JP2023015421A - エンハンサー - Google Patents

Abstract

【課題】プロモーターの内部に組み込む、或いはプロモーターと作動可能に連結することにより、プロモーターの転写活性を増強することのできる新規なエンハンサーの提供。【解決手段】トウモロコシユビキチン１遺伝子プロモーターの一部の領域を示す３５０個のポリヌクレオチドからなる塩基配列であり、以下の（ｉ）又は（ｉｉ）のポリヌクレオチドを含む、エンハンサー：（ｉ）２０１位～３００位の領域中の少なくとも４０の連続した塩基配列を含むポリヌクレオチド、（ｉｉ）（ｉ）のポリヌクレオチドと配列同一性が９０％以上の塩基配列からなり、且つプロモーター転写活性の増強作用を有するポリヌクレオチド。【選択図】なし

Description

本発明は、新規なエンハンサーに関し、より詳細には、プロモーターの内部に組み込む、或いはプロモーターと作動可能に連結することにより、プロモーターの転写活性を増強することのできるエンハンサーに関する。

産業上有益な植物の新品種を開発するために、植物同士を交配させて後代を選抜する交配育種法や、植物に突然変異を誘発させる突然変異育種法などが従来行われている。また近年では、有用遺伝子を植物に導入してその機能を発現させる遺伝子組換え植物の開発に加え、ゲノム編集技術による遺伝子の機能を改変した有用作物の品種開発も行われている。新品種の開発のためには、外来の遺伝子の導入や、内生遺伝子の発現の制御が有効な手段である。いずれの場合も、対象遺伝子を高いレベルで発現させることが効果的である場合が多い。そのためには、強力なプロモーターの利用や、外来または内生の遺伝子のプロモーターを増強する手段などがある。強力なプロモーターとしては、植物ウイルスプロモーター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス35Sプロモーター）やハウスキーピング遺伝子（例えば、ユビキチン遺伝子やアクチン遺伝子）等の構成的発現プロモーターなどの例がある。一方、プロモーターを増強する手段としては、エンハンサーの利用が有効である。エンハンサーは、遺伝子発現過程における転写を促進する因子であり、様々なシスエレメント配列で構成されている（非特許文献１）。シスエレメント配列は、温度、光、水、塩、化学物質、内生ホルモン等の非生物的ストレスに応答するものや、病原菌感染、食害等の生物的ストレスに応答するものが知られている（非特許文献１）。エンハンサーを構成するシスエレメント配列の組み合わせは、遺伝子発現を調節する上で極めて重要である。一般に、エンハンサーは、プロモーターの近傍に位置しており、その配置方向とは関係なく効果を示す場合もある。

しかしながら、その効果が確認されており、且つ利用しやすいエンハンサーは数少ない。近年では、次世代シークエンサーとバイオインフォマティクスとを用いた解析技術の向上により、遺伝子近傍や遺伝子から距離が離れた遺伝子間領域に存在する、エンハンサーではないかと考えられる因子を、植物ゲノム全体にわたって網羅的に予測できるようになってきている（非特許文献２）。例えば、シロイヌナズナ（非特許文献３）、トウモロコシ（非特許文献４）、コムギ（非特許文献５）で予測されたエンハンサーが報告されている。しかし、それらは膨大な数の候補因子に過ぎず、エンハンサー効果が検証されているものは少ない。現時点では、利用できるエンハンサーの数は極めて限られている。

エンハンサーの候補因子が、実際にエンハンサー効果を示すかどうかを検定するためには、カリフラワーモザイクウイルス（CaMV）35Sプロモーターの最小領域（コア領域ともいう）を用いるのが一般的である。このプロモーター自体は、強い構成的発現プロモーターとして知られているが、上記の最小領域以外の領域を取り除くと、発現レベルの弱い、最低限のプロモーター因子（最小プロモーター）となる。エンハンサー効果のある因子とCaMV 35S由来の最小プロモーターとを組み合わせると、再び強いプロモーター活性を示すようになることから、容易にエンハンサー活性の検定ができる。その例として、G-boxモチーフ（非特許文献６、７、特許文献１）、アブシジン酸応答エレメント（非特許文献８）、G-boxとW-boxモチーフとの組み合わせ（非特許文献９）、ダイズ由来熱ショックエレメント（非特許文献１０）、イネ由来GCN4とAACAモチーフとの組み合わせ（非特許文献１１）などの報告がある。また、動物研究分野では、高発現プロモーターとして知られるヒトEF-1αプロモーターの上流に、G-boxモチーフや異種由来のエンハンサー配列を組み込み、より効果的な遺伝子発現システムを構築する試みが報告されている（非特許文献１２）。

近年では、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFN）、TALエフェクターヌクレアーゼ（TALEN）、メガヌクレアーゼ、CRISPR/Cas9等の配列特異的なヌクレアーゼを利用したゲノム編集技術開発の躍進で、目的の内在遺伝子に変異を導入することや、標的とする配列に改変を加えることが可能になってきている（非特許文献１３、非特許文献１４）。遺伝子組換え技術やゲノム編集技術を駆使し、目的遺伝子のネイティブプロモーターを改変して望ましい発現様式を付与することは、新品種を開発する上で、有用遺伝子を集積する手段として非常に有効である。例えば、弱いネイティブプロモーターの配列を改変して遺伝子を高発現させる試みとして、配列の一部をG-boxモチーフに置換したダイズのGlycinin遺伝子のプロモーター（GmScreamM3）を用いて、このプロモーターにレポーター遺伝子を連結し、ライマメ（lima bean）でレポーター遺伝子の発現増大を検証した報告がある（非特許文献７）。その一方で、ゲノム編集のターゲットとなるネイティブプロモーター領域のシスエレメントについては、言及されてはいるものの（非特許文献１４、１５）、実際に改変が行われて検証された例は少ない。CRISPR/Cas9法を用いてプロモーターのゲノム編集を試みた事例としては、乾燥耐性に関与するトウモロコシARGOS8遺伝子の上流領域にGO2プロモーターを挿入、あるいは置換した報告（非特許文献１６）や、トマトの子実増大に関与するSLCLV3遺伝子のプロモーターに変異を導入した報告（非特許文献１７）等がある。

植物の生育促進には多くの場合、植物ホルモンが影響を及ぼしており、その一つとしてブラシノステロイドが知られている。ブラシノステロイドは、ステロイド骨格を有する化合物の一群である。植物の生育に関し、ブラシノステロイドは、（ｉ）茎、葉及び根の伸長成長促進、（ｉｉ）細胞分裂促進、（ｉｉｉ）葉肉細胞から導管又は仮導管への分化促進、（ｉｖ）エチレン合成促進、（ｖ）種子の発芽促進、並びに（ｖｉ）環境ストレスへの耐性付加などの作用を有している。このようなブラシノステロイドの生理活性に着目し、ブラシノステロイドの合成や情報伝達に関する遺伝子を植物に導入し、植物のバイオマスを増大させる試みが行われている（非特許文献１８、特許文献２）。これらの試みは、構成的に高発現するプロモーターに目的遺伝子のcDNA配列を連結して植物体に導入する手法を利用したものであり、内在遺伝子プロモーターのゲノム配列を改変することにより発現量を調節するものとは異なる。

米国特許第６１８７９９６号明細書 国際公開第２０１６／０５６６５０号

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上述したように、目的遺伝子を高発現させて品種改良するために、目的遺伝子のプロモーターに適したエンハンサーの利用が有効である。特に、遺伝子集積の品種開発が進むトウモロコシやダイズにおいて、そのようなエンハンサーの利用が強く望まれている。しかしながら、これまでにエンハンサー効果が確認されている因子は限られており、必ずしもそのすべてが目的遺伝子の発現を増強する上で有効であるとは限らない。遺伝子の発現を増強するためには、プロモーターの転写活性を増強することが重要である。そこで、本発明は、プロモーターの転写活性を増強するのに有用なエンハンサーを提供することを目的とする。

本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、カリフラワーモザイクウイルス（CaMV）35S最小プロモーターに連結させて、その転写活性を増強することのできる新規なエンハンサーを見出した。また、本発明者らは、当該プロモーターの転写活性の増強効果とともに、その新規なエンハンサーをトウモロコシBIL 7プロモーターに組み込むことによって、ZmBIL7遺伝子を高発現させることができることを見出した。これらの知見に基づき、本発明者らは、本発明を完成するに至った。

本発明は、好ましくは以下に記載するような態様により行われるが、これに限定されるものではない。
［態様１］
以下の（ｉ）又は（ｉｉ）のポリヌクレオチドを含む、エンハンサー：
（ｉ）配列番号１の２０１位～３００位の領域中の少なくとも４０の連続した塩基配列を含むポリヌクレオチド、
（ｉｉ）（ｉ）のポリヌクレオチドと配列同一性が９０％以上の塩基配列からなり、且つプロモーター転写活性の増強作用を有するポリヌクレオチド。
［態様２］
（ｉ）のポリヌクレオチドが、配列番号１の２０１位～３００位の領域中の少なくとも６０の連続した塩基配列を含む、態様１に記載のエンハンサー。
［態様３］
（ｉ）のポリヌクレオチドが、配列番号１の２０１位～３００位の領域中の少なくとも８０の連続した塩基配列を含む、態様１又は２に記載のエンハンサー。
［態様４］
（ｉ）のポリヌクレオチドが、配列番号１の２０１位～２４０位の領域に示される塩基配列、配列番号１の２２１位～２６０位の領域に示される塩基配列、配列番号１の２４１位～２８０位の領域に示される塩基配列、又は配列番号１の２６１位～３００位の領域に示される塩基配列を含む、態様１～３のいずれか１に記載のエンハンサー。
［態様５］
（ｉ）のポリヌクレオチドが、配列番号１の２０１位～３００位の領域に示される塩基配列を含む、態様１～４のいずれか１に記載のエンハンサー。
［態様６］
（ｉ）のポリヌクレオチドが、配列番号１の１位～３００位の領域に示される塩基配列を含む、態様１～５のいずれか１に記載のエンハンサー。
［態様７］
（ｉ）のポリヌクレオチドが、配列番号１に示される塩基配列を含む、態様１～６のいずれか１に記載のエンハンサー。
［態様８］
ＣＡＣＧＴＧで表される塩基配列を有する核酸断片をさらに含み、該核酸断片が（ｉ）又は（ｉｉ）のポリヌクレオチドに作動可能に連結している、態様１～７のいずれか１に記載のエンハンサー。
［態様９］
前記核酸断片を１～１０個含む、態様８に記載のエンハンサー。
［態様１０］
前記核酸断片が、６～１４のヌクレオチドからなる、態様８又は９に記載のエンハンサー。
［態様１１］
態様１～１０のいずれか１に記載のエンハンサーとプロモーターとを含む、核酸コンストラクト。
［態様１２］
エンハンサーが、プロモーター内に作動可能に挿入されている、又はプロモーターに作動可能に連結されている、態様１１に記載の核酸コンストラクト。
［態様１３］
態様１～１０のいずれか１に記載のエンハンサーを含む、ベクター。
［態様１４］
態様１１又は１２に記載の核酸コンストラクトを含む、ベクター。
［態様１５］
態様１～１０のいずれか１に記載のエンハンサーを含む、宿主細胞。
［態様１６］
態様１～１０のいずれか１に記載のエンハンサーが導入された、植物。
［態様１７］
態様１～１０のいずれか１に記載のエンハンサーを、プロモーターに対して作動可能に挿入する、又は作動可能に連結させる工程を含む、プロモーターの転写活性を増強する方法。
［態様１８］
遺伝子の発現を増強する方法であって、
態様１～１０のいずれか１に記載のエンハンサーを、プロモーターに対して作動可能に挿入する、又は作動可能に連結させる工程、及び
該プロモーターの下流に位置する遺伝子を発現させる工程、
を含む、上記方法。
［態様１９］
高生産性の植物を作出する方法であって、
態様１～１０のいずれか１に記載のエンハンサーと、該エンハンサーが作動可能に挿入された、又は作動可能に連結されたプロモーターとを含み、該プロモーターの下流に遺伝子が配置された核酸分子を植物細胞内に提供する工程、及び
該核酸分子を含む植物細胞から植物を作出する工程、
を含む、上記方法。

