA1 (Brustkrebs), VHL (Nierenzellkrebs)
und p53 ist bekannt, dass sie in entsprechenden Krebszellen eine abweichende
Lokalisation aufweisen. (Fabbro and Henderson, Exp. Cell Res. 282
(2003), 59–69).
Der Signalweg des Transkriptionsfaktor NF-kappaB, der einen Kernimportprozess
beinhaltet, spielt in einer Vielzahl von menschlichen Krankheiten
eine Rolle, beispielsweise Entzündungen,
Asthma, Atherosklerose, Arthritis und Krebs (Garg and Aggarwal,
Leukemia 16 (2002), 1053–1068).
Die
erfindungsgemäße Importin-α-Variante
kann daher als ein allgemeines Werkzeug zur Charakterisierung von
Zellen Anwendung finden und hat somit generelles diagnostisches
Potential, z.B. zur Diagnose von Krankheiten, die mit einer gestörten Verteilung
von Kernproteinen zwischen Cytoplasma und Zellkern in Zusammenhang
stehen oder ein von dem Normalzustand abweichendes Kernproteinprofil
aufweisen.
Somit
betrifft eine Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung ein Nukleinsäuremolekül, das eine Variante eines
Proteins mit einer biologischen Aktivität von humanem Importin-α kodiert,
das dadurch gekennzeichnet ist, dass die Nukleinsäuresequenz
des Nukleinsäuremoleküls gegenüber der
das native Protein kodierenden Nukleinsäuresequenz eine Mutation aufweist,
die zu einer Inaktivierung der autoinhibitorischen Domäne des humanen
Importin-α bei
der Variante führt.
Bei dem Importin-α handelt
es sich vorzugsweise um humanes Importin-α, mehr bevorzugt humanes Importin-α-1, dessen
Aminosäuresequenz
z.B. in O'Neill
and Palese, Virology 206 (1) (1995), 116–125 beschrieben ist.
Der
hier verwendete Ausdruck „Importin-α" bezieht sich sowohl
auf Importin-α-1
(=Karyopherin-α-1; Gen:
KPNA1) als auf andere, z.T. bereits beschriebene Typen von Importin-α (bzw. den
entsprechenden Genen), die eine nahezu gleiche Funktion wie Importin-α-1 haben,
sich jedoch bezüglich
der Spezifität
für manche NLS
unterscheiden können.
Somit betrifft der hier verwendete Ausdruck "Protein mit einer biologischen Aktivität von humanem
Importin-α" jedes Protein, das
mindestens eine der biologischen Eigenschaften von Importin-α-1 aufweist,
jedenfalls die Fähigkeit
zur spezifischen Bindung an die NLS der Kernproteine.
Der
hier verwendete Ausdruck "Variante
von Importin-α" betrifft jede Form
von Importin-α,
die gegenüber
der nativen Form so verändert
ist, dass die autoinhibitorische Domäne biologisch inaktiv ist,
d.h., die NLS-Bindungsstelle von Importin-α kann nicht mehr blockiert werden.
Dies wird vorzugsweise dadurch erreicht, dass Aminosäure(n) innerhalb
der autoinhibitorischen Domäne
entsprechend verändert
werden. Dies lässt
sich durch die gezielte Einfügung
von Punktmutationen in die Importin-α DNA (siehe bezüglich DNA-Sequenz
und Aminosäuresequenz
O'Neill and Palese,
Virology 206 (1) (1995), 116–125;
Accession-No.: GI:22043734) z.B. mittels der Polymerase-Kettenreaktion
durchführen.
Hierbei kann durch die Wahl geeigneter Oligonukleotide (Primer)
mit einem oder mehreren gegenüber
der Wildtyp-Sequenz veränderten
Nukleotiden eine beliebige Mutation der Aminosäuresequenz gezielt erzeugt
werden.
Vorzugsweise
erfolgt die Inaktivierung der autoinhibitorischen Domäne dadurch,
dass diese ganz oder teilweise deletiert ist. Am meisten bevorzugt
ist eine vollständige
Deletion, die die Aminosäuresequenz
von Position 1 bis 61 umfasst (Importin-α-ΔN).
