WO2004082583A2 - Utilisation d’oligogalacturonides en cosmetique ou pour la preparation d’une composition dermatologique ou pharmaceutique - Google Patents

Utilisation d’oligogalacturonides en cosmetique ou pour la preparation d’une composition dermatologique ou pharmaceutique Download PDF

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WO2004082583A2
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cells
skin
endothelial cells
expression
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Christian Lubrano
Gaëlle Saintigny
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Laboratoires De Biologie Vegetale Yves Rocher
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    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]

Definitions

  • the present invention relates to the use of a mixture of oligogalacturonides in cosmetics or for the preparation of a dermatological composition as agents for limiting the spread of the inflammatory response, in particular for sensitive skin.
  • Oligogalacturonides can be obtained by hydrolysis of pectin.
  • Pectin consists of a main chain called pectic acid, consisting of a chain of sugars of the galacturonic acid type.
  • the constituent sugars can be methylated or esterified, the proportion of processed sugars being characteristic of a given plant species.
  • the main chain is sometimes interrupted by the insertion of a side chain of neutral sugars such as rhamnose or glucose.
  • galacturonic acid monomer entity resulting from the hydrolysis of pectin or, an oligomer composed of galacturonic acid residues linked by 1-4 bonds.
  • the number of galacturonic acid residues is from 2 to 20, and preferably from 2 to 5.
  • the skin and in particular its outermost compartment, the epidermis, are permanently subjected to various stimuli and aggressions (metal pollution, ultra-violet radiation, temperature variation, mechanical stress, penetration of exogenous agents, wounds ...) . These stresses normally trigger an inflammatory response but which, in the case of sensitive skin, can be exacerbated.
  • the phenomenon of inflammation is a complex response to one or more stresses: indeed, many mechanisms are involved in the phenomenon of inflammation.
  • the different cell types of the skin will trigger the production and secretion of "message” or cyto ines molecules.
  • cytokines will act on different cells (including their emitters) to regulate their cellular activity, induce protein synthesis pathways for stress, repair or apoptosis. Their very presence will be detected, relayed and amplified by other effector cells.
  • the propagation of the inflammation signal will thus take place from cells to cells and then from tissue to tissue until triggering the recruitment of immunocompetent cells (leukocytes, etc.) present in the blood circulatory network.
  • chemotaxis By chemotaxis, they will be attracted to the area (dermal) of the inflammation.
  • the leukocytes then in close contact with the endothelial cells thanks to adhesion molecules like ICAM 1, cross the vascular wall and migrate in the dermis towards the place of inflammation more on the surface. This visually results in increased (tactile) sensitivity, redness and heat generation.
  • the inflammation process therefore involves many cellular and tissue mechanisms, including the adhesion of leukocytes to endothelial cells.
  • the Applicant has chosen to focus on a particular mechanism from among all of the mechanisms involved in the phenomenon of inflammation. Thus, the Applicant has chosen to focus more specifically on endothelial cells and this adhesion phenomenon involving them.
  • the cutaneous dermis is a richly vascular connective tissue.
  • the deep dermis contains a network of micro blood vessels whose role is, among other things, to supply the skin with nutrients.
  • the wall of these blood vessels consists of a chain of endothelial cells, polarized cells which form the endothelium or vascular wall, border between the lumen of the vessel and the connective matrix that is the dermis.
  • oligogalacturonides One of the important elements of the inflammation process is in particular the recognition of these cells of inflammation by the endothelial cell via these adhesion molecules which will trigger diapedesis and can trigger an amplification of the inflammatory phenomenon.
  • the inventors therefore sought to examine whether the oligogalacturonides had an action on inflammation, and in particular on the inflammations to which sensitive skin is regularly subject, and they then highlighted the mechanism of action of oligogalacturonides on the phenomenon of 1 inflammation.
  • oligogalacturonides have an action on cells of inflammation and prevent or limit the recognition of circulating cells like lymphocytes by endothelial cells.
  • the present invention therefore relates to the use of oligogalacturonides. as an agent limiting the spread of the inflammatory response, for the preparation of a cosmetic, dermatological or pharmaceutical composition.
  • Oligogalacturonides act to decrease the expression of cellular adhesion factors on endothelial cells of the dermis. They limit recognition by endothelial cells, circulating cells responsible for the spread of inflammation, and limit diapedesis.
  • the oligogalacturonides are used for the preparation of a cosmetic, dermatological or pharmaceutical composition useful for preventing or treating inflammations more particularly of the skin. These inflammations result from the spread of the inflammatory response in the skin.
  • the oligogalacturonides are used for the preparation of a cosmetic, dermatological or pharmaceutical composition making it possible to reduce the expression of cellular adhesion factors on the endothelial cells of the dermis, so as to decrease the spread of the inflammatory response in the skin.
  • the oligogalacturonides are used to limit the recognition, by endothelial cells, of the circulating cells responsible for the propagation of the inflammation, so as to decrease the propagation of the inflammatory response at the level skin.
  • oligogalacturonides are used to limit diapedesis so as to reduce the spread of the inflammatory response in the skin.
  • the invention therefore also relates to the use of oligogalacturonides for the preparation of a dermatological composition intended to treat dermatological inflammations.
  • the invention also relates to the use of oligogalacturonides for the preparation of a cosmetic composition particularly intended for sensitive skin.
  • the composition containing the oligogalacturonides is applied topically.
  • the composition according to the invention is in the form of an emulsion allowing the penetration of the oligogalacturonides into the dermis.
  • such a composition comprises, in dry weight equivalent relative to the total weight of the composition, from 0.01 to 5%, preferably 0.5% of oligogalacturonides.
  • the subject of the invention is also a method of cosmetic care of sensitive skin limiting the spread of the inflammatory response, characterized in that it comprises the application to the skin of an adequate amount of oligogalacturonides.
  • the invention also relates to a cosmetic care method for sensitive skin limiting the spread of the inflammatory response in the skin, characterized in that it makes it possible to reduce the expression of cellular adhesion factors on endothelial cells. dermis by applying to the skin an adequate amount of oligogalacturonides.
  • the oligogalacturonides are obtained by enzymatic hydrolysis of a pectin.
