WO2004074480A1

WO2004074480A1 - 変異遺伝子検出のためのシグナル増幅方法

Info

Publication number: WO2004074480A1
Application number: PCT/JP2004/002007
Authority: WO
Inventors: Mitsugu Usui; Toshihiko Fujikawa
Original assignee: Eisai Co., Ltd.
Priority date: 2003-02-21
Filing date: 2004-02-20
Publication date: 2004-09-02
Also published as: US20060210983A1; EP1595953B1; JPWO2004074480A1; CN100532550C; EP1595953A4; CN1748028A; KR20050106398A; CA2516360C; AU2004213716A1; AU2004213716B2; US7632639B2; EP1595953A1; ATE552339T1; JP4255472B2; KR101111568B1; CA2516360A1

Abstract

ＰＡＬＳＡＲ法によりＤＮＡチップにおける変異遺伝子の検出感度を向上させ、効率よくシグナルの増幅を確立させ、さらにＰＡＬＳＡＲ法に用いるオリゴヌクレオチド・プローブのデザインを工夫することにより簡便な検出を確立させることができるようにした変異遺伝子検出のためのシグナル増幅方法を提供する。ＤＮＡリガーゼを用いたライゲーション反応と、オリゴヌクレオチドの二本鎖の規則的な高次構造である自己集合体を形成する自己集合反応とを有し、ＤＮＡチップにおける変異遺伝子の検出感度を向上させるようにした。

Description

明細書変異遺伝子検出のためのシグナル増幅方法，技術分野

本発明は、ライゲーション反応及び自己集合体を形成する自己集合反応を用いて、 DNAチップ、 DNAマイクロアレイ、マイクロウェル又は球状ビ —ズ (本発明では、 DNAチップ、 DN Aマイクロアレイ、マイクロウェル又は球状ビーズを DN Aチップと総称する。）の変異遺伝子の検出感度を向上させることができるシグナル増幅方法に関する。背景技術

従来の遣伝子変異検出は、オリゴヌクレオチド同士を夕一ゲットに結合させ DNAリガ一ゼを用いて連結させる OLA ( Oligonucleotide Ligation Assay)法（例えば..米国特許第 4, 9 8 8 , 6 1 7号明細書及び D. Nickerson. Proc Natl. Acad. ScL, vol.87, pp.8923-8927 (1990). 参照。）、標識した d d N T P を用い一塩基伸長させる T D I ( Template-directed dye- terminator incorporation) 法 (例 J¾、 Chen A et al" Nucleic Acias Research, vol.25, No.2, pp.347-353 (1997). 参照。）、インベーダー法（例えば、米国特許第 5, 9 8 5, 5 5 7号明細書参照）等、様々な方法を利用しているが、上記の方法は、マルチプレックスやコスト、汎用性などに課題を持つ。

また、表面を特殊加工したスライドガラスなどの支持体に多数の D N Aプローブを高密度に固定し、標識したターゲットもしくはシグナル検出用プロ —ブをハイプリダイゼーシヨンさせシグナルを検出する技術は、従来から用いられてきたサザンプロット法と比較して、感度が十分の一と低く（例えば、村松正明ら、「DNAマイクロアレイと最新 P CR法」秀潤社、 85-86，2000. 参照。）、反応時間が長いという課題があった。

上記の問題を鑑み、本発明者らは酵素を使用しない新規な等温核酸増幅法を報告した（例えば、特許第 3267 576号公報参照。）。こ-の方法は、 3 箇所の領域から構成される一対のオリゴヌクレオチド（HoneyComb Probe、以下、 HCPと称する。）を用いる方法であり、第一 HCPと第二 HCPの各々の 3箇所の領域は互いに相補的な塩基配列を有し、両者を反応させた場合、領域の 1箇所のみとハイプリダイズする様に塩基配列を工夫したものである。この工夫により、一対の HC Pを反応させた場合、互いにハイブリダィズし、 HCPの自己集合反応により集合体を形成させることができる（以下、この自己集合反応による集合体の形成法を P A L S A R法と称する。）。発明の開示

上記した従来技術の現状に鑑み、本発明者らは、上記した P AL S AR法を用いて、変異遺伝子の検出感度を高くすべく、鋭意研究を重ねた結果、本発明に到達したものである。

本発明は、 P AL S AR法により DNAチップにおける変異遺伝子の検出感度を向上させ、効率よくシグナルの増幅を確立させ、さらに PAL S AR 法に用いるオリゴヌクレオチド*プローブのデザインを工夫することにより簡便な検出を確立させることができるようにした変異遺伝子検出のためのシグナル増幅方法を提供することを目的とする。

上記問題を解決するため、本発明の変異遺伝子検出のためのシグナル増幅方法の第 1の態様は、 DNAリガーゼを用いたライゲーシヨン反応と、オリゴヌクレオチドのニ本鎖の規則的な高次構造である自己集合体を形成する自己集合反応とを有し、 DN Aチップにおける変異遺伝子の検出感度を向上させるものである。本発明の変異遺伝子検出のためのシグナル増幅方法の第 2の態様は、捕捉用プローブと第 1プローブを夕一ゲット D N Aにハイプリダイズさせる第 1工程、夕ーゲット D N Aの変異部位が該捕捉用プローブと相補的な場合、 D N Aリガーゼを用いたライゲーシヨン反応により前記捕捉用プローブと前記第 1プローブを連結させる第 2工程、前記夕ーゲット D N Aを除去させる第 3工程、及び複数のオリゴヌクレオチド ·プローブを添加し、該オリゴヌクレオチド ·プローブの自己集合反応により自己集合体を形成させ、シグナルを増幅させる第 4工程を有し、前記捕捉用プローブと前記第 1プローブの塩基配列が、前記第 1工程において、前記捕捉用プローブの末端が前記夕 —ゲット D N Aの変異部位に位置し且つ該末端と前記第 1プローブが隣接する状態でタ一ゲット D N Aとァニーリングするように構成されており、前記複数のオリゴヌクレオチド 'プローブの少なくとも一つが前記第 1プロ一プと相補的な領域を有することを特徴とする。上記シグナル増幅方法により、 D N Aチップにおける変異遺伝子の検出感度を向上させることができる。上記第 1工程において、捕捉用プローブと第 1プローブの夕ーゲット D N Aへの結合は、捕捉用プローブと第 1プロ一プをターゲット D N Aに同時に結合させても良く、捕捉用プローブをターゲット D N Aに結合させた後、第 1プローブと夕ーゲット D N Aを結合させても良く、第 1プローブを夕ーゲッ 1、 D N Aに結合させた後、捕捉用プローブとターゲット D N Aを結合させても良く、結合順序は特に限定されない。

上記自己集合反応に用いるオリゴヌクレオチド ·プローブの塩基配列を、あらかじめ上記第 1プローブと相補的な配列にすることが好適である。

上記自己集合反応として、第 1に、互いに相補的な部分が n ( n≥ 3 ) 力所の数から構成される一対のオリゴヌクレオチド ·プローブ（本発明では、 H C Pと称する。）を用いて、互い違いに交差するようにハイブリダィゼ一ションさせることにより、オリゴヌクレオチドが自己集合し、二本鎖の自己集合体を形成させる自己集合反応を利用することができる。一種類の変異遺伝子を検出する場合、上記一対の H C Pの一方が上記第 1プローブとして用いることができるように構成することが好ましい。

上記自己集合反応として、第 2に、 N o . 1及び N o . 2の一対のオリゴヌクレオチドの各ォリゴヌクレオチドを 3 ' 側領域、中央領域、及び 5 ' 側領域の 3つの領域に分け、各オリゴヌクレオチドの中央領域を互いに相補的な塩基配列としてダイマープローブを形成するとともに、 3 '側領域及び 5 ' 側領域を互いに非相補的な塩基配列とした一対のダイマー形成用プローブを複数対含む第 1の系と、

