FR3071402B1 - Procede de traitement d'un extrait d'alginates, produit correspondant obtenu, et utilisations associees - Google Patents
Procede de traitement d'un extrait d'alginates, produit correspondant obtenu, et utilisations associees Download PDFInfo
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Abstract
La présente invention concerne un procédé amélioré d'obtention d'un produit à partir d'alginate, ainsi que le produit obtenu à partir de ce procédé. Ledit produit présente des propriétés physicochimiques et biologiques améliorées. Ledit produit est destiné notamment à préserver l'activité énergétique des fibroblastes du derme et/ou à stimuler leur synthèse de protéines de la matrice extracellulaire.
Description
PROCEDE DE TRAITEMENT D’UN EXTRAIT D’ALGINATES, PRODUITCORRESPONDANT OBTENU, ET UTILISATIONS ASSOCIEES
RESUME DE L’INVENTION
La présente invention concerne un procédé amélioré d’obtention d’un produit à partird’alginate, ainsi que le produit obtenu à partir de ce procédé. Ledit produit présente despropriétés physicochimiques et biologiques améliorées. Ledit produit est destiné notamment àpréserver l’activité énergétique des fibroblastes du derme et/ou à stimuler leur synthèse deprotéines de la matrice extracellulaire.
ART ANTERIEUR
Dans le domaine de la cosmétologie et de la dermatologie, les consommateurs sont trèsattachés à l’utilisation de produits comprenant des extraits naturels, ou des dérivés de telsextraits. En effet, nombre d’extraits naturels, et leurs dérivés, ont des propriétés tout à faitintéressantes, notamment vis-à-vis de l’hydratation de la peau, de son vieillissement, de sonteint, etc.
En particulier, les propriétés cosmétiques et dermatologiques des extraits naturelsd’alginate de sodium, et de leurs dérivés, sont connues. Les alginates dont despolysaccharides extraits d’une famille d’algues brunes (Pheophyceae), comprenantnotamment les laminaires et les fucus.
Afin de modifier les propriétés physicochimiques et/ou biologiques des alginates,différents procédés de traitement peuvent être mis en œuvre. Parmi les procédés disponibles,la mise en œuvre d’une dépolymérisation, généralement partielle, permet d’obtenir desoligosaccharides.
Par exemple, la demande WO98/13049 divulgue un procédé d’élaboration d’un produitobtenu par application d’un traitement de dépolymérisation d’un extrait naturel d’alginate desodium par utilisation d’une alginate lyase, suivi d’une hydrolyse en milieu acide. Il estrapporté que le produit obtenu permettrait notamment de protéger les cellules de Langerhansde l’épiderme contre les rayonnements ultraviolets, d’augmenter la concentration épidermiquede l’interleukine la, de présenter un effet anti-radicalaire, de protéger les cellules du derme del’oxydation des protéines, et de la fragmentation de l’ADN, de présenter un effet inhibiteurvis-à-vis de l’activité de l’enzyme 5a réductase et de présenter un effet inhibiteur vis-à-vis dela souche bactérienne pathogène Proprionibactérium acnés.
Pour être spécifique, la demande WO98/13049 divulgue un procédé comprenant lesétapes suivantes : (1) solubilisation d’un extrait d’alginate de sodium pendant une heure à uneconcentration de 5%, puis (2) dépolymérisation à une température de 25°C, à un pH de 7,5 etpendant au moins 4 heures au moyen d’une alginate lyase présente dans un ratio massiqueenzyme/alginate de 0,01%, puis (3) une hydrolyse partielle en milieu acide à une températurede 94°C, à un pH de 1,5 et pendant quatre heures par ajout d’acide sulfurique dans un ratioacide/alginate de 30% en poids sec, puis (4) refroidissement pendant une heure jusqu’à unetempérature inférieure à 35°C. Ladite étape d’hydrolyse est une étape facultative.
La demande FR2779953 divulgue un procédé similaire.
Malgré les propriétés utiles, tant physicochimiques que biologiques, des produitsdivulgués dans les demandes WO98/13049 et FR2779953, les formulateurs sont toujours à larecherche de produits aux propriétés augmentées et/ou additionnelles. De telles propriétésaugmentées et/ou additionnelles peuvent être obtenues par exemple en modifiant lespropriétés intrinsèques desdits produits. De telles propriétés intrinsèques peuvent êtrenotamment le profil de solubilisation, le degré de pureté, le contenu en matière organique,l’aspect du produit obtenu, etc. Afin de modifier ces propriétés intrinsèques, il est nécessaired’adapter le procédé d’obtention dudit produit.
