WO2004090122A1 - 舌上皮由来細胞株ｋｔ－１及びその用途 - Google Patents

舌上皮由来細胞株ｋｔ－１及びその用途 Download PDF

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Tetsuya Ookura
Keiko Kawamoto
Akihiro Hino
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National Food Research Institute
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    • C12N5/0618—Cells of the nervous system
    • C12N5/062—Sensory transducers, e.g. photoreceptors; Sensory neurons, e.g. for hearing, taste, smell, pH, touch, temperature, pain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12N2503/00—Use of cells in diagnostics
    • C12N2503/02—Drug screening
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    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
    • G01N2500/10—Screening for compounds of potential therapeutic value involving cells

Definitions

  • Tongue epithelium-derived cell line KT-1 Tongue epithelium-derived cell line KT-1 and its use
  • the present invention relates to a taste sensor, a method for searching for a taste sensor using the same, and more particularly, to a cell line KT-1 established from mouse tongue epithelial cells and its use.
  • the present invention relates to a method for searching for a substance that controls odor, a new taste substance, a taste modifying substance, and a taste reduction auxiliary substance.
  • a first object of the present invention is to provide a cell expressing a taste receptor and a transformant thereof.
  • a second object of the present invention is to provide a taste sensor using the cells.
  • a third object of the present invention is to provide an application of the taste sensor.
  • a fourth object of the present invention is to establish a system that uses cells at various stages of differentiation to search for differentiation-inducing factors for specific taste cells and substances that control the expression of taste receptors. .
  • the present invention provides the following cells, taste sensor, and uses thereof.
  • a cell line that expresses integrin receptor yuichi which was isolated from mouse tongue epithelium using strong expression of integli and ⁇ 1 as an indicator and established by long-term subculture.
  • a cell line ⁇ -1 established by long-term subculturing the cell line KT-1 according to 1 above in the following low serum medium.
  • Insulin final concentration 5 ng / ml
  • KT-1 cells obtained by culturing the cell line KT-1 according to 2 or 3 above in the following differentiation-inducing medium.
  • Epidermal growth factor final concentration 1 ng / ml
  • Keratinocyte growth factor final concentration 1 ng / ml
  • Phenylalanine final concentration 4.95 zg / ml
  • KT-1 cell according to 4, wherein the KT-1 cell functionally expresses a taste receptor.
  • the cell line KT-1 according to any one of the above 1 to 3 or the KT-1 according to the above 4 or 5.
  • Taste sensor including cells.
  • the taste receptor is a sweet receptor, a bitter receptor, a salty channel, or an amino acid receptor.
  • a cell line KT-1 that has not been expressed in the cell line KT-1, and has been transformed by transfection of a taste receptor Yuichi cDNA whose ligand is unknown.
  • the cell line KT-1 of the present invention is a cell established by isolating and culturing mouse tongue epithelial cells for at least two and a half years after culture.
  • the cell line KT-1 is a unique cell line that contains a mixture of undifferentiated cells and cells that express the taste receptor, and is referred to as FERM ⁇ -8347 (deposited on March 27, 2003).
  • FERM ⁇ -8347 deposited on March 27, 2003.
  • FERM ⁇ -8347 deposited on March 27, 2003.
  • FIG. 1 is a drawing showing the results of extracting total RNA from cell line KT-1A and performing RT-PCR using a specific primer.
  • FIG. 2 is a drawing showing the results of detecting taste receptor mRNA in cell line KT-1A.
  • Lane 1 Tlrl
  • Lane 2 Tli'2
  • Lane 3 Tlr3
  • Lane 4 Cytokeratin 8.
  • FIG. 3 is a drawing showing the results of detection of taste receptor uichi mHNA in KT-1C cells.
  • Lane 1 Tlrl Lane 2: Tlr2, Lane 3: Tlr3, Lane 4: Cytokeratin 8.
  • FIG. 4 is a drawing showing an immunohistochemical staining image showing the expression pattern of integrin in adult mouse circumvallate nipples.
  • FIG. 5 is a drawing showing the results of analysis of expression levels of each integrin molecule in the cell line KT- by flow cytometry.
  • Figure 6 shows immunostaining and in situ hybridization of molecules expressed in the cell line KT-1B (upper) and in the mouse circumvallate papillary (lower) and specifically expressed in taste buds. It is a drawing showing a result.
  • FIG. 7 is a drawing showing the results of sweet taste response in KT-1C cells by power calcium imaging.
  • FIG. 8 is a drawing showing the expression of the salty channel ctENaC of the cell line KT-IB by hormones. (Lane 1: progesterone, lane 2: hydrocortisone, lane 3: aldosterone)
  • FIG. 1 is a drawing showing a result.
  • Insulin final concentration 5 ng / ml
  • the resulting cell line was designated as KT-1B strain.
  • the cell line KT-1B has been deposited as FERM BP-8347.
  • the cell line KT-1B was cultured in the following medium for 3 to 7 days to further differentiate the cell line KT-1B to obtain KT-1C cells.
  • Differentiation induction medium MGDB basic medium C
  • Epidermal growth factor final concentration 1 ng / ml
  • Inulin-like growth factor final concentration ⁇ ng / ml
  • Phenylalanine final concentration 4.95 jug / ml
  • the cDNA of the cell line KT-1A was obtained by preparing a total RNA from the cell line KT-1A and performing a reverse transcription reaction using the total RNA as a type II. It is convenient to use a Trizol solution (manufactured by Invitrogen) or the like for RNA extraction. A reverse transcription reaction using 2 ⁇ g of this total UNA can be easily performed by using a Super Script First Strand cDNA synthesis kit (Invitrogen).
  • RNA was extracted from the cell lines KT-1A and KT-1C cells using a Trizol solution. Using 2 g of the obtained RNA, cDNA was synthesized on a 40-1 scale using a Super Script First Strand cDNA synthesis kit.
  • Figures 2 and 3 show cell lines KT-1A (Fig. 2) and KT-1C cells (Fig. 3) shows the results of detection of taste receptor Yuichi mRNA in FIG.
  • Lane 1 Tlrl
  • Lane 2 Tlr2
  • Lane 3 Tlr3
  • Lane 4 Cytokeratin 8.
  • the sweet receptor Yuichi Tlr2 and Tlr3, which are not expressed in the cell line KT-1A are expressed in the KT-1C cells. That is, KT-1C cells contain many cells expressing Tlr2 and Tlr3.
  • the cell lines KT-1A and KT-1C cells can be distinguished in the expression of Tlr2 and Tlr3.
  • Table 2 shows the expression results of the marker molecule and other marker molecules.
  • FIG. 4 is an immunohistologically stained image showing the integrin expression pattern of the adult mouse circumvallate papillae. As shown in FIG. 4, in the circumvallate nipple of the mouse, integrin 34 and integrin 6 were highly expressed confined to the basal epithelium. On the other hand, integrin ⁇ 1 was strongly expressed not only in the basal part but also in taste buds.
  • FIG. 5 shows the expression levels of each integrin molecule in the cell line KT-1B.
  • FIG. 6 shows the expression of undivided cell-specific molecules and taste bud-specific molecules in the cell line KT-1B (upper) and mouse circumvallate papillary (lower).
  • FIGS. 6A and 6B show the expression of musas hi protein
  • FIGS. 6E and 6F show the expression of cytokeratin 8-protein.
  • the scale bar is 40 m.
  • cells stained white indicate cells expressing each molecule.
  • cytokeratin 8 which is a taste bud-specific molecule was also expressed in the cell line KT-1B. Expression of cytokeratin 8 was observed in about 20 to 30% of cells of the cell line KT-1B.