  • the pectin used is of high quality, and preferably has not been standardized according to the manufacturing methods.
  • food namely in particular treated by the addition of sugars allowing a homogenization of the viscosities between the batches.
  • the degree of methylation and esterification of this pectin is low in order to be as close as possible to polygalacturonic acid.
  • the hydrolysis is carried out by an enzymatic cocktail comprising pectinases having mainly polygalacturonase, methylesterase, and polygalacturonase lyase activities.
  • the enzymes used to hydrolyze pectin are preferably industrial type enzymes frequently used in the fruit juice manufacturing industry.
  • These cocktails are designed to cut membrane pectins and thus allow better extraction of fruit juices by weakening the structures before pressing. They also make it possible to clarify the juices in which a disorder is not desirable (often linked to pectins).
  • the oligogalacturonides have a degree of polymerization of between 1 and
  • the oligogalacturonides are obtained by the process comprising the following stages: the hydrolysis of a pectin solution of concentration between 0.1 to 10% and preferably 1%, and of pH of the of the order of 4.5, by adding to said pectin solution an enzyme solution comprising from 10 to 1000 and preferably 100 polygalacturonase units, to obtain in the final solution from 1 to 10 and preferably 4 pectinase units,
  • the oligogalacturonides used in accordance with the invention are obtained by the process which follows: 0.1 to 10% of pectin and preferably 1% of pectin of HERBSTREITH type are dissolved and FOX Classic AU 910 from apple (pectin type HB AU). The pH is adjusted to 4.5 preferably with a solution of acetic acid. An enzyme solution corresponding to 10 to 1000, and preferably 100, polygalacturonase units is prepared. For example, an enzyme solution from the company is used
  • the enzyme solution is added to the pectin solution in order to finally obtain 1 to 10 pectinase units.
  • the hydrolysis is carried out at 50 ° C for 2 hours, then stopped by heating at 70 ° C for 1 hour or at 100 ° C for 5 minutes.
  • the high molecular weight polymers are precipitated by adding 1N HCl and then removed by centrifugation, preferably at 5000 g for 30 min, or by filtration.
  • the pH of the supernatant is readjusted in the end to a value between 6 and 8.
  • the oligogalacturonides formed are analyzed by HPLC, according to a technique perfected by the inventors, and which makes it possible to obtain the chromatographic profile of the oligogalacturonides formed.
  • Evaporative light scattering detector (DEDL; ALTECH).
  • Nitrogen flow 4.0SLPM (standard liter per min) (standard conditions for H20 as solvent). Choice of gradient
  • a distribution of the oligomers of size (degree of polymerization) from 1 to 5 is observed.
  • the absence of a standard does not make it possible to assay the oligomers of degree of polymerization of 4 and 5 but it is possible to assay the shortest oligomers. If one proceeds under the conditions described to the hydrolysis of a pectin solution of concentration 10 g / 1; the total concentration of mono, di and trigalacturonic acid is approximately 4.5 g / 1 in the end; therefore approximately 45% by weight of the pectin dissolved.
  • the oligogalacturonides formed are advantageously atomized or freeze-dried in the end in order to allow better preservation and easier handling.
  • Figure 1 shows unstimulated HMVEC endothelial cells
  • Figure 1A shows the cytoskeleton
  • Figure 1B is a section through several cells, allowing in particular to visualize the surface of the cell;
  • FIG. 2 shows HMVEC endothelial cells stimulated by TNF (lng / ml), Figure 2A shows the cytoskeleton, and Figure 2B is a section of several cells;
  • Figure 3 shows HMVEC endothelial cells stimulated by H2O2 (100 ⁇ M), Figure 3A shows the cytoskeleton, and Figure 3B is a section of several cells;
  • Figure 4 is a photo of the cytoskeleton of HMVEC endothelial cells treated with oligogalacturonides (0.001 mg / ml), Figure 4A shows the cytoskeleton, and Figure 4B is a section of several cells;
  • FIG. 5 is a photo of the cytoskeleton of HMVEC endothelial cells treated with oligogalacturonides (0, 10 mg / ml) and stimulated with TNF
  • FIG. 5A shows the cytoskeleton
  • FIG. 5B is a section of several cells
  • FIG. 6 is a photo of the cytoskeleton of HMVEC endothelial cells treated with oligogalacturonides (0, 10 mg / ml) and stimulated with H202
  • FIG. 6A shows the cytoskeleton
  • FIG. 6B is a section of several cells
  • FIG. 7A is a comparative histogram concerning the adhesion of the lymphocytes to the endothelial cells HskMEC.ST with and without the condition of oxidative stress, in the presence and in the absence of oligogalacturonides
  • FIG. 7B is a comparative histogram concerning the adhesion of the lymphocytes to the endothelial cells HskMEC.l with and without the oxidative stress condition, in the presence and in the absence of oligogalacturonides
  • - Figure 8 is a comparative histogram concerning the adhesion of lymphocytes to HskMEC.ST endothelial cells in flow condition with and without oxidative stress condition, in the presence and absence of oligogalacturonides.
  • Figure 1B shows the cell in a normal state
  • Figure 1A shows a basic network of actin fibers, proteins that make up the cytoskeleton.
  • endothelial cells will develop these fibers which will appear more numerous, denser, longer with increased organization.
  • FIG. 2 and 3 the presence of ICAM-1, a recognition marker on the surface of endothelial cells is shown in Figures 2A and 2B, Figures 2A and 3A represent the cytoskeleton of endothelial cells (actin stress fibers ). It can be noted that when the cells are stressed either by TNF (FIG. 2) or by H 2 0 2 (FIG. 3), the expression of the stress fibers and of ICAM-1 on the surface of the cells is markedly accentuated. , compared to the unstimulated cells of FIG. 1.
  • FIG. 4 shows HMVEC cells which were cultured on glass slides in culture wells then treated with the oligogalacturonides at 0.001 mg / ml for 5 hours at 37 ° C. The culture supernatants were then eliminated, the cells were washed with PBS (without Ca2 +, without Mg2 +), then treated with oligogalacturonides with or without TNF'r (lng / ml). The cells are incubated at 37 ° C.