OBJECTIFS DE L’INVENTION
La présente invention a pour objectif la mise en œuvre d’un procédé amélioréd’obtention d’un produit à partir d’alginate.
Un autre objectif de la présente invention, dans au moins un mode de réalisation, est lamise en œuvre d’un procédé dont les conditions expérimentales sont optimisées.
Un autre objectif de la présente invention, dans au moins un mode de réalisation, est lamise en œuvre d’une réaction de dépolymérisation améliorée.
Un autre objectif de la présente invention, dans au moins un mode de réalisation, est lamise en œuvre d’un procédé permettant l’obtention d’un produit dérivé d’un extraitd’alginates présentant un rendement augmenté et/ou une qualité améliorée et/ou une plusgrande pureté.
Un autre objectif de la présente invention, dans au moins un mode de réalisation, est lafourniture d’un produit dérivé d’alginate présentant des propriétés biologiques particulières.
DESCRIPTION DE L’INVENTION
Selon un premier aspect, la présente invention concerne un procédé d’obtention d’unproduit à partir d’alginate, ledit procédé comprenant les étapes suivantes : (1) solubilisation de l’alginate pendant au moins six heures à une concentration de5,2%, puis (2) dépolymérisation enzymatique à une température de 22°C, à un pH de 7,5 etpendant au moins trois heures au moyen d’une mannuronate lyase présentedans un ratio massique enzyme/alginate de 0,01% ; puis (3) hydrolyse partielle en milieu acide à une température de 94°C, à un pH de 1,5et pendant quatre heures par ajout d’acide sulfurique dans un ratioacide/alginate de 30% en poids sec ; puis (4) refroidissement pendant une heure jusqu’à une température inférieure à 35°C;puis (5) filtration sur filtre de cellulose.
Le produit obtenu par le procédé selon l’invention comprend des oligosaccharides dutype comprenant, des oligoalginates. Lesdits oligoalginates sont constitués de l’enchaînementde deux acides uroniques : l’acide mannuronique et l’acide guluronique. Ce produit estdénommé ci-après « oligosaccharide(s) » ou « oligosaccharide(s) » selon l’invention ».
Les inventeurs, en modifiant de manière sélective les conditions expérimentales duprocédé d’obtention de produits - oligosaccharides - à partir d’alginates, ont démontré quelesdits oligosaccharides présentaient des propriétés physicochimiques et biologiquesaméliorées. Cela a été rendu possible notamment en optimisant des paramètres spécifiquesdudit procédé. Notamment, en augmentant tant la concentration en alginates que le temps deréaction au cours de l’étape de solubilisation, il est obtenu un alginate dont l’homogénéisationest améliorée, ce qui facilite l’étape de dépolymérisation, l’enzyme ayant un meilleur accès àson substrat. La réduction de la température à 22°C au cours de l’étape de dépolymérisationenzymatique permet une mise en œuvre à une température plus proche de la températured’activité optimale de l’alginate lyase, ce qui favorise donc la réaction de dépolymérisation.L’optimisation tant de la concentration et du temps de réaction au cours de l’étape desolubilisation que de la température au cours de l’étape de dépolymérisation permet de réduirele temps de réaction à trois heures. Enfin, la mise en œuvre d’une étape de filtration surcellulose, qui est un support inerte, limite les effets d’échanges d’ions, les changements de pHpendant le procédé de dépolymérisation et les pertes d’oligosaccharides pendant la filtration.En particulier, les inventeurs ont démontré que la mise en œuvre d’une étape de filtration surun filtre de cellulose, en remplacement d’une filtration aux terres de diatomées, permet une optimisation du procédé, par évitement de l’ajustement du pH, des phénomènes d’échangesd’ions, et de la rétention d’une partie des oligosaccharides obtenus dans les terres dediatomées.
