KR20010020526A - 식물 및 바이러스 프로모터 - Google Patents

Abstract

본 발명은 유전자이식 식물에서 고수준의 유전자 발현을 유도하는데 사용할 수 있는 식물 및 바이러스 프로모터를 제공한다. 대표적인 프로모터는 재배품종 마이소어, 윌리암스 및 골드핑거로부터의 호주산 바나나-감염 배드나바이러스로부터 분리할 수 있다. 또한, 본 발명은 상기 프로모터가 암호서열에 작동적으로 연결되어 있는 작제물을 제공한다. 또한, 본 발명은 식물세포에서 유전자의 산물을 발현하는 방법, 게놈에 DNA 작제물을 갖는 식물세포 및 유전자이식 세포를 포함한 식물을 제공한다.

Description

식물 및 바이러스 프로모터{PLANT AND VIRAL PROMOTERS}

식물의 유전공학은 식물육종을 위한 대안임은 물론 표현형의 변형을 유도하는 바람직한 새로운 특성을 도입하기 위한 대안으로 입증되어 왔다. 또한, 식물의 유전공학은 생물학적 연구에 가치 있는 도구로 역할을 하고 있다. 식물의 유전자 조작은 생물체의 세포 수준에 그 초점이 맞춰져 있으며 세포 생물학, 분자 생물학 및 유전자 전달 과정의 모든 면을 망라하고 있다(Sharp et al., Food Technology, Feb. 1984, pp. 112-119). 조직 배양, 체세포클론 및 배우자클론 변이, 세포 선별 과정 및 재조합 DNA의 유전공학 도구는 유전자의 증폭된 발현 및 전달과 직간접으로 연관이 있다. 이를 위한 필수적인 문제는 유전자가 원하는 속도, 원하는 위치, 원하는 시간에 발현할 수 있도록 해 주는 적합한 프로모터를 선택하는데 있다. 식물 유전공학의 응용에 있어 대부분은 충분한 양의 유전자 산물(gene product)의 발현을 보장할 수 있는 강력한 프로모터를 요구한다는 것이다. 이러한 응용에는 식물-감염 바이러스, 세균, 진균 또는 선충류로 인한 질병에 대한 내성을 획득하고, 초식동물에 대한 내성을 획득하며, 제초제, 중금속 및 선별성 마커 시약에 대한 내성을 획득하고, 연구용 유전자 및 유전자 산물의 기능 분석을 실시하기 위해 비생물성 인자 (예, 가뭄, 염분, 추위 및 혐기상태)에 대한 내성을 획득하며, 유전자 및 유전자 산물의 표현억제 또는 증폭을 부여하고(유전자 발현의 조절), 거대분자 및 이차 대사산물의 조성물을 변형시키고 (예, 영양가를 높이거나 구조 성분을 변형시킨다), 식물 발생을 변형시키고, 과실이나 곡물의 질 (예, 수확 후 저장수명 또는 질병에 대한 내성)을 개선하는 것이 포함된다.

프로모터의 기능 및 작용방식은 단자엽 및 쌍자엽 식물 모두에서 광범위하게 연구되어 왔다. 대부분의 경우에 β-글루쿠로니다제 암호화 uidA 유전자[GUS: Jefferson et al., EMBO J. 6, 3901-3907 (1987)] 또는 안토시아닌 생성 또는 해파리 녹색 형광 단백질 암호화 유전자[GFP: Chalfie et al., Science 263, 802-805 (1994)]와 같은 레포터 유전자가 일시적이거나 안정한 유전자 발현 시스템에서의 프로모터 활성을 검정하기 위해 사용된다. 단자엽 종으로부터 유도된 프로모터는 흔히 유전자이식 쌍자엽 종에서 조절된 발현 패턴을 나타내지 않는 반면에 유전자이식 단자엽 종에서는 고도로 조절된 발현을 나타낸다[Shimamoto, Current Opinion in Biotechnology 5, 158-162(1994)]. 비록 절대적인 특이성은 없으나, 고도로 조절된 발현 패턴이 유전자이식 단자엽 종에서 수 개의 프로모터에 대하여 입증되었다. 이들 프로모터로는 광-유도성 및 잎-특이성 프로모터, 종자-특이성 프로모터, 분열조직-특이성 프로모터, 뿌리-특이성 프로모터, 꽃-특이성 프로모터, 호르몬-유도성 프로모터, 병원체-유도성 프로모터 및 구성성(constitutive) 프로모터가 포함된다. 단자엽 및 쌍자엽 식물내에서 동일 그룹의 종으로부터 유도된 프로모터가 동일하거나 유사한 고도의 조절된 발현 패턴을 나타내는 것으로 제시되어 왔다(상기 문헌 Shimamoto, 1994)

식물 유전공학에서의 많은 목적상, 강력한 준구성성(nearly constitutive) 프로모터가 식물을 통한 충분한 발현을 보장하는데 요구되고 있다. 식물의 유전자 조절을 위한 수 개의 강력한 준구성성 프로모터가 특허로 허여되었다(예, 꽃양배추 모자이크 바이러스의 35S 프로모터 - 미국특허 제5,352,605호, 제5,164,316호, 제5,196,525호, 제5,322,938호 및 제5,359,142호 참조). 그러나, 하나 이상의 준구성성 프로모터를 갖는 것은 수 개의 상이한 유전자가 식물에서 발현될 필요가 있을 때(유전자 피라미드형) 아주 유용할 수 있다. 유전자 표현억제가 동일한 프로모터에 의해 조절되는 수 개의 유전자로 형질전환된 식물에서 일어나는 것이 종종 관찰되어 왔다[Flavell, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 3490-3496 (1994); Finnegan and McElroy, Bio/Technology 12, 883-888 (1994); Matzke et al., Mol. Gen. Genet. 244, 219-229 (1994); Park et al. The Plant Journal 9, 183-194 (1996)]. 이러한 문제는 상동성(homology-based) 유전간섭에 의해 일어나는 것으로 여겨지며 유전자 피라미드형을 위해서는 상이한 프로모터를 사용하여 극복할 수 있다.

본 발명은 유전자이식(transgenic) 식물이 그들을 보유함으로써 고 수준의 유전자 발현을 할 수 있도록 하는 식물 및 바이러스 프로모터에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 특정 조직에서 특정 시간에 특정 속도로 발현할 수 있도록 식물의 형질전환용 재조합 유전자를 작제하는데 사용하기 위한 상기 프로모터의 용도에 관한 것이다.

도1은 재배품종 마이소어(My), 카벤디쉬-형 윌리암스(Cv) 및 골드핑거(Go)로부터의 호주 바나나-감염 배드나바이러스 분리체로부터의 프로모터 영역을 레포터 유전자(GUS 또는 GFP)와 융합하여 포함하는 프로모터-레포터 유전자 작제물을 도시한 것이다.

도2 내지 도5는 도1의 프로모터-레포터 유전자 작제물을 이용하여 일시적(transient) 프로모터 활성 검정의 결과를 보여준다.

도6은 표준화된 일시 조건하에서의 상이한 프로모터의 활성을 비교한 것이다.

도7 내지 도13은 도1의 프로모터-레포터 유전자 작제물을 이용한 안정한 프로모터 활성 검정의 결과를 보여준다.

도14는 유전자이식 사탕수수 잎에서의 GFP 생성을 근거로 하여 준정량(semi-quantitative) 프로모터 활성을 비교한 것이다.

도15는 유전자이식 바나나 식물의 상이한 조직에서의 GUS 생성을 근거로 하여 정량 프로모터 활성을 비교한 것이다.

도16 내지 도18은 서열번호 1의 서열로부터 유도된 프로모터 pMy, 서열번호 2의 서열로부터 유도된 프로모터 pCv 및 서열번호 3의 서열로부터 유도된 프로모터 pGo에서의 추정 프로모터 요소를 도시한 것이다.

본 발명의 목적은 유전자 발현의 조절을 위한 유전공학에서 사용할 수 있고 식물세포에서 작동하는 프로모터를 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 RNA 및/또는 폴리펩티드 암호화 DNA에 작동적으로 연결된 프로모터를 하나 이상 함유하는 키메라 유전자의 적어도 일부를 제공하는데 있다.