Die
erfindungsgemäße Importin-α-Variante
kann neben diesen Veränderungen
gegenüber
der nativen Form noch weitere Veränderungen aufweisen, d.h. gegenüber der
nativen Form Deletionen, Additionen und/oder Austausche von einer
oder mehreren Aminosäuren
und/oder (eine) modifizierte Aminosäure(n) aufweisen oder veränderte Oligosaccharidseitenketten,
wobei ihre biologische Aktivität
im wesentlichen erhalten bleibt. Zu den Austauschen zählen vorzugsweise "konservative" Austausche von Aminosäureresten,
d.h. Austausche gegen biologisch ähnliche Reste, z.B. die Substitution
eines hydrophoben Rests (z.B. Isoleucin, Valin, Leucin, Methionin)
gegen einen anderen hydrophoben Rest, oder die Substitution eines
polaren Rests gegen einen anderen polaren Rest (z.B. Arginin gegen
Lysin, Glutaminsäure
gegen Asparaginsäure
etc.). Deletionen können
zur Erzeugung von Molekülen
führen,
die eine deutlich geringere Größe aufweisen
(Fragmente), d.h., denen beispielsweise Aminosäuren am N- oder C-Terminus
fehlen. Die vorstehenden Varianten betreffen auch Importin-α-Varianten,
die im Vergleich zu der ursprünglichen
Form eine ähnliche
oder bessere biologische Aktivität
aufweisen. Diese biologische Aktivität kann mittels der in den nachstehenden
Beispielen beschriebenen Verfahren untersucht werden. Verfahren
zur Erzeugung der vorstehenden Änderungen
in der Aminosäuresequenz
bzw. entsprechenden Nukleinsäuresequenz
sind dem Fachmann bekannt und in Standardwerken der Molekularbiologie
beschrieben, beispielsweise in Sambrook et al., Molecular Cloning:
A Laboratory Manual, 2. Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory Press,
Cold Spring Harbor NY (1989). Der Fachmann ist auch in der Lage
zu bestimmen, ob eine von einer so veränderten Nukleinsäuresequenz
kodierte Importin-α-Variante die Kernlokalisationssequenz
(NLS) noch spezifisch binden kann.
Die
erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle können auch
in einen Vektor inseriert werden. Allgemeine, auf dem Fachgebiet
bekannte Verfahren können
zur Konstruktion von Expressionsvektoren, die die erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen
und geeignete Kontrollsequenzen enthalten, verwendet werden. Zu
diesen Verfahren zählen
beispielsweise in vitro-Rekombinationstechniken,
synthetische Verfahren, sowie in vivo-Rekombinationsverfahren, wie sie beispielsweise
in Sambrook et al., supra, beschrieben sind. Somit umfasst die vorliegende
Erfindung auch diese Nukleinsäuremoleküle enthaltende
Vektoren. Die Bezeichnung "Vektor" bezieht sich auf
ein Plasmid (z.B. pUC18, pBR322, pBlueScript), auf ein Virus oder
ein anderes geeignetes Vehikel. In einer bevorzugten Ausführungsform
ist das erfindungsgemäße Nukleinsäuremolekül im Vektor
mit regulatorischen Elementen funktionell verknüpft, die dessen Expression
in prokaryotischen oder eukaryotischen Wirtszellen erlauben. Solche
Vektoren enthalten neben den regulatorischen Elementen, beispielsweise
einem Promotor, typischerweise einen Replikationsursprung und spezifische
Gene, die die phänotypische
Selektion einer transformierten Wirtszelle erlauben. Zu den regulatorischen
Elementen für
die Expression in Prokaryonten, beispielsweise E.coli, zählen der
lac-, trp-Promotor oder T7-Promotor, und für die Expression in Eukaryonten
der AOX1- oder GAL1-Promotor in Hefe, und der CMV-SV40-, RVS-40-Promotor, CMV-
oder SV40-Enhancer für
die Expression in tierischen Zellen. Weitere Beispiele für geeignete
Promotoren sind der Metallothionein I- und der Polyhedrin-Promotor.