本発明によれば、プロモーターの転写活性を増強するのに有用なエンハンサーを提供することができる。本発明のエンハンサーは、種々のプロモーターに利用することができ、例えば植物遺伝子のプロモーターに利用することができる。その一つとして、トウモロコシBIL7遺伝子のネイティブプロモーター（ZmBIL7プロモーター）に本発明のエンハンサーを利用することができる。

本発明のエンハンサーを植物に利用した場合、植物細胞中のプロモーターにより発現される遺伝子の発現量をさらに高めることができる。植物細胞における通常のプロモーターでは、多くの場合、植物の器官や時期などによって発現させる遺伝子の量が異なるが、本発明のエンハンサーを利用することによって、それぞれ異なる遺伝子の発現量を底上げするように全体的に増加させることが可能となる。

図１は、pJT3968ベクターの構造を示す図面である。 図２は、ZmBIL7プロモーターの5’-deletion解析を示す。図２Ａは、pJT3968ベクター（PZmUbi_900を保有）及びpJT3968ベクターから派生したプラスミドのZmUbiプロモーター領域からGUS遺伝子までの構造を示す。図２Ｂは、各プラスミドを導入したトウモロコシ未熟胚におけるGUS活性について、PZmUbi_900のGUS活性を100%としたときの相対値を示す。

以下に、本発明の構成を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。例えば、本発明で用いられる遺伝子工学的技術は、公知のJ. Sambrookらの方法（Molecular Cloning、第２版、Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989； 第３版、Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001）にしたがって実施することができる。

＜エンハンサー＞
本発明の一態様は、以下の（ｉ）又は（ｉｉ）のポリヌクレオチドを含む、エンハンサーである：
（ｉ）配列番号１の２０１位～３００位の領域中の少なくとも４０の連続した塩基配列を含むポリヌクレオチド、
（ｉｉ）（ｉ）のポリヌクレオチドと配列同一性が９０％以上の塩基配列からなり、且つプロモーター転写活性の増強作用を有するポリヌクレオチド。

本明細書においてエンハンサーとは、プロモーターからの遺伝子の転写効率を上昇させる因子を意味する。一方、本明細書においてプロモーターとは、遺伝子の転写部位を決定し、また遺伝子の転写の頻度を直接的に調節するＤＮＡ上の領域を意味し、ＲＮＡポリメラーゼの結合によって遺伝子の転写が開始される。本発明において、エンハンサーとプロモーターとは互いに異なる概念である。本発明のエンハンサーは、プロモーターの転写活性を増強させることができ、それによってプロモーターの下流に存在する遺伝子の発現量を増加させることができる。

本発明のエンハンサーは、ポリヌクレオチドを含んでおり、当該ポリヌクレオチドは、配列番号１の２０１位～３００位の領域中の少なくとも４０の連続した塩基配列を含むことを特徴とする（以下、このポリヌクレオチドを「ポリヌクレオチド（ｉ）」と称する）。配列番号１に示される塩基配列は、トウモロコシユビキチン１遺伝子プロモーターの一部の領域を示す塩基配列であり、３５０個のヌクレオチドで表される。なお、本明細書において、「塩基配列を含むポリヌクレオチド」及び「ポリヌクレオチドが塩基配列を含む」との用語は、それぞれ「塩基配列を有するポリヌクレオチド」及び「ポリヌクレオチドが塩基配列を有する」と言い換えることもできる。

ポリヌクレオチド（ｉ）は、好ましくは、配列番号１の２０１位～３００位の領域中の少なくとも６０の連続した塩基配列を含み、より好ましくは、配列番号１の２０１位～３００位の領域中の少なくとも７０の連続した塩基配列を含み、さらに好ましくは、配列番号１の２０１位～３００位の領域中の少なくとも８０の連続した塩基配列を含み、さらに好ましくは、配列番号１の２０１位～３００位の領域中の少なくとも９０の連続した塩基配列を含む。

ポリヌクレオチド（ｉ）における配列番号１の２０１位～３００位の領域中の少なくとも４０の連続した塩基配列について、その位置は特に限定されないが、本発明において、ポリヌクレオチド（ｉ）は、例えば、配列番号１の２０１位～２４０位の領域に示される塩基配列（配列番号２）、配列番号１の２２１位～２６０位の領域に示される塩基配列（配列番号３）、配列番号１の２４１位～２８０位の領域に示される塩基配列（配列番号４）、又は配列番号１の２６１位～３００位の領域に示される塩基配列（配列番号５）を含む。好ましくは、ポリヌクレオチド（ｉ）は、配列番号１の２６１位～３００位の領域に示される塩基配列（配列番号５）を含む。

ポリヌクレオチド（ｉ）は、配列番号１の２０１位～２６０位の領域に示される塩基配列（配列番号６）、配列番号１の２２１位～２８０位の領域に示される塩基配列（配列番号７）、又は配列番号１の２４１位～３００位の領域に示される塩基配列（配列番号８）を含んでいてもよく、好ましくは、ポリヌクレオチド（ｉ）は、配列番号１の２４１位～３００位の領域に示される塩基配列（配列番号８）を含む。ポリヌクレオチド（ｉ）は、配列番号１の２０１位～２８０位の領域に示される塩基配列（配列番号９）、又は配列番号１の２２１位～３００位の領域に示される塩基配列（配列番号１０）を含んでいてもよく、好ましくは、ポリヌクレオチド（ｉ）は、配列番号１の２２１位～３００位の領域に示される塩基配列（配列番号１０）を含む。より好ましくは、ポリヌクレオチド（ｉ）は、配列番号１の２０１位～３００位の領域に示される塩基配列（配列番号１１）を含む。

本発明において、ポリヌクレオチド（ｉ）は、配列番号１の２０１位～３００位の領域中の少なくとも４０の連続した塩基配列を含む限り、配列番号１の２０１位～３００位の領域以外の領域を含んでいてもよい。例えば、ポリヌクレオチド（ｉ）は、配列番号１の１５１位～３００位の領域に示される塩基配列（配列番号１２）を含むことができ、配列番号１の１０１位～３００位の領域に示される塩基配列（配列番号１３）を含むことができ、配列番号１の５１位～３００位の領域に示される塩基配列（配列番号１４）を含むことができ、又は配列番号１の１位～３００位の領域に示される塩基配列（配列番号１５）を含むことができる。また、別の例としては、ポリヌクレオチド（ｉ）は、配列番号１の２０１位～３１０位の領域に示される塩基配列（配列番号１６）を含むことができ、配列番号１の２０１位～３２０位の領域に示される塩基配列（配列番号１７）を含むことができ、配列番号１の２０１位～３３０位の領域に示される塩基配列（配列番号１８）を含むことができ、配列番号１の２０１位～３４０位の領域に示される塩基配列（配列番号１９）を含むことができ、又は配列番号１の２０１位～３５０位の領域に示される塩基配列（配列番号２０）を含むことができる。また、別の例としては、ポリヌクレオチド（ｉ）は、配列番号１の２６１位～３５０位の領域に示される塩基配列（配列番号２１）を含むことができ、又は配列番号１の２４１位～３５０位の領域に示される塩基配列（配列番号２２）を含むことができる。また、別の例としては、ポリヌクレオチド（ｉ）は、配列番号１の２６１位～３４０位の領域に示される塩基配列（配列番号２３）を含むことができ、配列番号１の２６１位～３３０位の領域に示される塩基配列（配列番号２４）を含むことができ、配列番号１の２６１位～３２０位の領域に示される塩基配列（配列番号２５）を含むことができ、又は配列番号１の２６１位～３１０位の領域に示される塩基配列（配列番号２６）を含むことができる。ポリヌクレオチド（ｉ）に含まれる塩基配列は、ポリヌクレオチド（ｉ）が配列番号１の２０１位～３００位の領域中の少なくとも４０の連続した塩基配列を含む限り、配列番号１の１位～３５０位のいずれのヌクレオチドを端点としてもよい。本発明におけるポリヌクレオチド（ｉ）は、配列番号１に示される塩基配列を含むことができる。

本発明のエンハンサーは、上述したポリヌクレオチド（ｉ）と配列同一性が９０％以上の塩基配列からなり、且つプロモーター転写活性の増強作用を有するポリヌクレオチドを含んでいてもよい（以下、このポリヌクレオチドを「ポリヌクレオチド（ｉｉ）」と称する）。

ポリヌクレオチド（ｉｉ）は、ポリヌクレオチド（ｉ）と配列同一性が９０％以上の塩基配列からなるが、好ましくは、ポリヌクレオチド（ｉ）と配列同一性が９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、又は９９％以上の塩基配列からなる。

本明細書において塩基配列の同一性とは、対象とする２つの核酸間の塩基配列の同一性をいい、当該技術分野において公知の数学的アルゴリズムを用いて作成された塩基配列の最適なアラインメントにおいて一致する塩基の割合（％）によって表される。塩基配列の同一性は、視覚的検査及び数学的計算により決定することができる。また、コンピュータープログラムを用いて同一性を決定することもできる。配列比較コンピュータープログラムとしては、当業者に周知のホモロジー検索プログラム（例えば、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ）や配列整列プログラム（例えば、ＣｌｕｓｔａｌＷ））、あるいは遺伝情報処理ソフトウェア（例えば、ＧＥＮＥＴＹＸ（登録商標））などを用いることができる。本明細書における塩基配列の同一性は、具体的には、ＪＳｐｉｅｃｉｅｓのウェブサイト（http://imedea.uib-csic.es/jspecies/）で公開されている解析プログラム（ＢＬＡＳＴソフトウェアに基づいたＪＳｐｉｅｃｉｅｓプログラム（Richter, M., and Rossello-Mora, R. 2009. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106: 19126-19131））を用いて、デフォルトの設定条件で求めることができる。