본 발명은 첫 번째 양태로서 (1) 서열번호 1, 서열번호 2 또는 서열번호 3의 서열을 갖고 배드나바이러스로부터 분리된 DNA; (2) (1)의 DNA의 바이러스성 상동물(homologue) 또는 식물 게놈-유도된 변이체인 분리된 DNA; (3) (1) 또는 (2)의 분리된 DNA의 프로모터-활성 부분; (4) 엄격한 조건(stringent conditions)하에서 (1)의 DNA 또는 (2)의 DNA에 하이브리드화하는 분리된 DNA; 또는 (5) (4)의 DNA의 프로모터-활성 부분을 포함하고 식물세포에서 작동하는 프로모터를 제공한다.

본 발명은 두 번째 양태로서 첫 번째 양태의 프로모터 하나 이상이 암호서열에 작동적으로 연결된 하나 이상의 유전자를 포함한 DNA 작제물(construct)을 제공한다.

본 발명은 세 번째 양태로서 (1) 첫 번째 양태의 프로모터 하나 이상이 암호서열에 작동적으로 연결된 제1 유전자 및 (2) 프로모터가 암호서열에 작동적으로 연결된 제2 유전자를 포함하고, 제2 유전자 암호서열의 발현산물이 제1 유전자 암호서열의 발현산물의 활성을 조절하는 DNA 작제물을 제공한다.

본 발명은 네 번째 양태로서 산물을 암호화한 두 번째 양태의 DNA 작제물 또는 이의 RAN 전사물을 식물세포내로 도입함을 특징으로 하는 식물세포에서 산물을 발현시키는 방법을 제공한다.

본 발명은 다섯 번째 양태로서 게놈이 두 번째 양태 또는 세 번째 양태의 DNA 작제물을 포함하는 식물세포를 제공한다.

본 발명은 여섯 번째 양태로서 다섯 번째 양태의 세포를 포함하는 식물, 식물조직 또는 식물의 재생(reproductive)물질을 제공한다.

발명을 실시하기 위한 최적방식 및 기타 방식

본 명세서에 사용된 약어는 그 의미가 다음과 같다:

ER 소포체

GFP 해파리 아에쿠오레아 빅토리아의 녹색 형광 단백질

GUS 이. 콜라이의 β-글루쿠로니다제

MU 4-메틸움벨리페론

MUG 4-메틸움벨리페릴-β-D-글루쿠로니드

Nos 아그로박테리움 투메파시엔스의 노팔린 신타제(synthase) 터미네이터

p35S 꽃양배추 모자이크 바이러스 35S 프로모터

PCR 폴리머라제 연쇄 반응

pCv 서열번호 2의 서열에 따른 프로모터 영역

PEG 폴리에틸렌 글리콜

pGO 서열번호 3의 서열에 따른 프로모터 영역

pMy 서열번호 1의 서열에 따른 프로모터 영역

pUbi 옥수수 유비퀴틴 프로모터

ScBV 사탕수수 막대형 배드나바이러스

본 명세서에 사용된 하기의 용어는 그 의미가 명료하고 일관되게 나타날 수 있도록 다음과 같이 정의한다.

배드나바이러스: 막대형 DNA 바이러스.

암호서열: 폴리펩티드로 해독되거나 해독되지 않을 수 있는 기능성 RNA 전사물을 암호화한 핵산 서열.

구성성 프로모터: 유기체의 대부분 세포에서 활동하는 프로모터. 용어 준구성성 프로모터에서의 프로모터는 대부분의 경우에서 식물발생동안에 모든 유형의 세포에서 활동하나 식물발생의 다른 단계동안에 다른 유형의 세포에서 다른 속도로 활동할 수 있음으로 내포한다.

상동물: 서열번호 1의 서열중 염기 1538 내지 2105에서, 서열번호 2의 서열중 염기 850 내지 1322에서, 서열번호 3의 서열중 염기 859 내지 1297에서 또는 200 bp 이상으로 그들의 일부에서 60% 이상의 서열상동성을 가지고 서열번호 1, 서열번호 2 또는 서열번호 3에 상응하는 DNA 서열과 실질적으로 동일한 기능을 가지는 다른 유기체 또는 바이러스 분리체로부터의 핵산서열. 바람직한 동종체는 70% 이상, 더욱 바람직한 동종체는 75%의 서열상동성을 갖는다.

식물 게놈-유래된 변이체: 식물게놈에 존재하고 서열번호 1의 서열(염기 1538-2105), 서열번호 2의 서열(염기 850-1322) 또는 서열번호 3의 서열(염기 859-1297) 또는 200 bp 이상으로 그들의 일부와 60% 이상의 서열상동성을 갖는 DNA. 바람직한 식물게놈-유래된 변이체는 70% 이상, 더욱 바람직한 변이체는 75%의 서열상동성을 갖는다.

프로모터: 유전자의 암호서열의 전사개시와 연관된 요소를 포함하는 것으로 유전자의 암호서열 5' 말단에 위치한 DNA 서열.

DNA 염기의 일문자 코드는 문헌[Biochemical Journal 219:345-373 (1984)에 기술된 IUPAC-IUB 표준에 따른다. 실시예에서의 퍼센트는 달리 언급되지 않는 한 중량/용량(w/v)으로 나타낸 것이다.

본 발명자들은 재배품종 마이소어, 윌리암스 및 골드핑거로부터 채취된 호주 바나나-감염 배드나바이러스의 바이러스성 게놈의 PCR-증폭된 cDNA 서열에서 세 개의 프로모터 서열을 분리하였다.

이들 프로모터는 물론 바나나-감염 배드나바이러스로부터의 상동물 및 식물게놈-유도된 변이체는 개별적으로 또는 복합적으로 적당한 암호서열과 연결하여서 해당 유전자를 적합한 수준으로 발현할 수 있는 유전자이식 식물을 제조하는데 사용할 수 있다.

본 발명에 따른 세 개의 프로모터를 포함한 DNA는 재배품종 마이소어, 윌리암스 및 골드핑거로부터 채취한 배드나바이러스 게놈(예, 호주 바나나-감염 배드나바이러스 분리체)으로부터의 바이러스성 DNA를 클리닝하여 얻을 수 있다. 감염된 호주 바나나 식물(재배품종 마이소어, 윌리암스 및 골드핑거)로부터 분리된 배드나바이러스 DNA는 제한효소로 단편화할 수 있으며 단편들은 이. 콜라이와 같은 숙주 세포에서 복제할 수 있는 플라스미드내로 아클로닝시킬 수 있다. 다른 방도로서, 그들 프로모터 서열은 게놈 DNA를 직접 폴리머라제 연쇄반응으로 증폭시켜 생성할 수 있다. 필요한 프라이머는 서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 3의 서열데이터로부터 고안할 수 있다. 서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 3에 존재하는 것과 같은 서열을 갖는 프로모터를 제조하는 또 다른 방법은 DNA 합성에 의한 것이다. 이러한 합성은 10 내지 100개 염기의 올리고뉴클레오타이드가 쉽게 합성될 수 있어 좀더 큰 프로모터 서열의 프로모터-활성 부분이 필요한 경우에 적절하다. 또한, 상보 올리고뉴클레오타이드를 합성하여 원하는 염기서열의 이본쇄를 형성할 수 있다.

상기한 바와 같이, 본 발명은 서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 3의 서열을 갖는 프로모터 뿐만 아니라 서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 3의 서열의 바나나-감염 배드나바이러스로부터의 상동물 및 식물게놈-유도된 변이체(예, 식물게놈-통합된 배드나바이러스 또는 레트로트란스포손의 변이체)를 포함한다. 또한, 본 발명은 서열번호 1의 염기 1538-2105, 서열번호 2의 염기 850-1322 또는 서열번호 3의 염기 859-1297를 포함한 DNA와 긴축조건(stringent conditions)하에서 하이브리드화하는 DNA를 포함한다. 상동물 및 식물게놈-유도된 변이체는 서열번호 1의 DNA 서열(염기 1538-2105), 서열번호 2의 DNA 서열(염기 850-1322) 또는 서열번호 3의 DNA 서열(염기 859-1297)과 약 60% 정도만큼 낮은 상동성을 가질 수 있다. 본 발명의 프로모터가 서열번호 1의 DNA 서열(염기 1538-2105), 서열번호 2의 DNA 서열(염기 850-1322) 또는 서열번호 3의 DNA 서열(염기 859-1297)과 하이브리드화하는 긴축조건은 다음과 같이 정의될 수 있다:

세척액-0.1 x SSPE, 0.1% SDS

세척온도-65℃

세척횟수-2회

(1 x SSPE는 180 mM NaCl, 10 mM NaH₂PO₄, 1 mM EDTA (pH 7.4))

본 발명의 프로모터 서열의 바람직한 프로모터-활성 부분은 서열번호 1의 염기 1538-2105, 서열번호 2의 염기 850-1322 및 서열번호 3의 염기 859-1297이다. 보다 더 바람직한 부분은 서열번호 1의 염기 1806-2105, 서열번호 2의 염기 1023-1322 및 서열번호 3의 염기 998-1297이다.

