CZ308137B6 - Expresní systém a způsob exprese proteinů v rostlinách - Google Patents

Expresní systém a způsob exprese proteinů v rostlinách Download PDF

Info

Publication number
CZ308137B6
CZ308137B6 CZ2015-764A CZ2015764A CZ308137B6 CZ 308137 B6 CZ308137 B6 CZ 308137B6 CZ 2015764 A CZ2015764 A CZ 2015764A CZ 308137 B6 CZ308137 B6 CZ 308137B6
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
ntr
tobamovirus
expression
gene
cassette
Prior art date
Application number
CZ2015-764A
Other languages
English (en)
Other versions
CZ2015764A3 (cs
Inventor
Tomáš Moravec
Oldřich Navrátil
Noemi Čeřovská
Helena Plchová
Petr Vaculík
Jana Okleštková
Original Assignee
Ústav experimentální botaniky AV ČR, v. v. i.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ústav experimentální botaniky AV ČR, v. v. i. filed Critical Ústav experimentální botaniky AV ČR, v. v. i.
Priority to CZ2015-764A priority Critical patent/CZ308137B6/cs
Publication of CZ2015764A3 publication Critical patent/CZ2015764A3/cs
Publication of CZ308137B6 publication Critical patent/CZ308137B6/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • C12N15/743—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Agrobacterium; Rhizobium; Bradyrhizobium
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
    • C12N15/8202—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation by biological means, e.g. cell mediated or natural vector
    • C12N15/8205—Agrobacterium mediated transformation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
    • C12N15/8206—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation by physical or chemical, i.e. non-biological, means, e.g. electroporation, PEG mediated
    • C12N15/8207—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation by physical or chemical, i.e. non-biological, means, e.g. electroporation, PEG mediated by mechanical means, e.g. microinjection, particle bombardment, silicon whiskers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C12N15/8257—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits for the production of primary gene products, e.g. pharmaceutical products, interferon
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C12N2510/02—Cells for production
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/00041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2770/00043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/00041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2770/00044—Chimeric viral vector comprising heterologous viral elements for production of another viral vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/38011—Tombusviridae
    • C12N2770/38041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/38011—Tombusviridae
    • C12N2770/38041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2770/38043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/38011—Tombusviridae
    • C12N2770/38041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2770/38044—Chimeric viral vector comprising heterologous viral elements for production of another viral vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2799/00—Uses of viruses
    • C12N2799/02—Uses of viruses as vector
    • C12N2799/021—Uses of viruses as vector for the expression of a heterologous nucleic acid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2820/00—Vectors comprising a special origin of replication system
    • C12N2820/60—Vectors comprising a special origin of replication system from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2840/00—Vectors comprising a special translation-regulating system
    • C12N2840/60—Vectors comprising a special translation-regulating system from viruses

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

Expresní systém pro biologicky bezpečnou expresi alespoň jednoho rekombinovaného proteinu v rostlinách, který obsahujea) expresní kazetu pro produkci RNA dependentní RNA polymerázu tobamoviru, přičemž kódující oblast genu RdRp není ohraničena autentickými 5ʻ a 3ʻ NTR oblastmi pocházejícími ze stejného viru jako RdRp, ale NTR oblastmi z jiného viru nebo rostlinného genu;b) expresní kazetu pro produkci represoru genového silencingu P19 z tombusviru; ac) alespoň jednu produkční kazetu pro produkci mRNA obsahující následující elementy v uvedeném pořadí; 5ʻNTR tobamoviru, subgenomový promotor obalového proteinu tobamoviru, alespoň jeden gen kódující rekombinantní protein, který má být v rostlině exprimován, 3ʻNTR tobamoviru a ribozym pro správné sestřižení mRNA na konci 3ʻNTR tobamoviru.Způsob získávání proteinů v rostlinách expresí s použitím tohoto expresního systému.