N o . 3及び N o . 4の一対のオリゴヌクレオチドの各オリゴヌクレオチドを 3 ' 側領域及び 5 ' 側領域の 2つの領域に分け、各ォリゴヌクレオチドの 3，側領域及び 5 '側領域を互いに非相補的な塩基配列とした一対の架橋プ口一ブを複数対含む第 2の系とを有し、該架橋プロ一ブを該ダイマ一形成用プローブより形成されるダイマーを架橋することが可能な塩基配列とし、該プローブをハイプリダイゼ一シヨンさせることによりオリゴヌクレオチドが自己集合し、二本鎖の自己集合体を形成させる自己集合反応を利用できる。上記一対のダイマー形成用プロ一ブ及び上記一対の架橋プローブを、該プロ —ブのいずれか一つ、より好ましくは一対のダイマー形成用プローブの一方が上記第 1プローブとして用いることができるように構成することが好適である。

上記プローブの塩基配列を、第 1の系の N o . 1—オリゴヌクレオチドの 3 ' 側領域と第 2の系の N o . 3—オリゴヌクレオチドの 3 ' 側領域、第 1 の系の N o . 2—オリゴヌクレオチドの 5 ' 側領域と第 2の系の N o . 4 - オリゴヌクレオチドの 5 ' 側領域,、第 2の系の N o . 4 _オリゴヌクレオチドの 3 ' 側領域と第 1の系の N 0 . 2—オリゴヌクレオチドの 3 ' 側領域、第 2の系の N o . 3—オリゴヌクレオチドの 5 ' 側領域と第 1の系の N o . 1一オリゴヌクレオチドの 5 '側領域をそれぞれ相補的な塩基配列とすることができる。

上記プローブの塩基配列を、第 1の系の No. 1—オリゴヌクレオチドの 3 ' 側領域と第 2の系の N 0. 3—オリゴヌクレオチドの 3 ' 側領域、第 1 の系の No. 2—オリゴヌクレオチドの 5 ' 側領域と第 2の系の N o . 3— オリゴヌクレオチドの 5 ' 側領域、第 1の系の No. 2—オリゴヌクレオチドの 3，側領域と第 2の系の N o . 4一オリゴヌクレオチドの 3 ' 側領域、第 1の系の N o. 1—オリゴヌクレオチドの 5 ' 側領域と第 2の系の No. 4一オリゴヌクレオチドの 5 '側領域をそれぞれ相補的な塩基配列とすることができる。

上記夕一ゲット DN Aに一本鎖の DN A又は二本鎖の DN Aを用いることができる。上記シグナル増幅方法において、直接ターゲット DNAとして用いられるのは、一本鎖の DNAであるが、二本鎖を解離することにより、二本鎖の DNAも使用することができる。例えば、 DNAを铸型にした遺伝子増幅法（例えば，？じ尺法ゃ1^ 1 法等）を用いて増幅された DNAを使用することが可能である。また、標的遺伝子が RN Aである場合、 RNAを铸型にした遺伝子増幅法（例えば、 RT— P CR法等）を用いて増幅された D N Aを使用することも可能であり、本発明に含まれるものである。

上記 DN Aチップが、夕一ゲット DN Aを捕捉するための捕捉用プローブを結合する支持体を有し、該支持体として、マイクロプレート型、スライドグラス型、微粒子型、又は電気伝導性の基板型等の支持体を用いることが好適である。上記マイクロプレート型と微粒子型の支持体の材質にはプラスチックゃポリスチレン等を使用することができる。また、スライドグラス型の支持体では、ガラスやプラスチック等の素材を使用することができる。電気伝導性の基板型の支持体には、金電極や I TO電極（indium oxide電極）などを使用することができる。上記自己集合体に対して、あらかじめ発色系酵素、発光系酵素、又はラジオアイソトープ等で標識した標識プローブをハイブリダィゼーシヨンさせて自己集合体の存在を検出することが可能である。

上記自己集合体に対して、核酸と結合する性質を持った蛍光物質を加え、その蛍光物質の光化学的な変化により上記自己集合体の存在を検出することが可能である。

あらかじめ自己集合体を形成するォリゴヌクレオチドを蛍光物質で標識し、上記自己集合体の存在を蛍光物質の光化学的な変化により検出することが可能である。

あらかじめ自己集合体を形成するォリゴヌクレオチドをラジオアイソト —プで標識し、上記自己集合体の存在をラジオアイソト一プにより検出することが可能である。

あらかじめ自己集合体を形成するオリゴヌクレオチドを発色系酵素又は発光系酵素で標識し、上記自己集合体の存在を蛍光物質の光化学的な変化により検出することが可能である。

上記オリゴヌクレオチドは-, D N A , R N A、 P N AまたはL N Aのぃずれかから選ばれる塩基から構成される。図面の簡単な説明

図 1は、本発明のシグナル増幅方法の工程順の第 1〜第 4の例におけるステツプ 1 0 0を原理的に示す模式図である。

図 2は、本発明のシグナル増幅方法の工程順の第 1〜第 4の例におけるステツプ 1 0 2を原理的に示す模式図である。

図 3は、本発明のシグナル増幅方法の工程順の第 1の例におけるステップ 1 1 0を原理的に示す模式図である。

図 4は、本発明のシグナル増幅方法の工程順の第 1の例におけるステップ 1 1 2を原理的に示す模式図である。

図 5は、本発明のシグナル増幅方法の工程順の第 1の例におけるステップ 1 1 4を原理的に示す模式図である。

図 6は、本発明のシグナル増幅方法の工程順の第 1の例におけるステップ 1 1 6を原理的に示す模式図である。

図 7は、本発明のシグナル増幅方法の工程順の第 2の例におけるステップ 1 2 4を原理的に示す模式図である。

図 8は、本発明のシグナル増幅方法のェ程順の第 2の例におけるステップ 1 2 6を原理的に示す模式図である。

図 9は、夕一ゲット D N Aの変異部位が捕捉用プローブの末端と相補していない塲合の参考例におけるステップ 2 0 0を原理的に示す模式図である。図 1 0は、ターゲット D N Aの変異部位が捕捉用プローブの末端と相補していない場合の参考例におけるステップ 2 0 2を原理的に示す模式図である。

図 1 1は、ターゲット D N Aの変異部位が捕捉用プローブの末端と相補していない場合の参考例におけるステップ 2 0 4を原理的に示す模式図である。

図 1 2は、ターゲット D N Aの変異部位が捕捉用プローブの末端と相補していない場合の参考例におけるステップ 2 0 6を原理的に示す模式図である。

図 1 3は、本発明のシグナル増幅方法の工程順の第 3の例におけるステツプ 1 3 6を原理的に示す模式図である。

図 1 4は、本発明のシグナル増幅方法の工程順の第 3の例におけるステツプ 1 3 8を原理的に示す模式図である。

図 1 5は、本発明のシグナル増幅方法の工程順の第 4の例におけるステツプ 1 4 6を原理的に示す模式図である。図 1 6は、本発明のシグナル増幅方法の工程順の第 4の例におけるステツプ 1 4 8を原理的に示す模式図である。