두 번째 및 세 번째 양태의 DNA 작제물은 암호서열에 작동적으로 연결된 하나 이상의 프로모터를 포함할 수 있다. 이들 추가의 프로모터는 동일한 프로모터이거나 동일한 프로모터의 유도체이거나 이종 프로모터일 수 있다. 또한, 인핸서 또는 사일런서와 같이 작동적으로 연결된 조절요소가 DNA 작제물에 포함될 수 있다.

두 번째 및 세 번째 양태의 DNA 작제물에서 프로모터(들)이 작동적으로 연결된 암호서열은 안티센스 RNA, 리보자임 또는 구조성분으로서 작용하는 RNA를 암호화할 수 있거나 효소 또는 구조성분으로서 작용하거나 일부 다른 생리효과를 나타내는 폴리펩티드로 해독된다. 암호서열은 하나 이상의 RNA 또는 하나 이상의 폴리펩티드를 암호화할 수 있다. 또한, 암호영역은 하나 이상의 RNA와 하나 이상의 폴리펩티드의 조합을 암호화할 수 있다. 본 발명에 따른 프로모터를 사용한 유전자이식 식물에서 유용하게 발현될 수 있는 트란스유전자 산물의 예로는 (1) 식물-감염 바이러스, 세균, 진균 또는 선충류에 대한 질병 내성을 획득하거나, (2) 초식동물에 대한 내성을 획득하거나, (3) 제초제, 중금속 또는 선별성 마커 시약에 대한 내성을 획득하거나, (4) 비생물성 인자 (예, 가뭄, 염분, 추위 및 혐기상태)에 대한 내성을 획득하거나, (5) 연구용 유전자 및 유전자 산물의 기능 분석을 실시하거나, (6) 유전자 및 유전자 산물의 표현억제 또는 증폭을 부여하거나(유전자 발현의 조절), (7) 거대분자 및 이차 대사산물의 조성을 변형시키거나(예, 영양가를 높이거나 구조 성분을 변형시킨다), (8) 식물 발생을 변형시키거나, (9) 과실이나 곡물의 질 (예, 수확 후 저장수명 또는 질병에 대한 내성)을 개선하는데 도움을 주는 산물이다.

본 발명의 세 번째 양태와 관련하여서, DNA 작제물의 제1 유전자는 두 번째 양태의 DNA 작제물을 포함한 유전자의 모든 변이 및 옵션을 포함한다. DNA 작제물의 제2 유전자는 (1) 제1 유전자의 발현산물의 효과를 보충하거나 강화하는 발현산물, (2) 제1 유전자의 발현산물을 중화하는 발현산물 또는 (3) 제1 유전자 프로모터의 활성을 변형시키는 발현산물을 가질 수 있다.

이러한 옵션 덕분에 제1 유전자의 프로모터에 의해 중재된 강력한 발현과 제2 유전자의 결합에 의한 유전자 발현의 고도의 조절이 가능하다.

본 발명의 요약으로부터 주지되는 바와 같이 본 발명은 두 번째 및 세 번째 양태의 DNA 작제물을 포함하는 유전공학적으로 조작된 게놈을 갖는 유전자이식 식물 세포를 포함한다. 이들 DNA 작제물은 또한 식물세포에서 안정하게 또는 일시적으로 발현하는 하나 이상의 해당 암호서열을 갖는 재조합 바이러스성 서열을 포함할 수 있다. 다른 방도로서, RNA 전사물은 식물세포의 형질전환을 위해 사용할 수 있는 상기 작제물로부터 제조할 수 있다.

DNA를 식물의 게놈내로 도입하는 기술은 본 분야에 잘 알려져 있으며 예를 들면 문헌[Sagi et al., Bio/Technology 13, 481-485 (1995); May et al., Bio/Technology 13, 485-492 (1995); Zhong et al., Plant Physiol. 110, 1097-1107 (1996)]에 기술되어 있다.

본 발명의 DNA 작제물은 아그로박테리움-중재된 형질전환, DNA-피복된 텅스텐 또는 금 입자로의 바이오리스틱 충격, 원형질의 전기동공되거나 폴리에틸렌글리콜-중재된 DNA 형질전환, 진공여과 및 기타 기계적 DNA 전이기술을 포함한 방법을 사용하여 표적 식물세포의 게놈내로 도입하는 것이 유리하다. 본 발명의 DNA 작제물을 포함한 유전자이식 식물세포는 특정 식물에 적절한 조건을 사용하여 증식시킬 수 있다. 유사하게, 완전한 식물이나 그 식물의 증식 물질은 공지 방법 및 조건을 이용하여 초기 유전자이식 세포로부터 제조할 수 있다.

본 발명의 프로모터는 단자엽 및 쌍자엽 식물에서 뿐만 아니라 겉씨식물 및 양치류에도 사용할 수 있다. 예를 들면, 프로모터는 다음의 단자엽 종에서 활동한다: 사탕수수, 바나나, 옥수수, 기장. 본 발명의 프로모터가 활동하는 쌍자엽 종에는 담배, 캐놀라, 티푸 나무 및 니코티아나 벤타미아나가 포함된다. 본 발명의 프로모터가 활동하는 겉씨식물 및 양치류에는 라디아타 파인 및 피쉬본이 포함된다.

하기의 실시예로 본 발명을 예시한다. 그러나, 이들 실시예가 본 발명을 한정하는 것으로 이해하여서는 아니된다.

일반적인 방법

DNA의 조작은 문헌에 기술된 것과 같은 공지방법을 사용하여 실시하였다[Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour NY (1989)]. 상기 문헌의 내용은 본 명세서에 참조로 인용된다. 시약 및 기타 재료는 달리 언급되지 않는 한 구입한 것이다.

실시예 1

신규한 프로모터의 클로닝

호주 노쓰 퀸슬랜드 사우스 죤스톤소재의 웨트 트로픽스 아그리컬쳐 센터에서 입수한 바나나 재배품 마이소어(무사 그룹 AAB) 및 윌리암스(무사 그룹 AAA) 및 호주 노쓰 퀸슬랜드 디어알의 한 벌판에서 입수한 골드핑거(무사 그룹 AAAB)의 감염된 잎으로부터 배드나바이러스 분리체를 수득하였다.

코코아 팽윤 발아 배드나바이러스[Lot et al., J. Gen. Virol 72, 1735-1739 (1991)]의 정제를 위해 사용된 변형 프로토콜을 사용하여 재배품 마이소어로부터 배드나 비리온을 분리하였다. 5 mM 나트륨 디에틸디티오카르바메이트 (DIECA), 0.2% 티오글리세롤, 0.5% 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 6000 및 0.5% (v/v) 셀루클라스트(Novo Industries)가 함유된 추출 완충액(50 mM NaH₂PO₄/Na₂HPO₄완충액, pH 6.1) 6 용적에 라미나 조직을 혼입시켜 균질화하였다. 추가로 2 용적의 추출 완충액을 첨가하고 실온에서 100 rpm으로 진탕한 후 4℃에서 밤새 배양하였다. 네겹의 투박한 무명을 통해 균질물을 여과하고 여액을 SW HS4 회전자(rotor) (Sorvall)에서 10℃, 3,950 rpm (3,000 x g)으로 20분간 원심분리하였다. 상등물에 0.2 M NaCl과 9.5% PEG 6000을 첨가하고 15분간 교반한 후 실온에서 3시간 방치해 두었다. PEG 침전물을 SW HS4 회전자에서 10℃, 7,000 rpm(10,000 x g)으로 20분간 원심분리하여 펠렛을 얻었다. 펠렛을 최초 추출 용적의 1/30인 재현탁 완충액 (50 mM NaH₂PO₄/Na₂HPO₄, pH 6.8, 0.2 M NaCl, 0.1% Na₂SO₃및 5 mM EDTA 함유)에 재현탁시켰다. 현탁액을 SS34 회전자 (Sorvall)에서 8,180 rpm(8,000 x g)로 원심분리하여 등명하게 만든 후 상등물을 유지하고 펠렛을 다시 최초 추출 용적의 1/30인 재현탁 완충액중에 재현탁시켰다. 원심분리를 반복하고 상등물을 모은 다음 최종 펠렛을 버렸다. 상등물에 셀라이트(출발물질 30 g당 2 g)를 첨가하고 혼합한 다음 부크너 깔대기를 통해 경미한 흡인하에서 여과하였다. 여액에 0.2M NaCl과 7% PEG 6000을 첨가하고 혼합물을 4cm 셀라이트 컬럼으로 옮겼다. 컬럼을 직경 2cm의 30 ml 주사기에 준비하고 재현탁 완충액으로 평형시켰다. 5%, 3%, 1% 및 0% PEG 6000이 함유된 재현탁 완충액 25 ml 분액을 차례로 단계별로 첨가하면서 경미한 흡인하에서 바이러스를 용출하였다. 각 단계의 용출물을 SA 600 회전자 (Sorvall)에서 10℃, 6,950 rpm(7000 x g)으로 10분간 원심분리하고 상등물을 70Ti 회전자 (Beckman)에서 50,000 rpm(25,500 x g)로 50분간 원심분리하였다. 펠렛을 100 μl의 50 mM 삼나트륨 시트레이트 완충액, pH 7.0에 현탁시키고 분액을 동일 용적의 2% 포스포텅스텐산 칼륨 네가티브 염료로 염색한 후 바이러스의 존재에 대해 전자현미경으로 검사하였다.