  • RNA probes labeled with digoxigenin were dissolved in a hybridization solution (50% formamide, 5 XSSC, 10% DenhartS 10 mg / ml salmon testis DNA) so that each probe had a concentration of 0.5 ⁇ g / ml.
  • FIG. 6 shows the expression of undivided cell-specific molecules and taste bud-specific molecules in the cell line KT-1B (upper) and mouse circumvallate papillary (lower).
  • Figures 6C and 6D show undivided 6G and 6H show the expression of the taste bud-specific gene STG, and
  • FIGS. 61 and 6J show the expression of bitter taste receptors T2r5, T2rl8, and T2r.
  • FIG. 19 shows the expression of 19.
  • cells stained white indicate cells expressing each molecule.
  • the portion stained black indicates the expressing cells.
  • FIG. 6 ' shows that the cell population containing the cell line KT-1B contains undifferentiated cells, cells expressing taste bud-specific molecules, and cells responding to bitter taste.
  • the cell line KT-1B was cultured in a 35 mm glass bottom dish (Matsunami glass), and when it reached 50-70% confluence, the differentiation induction treatment described in Example 1-3 was performed for 3-7 days. KT-1C cells were obtained.
  • PBS (-) and KT-1C cells were washed twice with imaging buffer one (NaHC0 3 2 2 mM, KC1 5 mM, NaH 2 P0 4 1.25 mM, glucose 10 mM, NaCl 124 m M) in 1 ml 5 ⁇ 1 Fura-2- ⁇ (1 mM dissolved in DMSO ⁇ Molecular Probe) and 5 Probe1 cremophor (acalai tesque) were added and incubated at room temperature for 30 minutes for Fura-2. - ⁇ was taken into cells.
  • imaging buffer one NaHC0 3 2 2 mM, KC1 5 mM, NaH 2 P0 4 1.25 mM, glucose 10 mM, NaCl 124 m M
  • 5 Probe1 cremophor acalai tesque
  • the cells were washed twice with an imaging buffer to remove Fura-2- ⁇ which was not taken up by the cells.Then, fill the dish with 1 ml of a solution containing lmM MgCl 2 and 2 mM CaCl 2 in the imaging buffer. Then, an artificial sweetener Acesulfame K (manufactured by Fluka), which is known to be a ligand for sweet receptor Yuichi Tlr2 / Tlr3, was added to a final concentration of 5 mM.
  • Acesulfame K manufactured by Fluka
  • Cells having a sweet responsiveness that is, cells functionally expressing Tlr2 and Tlr3, which are sweet receptors, respond to Acesulfame K (a sweet substance) to cause calcium to enter the cytoplasm, As a result, cytoplasmic calcium It is known that the concentration increases. Therefore, the fluorescence (490 nm) emitted by Fura-2 caused by calcium flowing into the cytoplasm due to the addition of Acesulfame K is controlled by AquaCosmos software (Hamamatsu Photonics, Inc.) using a CCD camera (Hamamatsu Photonics, Inc.). Were measured over time using an inverted fluorescence microscope (DMRIB, Leica, Inc.) equipped with a laser microscope. After the measurement, temporal change analysis was performed using AquaCosmos software to convert the time-dependent change in the fluorescence intensity of each cell into a change in calcium concentration, and a graph was formed.
  • AquaCosmos software Hamamatsu Photonics, Inc.
  • DMRIB inverted flu
  • FIG. 7 shows the results.
  • FIG. 7A shows the fluorescence intensity before adding Acesulfame K
  • FIG. 7B shows the fluorescence intensity 0.5 minutes after adding Acesulfame K.
  • the color bar on the right side of FIG. 7B indicates that the fluorescence intensity increases from blue to red.
  • the fluorescence intensity changed from green to yellow to red by addition of AcesvdfameK. This indicates that the addition of Aces ulfame K caused a calcium influx into the KT-1C cells and increased the intracellular calcium concentration.
  • FIG. 7C shows the time course of calcium concentration for the cells indicated by the arrows in FIG. 7 7.
  • the horizontal axis represents the time (minutes) from the start of the measurement, and the vertical axis represents the intracellular calcium concentration.
  • the point indicated by the arrow indicates the time when Acesu ame ⁇ was added. From FIG. 7C, it can be understood that the added calcium of Acesulfame K caused a calcium influx into the KT-1C cell, resulting in an increase in the intracellular calcium concentration.
  • KT-1C cells functionally express Tlr2 and Tlr3, which are sweet receptors, and have a sweet responsiveness. Therefore, it was shown that KT-1C cells can be used as a taste sensor for sensing sweetness and can be used to search for alternative sweeteners and sweet taste enhancers. 4788
  • the cells having the sweetness response ability of this example were obtained by treating the cell strain KT-1B deposited as ERM BP-8347 with the MCDB basic medium C described in Examples 1-3. 1 C cells can be isolated by selecting the increase in intracellular calcium concentration due to the addition of Aceslfame K described above as an index.
  • the cell line KT-1B when cultured in the presence of hydrocortisone, is an amyloid-sensitive sodium channel subunit ("ENaC
  • the cell line KT-1B was treated with the hormones progesterone (0.1 ⁇ ⁇ M) ⁇ aldosterone (1 ⁇ M) or hydrocortisone (0.2 ⁇ ) for 6 days to express the salty channel ⁇ 3 ⁇ 4ENaC. Examined.
  • RNA was extracted from the treated cell line KT- using a Trizol solution, and cDNA was synthesized on a 40-to-1 scale using a Super Script First Strand cDNA synthesis kit using the obtained 2 g RNA.
  • cDNA solution (1 ⁇ 1) as type II
  • 2.5 units of TakaraTaq manufactured by Takara
  • primers 0.2 ⁇ M each
  • SEQ ID NOs: 13 and 14 specific to salty channel ENaC. 5 minutes at 95 ° C on a 1 scale, and then 35 cycles of 1 minute at 95 ° C, 1 minute at 58 ° C, and 2 minutes at 72 ° C.
  • a PCR reaction was performed.
  • the PCR reaction solution (8-1) was electrophoresed on a 1.5% agarose gel, stained with ethidium umide, and photographed.
  • Figure 8 shows the taste receptors in the cell line KT-1B treated with each hormone (lane 1: progesterone, lane 2: hydrocortisone, lane 3: aldosterone). Yuichi Shows the results of mRNA detection.
  • N a imaging buffer one NaHC0 3 22mM, KC1 5mM, NaH 2 P0 4 1.25mM, Gunorekosu 10 mM
  • N-methyl D-glucamine 124 mM
  • lzl CoroNa-Red manufactured by Molecular Probe
  • the dish was filled with 1 ml of a solution containing ImM MgCl 2 and 2 mM CaCl 2 in an imaging buffer, and NaCl, which is known to be a salty channel ligand, was added thereto to a final concentration of 50 mM. .
  • FIG. 9A shows the fluorescence intensity before adding NaCl
  • FIG. 9B shows the fluorescence intensity 0.5 minutes after the addition of NaC1.
  • the color bar on the right side of FIG. 9B indicates that the fluorescence intensity is high from blue to red.
  • the fluorescence intensity was changed from blue to yellow * red by the addition of NaCl. This indicates that the inflow of sodium into the KT-1C cell was caused by the addition of NaCl and the intracellular sodium concentration was increased.
  • FIG. 9C shows the time course of sodium concentration for the cells indicated by the arrows in FIG. 9B.
  • the horizontal axis represents the time (minutes) from the start of the measurement
  • the vertical axis represents the intracellular sodium concentration.
  • the point indicated by the down arrow indicates the time when 50 mM NaCl was added
  • the point indicated by the up arrow indicates the time when 150 mM NaCl was added.