図 1 7は、本発明のシグナル増幅方法の工程順の第 5の例におけるステツプ 1 5 0を原理的に示す模式図である。

図 1 8は、本発明のシグナル増幅方法の工程順の第 5の例におけるステツプ 1 5 2を原理的に示す模式図である。

図 1 9は、本発明のシグナル増幅方法の工程順の第 5の例におけるステツプ 1 5 4を原理的に示す模式図である。

図 2 0は、本発明のシグナル増幅方法の工程順の第 5の例におけるステツプ 1 5 6を原理的に示す模式図である。

図 2 1は、本発明のシグナル増幅方法のェ程順の第 6の例におけるステツプ 1 6 0を原理的に示す模式図である。

図 2 2は、本発明のシグナル増幅方法の工程順の第 6の例におけるステツプ 1 6 2を原理的に示す模式図である。

図 2 3は..本発明のシグナル増幅方法の工程順の第 6の例におけるステツプ 1 6 3を原理的に示す模式図である。

図 2 4は、本発明のシグナル増幅方法の工程順の第 6の例におけるステツプ 1 6 4を原理的に示す模式図である。

図 2 5は、本発明のシグナル増幅方法の工程順の第 6の例におけるステップ 1 6 5を原理的に示す模式図である。

図 2 6は、本発明のシグナル増幅方法の工程順の第 6の例におけるステツプ 1 6 6を原理的に示す模式図である。

図 2 7は、実施例 1の結果を示す写真である。

図 2 8は、実施例 2の結果を示す写真である。発明を実施するための最良の形態以下に本発明の実施の形態を添付図面に基づいて説明するが、これらの実施の形態は例示的に示されるもので、本発明の技術思想から逸脱しない限り種々の変形が可能であることはいうまでもない。

図 1〜図 6は、本発明のシグナル増幅方法の工程順の第 1の例を原理的に示す模式図である。第 1の例は、ターゲット DNA (1 0 a)の変異部位（ 1 1 a) が捕捉用プローブ（12 a) の末端（1 3 a) と相補している場合を示す。さらに、第 1の例は、互いに相補的な 3領域から構成され、自ら自己集合して集合体を形成することができる一対のオリゴヌクレオチド ·プロ一ブ [即ち、一対の HC P ； HC P— 1 (5'-Χ-Υ-Ζ-3') ( 1 6 a) 及び HC P - 2 (5'-Χ'-Υ'-Ζ'-3') (1 8 a)] を用いた PAL S AR法を利用したシグナル増幅方法であり、該一対の H CP (1 6 a, 1 8 a) は、図 3に示した如く、あらかじめ蛍光物質（22) で標識されており、 HCP— 1 (1 6 a) は夕一ゲット DNA (1 0 a) と相補的な領域を持ち、捕捉用プローブ（1 2 a) と隣接して夕ーゲット DNA (1 0 a) にハイプリダイズするように構成されている。

図 1に示した如く、支持体 ( 14) 上にターゲット DN A (1 0 a) に相補的な領域を有し且つ該夕一ゲット DNA ( 1 0 a) の遺伝子変異部位（ 1 1 a) が末端（ 1 3 a) に位置する捕捉用プローブ（1 2 a) を結合させ、ターゲット DN A (1 0 a) を加える (ステップ 1 00 )。次に図 2に示した如く、ターゲット DNA ( 1 0 a) を捕捉した後（ステップ 1 02)、図 3に示した如く、そのターゲット DN A ( 1 0 a) と相補的な領域を持ち、自ら自己集合して集合体を形成することができる蛍光物質（22) で標識された片方の HC P— 1 (1 6 a) を捕捉用プローブ（1 2 a) と隣り合った形で結合させる（ステップ 1 1 0)。

タ一ゲット DNA (1 0 a) の変異部位（1 1 a) と捕捉用プローブ（1 2 a) の末端（ 1 3 a) とが相補されているため、図 4に示した如く、ライゲーション反応により、捕捉用プローブ（1 2 a) と HCP— 1 (1 6 a) が連結される（ステップ 1 1 2)。ライゲーシヨン反応後、図 5に示すように、ターゲット DN A ( 1 0 a) を除去する（ステップ 1 14)。図 5は、ターゲット DNA ( 1 0 a) を解離させ、 HCP— 1 (1 6 a) を連結させた捕捉用プローブ（1 2 a) が支持体（14) に結合している状態を示す。図 6に示したごとく、一対の HC P (1 6 a, 1 8 a) を加えて、自己集合反応により自己集合体（20 a) を形成させ、シグナルを増幅することがでさる (ステップ 1 1 6)。

図 7及び図 8は、本発明のシグナル増幅方法の工程順の第 2の例を原理的に示す模式図である。第 2の例は、一対の HC P ( 1 6 a, 1 8 a) を用いた PAL SAR法を利用したシグナル増幅方法であり、且つ夕一ゲット DN A (1 0 a) と相補的な領域を持ち、蛍光物質 (22) で標識されていない一対の HC P ( 1 6 a, 1 8 a) を用いる例を示す。

上記した第 1の例と同様にして、ステップ 1 00及びステップ 10 2を行つた後. そのターゲット DNA ( 1 0 a) と相補的な領域を持ち、自ら自己集合して集合体を形成することができる片方の HCP— 1 ( 1 6 a) を捕捉用プローブ（ 1 2 a) と隣り合った形で結合させる。

ライゲ一ション反応により、捕捉用プローブ（1 2 a) と HCP— 1 (1 6 a) を連結させた後、ターゲット DN A ( 1 0 a) を除去する (ステップ 1 20 )。一対の HC P (1 6 a, 1 8 a) を加えて、自己集合反応により自己集合体（20 b) を形成させた後（ステップ 1 2 2)、図 7に示したごとく、形成された自己集合体（20 b) に対してインターカレ一夕一（24) を揷入し（ステップ 1 24)、図 8に示した如く、シグナルを増幅することができる（ステップ 1 26)。なお、ステップ 1 22とステップ 1 24を同時に行うことも可能である。

図 9〜図 1 2は、ターゲット DNA (1 0 b) の変異部位（l i b) が捕捉用プローブ（12 a) の末端（1 3 a) と相補していない場合の参考例を原理的に示す模式図である。図 9に示した如く、夕ーゲッ卜 DNA (1 0 b) を捕捉した後（ステップ 20 0)、図 1 0に示した如く、その夕一ゲット D NA (1 0 b) と相補的な領域を持ち、自ら自己集合して集合体を形成することができる蛍光物質（22) で標識された片方の HC P— 1 (1 6 a) を捕捉用プローブ（1 2 a) と隣り合った形で結合させる（ステップ 202)。次に図 1 1に示した如く、ターゲット DNA ( 1 0 b) の変異部位（l i b) と捕捉用プロ一ブ（ 1 2 a) の末端（1 3 a) とが相補されないため、ライゲーション反応が行われず (ステップ 204)、図 1 2のようにターゲット DNA ( 1 0 b) を解離させると (ステツプ 206 )、捕捉用プローブ（ 1 2 a) のみ支持体 ( 14) に結合した状態となり.，その後、一対の HC P ( 1 6 a, 1 8 a) を加えることにより形成される自己集合体 ( 20 a) は、捕捉用プローブ (1 2 a) に結合せず、洗浄等により除去されるため、シグナル増幅は行われない。

図 1 3及び図 14は、本発明のシグナル増幅方法の工程順の第 3の例を原理的に示す模式図である。第 3の例は夕ーゲット DNA ( 1 0 a) の変異部位（1 1 a) が捕捉用プローブ (1 2 a) の末端 ( 1 3 a) と相補している場合を示す。さらに、第 3の例は、自らダイマーを形成する一対のダイマ一形成用プロ一ブ [ダイマー形成用プローブ一 1， 2 (5'-X-a_b-3'， 5'-d-a'-e_3，) ( 2 6, 28 )] 及び該ダイマー形成用プローブより形成されるダイマーを架橋することが可能な一対の架橋プローブ [架橋プローブ一 1 , 2 (5'-d，-b'-3'， 5'-X'-e'-3，）（ 3 0, 3 2)] を用いた P A L S A R法を利用したシグナル増幅方法であり、あらかじめ蛍光物質（22) で標識された一対のダイマー形成用プロ一ブ（ 26, 2 8 ) により形成されたダイマーを用いた場合の例を示す。なお、該ダイマー形成用プローブ— 1 (26) は、夕一ゲット DNA (1 0 a) と相補的な領域を持ち、且つ捕捉用プローブ（1 2 a) と隣接してターゲット DNA (1 0 a) にハイブリダィズするように構成されている。 .

