WO2004058979A1 - Promotor artificial para la expresión de secuencias de adn en células vegetales. - Google Patents

Promotor artificial para la expresión de secuencias de adn en células vegetales. Download PDF

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Guillermo Selman-Housein Sosa
Alberto SALAZAR RODRÍGUEZ
Daymí ABREU REMEDIOS
Osmany RAMOS GONZÁLEZ
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Centro De Ingenieria Genetica Y Biotecnologia
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Definitions

  • This invention relates to the branch of Biotechnology and more specifically to Plant Genetic Engineering.
  • chimeric DNA constructions are provided with a high promoter activity of transcription / translation of any nucleotide sequence fused to them, in cells of monocotyledonous or dicotyledonous plants, which allows obtaining transgenic plants with high levels of gene expression and DNA sequences of interest.
  • Plant genetic engineering is a technology that has proven very productive for basic research and commercial production of new biotechnological products (Hammond J. Curr. Top. Microbiol. Immunol 1999, 240: 1-19; Simoens C. and Van Montagu M. Reproduction Update 1995, 1: 523-542).
  • promoter signals that guarantee the adequate expression, in strength or temporal or spatial location, of the genes or DNA sequences introduced to the plants genetically manipulated by means of molecular biology techniques, is of vital importance for the success of the genetic engineering of the plants. For this reason, in the last two decades multiple efforts have been devoted to the search for promoters and signals capable of ensuring the expression that each transgene requires. In this way, promoters of different origins (vegetable, viral, Ti or Ri of Agrobacterium, or chimeric) have been evaluated and used in the production of transgenic plants.
  • the constitutive promoters most widely used in the genetic manipulation of plants have been: the 35S RNA promoter of Cauliflower Mosaic Virus (CaMV) (Odell JT; Nagy F; Chua NH Nature 1985, 313: 810-812) , the promoter nos of the nopaline synthetase gene of the Ti plasmid of A. tumefaciens (An G; Costa MA; Mitra A; Ha S; Marton L. Plant Phisiol.
  • CaMV Cauliflower Mosaic Virus
  • each of these natural expression systems presents limitations due primarily to the fact that their expression levels are not high enough in plants of any kind; for example, promoter expression is low in dicotyledonous plant cells and virtually undetectable in monocotyledone, while the CaMV 35 S promoter, the most universally used, is much stronger in tobacco cells than in monocotyledon plant cells (Topfer R; Maas C; Horicke-Grandpierre C; Schell J; Steinbiss HH Methods Enzymol. 1993, 217: 67-78; Mitsuhara I; Ugaki M; Hirochika H; Ohshima M; Murakami T; Gotoh Y; et al. Plant Cell Physiol. 1996, 37: 49-59).
  • promoters of rice actin-1 and corn ubiquitin-1 are highly efficient in promoting the transcription of genes placed under them in monocotyledonous plant cells, but their promoter activity in tobacco cells is low (Schledzewski K; Mendel RR Transgenic Research 1994, 3: 249-255).
  • multiple variants of chimeric promoters have been designed where natural promoters are combined with transcription or translation enhancing elements.
  • enhancer elements are for example: the Omega translational enhancer of the Tobacco Mosaic Virus (TMV), (Gallie DR; Sleat DE; Watts JW; Turner PC; Wilson TMA Nucleic Acids Res.
  • patent application WO9943838 revindicates a synthetic promoter based on a sequence of the TATA box to the transcription start site with a high GC content, 64% or more, linked by its 5 'region to enhancer sequences of Transcription taken from the 35S promoters, ubiquitin-1 corn and octopine synthase.
  • patent application WO0058485 claims an artificial promoter derived from the combination of sequences from the genome of two plant viruses, the Yellow Spotted Viral of the Cornelina (CoYMV) and the Viras of the Venous Mosaic of the Yucca ( CsVMV), and activator sequences originating from the 35S promoter.
  • CoYMV Yellow Spotted Viral of the Cornelina
  • CsVMV Viras of the Venous Mosaic of the Yucca
  • CIRE-1 and CIRE-2 that are located between nucleotides 28 to 65 and 66 to 118, respectively, have been identified as responsible for the translation enhancing properties of this leader.
  • viral base 148 Niepel M; Gallie DRJ Virol. 1999, 73: 9080-9088.
  • no specific element that is considered critical for the potentiating activity of this viral leader has been defined.
  • introns of natural origin and adjacent sequences have also been widely used to potentiate different gene expression systems up to factors of hundreds, especially when the intron is placed near the 5 'end of the gene in question.
  • LMEs intron-mediated messenger RNAs
  • a strong LME of expression has been observed primarily in monocotyledonous plant cells, not commonly exceeding the IME in dicotyledons a factor of 2 to 5 times.
  • the molecular mechanisms of SCI have not been fully discovered (Simpson GG; Filipowicz W. Plant Mol. Biol.
  • the variations of the LME of the expression observed between cells of monocotyledonous and dicotyledonous plants may be due to the fact that there are recognized differences between the requirements necessary for an adequate processing of the pre- MRNA in plant cells of different classes.
  • the existence of AU-rich segments within the introns is not essential for their processing to occur;
  • Monocotyledonous cells can also process introns that contain stem structures with hairpin or have a high GC content (more than 50%), which indicates that dicotyledonous cells are not able to process introns with complex secondary structures (Goodall GJ; Filipowicz W The EMBO Journal 1991, 10: 2635-2644; Lorkovic ZJ; Kirk DAW; Lambermon MHL; Filipowicz W. Trends in Plant Science. 2000, 5: 160-167).
  • the expression promoter sequence proposed in this invention contains a group of its own characteristics that altogether distinguish it: 1) it is functionally universal in that it is active in both dicotyledonous and monocotyledonous plant cells, allowing to obtain transgenic plants from any class with high levels of gene expression and DNA sequences of interest; 2) it is based on a combination of artificially assembled genetic elements in such a way that they not only increase mRNA levels of interest through JJVIE, but also promote their translation; 3) the absence in this promoter of long DNA fragments of identical sequence to the natural one or of viral origin, minimizes the risk of silencing the expression mediated by homologous RNAs and the possibility of new races or strains of viral origin as a result of homologous in plant recombination; 4) the sequence of the TATA box to the transcription start site does not necessarily have to have a high GC content; 5) our promoter sequence is extremely versatile since different regulatory elements of transcriptional activity can be inserted 5 'to it to confer to the expression capacity of temporal response, organ
  • introns we use as a building material have a high GC content, complex secondary structures with abundant stems, and their branching points near the AG acceptor of the 3 'processing site they have sequences far from the consensus, so that these introns are hardly efficiently processed in dicotyledonous plant cells.
  • the second relevant component of the object of this invention is an artificial translational enhancer that was fused following the chimeric exon / intron to raise expression levels.
  • a base promoter initially formed by a consensus TATA box (Joshi CP Nucleic Acids Res. 1987, 15: 6643-6653) was designed to which the region -24 to -4 was fused ( from the start of transcription) of the CaMV 35S promoter, then incorporating the -5 to +27 region of the rice actin-1 gene that will provide the transcription start site and a region rich in C and A.
  • the +26 to +72 region (from the start of transcription) of the corn ubiquitin-1 gene was fused to provide regions rich in AC and CT respectively, which make up a first artificial exon that joined the second actin exon. 1 corn, 12 bases before the 5 'processing site of your IVS2 intron and even include the latter.
  • the artificial intron designed by us was constituted of: the first 54 bases of the IVS2 intron, fused to 37 bases of a 5 'region of the first corn ubiquitin-1 intron corresponding to the bases of +89 to +126 from the beginning of transcription, followed by 375 bases of the first rice actin-1 intron (from position +103 to +477 from the start of transcription of this gene), fused to 33 bases of 3 'of the ubiquitin intron- 1 of corn (from position +1051 to +1083 from the beginning of transcription), attached to the second half of intron IVS2 of actin-1 of corn (from position -52 to +5 from the site 3 'processing of this intron) and a 29 base chimeric sequence containing restriction sites and a consensus translation start sequence (Lütcke HA; Chow KC; Mickel FS; Moss KA; Kern HF; Scheele
  • the element as- ⁇ used in our constructions as a transcription enhancer has a novel design because it has less than 50% homology with the palindromic enhancer of octopine synthase (Ellis JG; Llewellyn DJ; Walker JC ; Dennis ES; Peacock WJ EMBO J. 1987, 6: 3203-3208; EP0278659), is not identical (less than 85% identity) to any of the variants of this type of sequences claimed from the study by Ellis and collaborators (Bouchez D; Tokuhisa JG; Llewellyn DJ; Dennis ES; Ellis JG EMBO J. 1989, 8: 4197-4204; USPat.
  • the 556 base fragment used by us does not contain the elements of "thermal shock box" which have been defined as essential for the functionality of this enhancer (they are between positions -188 and -214 of the sequence of this promoter), and therefore the transcription enhancing activity of the sequence of the promoter is original and not obvious ubiquitin promoter we use.
  • the PART promoter was also fused to a small 214 base fragment that corresponds to the -31 to -245 region from the start of transcription of the rice gluB-1 gene (Takaiwa F; Oono K; Kato A. Plant Mol. Biol. 1991, 16: 49-58) to form the new GARTE promotion region (Figure 8).
  • Transient expression assays demonstrated that the GARTE's new artificial promoter is highly efficient for expressing DNA sequences in the seed endosperm.
  • a vector for genetic transformation By a vector for genetic transformation is understood in this application, a DNA molecule (purified, or contained within a bacterial cell, or a vira), which serves as a carrier vehicle to introduce any previously inserted DNA fragment into a plant cell in her. Description of the Figures
  • Figure 1 Sequences of the actin-1 genes of rice (Act), ubiquitin-1 of corn (Ubi) and sucrose synthase-1 of corn (Shrun) from the start of transcription. The first exon (in capital letters) and the 5 'region of the first intron (in lower case), and the location of motifs of common and repeated sequences (underlined) are shown.
  • Figure 2. Sequence of the EUREKA artificial translational enhancer, showing its relevant elements and the restriction sites included.
  • Figure 3 Sequence of the Exon / Intron Artificial Exon ART, showing the origin of each of its component fragments (the artificial intron is in lowercase; double underlined are the bases inserted to create UUUUUAU type sequences; some relevant restriction sites are indicated ( simple underlines)).
  • PART promoter Primary structure of the object of this invention (PART promoter), showing the base promoter attached to the Exon Intron / Exon ART and the Eureka translational enhancer (in italic lowercase the promoter, and in lowercase the intron; the exons are in uppercase ; some relevant restriction sites (underlined) are indicated, the TATA box is doubly underlined, and the translation start codon is in bold).
  • PART promoter Primary structure of the object of this invention
  • Figure 6 Primary stratum of the U3ARTE promoter, showing its component elements: region from -299 to -855 from the beginning of transcription of the ubi-1 maize gene, in capital letters; transcription enhancer type as-1, in capital letters-bold; region -43 to -310 from the start of transcription of the act-1 rice gene, in uppercase-italic; promoter PART in lowercase (in double underline the TATA box, in italics the intron ART, and in simple underline the start of translation)).
  • FIG. 7 Variants of promoters with the enhancer elements object of this invention.
  • E Promoter 35S (1.3Kb); R EurekaJ Exon / Intron / Exon ART translational enhancer; Artificial promoter nucleus;
  • Figure 8 Primary structure of the GARTE promoter, showing its component elements: region from -31 to -245 from the start of transcription of the rice gluB-1 gene, in uppercase-italics; promoter PART (in italic lowercase the promoter, and in simple lowercase the intron; the exons are in uppercase; some relevant restriction sites (underlined) are pointed out, the TATA box is doubly underlined, and the translation start codon is bold ).
  • Figure 9. Map of the pUC-GUSint.
  • Figure 11 Map of the pBPFAl9-linker.
  • Plasmids pC-EURGUSint; pC-ARTEGUSint; pGARTEGUSint and pC- U3ARTEGUSint were deposited under the Budapest Treaty for the Protection of Microorganisms at the Belgian Coordinated Collections of Microoganism, Plasmid Collection (BCCMZLMBP) Universiteit Gent, 'Fiers-Schell-Van Montagu' building, Technologiepark 927, B-9052 Gent -Zwijnaarde, Behca ,.
  • PC-EURGUSint plasmids PC-EURGUSint plasmids; pC-ARTEGUSint; pGARTEGUSint with access numbers LMBP 4727; LMBP 4725; LMBP 4728 respectively and dated May 19, 2003 and the pC-U3ARTEGUSint with the number 4791 of November 25, 2003.
  • the 86 base pair (bp) DNA fragment corresponding to the Eureka translational enhancer (SEQ ID NO: 1) was cloned into the pBluescript II SK vector (Stratagene, USA) previously digested with the enzymes Pstl and S cl, taking advantage of the fact that Cohesive ends with both restriction enzymes were included in the design of the synthetic DNA fragment.
  • the plasmid resulting from this cloning was named pBS-Eureka.
  • the synthetic I-Ac / U DNA fragment (SEQ ID NO: 4), containing the end of the artificial Intron was inserted into the plasmid pBS-AcUAc digested with the enzymes Barn ⁇ U and S ⁇ cl, to produce the plasmid pBS-AcUAcU.
  • PART promoter For the construction of the promoter sequence object of this invention (PART promoter), the DNA fragment containing the base promoter and the entire Exon / Intron / Exon ART without its region 3 was obtained by Xhol-Pstl digestion of plasmid pBS-ART. ', inserting it into the plasmid pBS-Eureka digested with these same enzymes.
  • plasmid pPARTE Figure 4, Figure 7D
  • Example No.2 Demonstration of the functionality of the Eureka and ART enhancers in plant cells . a) Functionality of the Eureka translational enhancer in tobacco cells.
  • plasmid pBPF ⁇ -GUSint was constructed, cloning the GUSint gene, obtained from pUC-GUSint by digestion Sal ⁇ I Klenow and Kpnl, between the Sm ⁇ l and Kpnl sites of the vector pBPF ⁇ 7 .
  • This plasmid is similar to pBPF-EURGUSint except that instead of the Eureka enhancer, the expression of the GUSint gene is under the control of the Omega enhancer of TMV.
  • Another control plasmid was constructed by eliminating the Omega enhancer from the pBPF ⁇ -GUSint construct, by consol-Ncol digestion, Klenow treatment and plasmid re-circularization, to obtain the pBPF-GUSint vector.
  • tumefaciens LBA4404 we proceeded to test the functionality of the Eureka enhancer by means of an experiment of transient expression in célulasT1 tobacco cells according to the protocol described by An (An G. Plant Physiol. 1985, 79: 568-570) with some modifications. After co-cultivating the tobacco cells with each carrier of each binary vector for 4 days, the cells were collected and processed according to Jefferson (Jefferson RA 1988. Plant reporter genes: the GUS gene fusion system. In: JK Setlow (Ed), Genetic Engineering Vol.10, Plenum Publishing Corporation, p.247-263) to determine the ⁇ -gl ⁇ curonidase (GUS) activity present in them. Each experiment was performed in triplicate with 5 replicates per construction each time, and the results are shown in the following table.
  • the GUSint fragment of the pUC-GUSint was digested with Ncol-S ⁇ cl, and cloned in the pBS-ART digested with these same enzymes, to give rise to the plasmid pBS- ARTGUSint.