  • FIG. 9C also shows that the addition of NaCl caused the influx of sodium into the KT-1C cell, resulting in an increase in intracellular sodium concentration.
  • the intracellular sodium concentration also changed according to the added NaCl concentration.
  • KT-1C cells functionally express the salty channel, ENaC, and have salty response ability. Therefore, it was shown that KT-1C cells can be used as a taste sensor for sensing salty taste and can be used to search for a salty substitute substance or a salty taste enhancing substance.
  • the cell having the salty response ability of this example is KT-1 obtained by treating the cell strain KT-1B deposited as FERM BP-8347 with the MCDB basic medium C described in Examples 1-3.
  • C cells can be isolated by selecting the above-mentioned increase in intracellular sodium concentration due to NaCl-added calo as an index.
  • the cell line KT-1B was cultured in a 35 mm glass bottom dish (Matsunami glass), and when it reached 50-70% confluence, the KT-1B cells washed twice with PBS (-) were transferred to an imaging buffer.
  • PBS PBS
  • the fluorescence (490 nm) emitted by Fluo-3 due to the calcium flowing into the cytoplasm due to the addition of cycloheximide was measured by AquaCosmos Software One (Hamamatsu Photonics). The measurement was performed over time using an inverted fluorescence microscope (Leica, DMRIB) equipped with a CCD camera (manufactured by Hamamatsu Photonics, Inc.) controlled by the company. After the measurement, the time-dependent change of the fluorescence intensity in each cell was converted to a calcium concentration change using AquaCosmos software, and the time-dependent change was calculated and graphed.
  • the cells having the bitter taste response ability in this example were obtained by simply selecting the cell line KT-1B deposited as FERM BP-8347 using the above-mentioned increase in intracellular calcium concentration by the addition of cycloheximide as an index. Can be released.
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Abstract

　マウス舌上皮よりインテグリンβ１の強発現を指標に単離され、長期継代培養して樹立された、味覚レセプターを発現する細胞である細胞株KT-1；細胞株KT-1を含む味覚センサー；及び、細胞株KT-1の、味細胞の分化誘導因子や味覚レセプターの発現を制御する物質、新規味物質、味覚修飾物質、味覚減退補助物質を探索するための使用。

Description

明細書
舌上皮由来細胞株 KT- 1及びその用途
技術分野 '
本発明は、 味覚センサー、 これを利用した味覚センサー等の探索方法に関し、 さらに詳細には、 マウス舌上皮細胞から樹立された細胞株 KT-1及びその用途に 関する。 特に、 マウス舌上皮細胞より樹立された細胞株 KT-1を味覚センサ一と して利用する方法、 ならびに細胞株 KT-1を利用して味細胞の分化誘導因子や味 覚レセプ夕—の発現を制御する物質、 新規味物質、 味覚修飾物質、 味覚減退補助 物質を探索する方法に関する。 背景技術
舌上皮細胞を単離 .培養する方法は既に報告されている （例えば、 In Vitro Cell. Dev.Biol. 38: 365-372 (2002)参照） 。 しかしながら、 舌上皮由来の細胞 で味覚レセプ夕一を発現する細胞株や分化状態の異なる細胞集団を含む細胞株に ついては報告されていない。 このため、 生きた細胞を用いて特定の味応答を再現 性良く測定することや、 味細胞の分化誘導因子を同定するシステムを構築するこ とは非常に困難であった。 発明の開示
本発明の第 1の目的は、 味覚レセプターを発現する細胞及びその形質転換体を 提供することである。
本発明の第 2の目的は、 上記細胞を用いた味覚センサーを提供することである
本発明の第 3の目的は、 上記味覚センサ一の用途を提供することである。 本発明の第 4の目的は、 様々な分化段階の細胞を利用して、 特定の味細胞への 分化誘導因子や味覚レセプ夕一の発現を制御する物質を探索する系を確立するこ . あ 。
以下、 本発明を詳細に説明する。 発明を実施するための形態
本発明は以下の細胞、 味覚センサ一、 その用途を提供するものである。
1 . マウス舌上皮よりィンテグリ、ノ β 1の強発現を指標に単離され、 長期継代培 養して樹立された、 Β来覚レセプ夕一を発現する細胞である細胞株 ΚΤ-1。
2 . 前記 1に記載の細胞株 KT-1を、 以下の低血清培地中で長期継代培養して樹 立された細胞株 ΚΤ-1。
カ レシゥム 最終濃度 5 j glmi
上皮成長因子 最終濃度 10 ng/ml
塩基性繊維芽細胞成長因子 最終濃度' 10 ng/ml
インシュリン 最終濃度 5 ng/ml
トランスフェリン 最終濃度 10 ng/mi
ヒドロコルチゾン 最終濃度 0.2 juM
ェ夕ノールアミン 最終濃度 0.5 JLLM
ホスホエタノールアミン 最終濃度 0.5 uM
へパリン 最終濃度 20 z /ml
ゲン夕マイシン 最終濃度 10 mg/ml
アンフォテリシン Β 500 ng/ml
ペニシリン 琼終 50 U/ml
ストレブトマイシン 最終濃度 50 mg/ml
カルシウムをキレートした牛胎児血清 最終濃度 0.25 % 3 . 受託番号: FEE BP-8347で寄託されている、 前記 2.に記載の細胞株 KT-1。
4 . 前記 2又は 3に記載の細胞株 KT-1を、 以下の分化誘導培地中で培養して得 られる KT-1細胞。
曰 、,曲