Description

Oblast techniky
Předložený vynález se týká expresního systému, vektorů a způsobu pro biologicky bezpečnou expresi rekombinantních proteinů v rostlinách.
Dosavadní stav techniky
Expresní vektory založené na rostlinných virech se dnes velmi často používají pro expresi rekombinantních proteinů s vysokou přidanou hodnotou v rostlinách, a to jak v laboratorním měřítku, tak stále častěji i v poloprovozním či komerčním měřítku. Výhodou použití replikujících se virových vektorů je zejména vysoký výtěžek exprimovaného proteinu a poměrně vysoká rychlost, s jakou lze produkovaný protein z rostliny izolovat, která se pohybuje v řádu od několika málo dní do několika týdnů. Současné metody však mají řadu nedostatků. Mezi ně patří například nutnost infikovat rostlinu buď kompletním rekombinantním rostlinným virem, nebo pomocí virové RNA. V poslední době je populární využití binárního plazmidu vloženého do A. tumefaciens. A. tumefaciens se poté infiltruje do listu, kořene nebo suspenzní buněčné kultury a z přepsané RNA se iniciuje virová infekce. Výhodou použití A. tumefaciens pro iniciaci virové infekce je to, že lze snadno použít i viry nebo virové vektory, které netvoří kompletní virové částice. Takové vektory se v rostlině vyskytují, případně šíří, pouze jako volná RNA a nejsou tudíž snadno přenosné ani mechanicky, ani přirozeným vektorem. Tím je zajištěna biologická bezpečnost.
Replikující se virové vektory však mají i některé nevýhody, mezi které patří nestabilita vložených úseků DNA/RNA, která omezuje velikost exprimovaného genu na přibližně 1,5 kb. Dalším velkým omezením je nemožnost použít replikující se virový vektor k současné expresi více proteinů v jedné rostlinné buňce. V neposlední řadě je v některých případech i technicky náročné do binárního vektoru obsahujícího kompletní infekční cDNA rostlinného viru vložit další DNA sekvence, zajišťující expresi požadovaného rekombinantního proteinu.
Podstata vynálezu
Předmětem tohoto vynálezu je expresní systém pro biologicky bezpečnou expresi alespoň jednoho rekombinantního proteinu v rostlinách, který obsahuje
a) expresní kazetu produkující RNA dependentní RNA polymerázu (RdRp) tobamoviru, přičemž kódující oblast genu RdRp není ohraničena autentickými 5' a 3' NTR oblastmi pocházejícími ze stejného viru jako RdRp, ale NTR oblastmi z jiného viru nebo rostlinného genu;
b) expresní kazetu produkující represor genového silencingu P19 z tombusviru; a
c) alespoň jednu produkční kazetu, která produkuje mRNA obsahující následující elementy v uvedeném pořadí: 5'NTR tobamoviru, subgenomovy promotor obalového proteinu tobamoviru, alespoň jeden gen kódující rekombinantní protein, který má být v rostlině exprimován, 3'NTR tobamoviru a ribozym pro správné sestřižení mRNA na konci 3'NTR tobamoviru.
Ve výhodném provedení jsou tyto expresní a produkční kazety umístěny v T-DNA oblastech binárních vektorů schopných replikace v E.coli a Agrobacterium sp. S výhodou jsou obě konstantní expresní kazety umístěny v T-DNA jediného binárního plazmidu. Alternativně však mohou být umístěny každá v samostatném binárním plazmidu. S výhodou je ve vynálezu gen, který má být v rostlině exprimován, vložen do malého produkčního plazmidu, aniž by bylo nutné
- 1 CZ 308137 B6 zasahovat do podpůrných funkcí nutných pro dosažení vysoké míry exprese, tj do virové replikázy a supresoru genového silencingu.
Pro vytvoření plazmidu nesoucích expresní kazety lze použít způsob klonování založený na GoldenGate technice.
Výhodou vynálezu je, že je založen na replikačním mechanismu tobamoviru. Vynález využívá skutečnosti, že virová RnRp je schopna specificky rozeznat RNA struktury nacházející se na 5' a 3' koncích virové RNA a rozpoznanou RNA obsahující tyto struktury replikovat. Gen pro replikázu lze tedy umístit na samostatný genový konstrukt, přičemž je tento konstrukt upraven tak, aby mRNA pro RdRp polymerázu neobsahovala koncové struktury rozeznávané touto polymerázou, a současně v rostlinné buňce exprimovat další mRNA z jiného samostatného plazmidu, která na svých koncích obsahuje struktury rozpoznávané virovou RdRp a je tak zesilována aktivitou RdRp enzymu. Vzhledem k tomu, že žádný z genových konstruktů neobsahuje gen pro virový obalový protein ani strukturu RNA potřebnou pro enkapsidaci virových částic, není taková RNA schopna se v rostlině šířit systémově, ani ji není možno mechanicky přenést na jinou rostlinu.
S výhodou jsou jako vektory použity plazmidy schopné replikace jak v bakteriích E.coli, tak i v bakteriích Agrobacterium sp (například A. tumefaciens nebo A. rhizogenes).
Dále plazmid může obsahovat geny usnadňující selekci v bakteriích a/nebo v rostlinném hostiteli, jako jsou například geny pro rezistenci na antibiotika, herbicidy a další odborníkům známé geny.
Ve výhodném provedení je tobamovirem virus mozaiky tabáku (TMV). TMV je rostlinný virus s pozitivním ssRNA genomem o velikost 6,5 kb vytvářející tyčinkovité částice o délce 300 nm a průměru 18 nm.