  • this last plasmid was digested with Sal ⁇ -BglH and treated with SI nuclease, to give rise to pBS- ⁇ ARTGUSint, from which the ARTGUSint fragment was obtained by Xhól-Kpnl digestion and cloned into the vector pBPF ⁇ 7 digested with the same enzymes, obtaining the plasmid pBPFARTGUSint ( Figure 7B), where the expression of the gus gene is under the control of the 35M promoter of the CaMV (1.3 Kb version), the Exon / Intron / Exon ART and the termination signals of the transcription of the US gene of A tumefaciens (Tnos).
  • the band containing the ART element was obtained by Xhól-Pstl digestion and fused to the PBS-EURGUSint vector digested in the same way, to obtain the plasmid pBS-ARTEGUSint.
  • a fragment of AD ⁇ containing the GUSint gene was obtained by digestion Xhól-Kpnl under the signals of the genetic elements ART and Eureka, which was introduced into the vector digested pBPF ⁇ 7 to produce plasmid pBPFARTEGUSint ( Figure 7C ).
  • the Xhól-Kpnl band of plasmid pBS-ARTEGUSint was cloned into the vector pBPFA19-linker, to obtain the construction ⁇ BPFA19ARTEGUSint.
  • a control constraint pBPFAl9GUSint, was performed by cloning the GUSint fragment of plasmid pUC-GUSint in the vector pBPFA19-linker digested with Ncol and S ⁇ cl.
  • Another plasmid used as a control was pBPF ⁇ -GUSint.
  • the qualitative evaluation of the ability of ART and Eureka as gene expression enhancers in rice cells was carried out by means of transitive expression assays in calluses of the Pearl Indica strain.
  • the calluses were obtained from mature seeds previously sterilized with sodium hypochlorite and alcohol, and grown for 21 days in the dark in the medium ⁇ 6-2 (Salts and vitamins of the medium ⁇ 6 (Chu CC; et al. Scientia Sinicl975, 18 : 659); O. lg / L of myo-inositol; Casein hydrolyzate 1 g / L; 2.4 D at 2mg / L; Sucrose 30g / L; Fitagel 3g / L, pH 5.7).
  • the transformation was carried out by bombardment with microprojectiles; and before the bombing the calluses were subcultured in ⁇ 6-2 medium supplemented with 0.4 M mannitol for osmotic pre-treatment.
  • Microprojectiles for bombardment are prepared using 1 ⁇ m gold spherical particles (BioRad), according to published protocol (Russell DR, Wallace KM, Bathe JH, et al. Plant Cell Rep. 1993, 12: 165-169). The transformation is carried out using the Biorad PDS-1000 / He system. For firing, 30 calluses are placed in the center of the plate to be bombarded with the following conditions: 1100 psi pressure, 6 cm distance and one shot per plate.
  • Example No. 3 Variants of the expression system PART, using different 5 'transcription activating regions. a) Addition to the promoter PART of the 5 'activating region of transcription of the rice actin-1 gene.
  • the plasmid pPARTE was digested with the EcoRI and EcoRV enzymes, and the En-Acl synthetic DNA fragment was inserted therein. -43 to -221 from the start of transcription of the rice actin-1 gene; SEQ LO NO: 10) with ends that bind with the enzymes in question.
  • Plasmid pAlPARTE was digested with Nrul and Sal ⁇ and the synthetic DNA fragment called ASP (SEQ ID NO: 13) was inserted into it, which has restriction enzyme cohesive sites used and encodes for an as-transcription enhancer sequence -l, thus producing the constraint pASP ⁇ AlPARTE.
  • This last plasmid was digested with Sal ⁇ , treated with SI nuclease and re-digested with PstI to obtain a DNA fragment of approximately 900 base pairs that was cloned into the pAlPARTE vector digested with Nrul and Pstl, to finally obtain the plasmid pASPAlPARTE, which has the ASP enhancer inserted in the Nrul site of the 5 'activating region of rice actin-1 transcription.
  • PCR polymerase chain reaction
  • Oli-Ul SEQ ID NO: 16
  • OH-U2 SEQ ID NO: 17
  • the amplified fragment was digested with the enzymes Kpnl and Xhól (sites both included in the primers) and cloned into the pBluescript II SK vector, also processed, to obtain the pBS-Ubil restriction.
  • GLU 214 base DNA fragment
  • Example No.4 Functionality of the different variants of the expression system PART in tobacco and rice cells.
  • the CaMV 35S promoter controlling the expression of the GUSint gene in the binary vector was eliminated by Smal-Spel digestion.
  • the binary vectors pC-AP ARTEGUSint, pC-2AlPARTEGUSint, pC-2AP ARTEGUSint and pC-U3ARTEGUSint were introduced to A. tumefaciens cells to perform transient expression experiments on NT 1 tobacco cells, as described in section (a) of Example No.2.
  • pC-GUSint was used where the expression of the gengus is under the control of the 35S promoter of the CaMV (1.3 Kb version) and the Tnos terminator.
  • the experiments were performed in duplicate (with five replicas for each treatment) and the results obtained are shown in the following table: Table 5. Functionality of the different variants of the expression system PART in tobacco cells.
  • the binary vectors pC-AP ARTEGUSint, pC-2AlPARTEGUSint, pC-2AP ARTEGUSint and pC-U3 ARTEGUSint were bombarded to rice corns as described in section (c) of Example No. 2, to evaluate the activity of the different promoters PART in monocotyledonous plant cells by transient expression assays.
  • pActl-F McElroy D; Zhang W; Cao J; Wu R. Plant Cell 1990, 2: 163-171
  • the expression cassette was extracted by Kpnl-Xbál digestion and inserted into the binary plasmid pCAMBIA2300 digested with these same enzymes, to produce the pC-ActlF vector.
  • the approximately 2.5 Kb Sal ⁇ I Klenow-Pstl fragment of the pBPFARTEGUSint vector which contains the Eureka fragment fused to the GUSint gene with the nos (Tnos) terminator, was cloned into the pGARTE vector digested with Xb ⁇ l I Klenow - Pstl to form the pGARTEGUSint constraint.
  • a control plasmid was also constructed by replacing the GARTE promoter in pGARTEGUSint, by Xhól-Ncol digestion, with a highly efficient promoter in seed endosperm such as the promoter of the rice glutelin Bl gene, obtained from plasmid pGEM-T-GluB -lprom by digestion Sal ⁇ - Ncol. This is how pGluGUSint was obtained.
  • the data shown reaffirms that the insertion of upstream regulatory sequences to the element object of this invention allows it to be used to efficiently drive the expression of any specific DNA sequence temporarily, organ or tissue. It is obvious to someone with knowledge in plant molecular biology that the regulatory sequences of the GluB-1 promoter inserted in the GARTE promoter can be successfully substituted by regulatory sequences that respond to biotic stress such as the attack of pathogens, abiotic as wounds. , temperatures, salinity, drought, or the presence of certain chemical substances, or oxidative stresses, or different stages of development of the organs and tissues of the plant, etc.
  • the DNA sequences cloned under the regulatory signals object of this invention can be introduced into plant cells and stably inserted into them by known biological or physicochemical methods of transformation, and that from these genetically modified cells is It is possible to regenerate fertile plants in which the DNA sequences of interest will be conveniently expressed according to the promoter variant that we have fused to it.
  • the present invention reveals its potential to contribute to the production of transgenic plants with higher levels of resistance to pests, diseases, stresses of different types, higher agricultural yields, or highly efficient in producing compounds for medical or industrial use, among others.
  • Transcriptional activator sequence derived from the corn ubiquitin-1 gene (region -299 to -855).

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Abstract

Un promotor artificial caracterizado porque es una molécula quimérica de ADN recombinante que después de ser introducida en células de plantas de cualquier clase promueve altos niveles de expresión de cualquier molécula de ADN fusionada a su extremo 3’. Los elementos genéticos base de la molécula promotora que aquí se describe son: un núcleo promotor con una caja TATA consenso seguida de una región Exón/Intrón/Exón y de un elemento potenciador de la actividad traduccional construidos todos artificialmente. Elementos reguladores de la expresión transcripcional pueden ser insertados corriente arriba del promotor que aquí se describe para conferir a la expresión capacidad de respuesta temporal, órgano, o tejido específica. Los elementos genéticos artificiales diseñados pueden ser funcionalmente insertados entre cualquier promotor activo en células de plantas y una secuencia cualquiera de ADN, para incrementar los niveles de transcripción/traducción de esta última.

Description

PROMOTOR ARTIFICIAL PARA LA EXPRESIÓN DE SECUENCIAS DE ADN
EN CÉLULAS VEGETALES.
Campo de la invención Esta invención se relaciona con la rama de la Biotecnología y más específicamente con la Ingeniería Genética de las Plantas. En particular, se brindan construcciones quiméricas de ADN con una alta actividad promotora de la transcripción/traducción de cualquier secuencia nucleotídica fusionada a ellas, en células de plantas monocotiledóneas o dicotiledóneas, lo que permite la obtención de plantas transgénicas con altos niveles de expresión de genes y secuencias de ADN de interés.
Arte previo
La ingeniería genética de las plantas es una tecnología que ha demostrado ser muy productiva para la investigación básica y la producción comercial de nuevos productos biotecnológicos (Hammond J. Curr. Top. Microbiol. Immunol 1999, 240:1-19; Simoens C. y Van Montagu M. Reproduction Update 1995, 1:523-542).
La selección de señales promotoras que garanticen la expresión adecuada, en fortaleza o localización temporal o espacial, de los genes o secuencias de ADN introducidas a las plantas manipuladas genéticamente mediante técnicas de biología molecular, es de vital importancia para el éxito de la ingeniería genética de las plantas. Por esta razón, en las últimas dos décadas múltiples esfuerzos han sido dedicados a la búsqueda de promotores y señales capaces de asegurar la expresión que cada transgen requiere. De esta forma, promotores de diferentes orígenes (vegetal, viral, del Ti o Ri de Agrobacterium, o quiméricos) han sido evaluados y empleados en la producción de plantas transgénicas. Los promotores constitutivos más ampliamente empleados en la manipulación genética de las plantas han sido: el promotor del ARN de 35S del Virus del Mosaico de la Coliflor (CaMV) (Odell J.T; Nagy F; Chua N.H. Nature 1985, 313:810-812), el promotor nos del gen nopalina sintetasa del plásmido Ti de A. tumefaciens (An G; Costa M.A; Mitra A; Ha S; Marton L. Plant Phisiol. 1986, 88:547-552); el promotor del gen actina-1 de arroz (McElroy D; Zhang W; Cao J; Wu R Plant Cell 1990, 2:163-171) y el promotor del gen ubiquitina-1 de maíz (Christensen A.H; Sharrock R.A; Quail P.H. Plant Mol. Biol. 1992, 18:675-689). Sin embargo, cada uno de estos sistemas naturales de expresión presenta limitaciones debido fundamentalmente a que sus niveles de expresión no son lo suficientemente altos en plantas de cualquier clase; por ejemplo, la expresión del promotor es baja en células de plantas dicotiledóneas y prácticamente indetectable en monocotiledóneas, mientras que el promotor 35 S del CaMV, el más universalmente utilizado, es mucho más fuerte en células de tabaco que en células de plantas monocotiledóneas (Topfer R; Maas C; Horicke-Grandpierre C; Schell J; Steinbiss H.H. Methods Enzymol. 1993, 217:67-78; Mitsuhara I; Ugaki M; Hirochika H; Ohshima M; Murakami T; Gotoh Y; y otros. Plant Cell Physiol. 1996, 37:49-59). De la misma forma, los promotores de la actina-1 de arroz y de la ubiquitina-1 de maíz son altamente eficientes en promover la transcripción de los genes colocados bajo ellos en células de plantas monocotiledóneas, pero su actividad promotora en células de tabaco es baja (Schledzewski K; Mendel R.R. Transgenic Research 1994, 3:249-255). Con el fin de incrementar los niveles de expresión de las proteínas heterólogas en las plantas transgénicas, se han diseñado múltiples variantes de promotores quiméricos donde se combinan promotores naturales con elementos potenciadores de la transcripción o la traducción. Entre estos elementos potenciadores encontramos por ejemplo: el potenciador traduccional Omega del Virus del Mosaico del Tabaco (TMV), (Gallie D.R; Sleat D.E; Watts J.W; Turner P.C; Wilson T.M.A. Nucleic Acids Res. 1987, 15:3257-3273 ), o del Virus de Grabado del Tabaco (TEV) (Carrington J.C; Freed D.D. J. Virol. 1990, 64:1590- 1597); elementos activadores de los promotores de octopina sintasa (From H; Katagiri F; Chua N.H. Plant Cell 1989, 1:977-984), manopina sintasa (Comai L; Moran P; Maslyar D. Plant Mol Biol. 1990, 15:373-381) o 35S (Kay R; Chan A; Daly M; McPherson J. Science 1987, 236:1299-1302); y exones e intrones naturales como el primer intrón de la alcohol deshidrogenasa-1 de maíz (Callis J; Fromm M; Walbot V. Genes Devel. 1987, 1:1183- 1200; Last D.I; Brettell R.I.S; Chamberlaine D.A; Chaudhury A.M; Larkin P.J; y otros. Theor Appl. Gen. 1991, 81:581-588), el primer exó /intrón de la sacarosa sintasa- 1 de maíz (Maas C; Laufs J; Grant S; Korfhage C; Werr W. Plant Mol. Biol. 1991, 16:199-207), el primer exón/intrón de la actina-1 de arroz (McElroy D; Blo ers A.D; Jenes B; Wu R. Mol. Gen. Genet. 1991, 231:150-160), etc. De esta forma surgieron los promotores 2X35S, Mac, Emú y otros EP0459643; EP0651812), que continúan siendo fuertes fundamentalmente en células vegetales de una clase específica, dicotiledóneas o monocotiledóneas (Schledze ski K; Mendel R.R. Transgenic Research 1994, 3:249-255). El desarrollo de promotores fuertes que puedan ser empleados para expresar genes tanto en células de plantas dicotiledóneas como monocotiledóneas ha sido y es tarea relevante para muchos laboratorios no sólo por el reto científico que ello representa, o por el ahorro que implica poder utilizar una única construcción genética para transformar plantas de diversas clases, sino además por la necesidad de contar con sistemas de expresión propios que faciliten la producción y comercialización de los productos biotecnológicos. Con este fin la solicitud de patente WO9943838 revindica un promotor sintético basado en una secuencia de la caja TATA hasta el sitio de inicio de la transcripción con un contenido elevado de GC, 64% o más, unida por su región 5' a secuencias potenciadoras de la transcripción tomadas de los promotores 35S, ubiquitina-1 de maíz y octopina sintasa. Por su parte, buscando no sólo expresión en dicotiledóneas y monocotiledóneas, sino además para evitar el silenciamiento dependiente de secuencias homologas (Park Y.D; Papp I; Moscone E; Iglesias V; Vaucheret H; Matzke A; Matzke M.A. Plant J. 1996, 9:183-194), la solicitud de patente WO0058485 reivindica un promotor artificial derivado de la combinación de secuencias provenientes del genoma de dos virus vegetales, el Viras del Moteado Amarillo de la Cornelina (CoYMV) y el Viras del Mosaico Venoso de la Yuca (CsVMV), y de secuencias activadoras originarias del promotor 35S.