カノレシゥム 取' 濃度 10
上皮成長因子 最終濃度 1 ng/ml
ケラチノサイト成長因子 最終濃度 1 ng/ml
インシュリン様成長因子 最終濃度 D ng/ml
トランスフェリン 最終濃度 100 ng/ml
ヒドロコルチゾン 最終濃度 0.2 /M
アルドステロン 最終濃度 10 nM
エタノールァミン 最終濃度 0.5 Ά
ホスホエタノールァミン 最終濃度 0.5 μΆ
カルシトリオール 最終濃度 10 nM
9-シス レチノイン酸 最終濃度 0.8
グルタチオン 最終濃度 200
システィン 最終濃度 50 μΆ
チロシン 最終濃度 2.72 jug/ml
フエ二ルァラニン 最終濃度 4.95 zg/ml
へパリン 最終濃度 20 us i
ゲン夕マイシン 最終濃度 10 mg/ml
アンフォテリシン Β 最終濃度 500 ng/ml
ぺニシリン 最終濃度 50 U/ml
ストレプトマイシン 最終濃度 50 mg/ml
5 . 味覚レセプ夕一を機能的に発現している、 前記 4に記載の KT-1細胞。
6 . 前記 1 〜 3のいずれかに記載の細胞株 KT-1又は前記 4又は 5に記載の KT-1 細胞を含む味覚センサ一。
7 . 前記 1〜 3のいずれかに記載の細胞株 KT-1又は前記 4又は 5に記載の KT-1 細胞を用いて、 該味覚レセプ夕一が受容する味物質を識別することを特徴とする 細胞株 KT-1の味覚センサ一としての使用。
8 . 味覚レセプ夕一が甘味レセプ夕一、苦味レセプ夕一、 塩味チャネル、 又はァ ミノ酸レセプ夕一である、 前記 7記載の使用。
9 . 細胞株 KT-1で発現していない、 リガンドが既知である味覚レセプ夕一 cDN
Aの遺伝子導入により形質転換された細胞株 KT-1。
1 0 . 前記 9記載の形質転換された細胞株 KT-1の、 該味覚レセプ夕一が受容す る特定の味を感知する細胞としての使用。
1 1 . 細胞株 KT-1で発現していない、 リガンドが未知である味覚レセプ夕一 cD NAの遺伝子導入により形質転換された細胞株 KT-1。
1 2 . 前記 1 1記載の形質転換された細胞株 KT-1を使用して、 該未知のリガン ドを探索する方法。
1 3 . 前記 1〜 3のいずれかに記載の細胞株 KT-1又は前記 4又は 5に記載の ΚΤ -1細胞の、 味細胞の分化誘導因子や味覚レセプ夕一の発現を制御する物質、 新規 味物質、 味覚修飾物質、 味覚減退補助物質を探索するための使用。
1 4 . 前記 1〜 3のいずれかに記載の細胞株 KT-1又は前記 4又は 5に記載の ΚΤ -1細胞及び味物質を用いて、 該味物質に対する味覚レセプ夕一を探索する方法。
1 5 . 味覚レセプ夕一が塩味チャネルである、 前記 1 4に記載の方法。 本発明の細胞株 KT-1は、 マウス舌上皮細胞を単離 '培養後、 2年半以上継代 •維持することにより樹立された細胞である。細胞株 KT-1は、 未分化な細胞と 味覚レセプ夕一を発現する細胞とが混在するユニークな細胞株であり、 FERM ΒΡ-8347(寄託日:平成 15年 3月 27日）として〒 305-8566茨城県つくば巿東 1丁目 1 番地 1中央第 6の独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託セン夕一に寄託 されている。 図面の簡単な説明
図 1は、 細胞株 KT-1Aから total RNAを抽出し、 特異プライマ一を用いて RT- PCRを行つた結果を示す図面である。
図 2は、 細胞株 KT-1Aにおける味覚レセプ夕一 mRNAの検出結果を示す図面 である。 図中、 レーン 1: Tlrl、 レーン 2: Tli'2、 レーン 3: Tlr3、 レーン 4: サイ トケラチン 8である。
図 3は、 KT-1C細胞における味覚レセプ夕一 mHNAの検出結果を示す図面で ある。 図中、 レーン 1: Tlrl レ一ン 2: Tlr2、 レーン 3: Tlr3、 レーン 4:サイト ケラチン 8である。
図 4は、 成体マウス有郭乳頭におけるィンテグリンの発現パ夕一ンを示す免疫 組織染色像を示す図面である。
図 5は、 細胞株 KT- における各インテグリン分子の発現レベルをフローサ ィトメ一夕一で解析した結果を示す図面である。
図 6は、 細胞株 KT-1B (上段） およびマウス有郭乳頭 （下段） で発現する未 分ィ匕および味蕾特異的に発現する分子について、 免疫染色ならびに in situハイ ブリダイゼーシヨンを行つた結果を示す図面である。
図 7は、 力ルシゥムイメージングによる KT- 1C細胞における甘味受容応答の 結果を示す図面である。
図 8は、 ホルモンによる細胞株 KT- IBの塩味チャネル ctENaC発現の変ィ匕を示 す図面である。 (レーン 1 ：プロゲステロン、 レーン 2 ：ヒドロコルチゾン、 レ —ン 3 ：アルドステロン）
図 9は、 ナトリウムィメ一ジングによる： T-1C細胞における塩味受容応答の 結果を示す図面である 発明を実施するための最良の形態
以下、 実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、 本発明は下記実施例に 限定されるものではない。 実施例
1 . 細胞株 KT-1の樹立方法
1 - 1 . 細胞株 KT-1A株の樹立
マウス舌上皮からィンテグリ、ノ β 1の強発現を指標に細胞を回収し、 初代培養 後 1年間半、 以下の培地により維持 ·継代 ( 1 - 2週間に一度） した。 培地： MCDB153基本培地 A
カルシウム 最終濃度 5 j g/val
上皮成長因子 最終濃度 10 ng/ml
塩基性繊維芽細胞成長因子 最終濃度 10 ng/ml
ィンシユリン 最終濃度 5 ng/ml
トランスフェリン 最終濃度 10 ng/ml
ヒドロコルチゾン 最終濃度 0.2 μΜ
エタノールアミン 最終濃度 0.5 μΜ
ホスホエタノールアミン 最終濃度 0.5 J LM
へパリン 最終濃度 20 /ml
ゲンタマイシン 最終濃度 10 mg ml
アンフォテリシン B 最終濃度 500 ng/ml
ぺニシリン 最終濃度 50 U/ml ストレプトマイシン 最終濃度 50 mg/ml カルシウムをキレートした牛胎児血清 最終濃度 0.5 % 得られた細胞株を KT-1A株とした。
1— 2 . 細胞株 KT- IB株の樹立
継代のために細胞株 KT-1Aが付着しているプラスティヅクディッシュを 3回 P BS(-)で洗浄した後、 0 . ◦ 5 %トリプシン- 1 mM EDTAをカロえて 3 7。。で 5 - 1 0分間反応させた。 ディヅシュより剥がれてきた細胞を、 トリプシン活性を中 和してから遠心により回収し、 新たな培地で懸濁して、 コラーゲンタイプ IV (3 g/ml) とマトリジエル （10〃l/ml) でコ一トしたプラスティヅクディヅシュに 播いた。 そして、 以下のより血清濃度の低い (0.25%)培地にて、 3 - 4日間に一度 の継代を 1年半以上行い続けた。 培地： MCDB153基本培地 B
カルシウム 最 濃度 . 5
上皮成長因子 最終濃度 10 ng/ml
塩基性繊維芽細胞成長因子 最終濃度 10 ng/ml
インシュリン 最終濃度 5 ng/ml
トランスフェリン 最終濃度 10 ng/ml
ヒドロコルチゾン 最終濃度 0.2 j M
エタノールァミン 最終濃度 0.5 juM
ホスホェ夕ノ一ルァミン 最終濃度 0.5 M
へハ。リン ^終濃度 20 ju g/ml
ゲン夕マイシン 10 mg/ml アンフォテリシン B 最終濃度 500 ng/ml ペニシリン 最終濃度 50 U/ml
ストレプトマイシン 最終濃度 50 mg/ml
カルシウムをキレートした牛胎児血清 最終濃度 0.25 % 得られた細胞株を KT-1B株とした。 細胞株 KT-1B株は FERM BP- 8347として 寄託されている。
1— 3 . 細胞株 KT-1Bから KT-1C細胞への分化誘導
細胞株 KT-1Bを以下の分ィ匕誘導培地で 3〜 7日間培養して、 細胞株 KT-1Bを 更に分化させて KT-1C細胞を得た。 分化誘導培地： MGDB基本培地 C