En particulier, sans vouloir être tenu par aucune théorie, les inventeurs ont mis en avantque les oligosaccharides obtenus avec le procédé selon l’invention présentaient des propriétésphysicochimiques améliorées. Ainsi, lesdits oligosaccharides sont moins colorés (indice deGardner IG), caractéristique d’un produit de meilleure qualité. En outre, ledit produit a uncontenu en matière organique plus élevé (rapport entre matière organique et matière minéraleOm/Mm), caractéristique d’un produit plus pur comprenant moins de contaminants d’origineminérale, c’est à dire qu’il y a une meilleure purification du produit au cours des étapesd’hydrolyse et de filtration. Enfin, ledit produit est plus pur (chromatographie d’exclusionionique).
En outre, sans vouloir être tenu par aucune théorie, les inventeurs ont mis en avant queles oligosaccharides obtenus avec le procédé selon l’invention présentaient des propriétésbiologiques améliorées. Ainsi, ledit produit à un effet positif sur l’activité énergétique desfibroblastes (stimulation de l’ATP). En outre, ledit produit à un effet positif sur la synthèse deprotéines de la matrice extra-cellulaire, en particulier des collagènes par les fibroblastes duderme, (stimulation de la synthèse de collagène de type 1). Enfin, ledit produit à un effetpositif sur la senescence des fibroblastes.
Selon un mode préféré de réalisation, l’alginate est un extrait naturel d’alginate,préférentiellement un extrait naturel d’alginate obtenu à partir d’algues brunes(Pheophyceae), très préférentiellement un extrait naturel d’alginate obtenu à partir de l’espèced’algues brunes Laminaria digitata. Ledit extrait peut être notamment un extrait d’alginate desodium. L’étape de dépolymérisation peut être mise en œuvre au moyen d’une mannuronaselyase étant une alginate lyase. Cette enzyme, obtenue par fermentation bactérienne, permet dedépolymériser par B-élimination les blocs alternés de la molécule d’alginate de sodium, quisont constitués d’enchaînements d’a-L-guluronate de sodium et de B-D-mannuronate desodium liés en 1,4. De plus, ladite enzyme permet de réduire très rapidement la viscosité de lasolution d’alginate de sodium au terme de ladite étape de dépolymérisation.
Selon un second aspect, la présente invention concerne un produit obtenu par le procédéselon la présente invention. Ledit produit selon l’invention présente des propriétés physicochimiques et biologiques améliorées en comparaison des produits obtenus par lesprocédés conventionnels.
Ledit produit peut comprendre en outre, par addition, au moins un oligo-élément. Leditoligo-élément peut former un complexe stable appelé chélate avec l’oligosaccharide selonl’invention. Les oligo-éléments peuvent être des éléments minéraux cationiques, par exempledes éléments minéraux choisis parmi le groupe constitué de Zn2+, Mn2+, Mg2+ et leursmélanges.
Le degré de polymérisation de l’oligosaccharide selon l’invention peut être mesuré partoute méthode conventionnelle, notamment celle dite du « dosage des doubles liaisonsconjuguées ». La masse moléculaire moyenne en nombre peut être mesurée par toute méthodeconventionnelle, notamment la méthode de Somogyi-Nelson dite du « dosage des sucresréducteurs ».
Dans un mode de réalisation particulier, ledit produit est destiné à préserver l’activitéénergétique des fibroblastes du derme. En particulier, ledit produit est destiné à prévenir oulimiter la diminution de la production d’ATP par les fibroblastes induite par le stress et/ou lasenescence.
Dans un autre mode de réalisation, ledit produit est destiné à stimuler la synthèse deprotéines de la matrice extracellulaire, notamment de collagène, par les fibroblastes.
Les caractéristiques de la présente invention apparaîtront plus clairement à la lecture dela description ci-contre et des exemples ci-dessous.
DESCRIPTIF DES FIGURES
La figure 1 est une représentation graphique de la couleur (indice de Gardner) deproduits obtenus à partir d’alginate.
La figure 2 est une représentation graphique du contenu en matière organique deproduits obtenus à partir d’alginate.
La figure 3 est une représentation graphique de la mesure de Faire sous la courbecaractéristique de produits obtenus à partir d’alginate.
La figure 4 est une représentation graphique de l’effet protecteur du produit selonl’invention contre la chute d’ATP induite par un stress.