ポリヌクレオチド（ｉｉ）は、プロモーター転写活性の増強作用を有することを特徴とする。本発明において、プロモーター転写活性の増強作用は、プロモーターの下流に位置する遺伝子の発現量により調べることができる。すなわち、ポリヌクレオチド（ｉｉ）がプロモーターに連結（又は挿入）されていない状態でのプロモーター下流の遺伝子の発現量と比較して、ポリヌクレオチド（ｉｉ）がプロモーターに連結（又は挿入）されている状態（それ以外は全て同一の条件）でのプロモーター下流の遺伝子の発現量の方が多い場合に、ポリヌクレオチド（ｉｉ）はプロモーター転写活性の増強作用を有すると判断することができる。なお、本発明のエンハンサーがプロモーター転写活性の増強作用を有することも上記と同様にして調べることができる。すなわち、本発明のエンハンサーがプロモーターに連結（又は挿入）されていない状態でのプロモーター下流の遺伝子の発現量と比較して、本発明のエンハンサーがプロモーターに連結（又は挿入）されている状態（それ以外は全て同一の条件）でのプロモーター下流の遺伝子の発現量の方が多い場合に、本発明のエンハンサーはプロモーター転写活性の増強作用を有すると判断することができる。プロモーター転写活性の増強作用を評価するために使用されるプロモーターの種類は特に限定されないが、例えば、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）３５Ｓ最小プロモーターなどを用いることができる。

本発明のエンハンサーに含まれるポリヌクレオチドは、配列番号１の２０１位～３００位の領域中の少なくとも２０の連続した塩基配列を含むものであってもよい。この場合、当該ポリヌクレオチドにおける配列番号１の２０１位～３００位の領域中の少なくとも２０の連続した塩基配列について、その位置は特に限定されないが、当該ポリヌクレオチドは、例えば、配列番号１の２０１位～２２０位の領域に示される塩基配列（配列番号２７）、配列番号１の２２１位～２４０位の領域に示される塩基配列（配列番号２８）、配列番号１の２４１位～２６０位の領域に示される塩基配列（配列番号２９）、配列番号１の２６１位～２８０位の領域に示される塩基配列（配列番号３０）、又は配列番号１の２８１位～３００位の領域に示される塩基配列（配列番号３１）を含む。好ましくは、当該ポリヌクレオチドは、配列番号１の２６１位～２８０位の領域に示される塩基配列（配列番号３０）、又は配列番号１の２８１位～３００位の領域に示される塩基配列（配列番号３１）を含む。また、本発明のエンハンサーに含まれるポリヌクレオチドは、配列番号１の２０１位～３００位の領域中の少なくとも２０の連続した塩基配列を含むポリヌクレオチドと配列同一性が９０％以上の塩基配列からなり、且つプロモーター転写活性の増強作用を有するポリヌクレオチドであってもよい。配列同一性及びプロモーター転写活性の増強作用は上記に説明した通りであり、好ましい配列同一性の割合も上記と同様である。

本発明のエンハンサーに含まれる上記のポリヌクレオチドは、当該エンハンサーにおいて複数存在していてもよい。例えば、上記のポリヌクレオチドは、本発明のエンハンサーにおいて１～５個含まれる。

本発明においてエンハンサーは、上述した通りプロモーターとは異なる概念である。一般に、プロモーターにおいては、転写開始点よりおよそ５０ｂｐ上流の領域が遺伝子の転写活性に重要であることが知られている。本発明のエンハンサーは、プロモーターとは異なるという観点から、トウモロコシユビキチン１遺伝子プロモーターの転写開始点より４４ｂｐ上流の領域を含まないことが好ましい。本明細書において、当該領域は、配列番号３２に示される塩基配列で表される。すなわち、本発明のエンハンサーは、配列番号３２に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを含まないことが好ましい。一般に、いかなるポリヌクレオチド配列も、その配置される部位によっては、転写活性を示してプロモーターとして働くことがあり得る。同様に、本発明のエンハンサーも、他のプロモーターと組み合わせることなく、単独でプロモーターとして機能することはあり得る。しかし、プロモーターの能力と、エンハンサーの能力とは異なるものであり、一方の能力の存在が他方の能力の存在を示唆するものではない。なお、仮に本発明のエンハンサーがプロモーターの能力も示すことがあっても、エンハンサーとしての利用に特段の影響を及ぼすものではない。

本発明のエンハンサーは、ＣＡＣＧＴＧで表される塩基配列を有する核酸断片をさらに含むことができる。当該核酸断片は、ポリヌクレオチド（ｉ）又はポリヌクレオチド（ｉｉ）に作動可能に連結していることを特徴とする。「当該核酸断片がポリヌクレオチド（ｉ）又はポリヌクレオチド（ｉｉ）に作動可能に連結する」とは、本発明のエンハンサーが有する作用効果を発揮できる程度に、当該核酸断片がポリヌクレオチド（ｉ）又はポリヌクレオチド（ｉｉ）に連結することを意味する。当該核酸断片は、ポリヌクレオチド（ｉ）又はポリヌクレオチド（ｉｉ）と直接的に（隣接して）連結されていてもよいし、１又は２以上のヌクレオチドを介して連結されていてもよい。また、当該核酸断片の位置は、ポリヌクレオチド（ｉ）又はポリヌクレオチド（ｉｉ）の上流であっても下流であってもよいが、本発明では、当該核酸断片はポリヌクレオチド（ｉ）又はポリヌクレオチド（ｉｉ）の下流に連結することが好ましい。本発明のエンハンサーは、当該核酸断片をさらに含むことにより、プロモーター転写活性の増強作用をさらに高めることができる。なお、本明細書において、「塩基配列を有する核酸断片」及び「核酸断片が塩基配列を有する」との用語は、それぞれ「塩基配列を含む核酸断片」及び「核酸断片が塩基配列を含む」と言い換えることもできる。

本発明のエンハンサーに含まれる上記の核酸断片の数は、特に限定されないが、例えば１～１０個であり、好ましくは２～９個、より好ましくは３～８個である。当該核酸断片の数が２個以上の場合、それぞれの核酸断片は直接的に（隣接して）連結されていてもよいし、１又は２以上のヌクレオチドを介して連結されていてもよい。また、当該核酸断片の数が２個以上の場合、全ての核酸断片がポリヌクレオチド（ｉ）又はポリヌクレオチド（ｉｉ）の上流又は下流に位置していてもよいし、一部の核酸断片がポリヌクレオチド（ｉ）又はポリヌクレオチド（ｉｉ）の上流に位置し、残りの核酸断片がポリヌクレオチド（ｉ）又はポリヌクレオチド（ｉｉ）の下流に位置していてもよい。本発明では、当該核酸断片の数が２個以上の場合、全ての核酸断片がポリヌクレオチド（ｉ）又はポリヌクレオチド（ｉｉ）の下流に位置していることが好ましい。

ＣＡＣＧＴＧで表される塩基配列を有する核酸断片は、特に限定されないが、例えば６～１４のヌクレオチドからなり、好ましくは８～１２のヌクレオチド、より好ましくは９～１１のヌクレオチド、最も好ましくは１０のヌクレオチドからなる。当該核酸断片に含まれるＣＡＣＧＴＧ以外のヌクレオチドの種類は、特に限定されない。

本発明において、ＣＡＣＧＴＧで表される塩基配列を有する核酸断片は、特に限定されないが、好ましくは、配列番号３３に示される塩基配列を有する核酸断片、配列番号３４に示される塩基配列を有する核酸断片、配列番号３５に示される塩基配列を有する核酸断片、配列番号３６に示される塩基配列を有する核酸断片、配列番号３７に示される塩基配列を有する核酸断片、配列番号３８に示される塩基配列を有する核酸断片、配列番号３９に示される塩基配列を有する核酸断片、配列番号４０に示される塩基配列を有する核酸断片、配列番号４１に示される塩基配列を有する核酸断片、配列番号４２に示される塩基配列を有する核酸断片、配列番号４３に示される塩基配列を有する核酸断片、配列番号４４に示される塩基配列を有する核酸断片、又は配列番号４５に示される塩基配列を有する核酸断片であり、より好ましくは、配列番号３５に示される塩基配列を有する核酸断片、又は配列番号４２に示される塩基配列を有する核酸断片である。本発明では、これらの核酸断片のうち１種のみを単独で用いてもよく、或いは２種以上を組み合わせて用いてもよい。

また、本発明のエンハンサーは、ＴＴＧＡＣで表される塩基配列を共通のモチーフとして、ＴＴＧＡＣ、ＴＴＧＡＣＣ、ＴＴＧＡＣＴ、ＴＴＴＧＡＣＣ、又はＴＴＴＧＡＣＴで表される塩基配列を有する核酸断片をさらに含むことができる。また、本発明のエンハンサーは、ＧＣＣＣＡで表される塩基配列を共通のモチーフとして、ＧＧＣＣＣＡ、ＴＧＧＧＣＣ、ＡＧＣＣＣＡ、又はＡＧＧＴＧＧＧＣＣＣＧＴで表される塩基配列を有する核酸断片をさらに含むことができる。また、本発明のエンハンサーは、ＧＡＴＡで表される塩基配列を共通のモチーフとして、ＴＧＡＴＡＧ、ＴＧＡＴＡＡ、ＡＧＡＴＡＧ、ＡＧＡＴＡＡ、ＡＴＧＡＴＡＡＧＧ、ＡＡＧＡＴＡＡＧＡＴＴ、又はＧＡＴＡＡＧで表される塩基配列を有する核酸断片をさらに含むことができる。また、本発明のエンハンサーは、ＧＴで表される塩基配列を共通のモチーフとして、ＧＧＴＡＡＴＴ、ＧＧＴＡＡＡＴ、又はＧＴＧＴＧＧＴＴＡＡＴＡＴＧで表される塩基配列を有する核酸断片をさらに含むことができる。また、本発明のエンハンサーは、ＧＡＰ－ｂｏｘを有する核酸断片として、ＣＡＡＡＴＧＡＡＡＧＡ、又はＣＡＡＡＴＧＡＡで表される塩基配列を有する核酸断片をさらに含むことができる。本発明では、上記の核酸断片のうち１種のみを単独で用いてもよく、或いは２種以上を組み合わせて用いてもよい。