바이러스-함유 분획을 모으고 시트레이트 완충액중의 10 내지 40% 수크로즈 밀도구배상에 분별한 다음 SW 41 회전자 (Beckman)에서 35,000 rpm (16,500 x g)로 원심분리하였다. 254 nm에서의 흡광도를 모니터링하는 ISCO 분획장치를 사용하여 구배를 분획하고 0.5 ml 분획을 취하였다. 최고 흡광도를 보이는 분획을 모으고 시트레이트 완충액에 희석한 다음 75Ti 회전자 (Beckman)에서 4℃, 53,000 rpm (29,000 x g)로 30분간 원심분리하여 펠렛을 수득하였다. 펠렛을 50 μl 시트레이트 완충액에 재현탁시키고 분액을 동일한 용적의 2% 포스포텅스텐산 칼륨 용액으로 염색한 후 바이러스 농도 및 순도에 대해 전자현미경으로 검사하였다.

총 핵산 추출방법[Lot et al., J. Gen Virol. 72, 1735-1739 (1991)]을 사용하여 바이러스 DNA를 준비하였다. 이의 일부를 XhoII로 분해하고 단편을 사전에 BamHI로 절단하고 탈인산화된 pBluescript II SK + (Stratagene)내로 아클로닝시켰다. 이들 클론으로부터 얻은 서열을 PCR 증폭을 위해 변성 배드나 T 프라미머(Lockhart and Olszewski in Breeding Bananas and Plantain for Resistance to Diseases and Pests, pp. 105-113. J. Ganry, ed., Montpellier, France, CIRAD/INIBAP, 1993)와 병합하여 사용된 프라이머 L2838-전위의 설계를 위한 토대로서 사용하였다. 프라이머의 서열은 다음과 같다.

L2838-상향 (서열 4)

5'-CCC AGG AAT AAA CAC GAT TAT CAG TC-3'

배드나T (서열 5)

5'-CAC CCC CGG G(A/C)(C/T) (A/C)(A/T)(A/C/G/T) GCT CTG ATA CCA-3'

PCR 혼합물(2.5 μl 10 x PCR 완충액 (Gibco BRL), 0.625 μl 50 mM MgCl₂용액, 1.125㎕ 20μM L2838-상향 프라이머, 2.5㎕ 4μM 배드나 T 프라이머, 0.5㎕ 10mM dNTP들, 0.2㎕ Taq DNA 폴리머라제(Gibco BRL), 16.55㎕ H₂O 및 1㎕의 1:200 희석되고 정제된 배드나바이러스 DNA)를 하이베이드 옴니진 써모사이클러 (Stratagene)에서 제조업자의 지시사항에 따라 프로그래밍 조건 (94℃ 2분; 94℃ 0.5분, 62℃ 0.5분, 72℃ 2분으로 35회)하에 배양하였다. 다른 PCR 산물로부터 전기영동 분리한 후 2 kb 산물을 제조업자의 지시사항에 따라 pCR-Script SK+(Stratagene)내로 아클로닝시켰다. 이 클론을 pCRBSV2로 명명하였다.

카벤디쉬형 재배품 윌리암스 및 골드핑거로부터의 배드나바이러스 입자를 문헌[Ahlawat et al., Plant Disease 80, 590-592 (1996)]의 변형된 소규모 바이러스 입자 농축 방법을 사용하여 준비하였다. 라미나 조직을 액체질소에서 약연과 막자를 사용하여 빻아서 분말로 만들었다. 2 용적의 미니프렙 추출 완충액(0.2 M KH₂PO₄/K₂HPO₄, pH 7.0, 15mM EDTA, 2% PVP, 2% PEG 6000 및 0.4% Na₂SO₃함유)을 첨가하였다. 추가로 마모한 후 추출물을 4겹의 무명을 통해 여과하였다. 그런 다음 여액을 SW HS4 회전자 (Sorvall)에서 4℃, 7,000 rpm (10,000 x g)로 15분간 원심분리하고 상등물을 수거하였다. 상등물에 1/15 용적의 33% (v/v) 트리톤 X-100을 첨가하고, 상등물을 간단하게 진탕시킨 다음 70Ti 회전자 (Beckman)에서 4℃, 45,000 rpm (24,000 x g)으로 45분간 0.2M KH₂PO₄/K₂HPO₄완충액(pH 7.0)중의 30% 수크로즈의 5 ml 패드를 통해 원심분리하였다. 펠렛을 증류수로 경미하게 세척하고 100μl의 0.1M KH₂PO₄/K₂HPO₄완충액(pH 7.0)중에 재현탁시켰다. 30 ml의 클로로포름을 재현탁액에 첨가하고 혼합하여 에멀젼화한 후 에멀젼을 벤취탑 마이크로퓨지에서 13,000 rpm으로 5분간 원심분리하였다. 상등물을 제거하고 분액을 동일한 용적의 2% 포스포텅스텐산 칼륨 용액으로 염색한 다음 전자현미경으로 검사하였다.

면역포착-PCR을 1μg/ml의 농도로 50 mM 탄산나트륨 완충액(pH 9.6)중에서 25 μl의 사탕수수 막대형 바이러스 (ScBV) 항체 (Agdia)로 피복된 박층벽 0.6 ml PCR 튜브 (Quantum)에서 실시하였다. 실온에서 3시간(골드핑거 분리체의 경우 4시간) 배양한 후 튜브를 PBST(137 mM NaCl, 6.4 mM Na₂HPO₄x 2H₂O, 1.4 mM KH₂PO₄, pH 7.4; 0.1% 트윈 20(Sigma) 함유)와 함께 3회 와동 (골드핑거 분리체의 경우 2회 와동)시켜 세척하였다. 25 μl의 농축 바이러스 추출물을 첨가한 후 튜브를 실온에서 3시간 (골드핑거 분리체의 경우 4℃에서 밤새) 배양한 다음 PBST로 3회 물로 1회 세척하였다. 물은 PCR전에 제거하였다. 변성 프라이머 배드나T 및 배드나3(Lockhart 및 Olszewski, 상기 문헌)을 PCR 증폭을 위해 사용하였다. 배드나3의 서열은 다음과 같다.

배드나3 (서열 6)

5'-AAT AGC GGC CGC AT(A/C/T) AT(A/C/T) AT(A/C/T) GA(A/G) AC(A/C/G/T) GA-3'

PCR 혼합물 (윌리암스 분리체의 경우 5 μl 완충액 A (Gibco BRL), 5 μl 완충액 B (Gibco BRL), 5 μl 4μM 배드나3 프라이머, 5 μl 4μM 배드나T 프라이머, 2.5 μl 1mM dNTPs, 2μl 이롱가제 (Gibco BRL) 및 25.5 μl 물, 골드핑거 분리체의 경우 2.5 μl 10 x PCR 완충액 (Gibco BRL), 0.75 μl 50 mM MgCl₂, 2.5 μl 4 μM 배드나3 프라이머, 2.5 μl 4 μM 배드나T 프라이머, 1.25 μl 1 mM dNTPs, 0.4 μl Taq 폴리머라제 (Gibco BRL, 5 유니트/μl) 및 15.1 μl 물)을 면역-포착된 바이러스 입자가 함유된 튜브에 첨가하고 여기에 20 μl 광유를 바르고 제조업자의 지시사항에 따른 프로그래밍 조건 (94℃ 0.5분, 37℃ 0.5분, 72℃ 2분으로 4주기 및 94℃ 0.5분, 55℃ 0.5분 및 72℃ 2분으로 30주기)에 맞춰 하이베이드 옴니진 써모사이클러 (Stratagene)에서 배양하였다. 전기영동하여 다른 PCR 산물로부터 분리한 후 1.3kb 산물을 제조업자의 지시사항에 따라 pCR2.1 (Invitrogen) 내로 아클로닝시켰다. 이들 클론을 pCRSVCv (윌리암스 분리체) 및 pCRGF2 (골드핑거 분리체)라 명명하였다.

