WO2004083413A1 - 器官形成方法 - Google Patents

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WO2004083413A1
WO2004083413A1 PCT/JP2004/003578 JP2004003578W WO2004083413A1 WO 2004083413 A1 WO2004083413 A1 WO 2004083413A1 JP 2004003578 W JP2004003578 W JP 2004003578W WO 2004083413 A1 WO2004083413 A1 WO 2004083413A1
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acid
tetrahydro
retinoic acid
benzoic acid
cells
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PCT/JP2004/003578
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Makoto Asashima
Tatsuo Hamazaki
Hiroyuki Kagechika
Koichi Shudo
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Research Foundation Itsuu Laboratory
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    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells

Definitions

  • the present invention relates to a method of forming an organ from undifferentiated vertebrate cells.
  • Vertebrate organisms including humans, have a great number of organs and tissues.
  • organ formation from undifferentiated cells For inflammation 'regeneration, Vol. 22, 21, 2002, and spleen organogenesis, refer to JP-A-2001-299335 and JP-A-2001-333770.
  • undifferentiated cells which are animal caps (pluripotent cell clusters) at the blastula stage of a newt, with a high concentration of activin can form a rhythmically beating heart with a 60% formation rate. .
  • retinoic acid is an active metabolite of vitamin A. It acts to differentiate developing immature cells into mature cells with unique functions, promotes cell growth and maintains life. It has a very important physiological action such as action.
  • Such compounds having retinoic acid and retinoic acid-like biological activity are collectively referred to as "retinoides”.
  • Retinoic acid is a regulator of embryonic patterning along the anterior-posterior axis (Nature 340, 140-144, 1989, Development 112, 945-958, 1991, Dev. Biol. 192, 1-16, 1997, Zool. Sci. 15, 879-886, 1998), and it has been abandoned that this retinoic acid retrogrades anterior nervous tissue in the Xenopus embryo and has an effect on mesoderm development (Genes Dev. 5, 175-187, 1998). 1991, Develop. Growth. Differ. 35, 123-128, 1993).
  • mesoderm tissues such as notochord, muscle, mesenchymal and luminal epithelium
  • activin Rost. Biol. 198, 330-335, 1990, Nature 347, 391-394, 1990, Roux's Arch. Dev. Biol. 200, 230-233, 1991
  • retinoic acid co-processed with activin.
  • mesoderm tissues such as notochords, muscles and pronephros differentiated from animal cap cells are lateralized (Develop. Growth. Differ. 35, 123-128, 1993) Have been reported.
  • retinoic acid The effects of retinoic acid on endodermal organs have been reported by Dixon et al. When treating retinoic acid embryos at stages 22-32 with retinoic acid results in abnormal morphology of digestive organs such as the intestine, liver, and stomach. However, it has also been reported that the knees of embryos at the stage 22-32 treated with retinoic acid form normally and that the expression of the endoderm-specific marker XlHbox8 is not affected ( Dev. Genes Evol. 208, 318-326, 1998).
  • all-trans retinoic acid is a retinoic acid receptor (Evans, RM, Science, 240, p. 889, 1988) belonging to the superfamily (Evans, RM). (MR) as a ligand to control the proliferation, differentiation, or death of animal cells (Petkovich, M., et al., Nature, 330, pp. 444-450, 1987). It is known that an upper pancreas can be formed in vitro by using this oleno 'trans' retinoic acid or by using a combination of all-trans retinoic acid and activin (Japanese Patent Application Publication No. 2001-299335 and No. 2001-333770).
  • RXR retinoid X receptor
  • 9-cis-retinoic acid as a natural ligand; this compound is also a ligand of RAR
  • RXR forms a dimer with MR and regulates the expression of retinoic acid bioactivity by initiating or suppressing gene transcription (angelsdorf, DJ et al., Nature, 345). , pp. 224-229).
  • Various agonists or antagonists capable of binding to RXR are known (eg, HX600 described in JP-A-10-59951, and HX603 described in the same publication as antagonists). Whether or not organs can be formed from undifferentiated cells using a ligand that binds to RXR has not been known at all. Disclosure of the invention
  • An object of the present invention is to provide a means for forming a desired organ from undifferentiated vertebrate cells.
  • the present inventors have conducted intensive studies to solve the above-described problems, and as a result, have found that organs such as heart and nerve can be formed from undifferentiated cells using a ligand that binds to RXR.
  • the present inventors have found that the use of RAR ligands that do not substantially bind to retinoic acid receptor (RAR) subtype y and activin as RAR ligands enables the formation of highly differentiated knees from undifferentiated cells.
  • RAR retinoic acid receptor
  • a method for forming organs and / or tissues in vitro from undifferentiated vertebrate cells which comprises culturing undifferentiated cells of a vertebrate animal in the presence of a retinoic acid X receptor ligand.
  • the above method wherein the retinoic acid X receptor ligand is an agonist or antagonist of retinoic acid X receptor, wherein the organ and / or tissue formed is A method as described above is provided which is heart, smooth muscle tissue, or adipocyte tissue.
  • the present invention also provides a differentiation inducer for forming an organ and / or tissue from undifferentiated vertebrate cells in vitro, which comprises a retinoic acid X receptor ligand. You.
  • a method of forming a knee in vitro from undifferentiated cells of a vertebrate or a method of forming a tissue having spleen morphology and function in vitro from undifferentiated cells of a vertebrate, comprising the steps of: Undifferentiated cells of retinoic acid receptor subtype
  • a method comprising culturing in the presence of a retinoic acid receptor ligand and activin that does not substantially bind to 7.
  • the above-mentioned retinoic acid receptor ligand is 4-[(5,6,7,8-tetrahydro-5,5,8,8-tetramethyl-2-naphthalenyl) pyruvamoyl] benzoic acid
  • a method as described above which is an acid.
  • a differentiation inducer for in vitro forming a knee or a tissue having a morphology and function of the knee from undifferentiated cells of a vertebrate, wherein the retinoic acid does not substantially bind to the retinoic acid receptor subtype ⁇ .
  • the present invention also provides a differentiation inducer containing a receptor ligand.
  • the present invention provides an organ and / or tissue formed by the above method.
  • FIG. 1 is a photograph showing ES cell colonies.
  • FIG. 2 is a photograph showing an embryoid body formed in a Pacteria dish.
  • FIG. 3 is a photograph showing a heart (cardiomyocyte-like cell mass) formed by the method of Example 1.
  • FIG. 4 is a photograph showing a smooth muscle tissue (smooth muscle-like cell mass) formed by the method of Example 2.
  • FIG. 5 is a photograph showing an adipocyte tissue formed by the method of Example 2.
  • FIG. 6 is a photograph of a viscera tissue including a renal duct, endocrine and exocrine cells, etc., induced to differentiate from the embryoid body by the method of Example 3.
  • FIG. 7 is a photograph showing exocrine cells of the knee induced by the method of Example 3.
  • FIG. 8 is a photograph showing i3 cells (endocrine cells) of the spleen induced by the method of Example 3.
  • an organ and / or tissue means an organ, a tissue, and a combination thereof constituting a vertebrate.
  • an organ formed by the method of the present invention may have a structure that is usually classified as a tissue bound thereto, and a method of forming such a conjugate is also included in the scope of the present invention. You. Further, two or more kinds of organs and tissues may be simultaneously formed by the method of the present invention. Examples of the organ include, for example, a heart, a knee, a kidney, and the like, and examples of the tissue include a nerve tissue, a smooth muscle tissue, and an adipocyte tissue, but are not limited thereto.
  • the organ is preferably a heart or a spleen, and the tissue is preferably a smooth muscle tissue or an adipose tissue.
  • Retinoic acid X receptor ligands include retinoic acid X receptor agonists (hereinafter sometimes referred to as RXR agonists) and retinoic acid X receptor antagonists (hereinafter referred to as RXR ligands). RXR antagonists). Whether a substance can be an RXR ligand is determined, for example, by Boehm, MF, et al., J. Med.
  • RXR ligands include, for example, JP-A-9-100270, JP-A-10-59951, JP-A-10-114757, JP-A-10-237050, and JP-A-10-237050.
  • RXR ligands Compounds that can act as RXR ligands among compounds described in JP-338658, JP-A-2000-273079, International Publication WO99 / 24415, and the like can be used, but are not limited thereto.
  • RXR ligands may be used in combination of two or more.
  • RXR antagonists can be used in combination.
  • RXR agonist for example,
  • RXR agonists and RXR antagonists are not limited to these specific compounds.
  • vertebrate undifferentiated cells such as birds, reptiles, and amphibians can be used in addition to mammals.
  • undifferentiated cells stem cells such as embryonic stem cells, hematopoietic stem cells, and basal cells of small intestinal crypts, as well as cell populations such as animal cap embryoid bodies of middle to late blastulas can be used. it can.