El mecanismo mediante el cual diferentes elementos genéticos potencian la transcripción o traducción de secuencias nucleotídicas no está totalmente esclarecido. Así, por ejemplo, se ha reportado que secuencias líderes de diferentes viras de ARN pueden potenciar la traducción de diferentes ARN mensajeros (ARNm) fusionados a ellas independientemente de si sus extremos 5' tienen la estructura de caperuza (m7G (5') ppp (5') N) o no (Sleat D.E; Wilson T.M.A. 1992. Plant viras genomes as sources of novel functions for genetic manipulations. In: T.M.A. Wilson & J.W. Davies (Eds), Genetic engineering with plant virases. CRC Press, Inc. ρ.55-113; Gallie D.R; Sleat D.E; Watts J.W; Turner P.C; Wilson T.M. Nucleic Acids Res. 1987, 15:8693-8711). Sin embargo, a excepción de que la estructura secundaria de los ARN de todos estos líderes virales no es compleja, no se ha determinado que existan otros elementos comunes entre las secuencias nucleotídicas de los mismos que puedan responder por sus propiedades potenciadoras de la traducción. En particular se ha reportado para el fragmento Omega del TMV que sus propiedades potenciadoras de la traducción están relacionadas con la presencia de al menos una copia del octámero ACATTTAC, que se encuentra repetido en su secuencia, y de una región de (CAA)n de 25 bases que es el motivo considerado crítico (dos copias de la región (CAA)n son suficientes para conferir altos niveles de potenciación) (Gallie D.R; Walbot V. Nucleic Acids Res. 1992, 20:4631-4638). Sin embargo, se ha reportado que la región rica en CA de 28 bases perteneciente al líder del Viras X de la Papa (PVX), no tiene por sí sola propiedades potenciadoras de la traducción (Pooggin M.M; Skryabin K.G. Mol. Gen. Genet. 1992, 234:329-331); mientras que se postula que el pentanucleótido CCACC que forma parte de esta región CA del líder del PVX, podría interactuar complementariamente con el 3' del ARNr 18S (Tomashevskaya O.L; Solovyev A.G; Karpova O.V; Fedorkin O.N; RodionovaN.P; Morozov S.Y; Atabekov J.G. J. Gen. Virol. 1993, 74:2717-2724)
Para otros líderes virales también han sido determinados algunos elementos de secuencia involucrados en sus actividades potenciadoras de la traducción, como es el caso de la secuencia CCTTTAGGTT conservada en los líderes de los carlaviras como el Viras S de la Papa (PVS) (Turner R; Bate N; Tewell D; Foster G.D. Arch. Virol. 1994, 134:321-333); y el llamado motivo ICR2 (regiones internas de control de tipo 2), GGTTCGANTCC, localizado en regiones repetidas de 27 bases del líder del ARN3 del Viras del Mosaico de la Alfalfa (AIMV), de los cuales son necesarios dos para obtener niveles óptimos de traducción (van der Vossen E.A.G; Neeleman L; Bol J.F. Nucleic Acids Res. 1993, 21:1361-1367).
En el caso del líder del TEV, dos regiones llamadas CIRE-1 y CIRE-2 que se encuentran entre los nucleótidos 28 a 65 y 66 a 118, respectivamente, han sido identificadas como las responsables de las propiedades potenciadoras de la traducción de este líder viral de 148 bases (Niepel M; Gallie D.R. J. Virol. 1999, 73:9080-9088). Sin embargo, dentro de las regiones CIRE no ha sido definido ningún elemento específico que se considere crítico para la actividad potenciadora de este líder viral.
Como anteriormente referimos, los intrones de origen natural y las secuencias adyacentes también han sido ampliamente empleados para potenciar diferentes sistemas de expresión génica hasta factores de cientos, especialmente cuando el intrón se coloca cerca del extremo 5' del gen en cuestión. Sin embargo, se reporta que la potenciación de la acumulación de los ARN mensajeros mediada por los intrones (LME) depende entre otros factores del origen del intrón, de las regiones exónicas que flanquean el mismo y hasta del tipo de células. Una fuerte LME de la expresión ha sido observada fundamentalmente en células de plantas monocotiledóneas, no excediendo comúnmente la IME en dicotiledóneas un factor de 2 a 5 veces. Los mecanismos moleculares de la LME no han sido completamente descubiertos (Simpson G.G; Filipowicz W. Plant Mol. Biol. 1996, 32:1-41; Schuler M.A. 1998. Plant pre-mRNA splicing. In: J. Bailey-Serres & D.R. Gallie (Eds), A look beyond transcription: mechanisms determining mRNA stability and translation in plants. American Society of Plant Physiologists. p. 1-19; Lorkovic Z.J; Rirk D.A.W; Lambermon M.H.L; Filipowicz W. Trends in Plant Science. 2000, 5:160-167).
Las variaciones de la LME de la expresión que se observa entre células de plantas monocotiledóneas y dicotiledóneas, pueden deberse a que existen reconocidas diferencias entre los requerimientos necesarios para que ocurra un procesamiento adecuado de los pre- ARNm en células de plantas de clases diferentes. De hecho, en las células de plantas monocotiledóneas, a diferencia de lo que ocurre en dicotiledóneas, no es indispensable la existencia de segmentos ricos en AU dentro de los intrones para que ocurra el procesamiento de los mismos; pudiendo además las células monocotiledóneas procesar intrones que contienen estructuras de tallo con horquilla o tienen alto contenido de GC (más de 50%), lo que indica que las células dicotiledóneas no son capaces de procesar intrones con estructuras secundarias complejas ( Goodall G.J; Filipowicz W. The EMBO Journal 1991, 10:2635-2644; Lorkovic Z.J; Kirk D.A.W; Lambermon M.H.L; Filipowicz W. Trends in Plant Science. 2000, 5:160-167). Estas razones pueden explicar, al menos en parte, por qué los sistemas desarrollados hasta ahora, en los cuales se emplea la LME para potenciar artificialmente la expresión de secuencias nucleotídicas de interés, son clase específicos.
Descripción detallada de la invención:
La secuencia promotora de la expresión que se propone en esta invención, contiene un grupo de características propias que de conjunto la distinguen: 1) es funcionalmente universal por cuanto es activa tanto en células de plantas dicotiledóneas como monocotiledóneas, permitiendo la obtención de plantas transgénicas de cualquier clase con altos niveles de expresión de los genes y secuencias de ADN de interés; 2) se basa en una combinación de elementos genéticos ensamblados artificialmente de forma tal que no sólo incrementan los niveles del ARNm de interés mediante JJVIE, sino que además promueven la traducción de los mismos; 3) la ausencia en este promotor de largos fragmentos de ADN de secuencia idéntica a la natural o de origen viral, minimiza el riesgo de silenciamiento de la expresión mediada por ARN homólogos y la posibilidad de que surjan nuevas razas o cepas de viras como consecuencia de la recombinación homologa in planta; 4) la secuencia de la caja TATA hasta el sitio de inicio de la transcripción no tiene que tener necesariamente un elevado contenido de GC; 5) nuestra secuencia promotora es extremadamente versátil ya que diferentes elementos reguladores de la actividad transcripcional pueden ser insertados 5' a ella para conferir a la expresión capacidad de respuesta temporal, órgano, o tejido específica; 6) los elementos genéticos artificiales que la componen también pueden ser funcionalmente insertados entre cualquier promotor activo en células de plantas y una secuencia cualquiera de ADN, para incrementar la transcripción/traducción de esta última. El diseño de la región quimérica Exón/Intrón/Exón con una alta actividad potenciadora de la acumulación de ARNm en células de plantas de cualquier clase y su integración funcional a un potenciador artificial de la traducción constituyen dos componentes esenciales del presente objeto de invención, porque nos permiten expresar más eficientemente cualquier secuencia de ADN de interés en las células vegetales.
Es importante aclarar, que cuando decimos que una región, molécula o secuencia de ADN, es artificial o quimérica, nos estamos refiriendo a que la misma ha sido diseñada y fabricada in vitro y por lo tanto no existe en la naturaleza ningún elemento genético cuya estructura primaria del ADN sea idéntica a la de ella, independientemente de que algún pequeño fragmento componente suyo tenga origen natural.
Al diseñar un intrón, con sus regiones exónicas adyacentes, capaz de promover la actividad IME de la expresión, hubimos de estudiar qué motivos de secuencia y componentes genéticos eran comunes en aquellos intrones vegetales con reportada actividad potenciadora de la transcripción. Al mismo tiempo hubo de resolverse el reto que representa lograr un adecuado y eficiente procesamiento de este intrón, independientemente de su contenido de GC, en células de plantas de cualquier clase (dicotiledóneas o monocotiledóneas). Al comparar las secuencias de los intrones de actina-1 de arroz y ubiquitina-1 y sacarosa sintasa- 1 de maíz, ampliamente empleados como potenciadores de la transcripción, detectamos la presencia de motivos de secuencia comunes y repetidos en todos ellos (Figura 1). No está demostrado que ninguno de estos motivos en particular sea responsable de la LME que estos intrones confieren, pero el alto nivel de conservación del motivo CTCC (o secuencias homologas CTC, TCC y TC) en todas estas regiones, así como en las regiones 5 ' de las cajas TATA de muchos promotores vegetales, indican la posibilidad de que el mismo favorezca la unión de factores transcripcionales que promueven la actividad ARN- polimerasa II. Igualmente la abundancia y conservación de secuencias ricas en C y A en los primeros exones (regiones que quedarán como líderes no traducibles de los ARNm) y en los líderes virales de reportada actividad potenciadora de la traducción, indica que dichas secuencias pudieran promover la estabilidad de los ARNm resultantes y su capacidad para ser traducidos.
Es apropiado destacar que no existe completa demostración científica de ninguna de las hipótesis anteriormente adelantadas, por lo que no es obvio que la construcción de un intrón artificial con sus exones adyacentes, conteniendo repetidamente los motivos de secuencia por nosotros señalados, resulte en una región con una alta actividad potenciadora de la transcripción y acumulación de ARNm; sin embargo, los resultados de nuestro trabajo así lo indican.
A partir del mencionado estudio de comparación entre los diferentes intrones con sus correspondientes exones, decidimos diseñar una región Exón/Intrón/Exón artificial que combinara aquellos fragmentos de las secuencias de los intrones/exones de actina-1 de arroz y ubiquitina-1 de maíz, ricos en los motivos que consideramos relevantes para promover la actividad LME de la expresión. Al realizar esta tarea, hubo que tener en cuenta que el intrón artificial resultante debía ser procesable en células de plantas dicotiledóneas, para que el mismo pudiera también promover el incremento de la expresión en este tipo de células. Sin embargo, nos encontramos con la dificultad de que los intrones que utilizamos como material de construcción (actina-1 de arroz y ubiquitina-1 de maíz) tienen un alto contenido de GC, estructuras secundarias complejas con abundantes tallos, y sus puntos de ramificación cercanos al aceptor AG del sitio de procesamiento 3' poseen secuencias alejadas del consenso, por lo que difícilmente estos intrones sean eficientemente procesados en células de plantas dicotiledóneas.
A fin de simplificar la estractura secundaria del Exón/Intrón/Exón diseñado por nosotros para facilitar su procesamiento en células de plantas de cualquier clase, decidimos realizarle múltiples cambios puntuales de secuencia, así como insertar en el mismo secuencias tipo UUUUUAU que activan el procesamiento (Gniadkowski M; Hemmings-Mieszczak M; Klahre U; Liu H.X; Filipowicz W. Nucleic Acids Res. 1996, 24:619-627). Adicionalmente, nuestra secuencia quimérica se fusionó al segundo exón y se insertó dentro del segundo intrón de la actina-1 de maíz (IVS2), para aprovechar que este es altamente procesable en dicotiledóneas (Ej.: tabaco) (Goodall G.J; Filipowicz W. The EMBO Journal 1991, 10:2635-2644). La probable estractura secundaria de cada una de las variantes diseñadas de nuestro éxon/intrón/exón artificial, fue estudiada mediante análisis con ordenador empleando el programa PCFOLD 4.0 (Zuker M. Meth. Enzymology 1989, 180:262-288). Llamamos ART al Exón/Intrón/Exón artificial creado por nosotros. Como ya se mencionó, el segundo componente relevante del objeto de esta invención es un potenciador traduccional artificial que se fusionó a continuación del exón/intrón quimérico para elevar los niveles de la expresión.
El potenciador artificial de la traducción fue diseñado a partir del análisis de las secuencias y estructuras secundarias de diferentes líderes virales. De este análisis llegamos a la conclusión de que son tres los elementos esenciales en todos estos potenciadores traduccionales: 1) una estractura secundaria muy poco compleja; 2) segmentos de secuencia ricos en C y A; 3) motivos homólogos en más del 83% a la secuencia consenso HCAYYY (H= C ó U ó A; Y= C ó U, ver Tabla 1), expuestos y que con frecuencia se encuentran repetidos y/o en las horquillas de estructuras que tienen un tallo con baja temperatura de fusión. Tabla 1. Secuencias estructuralmente conservadas en los fragmentos líderes de varios virus ARN (H=C/U/A; Y=C/U).
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A partir de las premisas señaladas, diseñamos un potenciador traduccional artificial en el cual secuencias tipo HCAYYY colocadas dentro de sendas estructuras de tallo con horquilla, se insertaron dentro de una secuencia de 45 bases rica en C y A. Este potenciador traduccional artificial no tiene más de un 55 % de homología con los líderes de los viras ARN que sirvieron para obtener las premisas teóricas empleadas en su confección, e incluso, no existe entre ellos ningún segmento de secuencia de más de 6 nucleótidos que sea 100%o homólogo. Por esto podemos afirmar que nuestro potenciador artificial no se deriva de ningún potenciador traduccional anteriormente reportado o protegido (EP 0270611), ni contiene secuencias directamente derivadas de ellos. A nuestro potenciador traduccional quimérico se adicionaron sitios de restricción para facilitar su manipulación y la fusión de genes de interés a él. Finalmente, antes de fusionar el nuevo potenciador traduccional al exón/intrón artificial que creamos, su funcionalidad fue comprobada in vivo, demostrándose que posee la misma capacidad de potenciar la expresión de un gen quimérico que el fragmento Omega del TMV. Llamamos Eureka a este potenciador artificial de la traducción creado por nosotros (Figura 2).