La figure 5 est une représentation graphique de l’effet protecteur du produit selonl’invention contre la chute d’ATP induite par un peptide lié à la senescence avec traitementpendant le stress.
La figure 6 est une représentation graphique de l’effet protecteur du produit selonl’invention contre la chute d’ATP induite par un peptide lié à la senescence avecprétraitement.
La figure 7 est une représentation graphique de l’effet protecteur du produit selonl’invention sur la synthèse de collagène de type 1 dans des fibroblastes de derme humain.
Les figures 8a, 8b, 8c et 8d sont des photographies de fibroblastes permettant d’observerl’effet protecteur du produit selon l’invention sur la chute de collagène de type I induite parun peptide liée à la senescence.
Les figures 9a, 9b, 9c et 9d sont des photographies de fibroblastes permettant d’observerla présence de SA-beta galactosidase.
La figure 10 est une représentation graphique de la quantification de la SA-betagalactosidase dans des fibroblastes.
Les figures lia, 11b, 11c et lld sont des photographies de fibroblastes permettantd’observer la présence de SA-beta galactosidase.
EXEMPLES
Exemple 1 - Procédé d’obtention d’un produit à partir d’alginate
Un extrait d’alginate est obtenu à partir de Laminaria digitata. Cet extrait d’alginate estsolubilisé pendant au moins six heures à une concentration de 5,2%. L’extrait d’alginatesolubilisé est ensuite soumis à une dépolymérisation enzymatique à une température de 22°C,à un pH de 7,5 et pendant au moins 3 heures au moyen d’une alginate lyase présente dans unratio massique enzyme/alginate de 0,01%. L’extrait d’alginate dépolymérisé est ensuitesoumis à une hydrolyse partielle en milieu acide à une température de 94°C, à un pH de 1,5 etpendant quatre heures par ajout d’acide sulfurique dans un ratio acide/alginate de 30% enpoids sec. L’extrait d’alginate hydrolysé est ensuite soumis à un refroidissement pendant uneheure jusqu’à une température inférieure à 35°C. L’extrait d’alginate hydrolysé refroidi estensuite filtré sur filtre de cellulose.
Un procédé alternatif comparatif a également été mis en œuvre. Toutes les étapes ci-dessus ont été mises en œuvre à l’identique, à l’exception de l’étape de filtration qui a étémise en œuvre au moyen d’un filtre en terres de diatomées.
Le degré de polymérisation du produit obtenu par le procédé selon l’invention - à savoirun extrait d’alginate dépolymérisé, hydrolysé, refroidi et filtré - est d’environ entre 7 et 11.
La masse moléculaire moyenne en nombre du produit obtenu par le procédé selonl’invention - à savoir un extrait d’alginate dépolymérisé, hydrolysé, refroidi et filtré - estd’environ 4500 Daltons.
Le produit (selon l’invention) et le produit (comparaison) ont été caractérisés.
Notamment, la couleur desdits produits a été déterminée par mesure de l’indice deGardner. Les résultats obtenus sont illustrés en figure 1. Le produit selon l’invention présenteune valeur d’indice de Gardner inférieure et est donc moins coloré, ce qui traduit uneamélioration du produit.
Le contenu en matière organique desdits produits a également été déterminé, par mesuredu rapport entre matière organique et matière minérale. Les résultats sont illustrés en figure 2.Le contenu en matière organique du produit selon l’invention est de 25% supérieur à celui duproduit (comparaison), ce qui traduit un produit plus pur, comprenant moins de contaminantsd’origine minérale, et ce qui traduit donc une meilleure purification du produit au cours desétapes d’hydrolyse et de filtration.
La pureté a également été analysée par mesure de la taille par chromatographied’exclusion ionique. Les résultats sont illustrés en figure 3. La taille moyenne (massemoléculaire moyenne) est la même entre le produit selon l’invention et le produit(comparaison), mais l’aire sous la courbe caractéristique est plus élevée pour le produit selonl’invention.
Les activités biologiques présentées ci-après sont évaluées à partir d’une solutioncontenant 5% de l’oligoalginate obtenu selon l’invention. Les pourcentages sont donc despourcentages de cette solution.
