WO2004082814A2 - Verfahren und vorrichtung zum benetzen eines substrats mit einer flüssigkeit - Google Patents

Verfahren und vorrichtung zum benetzen eines substrats mit einer flüssigkeit Download PDF

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Peter Frischmann
Herbert Wieder
Thomas KRATZMÜLLER
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Definitions

  • the invention relates to a method and a device for wetting a substrate with a liquid, and to a liquid-wetted substrate that can be produced with the method according to the invention.
  • wetting a substrate with a liquid is widely used in industry and science. Especially in the field of microstructuring of surfaces for the life sciences, medical technology and sensor technology, in addition to the classic lithographic methods, wetting processes have also become increasingly important in recent years.
  • wetting methods for the lateral structuring of surfaces can be roughly divided into two classes: methods with direct contact of the wetting device with the substrate, and methods without direct contact.
  • micro-contact printing In the structuring methods with direct contact, the micro-contact printing ⁇ CP (mico-contact printing) should be emphasized, which was first published by Whitesides 1994 (A. Kumar, GM Whitesides, Science, 1994, 263, 60; US-A-6 048 623) was presented.
  • a micro-structured stamp is wetted with a liquid, then brought into contact with the substrate to be processed and thus the surface brought to the substrate to be processed and thus imprinted a lateral chemical structure on the surface.
  • a major difficulty of this technique is the realization of a uniform contact between the stamp and the substrate, which is of crucial importance for the success or the quality.
  • the ink-jet printing methods should be mentioned here by way of example.
  • the liquid is absorbed in the printhead and positioned over the desired location on the substrate.
  • a force is exerted on the liquid by a piezoelectric crystal or a pump, so that a drop leaves the contact head and is transferred to the substrate.
  • the size of the wetted area is also determined by the surface energies of the materials involved.
  • the equilibrium state of the drop defined by the contact angle between liquid and substrate, is highly dependent on factors such as Surface roughness, chemical inhomogeneities of the material, variations in the surrounding atmosphere and of course impurities.
  • the transferred drops are wetted on a macroscopic substrate in very different ways. The processes from the prior art are therefore subject to fundamental limits with regard to tolerances in spot sizes and wetting volumes.
  • the object of the present invention is therefore to create a method and a device for wetting substrates with a liquid which do not have the disadvantages of the prior art.
  • Liquid not only pure liquid substances, but also liquids with de- tergenz, any kind of dissolved organic or inorganic substances, as well as emulsions, suspensions and colloidal solutions.
  • Laser ablation partial or complete removal of organic or inorganic protective layers, but also the removal of contaminants on a substrate by exposure to laser light.
  • Solder masking lacquer known from printed circuit board technology, which is applied to printed circuit boards to prevent the formation of solder bridges during automated soldering.
  • Protective layer applied to the substrate to be processed before the actual wetting Any material can be used for this, which forms a closed layer on the substrate surface and thus separates it from the environment and can be removed at a later time by laser ablation partially and without residue.
  • This protective layer can consist of both organic and inorganic materials and, depending on the type of substrate and the application requirements, can be physisorbed, chemisorbed or covalently bound and applied using any technique.
  • Solid substrates include both plastics and metals, semiconductors, glasses, composites or porous materials.
  • the term surface is independent of the spatial dimensions of the surface and also includes nanoparticles (particles or clusters of a few individual to several hundred thousand surface atoms or molecules).
  • PNA Peptide nucleic acid synthetic DNA or RNA in which the
  • N (COCH 2 base) -CH 2 CO unit hybridizes PNA with DNA).
  • Nucleic acid at least two covalently linked nucleotides or at least two covalently linked pyrimidine (e.g. cytosine, thymine or uracil) or purine bases (e.g. adenine or guanine).
  • the term nucleic acid refers to any "backbone" of the covalently linked pyrimidine or purine bases, such as. B. on the sugar-phosphate backbone of DNA, cDNA or RNA, on a peptide backbone of the PNA or on analog structures (e.g. phosphoramide, thio-phosphate or dithio-phosphate backbone).
  • An essential feature of a nucleic acid in the sense of the present invention is that it can bind naturally occurring cDNA or RNA in a sequence-specific manner.
  • Nucleic acid - Nucleic acid of unspecified base length e.g. nuc-oligomer, linseic acid octamer: a nucleic acid with any backbone in which 8 pyrimidine or purine bases are covalently bound to one another.
  • Oligomer equivalent to nucleic acid oligomer Oligonucleotide equivalent to oligomer or nucleic acid oligomer, e.g. B. a DNA, PNA or RNA fragment unspecified base length.
  • Oligo Abbreviation for oligonucleotide ss Single Strand
  • alkyl denotes a saturated hydrocarbon radical which is straight-chain or branched (for example ethyl, isopropyl or 2,5-dimethylhexyl etc.).
  • alkyl refers to a group with two available valences for covalent linkage (e.g. - CH 2 CH 2 -, -CH 2 CH 2 CH 2 - or -CH 2 C (CH 3 ) 2 CH 2 CH 2 C (CH 3 ) 2 CH 2 - etc.).
  • Alkenyl alkyl groups in which one or more of the C-C single bonds are replaced by C C double bonds.
  • Alkynyl alkyl or alkenyl groups in which one or more of the C-C single or C C double bonds are replaced by C ⁇ C triple bonds.
  • C18 octadecanethiol fluorophore chemical compound that is able to emit a longer-wave (red-shifted) fluorescent light when excited with light.
  • Fluorophores fluorescent dyes
  • UV ultraviolet
  • VIS visible
  • IR infrared
  • the absorption and emission maxima are typically shifted from each other by 15 to 40 nm (Stokes shift).
  • Ligand Term for molecules that are specifically bound by the ligate examples include substrates, cofactors or coenzymes of a protein (enzyme), antibodies (as ligand of an antigen), antigens (as ligand of an antibody), receptors (as ligand of a hormone), hormones (as ligand of a receptor) ) or nucleic acid oligomers (as ligand of the complementary nucleic acid oligomer.
  • Ligate Term for (macro) molecule with specific recognition and binding sites for the formation of a complex with a ligand (template).
  • Fluorescein resorcin phthalein R any unspecified organic radical as a substituent or side chain.
  • Thiol molecules of the general structure HS -Spacer-R or [SSpacer-R] 2 spacers Any molecular connection between two molecules or between a surface atom, surface molecule or a surface molecule group and another molecule, usually alkyl, alkenyl, alkynyl, Heteroalkyl, heteroalkenyl, heteroalkynyl chains.
  • Preferred spacers are those of chain length 1-20, in particular chain length 1-14, the chain length being the shortest continuous connection between the structures to be connected.
  • the terminal phosphate group of the oligonucleotide is esterified at the 3 'end with (HO- (CH 2 ) 2 -S) 2 to PO- (CH 2 ) 2 -SS- (CH 2 ) 2 -OH, the SS bond being cleaved homolytically and each causes an Au-SR bond.
  • the probe oligonucleotide carries a covalently attached fluorophore fluorescein.
  • Oligo-Spacer-SS- two identical or different nucleic acid oligomers which are connected to each other via a disulfide bridge, the disulfide bridge being connected to the nucleic acid oligomers via any two spacers and the two spacers having a different chain length (shortest continuous connection between the disulfide bridge and the respective nucleic acid oligomer), in particular any chain length between 1 and 14, and these spacers in turn are connected to various naturally existing on the nucleic acid oligomer. ne or attached to these by modification attached reactive groups.
  • These spacers can in turn be bound to various reactive groups that are naturally present on the nucleic acid oligomer or are attached to it by modification and “n” is any integer, in particular a number between 1 and 20.
  • n x R-S-S-nucleic acid oligomer to which n disulfide functions are connected via spacers in each case -oligo a spacer, any residue R saturating the disulfide function.
  • the spacer for connecting the disulfide function to the nucleic acid oligomer can each have a different chain length (shortest continuous connection between disulfide function and nucleic acid oligomer), in particular any chain length between 1 and 14. These spacers can in turn be attached to different ones of course on the nucleic acid -Oligomer existing or attached to this by modification attached reactive groups.
  • the placeholder "n" is any integer, in particular a number between 1 and 20.
  • a method for wetting a substrate with a liquid comprises the following method steps: a) providing a substrate with a surface to be wetted; b) providing a wetting liquid; c) applying a protective layer to the substrate, which is the one to be wetted
  • the procedure according to the invention largely prevents contamination of the wetting areas and the wear on the
  • wetting device minimized.
  • structuring of the protective layer allows the areas to be wetted on the substrate to be specified in a simple manner.
  • a solid body made of plastic, metal, semiconductor, glass, composite, porous material or a combination of these materials is advantageously provided as the substrate.
  • a solid is preferably provided as the substrate, the surface to be wetted of which is formed by a silicon, platinum or gold layer or an oxidic layer or a glass.
  • the spatial design of the substrate is not restricted according to the invention. Rather, a macroscopic solid-state disk, a micro- or nanoparticle, for example, can be provided as the substrate.
  • the term “wetting liquid” includes in particular purely liquid substances, solutions of organic and / or inorganic substances, emulsions, suspensions or colloidal solutions.
  • the material of the protective layer is expediently matched to the substrate material such that the protective layer material is physisorbed, chemisorbed or covalently, coordinatively or via complex formation on the substrate surface to be wetted.
  • a protective layer a positive or negative photoresist can be applied to the substrate, preferably sprayed on or spun on.
  • a solder resist can also be used as a protective layer for the substrate. It is preferred that the solder resist is applied by screen printing, curtain casting or a spray process.
  • an organic polymer in particular made of cellulose, dextran or collagen, is applied to the substrate as a protective layer.
  • the organic polymer is preferably spin-coated or physisorbed.
  • a self-assembled monolayer made of organic molecules is applied as a protective layer. This is produced in particular by dissolving the organic molecules in an aqueous or organic solvent and bringing the solution into contact with the substrate.
  • a particularly preferred embodiment results if a solid is advantageously provided as the substrate, the surface to be wetted is formed by a gold layer and if a self-assembled monolayer of thiols, in particular of the general structure HS-Spacer-R or [S -Spacer-R] 2 is applied.
  • R represents any head group and the spacer has a chain length of 1-20, in particular 1-14.
  • a solid body is provided as the substrate, the surface to be wetted of which is formed by a silicon or platinum layer, and if as a protective layer a self-assembled monolayer of amines, in particular the general structure H 2 N-Spacer-R is applied.
  • R represents any head group and the spacer has a chain length of 1-20, in particular 1-14.
  • a solid body is provided as the substrate, the surface to be wetted of which is formed by an oxidic surface or a glass.
  • the head group R is expediently selected from the group CH 3 , OH, CO 2 H, NH 2 , NH 3 + or SO 3 " .
  • the protective layer is advantageously applied in step c) in the form of a closed layer to the substrate surfaces to be wetted. It can be applied over the entire surface of the entire surface of the substrate or can only cover partial areas of the surface. The protective layer is then expediently removed without residue in the area of the desired wetting areas.
  • the protective layer is structured by means of laser ablation, in particular by irradiating partial areas of the protective layer with continuous or pulsed laser radiation of a predetermined wavelength.
  • the protective layer is in particular exposed directly to the laser radiation via an optic or a mask in order to expose the wetting areas.
  • the surface of the substrate to be wetted is exposed in the area of the wetting areas by the laser radiation. is melted. This results in a reduced surface roughness and an improved homogeneity of the surface of the substrate. In addition, less gold layers are removed from the surface by ablation.
  • the wetting areas are advantageously produced with a characteristic extent of approximately 5 ⁇ m to approximately 200 ⁇ m, preferably of approximately 10 ⁇ m to approximately 100 ⁇ m. A value of approximately 20 ⁇ m to approximately 500 ⁇ m, preferably of approximately 50 ⁇ m to approximately 200 ⁇ m, is set as the lateral distance.
  • the wetting areas advantageously have an essentially rectangular, elliptical or circular outline.
  • additional feed channels are introduced into the protective layer in step d) in order to enable the supply of an analyte liquid to the exposed wetting areas.
  • the supply channels are expediently introduced into the protective layer at a depth of 10% to 99%, preferably from 20% to 95%, particularly preferably from 50% to 95% of the thickness of the protective layer.
  • the exposed wetting areas are advantageously arranged within the supply channels.
  • the wetting device comprises in particular a single needle, capillary, tweezers, a single ring or stamp.
  • it can also comprise an arrangement of several needles, capillaries, tweezers, rings, stamps, or an arrangement of various of these elements.