Zu geeigneten Vektoren zählen
beispielsweise auf T7 basierende Expressionsvektoren für die Expression
in Bakterien (Rosenberg et al., Gene 56 (1987), 125, pMSXND für die Expression
in Säugerzellen
(Lee und Nathans, J.Biol.Chem. 263 (1988), 3521, und von Baculovirus
abgeleitete Vektoren für
die Expression in Insektenzellen.
In
einer bevorzugten Ausführungsform
liegt die erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz
so in dem Vektor vor, dass ein Fusionsprotein kodiert wird, das
eine Importin-α- Variante sowie einen
Fusionspartner (Polypeptid oder Peptid) umfasst, wobei der Fusionspartner
am N- oder C-Terminus mit der Importin-α-Variante über eine Peptidbindung verknüpft ist.
Vorzugsweise
handelt es sich bei dem Fusionspartner um ein nachweisbares Polypeptid/Peptid,
z.B. Glutathion-S-Transferase (GST), Strep-tag oder Hemagglutinin(HA)-tag
oder ein Polypeptid/Peptid, das die Anreicherung/Isolierung der
Komplexe aus der Importin-α-Variante
und Kernproteinen erlaubt, z.B. Glutathion-S-Transferase (GST),
Hexahistidin-tag, Calmodulin Binding Protein (CBP)-tag oder Protein
A-tag, wobei Glutathion-S-Transferase bevorzugt ist.
Die
vorliegende Erfindung betrifft auch die vorstehend beschriebenen
Vektoren enthaltende Wirtszellen. Zu diesen Wirtszellen zählen Bakterien,
Hefe, Insekten- und Tierzellen, vorzugsweise Säugerzellen. Verfahren zur Transformation
dieser Wirtszellen, zur phänotypischen
Selektion von Transformanten und zur Expression der erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle unter
Verwendung der vorstehend beschriebenen Vektoren sind auf dem Fachgebiet
bekannt.
Die
vorliegende Erfindung betrifft darüber hinaus die von den vorstehenden
Nukleinäuremolekülen bzw.
diese enthaltenden Vektoren kodierten Importin-α-Varianten (z.B. Importin-α-ΔN) und Fusionsproteine.
Die
vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung
der erfindungsgemäßen Importin-α-Variante
(oder des Fusionsproteins) und Gewinnung des Proteins aus der Kultur.
Geeignete Verfahren zur rekombinanten Herstellung von Proteinen
sind allgemein bekannt (siehe beispielsweise Holmgren, Annu.Rev.Biochem.
54 (1985), 237; LaVallie et al., Bio/Technology 11 (1993), 187;
Wong, Curr.Opin.Biotech.6 (1995), 517; Romanos, Curr.Opin.Biotech.6
(1995), 527; Williams et al., Curr. Opin. Biotech.6 (1995), 538;
und Davies, Curr. Opin.Biotech.6 (1995), 543). Auch geeignete Reinigungsverfahren
(beispielsweise präparative Chromatographie,
Affinitätschromatographie,
beispielsweise Immunoaffinitäts-chromatographie,
HPLC etc.) sind allgemein bekannt.
Schließlich betrifft
die vorliegende Erfindung, die eine erfindungsgemäße Importin-α-Variante,
vorzugsweise als Fusionsprotein mit einem nachweisbaren oder spezifisch
anreichenbaren/isolierbaren Partner erlaubt. Die damit durchführbaren
Nachweise umfassen: (a) Charakterisierung der Proteinzusammensetzung, (b)
analytischer Nachweis von Proteinen, die eine Kernlokalisationssignal
enthalten, (c) Target-Identifizierung (differentielle Protein-Lokalisation
im Kern) und (d) direkte Diagnostik des Kernproteoms.