Exemple 2 - Evaluation in vitro de l’effet sur le niveau énergétique des cellules par lamesure d’ATP - Effet sur la baisse d’ATP induite par un stress L’effet des oligosaccharides selon l’invention sur la baisse d’ATP induite par un stress aété évalué dans des fibroblastes de derme humain issus d’un donneur de 50 ans, utilisés au8ème repiquage.
Les cellules ont été ensemencées dans un milieu pour la culture des fibroblastescontenant 10% de sérum de veau fœtal (SVF) et cultivées pendant un jour. Ensuite, lescellules ont été stressées ou non (contrôle) pendant quatre heures. Les conditions de stress ontété générées par exposition à un gaz d’échappement automobile. Des conditions alternativesde stress peuvent être utilisées.
La production d'ATP (en % par rapport au témoin sans stress) a été mesurée à l'aide dukit Mitochondrial TOX-GLO (Promega). Les résultats obtenus sont illustrés dans la figure 4. L'exposition des fibroblastes au stress a induit une diminution significative de laproduction d'ATP par rapport au contrôle non traité de -43%. Ledit produit testé à 0,05%,0,1% et 0,25% a protégé les cellules de 45%, 55% et 71%, respectivement, contre ladiminution de la production d'ATP induite par l'exposition au stress.
Exemple 3a - Evaluation in vitro de l’effet sur le niveau énergétique des cellules par lamesure d’ATP - Effet sur la baisse d’ATP due à un peptide induisant la sénescence(traitement pendant le stress) L’effet a été évalué dans des fibroblastes de derme humain issus d’un donneur de 51ans.
Les cellules ont été ensemencées dans du milieu contenant 10% de sérum de veau fœtal(SVF) puis incubées pendant 5 jours. Elles ont ensuite été traitées avec le peptide à 20μΜ etavec et sans le produit obtenu par le procédé selon l’invention à 0,15%.
Après 4h à 37°C, un dosage de l’ATP a été réalisé à l’aide du kit Mito Tox Glo(Promega). Les résultats exprimés en % par rapport au témoin obtenus sont illustrés dans lafigure 5.
Les oligosaccharides selon l’invention protègent significativement les fibroblastes d’unebaisse d’ATP induite par le peptide: +82% d’ATP avec ledit produit à 0,15% (Figure 5 enannexe).
Exemple 3b - Evaluation in vitro de l’effet sur le niveau énergétique des cellules par lamesure d’ATP - Effet sur la baisse d’ATP due à un peptide induisant la sénescence(prétraitement avant le stress) L’effet a été évalué dans des fibroblastes de derme humain issus d’un donneur de 39ans.
Les cellules ont été ensemencées dans du milieu contenant 10% de sérum de veau fœtal(SVF) puis incubées pendant 4 jours. Elles ont ensuite été prétraitées ou non avec le produitobtenu par le procédé selon l’invention à 0,15% pendant 18h puis traitées avec le peptide à20μΜ en présence ou non dudit produit à 0,15%.
Après 4h à 37°C, un dosage de l’ATP a été réalisé à l’aide du kit Mito Tox Glo(Promega). Les résultats exprimés en % par rapport au témoin sont illustrés dans la figure 6.
Le prétraitement par les oligosaccharides selon l’invention seul protège les fibroblastesd’une baisse d’ATP induite par l’ajout ultérieur du peptide (+23%). Cet effet protecteur estencore plus important lorsque le prétraitement est suivi d’un traitement avec lesditsoligosaccharides pendant le stress avec le peptide (+65%).
Exemple 4 - Evaluation de l’effet sur l’activité des cellules par la mesure de la synthèsede collagène L’effet sur la synthèse de collagène a été évalué dans des fibroblastes de derme humainissus d’un donneur de 39 ans, utilisés au 12eme repiquage.
Les cellules ont été ensemencées à raison de 5000 cellules par puits et cultivées enprésence de milieu contenant 10% de S VF (sérum de veau fœtal) pendant 4 jours. Au bout deces 4 jours, les cellules ont été traitées ou non (contrôle) par le produit obtenu par le procédéselon l’invention à 0,005%, 0,01% ou 0,1%, respectivement, en présence de milieu contenant2% de SVF puis incubées pendant 3 jours. Le traitement a été renouvelé, puis les cellules ontété incubées pendant 3 jours.