  • FIG. 5B The coverslips are then included in glycerol on slides, then observed under optical or confocal microscopy.
  • the cytoskeleton and the expression of the ICAM-1 adhesion molecules are observed.
  • FIG. 5A represents the cytoskeleton of endothelial cells (actin stress fibers).
  • the photos of Figures 6A and 6B were taken after following the following protocol:
  • the cells HMVEC are cultivated on glass slides in culture wells then treated with oligogalacturonides at 0.001 mg / ml for 5 hours at 37 ° C.
  • the culture supernatants are then eliminated, the cells are washed with PBS (without Ca2 +, without Mg2 +), then treated with oligogalacturonides or with or without H 2 0 2 (100 ⁇ m).
  • the cells are incubated at 37 ° C for 1 hour.
  • the H 2 0 2 wells are washed with PBS (without Ca2 +, without Mg2 +), then these wells are treated with 1 ml / well of oligogalacturonides at 0, 10 mg / ml.
  • the incubation is carried out for 15 hours at 37 ° C.
  • the wells are washed twice with PBS, the cells are fixed with 3% para-formaldehyde.
  • the non-specific binding sites of the antibodies are then saturated with 50 mM ammonium chloride, then the cells are permeabilized by 0.01% saponin.
  • the coverslips with the fixed cells are then brought into contact with the primary antibody: anti ICAM-1 coupled FITC (Diaclone) and rhodamine (Sigma, P1951 Phalloidin TRITC labeled), for 1 hour 30 minutes then washed twice with PBS.
  • the coverslips are then included in glycerol on slides, then observed under optical or confocal microscopy.
  • FIG. 6B The presence of ICAM-1, a recognition marker on the surface of endothelial cells is represented in FIG. 6B, FIG. 6A represents the cytoskeleton of endothelial cells (actin stress fibers).
  • ICAM-1 an adhesion molecule induced on the surface of endothelial cells under the action of cytokines is reduced under the action of oligogalacturonides. Because of this decrease, the recruitment of circulating cells will be less effective. Oligogalacturonides are therefore inhibitors of the recognition of inflammation cells by endothelial cells. The factors triggering the inflammatory reaction are mimicked in vitro by an oxidative stress represented by TNF't "or H 2 0 2. The effect of oligogalacturonides is evaluated under stress conditions (stimulation by TNF or H 2 0 2 ) or no.
  • the 2 cell types (circulating cells and endothelial cells) are brought into contact and the relative adhesion between these 2 cell types is looked at in the absence and in the presence of oligogalacturonides. The effect is evaluated under stress conditions (stimulation by ⁇ 2 0 2 ) or not.
  • Figures 7A and 7B demonstrate adhesion of circulating cells: Quantitative and rheological adhesion studies (in vi tro) are carried out on organospecific endothelial cells primary and immortalized in a cellular senescence model.
  • HSkMEC.l and HSkMEC.ST cells endothelial skin cells, represent two types of immortalization.
  • the cells are cultured in OptiMEM (Gibco BRL, Life Technologies SARL, Cergy Pontoise, France) supplemented with SBF (5%, v / v, Dutscher, Brumath, France) and antibiotics.
  • the passage of the cells is done by treatment with 0.25% trypsin (Gibco BRL), 0.05% EDTA (/ v) in solution in phosphate buffer (PBS).
  • the cells are detached from the culture flasks by type 1 collagenase (1 mg / ml) / BSA (10 mg / ml).
  • Endothelial cells labeled with the fluorochrome PKH-26 GL (Horan and Slezak, 1989) (Sigma) are cultured 24 hours before in 24 well linbro (Falcon) (0.75 ⁇ 10 5 cells in 400 ⁇ l).
  • CEMT4 or HL-60 cells, marked by the FTC are incubated with endothelial cells in a ratio of 5 cells per endothelial cells for 30 minutes at room temperature.
  • the oligogalacturonides (100 ⁇ g / ml) are added during the post incubation of H 2 0 2 (100 ⁇ mol) (1 hour then 16 hours).
  • the results are expressed as a relative adhesion index (RAI) (Butcher et al., 1980), directly linked to the positive or negative effect of a molecule compared to the conditions of the control.
  • RAI relative adhesion index
  • the labeled cells are analyzed by flow cytometry using a FACS 440, or a FACSort (Becton Dickinson, Sunnyvale, CA, USA)
  • Oligogalacturonides cause a decrease in adhesion before and after activation with H 2 0 2 , without we can establish a difference between these two cell types, which is why it is important to place our in flow conditions.
  • Figure 8 shows the results after using flow cytometry. This technique simulates shear forces in vitro.
  • An infusion chamber connected by a hose system to a pump draws a buffer sample from a reservoir.
  • a coverslip covered by a monolayer of endothelial cells is mounted in the central opening of the perfusion chamber perpendicular to the flow.
  • the desired shear force is obtained by regulating the blood flow according to the diameter of the channel of the infusion chamber.
  • the flow is stopped and the slide taken out of the chamber. The slide is then washed, fixed, stained and ready to be evaluated by an image analysis system.
  • the cells in suspension pass for 3 minutes then the flow is stopped and the medium alone is passed under the same conditions, with or without modulating molecules (10 minutes, 100 ⁇ l / min), medium alone (10 minutes, lml / min).
  • the labeled cells are analyzed by flow cytometry using a FACS 440, or a FACSort (Becton Dickinson, Sunnyvale, CA, USA) and quantified according to Paprocka et al. (2002). Five thousand events, selected in structure size, are recorded and analyzed by PC Lysis ® or CellQuest ® software (Becton Dickinson). The mean fluorescence of the controls, placed at a value less than 10, is used as a threshold for estimating the positive cells. The histograms presented are a representative of five separate experiments.
  • the results differ from the results obtained under static adhesion conditions.
  • HSkMEC.l cells which represent two types of immortalization
  • HSkMEC.ST cells which represent two types of immortalization
  • Oligogalacturonides therefore have the effect on the one hand of decreasing the expression of actin fibers, and on the other hand of decreasing the expression of adhesion molecules. They therefore exert an anti-stress and cytoprotective effect.