  • the term "undifferentiated cells” as used herein should not be interpreted as excluding a cell population formed by two or more cells.
  • Organ and Z or tissue formation by the method of the present invention can be performed by various methods used in the art as a method for forming an organ and Z or tissue from undifferentiated cells.
  • a method for forming an organ and Z or tissue from undifferentiated cells For example, since methods for forming a knee from undifferentiated cells are described in detail in JP-A-2001-299335 and JP-A-2001-333770, those skilled in the art will refer to these publications while referring to these publications.
  • the desired organ can be formed from the undifferentiated cells according to the method of the Examples of the present specification.
  • the disclosures of JP-A-2001-299335 and JP-A-2001-333770 are all incorporated herein by reference.
  • organogenesis can be performed by culturing the embryoid body derived from embryonic stem cells in the presence of an appropriate concentration of RXR ligand for one to several days. After culturing for one to several days in the presence of the RXR ligand, further culturing may be continued in the absence of the RXR ligand.
  • concentration of the RXR ligand is not particularly limited, but can be appropriately selected, for example, from a range of about IX 10 to 12 to 1 ⁇ 10 ⁇ 3 M.
  • the method of the present invention is in. Although it can be performed in an in vitro environment, the term in vitro is used herein to mean “in vitro” and should not be construed as limiting in any way.
  • embryonic stem cells include 129 mouse E14 cells (ATCC #; CRL-1821) established by Hooper or C57BL mice B6 (ATCC #;) established by Ledermann and Burki. SCRC-1002) can be used. These were lined from the inner cell mass of mouse blastocysts.
  • the types of embryonic stem cells are not limited to these. In general, the passage number of embryonic stem cells does not affect the ability to form organs and / or tissues.
  • the RXR ligand solution is diluted with a medium as needed and added to the medium, followed by treatment for one to several days.
  • a solvent for dissolving the RXR ligand water, physiological saline, a buffer, an organic solvent such as dimethyl sulfoxide, or a mixture of water and an organic solvent can also be used.
  • a manore well plate coated with laminin, collagen I or matrigenolecoat (Biocoat, manufactured by Becton Dickinson) can be used, if necessary. After this treatment, it is desirable to record the state of cell differentiation after a certain period of time.
  • the bone morphogenic proteins (BMP) BMP2 / 4 and BMP6 / 7 have the strength of FGF, activin, folistatin, bidelogenin, insulin, gnore gon, concanavalin, cytochalasin, and cadaverine.
  • treatment can be performed using an inducing factor such as, cell growth factor, or cytodynamics.
  • the present invention provides a method for extracting a knee from undifferentiated vertebrate cells.
  • a method for in vitro formation of a vertebrate undifferentiated cell or a tissue having morphology and function of a knee from vertebrate undifferentiated cells comprising converting vertebrate undifferentiated cells to retinoic acid receptor subtype ⁇ . Culturing in the presence of a retinoic acid receptor ligand and activin which do not bind specifically.
  • Retinoic acid receptor (MR) ligand (hereinafter sometimes referred to as RAR ligand) binds to receptors required for all-trans-retinoic acid or 9-cis-retinoic acid to exert physiological effects. It is a compound having properties.
  • an action similar to retinoic acid eg, a cell differentiation action, a cell growth promoting action, and a life sustaining action
  • a retinoic acid receptor agonist hereinafter sometimes referred to as a RAR agonist
  • RAR ligands exhibiting at least one action of the above) or a part thereof can be used. Whether or not it is a RAR ligand can be easily determined by various methods described in M.
  • RAR ligand used in the method of the present invention binds to RAR subtype a (RARa) and subtype 3 (RAR ⁇ ), or substantially binds to subtype y (RAR ⁇ ). Not a RAR ligand. Binding to the retinoic acid receptor subtype can be easily confirmed by the method described in the literature (H. de The, and A. Dejean, "Retinoids, 10 years on, Basel, Karger, pp.
  • RAR ligand having the above properties for example, a RAR agonist having a basic skeleton of phenyl-substituted rubamoyl benzoic acid or phenyl-substituted carboxamide benzoic acid can be used.
  • a RAR agonist having a basic skeleton of phenyl-substituted rubamoyl benzoic acid or phenyl-substituted carboxamide benzoic acid can be used.
  • RAR ligands based on benzoic acid or phenyl-substituted carboxamide benzoic acid are known
  • the term basic skeleton means the main chemical structure to which one or more optional substituents are attached.
  • the phenyl group to be substituted with the carbamoyl group or the carpoxamide group has one or more substituents.
  • a lower alkyl group can be used (in the present specification, lower means about 1 to 6 carbon atoms, preferably 1 to 4 carbon atoms).
  • a linear or branched alkyl group is preferable, and Specific examples include a methyl group, an ethyl group, an n-propyl group, an isopropyl group, an n-butyl group, a sec-butyl group, and a tert-butyl group.
  • Examples of the substituent on the phenyl group include a lower alkoxy group such as a methoxy group, a halogen atom (a halogen atom may be any of a fluorine atom, a chlorine atom, a bromine atom, and an iodine atom). Examples thereof include lower alkyl-substituted silyl groups such as a trimethylsilyl group.
  • Examples of the phenyl group to be substituted with the carbamoyl group include a phenyl group substituted with 2 to 4 lower alkyl groups or a phenyl group substituted with 1 or 2 tri-lower alkylsilyl groups. More preferably, a phenyl group substituted with 2 to 4 alkyl groups or a phenyl group substituted with 2 trimethylsilyl groups is more preferable.
  • the two lower alkyl groups to be substituted on the above phenyl group When two lower alkyl groups to be substituted on the above phenyl group are adjacent to each other, the two lower alkyl groups together form a 5-membered ring together with the ring-forming carbon atom of the phenyl group to which they are bonded.
  • One or two rings preferably one ring, may be formed.
  • the ring thus formed may be saturated or unsaturated, and the ring may be substituted with one or more lower alkyl groups such as a methyl group and an ethyl group.
  • the formed ring may be substituted with preferably 2 to 4 methyl groups, more preferably 4 methyl groups.
  • two adjacent lower alkyl groups substituted on a phenyl ring together form a 5,6,7,8-tetrahydronaphthalene ring ⁇ 5,5,8,8-tetramethyl-5,6,7 It is preferred that a 1,8-tetrahydronaphthalene ring or the like is formed.
  • RAR ligands include, for example, the following general formula (I):
  • R 2 , R 3 , R 4 , and R 5 each independently represent a hydrogen atom, a lower alkyl group, or a lower alkyl-substituted silyl group; and, R 2 , R 3 , R, and R 5 When any two of the adjacent groups are lower alkyl groups, they may be joined together to form a 5- or 6-membered ring with the carbon atom on the benzene ring to which they are attached. Often
  • the ring may have one or more alkyl groups
  • X represents -C0NH- or -NHC0-.
  • the lower alkyl group represented by R 2 , R 3 , R and R 5 is preferably a straight or branched chain having about 1 to 6 carbon atoms, preferably 1 to 4 carbon atoms.
  • a methyl group, an ethyl group, an n-propyl group, an isopropyl group, an n -butyl group, a sec -butyl group, or a teri; -butyl group can be used.
  • One or more optional substituents may be present on the lower alkyl group. Examples of the substituent include a hydroxyl group, a lower alkoxy group, and a halogen atom.
  • Examples of the lower alkyl-substituted silyl group represented by R 2 , R 2 , R and R 5 include a trimethylsilyl group.
  • Two adjacent lower alkyl groups selected from the group consisting of R ⁇ , R 3 , R 4 , and R 5 are joined together to form a 5- or 6-membered ring together with the carbon atom on the benzene ring to which they are attached.
  • One or two, preferably one, may be formed.
  • the ring thus formed may be saturated, partially saturated, or aromatic, and may have one or more alkyl groups on the ring.
  • As the alkyl group which can be substituted on the ring a linear or branched alkyl group having about 1 to 6 carbon atoms, preferably 1 to 4 carbon atoms can be used.
  • a methyl group, an ethyl group, and the like can be used, and preferably 2 to 4 methyl groups, more preferably 4 methyl groups may be substituted.
  • RAR ligands suitably used in the method of the present invention include: 4 - (2, 4-bis-trimethylsilyl-off We sulfonyl Cal poke Sami Do) benzoate (... Am 5 5 5 s, J. Med Chem, 33, pp 1430-1437, 1990) or 4- [(5, 6,7,8-Tetrahydro-5,5,8,8-tetramethyl-2-naphthaleyl) lubamoyl] Benzoic acid (Am80, Hashimoto, Y., Cell struct. Funct., 16, pp. 113-123, 1991; Hashimoto, Y. occidentalet al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 166, pp. 1300-1307, 1990), and a particularly preferred RAR ligand is Am80.
  • the method of the present invention comprises a step of culturing undifferentiated vertebrate cells in the presence of the above-mentioned MR ligand and activin.