Au bout des 3 jours de traitement, un marquage du collagène de type I enimmunofluorescence a été réalisé suivi d’une observation microscopique et d’une évaluationsemi-quantitative du marquage. Les résultats exprimés en % de fluorescence ramené à 100noyaux sont illustrés dans la figure 7.
La référence positive testée (mélange TGF-beta/vitamine C) stimule significativementla synthèse de collagène de type I de +184%. Ce résultat était attendu et valide l’étude. Lesoligosaccharides selon l’invention stimulent significativement la synthèse de collagène auxtrois concentrations testées.
Exemple 5a - Evaluation de l’effet protecteur vis-à-vis d’un peptide induisant lasénescence, mis en évidence par la mesure du collagène de type 1, diminué par levieillissement - Effet protecteur vis-à-vis de la chute du collagène L’effet protecteur a été évalué dans des fibroblastes de derme humain issus d’undonneur de 51 ans.
Les cellules ont été ensemencées puis incubées pendant 5 jours selon quatre conditions :1) sans le peptide (témoin négatif), 2) avec le peptide et sans les oligosaccharides selonl’invention (témoin positif), 3) avec les oligosaccharides selon l’invention à 0,15% pendant24h seul puis le peptide seul (= prétraitement), 4) avec les oligosaccharides selon l’invention à 0,15% pendant 24h seul puis le peptide + les oligosaccharides selon l’invention à 0,15%(= prétraitement+ pendant le stress). A la fin de l’incubation, un marquage en immunofluorescence du collagène de type I aété réalisé. Des photos ont été prises pour observation du collagène. Ces photos sontrapportées en figures 8a, 8b, 8c et 8d. La figure 8a correspond aux fibroblastes non traités. Lafigure 8b correspond aux fibroblastes traités par le peptide (ΙμΜ). La figure 8c correspondaux fibroblastes prétraités par le produit selon l’invention (0,15%) puis traités par le peptide(ΙμΜ) sans le produit selon l’invention. La figure 8d correspond aux fibroblastes prétraitéspar le produit selon l’invention (0,15%) puis traités par le peptide (ΙμΜ) + le produit selonl’invention (0,15%).
On observe une diminution de la synthèse de fibres de collagène de type 1 avec letraitement par le peptide (cf. figures 8a versus figure 8b). Le prétraitement par le produitobtenu selon l’invention à 0,15% avant le stress prévient la chute de cette synthèse (cf. figure8c versus figure 8b), et le prétraitement suivi d’un traitement pendant le stress protège lecollagène (cf. figure 8d versus figure 8b), et le stimule même plus que le témoin négatif (cf.figure 8d versus figure 8a).
Exemple 5b - Evaluation de l’effet protecteur vis-à-vis d’un peptide induisant lasénescence, mis en évidence par la mesure de l’activité SA-beta galactosidase (effet sur desfibroblastes issus d’un donneur de 55 ans)
Cet effet a été évalué par le marquage de la beta galactosidase associée à la sénescencedes cellules (SA-Beta-gal) dans des fibroblastes de derme humain provenant d’un donneur de55 ans utilisés au 8eme repiquage.
Des fibroblastes d’un donneur de 70 ans ont également été utilisés comme témoinpositif. Les cellules ont été traitées pendant 11 jours avec ou sans le peptide induisant lasénescence à Ο,ΙμΜ et avec ou sans les oligosaccharides selon l’invention à 0,15%.
Le marquage de la SA-beta galactosidase a ensuite été réalisé par colorimétrie enutilisant un kit spécifique. Des photographies ont été prises pour observation de la SA-betagalactosidase en bleu vert. Celles-ci sont rapportées en figures 9a, 9b, 9c et 9d. La figure 9acorrespond aux fibroblastes du donneur de 70 ans non traités (contrôle positif). La figure 9bcorrespond aux fibroblastes du donneur de 55 ans non traités. La figure 9c correspond auxfibroblastes du donneur de 55 ans traités avec le peptide (ΙμΜ). La figure 9d correspond auxfibroblastes du donneur de 55 ans traités avec le peptide (ΙμΜ) et les oligosaccharides selon l’invention (0,15%). Une analyse d’images a également été réalisée afin de la quantifier parmesure de la Somlntensité Seuillage. Celle-ci est rapportée en figure 10.