Para construir la secuencia promotora objeto de esta invención, se diseñó inicialmente un promotor base formado por una caja TATA consenso (Joshi C.P. Nucleic Acids Res. 1987, 15:6643-6653) a la que se fusionó la región -24 a -4 (a partir del inicio de transcripción) del promotor 35S del CaMV, incorporando a continuación la región -5 a +27 del gen actina-1 de arroz que proveerá el sitio de inicio de la transcripción y una región rica en C y A. A continuación se fusionó la región +26 a +72 (a partir del inicio de transcripción) del gen ubiquitina-1 de maíz para proveer regiones ricas en AC y TC respectivamente, que conforman un primer exón artificial que se unió al segundo exón de la actina-1 de maíz, 12 bases antes del sitio de procesamiento 5' de su intrón IVS2 y hasta incluir a este último. Múltiples cambios, adiciones o deleciones de bases se realizaron alrededor de esta zona de unión de acuerdo a las predicciones por computadora, para evitar posibles estructuras secundarias que afectaran la maduración del ARN. El intrón artificial diseñado por nosotros se constituyó de: las primeras 54 bases del intrón IVS2, fusionadas a 37 bases de una región 5' del primer intrón de ubiquitina-1 de maíz correspondiente a las bases de +89 a +126 a partir del inicio de transcripción, seguidas de 375 bases del primer intrón de la actina-1 de arroz ( desde la posición +103 hasta la +477 a partir del inicio de transcripción de este gen), fusionadas a 33 bases del 3 'del intrón de ubiquitina-1 de maíz ( de la posición +1051 hasta +1083 a partir de su inicio de transcripción), unidas a la segunda mitad del intrón IVS2 de la actina-1 de maíz (de la posición -52 hasta la +5 a partir del sitio de procesamiento 3' de este intrón) y a una secuencia quimérica de 29 bases conteniendo sitios de restricción y una secuencia consenso de inicio de traducción ( Lütcke H.A; Chow K.C; Mickel F.S; Moss K.A; Kern H.F; Scheele GA. The EMBO Journal. 1987, 6:43-48). La secuencia del Exón/Intrón/Exón artificial ART creado por nosotros se muestra en la Figura 3. Después de comprobar la procesividad del Exón/Intrón/Exón que construímos, mediante pruebas de expresión transiente en células de tabaco y arroz, a su extremo 3' fue fusionado el potenciador traduccional Eureka, pudiendo apreciarse en la Figura 4 la estractura final de la secuencia promotora objeto de esta invención (promotor PARTE). Se debe destacar que el elemento potenciador ART diseñado por nosotros, se mostró más eficiente como potenciador de la expresión génica que el comúnmente utilizado primer exón/intrón/exón del gen actina-1 de arroz; siendo el fragmento Eureka un potenciador adicional de su actividad. En este trabajo se logra por vez primera confeccionar de forma artificial dos elementos genéticos muy eficientes como potenciadores de la expresión de cualquier secuencia de ADN en células de plantas transgénicas de cualquier clase, lo que demuestra la validez de los preceptos teóricos en los que nos hemos basado. Por primera vez también se logra que un intrón artificial con un contenido de AT menor de 52 % sea adecuadamente procesado en células de plantas dicotiledóneas, y que promueva en ellas alta actividad IME de la expresión. También constituye una novedad la construcción de un potenciador traduccional completamente artificial, altamente eficiente y de baja homología con los líderes de los viras ARN.
Diferentes regiones activadoras de la transcripción fueron fusionadas 5' a la secuencia promotora objeto de esta invención. Así, la región -43 a -310 (a partir del inicio de transcripción) del gen actina-1 de arroz fue colocada 5' a nuestro promotor PARTE, como se muestra en la Figura 5, para formar la región promotora APARTE, a la cual se agregaron elementos potenciadores de la transcripción del tipo as-\ ( Benfey P.N; Chua N.H. Science, 1990, 250:959-966), así como un fragmento de 556 bases de la región 5' del promotor ubiquitina-1 de maíz (de -299 a -855 a partir del inicio de transcripción) para dar finalmente lugar al promotor U3 ARTE, cuya estractura se muestra en la Figura 6. Muchas otras variantes de secuencias promotoras fueron construidas a partir de los elementos genéticos descritos (ver Figura 7), y todas ellas demostraron su funcionalidad en ensayos in vivo, comprobándose el efecto sinérgico sobre la expresión de todos los potenciadores y regiones activadoras empleadas.
El elemento as-\ empleado en nuestras construcciones como potenciador de la transcripción (ver Figura 6) posee un diseño novedoso por cuanto tiene menos de un 50 % de homología con el potenciador palindrómico de la octopina sintasa ( Ellis J.G; Llewellyn D.J; Walker J.C; Dennis E.S; Peacock W.J. EMBO J. 1987, 6:3203-3208; EP0278659), no es idéntico (menos de un 85 % de identidad) a ninguna de las variantes de este tipo de secuencias reivindicadas a partir del estudio hecho por Ellis y colaboradores (Bouchez D; Tokuhisa J.G; Llewellyn D.J; Dennis E.S; Ellis J.G. EMBO J. 1989, 8:4197-4204; USPat. 5,837,849), y los motivos TGACG presentes en él se encuentran dentro de un contexto de secuencias flanqueantes único. Es importante resaltar que si bien el promotor del gen actina-1 de arroz ha sido descrito y utilizado para expresar diferentes genes (McElroy D; Zhang W; Cao J; Wu R. Plant Cell 1990, 2:163-171; WO9109948), nuestro trabajo revela por vez primera la actividad potenciadora de la transcripción de la región 5' del mismo y su uso como potenciador heterólogo de la transcripción. De la misma forma, aunque el uso de la región 5' activadora de la transcripción del promotor ubiquitina-1 de maíz ha sido reivindicada (EP0342926), el fragmento de 556 bases empleado por nosotros no contiene los elementos de "caja de choque térmico" que se han definido como esenciales para la funcionalidad de este potenciador (se encuentran entre las posiciones -188 y -214 de la secuencia de este promotor), y por lo tanto es original y no obvia la actividad potenciadora de la transcripción de la secuencia del promotor ubiquitina que utilizamos.
El promotor PARTE fue también fusionado a un pequeño fragmento de 214 bases que se corresponde con la región -31 a -245 a partir del inicio de transcripción del gen gluB-1 de arroz (Takaiwa F; Oono K; Kato A. Plant Mol. Biol. 1991, 16:49-58) para formar la nueva región promotera GARTE ( Figura 8). Ensayos de expresión transiente demostraron que el nuevo promotor artificial GARTE es altamente eficiente para expresar secuencias de ADN en el endospermo de semillas.
Así concluimos que la combinación funcional de todos estos elementos quiméricos activadores 5' de la transcripción es novedosa y de gran utilidad para producir elementos genéticos que permitan lograr altos niveles de expresión de secuencias de ADN en células vegetales, independientemente de la clase a las cuales ellas pertenezcan. Es obvio que otras regiones activadoras 5' de diferentes promotores pueden ser fusionadas en cis al objeto de esta .invención a fin de lograr altos niveles de expresión y/o conferir a la expresión capacidad de respuesta temporal, órgano, o tejido específica. Para alguien con experiencia en las técnicas de la ingeniería genética, lo aquí descrito le posibilita el uso de los potenciadores ART y Eureka, en combinación con cualquier elemento promotor de la transcripción en células de plantas, para potenciar la transcripción/traducción de cualquier secuencia de ADN en células vegetales monocotiledóneas o dicotiledóneas. Igualmente, los preceptos teóricos, fruto de nuestras observaciones, que nos llevaron al diseño de ART y Eureka, pueden ser empleados por alguien con experiencia en técnicas de biología molecular para confeccionar nuevos potenciadores de la expresión de secuencias de ADN en células de plantas. Considerando el gran desarrollo alcanzado por la ingeniería genética de las plantas en las dos últimas décadas, es obvio que el promotor objeto de esta invención acoplado a un gen cualquiera y a una secuencia terminadora de la transcripción puede ser insertado en un vector para la transformación genética de células vegetales, y mediante técnicas establecidas y de probada eficacia obtener plantas transgénicas que expresen el gen en cuestión. Por un vector para la transformación genética se entiende en esta solicitud, una molécula de ADN (purificada, o contenida dentro de una célula bacteriana, o un viras), que sirve como vehículo portador para introducir en una célula vegetal cualquier fragmento de ADN previamente insertado en ella. Descripción de las Figuras
Figura 1. Secuencias de los genes actina-1 de arroz (Act), ubiquitina-1 de maíz (Ubi) y sacarosa sintasa- 1 de maíz (Shrun) a partir del inicio de la transcripción. Se muestra el primer exón (en letras mayúsculas) y la región 5' del primer intrón (en minúsculas), y la localización en ellas de motivos de secuencias comunes y repetidos (subrayados). Figura 2. Secuencia del potenciador traduccional artificial EUREKA, mostrando sus elementos relevantes y los sitios de restricción incluidos. Figura 3. Secuencia del Exón/Intrón Exón artificial ART, mostrando el origen de cada uno de sus fragmentos componentes (el intrón artificial está en minúsculas; subrayadas dobles están las bases insertadas para crear secuencias tipo UUUUUAU; se señalan algunos sitios de restricción relevantes (subrayados simples)). Figura 4. Estructura primaria del objeto de esta invención (promotor PARTE), mostrando el promotor base unido al Exón Intrón/Exón ART y al potenciador traduccional Eureka (en minúsculas itálicas el promotor, y en simples minúsculas el intrón; los exones están en mayúsculas; se señalan algunos sitios de restricción relevantes(subrayados), la caja TATA está doblemente subrayada, y el codón de inicio de traducción está en negritas). Figura 5. Estructura primaria del promotor APARTE, mostrando la región 5' reguladora de la expresión del gen actina-1 de arroz (región -43 a -310 a partir del inicio de transcripción, en mayúsculas-itálicas) unida al promotor PARTE (en minúsculas itálicas el promotor, y en simples minúsculas el intrón; los exones están en mayúsculas; se señalan algunos sitios de restricción relevantes (subrayados), la caja TATA está doblemente subrayada, y el codón de inicio de traducción está en negritas).
Figura 6. Estractura primaria del promotor U3ARTE, mostrando sus elementos componentes: región de -299 a -855 a partir del inicio de transcripción del gen ubi-1 de maíz, en mayúsculas; potenciador de la transcripción tipo as-1, en mayúsculas-negritas; región -43 a -310 a partir del inicio de transcripción del gen act-1 de arroz, en mayúsculas- itálicas; promotor PARTE en minúsculas (en doble subrayado la caja TATA, en itálicas el intrón ART, y en subrayado simple el inicio de traducción)).
Figura 7. Variantes de promotores con los elementos potenciadores objetos de esta invención. A: 35SEureka; B: 35SART; C: 35SARTE; D: PARTE; E: APARTE; F:
2A1PARTE; G: 2APARTE; H: U3ARTE. E Promotor 35S (1.3Kb); R Potenciador traduccional EurekaJ Exón/Intrón/Exón ART; Núcleo promotor artificial;
Región 5'activadora del gen actina-1 de arroz (-43 a -221); [jjj Región 5'activadora del gen actina-1 de arroz (-226 a -310); Kl ASP (Potenciador tipo as-1); fe l Región 5'activadora del promotor ubiquitina-1 de maíz (-299 a -855).
Figura 8. Estructura primaria del promotor GARTE, mostrando sus elementos componentes: región de -31 a -245 a partir del inicio de transcripción del gen gluB-l de arroz, en mayúsculas-itálicas; promotor PARTE (en minúsculas itálicas el promotor, y en simples minúsculas el intrón; los exones están en mayúsculas; se señalan algunos sitios de restricción relevantes (subrayados), la caja TATA está doblemente subrayada, y el codón de inicio de traducción está en negritas). Figura 9. Mapa del pUC-GUSint. Figura 10. Mapa del ρBPFΩ7. Figura 11. Mapa del pBPFAl9-linker.
Figura 12. Demostración comparativa por tinción histoquímica con X-Gluc de la funcionalidad de los elementos ART y Eureka en células de arroz mediante la expresión transiente de diferentes construcciones genéticas portadoras del gen GUSint, introducidas por bombardeo con microproyectiles acelerados.
Depósito de microorganismos Los plásmidos pC-EURGUSint; pC-ARTEGUSint; pGARTEGUSint y pC- U3ARTEGUSint fueron depositados bajo el Tratado de Budapest para la protección de Microorganismos en el Belgian Coordinated Collections of Microoganism, Plasmid Collection (BCCMZLMBP) Universiteit Gent, 'Fiers-Schell-Van Montagu' building, Technologiepark 927, B-9052 Gent-Zwijnaarde, Behca,. Los plasmidos pC-EURGUSint; pC-ARTEGUSint; pGARTEGUSint con los números de acceso LMBP 4727; LMBP 4725; LMBP 4728 respectivamente y con fecha del 19 de mayo, 2003 y el pC-U3ARTEGUSint con el numero 4791 del 25 de Noviembre del 2003.
EJEMPLOS DE REALIZACIÓN Ejemplo No.l: Construcción de los elementos constituyentes de un nuevo sistema quimérico para la expresión de secuencias de ADN en células de plantas.
Todos los fragmentos de ADN que se sintetizaron fueron creados con extremos cohesivos a diferentes sitios de restricción de endonucleasas tipo II para facilitar la clonación correcta de los mismos. a) Clonaje del potenciador traduccional Eureka.
El fragmento de ADN de 86 pares de bases (pb) correspondiente al potenciador traduccional Eureka (SEQ ID NO: 1), fue clonado en el vector pBluescript II SK (Stratagene, USA) previamente digerido con las enzimas Pstl y S cl, aprovechando que en el diseño del fragmento de ADN sintético se incluyeron extremos cohesivos con ambas enzimas de restricción. El plásmido resultante de este clonaje fue nombrado pBS-Eureka. b) Ensamblaje del Exón/Intrón/Exón artificial ART.
El Exón Intrón/Exón artificial ART se construyó mediante clonación a partir de ensamblar, uno a continuación de otro, los fragmentos de ADN diseñados. Inicialmente, el fragmento sintético de ADN llamado P35AcU (SEQ ID NO: 2) que contenía el promotor base, el primer Exón y parte del Intrón artificial, fue clonado en el vector pBluescript II SK digerido con las enzimas EcoRl y S^el, para obtener el plásmido pBS-AcU. A continuación, este último plásmido fue digerido con Spel y S cl, y en él se insertó el fragmento de ADN sintético I-U/Ac (SEQ ID NO: 3) que codifica para parte del intrón artificial. Así se obtuvo el plásmido pBS-AcUAc.
Seguidamente, el fragmento sintético de ADN I-Ac/U (SEQ ID NO: 4), conteniendo el final del Intrón artificial fue insertado en el plásmido pBS-AcUAc digerido con las enzimas BarníU y Sαcl, para producir el plásmido pBS-AcUAcU. Al insertar en el plásmido pBS-AcUAcU digerido con Spel y Sαcl, el fragmento IniT (SEQ LD NO: 5), se completó el Exón/Intrón/Exón artificial ART (SEQ JD NO: 6), conformándose el plásmido pBS-ART cuya estructura primaria entre los sitios EcoRI y Sαcl del vector pBlueScript II se muestra en la secuencia SEQ LD NO: 7. c) Construcción del promotor PARTE. Para la construcción de la secuencia promotora objeto de esta invención (promotor PARTE), se obtuvo mediante digestión Xhol - Pstl del plásmido pBS-ART el fragmento de ADN que contiene el promotor base y todo el Exón/Intrón/Exón ART sin su región 3', insertándolo en el plásmido pBS-Eureka digerido con estas mismas enzimas. Así logramos el plásmido pPARTE (Figura 4, Figura 7D), cuya secuencia entre los sitios EcoRI y Sαcl se muestra en la secuencia SEQ LD NO: 9. Ejemplo No.2: Demostración de la funcionalidad de los potenciadores Eureka y ART en células vegetales. a) Funcionalidad del potenciador traduccional Eureka en células de tabaco. Para verificar el poder potenciador de Eureka en células de tabaco y arroz se realizaron una serie de construcciones genéticas auxiliares. El gen reportero uidh con el intrón IV2 del gen ST-LS1 de papa insertado en el sitio SwαBI (GUSint), fue obtenido mediante digestión Ncol - Sαcl a partir del plásmido pUC-GUSint (Figura 9), y clonado en estos mismos sitios del plásmido pBS-Eureka, para dar lugar al vector pBS-EURGUSint. Este último plásmido fue digerido a continuación con las enzimas Psñ y Salí y tratado con la nucleasa SI para obtener el plásmido pBS-ΔEURGUSint; del cual se obtuvo, mediante digestión Xhdl - Kpnl, un fragmento de ADΝ conteniendo el potenciador Eureka fusionado al gen GUSint que se insertó en el vector pBPFΩ7 (Figura 10). De esta forma obtuvimos el vector pBPF-EURGUSint (Figura 7A), en el cual la expresión del gen GUSint está bajo el control del promotor 35S del CaMV (versión de 1.3 Kb), el potenciador Eureka y las señales de terminación de la transcripción del gen nos de Agrobacíerium tumefaciens (Tnos).