S výhodou obsahuje kazeta produkující RNA dependentní RNA polymerázu (RdRp) 5' NTR sekvenci viru leptané mozaiky tabáku (TEV).
Výhodné vektory podle tohoto vynálezu umožňují výrazně snadnější klonování genových konstruktů pro expresi, protože většina genů a funkcí nezbytných pro dosažení vysoké míry exprese se nachází na konstantním pomocném plazmidu, který není nutno mezi experimenty nijakým způsobem měnit nebo upravovat. Veškeré nutné změny probíhají na menším binárním plazmidu, jehož velikost nepřesahuje 4,1 kB (bez započítání velikosti vloženého genu určeného pro expresi v rostlinách). Díky malé velikosti vektoru i odvozené RNA lze vektory podle vynálezu použít i pro expresi větších genů, než je možné s vektorem založeným na replikující se úplné virové RNA. Rovněž bylo překvapivě pozorováno, že vektory podle vynálezu umožňují simultánní expresi více proteinů v téže rostlinné buňce.
Ve výhodném provedení vynález dále popisuje pomocný konstantní plazmid, který obsahuje dvě expresní kazety. První kazeta obsahuje gen RNA dependentní RNA polymerázy z tobamoviru, ve výhodném provedení se jedná o RdRp Viru mozaiky tabáku.
S výhodou jsou jedna nebo obě konstantní expresní kazety vloženy do plazmidu pod kontrolou vhodných regulačních sekvencí, které umožní produkci mRNA v rostlinné buňce, jako jsou například promotory CaMV35S, aktinu, ubikvitinu a NOS terminátor.
RdRp může s výhodou obsahovat jeden nebo více intronů, které zlepšují stabilitu plazmidu v E.coli a transport RdRp mRNA z jádra buňky do cytoplasmy (Marillonnet, et al. Systemic Agrobacterium tumefaciens-mediated transfection of viral replicons for efficient transient expression in plants. Nature biotechnology 23.6 (2005): strana 718 až 723.).
-2CZ 308137 B6
Dále se předkládaný vynález týká způsobu získávání proteinů v rostlinách expresí s použitím expresního systému podle vynálezu, kdy se do rostlinné buňky vnesou:
a) expresní kazeta produkující RNA dependentní RNA polymerázu (RdRp) tobamoviru, přičemž kódující oblast genu RdRp není ohraničena autentickými 5' a 3' NTR oblastmi pocházejícími ze stejného viru jako RdRp, ale NTR oblastmi z jiného viru nebo rostlinného genu;
b) expresní kazeta produkující represor genového silencingu P19 z tombusviru; a
c) alespoň jedna produkční kazeta, která produkuje mRNA obsahující následující elementy v uvedeném pořadí: 5'NTR tobamoviru, subgenomovy promotor obalového proteinu tobamoviru, alespoň jeden gen kódující rekombinantní protein, který má být v rostlině exprimován, 3'NTR tobamoviru a ribozym pro správné sestřižení mRNA na konci 3'NTR tobamoviru.
Expresní a produkční kazety lze do rostliny vnést libovolným známým způsobem, například infekcí in-vitro transkribovanou RNA, mechanicky pomocí plazmidové DNA nebo virovými částicemi, biolisticky nebo agroinfiltrací.
Pokud je použita agroinfiltrace, je výhodné vybrat takové rostliny, ve kterých je dosahováno vysoké účinnosti agroinfiltrace, například rostliny Nicotiana benthamiana.
V infiltrovaných rostlinách dochází k replikaci pouze RNA odpovídající variabilnímu produkčnímu genovému konstruktu, ve kterém není žádný gen pro obalový protein ani signál pro enkapsidaci RNA. Tyto sekvence neobsahují ani pomocný konstantní genový konstrukt. RNA tudíž není schopna se v těchto rostlinách systémově šířit a je rovněž zabráněno jejímu přenosu mechanicky nebo přirozeným vektorem například hmyzem v případě současné neúmyslné infekce kompletním virem divokého typu.
Po expresi proteinu se vytvořené rekombinatní proteiny mohou získat z rostliny například extrakcí.
Vynález je dále popsán s pomocí připojených příkladů, které však nijak neomezují nárokovaný rozsah.
Objasnění výkresů
Obrázek 1: Na obrázku je schematicky znázorněna struktura genomu viru tabákové mozaiky, typového zástupce rodu Tobamovirus. Genom sestává z těchto částí: 5' nepřekládané oblasti (5'NTR), genu pro RNA dependentní RNA polymerázu (126/183 kDa protein), která se translatuje ve dvou formách pomocí suprese stop-kodónu, genu pro virový movement protein (MP), genu pro obalový protein viru (CP) a 3' nepřekládané oblasti (3'NTR). Virová RNA má strukturu čepičky na 5' konci a neobsahuje poly-A 3'-konec. Na obrázku jsou znázorněny subgenomové promotory MP a CP.
Obrázek 2: Na obrázku jsou schematicky znázorněny dva plazmidy pro expresi proteinů v rostlinách podle vynálezu. Konstantní plazmid obsahuje expresní kazetu produkující RNA dependentní RNA polymerázu (RdRp) tobamoviru pod silným promotorem. ORF pro RdRp není ohraničena NTR oblastmi z tobamoviru, ale obsahuje heterologní 5' a 3' NTR oblasti. Druhá expresní kazeta produkuje represor genového silencingu P19 z tombusviru. Druhý variabilní produkční plazmid obsahuje expresní kazetu produkující mRNA zahrnující tyto části: 5'NTR tobamoviru, subgenomovy promotor obalového proteinu tobamoviru, protein kódující oblast genu, který má být v rostlině exprimován (GOI), 3'NTR tobamoviru a ribozym.
-3 CZ 308137 B6