  • the undifferentiated cells and the culture method those described above can be used.
  • an inducer other than activin for example, FGF
  • an organ which is substantially completed as a spleen or a highly differentiated tissue having substantially the form and function of a spleen is obtained. There is a feature that can be obtained.
  • concentration of RAR ligands ⁇ Pi Akuchibin is Ru appropriately selectable der, for example, the concentration of the RAR ligand and 1 X 10- 12 ⁇ 1 X 10- 3 M in the range of about, 0.1 the concentration of ⁇ click Chibin 1 It can be in the range of about 1000 ng / ml.
  • a combination of the MR ligand and the RXR ligand can be used.
  • the organ and / or tissue formed by the method of the present invention can be used for screening of a medicine having the organ and / or tissue as a direct or indirect action point.
  • a heart is formed by the method of the present invention, the formed heart has a constant pulsatile rhythm over a long period of time.
  • using this heart to screen for a drug that acts to increase or decrease heart rate Is possible.
  • Example 1 Heart formation using RXR ligand
  • E14 cells (ATCC #; CRL-1821) of a 29 strain mouse or B6 (ATCC #; SCRC-1002) of a C57BL strain mouse were used. Inoculate 0.1% gelatin-coated culture dishes with mouse fetal fibroblasts prepared from 13-day embryo mice, 12% fetal calf serum (Giboco), 100 U / ml penicillin (Sigma), 100 ⁇ l The cells were cultured for 24 hours in a medium containing g / ml streptomycin (Sigma).
  • the cells were treated with 10 ⁇ g / ml mitomycin C (MMC; Sigma) for 4 hours to inhibit cell division, then washed twice with phosphate buffered saline (PBS) to remove MMC.
  • PBS phosphate buffered saline
  • the medium for ES cells includes 15% fetal calf serum for ES (Giboco), 2 mM L-glutamine (Gibco), MEM non-essential amino acid (Sigma), 1 mM sodium pyruvate (Giboco), 0.0007% ] D-MEM containing 3-mercaptoethanore (Sigma), 1000 U / ml Leukemia inhibiting factor (Chemicon) N 100 U / ml penicillin (Sigma), 100 ⁇ g / ml streptomycin (Sigma) over scan, Giboco) used, and cultured at 37 ° C for at C0 2 incubator (5% C0 2, 100% humidity), the culture medium was exchanged daily.
  • the subculture was performed 72 hours after seeding the ES cells.
  • Feeder cells mouse fetal fibroblasts treated with C were seeded 24 hours before in a gelatin-coated culture dish, and then completely dissociated by 0.05% trypsin-0.02% EDTA treatment.
  • ES cells were seeded to form colonies (see Fig. 1). After inoculation of the ES cells, the cells were cultured for 3 days to form a colony. The colony was isolated by pipetting, and then inoculated on a culture dish for bacteria having extremely low cell adhesion.
  • the medium used was D-MEM (high glucose) containing 15% Knockout SR (SR, Giboco), 100 U / ml penicillin, and lOO ⁇ g / ml streptomycin.
  • SR Knockout SR
  • the embryoid bodies 0.1% gelatin coated 2 ⁇ El plates (TPP Co.) to 4 were seeded to six Dzudzu, PA024 of 1 X 10- 5 M as RXR ligand (2 - [N-cyclopropyl Mechinore -N- (5,6,7,8-tetrahydro-5,5,8,8-tetramethylnaphthalene-2-yl) [Mino] pyrimidine-5-carboxylic acid) was added and cultured for 2 days.
  • a cell mass of autonomically beating cardiomyocytes was formed 48 to 72 hours after the start of treatment as 0 hour (Fig. 3). The frequency of appearance of this cell mass was 0.2 cell mass / embryoid body.
  • Example 1 In the same manner after treatment with 1 X 10- 5 ⁇ 2 ⁇ 1 ( ⁇ of 6 ⁇ ⁇ 024, smooth muscle-like cells were formed by further continued when about 1-2 weeks culture. The cell mass, It showed slow peristalsis, and the frequency was 0.1-0.2 cell masses (Fig. 4) In addition, adipocytes began to appear in about 2 weeks and were cultured for 20 days about 30-40% of the total when ever became adipocytes. in terms of the numerical value per embryoid bodies was almost 100%. All-trans retinoic fin acid treatment control group (1 X 10- 5 ⁇ The amount of adipocytes formed was 2-3 times higher in the ⁇ 024 treatment group than in the case of ⁇ 024) (Fig. 5) Example 3: Combination of RAR ligands Am80 and activin to form viscera
  • Mouse embryonic fibroblast primary mouse treated with mitomycin-C (10 / ig / ml, 3 hr) to inhibit cell division on a 10-cm culture dish (TPP) coated with 1% gelatin.
  • Embryonic fibroblast PMEF was inoculated, cultured for at least one day, and used as a feeder layer.
  • ES-E14TG2a ATCC # CRL-182l
  • Medium for ES cells is 15% fetal bovine serum (FBS, Gibco), non-essential amino acids, 0.007% 13-mercaptoethanol, 1000 U / ml Leukemia inhibiting factor (Chemicon), 100 U / ml Performed in DMEM (high glucose, Gibco) containing penicillin and 0.1 mg / ml streptomycin. The medium was changed every day.
  • EBs were formed from colonies 72 hours after seeding the above ES cells. After the ES cell colonies were washed once with Dulbecco's PBS, 1 mg / ml collagenase / dispase (Roche) was added at 1 ml per 10 cm dish, and the cells were treated at room temperature for 30 to 40 seconds. When about 50% of the knee has emerged in the solution, it contains Embryoid medium (EM), 15% Knockout Serum Replacement (KSR, Gibco), 100 U / ml penicillin, 0.1 mg / ml streptomycin DMEM (high glucose) was added at 13 ml per 10 cm culture dish to collect colonies.
  • EM Embryoid medium
  • KSR Knockout Serum Replacement
  • the media was collected in a 15 ml tube without physical damage to the ES cell colonies, and allowed to stand for about 5 minutes. When the colonies settled out, the medium was removed and resuspended in EM.
  • the ES cells were seeded on a low-adhesion culture 10 cm dish (Corning or Nunc) and cultured in a floating system. The medium was changed once every two days, and on the fourth day, it was used as an embryoid body (EB) in the experiment.
  • EB embryoid body
  • EBs having a diameter of about 500 ⁇ m were transferred to a low-adhesion 24-well plate (Corning or Nunc) together with 100 ⁇ l of medium, one at a time, while observing with a stereomicroscope.
  • a differentiation-inducing medium containing 900 ⁇ l of activin / Am80 (4-[(5,6,7,8-tetrahydro-5,5,8,8-tetramethyl-2-naphthaluryl) potumbamoyl] benzoic acid) : DMEM (high darcos) containing 15% KSR, 10 ng / ral activin, 0.1 ⁇ M Am80, 0.1% BSA, 100 U / ml penicillin, 0.1 mg / ml streptomycin Culture was continued for 48 hours.
  • EBs were transferred to a 24-well tissue culture plate (TPP) coated with 0.1% gelatin while observing with a stereoscopic microscope, and 10% KSR, Culture was continued in DMEM (high glucose) containing 100 U / ml penicillin and 0.1 mg / ml streptomycin once every three days with a medium change.
  • DMEM high glucose
  • FIG. 7 is a photograph showing the induced exocrine cells of the kidney
  • FIG. 8 is a photograph showing the induced ⁇ cells (endocrine cells) of the knee.
  • anti-insulin antibody ⁇ anti-amylase antibody was positive, and RT-PCR analysis showed that knee-specific transcription factors such as PDX-1, PAX-4, and NGN-3 were detected from day 10 to day 14 of culture. Expression was continuously observed.
  • the method of the present invention provides a means for forming a desired organ from vertebrate undifferentiated cells, for example, an organ such as a heart, a nerve, or a spleen.