カルシウム 最終濃度 10 g/ml
上皮成長因子 最終濃度 1 ng/ml
ケラチノサイト成長因子 取終 1 ng/ml
インシユリン様成長因子 最終濃度 ΰ ng/ml
トランスフェリン 最終濃度 100 ng/ml
ヒドロコルチゾン 最終濃度 0.2 j
アルドステロン 最終濃度 10 nM
エタノーレアミン 最終濃度 0.5 μ
ホスホエタノールアミン 最終濃度 0.5
Figure imgf000009_0001
カルシトリオール 最終濃度 10 nM
9-シス レチノイン酸 最終濃度 0.8 zM
グル夕チオン 最終濃度 200 μΆ システィン 終辰度 50 /zM
チロシン 最終濃度 2.72 g/ml
フエ二ルァラニン 最終濃度 4.95 jug/ml
へパリン 最終濃度 20 ig/ail
ゲン夕マイシン 最終濃度 10 mg/ml
アンフォテリシン B 最終濃度 500 ng/ml
ペニシリン 最終濃度 50 U/ml
ストレプトマイシン 最終濃度 50 mg/ml
2 - 1 . RT-PCRによる細胞株 KT-1Aにおける味覚関連遺伝子の mRNA発現の 確認
(実験方法）
細胞株 KT- 1Aの cDNAを、 細胞株 KT- 1Aから total RNAを調製し、 この total RNAを錶型とした逆転写反応により得た。 RNAの抽出には Trizol溶液 (Invitrog en社製） 等を用いることが簡便である。 この total UNA 2〃gを用いて、 逆転 写反応を行うには、 Super Script First Strand cDNA合成キット （Invitrogen 社製） を用いると簡便に行うことができる。
この cDNAを錡型として、 あらかじめ設計しておいた各味覚レセプ夕一及び味 蕾関連分子に特異的なプライマー （各 0.2〃M) . (表 1 ) を用い、 2.5ユニットの TakaraTaq (Takara社製） を加えて スケールにて 9 5 °Cで 5分変性した後 、 9 5 °Cで 1分、 5 5 - 5 8 で1分、 7 2 °Cで 2分 を 1サイクルとする 3 5 サイクルの; PCR反応を行った。 各プライマーの配列は、 表 1に示した （但し、 配列番号 3 1〜3 4のプライマ一は、 後述する実施例 2— 2で使用した。 ) P CR反応液 8〃1を 1.5%ァガロースゲルで電気泳動し、 ェチジゥムプロマイ ドで染 色して写真撮影を行った。 表 1
味蕾ならびに未分化細胞に特異的なマ一力一に対するォリゴヌクレオチドプライ マ一、 アニーリング温度 (°C)及び PCR産物の大きさ （bp)
Figure imgf000011_0001
(実験結果）
結果を図 1に示す。 細胞株 KT-1Aでは、 味覚レセプターをコードする Tlrl、 T 2r5、 T2rl8、 T2rl9や塩味の受容に関わるひ ENaC (アミ口ライド感受性ナトリ ゥムチャンネル サブユニット） 、 Gタンパク質である Ga'i2、 Gai3s Gァ 13、 ならびに、 味蕾およびその周囲で特異的に発現する STG、 サイトケラチン 8、 P atchedl (図面において Ptel又は patclied-1と表記することもある）の発現が確認さ れたが、 Tlr2、 Tlr3及び gustducinは発現していなかった。 以上より、 細胞株 K T-1Aは、 未分化な細胞から味覚レセプ夕一を発現する細胞まで、 様々な分化段 階の細胞から構成されていることがわかる。
2 - 2 . 細胞株 KT-1A及び KT-1C細胞における味覚レセプ夕一 mRNAの検出 ·
(実験方法）
細胞株 KT-1A及び KT-1C細胞から Trizol溶液によりそれぞれの RNAを抽出し た。 得られた RNA 2〃g用いて、 Super Script First Strand cDNA合成キヅト により cDNAを 4 0〃1スケールで合成した。 この cDNA溶液 1〃1を錶型に各味 覚レセプ夕一 （Tli'l、 Tlr3、 Tlr2及びサイ トケラチン 8 ) に特異的なプライマ ― (Tlrl：配列番号 3 1及び 3 2、 Tlr3：配列番号 3 3及び 3 4、 Tlr2：配列 番号 3及び 4、 サイトケラチン 8 ：配列番号 2 7及び 2 8 ) (各 0·2〃Μ) を用 いて 2.5ュニヅト TakaraTaq (Takara社製） を加えて 25〃1スケールにて 9 5 °C で 5分変性した後、 9 5。0で1分、 5 8— 6 8 °0で1分、 7 2 °Cで 2分を 1サイ クルとする 3 5サイクルの PCR反応を行った。 PCR反応液 8〃1を 1.5%ァガ口一 スゲルで電気泳動し、 ェチジゥムプロマイドで染色して写真撮影を行った。
(実験結果）
図 2及び 3に、 RT-PCR法による細胞株 KT-1A (図 2 )及び KT-1C細胞 （図 3 ) における味覚レセプ夕一 mRNAの検出結果を示す。 各図において、 レーン 1: Tlrl、 レーン 2: Tlr2、 レ一ン 3: Tlr3、 レーン 4:サイトケラチン 8である。 図 2と図 3とを対比すると細胞株 KT-1Aでは発現していない甘味レセプ夕一 T lr2及び Tlr3が KT-1C細胞では発現している。 すなわち、 KT-1C細胞には Tlr2 及び Tlr3を発現する細胞が多く含まれている。 したがって、 細胞株 KT-1Aと KT -1C細胞とは、 Tlr2及び Tlr3の発現において区別することができる。
また、 前記マ一カー分子及びその他のマーカ一分子の発現結果を、 以下の表 2 に 5
表 2
細胞株 KT-1A及び KT-1C細胞における種々のマ一力一分子の発現
マ一カー分子 発現の有無
細胞株 KT-1A KT-1C細胞 味蕾特異的マーカ一
サイトケラチン 8 + + + +
S T G + +
味覚レセプ夕一とチャンネル
Tlrl + +
Tlr2 一 ++
Tlr3 一 ++
T2r5 + ―
T2rl8 + +
T2rl9 + + +
aENaC + +
Gタンパク質
gustducin ― ―
G i2 + + +
Gai3 + + +
Gァ 13 + + +
未分化マーカ一
1 _ L"L fl丄し1 + + ++
Notch 1 + + ++ 表中の記号の意味は以下のとおりである。
+ + :強く発現している、 + :発現している、 一：発現していない。
2-3. 有郭乳頭の免疫組織染色
(実験方法）
雄 C57BL/6マウスの舌を摘出後、 有郭乳頭の凍結切片 （10〃m) を載せたス ライ ドを、 4 %パラフオルムアルデヒドを含む PBS (-)で固定した後、 様々な抗 インテグリン抗体と 4°Cで一晩反応させた後、 蛍光標識 2次抗体 （Alexa488標 識抗ゥサギもしくは抗マウス IgGならびに Cy3標識抗ハムスターもしくはラヅ ト I gG) で染色した。
(実験結果）
図 4は、 成体マウス有郭乳頭のィンテグリン発現パターンを示す免疫組織染色 像である。 図 4に示すように、 マウスの有郭乳頭では、 インテグリン 34とイン テグリンひ 6とが上皮基底部に限局して強発現していた。 一方、 インテグリン^ 1は基底部のみならず、 味蕾においても強い発現が認められた。
2-4..細胞株 KT-1Bのフ口一サイトメ一夕一解析
(実験方法）
細胞株 KT-1B (2 X105個） を抗インテグリンモノクローナル抗体 ( l j g) と 4 °Cで 30分間反応させた後、 FITC標識 2次抗体で染色し、 発現レベルを示 す強度をフローサイトメ一夕一にて解析した。
(実験結果）
細胞株 KT- 1Bにおける各インテグリン分子の発現レベルを図 5に示した。 有 郭乳頭付近の舌上皮基底部 （図 4 ) と同様に細胞株 KT-1Bでは、 ひ 6、 1、 ;5 4の発現が認められた。 したがって、 細胞株 KT-1Bは、 上記の有郭乳頭と同 様のインテグリンの発現パターンを示した。 このことから、 細胞株 KT-1Bには 、 基底部にある未分化の細胞と味蕾の細胞が混在していることが分かつた。