＜エンハンサーを含む核酸コンストラクト＞
本発明のエンハンサーは、プロモーターと組み合わせた上で核酸コンストラクトとして利用することができる。すなわち、本発明の別の一態様は、上述した本発明のエンハンサーとプロモーターとを含む核酸コンストラクトである。上述した通り、本発明のエンハンサーはプロモーター転写活性の増強作用を有することから、かかる本発明のエンハンサーとプロモーターとを含む核酸コンストラクトは、プロモーターの下流に位置する遺伝子の発現量を増加させることができる。

本発明の核酸コンストラクトにおけるプロモーターは、対象とする遺伝子の転写を行うことができる限り特に限定されないが、本発明のエンハンサーに対して異種の（heterogenous）プロモーターであることが好ましい。すなわち、本発明のエンハンサーはトウモロコシユビキチン１遺伝子プロモーターに由来することから、本発明の核酸コンストラクトにおけるプロモーターは、トウモロコシユビキチン１遺伝子プロモーターとは異なる種類のプロモーターであることが好ましい。

本発明の核酸コンストラクトにおいて、エンハンサーは、プロモーター内に作動可能に挿入されていてもよいし、或いはプロモーターに作動可能に連結されていてもよい。ここで、本明細書において「エンハンサーがプロモーター内に作動可能に挿入されている、又はプロモーターに作動可能に連結されている」とは、プロモーターがその機能を発揮するように、すなわち、対象とする遺伝子の転写を行うように、エンハンサーがプロモーター内に挿入されている、又はプロモーターに連結されていることを意味する。

本発明のエンハンサーがプロモーター内に作動可能に挿入されている場合、当該エンハンサーは、プロモーターの中央部分、プロモーターの中央部分より５’末端側、及びプロモーターの中央部分より３’末端側のいずれの位置に挿入されていてもよく、その位置は特に制限されない。

本発明のエンハンサーがプロモーターに作動可能に連結されている場合、当該エンハンサーは、プロモーターと直接的に（隣接して）連結されていてもよいし、１又は２以上のヌクレオチドを介して連結されていてもよい。また、エンハンサーの位置は、特に限定されないが、プロモーターの上流にあることが好ましい。

本発明のエンハンサーが作動可能に挿入される、又は作動可能に連結されるプロモーターとしては、特に限定されないが、例えば、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター（ＣａＭＶ３５Ｓ）、トウモロコシＢＩＬ７遺伝子プロモーター（ＺｍＢＩＬ７プロモーター）、トウモロコシ以外の各種ＢＩＬ７遺伝子プロモーター、トウモロコシユビキチン１遺伝子プロモーター以外の各種ユビキチンプロモーター、各種アクチンプロモーター、各種翻訳開始因子プロモーター、各種翻訳伸長因子プロモーター、ノパリン合成酵素遺伝子プロモーター、ナピン遺伝子プロモーター、オレオシン遺伝子プロモーター等が挙げられる。

また、本発明のエンハンサーが作動可能に挿入される、又は作動可能に連結されるプロモーターとしては、植物において部位特異的に発現させる機能を有するプロモーターも用いることができる。そのようなプロモーターとしては、葉部特異的に核酸を発現するプロモーター（例えば、イネｐｓｂ０遺伝子プロモーター（特開２０１０－１６６９２４））、茎部特異的に核酸を発現するプロモーター（例えば、シロイヌナズナＦＡ６プロモーター（Gupta et al. 2012 Plant Cell Rep. 31: 839-850.））、根部特異的に核酸を発現するプロモーター（例えば、ＲＣｃ３プロモーター（Xu et al. 1995 Plant Mol Biol 27: 237-248））、主に根、茎、葉の栄養器官で発現するプロモーター（例えば、シロイヌナズナＡＳプロモーター）等が挙げられる。

また、本発明のエンハンサーが作動可能に挿入される、又は作動可能に連結されるプロモーターとして、誘導性プロモーターも使用可能である。そのようなプロモーターとしては、例えば、糸状菌・細菌・ウイルスの感染や侵入、低温、高温、乾燥、紫外線の照射、オーキシンやブラシノステロイドといったホルモン等の特定の化合物の散布等の外因によって発現することが知られているプロモーター等が挙げられる。このようなプロモーターとしては、例えば、糸状菌・細菌・ウイルスの感染や侵入によって発現するイネキチナーゼ遺伝子のプロモーター（Xu et al. 1996 Plant Mol.Biol. 30:387）やタバコのＰＲタンパク質遺伝子のプロモーター（Ohshima et al. 1990 Plant Cell 2: 95）、低温によって誘導されるイネのｌｉｐ１９遺伝子のプロモーター（Aguan et al. 1993 Mol. Gen. Genet. 240:1）、高温によって誘導されるイネのｈｓｐ８０遺伝子とｈｓｐ７２遺伝子のプロモーター（Van Breusegem et al. 1994 Planta 193: 57）、乾燥によって誘導されるシロイヌナズナのｒａｂ１６遺伝子のプロモーター（Nundy et al. 1990 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 1406）、紫外線の照射によって誘導されるパセリのカルコン合成酵素遺伝子のプロモーター（Schulze-Lefert et al. 1989 EMBO J. 8: 651）、嫌気的条件で誘導されるトウモロコシのアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子のプロモーター（Walker et al. 1987 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 6624）、塩ストレスによって誘導されるプロモーター（Shinozaki and Yamaguchi-Shinozaki. 2000 Curr. Opin. Plant Biol. 3, 217-223）等が挙げられる。

＜ベクター＞
上述した本発明のエンハンサー、及び本発明の核酸コンストラクトは、いずれもベクター内に挿入して利用することができる。すなわち、本発明の別の態様は、本発明のエンハンサーを含むベクター、或いは本発明の核酸コンストラクトを含むベクターである。

ベクターは、簡便には当業界において入手可能な組換え用ベクターに所望の核酸を常法により連結することによって、調製することができる。本発明のベクターは、形質転換用ベクターであることが好ましく、特に植物細胞に適用する場合、本発明のベクターは、植物形質転換用ベクターであることが好ましい。本発明で使用されるベクターとしては、特に限定されないが、例えば、ｐＢＩ系のベクター、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ系のベクター、ｐＵＣ系のベクター等を使用できる。ｐＢＩ系のベクターとしては、例えば、ｐＢＩ１２１、ｐＢＩ１０１、ｐＢＩ１０１．２、ｐＢＩ１０１．３、ｐＢＩ２２１などが挙げられる。ｐＢＩ系のベクター等のバイナリーベクターは、アグロバクテリウムを介して植物に目的の核酸を導入できるという点で好ましい。また、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ系のベクターとしては、例えば、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（＋）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（－）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＫＳ（＋）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＫＳ（－）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（＋）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（－）などが挙げられる。ｐＵＣ系のベクターとしては、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１１９等を挙げることができる。ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ系のベクター、ｐＵＣ系ベクターは、植物に核酸を直接導入することができるという点で好ましい。さらにはｐＧｒｅｅｎシリーズ（www.pgreen.ac.uk）、ｐＣＡＭＢＩＡシリーズ（www.cambia.org）、ｐＬＣシリーズ（国際公開第２００７／１４８８１９号）などのバイナリーベクターや、ｐＳＢ１１（Komari et al, 1996, Plant J, 10: 165-174）、ｐＳＢ２００（Komori et al, 2004, Plant J, 37: 315-325）などのスーパーバイナリーベクターも好ましく使用することができる。

また、本発明のベクターは、転写産物の安定化に必要なポリアデニレーション部位を含む転写ターミネーター配列を含むことが好ましい。当業者は、転写ターミネーター配列を適切に選択することができる。

転写ターミネーター配列は、転写終結部位としての機能を有していれば特に限定されるものではなく、公知のものであってもよい。転写ターミネーター配列は、使用するプロモーターに応じて選択可能であり、例えば、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓの転写終結領域（ＣａＭＶ３５Ｓターミネーター）、ノパリン合成酵素遺伝子の転写終結領域（Ｎｏｓターミネーター）等を用いることができる。組換え発現ベクターにおいては、転写ターミネーター配列を適当な位置に配置することにより、細胞に導入された後に、不必要に長い転写物を合成する現象等の発生を防止することができる。

また、本発明のベクターには、他の核酸セグメントがさらに含まれていてもよい。当該他の核酸セグメントとしては、特に限定されるものではないが、選抜マーカーや、翻訳効率を高めるための塩基配列等を挙げることができる。また、本発明のベクターは、ＬＢやＲＢのボーダー配列をさらに含んでいてもよい。これらボーダー配列は、特にアグロバクテリウムを用いてベクター内の所望の核酸コンストラクトを植物体に導入する場合に、Ｔ－ＤＮＡ領域の植物細胞への移行に必要である。

選抜マーカーとしては、例えば薬剤耐性遺伝子を用いることができる。かかる薬剤耐性遺伝子としては、例えば、ハイグロマイシン、ブレオマイシン、カナマイシン、ゲンタマイシン、クロラムフェニコール等に対する薬剤耐性遺伝子を挙げることができる（抗生物質カナマイシン又はゲンタマイシンに耐性であるネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子、ハイグロマイシンに耐性であるハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子）。また、除草剤ホスフィノスリシンに耐性であるホスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼ遺伝子等も利用可能である。これにより、上記抗生物質や除草剤を含む培地中で生育する植物体を選択することによって、本発明のベクターの一部または全部が導入された植物体を容易に選抜することができる。

翻訳効率を高めるための塩基配列としては、例えばタバコモザイクウイルス由来のｏｍｅｇａ配列を挙げることができる。このｏｍｅｇａ配列をプロモーター下流の非翻訳領域（５’ＵＴＲ）に配置させることによって、遺伝子の翻訳効率を高めることができる。また、アルコールデヒドロゲナーゼなどの植物由来の５’ＵＴＲをプロモーター下流に配置させることによって、遺伝子の翻訳効率を高めることができる。このように、本発明のベクターには、その目的に応じて、さまざまな核酸セグメントを含ませることができる。

本発明のベクターの構築方法についても特に限定されるものではなく、適宜選択された母体となるベクターに、本発明のエンハンサー、プロモーター、対象遺伝子、及びターミネーター配列、並びに必要に応じて他のＤＮＡセグメントを所定の順序となるように導入すればよい。核酸を母体となるベクターに挿入するには、常法にしたがい、精製された核酸を適当な制限酵素で切断し、適当なベクターの制限酵素部位またはマルチクローニングサイトに挿入する方法などが用いられる（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， ５．６１－５．６３）。

当業者においては、所望の遺伝子を有するベクターを、一般的な遺伝子工学技術によって、適宜、作製することが可能である。通常、市販の種々のベクターを利用することにより容易に作製できる。

＜宿主細胞＞
本発明のエンハンサーは、細胞（宿主細胞）に導入することができる。すなわち、本発明の別の一態様は、本発明のエンハンサーを含む宿主細胞である。本発明のエンハンサーは、宿主細胞に対して外因的に（exogenously）（すなわち、外因性の物質として）、宿主細胞に含まれることが好ましい。