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Abstract

　脊椎動物の未分化細胞から器官及び／又は組織をインビトロで形成する方法であって、脊椎動物の未分化細胞をレチノイン酸Ｘ受容体リガンド（例えばレチノイン酸Ｘ受容体のアゴニスト又はアンタゴニスト）の存在下で培養する工程を含む方法、及び脊椎動物の未分化細胞から膵臓をインビトロで形成する方法、又は脊椎動物の未分化細胞から膵臓の形態及び機能を有する組織をインビトロで形成する方法であって、脊椎動物の未分化細胞をレチノイン酸受容体サブタイプγに実質的に結合しないレチノイン酸受容体リガンド及びアクチビンの存在下で培養する工程を含む方法。

Description

器官形成方法
技術分野
本発明は脊椎動物の未分化細胞から器官を形成する方法に関する。
背景技術
明
ヒトを含めて脊椎動物の生体には非常に沢山の器官や組織が存在しているが、 田
それらはもともと 1個の受精卵から細胞分裂 (卵割）と細胞分化を経て形成され、 バランスのとれた体制をもつ個体を構成するようになる。 このような器官及び組 織形成のプロセスはきわめて複雑であり、 誘導現象と呼ばれる重要な細胞間の相 互作用が多段階にわたって行われていると考えられている。
生体内で行われる器官形成のプロセスを試験管内 （イン · ビトロ） で再現し、 未分化細胞から所望の器官を形成する試みがなされている （例えば、 「未分化細 胞からの臓器形成」 、 炎症 '再生、 Vol. 22， 21, 2002、 脾臓の器官形成について は特開 2001-299335号公報及ぴ特開 2001-333770号公報を参照のこと）。例えば、 ィモリの胞胚期のアニマルキャップ （多能性をもった細胞塊） である未分化細胞 を高濃度のァクチビンで処理するとリズミカルに拍動する心臓を 60%の形成率で 形成することができる。 この心臓は、 1ヶ月以上も正常な拍動数を維持すること ができ、 心筋細胞に特異的な遺伝子の発現や心筋に特異的な介在板の存在なども 確認できることから、 機能的及び構造的にほぼ完全な心臓であると言える。 一方、 レチノイン酸 （ビタミン A酸） はビタミン Aの活性代謝産物であり、 発 生途上にある未熟な細胞を特有な機能を有する成熟細胞へと分化させる作用や、 細胞の增殖促進作用や生命維持作用などの極めて重要な生理作用を有している。 これまでに合成された種々のビタミン A誘導体、例えば、特開昭 61- 22047号公報 や特開昭 61-76440号公報記載の安息香酸誘導体、及ぴジャーナル ·ォブ ·メディ シナノレ ' ケミス トリー （Journal of Medicinal Chemistry, 1988， Vol. 31, No. 11， p. 2182) に記載の化合物なども、 同様な生理作用を有することが明らかにされて いる。 レチノイン酸及びレチノイン酸様の生物活性を有する上記化合物は 「レチ ノィド」 と総称されている。
レチノィン酸は前後軸に沿つた胚のパターンニングに対する調節因子であり (Nature 340, 140-144, 1989、 Development 112, 945 - 958, 1991、 Dev. Biol. 192, 1-16, 1997、 Zool. Sci. 15， 879 - 886， 1998) 、 このレチノイン酸がッメガエル 胚における前方神経組織を後方化させ、 中胚葉の発達において影響を及ぼすこと が失口られている (Genes Dev. 5， 175 - 187， 1991、 Develop. Growth. Differ. 35, 123-128， 1993) 。 また、 ッメガエルアニマルキャップ細胞にァクチビンの投与量 を変化させて処理することにより脊索、 筋肉、 間充織及び体腔上皮のようなほと んどの中胚葉組織を誘導することができること （Roux' s Arch. Dev. Biol. 198, 330 - 335， 1990、 Nature 347, 391-394, 1990、 Roux' s Arch. Dev. Biol. 200, 230-233， 1991) 、 及びァクチビンと共処理するレチノイン酸の投与量を変化させることに より、 アニマルキャップ細胞から分化する脊索、 筋肉及ぴ前腎のような中胚葉組 織を側後方化させること（Develop. Growth. Differ. 35, 123-128, 1993)が報告 されている。
内胚葉性器官に対するレチノイン酸の作用については、発生段階 22〜32のッメ ガエル胚をレチノイン酸で処理すると、 腸、 肝臓、 胃などの消化器官の形態が異 常になると、 Dixon らにより報告されているが、 レチノイン酸で処理した発生段 階 22〜32のッメガエル胚の膝臓は正常に形成され、内胚葉特異的マーカーである XlHbox8 の発現にも影響がみられないことも報告されている（Dev. Genes Evol. 208， 318-326， 1998)。
また、 オール · トランス（all- trans) · レチノイン酸は、細胞核内に存在する核 内受容体 ' スーパーファミ リー (Evans, R. M.， Science, 240, p. 889, 1988) に 属するレチノイン酸受容体（MR) にリガンドとして結合して、動物細胞の増殖 ' 分化あるいは細胞死などを制御することが明らかにされている (Petkovich, M.， et al. , Nature, 330, pp. 444-450, 1987)。 このォーノレ ' トランス ' レチノイン 酸を用いて、 あるいはオール · トランス · レチノイン酸とァクチビンを組み合わ せて用いることによって睥臓をインビトロで形成できることが知られている (特 開 2001-299335号公報及ぴ特開 2001-333770号公報）。
レチノイン酸の生理活性の発現については、 レチノイド X受容体（RXR, 9-cis- レチノイン酸を天然リガンドとする：本化合物は RARのリガンドでもある） の存 在が証明されている。 RXRは MRと二量体を形成し、 遺伝子の転写を惹起ないし 抑制してレチノィン酸の生理活性の発現を調節していることが明らかにされてい る ( angelsdorf, D. J. et al. , Nature, 345, pp. 224 - 229)。 RXRに結合可能なァ ゴニスト又はアンタゴニストが種々知られているが (ァゴニストとしては、 例え ば特開平 10-59951号公報に記載された HX600など、アンタゴニストとしては同公 報に記載された HX603など）、 RXRに結合するリガンドを用いて未分化細胞から器 官を形成できるか否かは従来全く知られていない。 発明の開示
本発明の課題は、 脊椎動物の未分化細胞から所望の器官を形成する手段を提供 することにある。本発明者らは、上記の課題を解決すべく鋭意研究を行った結果、 RXR に結合するリガンドを用いて未分化細胞から心臓や神経などの器官を形成で きることを見出した。 また、 本発明者らは、 RAR リガンドとしてレチノイン酸受 容体 (RAR)サブタイプ yに実質的に結合しない RAR リガンドとァクチビンとを用 いると、 未分化細胞から高度に分化した膝臓を形成できることを見出した。 本発 明は上記の知見を基にして完成されたものである。
すなわち、 本発明により、 脊椎動物の未分化細胞から器官及び/又は組織をィ ンビトロで形成する方法であって、 脊稚動物の未分化細胞をレチノイン酸 X受容 体リガンドの存在下で培養する工程を含む方法が提供される。 この発明の好まし い態様によれば、 レチノィン酸 X受容体リガンドがレチノィン酸 X受容体のァゴ ニスト又はアンタゴニストである上記の方法、 形成される器官及び/又は組織が 心臓、 平滑筋組織、 又は脂肪細胞組織である上記の方法が提供される。 また、 脊 椎動物の未分化細胞から器官及び/又は組織をインビトロで形成するための分ィ匕 誘導剤であって、 レチノィン酸 X受容体リガンドを含む分化誘導剤が本発明によ り提供される。
別の観点からは、脊椎動物の未分化細胞から膝臓をインビトロで形成する方法、 又は脊椎動物の未分化細胞から脾臓の形態及び機能を有する組織をインビトロで 形成する方法であって、 脊椎動物の未分化細胞をレチノィン酸受容体サブタイプ
7に実質的に結合しないレチノィン酸受容体リガンド及ぴァクチビンの存在下で 培養する工程を含む方法が提供される。 この発明の好ましい態様によれば、 上記 のレチノイン酸受容体リガンドが 4 - [ (5，6，7，8-テトラヒドロ- 5, 5， 8， 8-テトラメ チル- 2-ナフタレニル） 力ルバモイル] 安息香酸である上記の方法が提供される。 また、 脊椎動物の未分化細胞から膝臓又は膝臓の形態及び機能を有する組織をィ ンビトロで形成するための分化誘導剤であって、 レチノィン酸受容体サプタイプ γに実質的に結合しないレチノィン酸受容体リガンドを含む分化誘導剤も本発明 により提供される。