  • the wetting device has a liquid-releasing end surface, the lateral extent of which in at least one spatial direction is greater than the lateral extent of the loading areas of networking in this spatial direction. With correct alignment, direct contact between the wetting device and the surface of the substrate can thereby be avoided.
  • the end face of the wetting device advantageously has a greater lateral extent in both spatial directions than the wetting areas, so that direct contact between the wetting device and the wetting areas is avoided in all relative orientations.
  • the end face of the wetting device is preferably brought into contact with the protective layer adjacent to the wetting area.
  • a drop of the wetting liquid can thus be introduced into the structured recess in the protective layer in a controlled manner without direct contact with the substrate surface.
  • the end face of the wetting device for applying the wetting liquid can be brought completely over the wetting area and from above into contact with the surface of the protective layer adjacent to the wetting area.
  • the end face of the wetting device can be positioned laterally with an accuracy ( ⁇ x, ⁇ y) over a structured protective layer, and the wetting areas are generated with a characteristic lateral extent (x spot , y spo t), which by at least the positioning accuracy ( ⁇ x, ⁇ y) is smaller than the lateral extent (xtip, y «p) of the end face of the wetting device. This ensures that the delivery of a drop is controlled and only takes place over the protective layer.
  • modified nucleic acid oligomers are applied in aqueous solution as a wetting liquid.
  • the nucleic acid oligomers are one or more modified reactive groups, at least one reactive group being designed for a direct reaction with the surface of the substrate to be wetted.
  • the nucleic acid oligomers can also be modified with a fluorophore for subsequent visualization.
  • the invention also includes an apparatus for performing the described method.
  • a device particularly advantageously contains a wetting device whose end face can be positioned laterally over a structured protective layer with a positioning accuracy of less than 50 ⁇ m, preferably less than 10 ⁇ m.
  • the invention also includes a liquid-wetted substrate that can be produced by a previously described method.
  • the invention comprises a method for the controlled wetting of structured substrates with a liquid by means of a wetting device consisting of a single needle, capillary, tweezers, a ring or stamp or an arrangement of needles, capillaries, tweezers, rings or stamps ,
  • these wetting devices can have tips with any lateral extent, that is to say also and even preferably larger than the lateral area of the laser-ablated, free substrate locations.
  • the wetting device of the invention does not require direct contact with the substrate and can therefore be referred to as a pseudo-contact method.
  • the substrates are provided with a protective layer in order to to bridge the critical period between the manufacture of the substrate and the wetting of its surface. During this period, the protective layer prevents the accumulation of undesired impurities on the substrate surface.
  • any material can be used for the protective layer which forms a closed layer on a surface and thus separates the substrate surface from the surroundings and can be removed at a later point in time without residue, for example by laser ablation.
  • an adapted protective layer is advantageously chosen for a given substrate, which is optimized with regard to the adhesion between the substrate and protective layer.
  • the protective layer can also be optimized with regard to the liquid to be used. In the case of aqueous solutions, a hydrophilic layer material lends itself so that the liquids wet the feed channels of the invention and air bubbles are avoided. In the case of oily liquids, however, hydrophobic material is preferred.
  • organic polymers such as cellulose, dextran or collagen or self-assembled monoagens made from organic molecules such as silanes or thiols are also suitable. It is also conceivable to use lacquers whose special constituents form advantageous functionalizations for special applications when the material dries on the surface.
  • the protective layer can be applied, for example, by spraying in the case of the photoresists, by spin coating or physisorption in the case of the organic polymers, or by screen printing or curtain casting in the case of the solder resist Substrate are applied.
  • monolayers of organic molecules such as thiols or silanes with variable chain length are applied to the substrate in a self-assembling process.
  • the organic molecules are dissolved in aqueous or organic solvents and the solution is brought into contact with the substrate to be coated.
  • the deposition process ends in a monolayer of covalently bound molecules on the substrate.
  • the organic molecules can also be provided with amine groups (H 2 N-Spacer-R) instead of the thiol groups (SH-Spacer-R), which are then chemically or physisorbed onto platinum or silicon Allow surfaces to attach.
  • amine groups H 2 N-Spacer-R
  • SH-Spacer-R thiol groups
  • protective layers are applied to the substrates from solder resists known from printed circuit board technology.
  • solder resists Two-component or one-component solder resists are suitable, which are applied by curtain casting, screen printing or spraying and then in air or by UV radiation can harden.
  • An advantage of this process variant is that the thickness of the solder resist layer can be freely adjusted in a wide range, for example in the curtain casting process, by the speed of the substrates under the lacquer curtain.
  • laser ablation means not only the partial or complete removal of organic or inorganic protective layers, but also the removal of impurities on a substrate by irradiation with laser light. Laser ablation is advantageously used to remove or structure the applied protective layer at desired locations on the substrate in any geometry. This makes it possible to realize different, precisely defined free substrate areas or areas with a tapered protective layer in different sizes on one and the same substrate design only by changing the laser exposure.
  • Another aspect of the solution according to the invention is the melting of the substrate surface with complete removal of the protective layer by means of laser ablation, which can be achieved by adjusting the laser intensity or the irradiation time to the conditions of the substrate and the protective layer.
  • this short-term melting of the substrate surface close to the surface also closes pores in the material and thus improves the homogeneity of the free substrate surface.
  • ablation removes fewer layers of gold from the surface.
  • Laser ablation can be carried out by direct irradiation of the light or by irradiation of the light via an optic or a mask.
  • the size or shape of each exposed or structured wetting areas and their lateral distance are arbitrary and only depend on the respective application.
  • the wavelength of the laser light used, as well as the irradiation time and the number and duration of the pulses depend on the combination of protective layer and the material of the substrate surface and are preferably optimized for each pair.
  • structures from channels and free wetting areas are written into a solder mask using an excimer laser over a plurality of masks in a plurality of process steps, which structures, in addition to the controlled wetting at the free substrate locations by means of the pseudo-contact printing process described, also the targeted one Allow contacting of points connected to one another via channels with a liquid containing an analyte.
  • the wetting liquid is in particular with the aid of a needle, capillary, tweezers, a ring or stamp or an arrangement application of needles, capillaries, tweezers, rings or stamps onto the structured substrate.
  • the term “pseudo-contact printing” is used for the wetting process in order to differentiate the technology from the known standard method of “contact printing” and to make it clear that, because of the protective layer present and the lateral extent of the tips of the wetting device, which is preferably larger than the free surfaces to be wetted, there is no direct contact between the wetting device and the substrate surface. Since, in addition, the free substrate surface to be wetted is limited by the protective layer of a predetermined height, the wetting device encounters a geometrical barrier of a defined dimension, so that controlled wetting takes place.
  • ligates In the context of the invention, both pure liquid substances and any type of dissolved organic or inorganic substances, as well as emulsions, suspensions and colloidal solutions can be used. Possible materials in the sense of the invention are dissolved color pigments or any functionalized polymers and nanoparticles. In the field of sensor technology, all types of ligates can be applied to the substrate with the present invention. Molecules that specifically interact with a ligand to form a complex are referred to as ligates.
  • ligates in the sense of the present document are substrates, cofactors or coenzymes as complex binding partner of a protein (enzyme), antibodies (as complex binding partner of an antigen), antigens (as complex binding partner of an antibody), receptors (as complex binding partner of a hormone), hormones (as complex binding partner a receptor), nucleic acid oligomers (as complex binding partner of the complementary nucleic acid oligomer) or metal complexes.
  • the free substrate sites are wetted with modified nucleic acid oligomers in aqueous solution.
  • the nucleic acid oligomer to be applied to the free surface is modified with one or more reactive groups via a covalently attached spacer of any composition and chain length, these reactive groups preferably being located near one end of the nucleic acid oligomer.
  • the reactive groups are groups that can react directly with the unmodified surface.
  • HS spacer thiol
  • SS disulfide
  • the dispenser of the wetting device with any lateral extent (x t j P , y tip ) is positioned with an accuracy of ( ⁇ x, ⁇ y) over the structured protective film and lowered for wetting so that the contact of the Wetting device when dispensing the drop takes place only over the protective layer. This is ensured in particular if the wetting areas have a characteristic lateral extent (x spot . Yspot) which is at least the positioning accuracy less than the extent of the dispenser, that is to say the conditions
  • a method for wetting a substrate with a liquid according to an embodiment of the invention is described below in particular with reference to FIG. 1.
  • a substrate 10 is provided with a surface 12 to be wetted, FIG. 1 (a).
  • the substrate 10 consists of a glass slide with a vapor-deposited, 5 nm thick CrNi contact layer and a gold layer vapor-deposited thereon with a thickness of approximately 200 nm.
  • the substrate 10 is incubated at room temperature for 5-12 hours with 1 nmol / l octadecanethiol (C-18; Fluka) in ethanol and, after the incubation, rinsed with ethanol in order to add unbound thiol remove, Fig. 1 (b).
  • C-18 1 nmol / l octadecanethiol
  • the C18 protective film 14 is patterned by laser ablation to form a plurality of wetting areas 16, as illustrated in FIG. 1 (c).
  • the structuring of the C18 protective film is carried out with radiation 18 having a wavelength of 193 nm of an excimer laser 20 from Lambda-Physics.
  • the thiols of the protective layer 14 in the wetting areas 16 can be removed without residue.
  • the laser bombardment of the substrate 10 also leads to a melting of the gold surface, whereby pores are closed, the roughness is reduced and impurities are removed (FIG. 3).
  • the laser radiation is imaged on the substrate in a reduced form via a mask (not shown), which in the exemplary embodiment provides illumination spots with a diameter of 40-100 ⁇ m.
  • the wetting areas are burned into the protective layer with a lateral distance of, for example, 200 ⁇ m.
  • FIG. 2 shows SEM images of wetting areas 16 exposed by laser ablation in a protective layer 14.
  • a stop mask protective layer was used instead of the C18 protective layer of FIG. 1 for these SEM images.
  • a two-component solder resist (Elmer GL 2467 SM-DG, from Peters) is applied to the substrate in a curtain casting process known from printed circuit board technology in order to form a protective layer for the surface of the substrate.
  • Transport speed of the substrate 10 under the paint curtain can achieve any thickness of the protective layer in the range of approximately 10-150 ⁇ m.
  • the protective layer is structured with an excimer laser from Lambda-Physics by laser ablation.
  • 90-150 pulses of 20 ns with an area performance of 600-1200 mJ / cm 2 remove the varnish without residues and ensure that the gold substrates melt close to the surface, which closes the existing pores Roughness reduced and surface contamination removed.
  • the laser can be imaged on the substrate in a reduced size using various masks, the area intensity of the irradiation being set using the imaging device. Depending on the mask, different geometries of the ablated regions can be realized. , , ,
  • FIG. 2 illustrates that both rectangular or square cross sections (FIG. 2 (a)) and round cross sections, as shown in FIG. 2 (b), are possible.
  • FIG. 3 shows in (a) an AFM image of a gold surface which was melted in a circular partial area by laser bombardment, and in FIG. 3 (b) an elevation profile along the line B-B of FIG. 3 (a). It can clearly be seen that the melting reduces the roughness of the surface and increases the homogeneity of the irradiated surface. This facilitates the connection of probe molecules to the wetting regions 16 described below.
  • FIG. 1 (d) shows the wetting of the structured substrates by means of a wetting device 22 with nucleic acid oligomers in the pseudo-contact printing process.
  • the oligonucleotides are synthesized in an automatic oligonucleotide synthesizer (Expedite 8909; ABI 384 DNA / RNA synthesizer) according to the synthesis protocols recommended by the manufacturer for a 1.0 ⁇ mol synthesis.
  • the oxidation steps are carried out with a 0.02 molar iodine solution in order to avoid oxidative cleavage of the disulfide bridge.
  • Modifications to the 5 ' position of the oligonucleotides are carried out with a coupling step which is extended to 5 min.
  • the amino modifier C2 dT (Glen Research 10-1037) is built into the sequences with the respective standard protocol. The coupling efficiencies are determined online during the synthesis via the DMT cation concentration photometrically or conductometrically.
  • the oligonucleotides are deprotected with concentrated ammonia (30%) at 37 ° C for 16 h.
  • the oligonucleotides are purified using RP-HPL chromatography according to standard protocols (eluent: 0.1 molar triethylammonium acetate buffer, acetonitrile), and the characterization is carried out using MALDI-TOF MS.