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Abstract

Utilisation d'oligogalacturonides pour la préparation d'une composition cosmétique, dermatologique ou pharmaceutique utile pour prévenir ou traiter les inflammations plus particulièrement de la peau et méthode de soin cosmétique des peaux sensibles limitant la propagation de la réponse inflammatoire, caractérisée en ce qu'elle comprend l'application sur la peau d'une quantité adéquate d'oligogalacturonides.

Description

UTILISATION D ' OLIGOGALACTURONIDES EN COSMETIQUE OU POUR LA PREPARATION D'UNE COMPOSITION DERMATOLOGIQUE OU PHARMACEUTIQUE
La présente invention concerne l'utilisation d'un mélange d' oligogalacturonides en cosmétique ou pour la préparation d'une composition dermatologique comme agents de limitation de la propagation de la réponse inflammatoire, notamment pour les peaux sensibles. Des oligogalacturonides peuvent être obtenus par hydrolyse de la pectine. La pectine est constituée d'une chaîne principale appelée acide pectique, constituée d'un enchaînement de sucres du type acide galacturonique . Les sucres constitutifs peuvent être méthylés ou estérifiés, la proportion des sucres transformés étant caractéristique d'une espèce végétale donnée. La chaîne principale est parfois interrompue par l'insertion d'une chaîne latérale de sucres neutre type rhamnose ou glucose .
Par hydrolyse de la pectine, il est possible d'obtenir un mélange d ' oligogalacturonides de taille définie et de degré de polymérisation connu, selon les conditions de la réaction.
L'abrégé du brevet japonais JP 09 048732 publié dans le patent abstracts of Japan vol 1997 n°6 décrit les oligogalacturonides comme piège à radicaux libres et préconise leur utilisation en cosmétique dans une application anti-âge.
La demande de brevet internationale O002/42484 décrit un procédé de fabrication de produits d'hydrolyse de pectine destine à empêcher l'adhésion de germes pathogènes sur des cellules eucaryotes ou des interactions cellules-cellules . L'article intitulé « modified citrus pectin », Journal of the national cancer institute, vol 87,n°5,1995 décrit l'utilisation de fragments de pectine de poids moléculaires élevés en tant qu' anticancereux. Dans le cadre des travaux qui ont conduit à la présente invention, la Demanderesse a mis en évidence l'action des oligogalacturonides sur les phénomènes inflammatoires et sur la propagation de l'inflammation, notamment au niveau du derme . Dans la présente demande, on entend par oligogalacturonide :
- l'entité monomère acide galacturonique issue de l'hydrolyse de la pectine ou, un oligomère composé de résidus d'acide galacturonique liés par des liaisons 1-4. Le nombre de résidus d'acide galacturonique est de 2 à 20, et de préférence de 2 à 5.
La peau et particulièrement son compartiment le plus externe, l'epiderme, sont soumis en permanence à différents stimuli et agressions (pollution métallique, radiations ultra-violettes, variation de température, sollicitations mécaniques, pénétration d'agents exogènes, plaies...) . Ces stress déclenchent de façon normale une réponse inflammatoire mais qui, dans les cas des peaux sensibles, peut être exacerbée.
Le phénomène d'inflammation est une réponse complexe à un ou plusieurs stress : en effet, de nombreux mécanismes sont impliqués dans le phénomène de 1' inflammation. En cas d'agressions, les différents types cellulaires de la peau vont déclencher la production et la sécrétion de molécules "message" ou cyto ines . Ces cytokines vont agir sur différentes cellules (y compris leurs émettrices) pour réguler leur activité cellulaire, induire des voies de synthèse de protéines de stress, de réparation ou d'apoptose. Leur présence même va être détectée, relayée et amplifiée par d'autres cellules effectrices . La propagation du signal de l'inflammation va ainsi se faire de cellules en cellules puis de tissus en tissus jusqu'à déclencher le recrutement des cellules immunocompétentes (leucocytes...) présentes dans le réseau circulatoire sanguin. Par chimiotactisme, elles vont être attirées au niveau de la zone (dermique) de l'inflammation. Les leucocytes, alors en contact étroit avec les cellules endothéliales grâce à des molécules d'adhésion comme ICAM 1, traversent la paroi vasculaire et migrent dans le derme vers le lieu de l'inflammation plus en surface. Ceci se traduit visuellement par une sensibilité (tactile) accrue, une rougeur et un dégagement de chaleur.
Le processus de l'inflammation met donc en jeu de nombreux mécanismes cellulaires et tissulaires, parmi lesquels l'adhésion des leucocytes aux cellules endothéliales. La Demanderesse a choisi de s'intéresser à un mécanisme particulier parmi l'ensemble des mécanismes entrant en jeu dans le phénomène de l'inflammation. Ainsi, la Demanderesse a choisi de s'intéresser plus particulièrement aux cellules endothéliales et à ce phénomène d'adhésion les impliquant.
Le derme cutané est un tissu conjonctif richement vascularisé. En effet, le derme profond contient un réseau de micro vaisseaux sanguins dont le rôle est entre autres d'alimenter la peau en substances nutritives. La paroi de ces vaisseaux sanguins est constituée d'un enchaînement de cellules endothéliales, cellules polarisées qui forment 1 ' endothélium ou paroi vasculaire, frontière entre la lumière du vaisseau et la matrice conjonctive qu'est le derme. Les cytokines libérées en cas d'agression, de quelque nature qu'elle soit, provoquent l'expression de molécules d'adhésion qui vont permettre la reconnaissance et le recrutement, sur les cellules endothéliales, de cellules sanguines, ci -après dénommées « cellules de l'inflammation » et notamment de leucocytes activés. Il se produit alors une extravasion de ces cellules sanguines entre les cellules endothéliales, à travers la paroi vasculaire. Ces cellules de l'inflammation après avoir traversé la paroi endothéliale (diapédèse) migrent et remontent vers la surface de l'epiderme au site de l'inflammation en induisant des réactions en cascade qui s ' amplifient .
Un des éléments importants du processus d'inflammation est notamment la reconnaissance de ces cellules de l'inflammation par la cellule endothéliale via ces molécules d'adhésion qui va déclencher la diapédèse et peut déclencher une amplification du phénomène inflammatoire . Les Inventeurs ont donc cherché à examiner si les oligogalacturonides avaient une action sur l'inflammation, et notamment sur les inflammations auxquelles sont régulièrement sujettes les peaux sensibles, et ils ont alors mis en évidence le mécanisme d'action des oligogalacturonides sur le phénomène de 1' inflammation.