2 - 5 . マウス有郭乳頭及び細胞株 KT-1Bの免疫染色
(実験方法）
スライ ドガラス上で培養した細胞株 KT-1B、 及び、 上記の実施例 2— 3と同 様にして 4 %パラフオルムアルデヒドを含んだ PBS (-)により室温下で 1 0分間 固定したマウス有郭乳頭を、 抗 nmsashi抗体ゃ抗サイトケラチン 8抗体等と 4 °C で一晚反応させた後、 Mexa488-標識 2次抗体で染色した。
(実験結果）
図 6に、 細胞株 KT-1B (上段） およびマウス有郭乳頭 （下段） における未分 化細胞特異的分子及び味蕾特異的分子の発現を示す。 図 6 A及び図 6 Bは musas hi夕ンパク質、 図 6 E及び図 6 Fはサイトケラチン 8夕ンパク質の発現をそれぞ れ示す。 スケールバ一は 40 mである。 図 6中、 白く染まった細胞が、 各分子 を発現している細胞を示す。
図 6 A及び図 6 Bに示されるように、 有郭乳頭の基底部近傍で musashi夕ンパ ク質 （神経幹細胞で発現しているマーカー） の発現が認められ、 細胞株 KT-1B でも強い発現が認められた。 また図 6 E及び 6 Fに示されるように、 味蕾特異的 分子であるサイ トケラチン 8が細胞株 KT-1Bでも発現していた。 細胞株 KT-1B の約 2 0 - 3 0 %の細胞でサイトケラチン 8の発現が認められた。
2 - 6 . マウス有郭乳頭及び細胞株 KT-1Bの in situハイプリダイゼ一シヨン
4 による味覚関連分子の発現の確認
(実験方法）
マウス； Patchedl、 STG、 T2r5、 T2rl8、 T2rl9の各 cDNAを、 pGEM-Tプラス ミド (Promega社製)にサプクロ一ニングし、 これらのプラスミドを鎵塑に DIG β NA labeling Idt (ロッシュ社製） を用いてジゴキシゲニンで標識した RNAプロ —プを作製した。 これらを各プロ一ブが 0.5〃g/mlの濃度になるようにハイプリ ダイゼ一シヨン溶液 （50%フオルムアミド、 5 XSSC、 10% DenhartS 10mg/m 1サケ精巣 DNA) に溶角 した。 スライドガラス上で培養した細胞株 KT-1B、 及び 、 上記の実施例 2— 3と同様にして 4 %パラフオルムアルデヒドを含んだ PBS (- )により室温下で 1 0分間固定したマウス有郭乳頭を、 それそれ上記のプロ一ブ 液を希釈したハイプリダイゼーション液で被覆し、 6 5 °Cでー晚ハイブリダイズ した。
2 XSSC (室温で 5分)と 0.2 XSSC ( 6 5 °Cで 9 0分） で洗浄後、 I Xチラミ ドプロヅキングバッファ一 （Dupont社製） で 2時間ブロッキングした後、 Anti- Digoxigenin-POD (ブロッキングバッファ一で 1 0 0倍希釈、 ロッシュ社製） と 4 °Cでー晚反応させた。 0.02% Tween-20を含む PBS (-)にて 5分間 3回洗浄し た後、 ピオチニルチラミド （チラミドリアクションバヅファーで 5 0倍希釈、 D upont¾製） と 3 7 °Cで 3 0分間反応させた。 0.02% Tween-20を含む PBS (-)に て 5分間 3回洗浄した後、 ストレプトアビジン- Alexa488 (PBS (-)で 2 5 0倍希 釈、 Molecular Probe社製） と反応させて蛍光顕微鏡 （ライカ社製、 DMRIB) で観察，写真撮影した。
(実験結果）
図 6に、 細胞株 KT-1B (上段） およびマウス有郭乳頭 （下段） における未分 化細胞特異的分子及び味蕾特異的分子の発現を示す。 図 6 C及び 6 Dは、 未分ィ匕 細胞マ一カーである Patchedlの発現を示し、 図 6 G及び 6 Hは、 味蕾特異的遺 伝子 STGの発現を示し、 図 6 1及び 6 Jは、 苦味レセプター T2r5、 T2rl8、 T2r
19の発現を示す。 図 6中、 白く染まった細胞が、 各分子を発現している細胞を 示す。 但し、 図 6 Dでは、 黒く染まった部分が発現細胞を示す。 図 6'より、 細胞 株 KT-1Bを含む細胞集団中には、 未分化な細胞、 味蕾特異的分子を発現する細 胞及び苦味に応答する細胞を含んでいることが分かる。
3 .カルシウムイメージングを用いた KT- 1C細胞の甘味応答能の確認
(実験方法）
35mmガラスボトムディッシュ （松浪ガラス） 中で細胞株 KT-1Bを培養し、 5 0-70%コンフルェントになった時点で、 実施例 1— 3に記載の分化誘導処理を 3 - 7日間施して、 KT-1C細胞を得た。
PBS (-)で 2回洗浄した KT-1C細胞を、 イメージング用バッファ一 （NaHC03 2 2 mM、 KC1 5 mM、 NaH2P04 1.25 mM、 グルコース 10 mM、 NaCl 124 m M) 1 mlに 5〃1 Fura-2-ΑΜ (DMSOで溶解した 1 mMヽ Molecular Probe社製 ) と 5〃1クレモフォァ ( acalai tesque社)とを加えたものと一緒に室温で 3 0分 間インキュベートして Fura-2-ΑΜを細胞内へ取り込ませた。 その後、 イメージ ングバヅファ一で 2回洗浄して細胞に取り込まれなかつた Fura-2-ΑΜを除いた 次いでイメージングバヅファーに lmM MgCl2と 2 mM CaCl2とを加えた液 1 mlでデイツシュを満たし、 そこへ甘味レセプ夕一 Tlr2/Tlr3のリガンドであるこ とが知られている人工甘味料 Acesulfame K (Fluka社製） を終濃度で 5 mMに なるように加えた。 甘味応答能を有する細胞、 すなわち甘味レセプ夕一である T lr2及び Tlr3が機能的に発現している細胞は、 Acesulfame K (甘味物質） に応 答してカルシウムの細胞質内への流入が起こり、 その結果、 細胞質内カルシウム 濃度が上昇することが知られている。 そこで、 Acesulfame Kの添加により細胞 質へ流入したカルシウムに起因して Fur a-2が出す蛍光 (490nm)を、 AquaCosmo sソフトウェアー (浜松ホトニクス社製) で制御された CCDカメラ (浜松ホトニ クス社製） を装着した蛍光倒立顕微鏡 （ライカ社， DMRIB) で経時的に測定し た。 測定後、 AquaCosmosソフトウェア一で各細胞における蛍光強度の経時変化 をカルシウム濃度変化へ換算する絰時変化解析を行い、 グラフ化した。
(実験結果）
結果を図 7に示す。 図 7 Aは Acesulfanie Kを入れる前の蛍光強度を示し、 図 7 Bは Acesulfame Kの添加 0 . 5分後の蛍光強度を示している。 図 7 Bの右側 のカラーバーは、 青色から赤色に向かって蛍光強度が強いことを示している。 図 7 Bの矢印で示した細胞について図 7 Aと 7 Bとを比較すると、 Acesvdfam e K添加により蛍光強度が緑色から黄色 '赤色へと変化した。 このことは、 Aces ulfame Kの添加により、 KT-1C細胞内部へのカルシウム流入が起こり細胞内力 ルシゥム濃度が上昇したことを示している。
図 7 Cは、 図 7 Βの矢印で示した細胞についてのカルシウム濃度の経時的変化 を示している。 図 7 Cにおいて、 横軸は測定開始からの時間 （分） 、 縦軸は細胞 内カルシウム濃度を示している。 また、 矢印で示した点は Acesu ame Κを添カロ した時点を示している。 図 7 Cからも Acesulfame Kの添カロにより、 KT-1C細胞 内部へのカルシウム流入が起こり、 結果として細胞内カルシウム濃度が上昇した ことが理解される。
以上より、 KT-1C細胞は、 甘味レセプ夕一である Tlr2及び Tlr3を機能的に発 現しており、 甘味応答能を有することが理解される。 したがって、 KT-1C細胞 を、 甘味を感知する味覚センサ一として利用可能であること及び代替甘味料や甘 味増強物質を探索するために利用可能であることが示された。 4788 本実施例の甘味応答能を有する細胞は、 ERM BP-8347として寄託された細 胞株 KT-1Bを、 実施例 1 - 3に記載の MCDB基本培地 Cにて処理して得られる KT-1 C細胞を、 上述の Aces lfame K添加による細胞内カルシウム濃度の上昇を指標 として選択することによつて単離することができる。