Obrázek 3: Na obrázku je znázorněna mapa binárního plazmidu pro expresi RdRp tobamoviru v rostlinách pDBlal:35S-Rep. Plazmid obsahuje silný promotor 35S z Viru mozaiky květáku (CaMV), 5'-zesilovač translace z viru leptané mozaiky tabáku, gen pro RdRp z Viru mozaiky tabáku ve, kterém je vložen intron z kyselé peroxidázy tabáku a Nos terminátor transkripce. Vektor nese kanamycinový rezistenční marker pro selekci v E.coli a A. tumefaciens a replikační počátky pro oba tyto mikroorganismy.
Obrázek 4: Na obrázku je znázorněna mapa konstantního pomocného binárního vektoru pDB1021:Rep-P19. Kromě expresní kazety pro expresi RdRp tobamoviru, která je identická s tou ve vektoru pDBlal:35S-Rep znázorněném na obrázku 3, ještě dále obsahuje kazetu pro expresi supresoru genového silencingu P19 z tombusviru. Tato kazeta obsahuje promotor 35S z CaMV, gen supresoru P19 a Nos terminátor.
Obrázek 5: Na obrázku je znázorněna mapa variabilního produkčního plazmidu pDBlal:VVGFP, ve kterém je expresní kazeta pro expresi zeleného fluorescenčního proteinu. Plazmid obsahuje tyto funkční části promotor 35S z Viru mozaiky květáku, 5 NTR oblast z viru mozaiky tabáku (TMV), subgenomový promotor obalového proteinu TMV, gen pro zelený fluorescenční protein, 3 NTR oblast TMV, ribozym umožňující rozštěpení vznikající mRNA v místě konce 3NTR TMV a Nos terminátor. Vektor nese kanamycinový rezistenční marker pro selekci v E.coli a A. tumefaciens a replikační počátky pro oba tyto mikroorganismy.
Příklady uskutečnění vynálezu
Příklad 1: Příprava konstantního binárního plazmidu
Konstantní binární plazmid se připraví za pomocí postupů rekombinantní DNA, které jsou odborníkům dobře známy z oblasti techniky. Vektor má podobu plazmidu obsahujícího cDNA kopii RdRp rostlinného viru zrodu Tobamovirus. Ve výhodném provedení obsahuje produkční plazmid cDNA kopii RdRp viru tabákové mozaiky TMV. Pro použití dle vynálezu je důležité, že kódující oblast genu RdRp není ohraničena autentickými 5' a 3' NTR oblastmi pocházejícími ze stejného viru jako RdRp, ale NTR oblastmi z jiného viru nebo rostlinného genu. Dále tento plazmid obsahuje druhou expresní kazetu, produkující supresor genového silencingu P19 z Tombusviru. Obě genové kazety jsou pod transkripční kontrolou vhodných regulačních sekvencí, jako jsou například promotory CaMV35S, aktinu, ubikvitinu, a terminátory transkripce jako je Nos terminátor pocházející z A. tumefaciens a podobně. Tyto dvě expresní kazety mohou být výhodně umístěny v T-DNA stejného plazmidu, nebo mohou být do rostlinné buňky dopraveny na dvou izolovaných plazmidech. Plazmidy jsou schopny replikace jak v bakteriích E.coli, tak i v bakteriích Agrobacterium sp (například A. tumefaciens nebo A. rhizogenes). Dále takový plazmid může obsahovat geny usnadňující selekci v bakteriích a/nebo v rostlinném hostiteli, jako jsou například geny pro rezistenci na antibiotika či herbicidy.
V tomto příkladu byl jako výchozí vektor použit plazmid pGR2i-dCP:GFP, GenBank: KF981446.1. V tomto plazmidu je vložena infekční cDNA kopie TMV pod kontrolou CaMV35S promotoru a na 3' konci virové cDNA se nachází ribozym a transkripční terminátor NOS. V genu pro replikázu je vložen intron z kyselé peroxidázy tabáku, který zvýší stabilitu genu v E.coli a usnadní translokaci mRNA z jádra do cytoplazmy rostlinné buňky. Celá tato kazeta je umístěna na T-DNA, pro selekci v bakteriích lze použít antibiotikum kanamycin. Gen pro RdRp TMV byl z plazmidu amplifikován pomocí primerů
RdRpIF: GCGCCGTCTCGCTCGAATGATGGCATACACACAGACAGC
RdRpIR: GCGCCGTCTCGCTCGAAGCTTAACAACTAGAGCCGTCTATAAA
K amplifíkaci bylo použito Phusion Taq Polymerázy, (Thermo) a následujícího programu:
-4CZ 308137 B6
počáteční denaturace 98 °C 30 vteřin
30 cyklů 98 °C 15 vteřin
60 °C 15 vteřin
72 °C 2,5 minuty
Amplifikaci vzniká PCR produkt o velikosti 4,9 kb, který se přečistí pomocí kolonky QIAquick PCR cleanup (Qiagen) a restrikčně ligační reakcí se vloží do domestikačního plazmidu pUPDl (viz Sarrion-Perdigones, et al. GoldenBraid 2.0: A Comprehensive DNA Assembly Framework for Plant Synthetic Biology, Plant Physiology (2013)). Do reakce se vloží 75 ng PCR produktu, 75 ng plazmidu pUPDl, 1 pl 10 x ligačního pufru Promega, 1 μΐ T4 ligázy Promega, 1 μΐ enzymu BsmBI (LifeTechnologies) a voda do 10 μΐ. Reakce se nechá probíhat 25 cyklů při
následujícím programu. 25 cyklů 37 °C 2 minuty 16 °C 5 minut
Po ukončení cyklování se přidají následující kroky:
°C 5 minut °C 15 minut
Vzniklý rekombinantní plazmid se transformuje do kompetentních buněk E.coli TOP10 a vyseje na LB plotny s obsahem 100 pg/ml karbenicilinu a 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-P-Dgalaktopyranosidu (X-gal). Po 18 hodinové inkubaci při teplotě 37 °C se vyberou bílé kolonie a použijí pro izolaci plazmidové DNA, správné rekombinantní klony se ověří restrikčním štěpením a sekvenací.
Celá expresní kazeta se poté spojí do binárního vektoru pDBlalfal (Sarrion-Perdigones et al. (2013)) spolu s promotorem CaMV35S a NOS terminátorem pomocí resktrikčně ligační reakce a enzymu