Les Inventeurs ont en effet constaté que les oligogalacturonides avaient une action sur les cellules de l'inflammation et empêchaient ou limitaient la reconnaissance de cellules circulantes comme des lymphocytes par des cellules endothéliales.
La présente invention a donc pour objet l'utilisation d' oligogalacturonides. en tant qu'agent limitant la propagation de la réponse inflammatoire, pour la préparation d'une composition cosmétique, dermatologique ou pharmaceutique. Les oligogalacturonides ont pour action de diminuer l'expression des facteurs d'adhésion cellulaires sur les cellules endothéliales du derme. Ils limitent la reconnaissance par des cellules endothéliales, des cellules circulantes responsables de la propagation de l'inflammation, et limitent la diapédèse.
Conformément à l'invention, les oligogalacturonides sont utilisés pour la préparation d'une composition cosmétique, dermatologique ou pharmaceutique utile pour prévenir ou traiter les inflammations plus particulièrement de la peau. Ces inflammations résultent de la propagation de la réponse inflammatoire au niveau de la peau. Suivant un mode de réalisation particulier de l'invention, les oligogalacturonides sont utilisés pour la préparation d'une composition cosmétique, dermatologique ou pharmaceutique permettant de diminuer l'expression des facteurs d'adhésion cellulaires sur les cellules endothéliales du derme, de façon à diminuer la propagation de la réponse inflammatoire au niveau de la peau.
Suivant un autre mode de réalisation particulier de l'invention, les oligogalacturonides sont utilisés pour limiter la reconnaissance, par les cellules endothéliales, des cellules circulantes responsables de la propagation de l'inflammation, de façon à diminuer la propagation de la réponse inflammatoire au niveau de la peau.
Suivant un autre mode de réalisation de l'invention, les oligogalacturonides sont utilisés pour limiter la diapédèse de façon à diminuer la propagation de la réponse inflammatoire au niveau de la peau.
L'invention a donc également pour objet l'utilisation des oligogalacturonides pour la préparation d'une composition dermatologique destinée à traiter les inflammations dermatologiques.
L'invention a également pour objet l'utilisation des oligogalacturonides pour la préparation d'une composition cosmétique particulièrement destinée aux peaux sensibles .
Avantageusement, qu'elle soit à visée dermatologique ou à visée cosmétique, la composition contenant les oligogalacturonides est appliquée topiquement. De préférence, la composition selon l'invention est sous forme d'une émulsion permettant la pénétration des oligogalacturonides dans le derme.
De préférence, une telle composition comprend, en équivalent poids sec par rapport au poids total de la composition, de 0,01 à 5 %, de préférence 0,5 % d' oligogalacturonides .
L'invention a encore pour objet une méthode de soin cosmétique des peaux sensibles limitant la propagation de la réponse inflammatoire, caractérisée en ce qu'elle comprend l'application sur la peau d'une quantité adéquate oligogalacturonides.
L'invention a également pour objet une méthode de soin cosmétique des peaux sensibles limitant la propagation de la réponse inflammatoire au niveau de la peau, caractérisée en ce qu'elle permet de diminuer l'expression des facteurs d'adhésion cellulaires sur les cellules endothéliales du derme par application sur la peau d'une quantité adéquate d' oligogalacturonides .
Suivant un mode de réalisation préféré de l'invention, les oligogalacturonides sont obtenus par hydrolyse enzymatique d'une pectine. La pectine utilisée est de haute qualité, et de préférence n'a pas été standardisée suivant les modes de fabrication alimentaires, à savoir notamment traitée par l'addition de sucres permettant une homogénéisation des viscosités entre les lots. Avantageusement, le degré de méthylation et d' estérification de cette pectine est faible afin d'être le plus proche possible de l'acide polygalacturonique .
Avantageusement, l'hydrolyse est réalisée par un cocktail enzymatique comprenant des pectinases ayant principalement des activités polygalacturonase , méthylestérase, et polygalacturonase lyase. De préférence, les enzymes utilisées pour hydrolyser la pectine sont de préférence des enzymes de type industriel fréquemment utilisées dans l'industrie de fabrication des jus de fruits. Ces cocktails sont conçus pour couper les pectines membranaires et ainsi permettre une meilleure extraction des jus de fruits par la fragilisation des structures avant pressage. Elles permettent également de clarifier les jus dans lesquels un trouble n'est pas souhaitable (souvent lié aux pectines) .
De préférence, les oligogalacturonides présentent un degré de polymérisation compris entre 1 et
5. De manière particulièrement avantageuse, les oligogalacturonides sont obtenus par le procédé comprenant les étapes suivantes : l'hydrolyse d'une solution de pectine de concentration comprise entre 0,1 à 10 % et de préférence 1 %, et de pH de l'ordre de 4,5, par addition à ladite solution de pectine d'une solution d'enzyme comprenant de 10 à 1000 et de préférence 100 unités polygalacturonase, pour obtenir dans la solution finale de 1 à 10 et de préférence 4 unités pectinase,
- l'arrêt de l'hydrolyse,
- la séparation des polymères de haut poids moléculaire et la récupération des oligogalacturonides. Suivant un mode de réalisation particulier de l'invention, les oligogalacturonides utilisés conformément à l'invention sont obtenus par le procédé qui suit : on met en solution de 0,1 à 10 % de pectine et de préférence 1% de pectine type HERBSTREITH et FOX Classic AU 910 issue de pomme (pectine type HB AU) . Le pH est ajusté à 4,5 de préférence avec une solution d'acide acétique. On prépare une solution enzymatique correspondant à 10 à 1000, et de préférence 100, unités polygalacturonase. On utilise par exemple une solution enzymatique provenant de la société
LYVEN Clarification granulé. La solution enzymatique est ajoutée dans la solution de pectine afin d'obtenir en final de 1 à 10 unités pectinase. L'hydrolyse est effectuée à 50 °C pendant 2 heures, puis stoppée par chauffage à 70 °C pendant 1 heure ou à 100 °C pendant 5 minutes. Après refroidissement, les polymères de haut poids moléculaire sont précipités par ajout de HC1 IN puis éliminés par centrifugation, de préférence à 5000 g pendant 30 min, ou par filtration. Le pH du surnageant est réajusté en final à une valeur comprise entre 6 et 8. Les oligogalacturonides formés sont analysés par HPLC, suivant une technique mise au point par les inventeurs, et qui permet d'obtenir le profil chromatographique des oligogalacturonides formés. Colonne : TSK gel DEAE 5-P (TOSOHAAS)
Eluant : CH3C00NH4 1M / H20 en gradient d' élution
Débit phase mobile : lml/min
Détecteur évaporatif à diffusion de la lumière (DEDL; ALTECH) .