本発明の宿主細胞は、動物細胞であってよいし、或いは植物細胞であってもよく、特に限定されないが、本発明では、本発明の宿主細胞は植物細胞であることが好ましい。かかる植物細胞には、種々の形態の植物細胞、例えば、懸濁培養細胞、プロトプラスト、植物体中の細胞等が含まれる。

植物細胞は、特に限定されないが、双子葉植物由来又は単子葉植物由来の細胞を用いることができる。双子葉植物としては、シロイヌナズナ、ダイズ、ワタ、ナタネ、テンサイ、タバコ、トマト、ダイコン、ブドウ、ポプラなどが挙げられ、これらのうち好ましくはシロイヌナズナ、ダイズ、ワタ、ナタネ、タバコ、トマトであり、さらに好ましくはシロイヌナズナ、ダイズ、ワタ、ナタネである。単子葉植物としては、イネ、トウモロコシ、コムギ、オオムギ、ソルガム、サトウキビ、タマネギなどが挙げられ、これらのうち好ましくはイネ、トウモロコシ、コムギ、ソルガムであり、より好ましくはイネ、トウモロコシである。

本発明のエンハンサーは、本発明のベクターを利用して、宿主細胞に導入することができる。この場合、本発明の宿主細胞は、本発明のベクターを含む宿主細胞ということができる。宿主細胞内で対象の遺伝子を高発現させる方法としては、当該遺伝子を本発明のベクターに組み込み、例えば、ポリエチレングリコール法、アグロバクテリウム法、リポソーム法、カチオニックリポソーム法、リン酸カルシウム沈殿法、電気パルス穿孔法（エレクトロポレーション）（Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley & Sons.Section 9.1-9.9）、リポフェクション法、マイクロインジェクション法、パーティクルガン法等の当業者に公知の方法により細胞内に導入する方法が挙げられる。本発明においては、アグロバクテリウム法を好ましく使用することができる。植物細胞内に核酸を導入する場合、マイクロインジェクション法、エレクトロポレーション法、ポリエチレングリコール法等を用いて直接的に核酸を導入することもできるが、植物への遺伝子導入用プラスミドに組込み、これをベクターとして、植物感染能のあるウイルスあるいは細菌を介して、間接的に植物細胞に導入することもできる。かかるウイルスとしては、例えば、代表的なウイルスとして、カリフラワーモザイクウイルス、タバコモザイクウイルス、ジェミニウイルス等が挙げられ、細菌としては、アグロバクテリウム等が挙げられる。アグロバクテリウム法により、植物への遺伝子導入を行う場合には、市販のプラスミドを用いることができる。

宿主細胞内で対象の遺伝子を高発現させる他の方法としては、本発明のエンハンサーを、例えば、ポリエチレングリコール法、アグロバクテリウム法、リポソーム法、カチオニックリポソーム法、リン酸カルシウム沈殿法、電気パルス穿孔法（エレクトロポレーション）（Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley & Sons.Section 9.1-9.9）、リポフェクション法、マイクロインジェクション法、パーティクルガン法等の当業者に公知の方法により細胞内に導入し、当該遺伝子のプロモーター内に作動可能に挿入する方法、または、当該遺伝子のプロモーターと作動可能に連結する方法が挙げられる。植物細胞内に核酸を導入する場合、マイクロインジェクション法、エレクトロポレーション法、ポリエチレングリコール法等を用いて直接的に核酸を導入することもできるが、植物への遺伝子導入用プラスミドに組み込み、これをベクターとして、植物感染能のあるウイルスあるいは細菌を介して、間接的に植物細胞に導入することもできる。かかるウイルスとしては、例えば、代表的なウイルスとして、カリフラワーモザイクウイルス、タバコモザイクウイルス、ジェミニウイルス等が挙げられ、細菌としては、アグロバクテリウム等が挙げられる。アグロバクテリウム法により、植物への遺伝子導入を行う場合には、市販のプラスミドを用いることができる。

本発明のエンハンサーを、対象の遺伝子のプロモーター内に作動可能に挿入するため、または、対象の遺伝子のプロモーターと作動可能に連結するためには、宿主細胞のゲノムの標的部位に核酸を挿入する、ジーンターゲティングの手法、または、ゲノム編集（Gene editing、または、Genome editing）の手法を用いることができる。ジーンターゲティングの手法には、例えば、相同組換えを利用する方法がある（Terada et al., 2007, Plant Physiology 144, 846-856）。ゲノム編集の手法は、宿主細胞のゲノムの標的部位を特異的に切断することができる酵素、例えば、ＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ（Endo et al, 2016, Plant physiology 170, 667-677）、ＴＡＬＥＮＳ（Wang et al, 2014, Nature biotechnology 32, 947-951）、Ｚｉｎｃｆｉｎｇｅｒ Ｎｕｃｌｅａｓｅ（Duda et al. 2014, Nucleic acids research 42, e84-e84）、Ｍｅｇａ－ｎｕｃｌｅａｓｅ（Popplewell et al, 2013, Human gene therapy 24, 692-701）などを用いる手法である。この手法では、核酸を宿主細胞に導入する際に、上記の酵素若しくはその構成要素、または上記の酵素若しくはその構成要素をコードする核酸を当該宿主細胞にさらに導入して標的部位を切断し、その切断修復過程において、当該核酸を標的部位に挿入するものである（Osakabe and Osakabe, 2015, Plant and Cell Physiology 56, 389-400）。

＜植物＞
本発明のエンハンサーは、植物の中に導入することができる。すなわち、本発明の別の一態様は、本発明のエンハンサーが導入された植物である。本発明のエンハンサーは、プロモーター転写活性の増強作用を有しており、当該作用によってプロモーター下流の遺伝子の発現量を増大させることができる。例えば、当該遺伝子が植物の生産性の向上に寄与する遺伝子であれば、本発明のエンハンサーが導入された植物では、その植物の生産性を向上させることができる。

本発明の植物には、植物体の全体のみならず、植物器官（例えば、根、茎、葉、花弁、種子、果実、完熟胚、未熟胚、胚珠、子房、茎頂、葯、花粉等）、植物組織（例えば、表皮、篩部、柔組織、木部、維管束等）、これらの切片、カルス、苗条原基、実生、多芽体、毛状根及び培養根等のいずれもが含まれる。

本発明の植物は、単子葉植物であってもよいし、或いは双子葉植物であってもよい。単子葉植物としては、イネ、トウモロコシ、コムギ、オオムギ、ソルガム、サトウキビ、タマネギなどが挙げられ、これらのうち好ましくはイネ、トウモロコシ、コムギ、ソルガムであり、より好ましくはイネ、トウモロコシである。双子葉植物としては、シロイヌナズナ、ダイズ、ワタ、ナタネ、テンサイ、タバコ、トマト、ダイコン、ブドウ、ポプラなどが挙げられ、これらのうち好ましくはシロイヌナズナ、ダイズ、ワタ、ナタネ、タバコ、トマトであり、さらに好ましくはシロイヌナズナ、ダイズ、ワタ、ナタネである。

本発明の植物には、本発明のエンハンサーが導入された植物細胞を生育させた植物体、及び当該植物体の後代、子孫またはクローンである植物、並びにこれらの繁殖材料（例えば、種子、果実、切穂、塊茎、塊根、株、カルス、プロトプラスト等）が含まれる。本発明のエンハンサーは、特に限定されないが、上述した通りの方法で植物細胞（宿主細胞）に導入することができる。本発明のベクターを利用した場合、本発明の植物細胞は、本発明のベクターが導入された植物ということができる。植物細胞からの植物体の再生は、植物細胞の種類に応じて当業者に公知の方法で行うことが可能である。上記技術については既に確立し、本発明の技術分野において広く用いられており、本発明において上記方法を好適に用いることができる。

植物細胞を再分化させて植物体を再生させる方法は、植物細胞の種類により異なるが、例えばイネであればFujimuraら（Plant Tissue Culture Lett. 2:74 (1995)）の方法が挙げられ、トウモロコシであればShillitoら（Bio/Technology 7:581 (1989)）の方法やGorden-Kammら（Plant Cell 2:603(1990)）の方法が挙げられる。上記手法により再生され、かつ栽培した植物体中の導入された外来核酸の存在は、公知のＰＣＲ法やサザンハイブリダイゼーション法によって、又は植物体中のＤＮＡの塩基配列を解析することによって確認することができる。この場合、植物体からのＤＮＡの抽出は、公知のJ. Sambrookらの方法（Molecular Cloning、第2版、Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989；第3版、Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001）にしたがって実施することができる。

本発明のエンハンサーが導入された植物体が得られれば、該植物体から有性生殖又は無性生殖により子孫を得ることが可能である。また、該植物体やその子孫あるいはクローンから繁殖材料を得て、それらを基に該植物体を量産することも可能である。本発明には、本発明のエンハンサーが導入された植物細胞、該細胞を含む植物体、該植物体の子孫及びクローン、並びに該植物体、その子孫、及びクローンの繁殖材料が含まれる。すなわち、本発明には、導入処理を施した再分化当代である「Ｔ０世代」やＴ０世代の植物の種子である「Ｔ１世代」などの後代植物や、それらを片親にして交配した雑種植物やその後代植物が含まれる。

＜プロモーターの転写活性を増強する方法＞
本発明の別の一態様は、プロモーターの転写活性を増強する方法である。具体的には、本発明の方法は、上述した本発明のエンハンサーを、プロモーターに対して作動可能に挿入する、又は作動可能に連結させる工程を含む、プロモーターの転写活性を増強する方法である。

本発明の方法におけるプロモーターは上述した通りであり、特に限定されないが、本発明のエンハンサーに対して異種の（heterogenous）プロモーターであることが好ましい。すなわち、本発明のエンハンサーはトウモロコシユビキチン１遺伝子プロモーターに由来することから、本発明の方法におけるプロモーターは、トウモロコシユビキチン１遺伝子プロモーターとは異なる種類のプロモーターであることが好ましい。その他、本発明の方法で考慮されるべき用語、材料、手法等も上記の説明及び定義等に準じて解釈される。

本発明はプロモーターの転写活性を増強する方法であり、プロモーターの転写活性の増強は、プロモーターに挿入または連結されたエンハンサーの有無により調べることができる。すなわち、エンハンサーがプロモーターに挿入（又は連結）されていない状態でのプロモーター下流の遺伝子の発現量と比較して、エンハンサーがプロモーターに挿入（又は連結）されている状態（それ以外は全て同一の条件）でのプロモーター下流の遺伝子の発現量の方が多い場合に、プロモーターの転写活性が増強されていると判断することができる。