Bsal. Stručně do 0,2 ml mikrozkumavky se vloží 75 ng každého z plazmidu, 1 μΐ 10 x ligačního pufru Promega, 1 μΐ T4 ligázy Promega, 1 μΐ enzymu Bsal (LifeTechnologies) a voda do 10 μΐ. Reakce se nechá probíhat 25 cyklů při následujícím programu.
cyklů °C 2 minuty °C 5 minut
Po ukončení cyklování přidají následující kroky °C 5 minut °C 15 minut
Vzniklý rekombinantní plazmid se transformuje do kompetentních buněk E.coli TOP 10 a vyseje na LB plotny s obsahem 100 pg/ml kanamycinu a 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-P-Dgalaktopyranosidu (X-gal). Po 18 hodinové inkubaci při teplotě 37 °C se vyberou bíle kolonie a použijí pro izolaci plazmidové DNA, správné rekombinantní klony se ověří restrikčním štěpením a sekvenací. Mapa výsledného plazmidu nazvaného pDBlal: 35S-Rep je znázorněna na obrázku
3. Kazeta pro expresi supresoru genového silencingu P19 tombusviru se připraví podobným způsobem za vzniku plazmidu nazvaného nazvaný pDBla2: 35S-P19, nebo lze použít již připravenou kazetu (GB0108, databáze https://gbcloning.upv.es/). Vzniklé plasmidy lze zkombinovat pomocí restrikčně-ligační reakce s enzymem BsmBI do jednoho vektoru nazvaného pDB102:Rep-P19, který je znázorněn na obrázku 4.
Příklad 2: Příprava variabilního binárního expresního vektoru pro expresi GFP
Podobným způsobem jako při přípravě konstantního binárního expresního vektoru se bude postupovat i při přípravě variabilní části. Nejprve je třeba z vektoru pGR2idCP-GFP, GenBank: KF981446.1, PCR amplifikaci získat a) oblast promoru a 5'NTR viru mozaiky tabáku a b) oblast 3'NTR, ribozymu a Nos-Terminátoru. Ktomu se použijí následující primery:
GB2-35S-F: GCGCCGTCTCGCTCGGGAGACACGCTTGTCTACTCCAAAA
GB2-OmegaR GCGCCGTCTCGCTCGCATTGGTGATGTAATTGTAAATAGTAATTG
Vzniká amplikon o velikosti 507 bp a s primery
GB2-3'NTR-F: GCGCCGTCTCGCTCGGCTTTGACCTCTGGTCCTGCAACT
GB2-NOS-R: GCGCCGTCTCGCTCGAGCGATCAGGCGCCATTCGCCATT vzniká amplikon o velikosti 890 bp. PCR produkty se přečistí na kolonce a restrikčně ligační reakcí s enzymem BsmBI se stejným způsobem jako v příkladu 1 vloží do výchozího plazmidu pUPDl za vzniku plazmidů, pUPDl:35S-5'NTR a pUPDl:3'NTR-NosT. Správné rekombinantní plazmidy se ověří restrikčním štěpením a sekvenací. Variabilní expresní kazeta pro použití v rostlinách se poté složí retrikčně ligační reakcí s enzymem Bsal. Do 0,2 ml mikrozkumavky se vloží 75 ng každého z plazmidu (pDBla2, pUPDl:35S-5'NTR, pUPDl:3'NTR-NosT a pUPDIGFP (GB0059), 1 pl 10 x ligačního pufru Promega, 1 μΐ T4 ligázy Promega, 1 μΐ enzymu Bsal (LifeTechnologies) a voda do 10 μΐ. Reakce se nechá probíhat 25 cyklů při následujícím programu.
cyklů 37 °C 2 minuty °C 5 minut
Po ukončení cyklování přidají následující kroky °C 5 minut °C 15 minut
Bakterie se poté selektují na LB plotnách s kanamycínem a X-gal, správné rekombinantní klony se ověří restrikčním štěpením a sekvenací. Mapa výsledného plazmidu nazvaného pDBlaLWGFP je na obrázku 5.
Příklad 3: Transientní exprese modelového proteinu GFP v rostlinách N. benthamiana
Ověřenými rekombinantními plazmidy podle Příkladů 1 a 2 se transformují kompetentní buňky A. tumefaciens kmene GV3101 způsobem podle Hofgena a Willimitzera (Hofgen, R. & Willmitzer, L. (1988). Storage of competent cells for Agrobacterium transformation. Nucleic acids research 16, 9877).
Z izolovaných kanamycin-rezistentních kolonií se připraví zásobní glycerinové kultury, které se uchovávají při -78 °C. 5 ml LB media se selekčním antibiotikem se naočkuje A. tumefaciens ze zásobní kultury nesoucí produkční variabilní plazmid a současně se další 5 ml LB média naočkuje A. tumefaciens s pomocným konstantním plazmidem. Kultury se inkubují na třepačce při 28 °C po dobu 36 hodin. Poté se použité médium odstraní centrifugací 10 minut při 5000x g a bakteriální peleta se resuspenduje v infiltračním médiu (lOmM MgC12; lOmM MES a 100μΜ acetosyringon, (viz Bazzini, A. A., Mongelli, V. C, Hopp, Η. E., del Vas, M. & Asurmendi, S.
-6CZ 308137 B6 (2007), A practical approach to the understanding and teaching of RNA silencing in plants. Electronic Journal of Biotechnology 10, 179-190) tak, aby byla výsledná optická hustota OD6oo=0,3. Bakteriální suspenze se ponechají stát další 2 až 4 hodiny při pokojové teplotě. Vlastní infiltrace se provádí aplikací bakteriální suspenze pomocí 1 ml injekční stříkačky bez jehly na spodní stranu listů asi 3-4 týdny starých rostlin N. benthamiana. Průběh infekce lze sledovat pozorováním šíření GFP v infikovaných rostlinách pomocí přenosné UV-lampy a žlutého filtru. Množství produkovaného rekombinantního proteinu lze měřit nějakým vhodným způsobem dobře známým odborníkům v oboru, například testem ELISA, imunoblotem nebo v případě GFP přímým měřením fluorescence pomocí fluorometru. V tabulce 1 jsou uvedeny výsledky experimentu, při kterém byly rostliny inokulovány nejprve každým z virových vektorů samostatně a poté i jejich kombinací. Pouze v případě, kdy se v rostlinné buňce exprimují současně virová replikáza, P19 supresor genového silencingu a variabilní expresní kazeta ohraničená NTR oblastmi tobamoviru dochází k silné expresi genu GFP.