  • the amine-modified oligonucleotides are coupled to the corresponding activated fluorophores (eg fluorescein isothiocyanate) in accordance with the conditions known to the person skilled in the art. The coupling can take place both before and after the oligonucleotides have been bound to the surface.
  • buffer phosphate buffer, 0.5 molar in water, pH 7
  • the free propanethiol present in the incubation solution is also co-adsorbed by forming an Au-S bond (incubation step).
  • this single strand can also be hybridized with its complementary strand.
  • Split pin needles 22 (Arraylt chipmarker pins from Tele-Chem) are used for the assignment with the spotter from Cartesian Technologies (MicroSys PA), which have a loading volume 24 of 0.2 to 0.6 ⁇ L and volumes 26 of Dispense approximately 1 nL per wetting process.
  • a side view of the needle 22 during the wetting process and a wetted wetting area 16 is shown in FIG. 1 (e).
  • the contact surface 28 of the needles 22 has a diameter of approximately 130 ⁇ m and is thus significantly larger than the wetting areas 16 of the substrate that are exposed during laser ablation.
  • the needle is positioned over the substrate with an accuracy of 10 ⁇ m at a humidity of around 70-80%.
  • the drop 26 is released when the tip comes into contact with the protective layer 14 and there is no direct contact of the needle 22 with the surface 12 of the substrate 10 to be wetted. This situation is shown in the left partial image of FIG. 1 (e). After wetting has taken place, a drop of liquid 30 is applied in a controlled manner to the wetting point 16 of the substrate (right partial image of FIG. 1 (e)).
  • a fluorescence intensity measurement on the Au-ss-oligo-fluorescein system will now be described as an application example.
  • wetting areas 16 are also formed on a structured substrate 10 Functionalized nucleic acid oligomers.
  • a modified oligonucleotide of the sequence 5'-fluorescein-AGC GGA TAA CAC AGT CAC CT-3 '[C 3 -SSC 3 -OH] is immobilized on gold (50 ⁇ mol oligonucleotide in phosphate buffer (K ⁇ PO ⁇ KH ⁇ O . ⁇ 500 mmolar, pH 7), subsequent coating with propanethiol 1 mM in water) and in the form Au-S (CH 2 ) 2-ss-oligo-Fluorescein the fluorescence intensity of the surface with a fluorescence scanner from Lavision Biotech certainly.
  • 150 ⁇ l of the medium are placed on the gold surface and then covered with
  • FIG. 4 shows the fluctuations in the fluorescence intensity of several identical measurement spots.
  • the serial number of the measurement spots is plotted on the abscissa, the fluorescence intensity measured in any units on the ordinate.
  • the nucleic acid in the measured values of FIG. 4 (a), the nucleic acid
  • a solder resist is used as a protective layer and is structured with leads for liquid analytes in order to produce wetting areas.
  • supply channels for liquids can also be written in thick solder mask layers (for example 100-150 ⁇ m).
  • a first structuring step different types of channels are cut into the lacquer via a first mask, the depth of these channels being adjustable by the number of pulses.
  • a channel depth of about 80 - 120 ⁇ m is achieved with about 540 - 900 pulses (20 ns) of the laser with an area performance of 600 - 1200 mJ / cm 2 .
  • the remaining lacquer is then removed via a second mask in individual areas within the channels of the first structuring step by additional laser exposure with approximately 90-150 pulses (20 ns), and the substrate is thus exposed and melted. These exposed substrate sites are now wetted with nucleic acid oligomers as described above.
  • analyte such as Liquids which contain potentially complementary nucleic acid oligomers are brought into contact, and thus the analyte liquid required for an analysis is significantly reduced.
  • a channel structure that e.g. only one part of the exposed substrate locations per channel connects an arrangement of n linear channels, each of which contains all m wetting areas of a column of a uniform spot matrix of the dimension n x m, expediently 10 ⁇ n, m ⁇ 1000.
  • Another channel structure that connects all of the exposed substrate sites to one another is a single channel that meanders all of the exposed substrate sites of the uniform wetting area matrix of the dimension n x m, expediently 10 ⁇ n, m 1000 1000.

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Abstract

Ein Verfahren zum Benetzen eines Substrats mit einer Flüssigkeit umfasst die Verfahrensschritte a) Bereitstellen eines Substrats mit einer zu benetzenden Oberfläche; b) Bereitstellen einer Benetzungsflüssigkeit; c) Aufbringen einer Schutzschicht auf das Substrat, die die zu benetzende Oberfläche von der Umgebung trennt; d) Strukturieren der Schutzschicht, um vorbestimmte Benetzungsgebiete auf der zu benetzenden Oberfläche des Substrats freizulegen; und e) Aufbringen der Benetzungsflüssigkeit auf die freigelegten Benetzungsge­biete mittels einer Benetzungsvorrichtung ohne direkten Kontakt zwischen der Benetzungsvorrichtung und der zu benetzenden Oberfläche des Sub­strats. Die Erfindung enthält auch ein solcher massenherstellbares Substrat.

Description

Verfahren und Vorrichtung zum Benetzen eines Substrats mit einer Flüssigkeit
Technisches Gebiet
Die Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Vorrichtung zum Benetzen eines Substrats mit einer Flüssigkeit, sowie, ein mit dem erfindungsgemäßen Verfahren herstellbares flüssigkeitsbenetztes Substrat.
Stand der Technik
Das Benetzen eines Substrats mit einer Flüssigkeit hat breite Anwendung in Industrie und Wissenschaft. Speziell im Bereich der Mikrostrukturierung von Oberflächen für die Biowissenschaften, die Medizintechnik und die Sensorik erlangten in den letzten Jahren neben den klassischen lithographischen Methoden zusätzlich Benetzungsverfahren zunehmend an Bedeutung.
Diese Benetzungsverfahren zur lateralen Strukturierung von Oberflächen lassen sich grob in zwei Klassen unterteilen: Verfahren mit direktem Kontakt der Benetzungsvorrichtung mit dem Substrat, und Verfahren ohne direkten Kontakt.
Bei den Strukturierungsverfahren mit direktem Kontakt ist besonders das Mik- rokontakt-Drucken μCP (mico-contact-printing) hervorzuheben, das erstmals von Whitesides 1994 (A. Kumar, G.M. Whitesides, Science, 1994, 263, 60; US-A-6 048 623) vorgestellt wurde. Bei diesem Verfahren wird ein mikrostrukturierter Stempel mit einer Flüssigkeit benetzt, anschließend in Kontakt mit dem zu bearbeitenden Substrat gebracht und so der Oberfläche dem zu bearbeitenden Substrat gebracht und so der Oberfläche eine laterale chemische Struktur aufgeprägt. Eine große Schwierigkeit dieser Technik ist die Realisierung eines gleichförmigen Kontakts zwischen Stempel und Substrat, der für das Gelingen bzw. die Qualität von entscheidender Bedeutung ist.
Neben diesen strukturierten Stempeln gibt es im Stand der Technik verschiedene Vorrichtungen zum Platzieren von Flüssigkeitstropfen auf ein Substrat, wie Nadeln, Kapillaren, Ringe oder Pinzetten, die hauptsächlich als Modifikati- onen des Drückens von Tinte auf Papier entstanden sind. Hierbei wird die Vorrichtung in die zu übertragende Flüssigkeit getaucht, so dass sich Material überträgt. Dieses Material wird mit der Vorrichtung auf dem Substrat platziert und bildet einen benetzten Bereich, der von den Oberflächenenergien der Vorrichtung, der Flüssigkeit und des Substrates abhängt. Das übertragene Volu- men hängt bei diesen Verfahren in erster Linie von dem Durchmesser der Spitze der Vorrichtung ab. Probleme dieser Druckverfahren sind Variationen im übertragenem Flüssigkeitsvolumen und die Notwendigkeit, die Spitze mit dem Substrat für den Übertrag in physikalischen Kontakt zu bringen, was die Oberfläche des Substrats beschädigen kann.
Als Verfahren zum Übertrag von Flüssigkeiten auf ein Substrat, die ohne direkten Kontakt von Apparatur und Substrat auskommen, sollen hier beispielhaft die Ink-Jet Druckverfahren erwähnt werden. Bei diesen Techniken wird die Flüssigkeit im Druckkopf aufgenommen und dieser über der gewünschten Stelle des Substrats positioniert. Durch einen piezoelektrischen Kristall oder eine Pumpe wird auf die Flüssigkeit eine Kraft ausgeübt, so dass ein Tropfen den Kontaktkopf verlässt und auf das Substrat übertragen wird.
Auch bei den kontaktfreien Methoden ist die Größe des benetzten Bereichs durch die Oberflächenenergien der beteiligten Materialien bestimmt. Der durch den Kontaktwinkel zwischen Flüssigkeit und Substrat definierte Gleichgewichtszustand des Tropfen ist in hohem Grade abhängig von Faktoren wie Oberflächenrauhigkeit, chemischen Inhomogenitäten des Materials, Variationen der umgebenden Atmosphäre und natürlich Verunreinigungen. In einem realen System werden also die übertragenen Tropfen auf einem makroskopischen Substrat sehr unterschiedlich benetzen. Den Verfahren aus dem Stand der Technik sind also hinsichtlich der Toleranzen in Spotgrößen und Benet- zungsvolumina fundamentale Grenzen gesetzt.
Darstellung der Erfindung
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es deshalb, ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Benetzung von Substraten mit einer Flüssigkeit zu schaffen, welche die Nachteile des Standes der Technik nicht aufweisen.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß durch das Verfahren nach Anspruch 1 , die Vorrichtung nach Anspruch 38 und das flüssigkeitsbenetzte Substrat nach Anspruch 40 gelöst. Weitere vorteilhafte Details, Aspekte und Ausgestaltungen der vorliegenden Erfindung ergeben sich aus den abhängigen Ansprüchen, der Beschreibung, den Figuren und den Beispielen.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung werden die folgenden Abkürzungen und Begriffe benutzt:
Allgemeines μCP Micro-Contact-Printing. AFM Atomic-Force-Microscope. Analytflüssigkeit Flüssigkeit, die potentiell einen Analyten enthält, der über einen Sensor nachgewiesen werden soll.
Flüssigkeit nicht nur reine flüssige Stoffe, sondern auch Flüssigkeiten mit De- tergenz, jede Art von gelösten organischen oder anorganischen Stoffen, sowie Emulsionen, Suspensionen und kolloidalen Lösungen.
Laser-Ablation partielles oder vollständiges Entfernen von organischen oder anorganischen Schutzschichten, aber auch das Entfernen von Verunreinigungen auf einem Substrat durch Einstrahlung von Laserlicht.
Lötstopplack aus der Leiterplattentechnologie bekannter Lack, der auf Platinen aufgebracht wird, um beim automatisierten Löten das Entstehen von Lötzinnbrücken zu verhindern.
Pseudo-Kontakt- Aufbringen einer Flüssigkeit mit Hilfe einer Nadel, Kapillare, PinDrucken zette, eines Ringes oder Stempels bzw. einer Anordnung von Nadeln, Kapillaren, Pinzetten, Ringen oder Stempeln auf ein strukturiertes Substrat, wobei hier wegen der vorhandenen Schutzschicht und der lateralen Ausdehnung der Spitzen der Benetzungsvorrichtung, die bevorzugt größer als die freien zu benetzenden Flächen ist, kein direkter Kontakt zwischen der Benetzungsvorrichtung und dem Substrat zustande kommt.
Schutzschicht auf das zu bearbeitende Substrat vor der eigentlichen Benetzung aufgebrachte Schicht. Hierfür ist jedes beliebige Material verwendbar, das an der Substratoberfläche eine geschlossene Schicht bildet und diese somit von der Umgebung trennt und zu einem späteren Zeitpunkt durch Laser-Ablation partiell und rückstandsfrei entfernt werden kann. Diese Schutzschicht kann aus organischen wie auch aus anorganischen Materialien bestehen und je nach Substrattyp und Anwendungsvoraussetzungen physi- sorbiert, chemisorbiert oder kovalent gebunden sein und mit beliebigen Techniken aufgebracht werden.
SEM Scanning electron microscopy Substrat Festkörper mit einer frei zugänglichen Oberfläche, der somit mit einer Flüssigkeit benetzt werden kann. Als Festkörpersubstrate kommen sowohl Kunststoffe, als auch Metalle, Halbleiter, Gläser, Verbundstoffe oder poröse Materialien in Frage. Die Bezeichnung Oberfläche ist unabhängig von den räumlichen Dimensionen der Oberfläche und beinhaltet auch Nanopartikel (Partikel oder Cluster aus wenigen einzelnen bis mehreren hunderttausend Oberflächen-Atomen oder -Molekülen).