＜遺伝子の発現を増強する方法＞
本発明の別の一態様は、遺伝子の発現を増強する方法である。具体的には、本発明の方法は、上述した本発明のエンハンサーを、プロモーターに対して作動可能に挿入する、又は作動可能に連結させる工程、及び該プロモーターの下流に位置する遺伝子を発現させる工程を含む、遺伝子の発現を増強する方法である。本発明の方法においては、上述した本発明のエンハンサーと、当該エンハンサーが作動可能に挿入された、又は作動可能に連結されたプロモーターとを含み、当該プロモーターの下流に遺伝子が配置された核酸分子が細胞内に提供される。そして、当該核酸分子を含む細胞内で、対象の遺伝子の発現が増強される。本発明のエンハンサーが有するプロモーター転写活性の増強作用を利用することにより、本発明の方法が得られる。

本発明の方法における核酸分子は、本発明のエンハンサーと、当該エンハンサーが作動可能に連結された、又は作動可能に挿入されたプロモーターとを含む。本発明の方法におけるエンハンサー及びプロモーターに関しては、上記に説明した通りである。また、エンハンサーがプロモーター内に挿入されている状態、及びエンハンサーとプロモーターとが連結している状態も、いずれも上述した通りであり、その他、本発明の方法で考慮されるべき用語、材料、手法等も上記の説明及び定義等に準じて解釈される。

本発明の方法における上記の遺伝子は、プロモーターの下流に位置していればよく、プロモーターと直接的に（隣接して）連結されていてもよいし、１又は２以上のヌクレオチドを介して連結されていてもよい。上記の発現の増強の対象となる遺伝子としては、特に限定されないが、例えば、植物の生産性の向上に寄与する遺伝子を用いることができる。

本発明の方法において、核酸分子の細胞内への提供は、特に限定されないが、本発明のエンハンサーを宿主細胞に導入する方法を利用して行うことができ、その方法は上記に説明した通りである。すなわち、上述したように、本発明のベクターを利用して、当該ベクターを細胞内に導入することにより核酸分子を細胞内に提供してもよい。或いは、本発明のエンハンサー又はこれを含む核酸を細胞内に導入し、ジーンターゲティングやゲノム編集などの技術を利用して、下流に対象の遺伝子が配置されているプロモーターに対して本発明のエンハンサーを作動可能に挿入する、又は作動可能に連結させることにより、核酸分子を細胞内に提供してもよい。なお、本発明のベクターを利用せずに本発明のエンハンサー又はこれを含む核酸を細胞内に導入する場合（すなわち、後者の場合）、本発明のエンハンサーを作動可能に挿入する、又は作動可能に連結させるプロモーターは、当該細胞に内在するプロモーターであることが好ましい。核酸分子が導入される細胞は、特に限定されないが、植物細胞であることが好ましく、より好ましい細胞は上述した通りである。

本発明は遺伝子の発現を増強する方法であり、遺伝子の発現の増強は、プロモーターに挿入または連結されたエンハンサーの有無により調べることができる。すなわち、エンハンサーがプロモーターに挿入（又は連結）されていない状態でのプロモーター下流の遺伝子の発現量と比較して、エンハンサーがプロモーターに挿入（又は連結）されている状態（それ以外は全て同一の条件）でのプロモーター下流の遺伝子の発現量の方が多い場合に、遺伝子の発現が増強されていると判断することができる。

＜高生産性の植物を作出する方法＞
本発明の別の一態様は、高生産性の植物を作出する方法である。具体的には、本発明の方法は、上述した本発明のエンハンサーと、当該エンハンサーが作動可能に挿入された、又は作動可能に連結されたプロモーターとを含み、当該プロモーターの下流に遺伝子が配置された核酸分子を植物細胞内に提供する工程、及び当該核酸分子を含む植物細胞から植物を作出する工程を含む、高生産性の植物を作出する方法である。本発明のエンハンサーが有するプロモーター転写活性の増強作用を利用することにより、本発明の方法が得られる。

本発明の方法における核酸分子は、本発明のエンハンサーと、当該エンハンサーが作動可能に連結された、又は作動可能に挿入されたプロモーターとを含む。核酸分子に含まれるエンハンサー及びプロモーターに関しては、上記に説明した通りである。また、エンハンサーがプロモーター内に挿入されている状態、及びエンハンサーとプロモーターとが連結している状態も、いずれも上述した通りであり、その他、本発明の方法で考慮されるべき用語、材料、手法等も上記の説明及び定義等に準じて解釈される。

核酸分子における上記の遺伝子は、プロモーターの下流に位置していればよく、プロモーターと直接的に（隣接して）連結されていてもよいし、１又は２以上のヌクレオチドを介して連結されていてもよい。本発明の方法における遺伝子としては、特に限定されないが、植物の生産性の向上に寄与する遺伝子を用いることが好ましい。

本発明の方法において、核酸分子を植物細胞内に提供する工程は、特に限定されないが、本発明のエンハンサーを宿主細胞に導入する方法を利用して行うことができ、その方法は上記に説明した通りである。すなわち、上述したように、本発明のベクターを利用して、当該ベクターを植物細胞内に導入することにより核酸分子を植物細胞内に提供してもよい。或いは、本発明のエンハンサー又はこれを含む核酸を植物細胞内に導入し、ジーンターゲティングやゲノム編集などの技術を利用して、下流に対象の遺伝子が配置されているプロモーターに対して本発明のエンハンサーを作動可能に挿入する、又は作動可能に連結させることにより、核酸分子を植物細胞内に提供してもよい。なお、本発明のベクターを利用せずに本発明のエンハンサー又はこれを含む核酸を植物細胞内に導入する場合（すなわち、後者の場合）、本発明のエンハンサーを作動可能に挿入する、又は作動可能に連結させるプロモーターは、当該植物細胞に内在するプロモーターであることが好ましい。核酸分子が導入される植物細胞として好ましい細胞は、上述した通りであるが、特に限定されるわけではない。

植物細胞からの植物体の作出は、当業者に公知の方法を用いて行うことができる。例えば、核酸分子が導入された植物細胞を培養してカルス（細胞塊）を作製し、これを再分化させて、植物ホルモン（オーキシン及びサイトカイニン）を必要に応じて適宜利用して、植物体を作出することができる。植物細胞からの植物体の作出は、本発明の植物に関して上記に説明した方法を利用して行うこともできる。

本発明は高生産性の植物を作出する方法であり、作出された植物の生産性は、活性増強の対象となったプロモーターに挿入または連結されたエンハンサーの有無により調べることができる。すなわち、エンハンサーがプロモーターに挿入（又は連結）されていない状態での植物の生産性と比較して、エンハンサーがプロモーターに挿入（又は連結）されている状態（それ以外は全て同一の条件）での植物の生産性の方が高い場合に、高生産性の植物が作出されていると判断することができる。

以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の技術的範囲を限定するためのものではない。当業者は本明細書の記載に基づいて容易に本発明に修飾・変更を加えることができ、それらも本発明の技術的範囲に含まれる。

実験例１：トウモロコシUbiquitin 1遺伝子プロモーターに存在するエンハンサー領域の探索
トウモロコシUbiquitin 1遺伝子（遺伝子ID：GRMZM2G409726；以下、「ZmUbi」と称する）のプロモーター内に強いエンハンサー領域が存在すると考え、その領域を探索した。以下にその方法を説明する。

方法
供試したpJT3968ベクター（16339bp：図１）は、バイナリーベクターpLC41（Accession number: LC215698）を骨格としており、T-DNA領域内のmultiple cloning sitesに、ZmUbiプロモーター、ZmUbi 5’UTR（イントロン1を含む）、GUS遺伝子（ヒマのカタラーゼ遺伝子イントロンを含む）及びNOSターミネーターが連結された遺伝子発現カセット（PZmUbi-ZmUbiUTR-attB1-IcatGUS-attB2-Tnos）、並びにカリフラワーモザイクウイルス35Sプロモーターで制御された選抜マーカーBar遺伝子（P35S-Bar-T35S）が挿入されている。pJT3968ベクター内のZmUbiプロモーターの上流から100bpずつ800bpまで除去したpJT3968 derivativesを8種類構築した（図２Ａ）。

具体的には、pJT3968 derivativesは以下の手順で構築した。下表に示した通り、8種類のpJT3968 derivativesに特有のPCR1用forwardプライマーと8種類のpJT3968 derivativesに共通のreverseプライマーpJT3968_1338Rとを用いて、pJT3968ベクターを鋳型にして断片1をPCRで増幅した。次に、各種pJT3968 derivativesについて、断片1を鋳型にして、pJT3968_174FとpJT3968_1338Rのプライマー対を用いて、断片2をPCRで増幅した。増幅した各断片2とpJT3968ベクターとを制限酵素HindIII及びNheIで消化した後、DNA ligation kit <Mighty Mix>（Takara）を用いてライゲーションを行い、8種類のpJT3968 derivativesを得た。

次に、試験区となる構築した8種類のベクターとコントロール区となるpJT3968ベクター（コンストラクトPZmUbi_900）とを、それぞれアグロバクテリウムLBA4404株に導入し、Ishida et al. (2007, Nature protocols 2, 1614）の方法に従って、各コンストラクトあたりトウモロコシ（インブレッドライン：A188）未熟胚15個を形質転換した。コントロールは、コンストラクトを保有しないLBA4404株とした。接種3日目の未熟胚を用いてMUGアッセイを行い、GUS活性を調査した。MUGアッセイの手順を以下に示す。

＜MUGアッセイ＞
試薬組成
1. Extraction buffer
50mM Phosphate buffer (pH7.0)
10mM DTT
1mM EDTA (pH8.0)
0.1% Sodium lauroyl sarcosinate
0.1% Triton X-100
2. Stop buffer：0.2M Na₂CO₃
3. 4-MUG stock（基質）
1×working solution (1mM): 3.5 mg 4-Methylumbelliferyl-β-D-glucuronide hydrate (Sigma-Aldrich)/10 mL Extraction buffer
4. 4MU calibration stock（蛍光標準液）
1×working solution (1mM): 2.0 mg 4-Methylumbelliferone (Sigma-Aldrich)/10 mL MQ

MUGアッセイの手順
1. 接種3日目の未熟胚15片を300μlのExtraction bufferで破砕し、そのうちの250μlを冷凍保存した。
2. 手順1の抽出液100μl（pJT3968（PZmUbi_900）の場合は、手順1の抽出液10μl + Extraction buffer 90μl）に175μlのExtraction bufferおよび275μlの1mM 4MUGを添加し、37℃にて反応させた。
3. 60分反応させた後、反応液をそれぞれ100μl取り出し、400μlのStop buffer中に添加した。なお、反応開始前の溶液（反応0分）についても、同様にそれぞれ100μl取り出し、400μlのStop buffer中に添加した。
4. 手順3で得られた溶液200μlを96穴プレートに添加し、プレートリーダーTristar LB941 vTi（Berthold Technologies）にてGUS活性（counts/min/mg protein）を測定した（Excitation filter F370, Emission filter F450）。