Tabulka 1 : Hodnoty fluorescence rostlinných extraktů z příkladu 3
Ágrobacterium použité pru infiltraci Fluorescence GFP (RFI) ± SEM (460/10 nm exc, 530/20 em)
žádné 2532±650
prázdný vektor 4523^721
pDBIOá: 35S~Rep; 35S-P19 4361M75
pDBlaI;VV-GFP I2326±1Ó2O
pDBlO2: 35S-Rep; 35S-P19 +pDBlal;VV-GFP 4155(H-2530
Příklad 4: Současná transientní exprese dvou proteinů v rostlinách N. benthamiana
Pro ověření simultánní exprese dvou virových vektorů v téže buňce lze využít současné exprese dvou fluorescenčních proteinů s různými emisními charakteristikami. Lze například současně použít gen pro zelený fluorescenční protein (excitace 480 nm, emise 525 nm) a gen pro protein mCherry (excitace 587 nm, emise 610 nm). Postupem obdobným tomu, který byl popsán v příkladu 2 byl vytvořen variabilní binární expresní vektor pDBlaEVV-mCherry. Sekvenací ověřený plazmid se použije pro transformaci A. tumefaciens GV3101. V tomto příkladu se listy rostlin N.benthamiana infiltrují současně třemi kulturami A. tumefaciens - první kultura nese pomocný konstantní konstrukt pDB102: 35S-Rep:P19 s kazetami pro RdRp a pro supresorem P19, druhá nese variabilní expresní plazmid pDBlal:VV-GFP a třetí pak pDBlakVV-mCherry. 5 dní po infiltraci byly z infiltrovaných listů připraveny protoplasty, postupem popsaným v práci Giritch et al. Rapid high-yield expression of full-size IgG antibodies in plants coinfected with noncompeting viral vectors. Proceedings of the National Academy of Sciences 103.40 (2006): 14701-14706. Listy byly žiletkou nařezány na cca 1 mm silné proužky a poté byly přes noc macerovány v 0,4% roztoku celulázy Onozuka R-10 a 0,4% macerozymu R-10 (obojí Duchefa). Uvolněné protoplasty byly přefiltrovány přes jemnou nylonovou tkaninu a pozorovány pod fluorescenčním mikroskopem (Leica) vybaveným příslušnými filtry. V buňkách z listů infiltrovaných všemi třemi konstrukty byl pozorován signál obou fluorescenčních proteinů.
-7CZ 308137 B6
Příklad 5: Mechanický přenos vektoru podle vynálezu
Pro biologickou bezpečnost vektorů založených na rostlinných virech je důležitá jejich schopnost se šířit i mimo rostliny určené k expresi rekombinantního proteinu. Je výhodné, pokud je schopnost těchto vektorů šířit se mimo požadovanou rostlinu snížena, nebo její zcela zamezeno, a to i v případě, že dojde ke kontaminaci experimentálních rostlin příbuzným virem divokého typu.
Rostliny N. benthamiana byly ko-infiltrovány A. tumefaciens s těmito vektory pDB102: 35SRep:35S-P19 apDBlal:W-GFP stejným způsobem jako v příkladu 3.
dní po infiltraci byla pozorována GFP fluorescence v inokulovaných listech. Listy byly poté mechanicky inokulovány 20 pl virové suspenze, která obsahovala 10 pg/ml viru tabákové mozaiky divokého typu (wt TMV) v 20mM fosfátovém pufiru, pH 7,5. Po dalších 4 dnech byly na listech jasně patrné příznaky virové infekce, žloutnutí listů, počínající nekrózy vodivých pletiv, sklánění růstového vrcholu. Sektory vykazující GFP fluorescenci byly z listu vyříznuty korkovrtem a homogenizovány v 20mM fosfátovém pufru, pH 7,5. Zbytky rostlinných pletiv byly odstraněny centrifůgací a čirý extrakt byl použit jako inokulum (v ředění 1/100) pro mechanický přenos na listy N.benthamiana. Tři dny pro sekundárním přenosu byly listy pozorovány pod fluorescenčním mikroskopem a byly hledány buňky vykazující GFP fluorescenci. Jako druhá nezávislá metoda pro určení potenciálu neúmyslného šíření virového vektoru byla použita qPCR. Čirý extrakt z infikovaných listů byl ponechán při pokojové teplotě po dobu 2 hodin. Během této doby je většina cytoplasmatických mRNA částečně nebo zcela degradována. RNA, která je skrytá uvnitř virových částic však zůstane nedotčena. Po dvou hodinách byla z extraktu pomocí činidla RNAzol (MRC, Ohio, USA) izolována RNA postupem doporučeným výrobcem. Pro syntézu cDNA byl použit primer 3NTR-TMV, který je komplementární jak k virové RNA, tak i k RNA odvozené od virového vektoru pDBlaLVVGFP. Přepsaná cDNA byla ředěna 1:20 a poté analyzována pomocí qPCR na přístroji Light Cycler 2.0 (Roche) s použitím kitu DyNAmo™ Capillary SYBR® Green qPCR Kit (Thermo) dle doporučení výrobce. Zatímco detekce obalového proteinu (CP- TMV), který se vyskytuje pouze genomové RNA wt viru byla úspěšná již v 19 cyklu +/-1 cyklus, detekce pomocí primerů specifických pro GFP byla na úrovni pozadí (N. benthamiana infikovaná pouze virem wt TMV, bez vektoru pDBlal:W-GFP) tj. 33. cyklus +/- 2 cykly. Oba nezávislé způsoby naznačují, že RNA odvozená od variabilního produkčního plazmidu podle vynálezu není účinně chráněna obalovým proteinem viru ve virových částicích, což významným způsobem snižuje riziko jejího náhodného přenosu na necílovou rostlinu.
Tabulka 2: Primery použité pro qPCR detekci GFP/CP-TMV ve virových částicích | Název j Sekvence.j
3NTR/TMV | gcaccacgtgtgattacggacácsatc qGFP-Š· | qGFP-AS'““I §ř qCPTMV-Š “ ™ C ACFAC“““1 qCPTMV^AS [AACAGŤŤÁCnGŤGGŤGAÁGG
- 8 CZ 308137 B6
PATENTOVÉ NÁROKY