UV Ultraviolettes Licht
Genetik
DNA Desoxyribonukleinsäure
RNA Ribonukleinsäure
PNA Peptidnukleinsäure (synthetische DNA oder RNA, bei der die
Zucker-Phosphat Einheit durch eine Aminosäure ersetzt ist. Bei
Ersatz der Zucker-Phosphat Einheit durch die -NH-(CH2)2-
N(COCH2-Base)-CH2CO- Einheit hybridisiert PNA mit DNA).
A Adenin
G Guanin
C Cytosin
T Thymin
Base A, G, T, oder C
Bp Basenpaar
Nukleinsäure wenigstens zwei kovalent verbundene Nukleotide oder wenigstens zwei kovalent verbundene Pyrimidin- (z. B. Cytosin, Thymin oder Uracil) oder Purin-Basen (z. B. Adenin oder Guanin). Der Begriff Nukleinsäure bezieht sich auf ein beliebiges "Rückgrat" der kovalent verbundenen Pyrimidin- oder Purin-Basen, wie z. B. auf das Zucker-Phosphat Rückgrat der DNA, cDNA oder RNA, auf ein Peptid-Rückgrat der PNA oder auf analoge Strukturen (z. B. Phosphoramid-, Thio-Phosphat- oder Dithio-Phosphat- Rückgrat). Wesentliches Merkmal einer Nukleinsäure im Sinne der vorliegenden Erfindung ist, dass sie natürlich vorkommende cDNA oder RNA sequenzspezifisch binden kann.
Nukleinsäure- Nukleinsäure nicht näher spezifizierter Basenlänge (z. B. Nuk- Oligomer leinsäure-Oktamer: eine Nukleinsäure mit beliebigem Rückgrat, bei dem 8 Pyrimidin- oder Purin-Basen kovalent aneinander gebunden sind).
Oligomer Äquivalent zu Nukleinsäure-Oligomer. Oligonukleotid Äquivalent zu Oligomer oder Nukleinsäure-Oligomer, also z. B. ein DNA, PNA oder RNA Fragment nicht näher spezifizierter Basenlänge.
Oligo Abkürzung für Oligonukleotid. ss Single Strand (Einzelstrang)
Chemikalien
Alkyl Der Begriff "Alkyl" bezeichnet ein gesättigtes Kohlenwasserstoffradikal, das geradkettig oder verzweigt ist (z.B. Ethyl, Isopropyl oder 2,5- Dimethylhexyl etc.). Wenn "Alkyl" benutzt wird, um auf einen Linker oder Spacer zu verweisen, bezeichnet der Begriff eine Gruppe mit zwei verfügbaren Valenzen für die kovalente Verknüpfung (z. B. - CH2CH2-, -CH2CH2CH2- oder-CH2C(CH3)2CH2CH2C(CH3)2CH2- etc.).
Alkenyl Alkylgruppen bei denen eine oder mehrere der C-C Einfachbindungen durch C=C Doppelbindungen ersetzt sind. Alkinyl Alkyl- oder Alkenylgruppen bei denen eine oder mehrere der C-C Einfach- oder C=C Doppelbindungen durch C≡C Dreifachbindungen ersetzt sind.
Hetero-Alkyl Alkylgruppen bei denen eine oder mehrere der C-H Bindungen oder C-C Einfachbindungen durch C-N, C=N, C-P, C=P, C-O, C=O, C-S oder C=S Bindungen ersetzt sind.
Hetero-Alkenyl Alkenylgruppen bei denen eine oder mehrere C-H Bindungen, C-C Einfach- oder C=C Doppelbindungen durch C-N, C=N, C-P, C=P, C-O, C=O, C-S oder C=S Bindungen ersetzt sind. i
Hetero-Alkinyl Alkinylgruppen bei denen eine oder mehrere der C-H Bindungen, C-C Einfach-, C=C Doppel- oder C≡C Dreifachbindung durch C- N, C=N, C-P, C=P, C-O, C=O, C-S oder C=S Bindungen ersetzt sind.
C18 Octadecanthiol Fluorophor chemische Verbindung (chemische Substanz), die in der Lage ist, bei Anregung mit Licht ein längerwelliges (rotverschobenes) Fluoreszenzlicht abzugeben. Fluorophore (Fluoreszenzfarbstoffe) können Licht in einem. Wellenlängenbereich vom ultravioletten (UV) über den sichtbaren (VIS) bis hin zum infraroten (IR) Bereich absorbieren. Die Absorp- tions- und Emissionsmaxima sind typischerweise um 15 bis 40 nm gegeneinander verschoben (Stokes-Shift).
Ligand Bezeichnung für Moleküle, die vom Ligaten spezifisch gebunden werden; Beispiele von Liganden im Sinne der vorliegenden Schrift sind Substrate, Cofaktoren oder Coenzyme eines Proteins (Enzyms), Antikörper (als Ligand eines Antigens), Antigene (als Ligand eines Antikörpers), Rezeptoren (als Ligand eines Hormons), Hormone (als Ligand eines Rezeptors) oder Nuklein- säure-Oligomere (als Ligand des komplementären Nukleinsäure- Oligomers.
Ligat Bezeichnung für (Makro-) Molekül, an dem sich spezifische Er- kennungs- und Bindungsstellen für die Ausbildung eines Komplexes mit einem Liganden befinden (Template).
Fluorescein Resorcinphtalein R beliebiger, nicht näher spezifizierter organischer Rest als Substituent oder Seitenkette.
Amine Moleküle der allgemeinen Struktur H2N-Spacer-R Silane Moleküle der allgemeinen Struktur X3-Si -Spacer-R, wobei z.B. X = H, CI, OCH3
Thiole Moleküle der allgemeinen Struktur HS -Spacer-R oder [SSpacer-R]2 Spacer Beliebige molekulare Verbindung zwischen zwei Molekülen bzw. zwischen einem Oberflächenatom, Oberflächenmolekül oder einer Oberflächenmolekülgruppe und einem anderen Molekül, in der Regel Alkyl,- Alkenyl, Alkinyl-, Heteroalkyl-, Heteroalkenyl-, Heteroalkinyl-Ketten. Bevorzugte Spacer sind solche der Kettenlänge 1 - 20, insbesondere der Kettenlänge 1 - 14, wobei die Kettenlänge die kürzeste durchgehende Verbindung zwischen den zu verbindenden Strukturen darstellt.
Au-S-(CH2)2-ss- Gold-Oberfläche mit kovalent aufgebrachter Monolayer aus derivati- Oligo-Fluorescein siertem Einzelstrang-Oligonukleotid. Hierbei ist die endständige Phosphatgruppe des Oligonukleotids am 3' Ende mit (HO-(CH2)2-S)2 zum P-O-(CH2)2-S-S-(CH2)2-OH verestert, wobei die S-S Bindung homolytisch gespalten wird und je eine Au-S-R Bindung bewirkt. Am freien Ende trägt das Sonden-Oligonukleotid einen kovalent angebunden Fluorophor Fluorescein.
Oligo-Spacer-S-S- zwei gleiche oder verschiedene Nukleinsäure-Oligomere, die Spacer-Oligo über eine Disulfid-Brücke miteinander verbunden sind, wobei die Disulfidbrücke über zwei beliebige Spacer an die Nukleinsäure- Oligomere angebunden ist und die beiden Spacer eine unterschiedliche Kettenlänge (kürzeste durchgehende Verbindung zwischen Disulfidbrücke und dem jeweiligen Nukleinsäure- Oligomer) aufweisen können, insbesondere jeweils eine beliebige Kettenlänge zwischen 1 und 14 und diese Spacer wiederum an verschiedene natürlich am Nukleinsäure-Oligomer Vorhände- ne oder an diese durch Modifikation angebrachte reaktive Gruppen gebunden sein können.
(n x HS-Spacer)- Nukleinsäure-Oligomer, an das n Thiolfunktionen über jeweils oügo einen Spacer angebunden sind, wobei die Spacer jeweils eine unterschiedliche Kettenlänge (kürzeste durchgehende Verbindung zwischen Thiolfunktion und Nukleinsäure-Oligomer) aufweisen können, insbesondere jeweils eine beliebige Kettenlänge zwischen 1 und 14. Diese Spacer können wiederum an verschiedene natürlich am Nukleinsäure-Oligomer vorhandene oder an diesem durch Modifikation angebrachte reaktive Gruppen gebunden sein und "n" ist eine beliebige ganze Zahl, insbesondere eine Zahl zwischen 1 und 20.
(n x R-S-S- Nukleinsäure-Oligomer, an das n Disulfidfunktionen über jeweils Spacer)-oligo einen Spacer angebunden sind, wobei ein beliebiger Rest R die Disulfidfunktion absättigt. Der Spacer zur Anbindung der Disulfid- funktion an das Nukleinsäure-Oligomer kann jeweils eine unterschiedliche Kettenlänge (kürzeste durchgehende Verbindung zwischen Disulfidfunktion und Nukleinsäure-Oligomer) aufweisen, insbesondere jeweils eine beliebige Kettenlänge zwischen 1 und 14. Diese Spacer können wiederum an verschiedene natürlich am Nukleinsäure-Oligomer vorhandene oder an diesem durch Modifikation angebrachte reaktive Gruppen gebunden sein. Der Platzhalter "n" ist eine beliebige ganze Zahl, insbesondere eine Zahl zwischen 1 und 20.
Erfindungsgemäß umfasst ein Verfahren zum Benetzen eines Substrats mit einer Flüssigkeit die folgenden Verfahrensschritte: a) Bereitstellen eines Substrats mit einer zu benetzenden Oberfläche; b) Bereitstellen einer Benetzungsflüssigkeit; c) Aufbringen einer Schutzschicht auf das Substrat, die die zu benetzende
Oberfläche von der Umgebung trennt; d) Strukturieren der Schutzschicht, um vorbestimmte Benetzungsgebiete auf der zu benetzenden Oberfläche des Substrats freizulegen; und e) Aufbringen der Benetzungsflüssigkeit auf die freigelegten Benetzungsgebiete mittels einer Benetzungsvorrichtung ohne direkten Kontakt zwischen 5 der Benetzungsvorrichtung und der zu benetzenden Oberfläche des Substrats.
Durch die erfindungsgemäße Vorgehensweise werden Verunreinigungen der Benetzungsgebiete weitgehend ausgeschlossen und der Verschleiß der Be-
) netzungsvorrichtung minimiert. Zugleich können durch die Strukturierung der Schutzschicht die zu benetzenden Gebiete auf dem Substrat in einfacher Weise vorgegeben werden. Das geometrische Zusammenspiel der Größe der Benetzungsvorrichtung, der lateralen Abmessungen der Benetzungsgebiete und der Dicke der an die Benetzungsgebiete angrenzenden Schutzschicht
5 ermöglicht eine wohldefinierte Abgabe der Benetzungsflüssigkeit von der Be- netzungsvorrichtung an die Oberfläche des Substrats.
Als Substrat wird dabei mit Vorteil ein Festköper aus Kunststoff, Metall, Halbleiter, Glas, Verbundstoff, porösem Material oder aus einer Kombination dieser ) Materialien bereitgestellt. Insbesondere wird als Substrat bevorzugt ein Festköper bereitgestellt, dessen zu benetzende Oberfläche durch eine Silizium-, Platin- oder Goldschicht bzw. eine oxidische Schicht oder ein Glas gebildet ist.
Die räumliche Gestaltung des Substrats ist nach der Erfindung nicht einge- i schränkt. Vielmehr kann als Substrat beispielsweise eine makroskopische Festkörperscheibe, ein Mikro- oder Nanopartikel bereitgestellt werden.
Der Begriff "Benetzungsflüssigkeit" umfasst im Rahmen der vorliegenden Erfindung insbesondere rein flüssige Stoffe, Lösungen organischer und/oder an- l organischer Stoffe, Emulsionen, Suspensionen oder kolloidale Lösungen. Das Material der Schutzschicht wird zweckmäßig so auf das Substratmaterial abgestimmt, dass das Schutzschichtmaterial auf der zu benetzenden Substratoberfläche physisorbiert, chemisorbiert oder kovalent, koordinativ oder über Komplexbildung gebunden ist. Beispielsweise kann als Schutzschicht ein positiver oder negativer Photolack auf das Substrat aufgebracht, bevorzugt aufgesprüht oder aufgeschleudert werden. Ebenso kann als Schutzschicht für das Substrat ein Lötstopplack verwendet werden. Dabei ist bevorzugt, dass der Lötstopplack durch Siebdruck, Vorhanggießen oder ein Sprayverfahren aufgebracht wird.