일차로 벡터에 존재하는 프라이머를 사용하여 서열분석을 실시하고 후에 FS 터미네이터 프리믹스 (RPISM Ready Raction DyeDeoxy Terminator Cycle Sequencing Kit, Applied Biosystems) 및 자동 DNA 서열분석기 (Applied Biosystems)를 이용하여 수득된 서열에 존재하는 프라이머를 이용하여 서열분석을 실시하였다. 세 개의 모든 PCR 산물의 전체 서열을 얻고 호주 국립 게놈 정보 서비스(ANGIS) 프로그램 패키지를 이용하였을 때 이들은 배드나바이러스 서열로서 동정되었다. PCR 산물의 완전한 서열은 서열 1, 서열 2 및 서열 3으로 도시되어 있다. 세 개의 모든 서열은 3' 말단에 배드나바이러스 ORF 3의 일부에 대한 암호영역 (각각, 뉴클레오타이드 1-1537, 1-849 및 1-858)을 포함하고 5' 말단에 비암호영역 (각각, 뉴클레오타이드 1538-2105, 850-1322 및 859-1297)을 포함한다. 비암호영역의 3' 말단을 실시예 5에서 상세히 예시한 바와 같이 프로모터 서열 요소에 대해 추가로 분석하였다.

실시예 2

키메라 유전자의 작제

상기에서 서술된 PCR 산물을 사용하여 도1에 도시된 바와 같이 GUS 또는 GFP 암호화 레포터 유전자와 융합한 프로모터로서 수개의 작제물을 제조하였다.

바이오리스틱 또는 PEG-중재된 형질전환 기술을 사용한 식물 세포 형질전환에서 프로모터-레포터 카세트의 토대로서 pUbiGUS를 사용하였다(도1A). pUbiGUS는 pUC118에 옥수수 유비퀴틴 프로모터[Christensen et al., Plant Mol. Biol. 18, 675-689 (1992); Christensen and Quail, Transgen. Res. 5, 213-218 (1996)], GUS 레포터 유전자[Jefferson et al., EMBO J. 6, 3901-3907 (1987)] 및 아그로박테리움 투메파시엔스로부터의 노팔린 신타제 (nos) 터미네이터 서열을 함유한다.

pMyGUS는 옥수수 유비퀴틴 프로모터 대신에 마이소어로부터의 배드나바이러스 PCR 단편(3' 말단에 배드나 T 프라이머)을 함유한다(도1B). 이것은 pCRBSV2로부터의 평활말단 BamHI/NotI-절단 2kb 단편을 pUbiGUS의 평활말단 탈인산화 BamHI/HindIII-절단 4.8kb 단편에 연결시켜 작제하였다.

pCvGUS는 옥수수 유비퀴틴 프로모터 대신에 윌리암스로부터의 배드나바이러스 PCR 산물(3' 말단에 배드나 T 프라이머)를 함유한다(도1C). 이것은 pCRBSVCv로부터의 평활말단 BamHI/NotI-절단 1.3kb 단편을 pUbiGUS의 평활말단 탈인산화 BamHI/HindIII-절단 4.8kb 단편에 연결시켜 작제하였다.

또한, pUbiGFP를 바이오리스틱 또는 PEG-중재된 형질전환 기술을 사용한 식물 세포 형질전환에서 프로모터-레포터 카세트의 토대로서 사용하였다(도1D). pUbiGFP는 옥수수 유비퀴틴 프로모터, 변형된 GFP 레포터 유전자(sGFP(S65T); Chiu et al., Current Biol. 6, 325-30 [1996]) 및 노팔린 신타제 (nos) 터미네이터 서열을 함유한다.

pMyGFP는 옥수수 유비퀴틴 프로모터 대신에 마이소어로부터의 배드나바이러스 PCR 단편 (3' 말단에 배드나T 프라이머)을 함유한다(도1E). 이것은 pCRBSV2로부터의 평활말단 BamHI-절단 2kb 단편을 pUbiGFP의 평활말단 탈인산화 XbI-절단 4.2kb 단편에 연결시켜 작제하였다.

pCvGFP는 옥수수 유비퀴틴 프로모터 대신에 윌리암스로부터의 배드나바이러스 PCR 산물 (3' 말단에 배드나T 프라이머)을 함유한다(도1F). 이것은 pCRBSVCv로부터의 XbaI/BamHI-절단 1.3kb 단편을 pUbiGFP의 탈인산화 XbaI/BamHI-절단 4.8kb 단편에 연결하여 작제하였다.

pGOGFP는 옥수수 유비퀴틴 프로모터 대신에 골드핑거로부터의 배드나바이러스 PCR 산물 (3' 말단에 배드나T 프라이머)을 함유한다(도1G). 이것은 pCRGF2로부터의 EcoRV/BamHI-절단 1.3kb 단편을 pCvGFP의 EcoRV/BamHI-절단 4.8kb 단편에 연결하여 작제하였다.

또한, pBIN-mGFP5-ER 및 pArt27/35SGUS를 아그로박테리움-매개된 식물 형질전환에서 프로모터-레포터 카세트의 작제를 위한 토대로서 사용하였다(각각, 도1H 및 도1I). pBIN-mGFP5-ER (Dr. J. Haseloff, MRC Laboratory of Molecular Biology, Addenbrookes Hospital, Cambridge, UK)는 꽃양배추 모자이크 바이러스 35S 프로모터, GFP 레포터 유전자 mgfp5-ER의 ER-표적 돌연변이 버전 및 nos 터미네이터를 함유한다. pArt27/35SGUS는 pArt27(Gleave, Plant Mol. Biol. 20. 1203-1207[1992])에 꽃양배추 모자이크 35S 프로모터 (Odell et al., Nature 313, 810-812 [1985]), GUS 레포터 유전자 및 nos 터미네이터를 함유한다. pArtUbiGUS는 pArt27/35SGUS의 35S 프로모터 대신에 옥수수 유비퀴틴 프로모터를 함유한다(도1J).

pArtMyGUS는 옥수수 유비퀴틴 프로모터 대신에 마이소어로부터의 배드나바이러스 PCR 단편 (3' 말단에 배드나T 프라이머)을 함유한다(도1K). 이것은 pMyGFP로부터의 HindIII/BamHI-절단 1.6kb 단편을 pArtUbiGUS HindIII- 및 부분적인 BamHi-절단 13kb 단편에 연결하여 작제하였다.

pCvmGFP5-ER은 35S 프로모터 대신에 윌리암스로부터의 배드나바이러스 PCR 다편 (3' 말단에 배드나T 프라이머)을 함유한다(도 1L). 이것은 pCvGFP로부터의 EcoRV/BamHI-절단 1,3kb 단편을 pBIN-mgfp5-ER의 HindIII(평활말단)/BamHI-절단 13kb 단편에 연결하여 작제하였다.

모든 플라스미드 DNA는 Qiaprep Spin Miniprep 키트 (Qiagen)를 사용하여 이. 콜라이 DH5a로부터 제조하였다.

키메라 유전자 작제물은 본 발명의 목적을 위해 최적으로 개발된 생체내 일시적이고 안정한 발현 시스템을 사용하여 프로모터 활성을 평가하는데 유용한 것으로 밝혀졌다.

실시예 3

일시적 조건하에서 식물세포에서의 프로모터 활성의 검정

일시적 조건하에 실시예 2의 프로모터-레포터 유전자 작제물을 검정하는데 수개의 생체내 시험 시스템이 이용되었다. 이들 시스템은 GUS 검정을 사용하여 1) 단자엽 종(바나나, 옥수수, 수수, 사탕수수), 쌍자엽 종(담배, 캐놀라, 니코티나 벤타미아나, 티푸아나 티푸), 겉씨식물 종(피누스 라디아타) 및 양치류 (네프롤레피스 코르디폴리아)의 잎 및 기타 식물 기관에 바이오리스틱 유전자 전달; 2) GFP 검정을 사용하여 옥수수 잎 및 사탕수수 캘리에 바이오리스틱 유전자 전달; 및 3) 내부 표준과의 대조 GUS 검정을 사용한 옥수수 잎에 바이오리스틱 유전자 전달이 포함된다.