Température du four : 130°C
Débit d'azote : 4 , 0SLPM (standard liter per min) (conditions standards pour H20 en tant que solvant) . Choix du gradient
Figure imgf000011_0001
On observe une répartition des oligomères de taille (degré de polymérisation) de 1 à 5. L'absence de standard ne permet pas de doser les oligomères de degré de polymérisation de 4 et 5 mais il est possible de doser les oligomères les plus courts. Si on procède dans les conditions décrites à l'hydrolyse d'une solution de pectine de concentration 10 g/1 ; la concentration totale en acide mono, di et trigalacturonique est d'environ 4,5 g/1 en final ; donc environ 45 % en poids de la pectine mise en solution.
Les oligogalacturonides formés sont avantageusement atomisés ou lyophilisés en final afin de permettre une meilleure conservation et des manipulations plus aisées.
Les expérimentations qui suivent montrent les effets des oligogalacturonides sur l'expression des molécules d'adhésion d'ICAM-1 et sur les fibres d'actine, en condition de stress ou non d'une part, puis les effets des oligogalacturonides sur l'adhésion des lymphocytes aux cellules endothéliales en conditions de stress ou pas d'autre part :
- la figure 1 montre des cellules endothéliales HMVEC non stimulées, la figure 1A montre le cytosquelette, et la figure 1B est une coupe de plusieurs cellules, permettant notamment de visualiser la surface de la cellule ;
- la figure 2 montre des cellules endothéliales HMVEC stimulées par du TNF (lng/ml) , la figure 2A montre le cytosquelette, et la figure 2B est une coupe de plusieurs cellules ;
- la figure 3 montre des cellules endothéliales HMVEC stimulées par du H202 (100 μM) , la figure 3A montre le cytosquelette, et la figure 3B est une coupe de plusieurs cellules ;
- la figure 4 est une photo du cytosquelette de cellules endothéliales HMVEC traitées par des oligogalacturonides (0, 001 mg/ml) , la figure 4A montre le cytosquelette, et la figure 4B est une coupe de plusieurs cellules ;
- la figure 5 est une photo du cytosquelette de cellules endothéliales HMVEC traitées par des oligogalacturonides (0, OOlmg/ml) et stimulées par du TNF
(lng/ml) , la figure 5A montre le cytosquelette, et la figure 5B est une coupe de plusieurs cellules ;
- la figure 6 est une photo du cytosquelette de cellules endothéliales HMVEC traitées par des oligogalacturonides (0, OOlmg/ml) et stimulées par du H202
(100 μM) , la figure 6A montre le cytosquelette, et la figure 6B est une coupe de plusieurs cellules ;
- la figure 7A est un histogramme comparatif concernant l'adhésion des lymphocytes sur les cellules endothéliales HskMEC.ST avec et sans condition de stress oxydant, en présence et en absence d' oligogalacturonides ; - la figure 7B est un histogramme comparatif concernant l'adhésion des lymphocytes sur les cellules endothéliales HskMEC.l avec et sans condition de stress oxydant, en présence et en absence d'oligogalacturonides ; - la figure 8 est un histogramme comparatif concernant l'adhésion des lymphocytes sur les cellules endothéliales HskMEC.ST en condition de flux avec et sans condition de stress oxydant, en présence et en absence d' oligogalacturonides .
Ces figures mettent en évidence de l'expression des fibres d'actine et des molécules d'adhésion ICAM-1 : Observation du cytosquelette et de l'expression d'ICAM-1 par microscopie optique des échantillons marqués par immunofluorescence.
La figure 1B montre la cellule, dans un état normal, et la figure 1A présente un réseau de base de fibres d'actine, protéines constitutives du cytosquelette. En réponse à un stress, les cellules endothéliales vont développer ces fibres qui vont apparaître plus nombreuses, plus denses, plus longues avec une organisation accrue.
Sur les figures 2 et 3, la présence de ICAM-1, marqueur de reconnaissance à la surface des cellules endothéliales est représentée sur les figures 2A et 2B, les figures 2A et 3A représentent le cytosquelette des cellules endothéliales (fibres de stress d'actine). On peut remarquer que lorsque l'on stresse les cellules soit par TNF (figure 2) , soit par H202 (figure 3) , l'expression des fibres de stress et de ICAM-1 à la surface des cellules est nettement accentuée, par rapport aux cellules non stimulées de la figure 1.