Nach einer weiteren Verfahrensvariante wird als Schutzschicht ein organisches Polymer, insbesondere aus Cellulose, Dextran oder Collagen auf das Substrat aufgebracht. Das organische Polymer wird bevorzugt aufgeschleudert oder physisorbiert.
Nach noch einer weiteren vorteilhaften Variante wird als Schutzschicht eine selbstassemblierte Monolage aus organischen Molekülen aufgebracht. Diese wird insbesondere dadurch hergestellt, dass die organischen Moleküle in einem wässrigen oder organischen Lösungsmittel gelöst werden und die Lösung in Kontakt mit dem Substrat gebracht wird.
Eine besonders bevorzugte Ausgestaltung ergibt sich, wenn als Substrat mit Vorteil ein Festköper bereitgestellt wird, dessen zu benetzende Oberfläche durch eine Goldschicht gebildet ist und wenn als Schutzschicht eine selbstas- semblierte Monolage aus Thiolen, insbesondere der allgemeinen Struktur HS- Spacer-R oder [S-Spacer-R]2 aufgebracht wird. Dabei stellt R eine beliebige Kopfgruppe dar und der Spacer hat eine Kettenlänge von 1 - 20, insbesondere von 1 -14.
Eine andere besonders bevorzugte Ausgestaltung ergibt sich, wenn als Substrat ein Festköper bereitgestellt wird, dessen zu benetzende Oberfläche durch eine Silizium- oder Platinschicht gebildet ist, und wenn als Schutzschicht eine selbstassemblierte Monolage aus Aminen, insbesondere der allgemeinen Struktur H2N-Spacer-R aufgebracht wird. Auch hier stellt R eine beliebige Kopfgruppe dar und der Spacer hat eine Kettenlänge von 1 - 20, insbesondere von 1 -14.
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausgestaltung wird als Substrat ein Festköper bereitgestellt, dessen zu benetzende Oberfläche durch eine oxidische Oberfläche oder ein Glas gebildet ist. Als Schutzschicht wird dabei eine selbstassemblierte Monolage aus Silanen, insbesondere der allgemeinen Struktur X3-Si-Spacer-R aufgebracht, wobei R eine beliebige Kopfgruppe und X = H, CI oder OCH3 ist und der Spacer eine Kettenlänge von 1 - 20, insbesondere von 1 -14 hat.
In allen drei genannten Verfahrensvarianten ist die Kopfgruppe R zweckmäßig ausgewählt aus der Gruppe CH3, OH, CO2H, NH2, NH3 + oder SO3 " .
Die Schutzschicht wird in Schritt c) mit Vorteil in Form einer geschlossenen Schicht auf die zu benetzenden Substratoberflächen aufgebracht. Sie kann dabei sowohl vollflächig auf die gesamte Oberfläche des Substrats aufge- bracht werden, oder nur Teilbereiche der Oberfläche bedecken. Im Bereich der gewünschten Benetzungsgebiete wird die Schutzschicht anschließend zweckmäßig rückstandslos entfernt.
Die Strukturierung der Schutzschicht erfolgt in einer bevorzugten Ausgestal- tung mittels Laserablation, insbesondere durch Bestrahlung von Teilbereichen der Schutzschicht mit kontinuierlicher oder gepulster Laserstrahlung einer vorbestimmten Wellenlänge. Die Schutzschicht wird dazu insbesondere direkt, über eine Optik oder über eine Maske mit der Laserstrahlung beaufschlagt, um die Benetzungsgebiete freizulegen.
Es hat sich als vorteilhaft herausgestellt, wenn durch die Laserstrahlung die zu benetzende Oberfläche des Substrats im Bereich der Benetzungsgebiete auf- geschmolzen wird. Dadurch ergibt sich eine reduzierte Oberflächenrauhigkeit und eine verbesserte Homogenität der Oberfläche des Substrats. Außerdem werden durch die Ablation weniger Goldlagen von der Oberfläche Verunreinigungen entfernt.
Die Benetzungsgebiete werden vorteilhaft mit einer charakteristischen Ausdehnung von etwa 5 μm bis etwa 200 μm, bevorzugt von etwa 10 μm bis etwa 100 μm erzeugt. Als lateraler Abstand wird ein Wert von etwa 20 μm bis etwa 500 μm, bevorzugt von etwa 50 μm bis etwa 200 μm eingestellt. Die Benet- zungsgebiete weisen vorteilhaft einen im wesentlichen rechteckigen, elliptischen oder kreisförmigen Umriss auf.
Nach einer vorteilhaften Weiterbildung der Erfindung werden bei dem Schritt d) zusätzlich Zuleitungskanäle in die Schutzschicht eingebracht, um die Zufüh- rung einer Analytflüssigkeit zu den freigelegten Benetzungsgebieten zu er- möglichen.
Dabei werden die Zuleitungskanäle zweckmäßig mit einer Tiefe von 10% bis 99%, bevorzugt von 20% bis 95%, besonders bevorzugt von 50% bis 95% der Dicke der Schutzschicht in die Schutzschicht eingebracht. Die freigelegten Benetzungsgebiete sind dabei mit Vorteil innerhalb der Zuleitungskanäle angeordnet.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren umfasst die Benetzungsvorrichtung insbesondere eine einzelne Nadel, Kapillare, Pinzette, einen einzelnen Ring oder Stempel. Sie kann im Rahmen der Erfindung auch eine Anordnung mehrerer Nadeln, Kapillaren, Pinzetten, Ringen, Stempeln, oder eine Anordnung verschiedener dieser Elemente umfassen.
Nach einer zweckmäßigen Ausgestaltung weist die Benetzungsvorrichtung eine flüssigkeitsabgebende Endfläche auf, deren laterale Ausdehnung in zumindest einer Raumrichtung größer ist, als die laterale Ausdehnung der Be- netzungsgebiete in dieser Raumrichtung. Dadurch kann bei korrekter Ausrichtung ein direkter Kontakt zwischen der Benetzungsvorrichtung und der Oberfläche des Substrats vermieden werden.
Vorteilhaft weist die Endfläche der Benetzungsvorrichtung in beiden Raumrichtungen eine größere laterale Ausdehnung als die Benetzungsgebiete auf, so dass ein direkter Kontakt zwischen der Benetzungsvorrichtung und den Be- netzungsgebieten in allen relativen Orientierungen vermieden wird.
Zum Aufbringen der Benetzungsflüssigkeit wird bevorzugt die Endfläche der Benetzungsvorrichtung in Kontakt mit der an das Benetzungsgebiet angrenzenden Schutzschicht gebracht. Ein Tropfen der Benetzungsflüssigkeit kann so kontrolliert ohne direkten Kontakt mit der Substratoberfläche in die strukturierte Ausnehmung in der Schutzschicht eingebracht werden.
Insbesondere kann die Endfläche der Benetzungsvorrichtung zum Aufbringen der Benetzungsflüssigkeit vollständig über das Benetzungsgebiet und von o- ben in Kontakt mit der Oberfläche der an das Benetzungsgebiet angrenzenden Schutzschicht gebracht werden.
In einer vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung ist die Endfläche der Benetzungsvorrichtung mit einer Genauigkeit (Δx, Δy) lateral über einer strukturierten Schutzschicht positionierbar, und die Benetzungsgebiete werden mit einer charakteristischen lateralen Ausdehnung (xspot, yspot) erzeugt, die um zumin- dest die Positioniergenauigkeit (Δx, Δy) kleiner ist, als die laterale Ausdehnung (xtip,y«p) der Endfläche der Benetzungsvorrichtung. Dadurch ist sichergestellt, dass die Abgabe eines Tropfens kontrolliert und nur über die Schutzschicht erfolgt.
Gemäß einer zweckmäßigen Weiterentwicklung der Erfindung werden modifizierte Nukleinsäure-Oligomere in wässriger Lösung als Benetzungsflüssigkeit aufgebracht. Die Nukleinsäure-Oligomere sind dabei mit einer oder mehreren reaktiven Gruppen modifiziert, wobei zumindest eine reaktive Gruppe für eine direkte Reaktion mit der zu benetzenden Oberfläche des Substrats ausgelegt ist. Die Nukleinsäure-Oligomere können darüber hinaus zur nachfolgenden Visualisierung mit einem Fluorophor modifiziert sein.
Die Erfindung enthält auch eine Vorrichtung zur Durchführung des beschriebenen Verfahrens. Mit besonderem Vorteil enthält eine solche Vorrichtung eine Benetzungsvorrichtung, deren Endfläche mit einer Positioniergenauigkeit von weniger als 50 μm, bevorzugt von weniger als 10 μm lateral über einer strukturierten Schutzschicht positionierbar ist.
Die Erfindung enthält femer ein nach einem vorbeschriebenen Verfahren herstellbares flüssigkeitsbenetztes Substrat.
Weitere Ausgestaltungen und Vorteile der Erfindung werden nachfolgend ausführlich beschrieben:
Wie oben ausgeführt, umfasst die Erfindung ein Verfahren zur kontrollierten Benetzung strukturierter Substrate mit einer Flüssigkeit mittels einer Benetzungs- Vorrichtung bestehend aus einer einzelnen Nadel, Kapillare, Pinzette, eines Ringes oder Stempels bzw. einer Anordnung von Nadeln, Kapillaren, Pinzetten, Ringen oder Stempeln. In der vorliegenden Erfindung können diese Benet- zungsvorrichtungen Spitzen mit beliebiger lateraler Ausdehnung haben, also auch und sogar bevorzugt größer als die laterale Fläche der laserablatierten, freien Substratstellen. Die Benetzungsvorrichtung der Erfindung kommt ohne direkten Kontakt mit dem Substrat aus und kann somit als ein Pseudo-Kontakt- Verfahren bezeichnet werden.
Aufbringen einer Schutzschicht auf das Substrat
Erfindungsgemäß werden die Substrate mit einer Schutzschicht versehen, um den kritischen Zeitraum zwischen der Herstellung des Substrats und der Benetzung seiner Oberfläche zu überbrücken. Die Schutzschicht verhindert in diesem Zeitraum die Anlagerung unerwünschter Verunreinigungen an der Substratoberfläche.
Für die Schutzschicht kann jedes beliebige Material verwendet werden, das an einer Oberfläche eine geschlossene Schicht bildet und somit die Substratoberfläche von der Umgebung trennt und zu einem späteren Zeitpunkt etwa durch Laser-Ablation an gewünschten Stellen rückstandsfrei entfernt werden kann. Es versteht sich, dass mit Vorteil für ein gegebenes Substrat eine angepasste Schutzschicht gewählt wird, die in bezug auf die Haftung zwischen dem Substrat und Schutzschicht optimiert ist. Ebenso lässt sich die Schutzschicht im Hinblick auf die zu verwendende Flüssigkeit optimieren. Im Falle von wässri- gen Lösungen bietet sich ein hydrophiles Schichtmaterial an, so dass die Flüssigkeiten die Zuleitungskanäle der Erfindung benetzen und Luftblasen vermieden werden. Bei öligen Flüssigkeiten ist hingegen hydrophobes Material zu bevorzugen.
Durch die Zugabe von Detergenzien zu den verwendeten Flüssigkeiten lassen sich unabhängig vom Schichtmaterial verbesserte Benetzungen der Kanalstrukturen und damit gute Flusseigenschaften erreichen. Neben üblichen bekannten Lacken aus der Lithographie (positive und negative Photolacke) und der Leiterplatten-Technologie (Lötstopplacke) eignen sich auch organische Polymere wie Cellulose, Dextran oder Collagen bzw. selbstassemblierte Mo- noiagen aus organischen Molekülen wie Silane oder Thiole. Auch ist es denkbar, Lacke zu verwenden, deren spezielle Bestandteile beim Trocknen des Materials an der Oberfläche vorteilhafte Funktionalisierungen für besondere Anwendungen ausbilden.
Die Schutzschicht kann beispielsweise durch Sprühen im Falle der Photolacke, durch Spincoating oder Physisorption im Falle der organischen Polymere oder durch Siebdruck bzw. Vorhanggießen im Falle der Lötstopplacke auf das Substrat aufgebracht werden.