上記した第 1の例と同様にして、ステップ 1 00及びステップ 1 02を行つた後、そのターゲット DNA (1 0 a) と相補的な領域を持ち、蛍光物質 (22)で標識された一対のダイマー形成用プローブ一 1 , 2 ( 26, 28) より形成されたダイマ一を捕捉用プローブ（1 2 a) と隣り合った形で結合させる（ステップ 1 30)。次に、ライゲ一シヨン反応により、捕捉用プロ —ブ (1 2 a) とダイマ一形成用プロ一ブー 1 (26) を連結し (ステップ 1 3 2)、ターゲット DNA (1 0 a) を解離させた後 (ステップ 1 34)、図 1 3に示した如く、ダイマー形成用プロ一ブー 1， 2 ( 2 6, 28) より形成されたダイマー及び架橋プローブ一 1， 2 (30， 32) を添加し、上記プロ一ブ（26， 28， 30及び 32 ) をハイブリダイゼ一シヨンさせ（ステツプ 1 36)、図 14に示した如く、ダイマ一形成用プロ一ブ（26, 2 8) と架橋プローブ（30， 32) の自己集合反応により自己集合体（20 c ) を形成させ、シグナル増幅させることができる（ステップ 1 38)。図 1 5及び図 1 6は、本発明のシグナル増幅方法の工程順の第 4の例を原理的に示す模式図である。第 4の例は、自らダイマーを形成する一対のダイマー形成用プローブ [ダイマ一形成用プローブ— 1， 2 ( 26, 28)] 及び該ダイマ一形成用プローブより形成されるダイマーを架橋することが可能な一対の架橋プローブ（ 30， 32) を用いた PAL SAR法を利用したシグナル増幅方法であり、一対のダイマー形成用プローブにより形成されたダイマ一を用いて、ダイマ一形成用プロ一ブ（26, 28) 及び架橋プロ一ブ（ 30, 32) を標識しない場合の例である。

上記した第 1の例と同様にして、ステップ 100及びステップ 1 02を行つた後、そのターゲット DNA (1 0 a) と相補的な領域を有する一対のダイマ一形成用プローブ一 1， 2 ( 2 6, 28 ) より形成されたダイマ一を捕捉用プローブ（1 2 a) と隣り合った形で結合させる（ステップ 140)。ライゲーション反応により、捕捉用プロ一ブ（1 2 a) とダイマー形成用プローブ— 1 (26) を連結させた後、夕一ゲット DNA (1 0 a) を除去する（ステップ 142)。一対のダイマ一形成用プローブ（ 26, 28) より形成されたダイマー及び一対の架橋プローブ（ 30 , 32) を加えて、自己集合反応により自己集合体（20 d)を形成させた後（ステップ 144)、図 1 5に示したごとく、形成された自己集合体 ( 20 d ) に対してィンターカレーター（24) を挿入し（ステップ 146)、図 1 6に示した如く、シグナルを増幅することができる（ステップ 148)。なお、ステップ 144 とステップ 146を同時に行うことも可能である。

上記した例では、自己集合体を形成するオリゴヌクレオチド ·プローブの一つを第 1プローブと同一とした場合の例を示したが、必ずしも同一である必要はなく、第 1プローブとオリゴヌクレオチド ·プローブの少なくとも一つが結合できるように構成されているプローブを用いることができる。上記した例では.,予め支持体に結合させておいた捕捉用プローブを用いたが、捕捉用プローブと支持体とを結合させる段階は、夕ーゲット DNAを除去する段階までであればいつでもよく、特に限定されない。例えば、捕捉用プローブとターゲット DN Aを結合させた後、捕捉用プローブ、夕一ゲット DNA、第 1プローブが全て結合した後、及びライゲ一シヨン反応後等が挙げられる。

図 1 7〜図 20は、本発明のシグナル増幅方法の工程順の第 5の例を原理的に示す模式図である。第 5の例は、词時に複数の変異遺伝子を検出する方法であり、各ターゲット DNA ( 1 0 e , 1 0 f ， 1 0 g) の相補的配列を先端に持ち、 2箇所の H CP領域を含む第 1プローブ（34 e， 34 f , 3 4 g) と、一対の HC P ( 1 6 e， 1 8 e) を用いる例を示す。第 1プロ一ブは標的とする遺伝子の数だけ必要であり、この例では 3種類の遺伝子（1 4

0 e， 1 0 f 及び 1 0 g) の例を示しているため、先端領域の異なる 3種類の第 1プローブ（ 34 e , 34 f 及び 34 g) を用いる。第 1プローブの先端領域を除く 2領域は共通の H CPの配列を有しているため、第 1プローブの種類に関わらず H CPは一対のみでシグナルを増幅することができる。図 1 7に示したごとく支持体（ 14)上にターゲット DNA— 1 (1 0 e) に相補的な領域を有し且つ該ターゲット DNAの遺伝子変異部位（l i e) が末端（1 3 e) に位置し、該末端の塩基がそれぞれ異なる 4種の捕捉用プローブ（1 2 e；)、ターゲット DNA— 2 ( 1 0 f ) に相補的な領域を有し且つ該ターゲット DN Aの遺伝子変異部位（ 1 1 ί) が末端（1 3 ί) に位置し、該末端の塩基がそれぞれ異なる 4種の捕捉用プローブ（1 2 f )、並びに夕ーゲッ卜 DNA— 3 (1 0 g) に相補的な領域を有し且つ該夕一ゲット DN Aの遺伝子変異部位 (l l g) が末端 ( 1 3 g) に位置し、該末端の塩基がそれぞれ異なる 4種の捕捉用プローブ（1 2 g) を別々に結合させる (ステップ 1 50)。なお、図 1 7〜図 20において、末端のみ異なる捕捉用プローブ及び該末端はそれぞれ同一符号で示した。次に図 1 8に示した如く、夕ーゲット DNA (1 0 e， 1 0 f 及び 1 0 g ) 及び第 1プローブ（3 4 e , 34 f 及び 34 g) を捕捉用プローブ（1 2 e， 1 2 f 及び 1 2 g) に応じて結合させる（ステップ 1 5 2)。変異部位が相補されていない場合でも末端部分を除き同様に結合するが、この図には末端部分が相補されている場合のみを示した。次に図 1 9に示した如く、ライゲーション反応後ターゲット DNA ( 1 0 e , 1 0 f 及び 1 0 g) 及び未反応プロ一ブを除去する (ステップ 1 54)。

図 20に示した如く、一対の H C P (1 6 e， 1 8 e) を加え、自己集合体（2 0 e)を形成させシグナルを増幅することができる（ステップ 1 56)。なお、第 5の例では、遺伝子変異部位について 4塩基全てを分析する場合を示したが、捕捉用プローブ末端の塩基は必要に応じて適宜選択すればよく、特に限定されないものである。

図 2 1〜図 2 6は、本発明のシグナル増幅方法の工程順の第 6の例を原理的に示す模式図である。第 6の系は、ライゲーシヨン反応を 2箇所で行い、第 1プローブ（34 h) に HCP— 1 ( 1 6 h) と捕捉用プローブ（1 2 h) を連結させるという特徴を持つ。 HC P— 1 ( 1 6 h)、第 1プロ一ブ（ 3 4 h)、捕捉用プローブ（1 2 h) は、お互いに隣接するように設計されている。同時に複数の変異遺伝子を検出する場合、第 5の例と同様、第 1プローブの先端領域を各ターゲット DN Aに相補的にする以外は、第 2プローブ、 HC P—対とも遺伝子の種類に関わらず共通のオリゴヌクレオチド'プロ一ブを用いることができる。 '