また、 別の観点からは、 本発明により、 上記の方法で形成された器官及び/又 は組織が提供される。 図面の簡単な説明
第 1図は、 E S細胞のコロニーを示した写真である。
第 2図は、 パクテリアデイシュで形成された胚様体を示した写真である。
第 3図は、例 1の方法で形成された心臓（心筋様細胞塊）を示した写真である。 第 4図は、 例 2の方法で形成された平滑筋組織 （平滑筋様細胞塊） を示した写 真である。
第 5図は、 例 2の方法で形成された脂肪細胞組織を示した写真である。
第 6図は、 例 3の方法により胚葉体から分化誘導された降臓導管や内分泌 ·外 分泌細胞などを含む勝臓組織の写真である。 第 7図は、例 3の方法により誘導された膝臓の外分泌細胞を示した写真である。 第 8図は、 例 3の方法により誘導された薛臓の i3細胞 （内分泌細胞） を示した 写真である。 発明を実施するための最良の形態
本明細書において 「器官及び/又は組織」 とは、 脊椎動物を構成する器官、 組 織、 及ぴそれらの結合物を意味している。 例えば、 本発明の方法により形成され る器官には、 通常は組織として分類される構造物が結合している場合もあるが、 そのような結合物を形成する方法も本発明の範囲に包含される。 また、 本発明の 方法により同時に形成される器官及び組織はそれぞれ 2種以上であってもよい。 器官としては、 例えば心臓、 膝臓、 腎臓などを例示することができ、 組織として は神経組織、 平滑筋組織、 脂肪細胞組織などを例示することができるが、 これら に限定されることはない。 器官としては心臓又は脾臓などが好ましく、 組織とし ては平滑筋組織又は脂肪組織などが好ましい。
レチノイン酸 X受容体リガンド（以下、 RXRリガンドと呼ぶ場合がある） には、 レチノイン酸 X受容体のァゴニスト （以下、 RXR ァゴニストと呼ぶ場合がある） 及ぴレチノイン酸 X受容体のアンタゴニスト （以下、 RXR アンタゴニストと呼ぶ 場合がある） が包含される。 ある物質が RXRリガンドとなりうるか否かは、 例え ば Boehm, M. F. , et al. , J. Med. Chem. , 37 (18 2930-2941, 1994； Hey R. A. et al. , Cell, 68 (2 397 - 406, 1992 Levin, A. A. , et al. , Nature, 355 (6358) , 359 - 361, 1992 ; Chen, J. Y. et al. , Nature, 382, 819—822 1996 などに記載された方法により当業者が容易に確認することができる。 RXR リガン ドとしては、 例えば、 特開平 9- 100270号公報、 特開平 10-59951号公報、 特開平 10-114757 号公報、 特開平 10-237050 号公報、 特開平 10-338658 号公報、 特開 2000-273079号公報、 国際公開 W0 99/24415などに記載された化合物のうち RXR リガンドとして作用可能な化合物を用いることができるが、 これらに限定される ことはない。 RXRリガンドは 2種以上を組み合わせて用いてもよい。 RXRァゴニス トと RXRアンタゴニストとを組み合わせて用いることも可能である。
より具体的には、 RXR ァゴニストとしては、 例えば、
4- [5H-2, 3 -（2, 5-ジメチル- 2， 5-へキサノ） - 5-メチルジベンゾ [b， e] [1, 4]ジァゼピ ン- 11-ィル]安息香酸 (HX600) ；
4 - [2, 3- (2， 5 -ジメチル- 2， 5-へキサ）ジベンゾ [b， f] [1， 4]チアゼピン- 11-ィル]安 息香酸（HX630) ；
4 - [2， 3 -（2, 5-ジメチ- 2， 5-へキサノ )ジベンゾ [b， e]ァゼピン- 11 -ィル]安息香酸 (腿 40) ；
4- [1, 3-ジヒ ドロ -7， 8 -（2， 5-ジメチル -2, 5 -へキサノ メチル- 2 -ォキソ -2H-1, 4-ベンゾジァゼピン- 5-ィル]安息香酸（HX801) ；
(Z) - 5- [4- [N-メチル-（5, 6, 7， 8 -テトラヒ ドロ- 5， 5， 8, 8 -テトラメチルナフタレン
-2 -ィル）カルボキサミド]ベンジリデン] -2, 4-チアゾリジンジオン（TZ191) ；
(Z) -5- [4- [N-メチル- N - (5, 6， 7, 8 -テトラヒ ドロ- 3, 5， 5， 8， 8-ぺンタメチルナフタ レン - 2-ィル）ァミノ]ベンジリデン]- 2， 4 -チアゾリジンジオン（TZ335) ；
4- [N-シクロプロピルメチノレ- N -（5， 6, 7, 8-テトラヒ ドロ- 3, 5, 5， 8， 8-ぺンタメチル ナフタレン -2-ィル）ァミノ]安息香酸（DA124) ；
2- [N-シク口プロピルメチル- N -（5， 6, 7, 8-テトラヒドロ- 5， 5， 8, 8-テトラメチルナ フタレン -2 -ィル）ァミノ]ピリミジン- 5 -力ルポン酸（PA024) ；
4- [1- (5, 6， 7， 8—テトラヒドロ- 5， 5， 8, 8-テトラメチルナフタレン - 2-ィル） - 1， 3 -ジ ォキソラン -1-ィル]安息香酸（SR11237) ；
4- [1- (5， 6, 7， 8-テトラヒドロ- 3， 5, 5, 8, 8 -ぺンタメチルナブタレン- 2-ィル）ェテ ン- 1-ィル]安息香酸 (LGD1069) ；及び
6- [1- (5， 6， 7， 8 -テトラヒドロ- 3， 5, 5, 8， 8 -べンタメチルナフタレン- 2-ィル）シク 口プロプ- 1 -ィル]ピリジン- 3-力ルポン酸 (LG268)などを挙げることができる。
RXRアンタゴニストとしては、
4- (5H- 2， 3- (2, 5-ジメチル - 2， 5_へキサノ）-5 -メチル - 8 -二 ト ロジベンゾ [b，e] [1，4]ジァゼピン- 11-ィノレ）安息香酸 (HX531) ； 4- [5H-2, 3 -（2， 5 -ジメチル- 2， 5-へキサノ） - 5 - n -プロピルジベンゾ [b， e] [1, 4]ジァ ゼピン- 11-ィル]安息香酸 (HX603) ；
4 -（5H- 10， 11-ジヒ ドロ- 2, 3- (2, 5-ジメチル- 2, 5-へキサノ） - 5, 10-ジメチル- 8 -フ ェ二ル-ジベンゾ [b, e] [1， 4]ジァゼピン- 11-ィル）安息香酸 (HX711) ；
2- [N- (3- n-へキシルォキシ- 5, 6， 7, 8 -テトラヒ ドロ- 5， 5， 8, 8-テトラメチルナフタ レン- 2 -ィル） - N-メチルァミノ]ピリミジン- 5-力ルポン酸 (PA452) ；
5 - [4- (5, 6， 7, 8-テトラヒ ドロ- 5， 5, 8， 8 -テトラメチルナブタレン- 2 yl)フエニル] トロボロン（Tpl80) ；
(2Ε, 4Ε, 6Ζ) - 3-メチル- 7- (5, 6, 7, 8-テトラヒドロ- 5， 5， 8， 8 -テトラメチル- 3 - η -プ 口ピルォキシナフタレン- 2 -ィノレ）ォクタ- 2, 4, 6-トリエン酸（LG100754) ；及び
4- [Ν - [3- (2-ェチル -0-カルボラン- 1-ィル）フヱニル] - Ν -メチルァミノ]安息香酸 などが挙げられる。 もっとも、 RXRァゴニスト及び RXRアンタゴニストはこれら の特定の化合物に限定されることはない。
本発明の方法に使用可能な脊椎動物の未分化細胞の種類は特に限定されないが、 例えば、 哺乳類動物のほか、 鳥類、 は虫類、 両生類などの脊椎動物の未分化細胞 を用いることができる。 未分化細胞としては、 胚性幹細胞、 造血幹細胞、 小腸ク リプトの基底細胞などの幹細胞のほか、 例えば中〜後期の胞胚のアニマルキヤッ プゃ胚様体（embryoid body)などの細胞集団を用いることもできる。本明細書にお いて用いられる 「未分化細胞」 の用語は、 2以上の細胞により形成される細胞集 団ゃ細胞塊を排除するものと解釈してはならない。