In einer bevorzugten Ausgestaltung der Erfindung werden Monolagen organischer Moleküle wie Thiole oder Silane mit variabler Kettenlänge in einem selbstassemblierenden Prozess auf das Substrat aufgebracht. Hierfür werden die organischen Moleküle in wässrigen oder organischen Lösungsmitteln gelöst und die Lösung in Kontakt mit dem zu beschichtenden Substrat gebracht. Der Abscheidungsprozess endet in einer Monolage aus kovalent gebundenen Molekülen auf dem Substrat.
In einer besonders bevorzugten Ausgestaltung der Erfindung werden Thiole beispielsweise der allgemeinen Struktur HS-Spacer-R bzw. [S-Spacer-R]2 als dichte, geordnete und passivierende Monolage auf Gold aufgebracht, wobei R > beliebige Kopfgruppen wie z.B. R = CH3, OH, CO2H, NH2, NH3 + oder S03 sein können und Spacer als Begriff für beliebige molekulare Verbindungen zwischen zwei Molekülen verstanden werden soll, in der Regel Alkyl-, Alkenyl-, Alkinyl-, Heteroalkyl-, Heteroalkenyl-, Heteroalkinyl-Ketten mit Kettenlängen von 1 - 20, insbesondere 1 -14, wobei hier die Kettenlänge die kürzeste durchgehende Verbindung zwischen den zu verbindenden Strukturen ist. Al- temativ können die organischen Moleküle auch mit Amin-Gruppen (H2N- Spacer-R) anstelle der Thiol-Gruppen (SH-Spacer-R) versehen werden, die sich dann durch Chemi- oder Physisorption an Platin- oder Silizium- Oberflächen anlagern lassen. Werden die Thiol-Gruppen (SH-Spacer-R) alternativ durch Silan-Gruppen ersetzt (X3-Si-Spacer-R, wobei beispielsweise X = H, CI, OCH3), so lässt sich auf oxidischen Oberflächen oder Gläsern eine kovalent gebundene Monolage produzieren.
In einer anderen bevorzugten Art der Erfindung werden auf die Substrate Schutzschichten aus von der Leiterplattentechnologie bekannten Lötstoppla- cken aufgebracht. Es eignen sich 2-Komponenten oder 1 -Komponenten Lötstopplacke, die über Vorhanggießverfahren, Siebdruck oder Sprayverfahren aufgebracht werden und anschließend an der Luft oder durch UV-Bestrahlung aushärten können. Ein Vorteil dieser Verfahrensvariante ist, dass die Dicke der Lötstopplackschicht z.B. im Vorhanggießverfahren durch die Geschwindigkeit der Substrate unter dem Lackvorhang in einem großen Bereich frei eingestellt werden kann.
Laser-Ablation der Schutzschicht in beliebiger Geometrie
Unter dem Begriff "Laser-Ablation" wird im Rahmen dieser Anmeldung nicht nur das partielle oder vollständige Entfernen von organischen oder anorganischen Schutzschichten, sondern auch das Entfernen von Verunreinigungen auf einem Substrat durch Einstrahlung von Laserlicht verstanden. Die Laser- Ablation wird mit Vorteil zur Entfernung oder Strukturierung der aufgebrachten Schutzschicht an gewünschten Stellen des Substrats in beliebiger Geometrie eingesetzt. Dadurch jst es möglich, verschiedene, genau definierte freie Substratflächen oder Bereiche mit verjüngter Schutzschicht in unterschiedlicher Größe auf ein und demselben Substrat-Design nur durch Veränderung der Laser-Belichtung zu realisieren.
Ein weiterer Gesichtspunkt der erfindungsgemäßen Lösung ist das Aufschmelzen der Substratoberfläche bei vollständigem Entfernen der Schutzschicht mittels Laser-Ablation, das durch Einstellung der Laserintensität oder der Bestrahldauer auf die Gegebenheiten des Substrats und der Schutzschicht erreicht werden kann. Dieses kurzfristige, oberflächennahe Auf- schmelzen der Substratoberfläche schließt neben der Reduktion der Oberflächenrauhigkeit auch vorhandene Poren im Material und verbessert somit die Homogenität der freien Substratoberfläche. Außerdem werden durch die Abla- tion weniger Goldlagen von der Oberfläche Verunreinigungen entfernt.
Die Laser-Ablation kann durch direkte Einstrahlung des Lichts oder aber durch Einstrahlung des Lichts über eine Optik bzw. eine Maske erfolgen. Die Größe oder die Form der einzelnen freizulegenden oder strukturierten Benetzungs- gebiete und ihr lateraler Abstand sind hierbei beliebig und nur von der jeweiligen Anwendung abhängig. Die Wellenlänge des verwendeten Laserlichts, sowie Einstrahldauer bzw. Anzahl und Dauer der Pulse hängen von der Kombination aus Schutzschicht und des Materials der Substratoberfläche ab und werden vorzugsweise für jedes Paar optimiert.
In einer bevorzugten Variante der Erfindung wird mit einem Excimer-Laser über eine Blende eine Anordnung von freien Benetzungsgebieten mit einem Durchmesser von je d = 10 - 100 μm und einem lateralen Abstand von 50 - 200 μm in eine monomolekulare Schicht aus Octadecanthiol gebrannt.
In einer anderen bevorzugten Variante der Erfindung werden mit einem Excimer-Laser über mehrere Masken in mehreren Prozessschritten Strukturen aus Kanälen und freien Benetzungsgebieten in einen Lötstopplack geschrieben, die neben der kontrollierten Benetzung an den freien Substratstellen mittels des beschriebenen Pseudo-Kontakt-Druckverfahrens auch das gezielte Kontaktieren von über Kanälen miteinander verbundenen Stellen mit einer einen Analyten enthaltenden Flüssigkeit ermöglichen. In Lötstopplackschichten von 100 - 150 μm Dicke werden mit einer bestimmten Anzahl an Laser-Pulsen verschiedene Kanäle der Tiefe 80 - 100 μm und der Breite 10 - 150 μm geschnitten und dann innerhalb der Kanäle das Substrat an mehreren Stellen mit Durchmessern von etwa d = 10 - 100 μm durch weitere Laser-Pulse freigelegt. Durch solche in den Kanalstrukturen freigelegten, sensitiven Substratstellen wird die für eine Analyse benötigte Analytflüssigkeit im Vergleich zur Be- netzung des gesamten Substrates deutlich verringert.
Benetzung der strukturierten Substrate mit einer Flüssigkeit im PseudoKontakt-Drucken
Nach der Erfindung wird die Benetzungsflüssigkeit insbesondere mit Hilfe einer Nadel, Kapillare, Pinzette, eines Ringes oder Stempels bzw. einer Anord- nung von Nadeln, Kapillaren, Pinzetten, Ringen oder Stempeln auf das strukturierte Substrat aufgebracht. In der vorliegenden Anmeldung wird die Bezeichnung „Pseudo-Kontakt-Drucken" für den Benetzungsvorgang verwendet, um die Technik vom bekannten Standardverfahren des „Contact Printings" abzuheben und deutlich zu machen, dass wegen der vorhandenen Schutzschicht und der lateralen Ausdehnung der Spitzen der Benetzungsvorrichtung, welche bevorzugt größer als die freien zu benetzenden Flächen ist, kein direkter Kontakt zwischen der Benetzungsvorrichtung und der Substratoberfläche zustande kommt. Da zusätzlich die freie, zu benetzende Substratfläche von der Schutzschicht einer vorbestimmten Höhe begrenzt ist, trifft die Benetzungsvorrichtung auf eine geometrische Barriere definierter Abmessung, so dass eine kontrollierte Benetzung zustande kommt.
Im Rahmen der Erfindung lassen sich sowohl reine flüssige Stoffe, als auch jede Art von gelösten organischen oder anorganischen Stoffen, sowie Emulsionen, Suspensionen und kolloidale Lösungen verwenden. Denkbare Materialien im Sinne der Erfindung sind gelöste Farbpigmente oder beliebige funktionalisier- te Polymere und Nanopartikel. Auf dem Gebiet der Sensorik lassen sich mit der vorliegenden Erfindung alle Arten von Ligaten auf das Substrat aufbringen. Als Ligaten werden Moleküle bezeichnet, die spezifisch mit einem Liganden unter Ausbildung eines Komplexes wechselwirken. Beispiele von Ligaten im Sinne der vorliegenden Schrift sind Substrate, Cofaktoren oder Coenzyme als Komplexbindungspartner eines Proteins (Enzyms), Antikörper (als Komplexbindungspartner eines Antigens), Antigene (als Komplexbindungspartner eines Antikörpers), Rezeptoren (als Komplexbindungspartner eines Hormons), Hormone (als Komplexbindungspartner eines Rezeptors), Nukleinsäure- Oligomere (als Komplexbindungspartner des komplementären Nukleinsäure- Oligomers) oder Metallkomplexe.
In einer bevorzugten Art der Erfindung werden die freien Substratstellen mit modifizierten Nukleinsäure-Oligomeren in wässriger Lösung benetzt. Das Nukleinsäure-Oligomer, das auf die freie Oberfläche aufgebracht werden soll, ist über einen kovalent angebundenen Spacer beliebiger Zusammensetzung und Kettenlänge mit einer oder mehreren reaktiven Gruppe modifiziert, wobei sich diese reaktiven Gruppen bevorzugt in der Nähe eines Endes des Nukleinsäu- re-Oligomers befinden. Bei den reaktiven Gruppen handelt es sich um Grup- pen, die direkt mit der unmodifizierten Oberfläche reagieren können. Beispiele hierfür sind: (i) Thiol- (HS-) oder Disulfid- (S-S-) derivatisierte Nukleinsäure- Oligomere der allgemeinen Formel (n x HS-Spacer)-oligo, (n x R-S-S-Spacer)- oligo oder oligo-Spacer-S-S-Spacer-oligo, die mit einer Goldoberfläche unter Ausbildung von Gold-Schwefelbindungen reagieren, (ii) Amine, die sich durch Chemi- oder Physisorption an Platin- oder Silizium-Oberflächen anlagern und Silane, die mit oxidischen Oberflächen eine kovalente Bindung eingehen.
Im Pseudo-Kontakt-Drucken wird der Dispenser der Benetzungsvorrichtung mit beliebiger lateralen Ausdehnung (xtjP, ytip) mit einer Genauigkeit von (Δx, Δy) über dem strukturierten Schutzfilm positioniert und für die Benetzung so weit herabgesenkt, dass der Kontakt der Benetzungsvorrichtung bei der Abgabe des Tropfens nur über die Schutzschicht erfolgt. Dies ist insbesondere dann gewährleistet, wenn die Benetzungsgebiete eine charakteristische laterale Ausdehnung (xspot. Yspot) aufweisen, die um zumindest die Positioniergenau- igkeit kleiner als die Ausdehnung des Dispensers ist, also die Bedingungen
Xspot ≤ xtip - Δx und yspot ≤ ytιP - Δy
erfüllt sind.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
Nachfolgend soll die Erfindung anhand von Ausführungsbeispielen im Zusammenhang mit den Zeichnungen näher erläutert werden. Dabei sind nur die für das Verständnis der Erfindung wesentlichen Elemente dargestellt. Es zeigt Fig. 1 in (a) bis (e) eine schematische Darstellung der Prozessführung beim
Benetzen eines Substrats mit einer Flüssigkeit nach einem Ausführungsbeispiel der Erfindung;
Fig. 2 in (a) und (b) SEM-Aufnahmen von durch Laser-Ablation freigelegten
Benetzungsstellen in einer Stopplack-Schutzschicht;
Fig. 3 in (a) ein AFM-Bild einer gelaserten und aufgeschmolzenen Gold-
Oberfläche und in (b) ein Querschnitts-Höhenprofil entlang der Linie B- B aus Fig. 3(a); und
Fig. 4 die Schwankungen der Fluoreszenzintensität bei einer Mehrzahl identischer Messspots als Maß für die Oberflächenbelegungsdichte mit Nukleinsäureoligomeren, (a) bei auf herkömmliche Weise gespotteten Nukleinsäure-Oligomeren und (b) bei Benetzung von Benetzungsgebieten auf der Substratoberfläche durch ein erfindungsgemäßes Verfahren.
Wege zur Ausführung der Erfindung
Ein Verfahren zum Benetzen eines Substrats mit einer Flüssigkeit nach einem Ausführungsbeispiel der Erfindung wird nachfolgend insbesondere mit Bezug auf Fig. 1 beschrieben.