상기된 첫 번째 시험 시스템의 경우 다음의 방법이 사용되었다.

옥수수(사탕옥수수, 이오치프 임프루브드), 바나나(윌리암스), 수수, 사탕수수 및 엔. 벤타미아나 잎을 온실에서 자란 식물에서 자르고 3 내지 4cm 길이로 조각내었다. 이들을 염소 용액 (0.1% NaOCl, 0.1% 트윈 20)에서 30분간 경미하게 진탕시켜 표면-멸균시켰다. 계속해서, 이들을 멸균 탈이온수로 세정하고 멸균 "고염 MS" (0.2M 만니톨과 0.2M 솔비톨을 함유한 Murashige 및 Skoog, Physiologia Plantarum 15, 473-497 [1962]에 따른 MS-배지)가 함유된 페트리 디쉬에 배축 측면위로 놓아 세포 팽창을 감소시켰다.

입자 충격을 위해 잎 조각을 만니톨과 솔비톨이 없이 상기된 바와 같이 MS-배지에 배축 측면위로 옮겼다. DNA의 담체로서 직경 1.6 μm의 금 입자를 사용하였다. 이들을 70% 에탄올에 세척하고 3분간 와동한 후 15분간 배양하고 30초간 원심분리하여 액체를 제거하였다. 다음의 단계를 3회 반복하였다. 입자를 멸균 탈이온수에 재현탁시키고 1분간 와동시킨 다음 1분간 배양하고 마이크로퓨지에서 30초간 원심분리하여 펠렛화하였다. 계속해서 금 입자를 60 mg/ml 농도의 멸균 50% (v/v) 글리세롤에 재현탁시키고 5분간 와동시킨 후 사용하였다.

사용된 각각의 플라스미드 작제물(pMyGUS, pCvGUS 및 pUbiGUS; 실시예 2)를 위해, 4개 한 세트의 DNA 전달체를 제조하였다: 50 μ의 금 입자 현탁액을 1.5 ml 원심분리 관에 옮기고 추가 2.5분간 철저히 와동시켰다. 관을 계속해서 와동시키면서 10μl DNA (0.5 μg/μl), 50μl 멸균 2.5 M CaCl₂용액 및 20 μl 0.1 M 스퍼미딘 용액 (사용하기 전에 -70℃에서 멸균 및 20 μl 분획으로 저장)을 차례로 첨가하였다. 혼합물을 2분간 와동하고 1분간 배양한 다음 10초간 원심분리하여 펠렛화하였다. 펠렛을 휘젖지 않고 140 μl 70% 에탄올 및 140 μl 100% 에탄올에서 세척하고 50 μl 100% 에탄올에 경미하게 재현탁한 후 멸균 마크로캐리어 플라스틱 디스크에 10 μl 씩 똑같이 분할한 다음 이들을 건조기에서 말렸다. 마크로캐리어를 파열 디스크로부터 4cm 거리에 놓고 준비된 잎을 PDS-1000/He Biolistic Particle Delivery System (BioRad)에서 마크로캐리어로부터 8cm 거리에 두었다. 이 시스템은 문헌[Sand et al., Meth. Enzymol. 217: 483-509 (1993) 및 Heiser, BioRad US/EG Bulletin 1688 (1993)]에 기술된 절차에 따라 900 psi 내지 1550 psi의 압력으로 DNA를 전달하는데 사용되었다.

호주 루시아주 퀸스랜드 대학의 온실, 성장 캐비넷 및 정원에서 자란 식물로부터 담배(산티), 캐놀라, 티푸 트렉(티푸아나 티푸), 솔 나무(파이누스 라디아타) 및 피쉬본 양치류(네프롤레피스 코르디폴리아)의 잎과 기타 식물 기관을 잘랐다. 모든 식물 재료를 미리 적셔 둔 둥근 필터지가 함유된 페트리 디쉬에 배축 측면위로 놓았다.

맞춤 헬륨 압력-가동 입자 유입 총을 사용하여 문헌[Finer et al., Plant Cell Rep. 11:323-328 (1992)]의 변형된 방법에 따라 금 입자를 제조하고, DNA를 금 입자에 피복하며 입자충격을 실시하였다: 60 mg의 금 입자를 1 mL 70% 에탄올에 2분간 재현탁시키고 이어서 마이크로퓨지에서 10초간 회전시키고 탈이온수에 재현탁시켜 세척하였다. 10초간 원심분리하고 금 입자를 500 μl 50% (v/v) 글리세롤 용액에 재현탁시켜 원액(실온에서 6 내지 8주간 저장됨)을 제조하였다. 입자충격에 사용될 각 작제물을 위해, 금 입자를 격렬하게 재현탁시키고 50 μl를 새로운 관으로 제거한 다음 1분간 와동하였다. 와동동안에 새로이 제조된 플라스미드 DNA(Qiaprep Mini Spin 키트)를 5 μl (0.25 μg/μl) GUS-작제물, 50 μl 2.5 M CaCl₂용액 및 20 μl 0.1 M 스퍼미딘 용액을 함유한 혼합물로서 첨가하였다. 1분간 와동한 후 입자를 5 내지 10분간 정치하고 5초간 원심분리하였다. 과량의 상등물을 제거하고 입자를 20 μl의 상등물중에 재현탁시켰다. 와동한 후 3 μl를 각 충격을 위해 제거하고 3 mm 스위니 플라스틱 시린지 필터 홀더(Gelman Sciences)의 중앙에 넣었다. 방에서 7 바아(100 psi)와 -0.85 바아(-85 kPa)의 헬륨-구동 압력을 사용하여 18cm의 거리에서 식물재료에 충격을 가했다.

충격 후 모든 식물 재료를 성장 캐비넷 (25℃, 16시간 조명)에 48시간 보존한 후 X-글루-용액(50 ml/l DMSO 중에 용해된 1.25 g/l 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-β-D 글루쿠론산, 5 mM 시안화제일철, 5 mM 시안화제이철, 0.3%(v/v) 트리톤 X-100, 10%(v/v) 메탄올, 10 mM EDTA (pH 8.0), 0.1 M 인산나트륨 완충액 pH 7.0)에 옮겨 37℃에서 12시간 배양하였다.

청색반점의 수와 크기로 측정한 GUS 활성을 프로모터 활성의 지시제로 사용하였다. 청색 GUS 반점은 도면의 사진 복사본에서 검정 반점으로 나타나 있다. 프로모터-레포터 작제물 pMyGUS와 pCvGUS를 사용하여 수 차례의 실험을 실시하였다. 비교를 위해 pUbiGUS는 단자엽 종을 위해 포함시켰고 pBI221 (CaMV 35S 프로모터, GUS 레포터 유전자 및 nos 프로모터를 함유한 흔히 사용되는 식물 형질전환 벡터, Stratagene)은 쌍자엽 종, 겉씨식물 및 양치류 식물 재료를 위해 포함시켰다.

단자엽 일시 형질전환 실험 및 GUS 검정을 위해 사용된 세 개의 모든 프로모터(pMy, pCv 및 pUbi)는 옥수수, 바나나, 수수 및 사탕수수의 잎에서 뚜렷한 프로모터 활성을 보인 반면에 프로모터-없는 GUS 작제물을 사용하거나 DNA를 전혀 사용하지 않은 대조 실험은 아무런 활성도 보이지 않았다. 예로서, 도2는 1550 psi의 압력으로 pMyGUS (도2A), pCvGUS (도2B) 및 pUbiGUS (도2C)로 충격받은 옥수수 잎에 대한 전형적인 결과를 보여준다. 유사하게, 쌍자엽, 겉씨식물 및 양치류 종의 일시 형질전환 실험에서 사용된 세 개의 모든 프로모터 (pMy, pCv 및 p35S)은 시험된 식물 기관에 대해 뚜렷한 프로모터 활성을 보였다. 이들은 담배, 엔. 벤타미아나, 티푸 나무 및 피쉬본 양치류의 잎, 캐놀라의 잎과 줄기 및 파이누스 라디아타의 웅성 화판 및 줄기였다. 예로서, 도3은 pMyGUS (각각, 도3A, 도3D 및 도3G), pCvGUS (각각, 도3B, 도3E 및 도3H) 및 pBI221 (각각, 도3C, 도3F 및 도3I)로 충격받은 캐놀라, 담배 및 티푸 나무의 쌍자엽 잎에 대해 전형적인 결과를 보여준다. 도4는 pMyGUS (각각, 도4A, 및 도4D), pCvGUS (각각, 도4B, 및 도4E) 및 pBI221 (각각, 도4C, 및 도4F)로 충격받은 파이누스 라디아타의 웅성 화판 및 피쉬본 양치류의 잎에 대해 전형적인 결과를 보여준다. 작제물 pMyGUS 및 pCvGUS로의 형질전환에 의해 발생된 청색 반점의 수 및 농도는 서열 1과 서열 2가 시험된 모든 종에서 뚜렷한 프로모터 활성을 나타냄을 증명하였다.