Como control para la evaluación de la expresión de la construcción pBPF-EURGUSint, se construyó el plásmido pBPFΩ-GUSint, clonando el gen GUSint, obtenido del pUC-GUSint mediante digestión Salí I Klenow y Kpnl, entre los sitios Smαl y Kpnl del vector pBPFΩ7. Este plásmido es similar al pBPF-EURGUSint excepto que en lugar del potenciador Eureka, la expresión del gen GUSint está bajo el control del potenciador Omega del TMV. Otro plásmido control se construyó mediante la eliminación del potenciador Omega de la construcción pBPFΩ-GUSint, por digestión consol - Ncol, tratamiento con Klenow y re- circularización del plásmido, para obtener el vector pBPF-GUSint.
De los plásmidos pBPFΩ-GUSint, pBPF-GUSint, y pBPF-EURGUSint fueron obtenidos, mediante digestión con HinaTll, los casetes para la expresión del gen GUSint en plantas; estos casetes se clonaron en el vector binario pCAMBIA2300, para dar lugar a los plásmidos binarios pC-Ω7GUSint, pC-GUSint y pC-EURGUSint, respectivamente. Después de introducir los plásmidos binarios obtenidos a la cepa de A. tumefaciens LBA4404, procedimos a ensayar la funcionalidad del potenciador Eureka mediante un experimento de expresión transitoria en células de tabaco ΝT1 según el protocolo descrito por An ( An G. Plant Physiol. 1985, 79:568-570) con algunas modificaciones. Después de cocultivar durante 4 días las células de tabaco con élAgrobacteήum portador de cada vector binario, las células fueron colectadas y procesadas según Jefferson ( Jefferson R.A. 1988. Plant repórter genes: the GUS gene fusión system. In: J.K. Setlow (Ed), Genetic Engineering. Vol.10, Plenum Publishing Corporation, p.247-263) para determinar la actividad β-glυcuronidasa (GUS) presente en las mismas. Cada experimento se realizó por triplicado con 5 réplicas por construcción cada vez, y los resultados se muestran en la siguiente tabla.
Tabla 2. Demostración de la funcionalidad del potenciador traduccional Eureka en células de tabaco.
Figure imgf000017_0001
Como se observa en los resultados expuestos en la Tabla 2, no existen diferencias significativas en cuanto a la actividad potenciadora del fragmento Eureka y la del líder Omega del TMV, por lo que se demuestra que hemos logrado por vez primera un eficiente potenciador traduccional completamente artificial. Así se confirman también nuestros presupuestos teóricos de que es posible construir un elemento genético con significativas propiedades potenciadoras de la traducción de las secuencias de ADN fusionadas a continuación de él en dirección 3', mediante la combinación de regiones de secuencias ricas en C y A, con secuencias homologas al motivo HCAYYY (H=C/T/A; Y=C/T). b) Funcionalidad del Exón/Intrón/Exón artificial ART en células de tabaco. Para comprobar la funcionahdad del elemento ART en células de tabaco, inicialmente se obtuvo el fragmento GUSint del pUC-GUSint mediante digestión con Ncol - Sαcl , y se clonó en el pBS-ART digerido con estas mismas enzimas, para dar lugar al plásmido pBS- ARTGUSint. Seguidamente, este último plásmido fue digerido con Salí - BglH y tratado con nucleasa SI, para dar lugar al pBS-ΔARTGUSint, de donde el fragmento ARTGUSint fue obtenido por digestión Xhól - Kpnl y clonado en el vector pBPFΩ7 digerido con las mismas enzimas, obteniéndose el plásmido pBPFARTGUSint (Figura 7B), donde la expresión del gen gus está bajo el control del promotor 35S del CaMV (versión de 1.3 Kb), el Exón/Intrón/Exón ART y las señales de terminación de la transcripción del gen nos de A. tumefaciens (Tnos). Del plásmido pBS-ΔARTGUSint, fue obtenida mediante digestión Xhól - Pstl, la banda que contiene el elemento ART y la misma se fusionó al vector PBS-EURGUSint digerido de la misma forma, para obtener el plásmido pBS-ARTEGUSint. De este último plásmido se obtuvo por digestión Xhól - Kpnl un fragmento de ADΝ conteniendo el gen GUSint bajo las señales de los elementos genéticos ART y Eureka, que se introdujo en el vector pBPFΩ7 digerido de igual forma, para producir el plásmido pBPFARTEGUSint (Figura 7C).
De los plásmidos pBPFARTGUSint y pBPFARTEGUSint fueron obtenidos, mediante digestión conH dlII, los casetes para la expresión del gen GUSint en plantas; estos casetes se clonaron en el vector binario pCAMBIA2300, para dar lugar a los plásmidos binarios pC- ARTGUSint y pC-ARTEGUSint, respectivamente. Después de introducir los plásmidos binarios obtenidos en la cepa de Agrobacterium tumefaciens LBA4404, procedimos a ensayar la funcionalidad del potenciador Eureka en experimentos de expresión transitoria empleando células de tabaco ΝT1, según se describió en la sección (a) de este mismo Ejemplo. Los resultados obtenidos se muestran en la Tabla 3. Tabla 3. Demostración de la funcionalidad de los elementos genéticos ART y Eureka en células de tabaco.
Figure imgf000019_0001
Los resultados de la evaluación de la funcionalidad de ART en células de tabaco demuestran que el intrón artificial es correctamente procesado y tiene actividad potenciadora de la expresión en células de plantas dicotiledóneas. Nuestros resultados experimentales también demuestran el sinergismo positivo sobre los niveles de expresión que se obtiene de la interacción de los elementos ART y Eureka en la constracción pBPFARTEGUSint, donde se logra superar en más de 5 veces la capacidad de expresión del conocido promotor natural 35S del CaMV.
También se prueba que los elementos genéticos artificiales que diseñamos (ART y Eureka) pueden ser funcionalmente insertados entre un promotor cualquiera que sea activo en células de plantas (en este caso el 35S del CaMV) y una secuencia cualquiera de ADN (aquí el gen GUSint), para incrementar la transcripción/traducción de esta última, c) Funcionalidad de los potenciadores Eureka y ART en células de arroz. Un grupo de nuevas construcciones fueron realizadas para probar la funcionalidad de nuestros potenciadores artificiales en células de plantas monocotiledóneas. Inicialmente, el fragmento Xhól - Kpnl del plásmido pBPFARTGUSint, conteniendo el gen uidA (gus) fusionado en su extremo 5 ' al Exón/Intrón ART, fue insertado en el vector pBPFA19-linker (Figura 11) digerido con las mismas enzimas de restricción, para formar el plásmido pBPF Al 9 ARTGUSint. En este último plásmido se ha sustituido el exón/intrón/exón de la actina-1 de arroz, presente en el pBPFA19-linker, por el elemento artificial ART, quedando como los otros elementos reguladores de la expresión el promotor quimérico Al 9 ( que consiste en la combinación del potenciador tipo as-l de la octopina sintasa cuatriplicado unido al promotor 35S del CaMV (versión de 400 pb)) y el terminador de la transcripción Tnos.
De la misma forma, la banda Xhól - Kpnl del plásmido pBS-ARTEGUSint, fue clonada en el vector pBPFA19-linker, para obtener la construcción ρBPFA19ARTEGUSint. Adicionalmente, una constracción control, pBPFAl9GUSint, fue realizada clonando el fragmento GUSint del plásmido pUC-GUSint en el vector pBPFA19-linker digerido con Ncol y Sαcl. Otro plásmido empleado como control fue el pBPFΩ-GUSint. La evaluación cualitativa de la capacidad de ART y Eureka como potenciadores de la expresión génica en células de arroz, se realizó mediante ensayos de expresión transitiva en callos de la variedad índica Perla. Los callos fueron obtenidos a partir de semillas maduras previamente esterilizadas con hipoclorito de sodio y alcohol, y cultivadas por 21 días en la oscuridad en el medio Ν6-2 ( Sales y vitaminas del medio Ν6 (Chu C.C; y otros. Scientia Sinicl975, 18:659); O.lg/L de mio-inositol; Hidrolizado de caseína 1 g/L; 2,4 D a 2mg/L; Sacarosa 30g/L; Fitagel 3g/L, pH 5.7). La transformación se realizó por bombardeo con microproyectiles; y antes del bombardeo los callos se subcultivaron en el medio Ν6-2 suplementado con 0.4 M de manitol para el pre-tratamiento osmótico. Los microproyectiles para el bombardeo se preparan empleando partículas esféricas de oro de 1 μm (BioRad), según protocolo publicado (Russell D.R., Wallace K.M., Bathe J.H., y otros. Plant Cell Rep. 1993, 12:165-169). La transformación se realiza empleando el sistema PDS-1000/He de Biorad. Para el disparo se colocan 30 callos en el centro de la placa para ser bombardeados con las siguientes condiciones: 1100 psi de presión, 6 cm de distancia y un disparo por placa. Después del disparo los callos permanecen en el mismo medio osmótico por 16 horas en la oscuridad y a continuación se subcultivan 2 días en medio Ν6-2 sin manitol. La actividad GUS es revelada con X-Gluc según el método histoquímico (Jefferson R.A. 1988. Plant repórter genes: the GUS gene fusión system. In: J.K. Setlow (Ed), Genetic Engineering. Vol.10, Plenum Publishing Corporation, p.247-263). La evaluación se realiza con la ayuda de un estereomicroscopio mediante el conteo de los puntos y zonas teñidas de azul en cada callo (Figura 12). Los resultados obtenidos después de 4 experimentos con 3 réplicas se muestran a continuación en la Tabla 4.
Tabla 4. Demostración comparativa de la funcionalidad de los elementos ART y Eureka en células de arroz.
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Como se puede apreciar, estos resultados experimentales confirman también la funcionalidad de ART y Eureka como elementos potenciadores de la expresión génica en células de plantas monocotiledóneas. Es importante resaltar que en nuestros ensayos, la actividad LME demostrada por el Exón Intrón/Exón artificial ART (p Al 9 ARTGUSint) rae superior a la del primer exón/intrón/exón de la actina-1 de arroz (pBPFA19GUSint), siendo este último un elemento genético de reconocida capacidad potenciadora de la expresión génica. Adicionalmente, aunque en nuestros experimentos no se observa una apreciable diferencia entre los resultados obtenidos con las construcciones p Al 9 ARTGUSint y pA19ARTEGUSint, si observamos la Figura 12 podremos notar que la presencia del fragmento Eureka en esta última constracción aumenta significativamente la expresión, ya que fueron mucho más grandes e intensas las zonas reveladas por la tinción histoquímica con X-Gluc en los callos bombardeados con el pAl9ARTEGUSint.
A modo de conclusión, con el presente Ejemplo demostramos la funcionalidad de los elementos genéticos artificiales ART y Eureka como potenciadores de la expresión génica en células de plantas de cualquier clase. Adicionalmente se demostró que estos elementos potenciadores son altamente eficientes e incrementan los niveles de expresión independientemente del promotor a que sean fusionados los mismos. Finalmente, también demostramos que ART y Eureka pueden combinarse para de forma sinérgica potenciar aún más la expresión de aquellos genes colocados bajo ellos. Nuevamente se demuestra que ART y Eureka pueden ser pueden ser funcionalmente insertados entre cualquier promotor activo en células de plantas (el Al 9 por ejemplo) y una secuencia cualquiera de ADN (el gen GUSint), para incrementar la transcripción/traducción de esta última. Ejemplo No. 3: Variantes del sistema de expresión PARTE, empleando diferentes regiones 5' activadoras de la transcripción. a) Adición al promotor PARTE de la región 5' activadora de la transcripción del gen actina- 1 de arroz.
Para fusionar en cis al promotor PARTE la región 5' activadora de la transcripción del gen actina-1 de arroz, el plásmido pPARTE fue digerido con las enzimas EcoRI y EcoRV, y en él se insertó el fragmento de ADN sintético En-Acl (de -43 a -221 a partir del inicio de transcripción del gen actina-1 de arroz; SEQ LO NO: 10) con extremos que ligan con las enzimas en cuestión. Así obtuvimos el plásmido pAlPARTE, el cual se digirió con EcóKM y Hinάlll para insertarle el fragmento de ADN sintético En-Ac2 (-226 a -310 a partir del inicio de transcripción del gen actina-1 de arroz; SEQ ID NO: 11) que completa la región 5' activadora del promotor del gen actina-1 de arroz, y obtenemos así el plásmido APARTE (Figura 5, Figura 7E) cuya secuencia nucleotídica entre los sitios Hindlll y Sαcl se muestra en la secuencia SEQ ID NO: 12. b) Adición al promotor APARTE de secuencias potenciadoras de la transcripción tipo αs-1. El plásmido pAlPARTE se digirió con Nrul y Salí y en él se insertó el fragmento sintético de ADN llamado ASP (SEQ ID NO: 13), que posee sitios cohesivos a las enzimas de restricción empleadas y codifica para una secuencia potenciadora de la transcripción tipo as-l, produciendo de esta forma la constracción pASPΔAlPARTE. Este último plásmido fue digerido con Salí, tratado con nucleasa SI y vuelto a digerir con PstI para obtener un fragmento de ADN de aproximadamente 900 pares de bases que fue clonado en el vector pAlPARTE digerido con Nrul y Pstl, para finalmente obtener el plásmido pASPAlPARTE, que tiene insertado el potenciador ASP en el sitio Nrul de la región 5' activadora de la transcripción de la actina-1 de arroz. Mediante digestión EcoKV - Xhól, se insertó un segundo potenciador ASP al plásmido pASPAlPARTE, para obtener el vector p2AlPARTE (ver secuencia nucleotídica de este plásmido entre los sitios Kpnl y Sαcl en la secuencia SEQ LD NO: 14), Figura 7F.
Al plásmido pASPAlPARTE, se insertó el fragmento sintético En-Ac2, tal y como se hizo al plásmido pAlPARTE, y obtuvimos la constracción pASPAPARTE a la que un segundo potenciador ASP se insertó mediante digestión EcóRV - Salí obteniéndose finalmente el vector p2APARTE (Figura 7G). La secuencia nucleotídica del p2APARTE entre los sitios Salí y Sαcl se muestra en la secuencia SEQ ID NO: 15. c) Constracción del promotor U3 ARTE.