図 2 1は、第 1プローブ ( 34 h)、第 2プローブ (36)、タ一ゲッ卜 D N A (1 O h) 及び支持体 (14) 上に固定された捕捉用プロ一ブ ( 1 2 h) を示す (ステップ 1 60)。第 1プローブ ( 34 h ) はターゲット DNA (1 0 h)に相補的な配列を有し且つ HC P _ 1 (1 6 h)の配列を 1箇所有し、第 2プローブ（3 6) は HCP— 2 ( 1 8 h ) と同じ配列を 2箇所有する。図 22に示したごとく .. 第 1プローブ ( 34 h ) は第 2プローブ (36) とターゲット DNA(1 0 h)の両者とハイプリダイズする（ステップ 1 62)。図 23に示した如く、 HCP— 1 ( 1 6 h ) を加ぇハイブリダイゼ一ションを行い、 HCP— 1 ( 1 6 h) と第 2プローブ (3 6) がハイブリダィズすることにより HCP— 1 ( 1 6 h) と第 1プローブ（ 34 h) が隣接する。この結果、第 1プローブ（34 h) の両末端がそれぞれ捕捉用プローブ（1 2 h) と HCP— 1 ( 1 6 h) に隣接した状態となる（ステップ 1 6 3)。なお、ステップ 1 62とステップ 1 6 3は、同時に行うことも可能である。図 24、図 25に示した如く、捕捉用プローブ（ 1 2 h) の末端部分（ 1 3 h) が夕一ゲット DNA ( 1 0 h) の変異部位（ 1 1 h) と相補している場合ライゲーション反応後（ステップ 1 64)、ターゲット DNA (1 0 h)、 6 第 2プローブ（3 6) 及び未反応プローブを除去することにより、捕捉用プローブ（1 2 h)、第 1プローブ（34 h)、 HC P— 1 ( 1 6 ) が 1本に連結された状態となる（ステップ 1 6 5)。図 2 6に示す如く一対の HC P ( 1 6 h, 1 8 h) を加えることにより、自己集合体（2 0 h) が形成され (ステップ 1 6 6)、シグナルを増幅することができる。

本発明のシグナル増幅方法において、一対のオリゴヌクレオチド ·プロ一ブにあらかじめ検出のための標識物質として、 ¹²⁵ Iや³² P等のラジオアイソトープ、ジゴキシゲニンやァクリジニゥム ·エステル等の発光物質や C y 3 · Cy 5等の蛍光物質、 4—メチルゥンベリフェリルリン酸等の蛍光物質を利用するためのピオチン等、蛍光共鳴エネルギー転移 (F RET) を利用するためのドナ一蛍光色素とァクセプ夕一蛍光色素を付加させておき、ターゲット DNAを検出することも可能である。

核酸と結合する性質を有する色素を添加することにより、夕一ゲット DN Aを検出することも可能である。図 8及び図 1 6に示した如く、インター力レーターのような核酸と結合する性質を有する蛍光物質を用いてターゲッ卜 DNAを検出することが好適である。蛍光物質としては、核酸と結合する性質を有する蛍光物質であれば、特に限定されないが、例えば、 SYBR Green 1 stain, SYBR Ltreen II stam、 SYBR Green Gold stain, Vista Green stain, Gelstar stain、 Radiant Red stain、 PicoGreen > RiboGreen , OllGreen, Hoechst 33258 (Bis-Benzimide), Propidium Iodide > YO-PRO-1 Iodide, YO-PEO-3 Iodide (以上、 Molecular Probe 社製）、臭化工チジゥム、 Distamycin A、 TOTO、 Psoralen, ァクリジニゥムオレンジ（Acridine Orange)、 AOAO(homodimer)等が使用できる。

上記したオリゴヌクレオチド ·プローブを構成する核酸は、通常 DNA又は RNAで構成されるが、核酸類似体でも構わない。核酸類似体として、例えば、ペプチド核酸（PNA、例えば、国際公開第 9 2 / 2 0 7 0 2号パンフレット参照。）や Locked Nucleic Acid (LNA、例えば、 KoshkinAAet al. Tetrahedron 1998.54, 3607-3630. 、 Koshkin AA et al. J. Am. Chem. Soc.1998.120, 13252-13253. 、及び Wahlestedt C et al. PNAS.2000.97, 5633-5638. 参照。）が挙げられる。また、一対のオリゴヌクレオチド ·プローブは、通常、同じ種類の核酸で構成されるが、例えば DN Aプローブと R NAプローブが一対になっても差し支えない。即ち、プローブの核酸の種類は DNA、 RNA又は核酸類似体（例えば PNAや LNA等）から選択することができる。又、一つのプローブ内での核酸組成は一種類、例えば DNA のみから構成される必要がなく、必要に応じて、例えば、 DNAとRNAから構成されるオリゴヌクレオチド ·プローブ（キメラプローブ) を使用することも可能であり、本発明に含まれる。

本発明における標的遺伝子測定用試料は、該核酸を含む可能性のあるあらゆる試料が適用できる。標的遺伝子は試料より適宜調製または単離したものでもよく、特に限定されない。たとえば、血液、血清、尿、糞便、脳脊髄液、組織液、細胞培養物等の生体由来試料ウィルス、細菌、カビ等の含有または感染した可能性のある試料等が挙げられる。また、試料中の標的遺伝子を公知の方法で増幅した核酸も使用可能である。

なお、図において、先端銳角部は 3'末端を示し、起端黒丸印は 5'末端を示すものである。

(実施例）

以下に実施例をあげて本発明をさらに具体的に.説明するが、これらの実施例は例示的に示されるもので限定的に解釈されるべきでないことはいうまでもない。

(実施例 1 )

1. 目的 P A L S A R法を用いて変異末端部位の塩基の違いによる変異遺伝子の検出を試みた。

2 . 材料

以下に実施例 1で用いたォリゴヌクレオチド ·プローブの塩基配列を示す。 5 ( 1 ) キヤプチヤープローブ（捕捉用プローブ）

C P _ 1— A： 5' (ァミノ基） -GG GGAAGAGCAGAGATATACGTA-3' C P— 1一 T ： 5，（ァミノ基） -GG GGAAGAGCAGAGATATACGTT- 3' C P— 1— G ： 5' (ァミノ基) -GG GGAAGAGCAGAGATATACGTG- 3' C P— 1— C ： 5，（ァミノ基） -GG GGAAGAGCAGAGATATACGTG- 3' 10 ( 2 ) ターゲット遺伝子— 1 (Hemochromatosis遺伝子の塩基配列をもとに合成。変異部位 ( 8 4 5番目アミノ酸) を下線で示した。)

ターゲット遺伝子— 1— T ：

5'-GGC CTGGGTGCTCCACCTGG TACGTATATCTCTGCTCTTCC-3' タ一ゲッ卜遺伝子— 1— A：

丄 b 0 Ur jU

し丄丄し丄し丄し丄し丄丄しし o

夕一ゲット遺伝子— 1 一 C ：

5'-GGC CTGGGTGCTCCACCTGG CACGTATATCTCTGCTCTTCC-3' ターゲット遺伝子— 1 - G ：

5'-GGC CTGGGTGCTCCACCTGG GACGTATATCTCTGCTCTTCC-3' 20 ( 3 ) 第 1プローブ

第 1プローブ一 1 a ： 5，（リン酸化) -CCAGGTGGAGCACCCAG CATA TGTAGCAGAGCGTAAGTCATGTCCACC-3' (Alexa532標識）

( 4 ) H C P

H C P - 1 _ 1 ：

25 5' (Cy3標識） -CCAGGTGGAGCACCCA GCATATGTAGCAGAGC GTA AGTCATGTCCACC-3' HCP- 1 - 2 ：

5' (Cy3標識） -TGGGTGCTCCACCTGG GCTCTGCTACATATGC GGT GGACATGACTTAC-3'