In einem ersten Schritt wird ein Substrat 10 mit einer zu benetzenden Oberfläche 12 bereitgestellt, Fig. 1(a). Im Ausführungsbeispiel besteht das Substrat 10 aus einem Glas-Slide mit einer aufgedampften, 5 nm dicken CrNi- Kontaktschicht und einer darauf aufgedampften Goldschicht mit einer Dicke von etwa 200 nm. Vor der Belegung mit einer Schutzschicht wird das Substrat mit einer Standard Piranha-Reinigung (t = 30 s) behandelt. Zum Aufbringen einer C18- Schutzschicht 14 auf die Goldoberfläche wird das Substrat 10 bei Zimmertemperatur für 5 - 12 Stunden mit 1 nmol/l Octadecanthiol (C-18; Fluka) in Ethanol inkubiert und nach der Inkubation mit Ethanol gespült, um nicht angebundenes Thiol zu entfernen, Fig. 1 (b).
Anschließend wird der C18-Schutzfilm 14 durch Laser-Ablation strukturiert, um eine Mehrzahl von Benetzungsgebieten 16 auszubilden, wie in Fig. 1(c) illust- riert. Beispielsweise wird die Strukturierung des C18-Schutzfilms mit Strahlung 18 einer Wellenlänge von 193 nm eines Excimer-Lasers 20 der Firma Lamb- da-Physics durchgeführt. Mit 3 Pulsen ä 20 ns mit einer Flächenleistung von 100 mJ/cm2 lassen sich die Thiole der Schutzschicht 14 in den Benetzungsgebieten 16 rückstandsfrei entfernen. . . .
Der Laserbeschuss des Substrats 10 führt darüber hinaus zu einem Aufschmelzen der Goldoberfläche, wodurch Poren geschlossen, die Rauhigkeit reduziert und Verunreinigungen entfernt werden (Fig. 3).
Die Laserstrahlung wird über eine nicht gezeigte Maske verkleinert auf dem Substrat abgebildet, welche im Ausführungsbeispiel Beleuchtungsspots mit einem Durchmesser von 40-100 μm liefert. Die Benetzungsgebiete werden mit einem lateralen Abstand von beispielsweise 200 μm in die Schutzschicht gebrannt.
Figur 2 zeigt SEM-Aufnahmen von durch Laser-Ablation freigelegten Benetzungsgebieten 16 in einer Schutzschicht 14. Für diese SEM-Aufnahmen wurde anstelle der C18-Schutzschicht der Fig. 1 eine Stopplack-Schutzschicht verwendet. Da zu wird auf das Substrat ein 2-Komponenten Lötstopplack (El- pemer GL 2467 SM-DG, Fa. Peters) in einem aus der Leiterplatten- Technologie bekannten Vorhanggieß-Verfahren aufgebracht, um eine Schutzschicht für die Oberfläche des Substrats zu bilden. Durch die Variation der Transportgeschwindigkeit des Substrats 10 unter dem Lack-Vorhang lassen sich beliebige Dicken der Schutzschicht im Bereich von etwa 10 - 150 μm erzielen.
Nach dem Trocknen des Lackes wird die Schutzschicht mit einem Excimer- Laser der Firma Lambda-Physics durch Laserablation strukturiert. Im Fall von Schutzschichten einer Dicke von 15 - 20 μm entfernen 90 - 150 Pulse ä 20 ns mit einer Flächenleistung von 600 - 1200 mJ/cm2 den Lack rückstandsfrei und sorgen für ein oberflächennahes Aufschmelzen der Goldsubstrate, das vor- handene Poren schließt, die Rauhigkeit reduziert und Oberflächenverunreinigungen beseitigt. Der Laser kann über verschiedene Masken verkleinert auf dem Substrat abgebildet werden, wobei die Flächenintensität der Bestrahlung über die Abbildungsvorrichtung eingestellt wird. Je nach Maske lassen sich so verschiedene Geometrie der ablatierten Regionen realisieren. . . .
Die Figur 2 illustriert, dass sowohl rechteckige bzw. quadratische Querschnitte (Fig. 2(a)), als auch runde Querschnitte, wie in Fig. 2(b) dargestellt, möglich sind.
Die mit dem Aufschmelzen der Gold-Oberfläche des Substrats 10 verbundene Verbesserung der Oberflächenstruktur ist in Fig. 3 illustriert. Figur 3 zeigt in (a) eine AFM-Aufnahme einer Gold-Oberfläche, die in einem kreisförmigen Teilbereich durch Laserbeschuss aufgeschmolzen wurde, und in Fig. 3(b) ein Höhenprofil entlang der Linie B-B von Fig. 3(a). Es ist deutlich zu erkennen, dass durch das Aufschmelzen die Rauhigkeit der Oberfläche verringert und die Homogenität der bestrahlten Fläche erhöht wird. Dies erleichtert die nachfolgend beschriebene Anbindung von Sondenmolekülen an die Benetzungsgebiete 16.
Zurückkehrend zu Fig. 1 zeigt Fig. 1(d) die Benetzung der strukturierten Substrate mittels einer Benetzungsvorrichtung 22 mit Nukleinsäure-Oligomeren im Pseudo-Kontakt-Druckverfahren. Die Synthese der Oligonukleotide erfolgt in einem automatischen Oligonukleo- tid-Synthesizer (Expedite 8909; ABI 384 DNA/RNA-Synthesizer) gemäß der vom Hersteller empfohlenen Syntheseprotokolle für eine 1.0 μmol Synthese. Bei den Synthesen mit dem 1-O-Dimethoxytrityl-propyl-disulfid-CPG-Träger (Glen Research 20-2933) werden die Oxidationsschritte mit einer 0.02 molaren lodlösung durchgeführt, um eine oxidative Spaltung der Disulfidbrücke zu vermeiden. Modifikationen an der 5'-Position der Oligonukleotide erfolgen mit einem auf 5 min verlängerten Kopplungsschritt. Der Amino-Modifier C2 dT (Glen Research 10-1037) wird in die Sequenzen mit den jeweiligen Standardprotokoll eingebaut. Die Kopplungseffizienzen werden während der Synthese online über die DMT-Kationen-Konzentration photometrisch bzw. kondukto- metrisch bestimmt.
Die Oligonukleotide werden mit konzentriertem Ammoniak (30%) bei 37 °C 16 h entschützt. Die Reinigung der Oligonukleotide erfolgt mittels RP-HPL Chromatographie nach Standardprotokollen (Laufmittel: 0,1 molarer Triethy- lammoniumacetat-Puffer, Acetonitril), die Charakterisierung mittels MALDI- TOF MS. Die aminmodifizierten Oligonukleotide werden an die entsprechen- den aktivierten Fluorophore (z. B. Fluoresceinisothiocyanat) entsprechend der dem Fachmann bekannten Bedingungen gekoppelt. Die Kopplung kann sowohl vor als auch nach der Anbindung der Oligonukleotide an die Oberfläche erfolgen.
Auf das strukturierte Substrat 10 wird doppelt modifiziertes 20 bp Einzel- strang-Oligonukleotid der Sequenz 5'-AGC GGA TAA CAC AGT CAC CT-3' (Modifikation eins: die Phosphatgruppe des 3' Endes ist mit (HO-(CH2)2-S)2 zum P- O-(CH2)2-S-S-(CH2)2-OH yerestert ist, Modifikation zwei: an das 5' Ende ist der Flourescein-Modifier Fluorescein-Phosphoramidite (Proglio Biochemie GmbH) nach dem jeweiligen Standardprotokoll eingebaut) als 5x10"5 molare Lösung in Puffer (Phosphatpuffer, 0,5 molar in Wasser, pH 7) mit Zusatz von ca. 10"5 bis 10"1 molarem Propanthiol (oder anderen Thiolen oder Disulfiden geeigneter Kettenlänge) mit Hilfe eines Spotters (Carthesian) aufgebracht (Fig. 1(d)) und für 2 min -24h inkubiert. Während dieser Reaktionszeit wird der Disulfidspacer P-O-(CH2)2-S-S-(CH2)2-OH des Oligonukleotids homolytisch gespalten. Dabei bildet der Spacer mit Au-Atomen der Oberfläche eine kovalente Au-S Bindung aus, wodurch es zu einer 1 :1 Koadsorption des ss-Oligonukleotids und des abgespaltenen 2-Hydroxy-mercaptoethanols kommt. Das in der Inkubationslösung gleichzeitig anwesende, freie Propanthiol wird ebenfalls durch Ausbildung einer Au-S Bindung koadsorbiert (Inkubationsschritt). Statt des Einzel- strang-Oligonukleotids kann dieser Einzelstrang auch mit seinem Komplemen- tärstrang hybridisiert sein.
Für die Belegung mit dem Spotter der Firma Cartesian Technologies (Micro- Sys PA) werden Split-Pin Nadeln 22 (Arraylt Chipmarker Pins der Firma Tele- Chem) verwendet, die ein Ladevolumen 24 von 0.2 bis 0.6 μL haben und Vo- lumina 26 von etwa 1 nL pro Benetzungsvorgang abgeben. Eine Seitenan- sieht der Nadel 22 beim Benetzungsvorgang und ein benetztes Benetzungsgebiet 16 ist in der Fig. 1(e) dargestellt.
Die Kontaktfläche 28 der Nadeln 22 hat einen Durchmesser von etwa 130 μm und ist damit deutlich größer als die bei der Laser-Ablation freigelegten Benetzungsgebiete 16 des Substrates. Die Positionierung der Nadel über dem Substrat erfolgt mit einer Genauigkeit von 10 μm bei einer Luftfeuchtigkeit von etwa 70-80 %. Der Tropfen 26 wird beim Kontakt der Spitze mit der Schutzschicht 14 abgegeben und es kommt zu keiner direkten Berührung der Nadel 22 mit der zu benetzenden Oberfläche 12 des Substrats 10. Diese Situation ist im linken Teilbild der Fig. 1(e) gezeigt. Nach erfolgter Benetzung ist ein Flüssigkeitstropfen 30 auf der Benetzungsstelle 16 des Substrats kontrolliert aufgebracht (rechtes Teilbild der Fig. 1 (e)).
Als Anwendungsbeispiel wird nunmehr eine Fluoreszenz-Intensitätsmessung am System Au-ss-Oligo-Fluorescein beschreiben. Dazu werden wie oben beschrieben, Benetzungsgebiete 16 auf einem strukturierten Substrat 10 mit Nukleinsäure-Oligomeren funktionalisiert. Dazu wird ein modifiziertes Oligonukleotid der Sequenz 5'-Fluorescein-AGC GGA TAA CAC AGT CAC CT-3' [C3-S-S-C3-OH] auf Gold immobilisiert (50 μmol Oligonukleotid in Phosphat- Puffer (K^PO^KH^O.} 500 mmolar, pH 7), Nachbelegung mit Propanthiol 1 mM in Wasser) und in der Form Au-S(CH2)2-ss-oligo-Fluorescein die Fluoreszenzintensität der Oberfläche mit einem Fluoreszenz-Scanner der Firma Lavi- sion Biotech bestimmt. Zur Messung der Fluoreszenz in Gegenwart von flüssigen Medien werden 150 μl des Mediums auf die Goldoberfläche gegeben und anschließend mit einem Deckglas abgedeckt. Alternativ können auch Hybri- wells oder eine Imaging Chamber verwendet werden.
Figur 4 zeigt die Schwankungen der Fluoreszenzintensität mehrerer identischer Messspots. Die laufende Nummer der Messspots ist auf der Abszisse aufgetragen, die in beliebigen Einheiten gemessene Fluoreszenzintensität auf der Ordinate. Bei den Messwerten der Fig. 4(a) sind die Nukleinsäure-
Oligomere auf herkömmliche Weise gespottet, bei den Werten der Fig. 4(b) erfolgte die Benetzung durch das oben beschriebenen Pseudo-Kontakt- Druckverfahren der Erfindung. Es ist deutlich zu erkennen, dass die Schwankungen der Fluoreszenzintensitäten von Messspot zu Messspot durch die er- findungsgemäßen Maßnahmen gegenüber dem Stand der Technik signifikant reduziert werden.
In einem weiteren Ausführungsbeispiel wird ein Lötstopplack als Schutzschicht verwendet und zur Erzeugung von Benetzungsgebieten mit Zuleitungen für flüssige Analyten strukturiert. Mit Hilfe der Laser-Ablation von Lötstopplack- Schutzschichten lassen sich neben den einzelnen Benetzungsgebieten auch Zuleitungskanäle für Flüssigkeiten in dicke Lötstopplackschichten (beispielsweise 100 - 150 μm) schreiben.