Inicialmente se amplificó mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR), utilizando los oligonucleótidos cebadores Oli-Ul (SEQ ID NO: 16) y OH-U2 (SEQ ID NO: 17), un fragmento de ADN de aproximadamente 395 pb correspondiente a la región de -299 hasta - 680 a partir del inicio de transcripción del gen ubi-1 de maíz). El fragmento amplificado se digirió con las enzimas Kpnl y Xhól (sitios ambos incluidos en los cebadores) y clonó en el vector pBluescript II SK, igualmente procesado, para obtener la constracción pBS-Ubil. Seguidamente, un fragmento sintético de ADN (En-U2) que codifica para la región de -680 hasta -855 del gen ubi-l de maíz ( secuencia SEQ ID NO: 18) fue clonado en el vector pBS-Ubil digerido con las enzimas Ncol y Kpnl, conformándose la constracción pBS-Ubi2 que contiene la región 5' activadora de la transcripción del promotor ubiquitina-1 de maíz (de -299 a -855, secuencia SEQ LD O: 19). El fragmento clonado de la región 5' activadora de la transcripción del gen ubiquitina-1 de maíz, que no contiene las "cajas de choque térmico", fue obtenido del plásmido pBS-Ubi2 mediante digestión Xhól - Kpnl, e insertado en cis 5' al promotor 2APARTE por digestión San. - Kpnl del vector, para obtener la constracción que llamamos pU3ARTE (Figura 6, Figura 7H). La secuencia del vector pU3 ARTE entre los sitios Kpnl y Sαcl se muestra en la secuencia SEQ ID NO: 20. d) Construcción del promotor GARTE.
Para demostrar la plasticidad del objeto de esta invención, decidimos comprobar que la fusión al mismo de regiones regulatorias 5' de promotores con respuesta temporal, órgano, o tejido específica, le confiere la capacidad de lograr altos niveles de expresión con estas características. Así, la región 5' regulatoria del gen gluB-l de arroz que controla la órgano- especificidad de la expresión de la glutelina, fue fusionada en cis y 5 'al promotor PARTE. Para esto se sintetizó un fragmento de ADN de 214 bases (GLU) que se corresponde con la región -31 a -245 a partir del inicio de transcripción del gen gluB-l (SEQ ID NO: 21) y convenientes sitios de clonaje, para insertarlo en el plásmido pPARTE digerido con£coRI y Xhól, produciendo el vector pGARTE (Figura 8), cuya estructura primaria entre los sitios Xhól y Sαcl se muestra en la secuencia SEQ LD NO: 22.
Ejemplo No.4: Funcionalidad de las diferentes variantes del sistema de expresión PARTE en células de tabaco y arroz. Para evaluar en células de plantas monocotiledóneas y dicotiledóneas los niveles de expresión promovidos por cada una de las variantes del promotor objeto de esta invención, se eliminó mediante digestión Smal - Spel el promotor 35S del CaMV que controla la expresión del gen GUSint en el vector binario pC-ARTEGUSint, y en su lugar se insertó el fragmento Kpnl I nucleasa SI - Spel de cada una de las construcciones pAPARTE, p2AlPARTE, p2APARTE y pU3ARTE, para producir los nuevos vectores binarios pC- APARTEGUSint, pC-2AlPARTEGUSint, pC-2APARTEGUSint y pC-U3 ARTEGUSint. a) Ensayo en tabaco.
Los vectores binarios pC-AP ARTEGUSint, pC-2AlPARTEGUSint, pC-2AP ARTEGUSint y pC-U3ARTEGUSint fueron introducidos a células de A. tumefaciens para realizar experimentos de expresión transiente en células de tabaco NT 1, según se describió en la sección (a) del Ejemplo No.2. Como plásmido control se empleó el pC-GUSint donde la expresión del gengus esta bajo el control del promotor 35S del CaMV (versión de 1.3 Kb) y el terminador Tnos. Los experimentos se realizaron por duplicado (con cinco répücas para cada tratamiento) y los resultados obtenidos se muestran en la siguiente tabla: Tabla 5. Funcionalidad de las diferentes variantes del sistema de expresión PARTE en células de tabaco.
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Es evidente que nuestros resultados corroboran la funcionalidad de las diferentes variantes promotoras del objeto de esta invención, mostrando además que es posible modular la actividad del mismo en dependencia de las regiones 5' activadoras de la transcripción que sean fusionadas a PARTE. Es de resaltar que con nuestras construcciones genéticas logramos en células de plantas dicotiledóneas niveles de expresión superiores a los alcanzados por el promotor natural 35S del Viras del Mosaico de la Coliflor, b) Ensayo en arroz.
Los vectores binarios pC-AP ARTEGUSint, pC-2AlPARTEGUSint, pC-2AP ARTEGUSint y pC-U3 ARTEGUSint fueron bombardeados a callos de arroz según se describió en la sección (c) del Ejemplo No. 2, para evaluar la actividad de los diferentes promotores PARTE en células de plantas monocotiledóneas mediante ensayos de expresión transiente. Como plásmido control se empleó el pActl-F (McElroy D; Zhang W; Cao J; Wu R. Plant Cell 1990, 2:163-171) donde la expresión del gen gus está bajo el control del promotor del gen actina-1 de arroz y el terminador Tnos. De este plásmido se extrajo el cásete de expresión mediante digestión Kpnl - Xbál y se insertó en el plásmido binario pCAMBIA2300 digerido con estas mismas enzimas, para producir el vector pC-ActlF.
Los experimentos de bombardeo se realizaron por triplicado con 3 réplicas para cada construcción a evaluar. Los resultados obtenidos se muestran el la siguiente tabla:
Tabla 6. Funcionalidad de diferentes variantes del sistema de expresión PARTE en células de arroz.
Figure imgf000024_0002
Los resultados que muestra la tabla anterior certifican la funcionalidad de las diferentes variantes del promotor PARTE en células de plantas monocotiledóneas, lográndose con ellas niveles de expresión superiores al promotor natural del gen actina-1 de arroz. Así, se corrobora la utilidad del objeto de la presente invención como herramienta genética útil para lograr en células de plantas de cualquier clase altos niveles de expresión de cualquier secuencia de ADN colocada en cis bajo su control, c) Ensayo en semillas de arroz.
Para evaluar la tejido especificidad del promotor GARTE en endospermos de semillas de arroz, el fragmento Salí I Klenow - Pstl de aproximadamente 2.5 Kb del vector pBPFARTEGUSint, que contiene el fragmento Eureka fusionado al gen GUSint con el terminador nos (Tnos), se clonó en el vector pGARTE digerido con Xbάl I Klenow - Pstl para formar la constracción pGARTEGUSint.
También se construyó un plásmido control sustituyendo el promotor GARTE en el pGARTEGUSint, mediante digestión Xhól — Ncol, por un promotor altamente eficiente en el endospermo de semillas como el promotor del gen de la glutelina B-l de arroz, obtenido del plásmido pGEM-T-GluB-lprom por digestión Salí - Ncol. Así se obtuvo el pGluGUSint.
Las evaluaciones del promotor GARTE en comparación con el GluB-l, se realizaron según Y-S. Hwang ( Hwang Y-S; McCullar Cass; Huang N. Plant Science. 2001, 161: 1107-1116) mediante el bombardeo de endospermos inmaduros ( 8-9 días después de la polinización) aislados de los cariopsis de las espigas de la variedad de arroz índica Perla cultivada en invernadero. El ensayo fluorométrico para determinar la actividad GUS en los endospermos fue realizado según Jefferson (Jefferson RA. 1988. Plant repórter genes: the GUS gene fusión system. In: J.K. Setlow (Ed), Genetic Engineering. Vol.10, Plenum Publishing Corporation, p.247-263) 24 horas después del bombardeo con microp articulas de oro recubiertas con el ADN de los plásmidos a evaluar. Los resultados de la actividad GUS obtenidos en dos experimentos independientes con 5 réplicas cada uno se muestran en la
Tabla 7.
Tabla 7. Funcionalidad del promotor GARTE en endospermo de semillas de arroz.
Figure imgf000025_0001
Estos resultados confirman que el promotor quimérico GARTE basado en los elementos artificiales diseñados por nosotros es altamente eficiente para expresar genes en el endospermo do semillas; ya que aunque la secuencia GLU insertada en el promotor GARTE es capaz de conferir especificidad a la expresión, ella por si sola no garantiza altos niveles de la misma porque estos van a depender además de otros elementos constituyentes del promotor en cuestión ( Takaiwa F; Yamanouchi U; Yoshihara T; Washida H; Tanabe F; Kato A; Yamada K Plant Mol Biol. 1996, 30:1207-1221).
Más aún, los datos mostrados reafirman que la inserción de secuencias reguladoras corriente arriba al elemento objeto de esta invención permite que el mismo sea empleado para conducir eficientemente la expresión de cualquier secuencia de ADN de forma temporal, órgano o tejido específica. Es obvio para alguien con conocimientos en biología molecular de plantas, que las secuencias regulatorias del promotor GluB-l insertadas en el promotor GARTE, pueden ser exitosamente sustituidas por secuencias reguladoras que respondan a estrés biótico como por ejemplo el ataque de patógenos, abióticos como heridas, temperaturas, salinidad, sequía, o a la presencia de determinadas sustancias químicas, o a estreses oxidativos, o a diferentes estadios de desarrollo de los órganos y tejidos de la planta, etc.
Es evidente además, que las secuencias de ADN clonadas bajo las señales reguladoras objeto de esta invención pueden ser introducidas en células vegetales e insertadas establemente en ellas mediante conocidos métodos biológicos o físico-químicos de transformación, y que a partir de estas células modificadas genéticamente es posible regenerar plantas fértiles en las cuales las secuencias de ADN de interés se expresarán convenientemente según la variante de promotor que hayamos fusionado a ella. Así, la presente invención revela su potencialidad para contribuir a la producción de plantas transgénicas con mayores niveles de resistencia a plagas, enfermedades, estreses de diferentes tipos, mayores rendimientos agrícolas, o altamente eficientes en producir compuestos de uso médico o industrial, entre otros. LISTA DE SECUENCIAS
<110> Centro de Ingeniería Genética y Biotecnología <120> Promotor artificial para la expresión de secuencias de ADN en células vegetales .
<130> Promotor artificial <140> 0000
<141> 2002-11-18
<160> 22 <170> Patentln Ver. 2.1
<210> 1 <211> 86 <212> ADN <213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Potenciador traduccional Eureka.
<400> 1 gaaacaaatt gaacatcatt ctatcaatac aacacaaaca caacacaact caatcattta 60 tttgacaaca caactaaaca accatg 86
<210> 2
<211> 198
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Fragmento sintético P35AcU. <400> 2 gaattctata tataggaagt tcatttcatt tggagccccc caaccctacc accaccacca 60 ccaccacctc ctccttcaca caacacacac acaacagatc tcccccatcc tccctcccgt 120 cgcgccgcgc aacacctggt aagatggctg tgcgctcaga tatatatagt gatatgcact 180 acaaagatca taactagt 198
<210> 3 <211> 231 <212> ADN <213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Fragmento sintético I-U/Ac.
<400> 3 ctagaccgcc gcctcccccc ccccccctct ctaccttctc tctttctttc tccgtttttt 60 ttttccgtct cgtctcgatc tttggccttg gtagtttggg ggcgagaggc ggcttcgtcg 120 cccagatcgg tgcgcgtttt tttatttgga ggggcgggat ctcgcggctg ggtctcggcg 180 tgcggccgga ttctcgcggg gaatggggct ctcggatgtg gatccgagct c 231 <210> 4
<211> 255
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Fragmento sintético I-Ac/U.
<400> 4 gatctgatcc gccgttgttg ggggagatat ggggcgttta aaatttcgcc atgctaaaca 60 agatcaggaa gaggggaaaa gggcactatg gtttaatttt tatatatttc tgctgctgct 120 cgtcaggatt agatgtgctt gatctttctt tcttcttttt gtgggtagaa tttgaatccc 180 tcagcattgt tcatcggtag tttttctttt gtcgatgctc accctgttgt ttggtgtttt 240 tatactagtg agctc 255
<210> 5 <211> 93 <212> ADN <213> Secuencia Artificial
<220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Fragmento sintético IniT.
<400> 5 ctagtggcta tcctgacacg gtctctttgt caaatatctc tgtgtgcagg tataactgca 60 ggaaacaaca acaataacca tggtctagag ctc 93
<210> 6 <211> 692 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Exón/Intrón/Exón artificial ART.
<400> 6 accaccacca ccaccaccac ctcctccttc acacaacaca cacacaacag atctccccca 60 tcctccctcc cgtcgcgccg cgcaacacct ggtaagatgg ctgtgcgctc agatatatat 120 agtgatatgc actacaaaga tcataactag accgccgcct cccccccccc ccctctctac 180 cttctctctt tctttctccg tttttttttt ccgtctcgtc tcgatctttg gccttggtag 240 tttgggggcg agaggcggct tcgtcgccca gatcggtgcg cgttttttta tttggagggg 300 cgggatctcg cggctgggtc tcggcgtgcg gccggattct cgcggggaat ggggctctcg 360 gatgtggatc tgatccgccg ttgttggggg agatatgggg cgtttaaaat ttcgccatgc 420 taaacaagat caggaagagg ggaaaagggc actatggttt aatttttata tatttctgct 480 gctgctcgtc aggattagat gtgcttgatc tttctttctt ctttttgtgg gtagaatttg 540 aatccctcag cattgttcat cggtagtttt tcttttgtcg atgctcaccc tgttgtttgg 600 tgtttttata ctagtggcta tcctgacacg gtctctttgt caaatatctc tgtgtgcagg 660 tataactgca ggaaacaaca acaataacca tg 692
<210> 7 <211> 750 <212> ADN <213> Secuencia Artificial
<220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial:
Secuencia del vector pBS-ART entre los sitios EcoRI y Sacl .
<400> 7 gaattctata tataggaagt tcatttcatt tggagccccc caaccctacc accaccacca 60 ccaccacctc ctccttcaca caacacacac acaacagatc tcccccatcc tccctcccgt 120 cgcgccgcgc aacacctggt aagatggctg tgcgctcaga tatatatagt gatatgcact 180 acaaagatca taactagacc gccgcctccc cccccccccc tctctacctt ctctctttct 240 ttctccgttt tttttttccg tctcgtctcg atctttggcc ttggtagttt gggggcgaga 300 ggcggcttcg tcgcccagat cggtgcgcgt ttttttattt ggaggggcgg gatctcgcgg 360 ctgggtctcg gcgtgcggcc ggattctcgc ggggaatggg gctctcggat gtggatctga 420 tccgccgttg ttgggggaga tatggggcgt ttaaaatttc gccatgctaa acaagatcag 480 gaagagggga aaagggcact atggtttaat ttttatatat ttctgctgct gctcgtcagg 540 attagatgtg cttgatcttt ctttcttctt tttgtgggta gaatttgaat ccctcagcat 600 tgttcatcgg tagtttttct tttgtcgatg ctcaccctgt tgtttggtgt ttttatacta 660 gtggctatcc tgacacggtc tctttgtcaa atatctctgt gtgcaggtat aactgcagga 720 aacaacaaca ataaccatgg tctagagctc 750
<210> 8
<211> 757 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220>
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Exón/Intrón/Exón artificial ARTE.