4 . 細胞株 KT-1Bを用いたホルモンによる味覚レセプ夕一の発現制御
(実験方法）
細胞株 KT-1Bは、 ヒドロコルチゾン存在下で培養している間は、 塩味の受容 に閧与するアミ口ライド感受性ナトリゥムチャンネル サブュニヅ ト （"ENaC
) を恒常的に発現している。
そこで、 細胞株 KT-1Bを、 ホルモンであるプロゲステロン （0.1〃M) ヽ アル ドステロン （1〃M) 又はヒドロコルチゾン (0·2〃Μ)で 6日間処理して、 塩味チ ャネル <¾ENaCの発現を調べた。
処理した細胞株 KT- から Trizol溶液により RNAを抽出し、 得られた 2〃 g R NAを用いて、 Super Script First Strand cDNA合成キヅトにより cDNAを 4 0 〃1スケ一ルで合成した。 この cDNA溶液 1〃1を錶型として、 塩味チャネルひ EN aCに特異的なプライマ一 （各 0.2〃M) (配列番号 1 3及び 1 4 ) を用い、 2.5 ュニヅト TakaraTaq (Takara社製） を加えて 25 1スケールにて 9 5 °Cで 5分変 性した後、 9 5 °Cで 1分、 5 8 °Cで 1分、 7 2 °Cで 2分を 1サイクルとして、 3 5サイクルの PCR反応を行った。 PCR反応液 8〃1を 1.5%ァガロースゲルで電気 泳動し、 ェチジゥムブ口マイドで染色して写真撮影を行った。
(実験結果）
図 8に、 各ホルモン （レーン 1 ：プロゲステロン、 レーン 2 ：ヒドロコルチゾ ン、 レーン 3 ：アルドステロン） で処理した細胞株 KT-1Bにおける味覚レセプ 夕一 mRNAの検出結果を示す。
図 8に示すように、 プロゲステロン処理細胞と比較して、 アルドステロン又は ヒドロコルチゾンで処理した細胞では、 塩味チャネルである aENaCの発現量が 増加していることが明らかとなった。
5 . ナトリゥムイメージングを用いた KT-1C細胞の塩味応答能の確認
(実験方法）
実施例 3と同様にして誘導した KT-1C細胞を、 PBS (-)で 2階洗浄し、 次いで N aイメージング用バッファ一 （NaHC03 22mM, KC1 5mM, NaH2P04 1.25mM , グノレコース 10mM， N-methyl D-glucamine 124mM) 1mlに： l zl CoroNa- Red (Molecular Probe社製)を加えたものと一緒に室温で 3分間インキュベ一 トして CoroNa-Redを細胞内へ取り込ませた。 その後、 Naイメージング用バヅ ファーで 2回洗浄して細胞に取り込まれなかった CoroNa-Redを除いた。
次いでイメージングバヅファーに ImM MgCl2と 2mM CaCl2とを加えた液 lml でディヅシュを満たし、 そこへ塩味チャネルのリガンドであることが知られてい る NaClを終濃度で 50mMになるように加えた。 塩味応答能を有する細胞、 すな わち塩味チャネルである "ENaCが機能的に発現している細胞は、 NaCl (塩味 物質） に応答してナトリウムの細胞質内への流入が起こり、 その結果、 細胞質内 ナトリウム濃度が上昇することが知られている。 そこで、 NaClの添カ卩により細 胞質へ流入したナトリゥムに起因して CoroNa-Redが出す蛍光 (580nm)を、 Aqua Cosmosソフトウェア一 （浜松ホトニクス社製） で制御された CCDカメラ （浜松 ホトニクス社製) を装着した蛍光倒立顕微鏡 (ライカ社, DMRIB) で経時的に 測定した。 測定後、 AquaCosmosソフトウェア一で各細胞における蛍光強度の経 時変化をナトリゥム濃度変ィ匕へ換算する絰時変ィ匕解析を行い、 グラフ化した。 (実験結果）
結果を図 9に示す。 図 9 Aは NaClを入れる前の蛍光強度を示し、 図 9 Bは Na C1の添加 0 . 5分後の蛍光強度を示している。 図 9 Bの右側のカラ一バーは、 青色から赤色に向かつて蛍光強度が強いことを示している。
図 9 Aと 9 Bとを比較すると、 NaCl添加により蛍光強度が青色から黄色 *赤 色へと変ィ匕した。 このことは、 NaClの添カロにより、 KT-1C細胞内部へのナトリ ゥム流入が起こり細胞内ナトリゥム濃度が上昇したことを示している。
図 9 Cは、 図 9 Bの矢印で示した細胞についてのナトリゥム濃度の経時的変化 を示している。 図 9 Cにおいて、 横軸は測定開始からの時間 （分） 、 縦軸は細胞 内ナトリゥム濃度を示している。 また、 下矢印で示した点は 50mM NaClを添カロ した時点を、 上矢印で示した点は 150mM NaClを添カ卩した時点を示している。 図 9 Cからも NaClの添加により、 KT-1C細胞内部へのナトリゥム流入が起こり 、 結果として細胞内ナトリウム濃度が上昇したことが理解される。 また、 添カロす る NaCl濃度に応じて細胞内ナトリウム濃度も変ィ匕することが明らかになつた。 以上より、 KT-1C細胞は、 塩味チャネルであるひ ENaCを機能的に発現してお り、 塩味応答能を有することが理解される。 したがって、 KT-1C細胞を塩味を 感知する味覚センサ一として利用可能であること及び塩味代替物質や塩味増強物 質を探索するために利用可能であることが示された。
本実施例の塩味応答能を有する細胞は、 FERM BP-8347として寄託された細 胞株 KT-1Bを、 実施例 1 - 3に記載の MCDB基本培地 Cにて処理して得られる KT-1 C細胞を、 上述の NaCl添カロによる細胞内ナトリゥム濃度の上昇を指標として選 択することによって単離することができる。
6 . カルシウムイメージングを用いた細 «ΚΤ-1Βの苦味応答能の確認
(実験方法） 35mmガラスボトムディッシュ （松浪ガラス） 中で細胞株 KT-1Bを培養し、 5 0-70%コンフルェント.になった時点で、 PBS (-)で 2回洗浄した KT-1B細胞を、 イメージング用バヅファー （NaHC0322 mMヽ KC1 5 mM、 NaH2P04 1.25 m M、 グルコース 10 inMヽ NaCl 124 mM) 1 mlに 5 1 Muo-3-ΑΜ (DMSOで 溶解した 1 mM、 同仁化学社製） と 5〃1クレモフォァ (Nacalai tesque社）とを加 えたものと一緒に室温で 3 0分間ィンキュベ一トして Fhio-3-ΑΜを細胞内へ取り 込ませた。 その後、 イメージングバッファーで 2回洗浄して細胞に取り込まれな かった： Bluo-3-ΑΜを除いた。
次いでィメ一ジングバヅファーに ImM MgCl2と 2 mM CaCl2とを加えた液 1 mlでディヅシュを満たし、 そこへ苦味レセプ夕一 T2r5のリガンドであることが 知られているシク口へキシミドを終濃度で 1 mMになるように加えた。 苦味応答 能を有する細胞、 すなわち苦味レセプ夕一である T2r5が機能的に発現している 細胞は、 シクロへキシミ ド （苦味物質） に応答してカルシウムの細胞質内への流 入が起こり、 その結果、 細胞質内カルシウム濃度が上昇することが知られている そこで、 シクロへキシミ ドの添加により細胞質へ流入したカルシウムに起因し て Fluo-3が出す蛍光 (490nm)を、 AquaCosmosソフトウェア一 （浜松ホトニクス 社製） で制御された CCDカメラ （浜松ホトニクス社製） を装着した蛍光倒立顕 微鏡 （ライカ社， DMRIB) で経時的に測定した。 測定後、 AquaCosmosソフト ウェア一で各細胞における蛍光強度の経時変化をカルシウム濃度変ィ匕へ換算する 経時変化 S¾斤を行い、 グラフ化した。
本実施例の苦味応答能を有する細胞は、 FERM BP-8347として寄託された細 胞株 KT-1Bを、 上述のシクロへキシミド添加による細胞内カルシウム濃度の上 昇を指標として選択することによって単離することができる。 産業上の利用の可能性