ハイブリダィゼ一シヨン溶液として、 [終濃度 6 XS S C、 0. 1 mg/ mLサケの精子 DNA、 5 Xデンハルト溶液、 0. 2 %SD S]を調製した。キヤプチャ一プローブを固定する基盤としてアミノ修飾オリゴ DNA固定マイクロアレイ用コ一トスライドグラス（MAT S UN AM I GL AS S社製) を用い、スポッ夕一として、 DNAマイクロアレイヤー 32ピン型 (G r e i n e r b i o— o n e社製）を用いた。

3. 方法

3— 1. スライドグラスの作製

a) キャプチヤープローブのスボッティング

各キヤプチヤープローブ ( 1 0 O pmo I / L) とスボッティング溶液 (MATSUNAM I G L A S S社製）を等量混ぜ、 4種のプローブ溶液を調製した。得られたプローブ溶液をスライドグラス上に N= 4となるようスポットした。異なるプローブ溶液をスボッ卜する際は、滅菌水、及び冷ェ夕ノールにてピンを洗浄風乾した。スボット後のスライドグラスは、湿潤箱に入れ遮光し、ー晚静置した。

b) キヤプチヤープローブの固定

ブロッキング溶液（MAT S UN AM I GL AS S社製) 1つ、滅菌水 2つ、冷メタノール 1つをそれぞれ染色バットに用意し、ブロッキング溶液にて 20分、各滅菌水にて 3分、冷メタノールにて 3分、順次、スポッティング後のスライドグラスを浸し、固定後風乾させ、スライドグラスを作成した。

3— 2. 検出

a) ハイブリダィゼ一シヨン反応 4組のハイプリダイゼーション溶液に各ターゲット遺伝子をそれぞれ 3 0 pmo 1 ( 30 L) となるよう添加し、第 1プローブ 30 pmo l (3 O L) を加えた。 9 5° (：、 2分にて熱解離させた各溶液 2 5 Lを、前記キヤプチヤープローブを固定したスライドグラス上のチャンバ一内にて 4 2。、 2時間反応させ、キヤプチヤープローブ、夕一ゲット遺伝子、第 1プローブを八イブリダイズさせた。反応後のスライドは、 2 XS S C+ 0. 1 % SDS溶液で 2回、 1 X S S C溶液にて 1回、 0. 2 X S S C溶液にて 1回洗浄し風乾させた。

b) ライゲ一ション反応及びアルカリ変性

リガーゼは耐熱性リガーゼ（Tth DNA ligase) を用いた。このリガーゼ添付の緩衝液 (buffer) を用いて、液量 3 0 Lにリガーゼ (3 0 U) を添加し、この溶液の 2 5 ^ Lをチャンバ一内にて反応させた。反応条件は、 6 5。C 1 5分とした。

ライゲーション反応後、スライドグラスを 0. 2 X S S C溶液にて軽く洗浄し、 0. 2 5M N a OH溶液にて 1 0分間アルカリ処理を行い、未反応プロ一プ及び余剰プロ一ブを除去した。また、 N aOH溶液の中和には 0.

25 M HC 1溶液を用いた。変性後のスライドは、 2 XS S C+ 0. 1 %

S D S溶液で 2回、 1 X S S C溶液にて 1回、 0. 2 X S S C溶液にて 1回、洗浄し風乾させた。

C ) 自己集合体形成反応

八ィブリダイゼーション溶液に、 5 ' 末端をそれぞれ C y 3標識した一対の HCP (HCP— 1— 1及び HC P - 1 - 2) を終濃度 1 pmo 1 /a L となるよう加えた。 9 5° (：、 2分にて熱解離させたこの溶液 25 Lを、ァルカリ変性後の洗浄風乾させたスライドグラス上のチャンバ一内にて 6 8 °C、 2時間反応させ、自己集合体を形成させた。反応後のスライドは、 2 XS S C+ 0. 1 % S D S溶液で 2回、 1 X S S C溶液にて 1回、 0. 2 X S S C溶液にて 1回、洗浄し風乾させスライドグラス上の C y 3の蛍光を蛍光顕微鏡で観察した。結果を図 2 7に示す。

図 2 7に示した如く、ターゲット遺伝子の変異部位が捕捉用プローブと相補的な場合のみシグナルが増幅された。

(実施例 2 )

1. 目的

1 2種類の遺伝子におけるマルチプレックス（multiplex) 検出の検討を行った。

2. 材料

以下に実施例 2で用いたオリゴヌクレオチド ·プローブの塩基配列を示す _c ( 1 ) キヤプチャ一プローブ

CP- 1 -G ：実施例 1の C P - 1—Gと同一。

C P— 1 - A ：実施例 1の C P— 1— Aと同一。

CP— 2— T ： 5，（ァミノ基） -GCGCGGACATGGAGGACGTG!E-3，

CP- 2 -C ： 5，（ァミノ基） -GCGCGGACATGGAGGACGTGC-3' CP— 3— C : 5，（ァミノ基） -ATGCCGATGACCTGCAGAAG -3' C P - 3 - T ： 5' (アミノ基) -ATGCCGATGACCTGCAGAAGT-3' C P - 4— G ： 5，（ァミノ基） - CTTGAATTCCAAGAGCACACCi- 3' C P— 4— A : 5' (ァミノ基） -CTTGAATTCCAAGAGCACACA-3' C P - 5 - C ： 5' (ァミノ基) -GGAGAAGGTGTCTGCGGGAGC-3' C P _ 5— T ： 5' (ァミノ基) -GGAGAAGGTGTCTGCGGGAGT-3' C P— 6— A ： 5，（ァミノ基） -TGCTGGCTGAAATGGCAATGA-3' CP— 6— G : 5' (ァミノ基） -TGCTGGCTGAAATGGCAATGO:-3' C P— 7— A ： 5' (ァミノ基） -TGTTCTGGGTACTACAGCAGA-3' CP— 7— G : 5，（ァミノ基） -TGTTCTGGGTACTACAGCAGa-3' C P— 8— C ： 5' (ァミノ基） -TGGATGATTTGATGCTGTCC£-3， CP— 8— T : 5' (ァミノ基） -TGGATGATTTGATGCTGTCCIl-3， CP— 9— G : 5' (ァミノ基） -AATGCCAGAGGCTGCTCCCC -3， CP— 9— C : 5' (ァミノ基） -AATGCCAGAGGCTGCTCCCC£-3， CP— 1 0— C : 5，（ァミノ基） -AGCTGTTCGTGTTCTATGAT£-3， CP— 1 0— G : 5，（ァミノ基） -AGCTGTTCGTGTTCTATGAT(i-3' C P— 1 1 _ G ： 5，（ァミノ基) -ACTTGTGGTAGTTGGAGCTGG- 3' CP— 1 1— T : 5，（ァミノ基） -ACTTGTGGTAGTTGGAGCTGT-3' C P— 1 2— A : 5' (ァミノ基) -TATTCTCGACACAGCAGGTCA-3' CP— 1 2— T : 5，（ァミノ基） -TATTCTCGACACAGCAGGTCT-3' (2) 第 1プロ一ブ

第 1プローブ一 1 b ：

5' (リン酸化) -CCAGGTGGAGCACCCAGGCC GAACTATGC C GATAAC CGTG GTATAGTACGCTTGCACGTG CCCGTACATGCGTTGTAATG-3' 第 1プローブ一 2 ：

5， (リン酸化） -GCGGCCGCCTGGTGCAGTAC GAACTATG C C GATAAC CGTG GTATAGTACGCTTGCACGTG CCCGTACATGCGTTGTAATG-3' 第 1プローブ一 3 ：

5，（リン酸化） -GCCTGGCAGTGTACCAGGCC GAACTATG CCGATAAC CGTG GTATAGTACGCTTGCACGTG C C C GTAC ATGC GTTGTAATG - 3' 第 1プローブ一 4 :