Sur la figure 4, après traitement par les oligogalacturonides, on constate que l'expression des fibres de stress et de ICAM-1 à la surface des cellules est fortement diminuée. La figure 5 montre des cellules HMVEC qui ont été cultivées sur des lamelles en verre dans des puits de culture puis traitées par les oligogalacturonides à 0,001 mg/ml pendant 5 heures à 37°C. Les surnageants de culture ont été ensuite éliminés, les cellules ont été lavées au PBS (sans Ca2+ , sans Mg2+ ) , puis traitées par les oligogalacturonides avec ou sans TNF'r (lng/ml) . Les cellules sont incubées à 37°C pendant 16 heures puis ces puits ont été traités par lml/puit d' oligogalacturonides à 0, OOlmg/ml. L'incubation est faite pendant 15 heures à 37°C. Les puits sont lavés 2 fois au PBS, les cellules sont fixées à la para-formaldéhyde 3 %. Les sites de fixation non spécifiques des anticorps sont ensuite saturés par du chlorure d'ammonium à 50 mM, puis les cellules sont perméabilisées par la saponine 0,01 %. Les lamelles avec les cellules fixées sont ensuite mises en contact avec l'anticorps primaire : anti ICAM-1 couplé FITC (Diaclone) et la rhodamine (Sigma, P1951 Phalloidin TRITC labeled) , pendant 1 heure 30 puis lavées 2 fois au PBS. Les lamelles sont ensuite incluses en glycërol sur des lames, puis observées en microscopie optique ou confocale. On observe le cytosquelette et l'expression des molécules d'adhésion ICAM-1. La présence de ICAM-1, marqueur de reconnaissance à la surface des cellules endothéliales est représentée sur la figure 5B, la figure 5A représente le cytosquelette des cellules endothéliales (fibres de stress d'actine). Lorsque les cellules sont traitées par les oligogalacturonides après stimulation par TNF , l'expression des fibres de stress et de ICAM-1 est fortement diminuée par rapport à la situation de la figure 2, qui montre des cellules non traitées par des oligogalacturonides .
Les photos des figures 6A et 6B ont été prises après avoir suivi le protocole suivant : Les cellules HMVEC sont cultivées sur lamelles en verre dans des puits de culture puis traités par les oligogalacturonides à 0,001 mg/ml pendant 5 heures à 37°C. Les surnageants de culture sont ensuite éliminés, les cellules sont lavées au PBS (sans Ca2+, sans Mg2+ ), puis traitées par les oligogalacturonides ou avec ou sans H202 (lOOμm) . Les cellules sont incubées à 37°C pendant 1 heure. Un lavage des puits H202 est fait au PBS (sans Ca2+, sans Mg2+) , puis ces puits sont traités par lml/puit d' oligogalacturonides à 0, OOlmg/ml. L'incubation est faite pendant 15 heures à 37°C. Les puits sont lavés 2 fois au PBS, les cellules sont fixées à la para-formaldéhyde 3 %. Les sites de fixation non spécifiques des anticorps sont ensuite saturés par du chlorure d'ammonium à 50 mM, puis les cellules sont perméabilisées par la saponine 0,01 %. Les lamelles avec les cellules fixées sont ensuite mises en contact avec l'anticorps primaire : anti ICAM-1 couplé FITC (Diaclone) et la rhodamine (Sigma, P1951 Phalloidin TRITC labeled) , pendant 1 heure 30 puis lavées 2 fois au PBS. Les lamelles sont ensuite incluses en glycérol sur des lames, puis observées en microscopie optique ou confocale. On observe le cytosquelette et l'expression des molécules d'adhésion ICAM-1. La présence de ICAM-1, marqueur de reconnaissance à la surface des cellules endothéliales est représentée sur la figure 6B, la figure 6A représente le cytosquelette des cellules endothéliales (fibres de stress d'actine).
Lorsque les cellules sont traitées par les oligogalacturonides après stimulation par H202> l'expression des fibres de stress et de ICAM-1 est fortement diminuée par rapport à la situation de la figure 2, qui montre des cellules non traitées par des oligogalacturonides . En conclusion, lorsque les cellules sont traitées par les oligogalacturonides après stimulation soit par TNF (figure 5) soit par H202 (figure 6) , l'expression du cytosquelette et de ICAM-1 est fortement diminuée à la surface des cellules. Cette observation est valable aussi en absence de stress (figure 4) . Quel que soit le passage des cellules, les résultats sont identiques .
Les figures 1 à 6 montrent que l'expression de
ICAM-1, une molécule d'adhésion induite à la surface des cellules endothéliales sous l'action des cytokines est diminuée sous l'action des oligogalacturonides. Du fait de cette diminution, le recrutement des cellules circulantes sera moins efficace. Les oligogalacturonides sont donc inhibiteurs de la reconnaissance des cellules de l'inflammation par les cellules endothéliales. Les facteurs déclenchant la réaction inflammatoire sont mimés in vi tro par un stress oxydant représenté par TNF't" ou H202. L'effet des oligogalacturonides est évalué en conditions de stress (stimulation par le TNF ou H202) ou non.
Dans les figures 7A, 7B et 8, les 2 types cellulaires (cellules circulantes et cellules endothéliales) sont mises en contact et on regarde l'adhésion relative entre ces 2 types cellulaires en absence et en présence d' oligogalacturonides . L'effet est évalué en conditions de stress (stimulation par Η202) ou non.
Les figures 7A et 7B mettent en évidence de l'adhésion des cellules circulantes : Les études d'adhérence quantitative et rhéologiques (in vi tro) sont réalisées sur des cellules endothéliales organospécifiques primaires et immortalisées dans un modèle de sénescence cellulaire. Les cellules HSkMEC.l et HSkMEC.ST, cellules endothéliales de peau, représentent deux types d' immortalisation. Les cellules sont cultivées dans l'OptiMEM (Gibco BRL, Life Technologies SARL, Cergy Pontoise, France) supplêmenté en SBF (5%, v/v, Dutscher, Brumath, France) et antibiotiques. Le passage des cellules se fait par traitement à la trypsine 0,25% (Gibco BRL), 0,05% EDTA ( /v) en solution dans le tampon phosphate (PBS) . Pour les études en cytofluorimétrie, les cellules sont détachées des flacons de culture par la collagénase type 1 (lmg/ml)/BSA (lOmg/ml) .
Les expériences d'adhérence sont faites selon Bizouarne et al., 1993. Des cellules endothéliales marquées par le fluorochrome PKH-26 GL (Horan and Slezak, 1989) (Sigma) sont mises en culture 24 heures avant en linbro 24 puits (Falcon) (0,75xl05 cells dans 400μl) . CEMT4 ou HL-60 cells, marquées par la FTC (Denis et al., 1996) sont incubées avec les cellules endothéliales dans un rapport de 5 cellules par cellules endothéliales pendant 30 minutes à température ambiante.
En conditions de stress oxydant, les oligogalacturonides (lOOμg/ml) sont ajoutés lors de la post incubation de H202 (lOOμmol) (1 heure puis 16 heures) .