本発明の細胞株 KT-1を用いると、 特定の味応答を再現性良く測定することや
、 味細胞の分化誘導因子を同定するシステムを構築することが可能になる。

Claims

請求の範囲
1 . マウス舌上皮よりィンテグリノ、 β 1の強発現を指標に単離され、 長期継代培 養して樹立された、 味覚レセプ夕一を発現する細胞である細胞株 κτ-ι。
2 . 請求項 1に記載の細胞株 KT-1を、 以下の低血清培地中で長期継代培養して 樹立された細胞株 ΚΤ-1。
カルシウム 最終濃度 5 jU g/ml
上皮成長因子 最終濃度 10 ng/ml
塩基性繊維芽細胞成長因子 最終濃度 10 ng/mi
ィンシュリン 最終濃度 5 ng/ml
トランスフェリン 最終濃度 10 ng/mi
ヒドロコルチゾン 最終濃度 0.2 juM
エタノールアミン 最終濃度 0.5 μΜ
ホスホエタノールァミン 最終濃度 0.5 juM
へパリン 最終濃度 20 j g/ml
ゲン夕マイシン 最終濃度 10 mg/ml
アンフォテリシン Β 最終濃度 500 ng/ml
ぺニシリン 最終濃度 50 U/ml
ストレプトマイシン 最終濃度 50 mg/ml
カルシウムをキレートした牛胎児血清 最終濃度 0.25 %
3 . 受託番号: FE M BP-8347で寄託されている、 請求項 2に記載の細胞株 KT-1
0
4 . 請求項 2又は 3に記載の細胞株 KT-1を、 以下の分化誘導培地中で培養して 得られる KT-1細胞。
カルシウム 最終濃度 10 g/ml 上皮成長因子 最終濃度 丄 ng/nu
ケラチノサイト成長因子 最終濃度 1 ng/ml
インシユリン様成長因子 最終濃度 5 ng/ml
トランスフェリン 最終濃度 100 ng/ml
ヒドロコルチゾン 最終濃度 0.2 Ά
アルドステロン 最終濃度 10 ιιΜ
エタノールアミン 最終濃度 0.5 zM
ホスホエタノールァミン 最終濃度 0.5 μΆ
カフレシトリオール 最終濃度 10 nM
9-シス レチノイン酸 最終濃度 0.8 ί
グル夕チオン 最終濃度 200 μΆ
システィン 最終濃度 50 μΆ
チロシン 最終濃度 2.72 ug/ l
フエ二ルァラニン 最終濃度 4.95 / g/ml
へパリン 最終濃度 20 /g/ml
ゲンタマイシン 最終濃度 10 mg/ml
アンフォテリシン B 最終濃度 500 ng/ml
ぺニシリン 最終濃度 50 U/ml
ストレプトマイシン 最終濃度 50 mg/ml
5 . 味覚レセプ夕一を機能的に発現している、 請求項 4に記載の KT-1細胞。
6 . 請求項 1〜 3のいずれかに記載の細胞株 KT-1又は請求項 4又は 5に記載の KT-1細胞を含む味覚センサー。
7 . 請求項 1 ~ 3のいずれかに記載の細胞株 KT-1又は請求項 4又は 5に記載の KT-1細胞を用いて、 該味覚レセプ夕一が受容する味物質を識別することを特徴 とする細胞株 KT-1の味覚センサ一としての使用。
8 . 味覚レセプ夕一が甘味レセプ夕一、 苦味レセプ夕一、 塩味チャネル、 又はァ ミノ酸レセプ夕一である、 請求項 7記載の使用。
9 . 細胞株 KT- 1で発現していない、 リガンドが既知である味覚レセプ夕一 cDN
Aの遺伝子導入により形質転換された細胞株 ΙΐΤ-1。
1 0 . 請求項 9記載の形質転換された細胞株 KT-1の、 該味覚レセプ夕一が受容 する特定の味を感知する細胞としての使用。
1 1 . 細胞株 KT-1で発現していない、 リガンドが未知である味覚レセプ夕一 cD NAの遺伝子導入により形質転換された細胞株： KT-1。
1 2 . 請求項 1 1記載の形質転換された細胞株 KT-1を使用して、 該未知のリガ ンドを探索する方法。
1 3 . 請求項 1〜 3のいずれかに記載の細胞株 KT-1又は請求項 4又は 5に記載 の KT-1細胞の、 味細胞の分化誘導因子や味覚レセプ夕一の発現を制御する物質 、 新規味物質、 味覚修飾物質、 味覚減退補助物質を探索するための使用。
1 4 . 請求項 1〜 3のいずれかに記載の細胞株 KT-1又は請求項 4又は 5に記載 の KT-1細胞及び味物質を用いて、 該味物質に対する味覚レセプ夕一を探索する 方法。
1 5 . 味覚レセプ夕一が塩味チャネルである、 請求項 1 4に記載の方法。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9128079B2 (en) 2011-08-08 2015-09-08 The Coca-Cola Company Methods of using lung or bronchial epithelial cells to identify bitter taste modulators
EP2841565B1 (en) * 2012-04-25 2018-02-21 B.R.A.I.N. Biotechnology Research and Information Network AG Human taste cells capable of continuous proliferation

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP3698069B2 (ja) * 2001-05-01 2005-09-21 独立行政法人食品総合研究所 新規遺伝子

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
OKUMA TETSUYA ET AL.: "Hito no mikaku juyo system-sono saikochiku to sangyo riyo o mezashite", NATIONAL FOOD RESEARCH INSTITUTE, KENKYU NEWS, no. 6, March 2003 (2003-03-01), pages 4 - 5, XP002979695 *
OOKURA T. ET AL.: "Fibroblast and epidermal growth factors modulates proliferation and neural cell adhesion molecule expression in epithelial cells derived from the adult mouse tongue", IN VITRO CELL. DEV. BIOL. -ANIMAL., vol. 38, 2002, pages 365 - 372, XP002903700 *

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006044594A2 (en) 2004-10-15 2006-04-27 Monell Chemical Senses Center Methods for culturing mammalian taste cells
EP1833961A2 (en) * 2004-10-15 2007-09-19 Monell Chemical Senses Center Methods for culturing mammalian taste cells
JP2008516604A (ja) * 2004-10-15 2008-05-22 モネル ケミカル センシズ センター 哺乳動物の味覚細胞の培養方法
EP1833961A4 (en) * 2004-10-15 2008-07-09 Monell Chemical Senses Centre METHOD FOR CULTIVATING TASTE CELLS FROM MAMMALS
US7488599B2 (en) 2004-10-15 2009-02-10 Monell Chemical Senses Center Methods for culturing mammalian taste cells
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