Somit
erlaubt die erfindungsgemäße Importin-α-Variante
die Diagnose von Erkrankungen, die mit einem veränderten Kernproteom bzw. einem
veränderten
Kernprotein-Expressionsprofil
in Zusammenhang stehen. Die Diagnose umfasst üblicherweise die folgenden
Schritte: (a) Gewinnung einer Zellprobe von dem Patienten, und (b)
Inkontaktbringen der so erhaltenen Zellprobe mit der vorstehend
beschriebenen erfindungsgemäßen Importin-α-Variante
als Sonde unter Bedingungen, die die Bindung der Importin-α-Variante
an Kernproteine erlauben. Dieser Nachweis kann unter Anwendung von
dem Fachmann bekannten Standardtechniken durchgeführt werden.
Diesem sind auch Zellaufschlußverfahren
bekannt, die die Isolierung der Proteine auf eine solche Weise erlauben,
dass diese mit der Importin-α-Varianten
in Kontakt gebracht werden können.
Der Nachweis der gebundenen Importin-α-Variante und somit der Nachweis
der gebundenen Kernproteine kann über übliche Verfahren erfolgen,
vorzugsweise über
Western-Blot. Schließlich
können
die so analysierten bzw. dargestellten Kernproteine bzw. das so
ermittelte Kernprotein-Profil mit einer aus einem Kontrollgewebe
des Patienten bzw. aus einer oder mehreren Kontrollpersonen gewonnenen
Probe verglichen werden.
Weiter
betrifft die vorliegende Erfindung Kits zur Durchführung der
erfindungsgemäßen Diagnoseverfahren,
die eine erfindungsgemäße Importin-α-Variante
enthalten, gegebenenfalls in Kombination mit einem geeigneten Nachweismittel.
Je
nach Ausgestaltung des mit den erfindungsgemäßen Kits durchzuführenden
Diagnoseverfahrens kann die in dem Kit enthaltene Importin-α-Variante
an einem geeigneten Träger
immobilisiert sein.
Schließlich betrifft
die vorliegende Erfindung die Verwendung der erfindungsgemäßen Importin-α-Variante
zur Identifizierung oder Reinigung von NLS-tragenden Proteinen oder
zur Markierung von Kernproteinen (beispielsweise in Bereich „Proteomics"). Der Fachmann kennt
geeignete Techniken zur Durchführung
dieser Verfahren, die Identifizierung von Kernproteinen ist auch
in Beispiel 3 beschrieben.
Die
Erfindung wird weiter anhand der Figuren beschrieben, welche zeigen:
1: Schematische Darstellung der Konstruktion
des GST-Importin-α-ΔN kodierenden
Vektors zur heterologen Expression von Importin-α-ΔN in E.coli
Das
Fusionsgen aus Glutathion-S-Transferase und der kodierenden Sequenz
der Aminosäuren
62 bis 538 aus Importin-α steht
unter Kontrolle des chemisch induzierbaren tac Promotors. Des weiteren
sind Sequenzen für
die Propagation in E.coli (ori) und die Ampicillin-Selektion in
Kultur (Ampr) enthalten.
2: Aminosäuresequenz von Importin-α und Importin-α-ΔN
Fettgedruckt:
Importin-β bindende
bzw. autoinhibitorische Domäne.
Grau hinterlegt: N-terminale Deletion in Importin-α- ΔN.
3: Far Western Blot eines Kernextrakts
aus Jurkat T-Lymphozyten
Verdünnungsreihe
eines Kernextrakts aus Jurkat T-Lymphozyten aufgetrennt mit SDS-PAGE.
Im linken Bild ist eine Silberfärbung
der Gesamtproteine zu sehen. Analog dazu wurde ein „Far Western
Blot" mit GST-Importin-α-ΔN als Sonde
durchgeführt
(rechtes Bild). Die Komplexe aus Kernprotein und Importin α-ΔN wurden
mit den Antikörpern
anti-GST (Ratte IgG) und anti-Ratte IgG gekoppelt mit alkalischer
Phosphatase inkubiert und die Aktivität der alkalischen Phosphatase
mit einer Farbreaktion sichtbar gemacht.
Die
nachstehenden Beispiele veranschaulichen die Erfindung.