5' (リン酸化） -GTCTTCAGTGAAGCTGCAGG GAACTATG C C GATAAC CGTG GTATAGTACGCTTGCACGTG CCCGTACATGCGTTGTAATG-3' 第 1プロ一ブ— 5 ：

5，（リン酸化） -CGATTTCATCATCACGCAGC GAACTATGC CGATAAC CGTG GTATAGTACGCTTGCACGTG CCCGTACATGCGTTGTAATG-3' 第 1プローブ一 6 ： 5' (リン酸化） -AAGTTGAACTAGCTAGAATG GAACTATGC C GATAAC CGTG GTATAGTACGCTTGCACGTG CCCGTACATGCGTTGTAATG-3' 第 1プローブ一 7 ：

5' (リン酸化） -AGGGTATGCGGAAGCGAGCA GAACTATGCC GATAAC CGTG GTATAGTACGCTTGCACGTG CCCGTACATGCGTTGTAATG-3' 第 1プローブ一 8 ：

5，（リン酸化） -CGGACGATATTGAACAATGG GAACTATGCC GATAAC CGTG GTATAGTACGCTTGCACGTG C C C GTAC ATG CGTTG TAATG - 3' 第 1プローブ一 9 ：

5，（リン酸化） -CGTGGCCCCTGCACCAGCAG GAACTATGCCGATAAC CGTG GTATAGTACGCTTGCACGTG CCCGTACATGCGTTGTAATG-3' 第 1プローブ— 1 0 ：

5， (リン酸化） -ATGAGAGTCGCCGTGTGGAG GAACTATG C C GATAAC CGTG GTATAGTACGCTTGCACGTG CCCGTACATGCGTTGTAATG-3' 第 1プロ一ブー 1 1 ：

5' (リン酸化） -TGGCGTAGGCAAGAGTGCCT GAACTATGCCGATAAC CGTG GTATAGTACGCTTGCACGTG CCCGTACATGCGTTGTAATG-3' 第 1プローブ一 1 2 ：

5' (リン酸化） -AGAGGAGTACAGTGCAATGA GAACTATGCCGATAAC CGTG GTATAGTACGCTTGCACGTG CCCGTACATGCGTTGTAATG-3'

( 3 ) 夕一ゲット遺伝子

ターゲット遺伝子— 3 ( 3 ' 側領域 C P— 3—Tと相補的）：

5'-GGCCTGGTACACTGCCAGGC ACTTCTGCAGGTCATCGGCAT-3' ターゲット遺伝子一 6 ( 3 ' 側領域 C P— 6— Aと相補的）：

5'-CATTCTAGCTAGTTCAACTT TC ATTG C C ATTTC AGC C AG C A- 3' ターゲット遺伝子— 7 ( 3，側領域 C P— 7 _ Gと相補的）： 5' TGCTCGCTTCCGCATACCCT C CTGCTGTAGTAC C C AGAAC A- 3' ターゲット遺伝子— 9 (3 ' 側領域 C P— 9一 Gと相補的）：

5'-CTGCTGGTGCAGGGGCCACG CGGGGAGCAGCCTCTGGCATT-3' ターゲット遺伝子— 1 0 (3 ' 側領域 CP— 1 0—Cと相補的）： 5'-CTCCACACGGCGACTCTCAT GATCATAGAACACGAACAGCT-3' ターゲット遺伝子一 1 2 (3 ' 側領域 CP— 1 2 _Tと相補的）： 5'-TCATTGCACTGTACTCCTCT AGACCTGCTGTGTCGAGAATA-3' (4) HC P

HC P - 2 - 1 ：

5， (Cy3標識） - GAACTATGC CGATAAC CGTG GTATAGTACGCTTGCA CGTG C C CGTAC ATG C GTTGTAATG - 3'

H C P - 2 - 2 ：

5， (Cy3標識) -CACGGTTATCGGCATAGTTC CACGTGCAAGCGTACT ATAC CATTACAACG CATGTACGGG - 3'

なお、上記キヤプチヤープローブ、第 1プローブの 3 ' 側領域及び夕ーゲッ卜遺伝子は-.それぞれ下記の遺伝子の塩基配列をもとに合成したものである。

Hemochromatosis遺伝子： C P— 1及び第 1プローブ一 1 (変異部位 8 4 5番塩基）， C P— 1 0、第 1プローブ一 1 0及び夕一ゲット遺伝子一 1 0 (変異部位 1 8 7番塩基）、 ApolipoproteinE 遺伝子： C P— 2及び第 1 プローブ一 2 (変異部位 1 1 2番目アミノ酸）， C P_ 3、第 1プローブ一 3及び夕一ゲット遺伝子一 3 (変異部位 1 5 8番目アミノ酸）、 ApolipoproteinBlOO 遺伝子： C P — 4 及び第 1 プローブ一 4 、 Methylenetetrahydrofolate reductase遺伝子：し P— o及び第 1フローブ — 5、 Medium Chain Acyl-CoenzvmeA Dehydrogenase逭ナ： C P—り、第 1プローブ— 6及びターゲット遺伝子— 6、 Angiotensinogen遺伝子： C P - 7、第 1プロ一ブー 7及び夕一ゲット遺伝子— 7、 p53遺伝子： CP— 8及び第 1プロ一ブー 8 (変異部位 47番目アミノ酸）， CP— 9、第 1プローブ一 9及びターゲット遺伝子一 9 (変異部位 72番目アミノ酸）、 KRAS 遺伝子： CP— 1 1及び第 1プロ一ブー 1 1 (変異部位 1 2番目アミノ酸）、 CP _ 1 2及び第 1プロ一ブー 12 (変異部位 6 1番目アミノ酸）。

ハイプリダイゼーション溶液、スライドグラス及びスポッターは実施例 1 と同様のものを用いた。

3. 方法

3 - 1. スライドグラスの作製

各キヤプチヤープローブ (C P 1 0 O mo 1 / /2 L ) とスポッティング溶液（MAT S UN AM I GLAS S社製）を等量混ぜ、 24種のプロ一ブ溶液を調製した。このプローブ溶液をスライドグラス上に N= 1となるよう 1 2遺伝子分、計 24ケ所スポットした。なお、異なるプローブ液をスポットする際は、滅菌水、及び冷エタノールにてピンを洗浄風乾した。スポット後のスライドグラスは湿潤箱に入れ遮光しー晚静置した。

その後、実施例 1と同様にキヤプチヤープローブの固定を行い、スライドグラスを作製した。

S— Δ . 検出

ハイブリダィゼ一シヨン溶液に、 6種類のタ一ゲット遺伝子をそれぞれ 3 O pmo l ( 30 L) ずつ添加し、さらに 1 2種類の第 1プローブすべてをそれぞれ 3 O pmo 1 ( 30 /i L) ずつ加えた。 9 5。C、 2分にて熱解離させたこれらの溶液 2 5 Lを、.前記キヤプチヤープローブ 24本を固定したスライドグラス上のチャンバ一内にて 42 °C, 2時間反応させ、キヤプチャ一プローブ、ターゲット遺伝子、第 1プローブをハイブリダィズさせた。反応後のスライドは、 2 XS S C+ 0. 1 % S D S溶液で 2回、 1 X S S C 溶液にて 1回、 0. 2 X S S C溶液にて 1回洗浄し風乾させた。その後、 H C Pとして H C P— 2― 1及び H C P— 2— 2を用いた以外は実施例 1と同様にして実施例 1と同様にして、ライゲ一シヨン反応、アル力リ処理及び自己集合体形成反応を行い、スライドグラス上の蛍光を蛍光顕微鏡で観察した。結果を図 2 8に示す。