Les résultats sont exprimés comme index d'adhérence relative (RAI) (Butcher et al., 1980), directement lié à l'effet positif ou négatif d'une molécule par rapport aux conditions du témoin. Les cellules marquées sont analysées par cytomé rie en flux à l'aide d'un FACS 440, ou un FACSort (Becton Dickinson, Sunnyvale, CA, USA)
Les oligogalacturonides provoquent une baisse de l'adhésion avant et après activâ ion par H202, sans que nous puissions établir une différence entre ces deux types cellulaires, c'est pourquoi il est important de se placer en conditions de flux.
Figure imgf000018_0001
La figure 8 montre les résultats après utilisation de la cytométrie de flux. Cette technique permet de simuler les forces de cisaillement in vitro. Une chambre de perfusion connectée par un système de tuyaux à une pompe aspire un échantillon de tampon contenu dans un réservoir. Une lamelle couverte par une monocouche de cellules endothéliales est montée dans l'ouverture centrale de la chambre de perfusion perpendiculairement au flux. La force de cisaillement désirée est obtenue par régulation du débit sanguin selon le diamètre du canal de la chambre de perfusion. Après la perfusion dans un bain thermostaté à 37°C, le flux est arrêté et la lame sortie de la chambre. La lame est ensuite lavée, fixée, colorée et prête à être évaluée par un système d'analyse d'image. Les cellules en suspension passent pendant 3 minutes puis le flux est stoppé et le milieu seul est passé dans les mêmes conditions, avec ou sans molécules modulatrices (10 minutes, lOOμl/min) , milieu seul (10 minutes, lml/min) .
Les • cellules marquées sont analysées par cytométrie en flux à l'aide d'un FACS 440, ou un FACSort (Becton Dickinson, Sunnyvale, CA, USA) et quantifiées selon Paprocka et al. (2002). Cinq mille événements, sélectionnés en taille structure sont enregistrés et analysés par les logiciels PC Lysis® ou CellQuest® (Becton Dickinson) . La fluorescence moyenne des contrôles placée à une valeur inférieure à 10, est utilisée comme seuil pour estimer les cellules positives. Les histogrammes présentés sont un représentant de cinq expériences séparées.
Les résultats diffèrent des résultats obtenus en conditions d'adhésion statiques.
Cependant, l'inhibition est plus nette après action de H202. Les oligogalacturonides sont très inhibiteurs pour l'adhésion.
Figure imgf000019_0001
La différence entre les cellules HSkMEC.l et les cellules HSkMEC.ST (qui représentent deux types d' immortalisation) , viendrait du fait que HSkMEC.ST pourraient représenter des cellules "jeunes" par rapport aux cellules HSkMEC.l qui représenteraient des cellules plus proches de la sénescence.
Les oligogalacturonides ont donc pour effet d'une part de diminuer de l'expression des fibres d'actine, et d'autre part de diminuer l'expression des molécules d'adhésion. Ils exercent donc un effet antistress et cytoprotecteur.

Claims

REVENDICATIONS
1) Utilisation d'oligogalacturonides pour la préparation d'une composition cosmétique, dermatologique ou pharmaceutique permettant de diminuer l'expression des facteurs d'adhésion cellulaires sur les cellules endothéliales du derme, de façon à diminuer la propagation de la réponse inflammatoire au niveau de la peau.
2) Utilisation d'oligogalacturonides selon la revendication 1, caractérisée en ce que les oligogalacturonides limitent la reconnaissance, par les cellules endothéliales, des cellules circulantes responsables de la propagation de l'inflammation, de façon à diminuer la propagation de la réponse inflammatoire au niveau de la peau.
3) Utilisation d'oligogalacturonides selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisée en ce que les oligogalacturonides limitent la diapédèse, de façon à diminuer la propagation de la réponse inflammatoire au niveau de la peau.
4) Utilisation d'oligogalacturonides selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que les oligogalacturonides permettent de diminuer l'expression des fibres d'actine et l'expression des molécules d'adhésion, de façon à exercer un effet anti- stress et cytoprotecteur.
5) Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que ladite composition est une emulsion permettant la pénétration desdits oligogalacturonides dans le derme.
6) Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisée en ce qu'elle comprend, en équivalent poids sec par rapport au poids total de la composition, de 0,01 à 5 %, de préférence 0,5 % d' oligogalacturonides .
7) Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisée en ce que lesdits oligogalacturonides sont obtenus par hydrolyse enzymatique d'une pectine.
8) Utilisation selon la revendication 7, caractérisée en ce que ladite hydrolyse est réalisée par un cocktail enzymatique comprenant des pectinases ayant principalement des activités polygalacturonases , méthylestérase, et polygalacturonase lyase.
9) Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisée en ce que lesdits oligogalacturonides présentent un degré de polymérisation compris entre 1 et 5.
10) Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisée en ce que lesdits oligogalacturonides sont obtenus par le procédé comprenant les étapes suivantes : - l'hydrolyse d'une solution de pectine de concentration comprise entre 0,1 à 10 % et de préférence 1 %, et de pH de l'ordre de 4,5, par addition à ladite solution de pectine d'une solution d'enzyme comprenant de 10 à 1000 et de préférence 100 unités polygalacturonase, pour obtenir dans la solution finale de 1 a 10 et de préférence 4 unités pectinase,
- l'arrêt de l'hydrolyse,
- la séparation des polymères de haut poids moléculaire et la récupération des oligogalacturonides.
11) Utilisation selon la revendication 10, caractérisée en ce que les oligogalacturonides formés sont atomisés ou lyophilisés.
12) Méthode de soin cosmétique des peaux sensibles limitant la propagation de la réponse inflammatoire, caractérisée en ce qu'elle comprend l'application sur la peau d'une quantité adéquate d'oligogalacturonides.
13) Méthode de soin cosmétique des peaux sensibles limitant la propagation de la réponse inflammatoire au niveau de la peau, caractérisée en ce qu'elle permet de diminuer l'expression des facteurs d'adhésion cellulaires sur les cellules endothéliales du derme par application sur la peau d'une quantité adéquate d'oligogalacturonides.
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US20150080826A1 (en) * 2013-08-28 2015-03-19 The Procter & Gamble Company Substrate comprising oligogalacturonides and disposable absorbent article comprising the substrate

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