結果
MUGアッセイを行った結果、図２Ｂに示した通り、ZmUbiプロモーター全長コンストラクトPZmUbi_900のGUS活性を100%としたとき、-894bpから-394bp領域が含まれていない各コンストラクトPZmUbi_800、PZmUbi_700、PZmUbi_600、PZmUbi_500、PZmUbi_400は、100%以上あるいは100%に近いGUS活性レベルを示した。一方、ZmUbiプロモーターの-894bpから-295bpを含まないPZmUbi_300は67.9％に、-894bpから-195bpを含まないPZmUbi_200は64.5％に、-894bpから-95bpを含まないPZmUbi_100は23.0％に、それぞれGUS活性が下がることが確認された。これらの結果から、ZmUbiプロモーターの-394bpから-95bpにかけて、特にその中でも-194bpから-95bpにかけての100bpの領域に、プロモーター活性を促進させる因子すなわちエンハンサー因子の存在が示唆された。

実験例２：CaMV 35S最小プロモーターを用いたエンハンサーおよびシスエレメントの発現増強効果の確認
エンハンサーやシスエレメントのプロモーター転写活性への効果を客観的に評価するために、当該技術分野ではCaMV 35S 最小プロモーターと遺伝子の発現を可視化するレポーター遺伝子とを組み合わせて、植物細胞に導入する方法が一般的に行われている。本実験例では、レポーター遺伝子としてGUS遺伝子を用い、植物材料としてトウモロコシ未熟胚を用いて、実験例１の結果より推測したZmUbiプロモーター由来のエンハンサー領域および公知のシスエレメントの効果を評価することとした。

（１）評価試験用ベクターの構築
CaMV 35S最小プロモーターは、Ow et al.（1987, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 84, 4870-4874）、Benfey et al.（1990, Embo J 9, 1677-1684）、Ishige et al.（1999, The Plant Journal 18, 443-448）の報告を参考にして準備した。本実験例では、CaMV 35Sプロモーターの-89から+6の領域（転写開始点を+1とする）をCaMV 35S最小プロモーターとして使用した。

pBI221ベクター（GenBank: AF502128）内のCaMV 35S最小プロモーター（以下、「P35S-mini」と称する）に対して、下表に示したP35S-89F及びP35S+6Rのプライマー対を用いてPCRを行い、増幅産物をインサート断片とした。次に、pJT3968ベクターをPspXIとPacIで消化し、ZmUbiプロモーター（イントロン領域含む）を取り除いたものをベクター断片とした。上述のインサート断片とベクター断片とを混合し、In-Fusion HD cloning kit（Takara）を用いてpJT4509ベクターを構築した（pJT3968ベクター内のZmUbiプロモーターがP35S-miniに置換された）。同様に、下表に示したP35S-835F及びP35S+6Rのプライマー対で増幅した835bpからなるCaMV 35Sプロモーター領域全長（エンハンサー領域含む）P35S-FLをpJT3968ベクターのPspXI/PacI部位に挿入し、ポジティブコントロール用のpJT4508ベクターを構築した。

（２）評価コンストラクトの作製
実験例１の結果より推測したZmUbiプロモーター由来のエンハンサー領域ならびに公知のシスエレメントG-boxを、上記（１）で作製したpJT4509ベクターのP35S-mini上流のHindIII/XmaI部位にクローニングした。以下に構築方法を説明する。

（２－１）ZmUbiプロモーター由来のエンハンサー領域のコンストラクト
eZmUbi350、eZmUbi300、及びeZmUbi100は、PCRで増幅した。実験例１で特に強いエンハンサー領域として示されたZmUbiプロモーターの-194から-95領域にかけては、さらに40bpずつ4区画に分割したものを合成した（eZmUbi40a、eZmUbi40b、eZmUbi40c、eZmUbi40d）。その際、これらの断片の両端に、pJT4509ベクターのHindIII/XmaI部位にクローニングするためのアダプター配列を付加した。そして、アダプター配列が付加された断片を、HindIIIとXmaIとで消化したpJT4509ベクターとライゲーションすることにより、評価用コンストラクトを作製した。なお、当該ライゲーションには、DNA ligation kit <Mighty Mix>（Takara）を使用した。

（２－２）シスエレメントG-boxのコンストラクト
G-boxのコア配列（CACGTG）がIshige et al.（1999, Plant Journal 18, 443-448）により報告されており、当該コア配列を含む10塩基のシスエレメントの4量体を2種類合成した（G-box3(4x)及びG-box10(4x))。なお、G-box3はggCACGTGccの塩基配列、G-box10はgcCACGTGccの塩基配列をそれぞれ1量体としており、いずれもトウモロコシゲノムに保存されている。合成したG-box3(4x)及びG-box10(4x)の断片（各両端にIn-Fusionクローニング用アダプター配列が付加されている）を、In-Fusion HD cloning kit（Takara）を用いてpJT4509ベクターのHindIII/XmaI部位に挿入し、評価コンストラクトを作製した。

（２－３）評価コンストラクトのGUSアッセイ
ZmUbiプロモーター由来のエンハンサー領域の評価
上記（２－１）より得られた各種評価コンストラクトをアグロバクテリウムLBA4404株に導入し、Ishida et al. (2007, Nature protocols 2, 1614）の方法に従って、各コンストラクトあたりトウモロコシ（インブレッドライン：A188）未熟胚10個を形質転換した。なお、ネガティブコントロール区として、P35S-miniにGUS遺伝子が連結されたpJT4509ベクターを形質転換に供試した。接種した未熟胚は、2回に分けてGUS染色を行い（1回目：14日後、２回目：21日後）、P35S-miniに対する発現増強効果を判定した。

シスエレメントG-boxの評価
上記（２－２）より得られた各種評価コンストラクトをアグロバクテリウムLBA4404株に導入し、Ishida et al. (2007, Nature protocols 2, 1614）の方法に従って、各コンストラクトあたりトウモロコシ（インブレッドライン：A188）未熟胚7個を形質転換した。なお、ネガティブコントロール区として、P35S-miniにGUS遺伝子が連結されたpJT4509ベクターを形質転換に供試し、ポジティブコントロール区として、835bpからなるCaMV 35Sプロモーター全長（CaMV 35Sエンハンサー配列を含む）P35S-FLにGUS遺伝子が連結されたpJT4508ベクターを形質転換に供試した。接種した未熟胚は、接種3～6日後にGUS染色を行い、P35S-miniに対する発現増強効果を判定した。

GUS染色の手順を以下に示す。
＜GUS染色＞
試薬組成
1. 50 mM NaPi buffer (pH 6.8)
NaH₂PO₄・H₂O 6.66 g/L
Na₂HPO₄・12H₂O 17.66 g/L
2. NaPi buffer + Triton
50 mM NaPi buffer (pH 6.8) 198 mL
10% TritonX-100 2 mL
3. X-Gluc溶液
5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-glucuronide 100 mg
Ethylene glycol monomethyl ether 2 mL
4. X-Gluc反応液
NaPi buffer + Triton 790 μL
メタノール 200 μL
X-Gluc溶液 10 μL

GUS染色手順
1. 接種後の未熟胚あるいはカルスをNaPi buffer + Tritonの溶液中に浸漬した。
2. NaPi buffer + Triton溶液を除去した後、X-Gluc反応液を加え、37℃にて一晩反応させた。
3. X-Gluc反応液を除去した後、蒸留水を加えた。
4. 寒天培地に移し、実体顕微鏡（OLYMPUS SZX12）にて観察し、写真を撮影した。

GUS染色レベルの判定基準は下記の通りとした。
＋＋＋：GUS染色が濃紺色
＋＋：GUS染色が紺色
＋：GUS染色が青色
±：GUS染色がわずかに観察される（極めて薄い青色）
－：GUS染色が観察されない

結果
下表に示した通り、GUS染色を行った結果、全ての試験区において、コントロール区のpJT4509ベクターに比べてGUS活性を増大させることを確認した。G-box3とG-box10をタバコで評価した報告例では、両者の間でGUS活性レベルが異なるが（Ishige et al. 1999, Plant Journal 18, 443-448）、トウモロコシ未熟胚を用いた本実験例においては、両者のP35S-miniの発現増強効果に顕著な差は認められなかった。

実験例３：ZmBIL7プロモーターを用いたエンハンサーおよびシスエレメントの発現増強効果の評価試験
上記実験例２においてP35S-miniに対して発現増強効果を示したエンハンサーおよびシスエレメントについて、それぞれ単独で、あるいはエンハンサーとシスエレメントとを組み合わせて用いて、トウモロコシZmBIL7遺伝子（遺伝子ID: GRMZM2G143854）プロモーターに対する発現増強効果をトウモロコシ未熟胚由来カルスにおいて評価した。

（１）ZmBIL7プロモーターで制御されたGUS発現カセットを有するベクターの構築
単離するZmBIL7プロモーター領域は、EnsemblPlantsウェブサイト（http://plants.ensembl.org/index.html）でのトウモロコシB73ゲノム配列（assembly B73 RefGen_v4）の第４染色体173458089部位から173461088部位までの3000bpとした。

トウモロコシ（インブレッドライン：B73）緑葉からDNAを抽出し、下表に示したXmaI_ZmBIL7pro-3714F及びZmBIL7pro-1Rのプライマー対とTks Gflex DNA Polymerase（Takara）とを用いて、3000bpのZmBIL7プロモーターとその下流の714bpの5’UTRとを含む領域をPCR増幅した。この増幅断片を、In-Fusion HD cloning kit（Takara）を用いてpJT3968ベクターのPspXI部位とPacI部位との間にクローニングし、pJT4712を得た。このプラスミドの構築によって、pJT3968ベクター内のZmUbiプロモーター（下流にZmUbi遺伝子5’UTRを含む）がZmBIL7プロモーター（下流にZmBIL7遺伝子5’UTRを含む）に置換され、さらにZmBIL7プロモーターの直上流に制限酵素XmaI認識部位（-3006から-3001部位に対応する）が付加された。さらに、pJT4712ベクターを鋳型にして、ZB7pIG_2588F及びZB7pUIG_3212Rのプライマー対を用いてPCRを行い、ZmBIL7プロモーター3’末端の615bpを含む断片1を増幅した。また、pJT3968ベクターを鋳型にして、ZB7pUIG_3193F及びZB7pUIG_4321Rのプライマー対を用いてPCRを行い、1093bpのZmUbi遺伝子5’UTRを含む断片2を増幅した。次に、断片1と断片2を混合し、ZB7pIG_2588F及びZB7pUIG_4321Rのプライマー対を用いてoverlap extension PCRを行い、断片1と断片2とが連結された断片3を得た。断片3をStuIおよびPacIで消化し、同じ制限酵素で消化したpJT4712ベクターとライゲーションを行い、ZmBIL7プロモーター下流にZmUbi遺伝子5’UTRが連結されたpJT4713ベクターを得た。