상기된 두 번째 시험 시스템의 경우 다음의 방법을 사용하였다.

상기된 바와 같은 입자 유입 총을 사용한 pGoGFP로의 입자 충격을 위해 옥수수 잎을 사용하였다. 충격 후 24시간이 경과하여 GFP 발현을 GFP 플러스 필터 세트를 갖춘 형광 모듈이 있는 Leica MZ6 입체현미경 (Leica Microscopy and Scientific Instruments, Switzerland)을 사용하여 관찰하였다. 녹색 형광 세포의 검출을 프로모터 활성의 지시제로서 사용하였다. 녹색 형광 세포는 흑백사진복사본에서 백색으로 보인다. 도2D에 도시된 결과는 서열 2가 옥수수 잎에서 일시적 조건하에 프로모터 활성을 나타냄을 증명한다.

배발생 사탕수수 유합조직은 최정상 분열조직 바로위 10cm 영역내로부터 나온 어린 잎 조직에서 출발하였다(Taylor et al., Plant Cell Tissue Organ Cult. 28, 69-78[1992]). 유합조직 유도 배지(MSC3)은 MS 염 및 비타민 (Sigma), 0.5 g/l 카세인 가수분해물 (Gibco Peptone 140), 20 g/l 자당, 10% v/v 코코넛 물, 3 mg/l 2,4-D, pH 6.0 으로 구성되며 0.8% 한천 (Grade J, Davis)으로 고형화하였다. 계속된 암흑하에 30℃에서 유합조직이 유도되었다. 이때 14일 마다 규칙적으로 아배양하였고 6주간의 선택적인 아배양이 필요하였다.

입자 유지 총을 사용하여 미세주사 충격을 실시하였다[Finer et al., Plant Cell Rep. 11, 323-328 (1992)]. 이때 2,100 kPa 가스 전달 압력, 28 mmHg 진공과 0.5 msec 가스 전달 간격이 사용되었다. 플라스미드 DNA가 텅스텐 입자 (M10, Sylvania Chemicals)상에 침강하였다. 7㎠의 중심부에서 5 내지 10 mm 직경의 유합조직에 대해 전술한 바와 같이 오스모티쿰 배지상에서 충격을 실시하였다[Bower et al., Mol. Breeding 2, 239-249 (1996)].

각 5 μg의 pMyGFP, pCvGFP 또는 pUbiGFP (실시예 2)를 5 μg의 pEmuKN [Chamberlain et al., Aust. J. Plant Physiol. 21, 95-112 (1994)]과 혼합하여 미세주사 충격에 사용하여 사탕수수 유합조직에서의 프로모터 활성을 평가하고 카나마이신 선별하에 유전자이식 유합조직을 재생시켰다(실시예 4 참조). 사탕수수 조직에서의 GFP 발현은 상기된 바와 같이 형광 현미경으로 충격 후 2 및 7일째 및 2 및 12개월째 (실시예 4에서 안정한 발현의 결과)에 관찰되었다.

도5는 pMyGFP(도5A), pCvGFP(도5B) 및 pUbiGFP(도5C)로 충격받은 사탕수수 유합조직을 형광 현미경하에 충격 후 2일째에 찍은 사진이다. 세 개 모든 작제물 pMyGFP, pCvGFP 및 pUbiGFP의 형광반점 수 및 농도는 신규한 프로모터 둘다(pMy 및 pCv) 사탕수수 유합조직에서 일시적 프로모터 활성을 나타냄을 입증한다.

상기 세 번째 시험 시스템에 다음의 방법을 사용하였다.

입자충격동안에 내부 표준으로서 작제물 pUbiGFP를 사용하여 옥수수 잎에서 일시적 형질전환 조건하에 pMy 및 pCv를 4개의 다른 공지된 프로모터와 비교하였다. 내부 표준의 사용은 각 충격의 효능을 모니터하기 위함이며 흔히 일시적 유전자 발현 검정에서 관찰되는 고 변이성을 보상하기 위함이다.

옥수수 잎 (사탕옥수수, 이오치프 임프루브드)을 상기한 바와 같이 준비하고 입자 충격에 사용하였다. 비교를 위해 사용된 네 개의 프로모터-GUS 작제물은 pBI221, pMG221, pUbiGUS 및 pACT1-D이고 이들에는 각각 꽃양배추 담배 바이러스 [Mitsuhara et al., Plant Cell Physiol. 37:49-59 (1996)], 옥수수 쉬런큰-1 유전자로부터 3' 엑손/인트론 삽입되어 강화된 35S 프로모터 [Maas et al., Plant Mol. Biol. 16:199-207 (1991)], 옥수수 폴리유비퀴틴 프로모터 (상기 Christensen and Quail, 1996) 및 쌀 액틴1 유전자 프로모터 [McElroy et al., Plant Cell 2:163-171(1990)]가 uidA 유전자 및 nos 터미네이터에 융합되어 있다. 각 실험에서 네 개 한 세트의 DNA 전달체를 내부 표준으로서 0.5 μl(0.25 μg/μl) pUbiGFP를 포함시켜 변형하고 상기한 바와 같이 작제물 pBI221, pMG221, pUbiGUS, pACT1-D, pMyGUS 및 pCvGUS 각각에 대해 준비하였다. 48시간 후 GFP를 생성하는 많은 세포를 형광 입체현미경하에 각 구조물의 모든 잎에 대해 측정하였다. 이어서, 모든 잎을 상기한 바와 같이 X-gluc 염색 용액에서 배양하고 각 작제물에 대해 GUS 생성 반점의 수를 측정하였다. GUS-생성 반점 수를 GFP-생성 세포 수로 나누어 표준 활성 값을 얻었다. 모든 값을 pBI221로 얻은 값으로 표준화하였다. 이의 결과는 도6에 나타나 있으며 옥수수 잎에서 일시적 조건하에 pMy 및 pCv에 대해 얻은 활성이 전에 단자엽 식물에서 고수준의 유전자 발현을 위해 사용해 온 프로모터의 범위에 있음을 보여준다: pMy는 p35S에 비해 1.5배 높은 일시적 활성을 유도하고 pUbi에 비해서는 거의 반 정도의 활성을 유도하는 반면 pCv는 p35S보다 3배 높은 활성을 유도하고 pUbi와는 거의 대등한 활성을 유도한다.

실시예 3의 결과는 서열 1, 서열 2 및 서열 3에 제시된 서열 각각이 생체내에서 활발한 프로모터로서 작용함을 보여준다. 또한 이 결과는 서열 1 및 서열 2의 프로모터가 일시적 조건하에서 강력하게 발현하고 식물에서의 유전자 발현과 유전공학에서 귀중한 도구로 사용될 수 있음을 입증한다.

실시예 4

안정한 조건하에 식물세포에서의 프로모터 활성 검정

식물세포에서 안정한 발현 조건하에 실시예 2의 프로모터-레포터 유전자 작제물을 검정하는데 수개의 생체내 시험 시스템이 이용되었다. 이들 시스템은 1) 30 일이상 경과 후 GFP 검정을 사용한 사탕수수 및 담배에 바이오리스틱 유전자 전달, 2) 형질전환되고 재생된 식물(바나나, 사탕수수)의 GUS 및 GFP 검정, 3) 유전자이식 사탕수수에서 GFP 생성의 반정량 비교 웨스턴 블롯 검정 및 4) 유전자이식 바나나 식물의 상이한 기관의 정량 비교 GUS 활성 검정이다.

상기 시험 시스템(1)에 있어서 실시예 3에 기술된 사탕수수 형질전환 방법이 사용되었고 이는 다음과 같다.

충격 후 사탕수수 유합조직을 40 μg/l 제네티신 (Sigma)가 함유된 선별적인 유합조직-유도 배지 (MSC3)에 올려놓았다. 충격 후 2개이 되어 실시예 3에 기술된 방법을 사용하여 GFP 활성을 모니터 하였다. 녹색 형광은 흑백사진복사본에서 회색 또는 흰색으로 보인다.