本発明の方法による器官及び Z又は組織形成は、 未分化細胞からの器官及び Z 又は組織形成方法として当業界で利用されている種々の方法で行うことができる。 例えば、 未分化細胞から膝臓を形成する方法について特開 2001-299335号公報及 ぴ特開 2001-333770号公報に詳細に記載されているので、 当業者はこれらの刊行 物を参照しつつ、 本明細書の実施例の方法に従って、 未分化細胞から所望の器官 を形成させることができる。 特開 2001 - 299335号公報及ぴ特開 2001-333770号公 報の開示のすべてを参照として本明細書の開示に含める。 例えば、 胚性幹細胞から誘導した胚様体を用いて、 適宜の濃度の RXRリガンド の存在下で 1ないし数日培養することにより器官形成を行うことができる。 RXR リガンドの存在下で 1ないし数日培養した後、 RXR リガンドの非存在下でさらに 培養を継続してもよい。 RXR リガンドの濃度は特に限定されないが、 例えば I X 10一12〜 1 X 10— 3M程度の範囲から適宜選択できる。本発明の方法はィン。ビトロの 環境下で行うことができるが、本明細書においてイン ·ビトロの用語は「生体外」 の意味で用いられており、いかなる意味においても限定的に解釈してはならない。 例えば、胚性幹細胞 （ES細胞） としては、 Hooperによって樹立された 129系マ ウスの E14細胞（ATCC #； CRL-1821) 又は Ledermann and Burkiによって樹立さ れた C57BL系マウスの B6 (ATCC #; SCRC- 1002)などを用いることができる。 これ らはマウス胚盤胞の内部細胞塊からライン化されたものである。 もっとも、 胚性 幹細胞の種類はこれらに限定されることはない。 なお、 通常の場合、 胚性幹細胞 の継代数は器官及び/又は組織形成能に影響を及ぼさない。
例えば、 胚性幹細胞から誘導した胚様体をゼラチンコートした培養皿に接着さ せた後、 RXR リガンドの溶液を必要に応じて培地で希釈して培地に加えて 1から 数日処理する。 RXR リガンドを溶解するための溶媒としては、 水、 生理食塩水、 緩衝液などのほか、.ジメチルスルホキシドなどの有機溶媒又は水と有機溶媒との 混合物を用いることもできる。 胚様体の培養には、 必要に応じてラミニン、 コラ 一ゲン Iやマトリゲノレコート （Biocoat, Becton Dickinson社製） したマノレチウ エルプレートを用いることもできる。 この処理後、 一定時間後の細胞分化状態を 記録することが望ましい。 上記の処理の前後に、 骨形成因子 （Bone morphogenic protein, BMP) である BMP2/4や BMP6/7のほ力 FGF、 ァクチビン、 フオリスタチ ン、 ビデロゲニン、 インスリン、 グノレ力ゴン、 コンカナバリン、サイトカラシン、 カドベリンなどの誘導因子、 細胞増殖因子、 又はサイト力イン類などを用いて処 理することもできる。 このような処理を採用することにより、 器官及び/又は組 織形成の方向性や形成率を高めることができる場合がある。
別の観点から提供される本発明の方法は、 脊椎動物の未分化細胞から膝臓をィ ンビトロで形成する方法、 又は脊椎動物の未分化細胞から膝臓の形態及び機能を 有する組織をインビトロで形成する方法であって、 脊椎動物の未分化細胞をレチ ノイン酸受容体サブタイプ γに実質的に結合しないレチノイン酸受容体リガンド 及ぴァクチビンの存在下で培養する工程を含むことを特徴としている。
レチノイン酸受容体 （MR) リガンド （以下、 RARリガンドと呼ぶ場合がある） は、 オール -トランス-レチノイン酸または 9 -シス-レチノィン酸が生理作用を発 現するために必要な受容体に結合する性質を有する化合物である。 本発明の方法 には、 好ましくはレチノイン酸受容体ァゴニスト （以下、 RAR ァゴニストと呼ぶ 場合がある） としてレチノイン酸に類似する作用 （例えば、 細胞分化作用、 細胞 増殖促進作用、 及ぴ生命維持作用などの 1種以上の作用） 又はその一部の作用を 発揮する RAR リガンドを用いることができる。 RAR リガンドであるか否かは、 M. Sporn et al.， Retinoids, Academic Press, 1984 に記載された種々の方法によ り容易に判定できる。 本発明の方法で用いられる RAR リガンドは、 RARのサブタ ィプ a (RAR a ) 及ぴサブタイプ ]3 (RAR ^ ) に結合し、 か; サブタイプ y (RAR γ ) には実質的に結合しない RARリガンドである。 レチノイン酸受容体 ·サブタイプ への結合については文献記載の方法により容易に確認することができる （H. de The, and A. Dejean, "Retinoids, 10 years on , Basel, Karger, pp. 2-9, 1991)。 上記の性質を有する RARリガンドとしては、 例えば、 フエニル置換力ルバモイ ル安息香酸又はフエニル置換カルボキサミ ド安息香酸を基本骨格とする RARァゴ ニストを用いることができる。 フエニル置換力ルバモイル安息香酸又はフエニル 置換カルボキサミド安息香酸を基本骨格とする RARリガンドは種々知られている。 基本骨格という用語は、 1又は 2以上の任意の置換基が結合するための主たる化 学構造を意味する。 通常は、 力ルバモイル基又はカルポキサミド基に置換するフ ヱニル基が 1個又は 2個以上の置換基を有していることが好ましい。 このような 置換基としては、 例えば、 低級アルキル基を用いることができる （本明細書にお いて低級とは炭素数 1ないし 6個程度、 好ましくは炭素数 1ないし 4個を意味す る）。低級アルキル基としては直鎖又は分枝鎖のアルキル基が好ましく、より具体 的には、 メチル基、 ェチル基、 n -プロピル基、イソプロピル基、 n -プチル基、 sec - ブチル基、 又は tert- ブチル基などを挙げることができる。
また、 上記のフヱニル基上の置換基として、 例えば、 メ トキシ基などの低級ァ ルコキシ基、 ハロゲン原子 （ハロゲン原子としてはフッ素原子、 塩素原子、 臭素 原子、又はョゥ素原子のいずれでもよい）、例えばトリメチルシリル基などの低級 アルキル置換シリル基などを挙げることができる。 力ルバモイル基に置換するフ ェニル基としては、 例えば、 2ないし 4個の低級アルキル基で置換されたフエ二 ル基、 あるいは 1又は 2個のトリ低級アルキルシリル基で置換されたフヱニル基 などが好ましく、 2ないし 4個のアルキル基で置換されたフヱニル基、 又は 2個 のトリメチルシリル基で置換されたフヱニル基などがより好ましい。
上記のフエニル基上に置換する 2個の低級アルキル基が隣接する場合には、 そ れらの 2つの低級アルキル基は一緒になつてそれらが結合するフヱニル基の環構 成炭素原子とともに 5員環又は 6員環を 1個又は 2個、 好ましくは 1個形成して もよい。 このようにして形成される環は飽和でも不飽和でもよく、 環上には 1又 は 2個以上の低級アルキル基、 例えばメチル基、 ェチル基などが置換していても よい。 上記の形成された環上には、 好ましくは 2〜4個のメチル基、 さらに好ま しくは 4個のメチル基が置換していてもよい。 例えば、 フエニル環上に置換する 2個の隣接する低級アルキル基が一緒になつて 5，6，7，8-テトラヒ ドロナフタレ ン環ゃ 5， 5， 8, 8 -テトラメチル -5， 6, 7， 8- テトラヒ ドロナフタレン環などが形成 されることが好ましい。
好ましい RARリガンドとしては、 例えば、 下記の一般式（I)：
Figure imgf000011_0001
〔式中、 、 R2、 R3、 R4、 及び R5はそれぞれ独立に水素原子、 低級アルキル基、 又 は低級アルキル置換シリル基を示し、 、 R2、 R3、 R 及び R5のうち隣接するいず れか 2つの基が低級アルキル基である場合には、 それらが一緒になつてそれらが 結合するべンゼン環上の炭素原子とともに 5員環又は 6員環を形成してもよく
(該環は 1又は 2以上のアルキル基を有していてもよい）、 Xは- C0NH-又は- NHC0 - を示す〕 で表される RARリガンドを挙げることができる。
上記一般式（I) において、 、 R2、 R3、 R 及び R5が示す低級アルキル基として は、 炭素数 1ないし 6個程度、 好ましくは炭素数 1ないし 4個の直鎖又は分枝鎖 のアルキル基を用いることができる。 例えば、 メチル基、 ェチル基、 n -プロピル 基、 イソプロピル基、 n—プチル基、 sec-プチル基、 又は teri;- ブチル基などを用 いることができる。 上記の低級アルキル基上には 1個又は 2個以上の任意の置換 基が存在していてもよい。置換基としては、例えば、水酸基、低級アルコキシ基、 ハロゲン原子などを例示することができる。 、 R2、 、 R 及び R5が示す低級ァ ルキル置換シリル基としては、 例えば、 トリメチルシリル基などを挙げることが できる。
R\ 、 R3、 R4、 及び R5からなる群から選ばれる隣接する 2つの低級アルキル基 が一緒になつて、 それらが結合するベンゼン環上の炭素原子とともに 5員環又は 6員環を 1個又は 2個、 好ましくは 1個形成してもよい。 このようにして形成さ れる環は飽和、 部分飽和、 又は芳香族のいずれであってもよく、 環上には 1又は 2以上のアルキル基を有していてもよい。環上に置換可能なアルキル基としては、 炭素数 1ないし 6個程度、 好ましくは炭素数 1ないし 4個の直鎖又は分枝鎖のァ ルキル基を用いることができる。 例えば、 メチル基、 ェチル基などを用いること ができ、 好ましくは 2〜4個のメチル基、 さらに好ましくは 4個のメチル基が置 換していてもよい。 例えば、 R2及び が置換するベンゼン環と R2及び R3とによ り、 5, 6, 7, 8 -テトラヒ ドロナフタレン環や 5， 5, 8， 8-テトラメチル- 5， 6， 7, 8 - テト ラヒ ドロナフタレン環などが形成されることが好ましい。