Le niveau d’activité de la SA-beta galactosidase est significativement plus élevé de+56% dans les fibroblastes 70 ans par rapport à celui des cellules de 55 ans. Le traitementdes fibroblastes de 55 ans par le peptide à 0,1 μ M stimule significativement de +59%l’activité de la SA-beta galactosidase par rapport aux cellules non traitées. Le niveau estproche de celui mesuré dans les cellules de 70 ans. Le traitement par les oligosaccharidesselon l’invention 0.15% permet de contrer cette augmentation de la SA-beta galactosidasede -24% (soit 65% de protection). Les oligosaccharides selon l’invention protègent lesfibroblastes de la sénescence induite par le peptide.
Exemple 5c - Evaluation de l’effet protecteur vis-à-vis d’un peptide induisant lasénescence, mis en évidence par la mesure de l’activité SA-beta galactosidase (effet sur desfibroblastes issus d’un donneur de 70 ans)
Cet effet a été évalué par marquage de la SA-beta galactosidase dans des fibroblastes dederme humain provenant d’un donneur de 70 ans.
Les cellules ont été traitées pendant 11 jours avec ou sans le peptide induisant lasénescence à 0,1 μΜ et avec ou sans les oligosaccharides selon l’invention à 0,15%.
Le marquage de la SA-beta galactosidase a ensuite été réalisé par colorimétrie enutilisant un kit spécifique. Des photographies ont été prises pour observation de la SA-betagalactosidase en bleu vert. Celles-ci sont rapportées en figures lia, 11b, 1 le et 1 ld. La figurelia correspond aux fibroblastes du donneur de 70 ans non traités. La figure 11b correspondaux fibroblastes du donneur de 70 ans traités avec le peptide (ΙμΜ). La figure 11c correspondaux fibroblastes du donneur de 70 ans traités avec les oligosaccharides selon l’invention(0,15%). La figure 1 ld correspond aux fibroblastes du donneur de 70 ans traités avec lesoligosaccharides selon l’invention (0 ,15%) et le peptide (ΙμΜ).
Le niveau d’activité de la SA-beta galactosidase est assez élevé dans les cellules dudonneur de 70 ans avec ou sans le peptide. Le traitement avec l’oligosaccharide de l’inventionà 0,15% diminue le niveau de SA-beta galactosidase des cellules, qu’elles soient traitées ounon par le peptide. Ceci montre un effet anti-âge de l’oligosaccharide sur des cellules âgéesmême en absence d’un stress induisant un vieillissement in-vitro.
Claims (7)
- REVENDICATIONS1. Un procédé d’obtention d’un produit à partir d’alginate, ledit procédécomprenant les étapes suivantes : (1) solubilisation de l’alginate pendant au moins six heures à une concentration de5,2% ; puis (2) dépolymérisation enzymatique à une température de 22°C, à un pH de 7,5 etpendant au moins trois heures au moyen d’une mannuronate lyase présentedans un ratio massique enzyme/alginate de 0,01% ; puis (3) hydrolyse partielle en milieu acide à une température de 94°C, à un pH de 1,5et pendant trois heures par ajout d’acide sulfurique dans un ratio acide/alginatede 30% en poids sec; puis (4) refroidissement pendant une heure jusqu’à une température inférieure à 35° ;puis (5) filtration sur filtre de cellulose.
- 2. Procédé d’obtention selon la revendication 2, caractérisé en ce que lamannuronate lyase est une alginate lyase.
- 3. Produit obtenu à partir d’alginate par le procédé selon l’une quelconque desrevendications précédentes.
- 4. Produit obtenu à partir d’alginate selon la revendication 3, ledit produit étantdestiné à préserver l’activité énergétique des fibroblastes du derme.
- 5. Produit obtenu à partir d’alginate selon la revendication 4, ledit produit étantdestiné à prévenir ou limiter la diminution de la production d’ATP par lesfibroblastes induite par le stress.
- 6. Produit obtenu à partir d’alginate selon la revendication 4, ledit produit étantdestiné à prévenir ou limiter la diminution de la production d’ATP par lesfibroblastes induite par la senescence.
- 7. Produit obtenu à partir d’alginate selon la revendication 3, ledit produit étantdestiné à stimuler la synthèse de protéines de la matrice extracellulaire,notamment de collagène, par les fibroblastes.
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