In einem ersten Strukturierungsschritt werden hierbei über eine erste Maske verschiedene Arten von Kanälen in den Lack geschnitten, wobei sich die Tiefe dieser Kanäle durch die Anzahl der Pulse einstellen lässt. Eine Kanaltiefe von etwa 80 - 120 μm wird mit etwa 540 - 900 Pulsen (20 ns) des Lasers mit einer Flächenleistung von 600 - 1200 mJ/cm2 erreicht. In einem zweiten Strukturierungsschritt werden dann über eine zweite Maske in einzelnen Bereichen innerhalb der Kanäle des ersten Strukturierungsschrittes durch zusätzliche La- ser-Belichtung mit etwa 90 - 150 Pulsen (20 ns) der restliche Lack entfernt, und so das Substrat freigelegt und aufgeschmolzen. Diese freigelegten Substratstellen werden nun wie oben beschrieben mit Nukleinsäure-Oligomeren benetzt.
Auf einem oben beschriebenen Substrat können mehrere jeweils über einen der Kanäle im Lötstopplack verbundene Benetzungsgebiete gezielt mit einem Analyten, wie z.B. Flüssigkeiten die potentiell komplementäre Nukleinsäure- Oligomere enthalten in Kontakt gebracht werden, und somit die für eine Analyse benötigte Analytflüssigkeit deutlich reduziert werden.
Eine Kanalstruktur, die z.B. pro Kanal jeweils nur einen Teil der freigelegten Substratstellen verbindet ist eine Anordnung von n linearen Kanälen, die jeweils alle m Benetzungsgebiete einer Spalte einer gleichmäßigen Spot-Matrix der Dimension n x m enthalten, wobei zweckmäßig 10 ≤ n, m ≤ 1000 ist. Eine andere Kanalstruktur, die alle freigelegten Substratstellen miteinander verbindet ist ein einzelner Kanal, der mäanderförmig alle freigelegten Substratstellen der gleichmäßigen Benetzungsgebiete-Matrix der Dimension n x m verbindet, wobei zweckmäßig 10 < n, m ≤ 1000 ist.

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zum Benetzen eines Substrats mit einer Flüssigkeit, mit den Verfahrensschritten
a) Bereitstellen eines Substrats mit einer zu benetzenden Oberfläche;
b) Bereitstellen einer Benetzungsflüssigkeit;
c) Aufbringen einer Schutzschicht auf das Substrat, die die zu benetzende Oberfläche von der Umgebung trennt;
d) Strukturieren der. Schutzschicht, um vorbestimmte Benetzungsgebiete auf der zu benetzenden Oberfläche des Substrats freizulegen; und
e) Aufbringen der Benetzungsflüssigkeit auf die freigelegten Benetzungsgebiete mittels einer Benetzungsvorrichtung ohne direkten Kontakt zwischen der Benetzungsvorrichtung und der zu benetzenden Oberfläche des Substrats.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass als Substrat ein Festköper aus Kunststoff, Metall, Halbleiter, Glas, Verbundstoff, porösem Material oder aus einer Kombination dieser Materialien bereitgestellt wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass als Substrat ein Festköper bereitgestellt wird, dessen zu benetzende Oberfläche durch eine Siliziumschicht, eine Platinschicht, eine Goldschicht, durch eine oxidische Oberfläche oder ein Glas gebildet ist.
4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass als Substrat eine makroskopische Festkörperscheibe, ein Mikro- oder Na- nopartikel bereitgestellt wird.
5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass als Benetzungsflüssigkeit ein rein flüssiger Stoff, eine Lösung organischer und/oder anorganischer Stoffe, eine Emulsion, eine Suspension oder eine kolloidale Lösung bereitgestellt wird.
6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Material der Schutzschicht so auf das Substratmaterial abgestimmt wird, dass das Schutzschichtmaterial auf der zu benetzenden Substrat- Oberfläche physisorbiert, chemisorbiert oder kovalent, koordinativ oder über Komplexbildung gebunden wird.
7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass als Schutzschicht ein positiver oder negativer Photolack auf das Substrat aufgebracht, bevorzugt aufgesprüht oder aufgeschleudert wird.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass als Schutzschicht ein Lötstopplack auf das Substrat aufgebracht wird, bevorzugt, dass der Lötstopplack durch Siebdruck, Vorhanggießen oder ein Sprayverfahren aufgebracht wird.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass als Schutzschicht ein organisches Polymer, insbesondere aus Cellulose, Dextran oder Collagen auf das Substrat aufgebracht wird, bevorzugt, dass das organische Polymer aufgeschleudert oder durch Physisorption aufgebracht wird.
10.Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass als Schutzschicht eine selbstassemblierte Monolage aus organischen Molekülen aufgebracht wird.
11.Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass die selbstassemblierte Monolage aufgebracht wird, indem die organischen Moleküle in einem wässrigen oder organischen Lösungsmittel gelöst werden und die Lösung in Kontakt mit dem Substrat gebracht wird.
12.Verfahren nach Anspruch 10 oder 11 , dadurch gekennzeichnet, dass
- als Substrat ein Festköper bereitgestellt wird, dessen zu benetzende Oberfläche durch eine Goldschicht gebildet ist, und dass
- als Schutzschicht eine selbstassemblierte Monolage aus Thiolen, insbe- sondere der allgemeinen Struktur HS-Spacer-R oder [S-Spacer-R]2 aufgebracht wird, wobei R eine beliebige Kopfgruppe ist und der Spacer eine Kettenlänge von 1 - 20, insbesondere 1 -14 hat.
13.Verfahren nach Anspruch 10 oder 11 , dadurch gekennzeichnet, dass
- als Substrat ein Festköper bereitgestellt wird, dessen zu benetzende Oberfläche durch eine Silizium- oder Platinschicht gebildet ist, und dass - als Schutzschicht eine selbstassemblierte Monolage aus Aminen, insbesondere der allgemeinen Struktur H2N-Spacer-R aufgebracht wird, wobei R eine beliebige Kopfgruppe ist und der Spacer eine Kettenlänge von 1 - 20, insbesondere 1 -14 hat.
14.Verfahren nach Anspruch 10 oder 11 , dadurch gekennzeichnet, dass
- als Substrat ein Festköper bereitgestellt wird, dessen zu benetzende Oberfläche durch eine oxidische Oberfläche oder ein Glas gebildet ist, und dass
- als Schutzschicht eine selbstassemblierte Monolage aus Silanen, insbesondere der allgemeinen Struktur X3-Si-Spacer-R aufgebracht wird, wobei R eine beliebige Kopfgruppe und X = H, CI oder OCH3 ist und der Spacer eine Kettenlänge von 1 - 20, insbesondere 1 -14 hat.
15. Verfahren nach einem der Ansprüche 12 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass R = CH3, OH, CO2H, NH2, NH3 + oder SO3 " ist.
16. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Schutzschicht in Schritt c) in Form einer geschlossenen Schicht auf die zu benetzenden Substratoberfläche aufgebracht wird.
17. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Schutzschicht vollflächig auf die zu benetzende Oberfläche des Substrats aufgebracht wird.
Iδ.Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Schutzschicht mittels Laserablation, insbesondere durch Bestrahlung von Teilbereichen der Schutzschicht mit kontinuierlicher oder gepulster Laserstrahlung einer vorbestimmten Wellenlänge strukturiert wird.
19. Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass die Schutzschicht direkt, über eine Optik oder über eine Maske mit der Laserstrahlung beaufschlagt wird, um die Benetzungsgebiete freizulegen.
20.Verfahren nach Anspruch 18 oder 19, dadurch gekennzeichnet, dass durch die Laserstrahlung die zu benetzende Oberfläche des Substrats im Bereich der Benetzungsgebiete aufgeschmolzen wird.
21.Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Schutzschicht im Bereich der Benetzungsgebiete rückstandslos entfernt wird.
22.Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Benetzungsgebiete mit einer charakteristischen Ausdehnung von etwa 5 μm bis etwa 200 μm, bevorzugt von etwa 10 μm bis etwa 100 μm erzeugt werden.
23.Verfahren nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, dass die Benetzungsgebiete in einem lateralen Abstand von etwa 20 μm bis etwa 500 μm, bevorzugt von etwa 50 μm bis etwa 200 μm erzeugt werden.
24.Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Benetzungsgebiete mit im Wesentlichen rechteckigem, elliptischem oder kreisförmigem Umriss erzeugt werden.
25.Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass bei dem Schritt des Strukturierens der Schutzschicht Zuleitungskanäle in die Schutzschicht eingebracht werden, um die Zuführung einer Analytflüs- sigkeit zu den freigelegten Benetzungsgebieten zu ermöglichen.
26. Verfahren nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, dass die Zuleitungskanäle mit einer Tiefe von 10% bis 99%, bevorzugt von 20% bis 95%, besonders bevorzugt von 50% bis 95% der Dicke der Schutzschicht in die Schutzschicht eingebracht werden.
27.Verfahren nach Anspruch 25 oder 26, dadurch gekennzeichnet, dass die freigelegten Benetzungsgebiete innerhalb der Zuleitungskanäle angeordnet sind.
28.Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Benetzungsvorrichtung eine einzelne Nadel, Kapillare, Pinzette, einen einzelnen Ring oder Stempel umfasst.
29.Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Benetzungsvorrichtung eine Anordnung mehrerer Nadeln, Kapillaren, Pinzetten, Ringen, Stempeln, oder eine Anordnung verschiedener dieser Elemente umfasst.
30.Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Benetzungsvorrichtung eine flüssigkeitsabgebende Endfläche aufweist, deren laterale Ausdehnung in zumindest einer Raumrichtung größer ist, als die laterale Ausdehnung der Benetzungsgebiete in dieser Raumrichtung.
31. Verfahren nach Anspruch 30, dadurch gekennzeichnet, dass die Endfläche der Benetzungsvorrichtung in beiden Raumrichtungen eine größere laterale Ausdehnung aufweist als die Benetzungsgebiete.
32.Verfahren nach Anspruch 30 oder 31 , dadurch gekennzeichnet, dass zum Aufbringen der Benetzungsflüssigkeit die Endfläche der Benetzungs- Vorrichtung an einem Benetzungsgebiet in Kontakt mit der an das Benet- zungsgebiet angrenzenden Schutzschicht gebracht wird.
33.Verfahren nach einem der.Ansprüche 30 bis 32, dadurch gekennzeichnet, dass zum Aufbringen der Benetzungsflüssigkeit die Endfläche der Benetzungsvorrichtung vollständig über das Benetzungsgebiet und von oben in Kontakt mit der Oberfläche der an das Benetzungsgebiet angrenzenden Schutzschicht gebracht wird.
34.Verfahren nach einem Ansprüche 30 bis 33, dadurch gekennzeichnet, dass die Endfläche der Benetzungsvorrichtung mit einer Genauigkeit (Δx, Δy) lateral über einer strukturierten Schutzschicht positionierbar ist, und die Benetzungsgebiete mit einer charakteristischen lateralen Ausdehnung (XspotiYspot) erzeugt werden, die um zumindest die Positioniergenauigkeit
(Δx, Δy) kleiner ist, als die laterale Ausdehnung (xtiP,yti ) der Endfläche der Benetzungsvorrichtung. .
35.Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass als Benetzungsflüssigkeit modifizierte Nukleinsäure-Oligomere in wässriger Lösung aufgebracht werden, wobei die Nukleinsäure-Oligomere mit einer oder mehreren reaktiven Gruppen modifiziert sind und zumindest eine reaktive Gruppe für eine direkte Reaktion mit der zu benetzenden Oberfläche des Substrats ausgelegt ist.
36.Verfahren nach Anspruch 35, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure-Oligomere mit einem Fluorophor modifiziert sind.
37.Verfahren nach Anspruch 35 oder 36, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure-Oligomere in wässriger Lösung mit einem Detergenz aufgebracht werden.
38.Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens nach einem der vorherge- henden Ansprüche.
39.Vorrichtung nach Anspruch 38, mit einer Benetzungsvorrichtung, deren Endfläche mit einer Positioniergenauigkeit von weniger als 50 μm, bevorzugt von weniger als 10 μm lateral über einer strukturierten Schutzschicht positionierbar ist.
40.Flüssigkeitsbenetztes Substrat, herstellbar nach einem der Ansprüche 1 bis 37.
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