より具体的には、 本発明の方法に好適に用いられる RAR リガンドとして、 4 -（2, 4-ビストリメチルシリルフヱニルカルポキサミ ド）安息香酸 (Am555s, J. Med. Chem.， 33, pp. 1430-1437， 1990)又は 4- [ (5， 6， 7， 8 -テトラヒドロ- 5， 5， 8, 8-テト ラメチル -2-ナフタレエル) 力ルバモイル] 安息香酸（Am80, Hashimoto, Y. , Cell struct. Funct. , 16, pp. 113-123, 1991； Hashimoto, Y.„ et al. , Biochem. Biophys. Res. Commun. , 166, pp. 1300-1307, 1990)などを挙げることができ、 特に好まし い RARリガンドは Am80である。
本発明の方法は、 脊椎動物の未分化細胞を上記の MRリガンド及びァクチビン の存在下で培養する工程を含んでいる。 未分化細胞及ぴ培養方法は上記に説明し たものを用いることができる。 本発明の方法では、 例えばァクチビン以外の誘導 因子 （例えば FGF) を用いる必要がなく、 脾臓として実質的に完成された器官、 又は勝臓の形態及び機能を実質的に有する高度に分化した組織が得られるという 特徴がある。 RAR リガンド及ぴァクチビンの組み合わせ濃度は適宜選択可能であ るが、 例えば、 RARリガンドの濃度を 1 X 10— 12〜 1 X 10—3M程度の範囲とし、 ァク チビンの濃度を 0. 1〜1000 ng/ml程度の範囲とすることができる。 また、 より複 雑な構造を有する器官の形成のために、 MR リガンドと RXR リガンドとを組み合 わせて用いることもできる。
本発明の方法により形成された器官及び/又は組織は、 その器官及び/又は組 織を直接又は間接の作用点とする医薬のスクリーユングに用いることができる。 例えば、 本発明の方法により心臓を形成させた場合、 形成された心臓は長期に渡 つて一定の拍動リズムを有するが、 例えばこの心臓を用いて心拍数の増減に作用 する医薬をスクリーニングすることが可能である。 実施例
以下、 本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、 本発明の範囲は下記 の実施例に限定されることはない。 例 1 ： RXRリガンドを用いた心臓の形成
ES細胞として 29系マウスの E14細胞 （ATCC # ; CRL - 1821) 又は C57BL系マゥ スの B6 (ATCC # ; SCRC - 1002)を用いた。 0. 1% のゼラチンでコートした培養皿に 13 日胚のマウスから作成したマウス胎児繊維芽細胞を播種し、 12% 牛胎児血清 (Giboco) , 100 U/ml ペニシリ ン (Sigma) , 100 μ g/ml ス ト レプトマィシン (Sigma) を含む培地で 24時間培養した。 この細胞を 10 μ g/ml のマイトマイシン C (MMC ; Sigma) で 4 時間処理し細胞分裂を阻害した後、 リン酸緩衝生理食塩水 (Phosphate buffered saline, PBS) で 2回洗浄して MMCを取り除いた。 この繊維 芽細胞 （フィーダ一） の上に ES細胞を播種した。 ES細胞用培地としては、 15% ES 用牛胎児血清（Giboco)、 2 mM L-グルタミン（Gibco)、 MEM non-essential amino acid (Sigma)、 1 mM ピルビン酸ナトリウム（Giboco)、 0. 0007% ]3 -メルカプトエタノー ノレ (Sigma)、 1000 U/ml Leukemia inhibiting factor (Chemicon) N 100 U/ml ぺニ シリン（Sigma)、 100 μ, g/ml ストレプトマイシン（Sigma) を含む D- MEM (高ダルコ ース， Giboco)を用い、 C02インキュベーター (5% C02、 100%湿度） で 37°Cで培 養し、 培地交換は毎日行った。
継代培養は、 ES細胞を播種してから 72時間後に行った。 ゼラチンコートした 培養皿に、匿 C処理したフィーダー細胞 （マウス胎児繊維芽細胞） を 24時間前に 播種しておき、この上に 0. 05% トリプシン一 0. 02% EDTA処理によって完全に解離 した ES細胞を播種し、 コロニーを形成させた （第 1図参照）。 ES細胞を播種して から 3日間培養してコロニーを形成させ、 このコ口-一をピペッティングによつ て単離した後、 細胞接着性の非常に弱いバクテリア用培養皿に播種した。 培地と しては 15% Knockout SR ( SR, Giboco) , 100 U/ml ぺニシリン， lOO ^ g/ml スト レプトマイシンを含む D - MEM (高グルコース）を用いた。 この状態でさらに 3日間 培養することにより胚様体を作成した （第 2図)。
この胚様体を 0. 1% のゼラチンコートした 2 ゥエルプレート （TPP社製） に 4 〜6個づづ播種し、 RXRリガンドとして 1 X 10— 5 Mの PA024 (2 - [N シクロプロピル メチノレ- N- (5， 6， 7, 8 -テトラヒ ドロ- 5， 5, 8, 8 -テトラメチルナフタレン- 2 -ィル）了 ミノ]ピリミジン- 5 -力ルボン酸）を添加して 2日間培養した。処理開始時を 0時間 として 48〜72時間後に自律的に拍動する心筋様細胞の細胞塊が形成された（第 3 図）。 この細胞塊の出現頻度は、 0. 2細胞塊/胚様体であり、未処理群又は 1 X 10"5 Mオールトランスレチノイン酸で処理した対照群では、 処理後 2週間以内ではほ とんど心筋様細胞の分化は認められないため、 有意に PA024が作用していると考 えられた。 一方、 2 X 10— S Mの PA024で処理した胚様体では、 出現時期は遅れるも のの心筋様細胞塊の出現頻度が高く、 72〜96 時間で 0. 5 細胞塊/胚様体の形成 が認められた。 これらの細胞塊は、 骨格筋様細胞のように繊維状構造を取らず、 細胞塊を形成して自立的拍動を続けた。 例 2 ： RXRリガンドを用いた平滑筋及び脂肪細胞の形成
例 1と同様にして 1 X 10— 5〜2 Χ 1(Γ6 Μ の ΡΑ024で処理後、 培養をさらに続ける と約 1〜2週間で平滑筋様細胞が形成された。この細胞塊は、ゆっくりとしたぜん 動運動を示した。 頻度は 0. 1〜0. 2 細胞塊ノ胚様体であった （第 4図）。 また、 2 週間程度で脂肪細胞が出現し始め、 20日間培養し続けると全体の 30〜40%程度が 脂肪細胞となった。胚様体あたりの数値に換算するとほぼ 100%であった。 対照群 (1 X 10— 5 Μのオールトランスレチノィン酸処理） と比較して ΡΑ024処理群では形 成された脂肪細胞の量は 2〜3倍多かった （第 5図）。 例 3 ： RARリガンドである Am80とァクチビンとの組み合わせによる勝臓の形成
0. 1%ゼラチンで一晚コートした培養用 10 cmディッシュ（TPP)に、 マイトマイ シン- C 処理 （10 /i g/ml、 3 hr) して細胞分裂を阻害したマウス胚繊維芽細胞 (primary mouse embryonic fibroblast、 PMEF) を播¾し， 1 日以上培 してフ ィーダ一レイヤーとして用いた。 マウス ES 細胞として広く用いられている ES-E14TG2a (ATCC #CRL-182l)をフィーダ一レイヤー上に播種し、培養を行った。 ES細胞用培地は、 15%牛胎児血清 （FBS、 Gibco)、 非必須アミノ酸、 0. 007% 13 -メ ルカプトエタノ一ノレ、 1000 U/ml Leukemia inhibiting factor (Chemicon)、 100 U/ml ペニシリン、 及び 0. 1 mg/ml ストレプトマイシンを含む DMEM (高グルコース、 Gibco)中で行つた。 培地交換は毎日行なった。