（２）ZmBIL7プロモーターの-105bp部位にエンハンサーおよびシスエレメントを挿入したベクターの構築
以下の手順で、pJT4713ベクターのZmBIL7プロモーターに、実験例２で効果が確認されたエンハンサー領域、またはそのエンハンサー領域とシスエレメントとを組み合わせたものが挿入されたGUSアッセイ用ベクターを構築した。前記プロモーターにおいて挿入された塩基配列を下表に示す。

一般的に、プロモーター上でのシスエレメントの配置は、転写開始点から約50塩基上流に存在するコアプロモーター領域あるいはTATA-boxから、さらに50塩基程度上流がよいとされている（Aysha et al. 2018, Mol Biotechnol 60, 608-620; Pandiarajan and Grover. 2018, Plant Science 277, 132-138）。そこで、本発明では、ZmBIL7プロモーターの-105bp部位を挿入場所とした。挿入場所を作製するために、はじめにpJT4713ベクターの改変を行った。構築に用いたPCRプライマーを下表に示す。pJT4713ベクターを鋳型として、ZBp3000u_2584F及びGBoxcore1_4_Rのプライマー対、並びにZBp3000u_4309R及びGBoxcore1_4_Fのプライマー対を用いてそれぞれPCRを行い、断片1と断片2を得た。次に、断片1と断片2とを混合し、ZBp3000u_2584F及びZBp3000u_4309Rのプライマー対を用いてover-extension PCRを行い、断片1と断片2とが連結された断片3を得た。In-Fusion HD cloning kit（Takara）を用いて、断片3をpJT4713ベクターのPstI部位とPstI部位との間に挿入し、pJT4714ベクターを構築した。これにより、pJT4713ベクターのZmBIL7プロモーターの-108部位から-103部位の塩基配列（CAAGTC）が、pJT4714ベクターではPmlI認識部位（CACGTG）に置換された。次に、上記の表に示した各種挿入断片にPCRでアダプター配列を付加した後、In-Fusion HD cloning kit（Takara）を用いてpJT4714ベクターのPmlI部位に挿入し、評価用コンストラクトを得た。

（３）評価用コンストラクトのGUSアッセイ
上記の評価用コンストラクトをそれぞれアグロバクテリウムLBA4404株に導入し、Ishida et al.（2007, Nature protocols 2, 1614）の方法に従って、各コンストラクトあたりトウモロコシ（インブレッドライン：A188）未熟胚10個を形質転換した。なお、ZmBIL7プロモーターにGUS遺伝子が連結されたpJT4713ベクターをネガティブコントロール区、ZmUBIプロモーターにGUS遺伝子が連結されたpJT3968ベクターをポジティブコントロール区として、それぞれ形質転換に供試した。未熟胚に接種後、2回に分けてGUS染色を行い（1回目：14日後、2回目：21日後）、ZmBIL7プロモーターに対する発現増強効果を確認した。なお、GUS染色は、実験例２と同様の方法を使用し、GUS染色レベルの判定も実験例２と同様の判定基準を使用した。

結果
下表に示した通り、GUS染色を行った結果、全ての試験区において、コントロール区のpJT3968ベクターに比べてGUS活性を増大させることを確認した。供試したエンハンサー領域にシスエレメントを組み合わせたものはGUS活性が高くなり、特に、シスエレメントをエンハンサー領域の下流に連結させたものはGUS活性がさらに高くなった。

実験例４：イネ形質転換体におけるバイオマス評価
イネやシロイヌナズナのBIL7遺伝子を高発現プロモーターに連結してイネで高発現させると、イネのバイオマスが増大することが報告されている（国際公開第２０１６／０５６６５０号）。そこで、実験例３でエンハンサー効果を示した断片が挿入されたZmBIL7プロモーターの下流に、ZmBIL7遺伝子のゲノム断片を連結させた形質転換用ベクターをイネに導入し、イネのバイオマスを評価した。

形質転換用ベクターの構築に用いたエンハンサー断片を下表に示す。構築に供試したベクターpJT4627は、pLC41（Accession number: LC215698）を骨格としており、2つのT-DNA領域を保有する。1つ目のT-DNA領域内には、NOSプロモーターで制御されたネガティブ選抜マーカーBarnase遺伝子（イネRf-1遺伝子のイントロン5を含む）の遺伝子発現カセット（Pnos-Barnase-T35S）が含まれている。2つ目のT-DNA領域内には、ZmBIL7プロモーターの下流にZmBIL7遺伝子のゲノム断片が連結された遺伝子発現カセット（PZmBIL7-ZmBIL7genome）と、35Sプロモーターで制御された選抜マーカーHPT遺伝子が連結された遺伝子発現カセット（P35S-Icat-HPT-T35S）とが含まれている。連結したZmBIL7遺伝子のゲノム断片は、EnsemblPlantsウェブサイト（http://plants.ensembl.org/index.html）でのトウモロコシB73ゲノム配列（assembly B73 RefGen_v4）の第４染色体173453190部位から173458088部位までの4899bpとし、5’UTR、タンパクコーディング領域、及び3’UTRが含まれている。なお、pJT4627ベクターのZmBIL7遺伝子5’UTRをZmUbi遺伝子5’UTR（イントロン1を含む）に置換したベクターpJT4630も供試した。評価用コンストラクトは、実験例３で構築した下表のエンハンサー断片が挿入されたZmBIL7プロモーターを、上記２種類のベクターのZmBIL7プロモーターとそれぞれ置換することで得た。得られた４つのコンストラクトと対照のコンストラクト（エンハンサーがZmBIL7プロモーターに挿入されていないpJT4627ベクター）について、アグロバクテリウムLBA4404株を用いてイネ（品種：ゆきひかり）の形質転換を行った。イネの形質転換は、Hiei et al.（2008 Plant J 6:271-282）の方法に準じて行った。形質転換体の当代（T0世代）の栽培評価は、日本たばこ産業株式会社植物イノベーションセンターの組換え体専用温室にて行った。イネの栽培条件として、日長は14.5時間の長日条件とし、温度は昼温28℃、夜温20℃とした。実験に供した4つのコンストラクトおよび対照の1コンストラクトに関する組換え個体を育苗用の連結ポット（49穴）に各49苗鉢上げした。鉢上げ10日後、及び17日後に各49苗の草丈を測定した。

その結果、下表に示した通り、実験に供した4つのコンストラクトは全て、鉢上げ10日後、及び17日後のいずれにおいても、対照に比較して草丈が高かった。この結果から、本発明により提供されるエンハンサーを利用することにより、植物のバイオマスを増大して、高生産性の植物を作出できることが示唆された。

本発明は、遺伝子発現を利用するあらゆる産業分野において有用である。その一つとして、植物のバイオマスが利用可能な産業分野、例えば、食品分野、エネルギー分野、環境分野等において有用である。本発明を利用することによって、遺伝子におけるプロモーターの転写活性を増強することができ、遺伝子の発現量を高めることが可能となる。

Claims (19)

1. 以下の（ｉ）又は（ｉｉ）のポリヌクレオチドを含む、エンハンサー：
   （ｉ）配列番号１の２０１位～３００位の領域中の少なくとも４０の連続した塩基配列を含むポリヌクレオチド、
   （ｉｉ）（ｉ）のポリヌクレオチドと配列同一性が９０％以上の塩基配列からなり、且つプロモーター転写活性の増強作用を有するポリヌクレオチド。
2. （ｉ）のポリヌクレオチドが、配列番号１の２０１位～３００位の領域中の少なくとも６０の連続した塩基配列を含む、請求項１に記載のエンハンサー。
3. （ｉ）のポリヌクレオチドが、配列番号１の２０１位～３００位の領域中の少なくとも８０の連続した塩基配列を含む、請求項１又は２に記載のエンハンサー。
4. （ｉ）のポリヌクレオチドが、配列番号１の２０１位～２４０位の領域に示される塩基配列、配列番号１の２２１位～２６０位の領域に示される塩基配列、配列番号１の２４１位～２８０位の領域に示される塩基配列、又は配列番号１の２６１位～３００位の領域に示される塩基配列を含む、請求項１～３のいずれか１項に記載のエンハンサー。
5. （ｉ）のポリヌクレオチドが、配列番号１の２０１位～３００位の領域に示される塩基配列を含む、請求項１～４のいずれか１項に記載のエンハンサー。
6. （ｉ）のポリヌクレオチドが、配列番号１の１位～３００位の領域に示される塩基配列を含む、請求項１～５のいずれか１項に記載のエンハンサー。
7. （ｉ）のポリヌクレオチドが、配列番号１に示される塩基配列を含む、請求項１～６のいずれか１項に記載のエンハンサー。
8. ＣＡＣＧＴＧで表される塩基配列を有する核酸断片をさらに含み、該核酸断片が（ｉ）又は（ｉｉ）のポリヌクレオチドに作動可能に連結している、請求項１～７のいずれか１項に記載のエンハンサー。
9. 前記核酸断片を１～１０個含む、請求項８に記載のエンハンサー。
10. 前記核酸断片が、６～１４のヌクレオチドからなる、請求項８又は９に記載のエンハンサー。
11. 請求項１～１０のいずれか１項に記載のエンハンサーとプロモーターとを含む、核酸コンストラクト。
12. エンハンサーが、プロモーター内に作動可能に挿入されている、又はプロモーターに作動可能に連結されている、請求項１１に記載の核酸コンストラクト。
13. 請求項１～１０のいずれか１項に記載のエンハンサーを含む、ベクター。
14. 請求項１１又は１２に記載の核酸コンストラクトを含む、ベクター。
15. 請求項１～１０のいずれか１項に記載のエンハンサーを含む、宿主細胞。
16. 請求項１～１０のいずれか１項に記載のエンハンサーが導入された、植物。
17. 請求項１～１０のいずれか１項に記載のエンハンサーを、プロモーターに対して作動可能に挿入する、又は作動可能に連結させる工程を含む、プロモーターの転写活性を増強する方法。
18. 遺伝子の発現を増強する方法であって、
    請求項１～１０のいずれか１項に記載のエンハンサーを、プロモーターに対して作動可能に挿入する、又は作動可能に連結させる工程、及び
    該プロモーターの下流に位置する遺伝子を発現させる工程、
    を含む、上記方法。
19. 高生産性の植物を作出する方法であって、
    請求項１～１０のいずれか１項に記載のエンハンサーと、該エンハンサーが作動可能に挿入された、又は作動可能に連結されたプロモーターとを含み、該プロモーターの下流に遺伝子が配置された核酸分子を植物細胞内に提供する工程、及び
    該核酸分子を含む植物細胞から植物を作出する工程、
    を含む、上記方法。
    

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