Claims (5)

1. Expresní systém pro biologicky bezpečnou expresi alespoň jednoho rekombinantního proteinu v rostlinách, vyznačený tím, že obsahuje
a) expresní kazetu pro produkci RNA dependentní RNA polymerázu tobamoviru, přičemž kódující oblast genu RdRp není ohraničena autentickými 5‘ a 3‘ NTR oblastmi pocházejícími ze stejného viru jako RdRp, ale NTR oblastmi z jiného viru nebo rostlinného genu;
b) expresní kazetu pro produkci represoru genového silencingu P19 z tombusviru; a
c) alespoň jednu produkční kazetu pro produkci mRNA obsahující následující elementy v uvedeném pořadí: 5'NTR tobamoviru, subgenomovy promotor obalového proteinu tobamoviru, alespoň jeden gen kódující rekombinantní protein, který má být v rostlině exprimován, 3'NTR tobamoviru a ribozym pro správné sestřižení mRNA na konci 3'NTR tobamoviru.
2. Expresní systém podle nároku 1, vyznačený tím, že obsahuje plazmidy nesoucí expresní a/nebo produkční kazety podle nároku 1, přičemž expresní a/nebo produkční kazety jsou umístěny v T-DNA oblastech binárních vektorů.
3. Expresní systém podle nároku 2, vyznačený tím, že obě expresní kazety jsou umístěny v TDNA jediného binárního plazmidu a produkční kazeta je umístěna v T-DNA dalšího plazmidu.
4. Expresní systém podle nároku 2 nebo 3, vyznačený tím, že plazmidy obsahují geny pro selekci v bakteriích a/nebo v rostlinném hostiteli, s výhodou vybrané z genů pro rezistenci na antibiotika a herbicidy.
5. Expresní systém podle kteréhokoliv z předcházejících nároků, vyznačený tím, že tobamovirem je virus mozaiky tabáku, a s výhodou obsahuje kazeta pro produkci RNA dependentní RNA polymerázy 5' NTR sekvenci viru leptané mozaiky tabáku.
6. Expresní systém podle kteréhokoliv z nároků 2 až 5, vyznačený tím, že jedna nebo obě expresní kazety jsou umístěny v plazmidu pod kontrolou regulačních sekvencí vybraných z promotorů CaMV35S, aktinu, ubikvitinu a NOS terminátoru.
7. Expresní systém podle kteréhokoliv z předcházejících nároků, vyznačený tím, že kazeta pro produkci RNA dependentní RNA polymerázy obsahuje jeden nebo více intronů zlepšujících stabilitu plazmidu v E.coli a transport RdRp mRNA z jádra buňky do cytoplasmy.
8. Způsob získávání proteinů v rostlinách expresí s použitím expresního systému podle kteréhokoliv z předcházejících nároků, vyznačený tím, že se do rostlinné buňky vnesou:
a) expresní kazeta produkující RNA dependentní RNA polymerázu (RdRp) tobamoviru, přičemž kódující oblast genu RdRp není ohraničena autentickými 5‘ a 3‘ NTR oblastmi pocházejícími ze stejného viru jako RdRp, ale NTR oblastmi z jiného viru nebo rostlinného genu;
b) expresní kazeta produkující represor genového silencingu P19 z tombusviru; a
c) alespoň jedna produkční kazeta, která produkuje mRNA obsahující následující elementy v uvedeném pořadí: 5 'NTR tobamoviru, subgenomovy promotor obalového proteinu tobamoviru, alespoň jeden gen kódující rekombinantní protein, který má být v rostlině exprimován, 3'NTR tobamoviru a ribozym pro správné sestřižení mRNA na konci 3'NTR tobamoviru.
-9CZ 308137 B6
9. Způsob podle nároku 8, vyznačený tím, že se kazety vnesou do rostlinné buňky metodou vybranou z infekce in-vitro transkribovanou RNA, mechanicky pomocí plazmidové DNA nebo virovými částicemi, biolisticky nebo agroinfíltrace.
5 10. Způsob podle nároku 8 nebo 9, vyznačený tím, že rostlinami jsou rostliny Nicotiana benthamiana.
CZ2015-764A 2015-10-30 2015-10-30 Expresní systém a způsob exprese proteinů v rostlinách CZ308137B6 (cs)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CZ2015-764A CZ308137B6 (cs) 2015-10-30 2015-10-30 Expresní systém a způsob exprese proteinů v rostlinách