上記の ES細胞を播種して 72時間後にコロニーから EBを形成した。 ES細胞の コロニーを Dulbeccoの PBSで 1回洗った後、 1 mg/ml コラーゲナーゼ /ディスパ ーゼ (Roche) を 10cmディッシュ 1枚あたり 1 mlずつ加え、 室温で 30〜40秒処 理した。約 50%のコ口ニーが溶液中に浮き上がつてきたところで Embryoid medium (EM)、 15% Knockout Serum Replacement (KSR、 Gibco)、 100 U/ml ぺニシリン、 0. 1 mg/ml ストレプトマイシンを含む DMEM (高グルコース) を 10cmの培養用デ イツシュ 1枚あたり 13 ml加えてコロニーを回収した。 ES細胞のコロニーに物理 的ダメージを与えないようにしながらメディゥムごと 15mlチューブに集め、約 5 分静置した。 コロニーが沈殿したところで培地を除き、 EMに再懸濁した。 この ES コ口ニーを低接着性の培養 10 cmディッシュ（Corningまたは Nunc)に播種して浮 遊系で培養を続けた。 培地交換は 2 日に 1回行い、 4 日目に胚葉体 （EB) として 実験に用いた。
EBs形成開始から 96時間後に実体顕微鏡で観察しながら直径 500 μ m前後の EBs を低接着性の 24 ゥエルプレート （Corningまたは Nunc)に 100 μ ΐの培地と共に 1ゥエルあたり 1個づっ移した。その後で 900 μ 1のァクチビン/ Am80 (4- [ (5, 6, 7, 8 -テトラヒドロ- 5， 5, 8， 8 -テトラメチル- 2 -ナフタレュル） 力ルバモイル] 安息香 酸）を含む分化誘導培地： 15% KSR, 10 ng/ral ァクチビン、 0. 1 ^ M Am80、 0. 1% BSA、 100 U/ml ぺニシリン、 0. 1 mg/ml ストレプトマイシンを含む DMEM (高ダルコ一 ス）を加えて 48時間培養を続けた。
分化誘導培地で 48時間 EB処理した後 （EBs形成 6日後）、 実体顕微鏡で観察し ながら EBsを 0. 1%ゼラチンでー晚コートした 24ゥエル組織培養プレート （TPP) に移し、 10% KSR、 100 U/ml ぺニシリン、 0. 1 mg/ml ストレプトマイシンを含む DMEM (高グルコース）中で 3日に一度、 培地交換をして培養を続けた。
培養 12日目 （EB形成開始からの日数） から 16日目に腸管様構造が誘導形成さ れ、 この誘導形成はァクチビン/ Am80処理した EBのうち 60〜70%の割合で認めら れた。 培養 21 日前後になると、 その腸様構造が認められた EBのうち約 60%に膝 臓組織特異的構造や特異的に分化した細胞が形成された。 この瞎臓組織では、 膝 臓導管構造の形成と共に、 了ミラーゼ分泌顆粒を含む多くの外分泌細胞ゃィンス リンゃグルカゴンを産性する内分泌細胞の形態が認められた。 胚葉体から分化誘 導された脖臓導管や内分泌 ·外分泌細胞を含む勝臓組織の写真を第 6図に示す。 第 7図は誘導された腌臓の外分泌細胞を示した写真であり、 第 8図は誘導された 膝臓の β細胞 (内分泌細胞） を示した写真である。 また抗ィンスリン抗体ゃ抗ァ ミラーゼ抗体陽性であり、 RT- PCR法による解析では培養 10日目から 14日目には PDX- 1や PAX- 4、 NGN- 3などの膝臓特異的転写因子の発現が持続して観察された。 産業上の利用可能性
本発明の方法により、 脊椎動物の未分化細胞から所望の器官、 例えば心臓や神 経、 あるいは降臓などの器官を形成する手段が提供される。

Claims

請求 の 範 囲 ·
1 . 脊椎動物の未分化細胞から器官及び Z又は組織をィンビトロで形成する方法 であって、 脊椎動物の未分化細胞をレチノィン酸 X受容体リガンドの存在下で培 養する工程を含む方法。
2 . レチノイン酸 X受容体リガンドがレチノイン酸 X受容体のァゴニスト又はァ ンタゴニストである請求の範囲第 1項に記載の方法。
3 . レチノイン酸 X受容体リガンドが下記の群：
4- C5H-2, 3 -（2， 5 -ジメチル- 2， 5 -へキサノ） - 5 -メチルジベンゾ [b, e] [1, 4]ジァゼピ ン- 11-ィル]安息香酸、 4- [2, 3 -（2, 5-ジメチル- 2, 5-へキサ)ジベンゾ [b， f] [1, ] チアゼピン -11-ィル]安息香酸、 4 - [2， 3- (2， 5 -ジメチ- 2, 5 -へキサノ）ジベンゾ [b, e]ァゼピン - 11-ィル]安息香酸、 4 - [1， 3 -ジヒドロ— 7， 8 -（2， 5-ジメチル- 2, 5 -へ キサノ）-1 -メチル- 2 -ォキソ - 2H- 1 , -ベンゾジァゼピン -5-ィル]安息香酸、 (Z) -5- [4 - [N -メチル-（5， 6， 7, 8 -テトラヒ ドロ- 5， 5, 8, 8 -テトラメチルナフタレン - 2 -ィル）力ルポキサミ ド]ベンジリデン] -2， 4-チァゾリジンジオン、 (Z) -5- [4- [N- メチル- N -（5， 6， 7, 8 -テトラヒ ドロ- 3, 5, 5， 8， 8 -ぺンタメチルナフタレン- 2-ィル） ァミノ]ベンジリデン] -2, 4 -チアゾリジンジオン、 4- [N-シク口プロピルメチル - N -（5， 6, 7, 8 -テトラヒ ドロ- 3， 5, 5， 8， 8 -ペンタメチルナフタレン - 2 -ィル）ァミノ] 安息香酸、 2 - [N-シク口プロピルメチル- N- (5， 6， 7, 8 -テトラヒドロ- 5， 5, 8, 8 -テト ラメチルナブタレン- 2-ィル）ァミノ]ピリミジン - 5-力ルポン酸、 4 - [1- (5, 6, 7， 8 - テトラ七 ドロ- 5， 5， 8, 8 -テトラメチルナフタレン - 2-ィル） -1, 3-ジォキソラン - 1- ィル]安息香酸、 4- [1 -（5，6，7，8-テトラヒ ドロ- 3， 5， 5, 8， 8 -ペンタメチルナブタレ ン- 2 -ィル）ェテン- 1-ィル]安息香酸、 6- [1- (5，6，7，8-テトラヒ ドロ- 3， 5， 5， 8， 8 - ペンタメチルナフタレン- 2-ィル）シクロプロプ- 1 -ィル]ピリジン- 3 -力ルポン酸、 4 -（5H - 2， 3- (2, 5-ジメチル- 2, 5 -へキサノ）-5-メ チル- 8 -二 ト口ジベンゾ [b， e] [1， 4]ジァゼピン - 11 -ィノレ）安息香酸、 4- [5H- 2, 3- (2, 5 -ジメチル- 2, 5 -へキサ ノ）- 5- n -プ口ピルジベンゾ [b， e] [1, 4]ジァゼピン -11-ィル]安息香酸、 4_ (5H- 10， 11 -ジヒ ドロ- 2， 3 -（2, 5-ジメチル- 2, 5 -へキサノ）-5， 10 -ジメチル- 8 -フ ヱ二ル-ジベンゾ [b， e] [1, 4]ジァゼピン- 11-ィル）安息香酸、 2- [N- (3- n-へキシル ォキシ -5， 6， 7, 8-テトラヒ ドロ- 5， 5， 8， 8 テトラメチノレナフタレン- 2-ィノレ） - N -メ チルァミノ]ピリ ミジン -5-力ルポン酸、 5 - [4- (5, 6, 7, 8 -テトラヒ ドロ- 5， 5, 8, 8 - テ トラメチルナフタレン- 2 - yl)フェニル] トロボロン、 (2E, 4E, 6Z) - 3 -メチル -7- (5， 6, 7, 8 -テトラヒ ドロ- 5, 5， 8, 8-テトラメチル- 3- n -プロピゾレオキシナフタレ ン- 2 -ィル）オタタ- 2, 4, 6 -トリエン酸（LG100754)、 及ぴ 4- [N- [3- (2 -ェチル -o -力 ルポラン- 1 -ィル）フェニル] - N -メチルァミノ ]安息香酸からなる群から選ばれる 請求の範囲第 2項に記載の方法。
4 . 形成される器官及び/又は組織が心臓、 平滑筋組織、 又は脂肪細胞組織であ る請求の範囲第 1項ないし第 3項のいずれか 1項に記載の方法。
5 . 請求の範囲第 1項ないし第 4項のいずれか 1項に記載の方法により形成され た器官及び/又は組織。
6 . 脊椎動物の未分化細胞から器官及び Z又は組織をィンビトロで形成するため の分化誘導剤であって、 レチノイン酸 X受容体リガンドを含む分化誘導剤。
7 . 脊椎動物の未分化細胞から勝臓をインビトロで形成する方法、 又は脊椎動物 の未分化細胞から勝臓の形態及び機能を有する組織をインビトロで形成する方法 であって、 脊椎動物の未分化細胞をレチノィン酸受容体サプタイプ γに実質的に 結合しないレチノィン酸受容体リガンド及びァクチビンの存在下で培養する工程 . を含む方法。
8 . レチノイン酸受容体リガンドが 4-[ (5，6, 7，8-テトラヒドロ-5, 5, 8，8-テトラ メチル -2-ナフタレニル）カルパモイル]安息香酸である請求の範囲第 7項に記載 の方法。
9 . 脊椎動物の未分化細胞から膝臓をィンビトロで形成するための、，又は脊椎動 物の未分化細胞から膝臓の形態及び機能を有する組織をインビトロで形成するた めの分化誘導剤であって、 レチノイン酸受容体サブタイプ γに実質的に結合しな ぃレチノィン酸受容体リガンドを含む分化誘導剤。
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