<400> 8 accaccacca ccaccaccac ctcctccttc acacaacaca cacacaacag atctccccca 60 tcctccctcc cgtcgcgccg cgcaacacct ggtaagatgg ctgtgcgctc agatatatat 120 agtgatatgc actacaaaga tcataactag accgccgcct cccccccccc ccctctctac 180 cttctctctt tctttctccg tttttttttt ccgtctcgtc tcgatctttg gccttggtag 240 tttgggggcg agaggcggct tcgtcgccca gatcggtgcg cgttttttta tttggagggg 300 cgggatctcg cggctgggtc tcggcgtgcg gccggattct cgcggggaat ggggctctcg 360 gatgtggatc tgatccgccg ttgttggggg agatatgggg cgtttaaaat ttcgccatgc 420 taaacaagat caggaagagg ggaaaagggc actatggttt aatttttata tatttctgct 480 gctgctcgtc aggattagat gtgcttgatc tttctttctt ctttttgtgg gtagaatttg 540 aatccctcag cattgttcat cggtagtttt tcttttgtcg atgctcaccc tgttgtttgg 600 tgtttttata ctagtggcta tcctgacacg gtctctttgt caaatatctc tgtgtgcagg 660 tataactgca ggaaacaaat tgaacatcat tctatcaata caacacaaac acaacacaac 720 tcaatcattt atttgacaac acaactaaac aaccatg 757
<210> 9
<211> 815 '
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Descripción de la Secuencia Artificial:
Secuencia del vector pPARTE entre los sitios EcoRI y Sacl.
<400> 9 gaattctata tataggaagt tcatttcatt tggagccccc caaccctacc accaccacca 60 ccaccacctc ctccttcaca caacacacac acaacagatc tcccccatcc tccctcccgt 120 cgcgccgcgc aacacctggt aagatggctg tgcgctcaga tatatatagt gatatgcact 180 acaaagatca taactagacc gccgcctccc cccccccccc tctctacctt ctctctttct 240 ttctccgttt tttttttccg tctcgtctcg atctttggcc ttggtagttt gggggcgaga 300 ggcggcttcg tcgcccagat cggtgcgcgt ttttttattt ggaggggcgg gatctcgcgg 360 ctgggtctcg gcgtgcggcc ggattctcgc ggggaatggg gctctcggat gtggatctga 420 tccgccgttg ttgggggaga tatggggcgt ttaaaatttc gccatgctaa acaagatcag 480 gaagagggga aaagggcact atggtttaat ttttatatat ttctgctgct gctcgtcagg 540 attagatgtg cttgatcttt ctttcttctt tttgtgggta gaatttgaat ccctcagcat 600 tgttcatcgg tagtttttct tttgtcgatg ctcaccctgt tgtttggtgt ttttatacta 660 gtggctatcc tgacacggtc tctttgtcaa atatctctgt gtgcaggtat aactgcagga 720 aacaaattga acatcattct atcaatacaa cacaaacaca acacaactca atcatttatt 780 tgacaacaca actaaacaac catggtctag agctc 815
<210> 10 <211> 184 <212> ADN <213> Secuencia Artificial
<220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Fragmento sintético En-Acl.
<400> 10 atcaccgtga gttgtccgca ccaccgcacg tctcgcagcc aaaaaaaaaa aaagaaagaa 60 aaaaaagaaa aagaaaaaac agcaggtggg tccgggtcgt gggggccgga aaagcgagga 120 ggatcgcgag cagcgacgag gccggccctc cctccgcttc caaagaaacg ccccccatca 180 attc 184
<210> 11 <211> 94 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220>
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Fragmento sintético En-Ac2.
<400> 11 aagcttgata tccatagcaa gcccagccca acccaaccca acccaaccca ccccagtgca 60 gccaactggc aaatagtctc cacaccccgg cact 94
<210> 12 <211> 1087 <212> ADN <213> Secuencia Artificial
<220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial:
Secuencia del vector pAPARTE entre los sitios HindIII y Sacl.
<400> 12 aagcttgata tccatagcaa gcccagccca acccaaccca acccaaccca ccccagtgca 60 gccaactggc aaatagtctc cacaccccgg cactatcacc gtgagttgtc cgcaccaccg 120 cacgtctcgc agccaaaaaa aaaaaaagaa agaaaaaaaa gaaaaagaaa aaacagcagg 180 tgggtccggg tcgtgggggc cggaaaagcg aggaggatcg cgagcagcga cgaggccggc 240 cctccctccg cttccaaaga aacgcccccc atcaattcta tatataggaa gttcatttca 300 tttggagccc cccaacccta ccaccaccac caccaccacc tcctccttca cacaacacac 360 acacaacaga tctcccccat cctccctccc gtcgcgccgc gcaacacctg gtaagatggc 420 tgtgcgctca gatatatata gtgatatgca ctacaaagat cataactaga ccgccgcctc 480 cccccccccc cctctctacc ttctctcttt ctttctccgt tttttttttc cgtctcgtct 540 cgatctttgg ccttggtagt ttgggggcga gaggcggctt cgtcgcccag atcggtgcgc 600 gtttttttat ttggaggggc gggatctcgc ggctgggtct cggcgtgcgg ccggattctc 660 gcggggaatg gggctctcgg atgtggatct gatccgccgt tgttggggga gatatggggc 720 gtttaaaatt tcgccatgct aaacaagatc aggaagaggg gaaaagggca ctatggttta 780 atttttatat atttctgctg ctgctcgtca ggattagatg tgcttgatct ttctttcttc 840 tttttgtggg tagaatttga atccctcagc attgttcatc ggtagttttt cttttgtcga 900 tgctcaccct gttgtttggt gtttttatac tagtggctat cctgacacgg tctctttgtc 960 aaatatctct gtgtgcaggt ataactgcag gaaacaaatt gaacatcatt ctatcaatac 1020 aacacaaaca caacacaact caatcattta tttgacaaca caactaaaca accatggtct 1080 agagctc 1087
<210> 13 <211> 31 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Fragmento sintético ASP.
<400> 13 gtcgactgac gcttcgaatg acgcacatgc c 31
<210> 14
<211> 1065
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Descripción de la Secuencia Artificial:
Secuencia del vector p2AlPARTE entre los sitios Kpnl y Sacl.
<400> 14 ggtaccgggc cccccctcga ctgacgcttc gaatgacgca catgccatca ccgtgagttg 60 tccgcaccac cgcacgtctc gcagccaaaa aaaaaaaaag aaagaaaaaa aagaaaaaga 120 aaaaacagca ggtgggtccg ggtcgtgggg gccggaaaag cgaggaggat cgctgacgct 180 tcgaatgacg cacatgcccg agcagcgacg aggccggccc tccctccgct tccaaagaaa 240 cgccccccat caattctata tataggaagt tcatttcatt tggagccccc caaccctacc 300 accaccacca ccaccacctc ctccttcaca caacacacac acaacagatc tcccccatcc 360 tccctcccgt cgcgccgcgc aacacctggt aagatggctg tgcgctcaga tatatatagt 420 gatatgcact acaaagatca taactagacc gccgcctccc cccccccccc tctctacctt 480 ctctctttct ttctccgttt tttttttccg tctcgtctcg atctttggcc ttggtagttt 540 gggggcgaga ggcggcttcg tcgcccagat cggtgcgcgt ttttttattt ggaggggcgg 600 gatctcgcgg ctgggtctcg gcgtgcggcc ggattctcgc ggggaatggg gctctcggat 660 gtggatctga tccgccgttg ttgggggaga tatggggcgt ttaaaatttc gccatgctaa 720 acaagatcag gaagagggga aaagggcact atggtttaat ttttatatat ttctgctgct 780 gctcgtcagg attagatgtg cttgatcttt ctttcttctt tttgtgggta gaatttgaat 840 ccctcagcat tgttcatcgg tagtttttct tttgtcgatg ctcaccctgt tgtttggtgt 900 ttttatacta gtggctatcc tgacacggtc tctttgtcaa atatctctgt gtgcaggtat 960 aactgcagga aacaaattga acatcattct atcaatacaa cacaaacaca acacaactca 1020 atcatttatt tgacaacaca actaaacaac catggtctag agctc 1065
<210> 15
<211> 1135
<212> ADN . .
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Descripción de la Secuencia Artificial:
Secuencia del vector p2APARTE entre los sitios Salí y Sacl.
<400> 15 gtcgactgac gcttcgaatg acgcacatgc catccatagc aagcccagcc caacccaacc 60 caacccaacc caccccagtg cagccaactg gcaaatagtc tccacacccc ggcactatca 120 ccgtgagttg tccgcaccac cgcacgtctc gcagccaaaa aaaaaaaaag aaagaaaaaa 180 aagaaaaaga aaaaacagca ggtgggtccg ggtcgtgggg gccggaaaag cgaggaggat 240 cgctgacgct tcgaatgacg cacatgcccg agcagcgacg aggccggccc tccctccgct 300 tccaaagaaa cgccccccat caattctata tataggaagt tcatttcatt tggagccccc 360 caaccctacc accaccacca ccaccacctc ctccttcaca caacacacac acaacagatc 420 tcccccatcc tccctcccgt cgcgccgcgc aacacctggt aagatggctg tgcgctcaga 480 tatatatagt gatatgcact acaaagatca taactagacc gccgcctccc cccccccccc 540 tctctacctt ctctctttct ttctccgttt tttttttccg tctcgtctcg atctttggcc 600 ttggtagttt gggggcgaga ggcggcttcg tcgcccagat cggtgcgcgt ttttttattt 660 ggaggggcgg gatctcgcgg ctgggtctcg gcgtgcggcc ggattctcgc ggggaatggg 720 gctctcggat gtggatctga tccgccgttg ttgggggaga tatggggcgt ttaaaatttc 780 gccatgctaa acaagatcag gaagagggga aaagggcact atggtttaat ttttatatat 840 ttctgctgct gctcgtcagg attagatgtg cttgatcttt ctttcttctt tttgtgggta 900 gaatttgaat ccctcagcat tgttcatcgg tagtttttct tttgtcgatg ctcaccctgt 960 tgtttggtgt ttttatacta gtggctatcc tgacacggtc tctttgtcaa atatctctgt 1020 gtgcaggtat aactgcagga aacaaattga acatcattct atcaatacaa cacaaacaca 1080 acacaactca atcatttatt tgacaacaca actaaacaac catggtctag agctc 1135
<210> 16
<211> 31
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Oligonucleótido cebador Oli-Ul.
<400> 16 gaaggtaccg ccatggtcta aaggacaatt g 31
<210> 17 <211> 27 <212> ADN <213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Oligonucleótido cebador 01Í-U2.
<400> 17 ctcctcgagg gcgtttaaca ggctggc 27
<210> 18
<211> 186
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Fragmento sintético En-U2.
<400> 18 ggtaccgagc attgcatgtc taagttataa aaaattacca catatttttt ttgtcacact 60 tgtttgaagt gcagtttatc tatctttata catatattta aactttactc tacgaataat 120 ataatctata gtacaacaat aatatcagtg ttttagagaa tcatataaat gaacagttag 180 acatgg 186 <210> 19
<211> 563
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Descripción de la Secuencia Artificial:
Secuencia del activador transcripcional derivado del gen ubiquitina-1 de maiz (región -299 a -855) .
<400> 19 ggtaccgagc attgcatgtc taagttataa aaaattacca catatttttt ttgtcacact 60 tgtttgaagt gcagtttatc tatctttata catatattta aactttactc tacgaataat 120 ataatctata gtacaacaat aatatcagtg ttttagagaa tcatataaat gaacagttag 180 acatggtcta aaggacaatt gagtattttg acaacaggac tctacagttt tatcttttta 240 gtgtgcatgt gttctccttt ttttttgcaa atagcttcac ctatataata cttcatccat 300 tttattagta catccattta gggtttaggg ttaatggttt ttatagacta atttttttag 360 tacatctatt ttattctatt ttagcctcta aattaagaaa actaaaactc tattttagtt 420 tttttattta ataatttaga tataaaatag aataaaataa agtgactaaa aattaaacaa 480 atacccttta agaaattaaa aaaactaagg aaacattttt cttgtttcga gtagataatg 540 ccagcctgtt aaacgccctc gac 563
<210> 20 <211> 1692 <212> ADN <213> Secuencia Artificial
<220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial:
Secuencia del vector pU3ARTE entre los sitios Kpnl y Sacl,
<400> 20 ggtaccgagc attgcatgtc taagttataa aaaattacca catatttttt ttgtcacact 60 tgtttgaagt gcagtttatc tatctttata catatattta aactttactc tacgaataat 120 ataatctata gtacaacaat aatatcagtg ttttagagaa tcatataaat gaacagttag 180 acatggtcta aaggacaatt gagtattttg acaacaggac tctacagttt tatcttttta 240 gtgtgcatgt gttctccttt ttttttgcaa atagcttcac ctatataata cttcatccat 300 tttattagta catccattta gggtttaggg ttaatggttt ttatagacta atttttttag 360 tacatctatt ttattctatt ttagcctcta aattaagaaa actaaaactc tattttagtt 420 tttttattta ataatttaga tataaaatag aataaaataa agtgactaaa aattaaacaa 480 atacccttta agaaattaaa aaaactaagg aaacattttt cttgtttcga gtagataatg 540 ccagcctgtt aaacgccctc gactgacgct tcgaatgacg cacatgccat ccatagcaag 600 cccagcccaa cccaacccaa cccaacccac cccagtgcag ccaactggca aatagtctcc 660 acaccccggc actatcaccg tgagttgtcc gcaccaccgc acgtctcgca gccaaaaaaa 720 aaaaaagaaa gaaaaaaaag aaaaagaaaa aacagcaggt gggtccgggt cgtgggggcc 780 ggaaaagcga ggaggatcgc tgacgcttcg aatgacgcac atgcccgagc agcgacgagg 840 ccggccctcc ctccgcttcc aaagaaacgc cccccatcaa ttetatatat aggaagttca 900 tttcatttgg agccccccaa ccctaccacc accaccacca ccacctcctc cttcacacaa 960 cacacacaca acagatctcc cccatcctcc ctcccgtcgc gccgcgcaac acctggtaag 1020 atggctgtgc gctcagatat atatagtgat atgcactaca aagatcataa ctagaccgcc 1080 gcctcccccc ccccccctct ctaccttctc tctttctttc tccgtttttt ttttccgtct 1140 cgtctcgatc tttggccttg gtagtttggg ggcgagaggc ggcttcgtcg cccagatcgg 1200 tgcgcgtttt tttatttgga ggggcgggat ctcgcggctg ggtctcggcg tgcggccgga 1260 ttctcgcggg gaatggggct ctcggatgtg gatctgatcc gccgttgttg ggggagatat 1320 ggggcgttta aaatttcgcc atgctaaaca agatcaggaa gaggggaaaa gggcactatg 1380 gtttaatttt tatatatttc tgctgctgct cgtcaggatt agatgtgctt gatctttctt 1440 tcttcttttt gtgggtagaa tttgaatccc tcagcattgt tcatcggtag tttttctttt 1500 gtcgatgctc accctgttgt ttggtgtttt tatactagtg gctatcctga cacggtctct 1560 ttgtcaaata tctctgtgtg caggtataac tgcaggaaac aaattgaaca tcattctatc 1620 aatacaacac aaacacaaca caactcaatc atttatttga caacacaact aaacaaccat 1680 ggtctagagc te 1692 <210> 21 <211> 223 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Fragmento sintético G U.