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CZ2015-764A CZ308137B6 (cs) 2015-10-30 2015-10-30 Expresní systém a způsob exprese proteinů v rostlinách

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ2015764A3 CZ2015764A3 (cs) 2017-05-31
CZ308137B6 true CZ308137B6 (cs) 2020-01-22

Family

ID=59021110

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ2015-764A CZ308137B6 (cs) 2015-10-30 2015-10-30 Expresní systém a způsob exprese proteinů v rostlinách

Country Status (1)

Country Link
CZ (1) CZ308137B6 (cs)

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JAMES C. CARRINGTON* AND DEON D. FREED: Cap-Independent Enhancement of Translation by a Plant Potyvirus 5' Nontranslated Region 1990 JOURNAL OF VIROLOGY 64,1590-1597 *
Odon Thiébeauld et al: Alternative translation strategies in plant viruses 2007 Plant Viruses 1 – 20 *
Sarrion-Perdigones A., et al.: GoldenBraid 2.0: a comprehensive DNA assembly framework for plant synthetic biology 2013 Plant Physiol.162(3):1618-31 *
Theo W. Dreher and W. Allen Miller: Translational control in positive strand RNA plant viruses Virology. 2006 344(1): 185–197 *

Also Published As

Publication number Publication date
CZ2015764A3 (cs) 2017-05-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Peyret et al. When plant virology met Agrobacterium: the rise of the deconstructed clones
Mei et al. Protein expression and gene editing in monocots using foxtail mosaic virus vectors
RU2539793C2 (ru) Системы экспрессии белка
Wydro et al. Optimization of transient Agrobacterium-mediated gene expression system in leaves of Nicotiana benthamiana
US8519113B2 (en) Bipartite system, method and composition for the constitutive and inducible expression of high levels of foreign proteins in plants
JP6850041B2 (ja) 植物細胞でのタンパク質発現システム及びその使用
MXPA03008667A (es) Procedimientos y vectores para la amplificacion o expresion de secuencias de acido nucleico de interes en plantas.
Gao et al. Enhanced transgene expression in sugarcane by co-expression of virus-encoded RNA silencing suppressors
Liu et al. A tobamovirus expression vector for agroinfection of legumes and Nicotiana
Yoon et al. Agrobacterium-mediated infection of whole plants by yellow dwarf viruses
Alvarez et al. P19-dependent and P19-independent reversion of F1-V gene silencing in tomato
Pérez-Alonso et al. Agrobacterium tumefaciens-mediated genetic transformation of Digitalis purpurea L.
US20120042409A1 (en) Plant transformation using dna minicircles
Junqueira et al. A simplified approach to construct infectious cDNA clones of a tobamovirus in a binary vector
US20220235362A1 (en) Geminiviral vectors that reduce cell death and enhance expression of biopharmaceutical proteins
CZ308137B6 (cs) Expresní systém a způsob exprese proteinů v rostlinách
Bhat et al. Development of infectious clone of virus
WO2011154611A2 (en) A method for enhanced protein synthesis
Fateri Rezvani et al. Production of potato resistant plant to PVX using an RNA silencing mechanism
JP5089680B2 (ja) 形質転換植物、形質転換細胞、タンパク質生産キットおよびタンパク質の生産方法
Dujovny et al. A temperature‐controlled amplicon system derived from Plum pox potyvirus
Baskar et al. New-Generation Vectors for Plant Transgenics: Methods and Applications
Ellison Development of RNA Viral Vectors for Plant Genome Engineering
Huang et al. Trans‐complementation of the viral movement protein mediates efficient expression of large target genes via a tobacco mosaic virus vector
Kato Molecular strategies for resistance to circular single-stranded DNA viruses