図 2 8に示した如く、ターゲット遺伝子の変異部位が捕捉用プローブと相補的な場合のみシグナルが増幅された。産業上の利用可能性

以上述べた如く、本発明によれば、 P A L S A R法により D N Aチップにおける変異遺伝子の検出感度を向上させ、効率よくシグナルの増幅を確立させ、さらに P A L S A R法に用いるオリゴヌクレオチド ·プローブのデザィンを工夫することにより簡便な検出を確立させることができるようにした変異遺伝子検出のためのシグナル増幅方法を提供することができる。

Claims

請求の範囲

1 . D N Aリガーゼを用いたライゲーション反応と、オリゴヌクレオチドの二本鎖の規則的な高次構造である自己集合体を形成する自己集合反応とを有し、 D N Aチップにおける変異遺伝子の検出感度を向上させることを特徴とする変異遺伝子検出のためのシグナル増幅方法。

2 .捕捉用プローブと第 1プローブをターゲット D N Aにハイプリダイズさせる第 1工程、

ターゲット D N Aの変異部位が該捕捉用プローブと相補的な場合、 D N Aリガーゼを用いたライゲーション反応により前記捕捉用プローブと前記第 1 プローブを連結させる第 2工程、

前記ターゲット D N Aを除去させる第 3工程、及び

複数のオリゴヌクレオチド ·プローブを添加し、該オリゴヌクレオチド ·プローブの自己集合反応により自己集合体を形成させ、シグナルを増幅させる第 4工程を有し、

前記捕捉用プローブと前記第 1プローブの塩基配列が、前記第 1工程において、前記捕捉用プローブの末端が前記夕一ゲット D N Aの変異部位に位置し且つ該末端と前記第 1プローブが隣接する状態で夕一ゲット D N Aとァニ —リングするように構成されており、

前記複数のオリゴヌクレオチド ·プローブの少なくとも一つが前記第 1プローブと相補的な領域を有することを特徴とする変異遺伝子検出のためのシグナル増幅方法。

3 . 前記自己集合反応が、互いに相補的な部分が n ( n≥3 ) 力所の数から構成される一対のオリゴヌクレオチド ·プローブを用いて、互い違いに交差するようにハイブリダイゼーションさせることにより、オリゴヌクレオチドが自己集合し、二本鎖の自己集合体を形成させるものであることを特徴とする請求項 1又は 2記載のシグナル増幅方法。

4 . 前記自己集合反応が、 N o . 1及び N o . 2の一対のオリゴヌクレオチドの各オリゴヌクレオチドを 3 ' 側領域、中央領域、及び 5 ' 側領域の 3つの領域に分け、各オリゴヌクレオチドの中央領域を互いに相補的な塩基配列

5 としてダイマ一プローブを形成するとともに、 3 ' 側領域及び 5 ' 側領域を ' 互いに非相補的な塩基配列とした一対のダイマ一形成用プローブを複数対含む第 1の系と、

N o . 3及び N o . 4の一対のオリゴヌクレオチドの各オリゴヌクレオチドを 3 ' 側領域及び 5，側領域の 2つの領域に分け、各オリゴヌクレオチドの 10 3 '側領域及び 5 '側領域を互いに非相補的な塩基配列とした一対の架橋プローブを複数対含む第 2の系とを有し、

該架橋プロ一ブを該ダイマー形成用プローブより形成されるダイマーを架橋することが可能な塩基配列とし、

該プローブをハイブリダイゼーションさせることにより、オリゴヌクレオチ 15 ドが自己集合し、自己集合体を形成させる自己集合反応であることを特徴とする請求項 1又は 2記載のシグナル増幅方法。

5 . 前記プローブの塩基配列を、

第 1の系の N o . 1一オリゴヌクレオチドの 3 側領域と第 2の系の N o 3—オリゴヌクレオチドの 3 ' 側領域、

20 第 1の系の N o . 2—オリゴヌクレオチドの 5 側領域と第 2の系の N 0 4一オリゴヌクレオチドの 5 ' 側領域、

第 2の系の N o . 4—オリゴヌクレオチドの 3 ' 側領域と第 1の系の N o 2一才リゴヌクレオチドの 3 ' 側領域、

第 2の系の N o . 3 _オリゴヌクレオチドの 5 ' 側領域と第 1の系の N o 25 1一オリゴヌクレオチドの 5 '側領域をそれぞれ相補的な塩基配列とすることを特徴とする請求項 4記載のシグナル増幅方法。

6. 前記プローブの塩基配列を、

第 1の系の No. 1—オリゴヌクレオチドの 3 ' 側領域と第 2の系の No. 3—オリゴヌクレオチドの 3 ' 側領域、

第 1の系の No. 2_オリゴヌクレオチドの 5 ' 側領域と第 2の系の No. 3—オリゴヌクレオチドの 5 ' 側領域、

第 1の系の No. 2—オリゴヌクレオチドの 3 ' 側領域と第 2の系の No. 4—ォリゴヌクレオチドの 3 ' 側領域、

第 1の系の No. 1一オリゴヌクレオチドの 5 ' 側領域と第 2の系の No. 4一オリゴヌクレオチドの 5 '側領域をそれぞれ相補的な塩基配列とすることを特徴とする請求項 4記載のシグナル増幅方法。

7.前記ターゲット D N Aに一本鎖の D N A又は二本鎖の DNAを用いることを特徴とする請求項 1〜 6のいずれか 1項記載のシグナル増幅方法。

8. 前記自己集合反応に用いるオリゴヌクレオチドの塩基配列を、あらかじめ前記第 1プローブと相補的な配列にすることを特徴とする請求項 1〜 7 のいずれか 1項記載のシグナル増幅方法。

9. 前記捕捉用プローブが、支持体に結合していることを特徴とする請求項 1〜 8のいずれか 1項記載のシグナル増幅方法。

1 0. 前記支持体が、マイクロプレート型、スライドグラス型、微粒子型、又は電気伝導性の基板型の支持体であることを特徴とする請求項 9記載のシグナル増幅方法。

1 1. 前記自己集合体に対して、標識プロ一ブをハイブリダイゼーションさせることにより、前記自己集合体の存在を検出することを特徴とする請求項

1〜 1 0のいずれか 1項記載のシグナル増幅方法。

1 2. 前記標識プローブが、発色系酵素、発光系酵素、又はラジオアイソト —プで標識した標識プローブであることを特徴とする請求項 1 1記載のシグナル増幅方法。

1 3. 前記自己集合体に対して、核酸と結合する性質を持った蛍光物質を加え、その蛍光物質の光化学的な変化により前記自己集合体の存在を検出することを特徴とする請求項 1〜 1 0のいずれか 1項記載のシグナル増幅方法。

14.あらかじめ自己集合体を形成するオリゴヌクレオチドを蛍光物質で標識し、前記自己集合体の存在を蛍光物質の光化学的な変化により検出することを特徴とする請求項 1〜 1 0のいずれか 1項記載のシグナル増幅方法。

1 5.あらかじめ自己集合体を形成するオリゴヌクレオチドをラジオァイソト一プで標識し、前記自己集合体の存在をラジオァイソト一プにより検出することを特徴とする請求項 1〜 1 0のいずれか 1項記載のシグナル増幅方法。

1 6.あらかじめ自己集合体を形成するオリゴヌクレオチドを発色系酵素又は発光系酵素で標識し、前記自己集合体の存在を光化学的な変化により検出することを特徴とする請求項 1〜 1 0のいずれか 1項記載のシグナル増幅方法。

1 7. 前記オリゴヌクレオチドが、 DNA, RNA, PNAまたはLNAのいずれかから選ばれる塩基から構成されることを特徴とする請求項 1〜.1 6のいずれか 1項記載のシグナル増幅方法。