<400> 21 ctcgagatac atattaagag tatggacaga catttcttta acaaactcca tttgtattac 60 tccaaaagca ccagaagttt gtcatggctg agtcatgaaa tgtatagttc aatcttgcaa 120 agttgccttt ccttttgtac tgtgttttaa cactacaagc catatattgt ctgtacgtgc 180 aacaaactat atcaccatgt atcccaagat gcttttttaa ttc 223
<210> 22 <211> 1032 <212> ADN <213> Secuencia Artificial
<220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial:
Secuencia del vector pGARTE entre los sitios Xhol y Sacl.
<400> 22 ctcgagatac atattaagag tatggacaga catttcttta acaaactcca tttgtattac 60 tccaaaagca ccagaagttt gtcatggctg agtcatgaaa tgtatagttc aatcttgcaa 120 agttgccttt ccttttgtac tgtgttttaa cactacaagc catatattgt ctgtacgtgc 180 aacaaactat atcaccatgt atcccaagat gcttttttaa ttetatatat aggaagttca 240 tttcatttgg agccccccaa ccctaccacc accaccacca ccacctcctc cttcacacaa 300 cacacacaca acagatctcc cccatcctcc ctcccgtcgc gccgcgcaac acctggtaag 360 atggctgtgc gctcagatat atatagtgat atgcactaca aagatcataa ctagaccgcc 420 gcctcccccc ccccccctct ctaccttctc tctttctttc tccgtttttt ttttccgtct 480 cgtctcgatc tttggccttg gtagtttggg ggcgagaggc ggcttcgtcg cccagatcgg 540 tgcgcgtttt tttatttgga ggggcgggat ctcgcggctg ggtctcggcg tgcggccgga 600 ttctcgcggg gaatggggct ctcggatgtg gatctgatcc gccgttgttg ggggagatat 660 ggggcgttta aaatttcgcc atgctaaaca agatcaggaa gaggggaaaa gggcactatg 720 gtttaatttt tatatatttc tgctgctgct cgtcaggatt agatgtgctt gatctttctt 780 tcttcttttt gtgggtagaa tttgaatccc tcagcattgt tcatcggtag tttttctttt 840 gtcgatgctc accctgttgt ttggtgtttt tatactagtg gctatcctga cacggtctct 900 ttgtcaaata tctctgtgtg caggtataac tgcaggaaac aaattgaaca tcattctatc 960 aatacaacac aaacacaaca caactcaatc atttatttga caacacaact aaacaaccat 1020 ggtctagagc te 1032

Claims

REIVINDICACIONES
1) Un promotor artificial caracterizado porque es una molécula de ADN recombinante que promueve en células vegetales la expresión de cualquier secuencia de ADN fusionada a su extremo 3', y que se compone de: a) un elemento 5' regulador de la transcripción seguido de, b) un núcleo promotor artificial que comprende una caja TATA, una secuencia nucleotídica con un contenido de GC menor de 64% y un sitio de iniciación de la transcripción, que en su 3' se une a, c) una secuencia nucleotídica sintética transcribible y no traducible, conformada por un primer Exón quimérico, un Intrón artificial capaz de potenciar en células vegetales la expresión de los genes fusionados a él, y un segundo Exón quimérico con propiedades potenciadoras de la traducción de cualquier gen insertado a continuación del mismo.
2) Un promotor artificial caracterizado porque es una molécula de ADN recombinante según la reivindicación 1 donde el elemento 5' regulador de la transcripción es artificial.
3) Un promotor artificial caracterizado porque es una molécula de ADN recombinante según la reivindicación 1 donde el elemento 5' regulador de la transcripción es homólogo a una secuencia de ADN que de forma natural estimula y/o regula la expresión génica en células de plantas. 4) Un promotor artificial según la reivindicación 3, caracterizado porque el elemento 5' regulador de la transcripción proviene del gen actina-1 de arroz.
5) Un promotor artificial según la reivindicación 4, donde el elemento 5' regulador de la transcripción comprende un fragmento de la región de -43 a -310 a partir del inicio de transcripción del gen actina-1 de arroz. 6) Un promotor artificial según la reivindicación 5 cuya secuencia nucleotídica del elemento
5' regulador de la transcripción se corresponda con la secuencia SEQ ID NO: 10 ó con un fragmento de ella.
7) Un promotor artificial según la reivindicación 5, cuya secuencia nucleotídica del elemento 5' regulador de la transcripción se corresponda con la secuencia SEQ ID NO: li ó con un fragmento de ella.
8) Un promotor artificial según la reivindicación 3, caracterizado porque el elemento 5' regulador de la transcripción proviene del gen ubiquitina-1 de maíz. 9) Un promotor artificial según la reivindicación 8, donde el elemento 5' regulador de la transcripción comprende un fragmento de la región de -299 a -855 a partir del inicio de transcripción del genubiquitina-1 de maíz.
10) Un promotor artificial según la reivindicación 9, cuya secuencia nucleotídica del elemento 5' regulador de la transcripción se corresponda con la secuencia SEQ LD NO: 19 ó con un fragmento de ella.
11) Un promotor artificial según las reivindicaciones 2 y 3 donde el elemento 5' regulador de la transcripción es un potenciador transcripcional tipo as-1.
12) Un promotor artificial según la reivindicación 11, donde la secuencia nucleotídica del potenciador transcripcional tipo as-1 es esencialmente idéntica a la secuencia del fragmento que corresponde a los nucleótidos del 7 al 26 en la SEQ ID NO: 13, o a su secuencia complementaria.
13) Un promotor artificial según la reivindicación 3 donde el elemento 5' regulador de la transcripción provenga de un promotor de origen viral. 14) Un promotor artificial según la reivindicación 13, donde el elemento 5' regulador de la transcripción proviene del promotor 35S del CaMV.
15) Un promotor artificial según la reivindicación 2 y 3 caracterizado porque el elemento 5' regulador de la transcripción controla la expresión génica en las células vegetales de forma temporal, órgano o tejido específica. 16) Un promotor artificial según la reivindicación 15 caracterizado porque el elemento 5' regulador de la transcripción controla la expresión génica en semillas.
17) Un promotor artificial según la reivindicación 16 donde el elemento 5' regulador de la transcripción proviene del gen glutelina B-l de arroz.
18) Un promotor artificial según la reivindicación 17, donde el elemento 5' regulador de la transcripción comprende un fragmento de la región de -31 a -245 a partir del inicio de transcripción del gen glutelina B-l de arroz.
19) Un promotor artificial según la reivindicación 18 caracterizado porque la secuencia nucleotídica del elemento 5' regulador de la transcripción se corresponda con la secuencia SEQ ID NO: 21 o con un fragmento de ella. 20) Un promotor artificial según la reivindicación 15 cuyo elemento 5' regulador de la transcripción controla la expresión génica en células vegetales sometidas a condiciones de estrés biótico o abiótico.
21) Un promotor artificial según la reivindicación 15, cuyo elemento 5' regulador de la transcripción controla la expresión génica en tejidos vegetales que han sufrido heridas. 22) Un promotor artificial según la reivindicación 1 cuya región 5' reguladora de la transcripción se compone de dos o más elementos reguladores de diferentes orígenes operativamente acoplados, y que individualmente responden a alguna de las características señaladas en las reivindicaciones de la 2 a la 21. 23) Un promotor artificial según la reivindicación 1 cuyo primer Exón componente de la región artificial Exón/lntrón/Exón contiene motivos de secuencias con alto contenido de C y A.
24) Un promotor artificial según la reivindicación 1 cuyo primer Exón componente de la región artificial Exón/Intrón/Exón contiene secuencias donde se repite con frecuencia el motivo CTCC y/o sus secuencias homologas CTC, TCC y TC.
25) Un promotor artificial según la reivindicación 1, cuyo Intrón componente de la región artificial Exón/Intrón/Exón contiene secuencias donde se repite con frecuencia el motivo CTCC y/o sus secuencias homologas CTC, TCC y TC.
26) Un promotor artificial según las reivindicaciones de la 23 a la 25, cuya secuencia nucleotídica de la región artificial Exón/Intrón Exón se corresponda con la secuencia SEQ
JJD NO: 6 o con un fragmento de ella .
27) Un promotor artificial según la reivindicación 1 cuyo segundo Exón componente de la región artificial Exón/Intrón/Exón contiene motivos de secuencias con alto contenido de C y A. 28) Un promotor artificial según la reivindicación 1, donde el segundo Exón componente de la región artificial Exón/Intrón/Exón contiene al menos una secuencia en más de un 83% homologa al motivo HCAYYY (H= C ó T ó A; Y= C ó T).
29) Un promotor artificial según las reivindicaciones 27 y 28, caracterizado porque la secuencia nucleotídica del segundo Exón componente de la región artificial Exón/Intrón/Exón se corresponde con la secuencia SEQ LO NO: 1.
30) Un promotor artificial según las reivindicaciones de la 23 a la 29, caracterizado porque la secuencia nucleotídica de la región artificial Exón/Intrón/Exón se corresponde con la secuencia SEQ ID NO: 8 o con un fragmento de ella.
31) Un promotor artificial que responda a alguna de las reivindicaciones de la 1 a la 30, y que al menos parcialmente se corresponda con la secuencia SEQ ID NO: 20.
32) Un fragmento de ADN de un promotor artificial según las reivindicaciones de la 1 a la 31, que fusionado a cualquier promotor funcional en células de plantas, contribuya a potenciar la expresión de las secuencias de ADN controladas por este promotor. 33) Un fragmento de un promotor artificial según la reivindicación 32, con capacidad potenciadora de la traducción de los genes fusionados a él.
34) Un fragmento de un promotor artificial según la reivindicación 33, que contenga al menos un fragmento de secuencia en más de un 83% homologa al motivo HCAYYY (H= C ó T ó A; Y= C ó T).
35) Un fragmento de un promotor artificial según la reivindicación 33, que contenga motivos de secuencias con alto contenido de C y A.
36) Un fragmento de un promotor artificial según la reivindicación 33, cuya secuencia nucleotídica se corresponda con la secuencia SEQ ID NO: 1. 37) Un fragmento de un promotor artificial según las reivindicaciones de la 33 a la 36, que en células vegetales contribuya a aumentar la traducción de cualquier ARNm producido a partir del promotor 35S del CaMV.
38) Un fragmento de un promotor artificial según la reivindicación 32 que se corresponda con una región Exón/Intrón/Exón. 39) Un fragmento de un promotor artificial según la reivindicación 38, cuyo primer Exón contiene motivos de secuencias con alto contenido de C y A.
40) Un fragmento de un promotor artificial según la reivindicación 38, cuyo primer Exón contiene secuencias donde se repite con frecuencia el motivo CTCC y/o sus secuencias homologas CTC, TCC y TC. 41) Un fragmento de un promotor artificial según la reivindicación 38, cuyo Intrón contiene secuencias donde se repite con frecuencia el motivo CTCC y/o sus secuencias homologas
CTC, TCC y TC.
42) Un fragmento de un promotor artificial según la reivindicación 38, cuya secuencia nucleotídica se corresponda con la secuencia SEQ ID NO: 6. 43) Un fragmento de un promotor artificial según la reivindicación 38, cuya secuencia nucleotídica se corresponda con la secuencia SEQ TD NO: 8.
44) Un fragmento de un promotor artificial según las reivindicaciones de la 38 a la 43, que en células vegetales contribuya a aumentar la expresión de cualquier gen puesto bajo el control del promotor 35S del CaMV. 45) Un fragmento de un promotor artificial según la reivindicación 32, que se corresponda con un potenciador transcripcional tipo as-1.
46) Un fragmento de un promotor artificial según la reivindicación 45, cuya secuencia nucleotídica sea esencialmente idéntica a la secuencia del fragmento que corresponde a los nucleótidos del 7 al 26 en la SEQ ID NO: 13, o a su secuencia complementaria. 47) Un fragmento de un promotor artificial según la reivindicación 32, que se corresponda con un elemento 5' regulador de la transcripción.
48) Un fragmento de un promotor artificial según la reivindicación 47, cuyo elemento 5' regulador de la transcripción provenga del gen actina-1 de arroz. 49) Un fragmento de un promotor artificial según la reivindicación 48, cuya secuencia nucleotídica comprende un fragmento de la región de -43 a -310 a partir del inicio de transcripción del gen actina-1 de arroz.
50) Un fragmento de un promotor artificial según la reivindicación 49, cuya secuencia nucleotídica se corresponda con la secuencia SEQ ID NO: 10 o con un fragmento de ella. 51) Un fragmento de un promotor artificial según la reivindicación 49, cuya secuencia nucleotídica se corresponda con la secuencia SEQ ID NO: l i o con un fragmento de ella.
52) Un fragmento de un promotor artificial según la reivindicación 47, cuyo elemento 5' regulador de la transcripción provenga del gen ubiquitina-1 de maíz.
53) Un fragmento de un promotor artificial según la reivindicación 52, cuya secuencia nucleotídica comprende un fragmento de la región de -299 a -855 a partir del inicio de transcripción del genubiquitina-1 de maíz.
54) Un fragmento de un promotor artificial según la reivindicación 53, cuya secuencia nucleotídica se corresponda con la secuencia SEQ ID NO: 19 o con un fragmento de ella.
55) Un cásete para la expresión de secuencias de ADN en células vegetales conteniendo un promotor artificial que responde a alguna de las reivindicaciones de la 1 a la 31.
56) Un cásete para la expresión de secuencias de ADN en células vegetales conteniendo un elemento promotor de la transcripción funcionalmente unido a un fragmento de ADN que responde a alguna de las reivindicaciones de la 32 a la 54.
57) Un vector de ADN para la transformación de células vegetales conteniendo uno de los casetes de expresión caracterizados en las reivindicaciones 55 ó 56.
58) Una célula bacteriana portadora del vector de la reivindicación 57, y su descendencia.
59) Una célula vegetal transformada con el vector de la reivindicación 57, y su descendencia.
60) Una célula vegetal según la reivindicación 59, que expresa el fragmento de ADN que se encuentra bajo el control del promotor artificial contenido en el cásete de expresión que fue introducido mediante el vector descrito en la reivindicación 57.
61) Una célula vegetal según la reivindicación 59, con el cásete de expresión caracterizado en la reivindicación 55 ó 56 establemente integrado a su genoma. 62) Una planta transgénica regenerada a partir de la célula vegetal caracterizada en la reivindicación 61.
63) Una planta transgénica según la reivindicación 62, que expresa el fragmento de ADN que se encuentra bajo el control del promotor artificial contenido en el cásete de expresión que fue introducido mediante el vector descrito en la reivindicación 57.
64) La descendencia de las plantas transgénicas caracterizadas en la reivindicación 63.
65) Las plantas de la reivindicación 64 que sean dicotiledóneas.
66) Las plantas de la reivindicación 65 que sean solanáceas.
67) Las plantas de la reivindicación 66 que pertenezcan a una de las siguientes especies: tabaco, tomate o papa.
68) Las plantas de la reivindicación 64 que sean monocotiledóneas.
69) Las plantas de la reivindicación 68 que sean gramíneas.
70) Las plantas de la reivindicación 69 que pertenezcan a una de las siguientes especies: arroz, caña de azúcar, maíz, trigo o cebada. 71) La purificación y utilización de la proteína recombinante que producen las células o las plantas de las reivindicaciones 60 ó 63, como resultado de la expresión del fragmento de ADN que se encuentra bajo el control del promotor artificial contenido en el cásete de expresión que fue introducido mediante el vector descrito en la reivindicación 57.
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