도7은 pMyGFP(도7A), pCvGFP(도7B) 및 pUbiGFP(도7C)로 충격받은 사탕수수 유합조직을 형광현미경하에 충격 후 2개월되어 찍은 사진이다. 작제물 pMyGFP 및 pCvGFP의 형광 유합조직의 농도는 pUbiGFP에 의해 발생된 것과 대등하였다. 이는 두 신규한 프로모터가 옥수수 유비퀴틴 프로모터보다 사탕수수 유합조직에서 비슷한 안정활성을 보여줌을 시사한다.

상기 시험 시스템(1)에서, 이진 벡터 pBIN-mgfp5-ER, pArtMyGUS 또는 pCvmGFP5-ER을 함유한 아그로박테리움 투메파시엔스 균주 LBA4404를 사용하여 문헌[Ellis et al. (EMBO J. 6: 11-16 (1987)]에 기술된 방법에 따라 유전자이식 담배 유합조직 및 묘목을 생산하였다. 형광현미경을 사용하여 pBIN-mgfp5-ER 및 pCvmGFP5-ER로 형질전환된 유합조직 및 뿌리를 형성하는 유전자이식 싹을 분석하였다. 도8은 pCvmGFP-ER로 형질전환된 담배 유합조직 및 뿌리(각각 도8A 및 도8C) 및 pBIN-mgfp5-Er로 형질전환된 담배 유합조직 및 뿌리(각각 도8B 및 도8D) 및 형질전환되지 않은 유합조직의 결과를 보여준다. 담배 식물에서 프로모터의 활성이 전혀 정량되지 않은 한편 이의 결과는 pCv가 쌍자엽 식물의 형질전화에 유용하다는 것을 시사한다.

상기 시험 시스템 (2)를 사용하여, 레포터 유전자와 융합한 프로모터 pMy, pCv 및 pUbi를 함유한 유전자이식 사탕수수 및 바나나 식물을 제조하였다.

상기된 바와 같이 6회 충격으로부터 pMyGFP로 형질전환된 40개의 독립된 사탕수수 유합조직을 125개 사탕수수 식물을 재생하기 위해 사용하였다. 이들 식물은 21개 독립된 라인으로 분류되었다. 5회 충격으로부터 pCvGFP로 형질전환된 72개 독립된 사탕수수 유합조직을 109개 사탕수수 식물을 재생하는데 사용하였다. 이들 식물은 18개 독립된 라인으로 분류되었다. 대조군으로서, 12회 충격으로부터 pUbiGFP로 형질전환된 40개 독립된 사탕수수 유합조직을 37개 사탕수수 식물의 재생을 위해 사용하였다. 이들 식물은 16개 독립된 라인으로부터 기원하였다. GFP 형광을 사용하여 유전자이식 세포를 동정하고 그들의 독립된 상태를 설정하였다. 식물을 온실내 화분으로 옮기고 식물의 높이가 70 내지 120cm(형질전환 후 12개월 경과)이 이를 때까지 성장하도록 두었다. GFP 레포터 유전자에 융합된 pMy 및 pCv의 존재를 확인하기 위하여 pMyGFP 및 pCvGFP로 형질전환된 수개의 식물을 선택하여 둘다, 프로모터 영역의 일부 및 GFP 수용체 유전자의 일부를 커버하는 프라이머를 사용하여 DNA를 추출하고 PCR 분석하였다. 전체 식물 DNA를 문헌[Chang et al., Plant Mol. Biol. Rep. 9: 389-410 (1993)]의 방법에 따라 사탕수수 잎(각 200 mg)에서 분리하였다. GFP 레포터 유전자에 융합된 pMy 프로모터의 존재를 약 650 bp의 단편을 증폭하는데 사용한 프라이머 MyA(서열 7: 5'-AGAGGCGCCCCTGGTATTGG-3') 및 GFP-B(서열 8: 5'-AGATGGTGCGCTCCTGGACG-3')를 사용하여 pMyGFP로 형질전환된 식물로부터의 잎 추출물에 대해 PCR로 확인하였다. GFP 레포터 유전자에 융합된 pCv 프로모터의 존재는 약 550 bp의 단편을 증폭하는데 사용한 프라이머 CvA(서열 9: 5'-CCT AAC GAT GCG GGA AGC CG-3') 및 GFP-B를 사용하여 pCvGFP로 형질전환된 식물로부터의 잎 추출물에 대해 PCR로 확인하였다. 형질전환되지 않은 식물로부터의 추출물은 음성 대조군으로 역할을 하였다. 모든 프라이머는 호주 리스모어 소재 Pacific Oligos에 의해 합성되었다. 분석된 모든 식물의 PCR 산물은 DNA 겔 전기영동에서 예상된 밴드 크기를 보여준 반면 음성 대조군은 아무런 밴드도 보여주지 않았다(이 데이터는 제시되지 않았음).

GFP 생성을 평가하기 위하여 각 유전자이식의 수개 사탕수수 식물로부터의 가장 어린 잎을 상기한 바와 같이 입체형광현미경으로 분석하였다. 잎에서의 GFP 양은 0 내지 5의 상대 수치를 적용함으로써 평가하였다(0은 GFP 검출없음; 5는 최고의 GFP 생성). 또한, 선택된 식물로부터 뿌리 재료를 분석하였다(이 데이터 제시되지 않았음). pMyGFP로 형질전환된 식물에 대한 상대 수치는 0 내지 2인 한편, pCvGFP 또는 pUbiGFP로 형질전환된 식물은 잎에서 훨씬 강한 GFP 존재를 나타내는데 0 내지 5의 범위였다. 도9는 pMyGFP로 형질전환된 사탕수수 식물의 잎 및 뿌리(각각, 도9A 및 도9D), pCvGFP로 형질전환된 사탕수수 식물의 잎 및 뿌리(각각, 도9B 및 도9E), pUbiGFP로 형질전환된 사탕수수 식물의 잎(도9C) 및 형질전환되지 않은 대조 식물의 잎(도9F)을 형광현미경하에 찍은 사진을 보여주고 있다. pMyGFP로 형질전환된 식물은 보통 도관 잎 조직주위에서 가장 강력한 발현을 보여주고 있는 한편 pCvGFP 또는 pUbiGFP로 형질전환된 사탕수수 식물의 잎은 분석된 모든 세포에서 구성성 발현을 보여주었다. pMyGFP, pCvGFP 및 pUbiGFP로 형질전환된 사탕수수 식물로부터의 잎 및 형질전환되지 않은 식물로부터의 잎을 금속칼로 상처를 내어(㎠당 54) 프로모터의 상처-유도성을 시험하였다. 48시간 후 이루어진 GFP 형광의 평가는 pCvGFP 및 pUbiGFP로 형질전환된 잎의 상처 부위주위에 증가된 GFP 생성을 보여준 반면 pMyGFP로 형질전환된 잎 또는 형질전환되지 않은 잎의 경우는 형광의 증가가 관찰되지 않은 것으로 나타났다. 도9I는 pCvGFP로 형질전환된 사탕수수 식물로부터의 상처 후 48시간 경과된 잎의 일부를 보여주고 있다.

Biorad MRC600 광원과 488 nm에서의 여기에 적절한 필터가 있는 공초점현미경(Zeiss)를 사용하여 다른 잎 세포 층을 보더 자세히 연구하였고 방출은 509 nm에서 측정하였다. 도10은 pMyGFP(도10A), pCvGFP(도10B), pUbiGFP(도10C)로 형질전환된 식물 및 형질전환되지 않은 식물(도10D)로부터 향축-측면상으로 접하는 사탕수수 잎의 8 μm 거리에 9 시리얼 스캔의 중복 Z 시리즈의 디지털 영상을 보여준다. 심플라스트의 모든 세포 유형은 GFP의 존재를 나타낸 것으로 관찰되었고 이는 시험된 프로모터에 대해 준구성성 발현을 시사한다. 전에 관찰된 바와 같이, 가장 강력한 GFP 형광은 pCvGFP로 형질전환된 사탕수수 잎에서 관찰되었고 그 다음은 pUbiGFP이고 그 다음은 pMyGFP인 한편 pMyGFP 작제물은 도관 조직 주위에 있는 세포외 다른 세포에서 보다 낮은 발현을 나타냈다(도10). 도11은 pCvGFP로 형질전환된 잎에 대해 도10B에서 보여준 Z 시리즈의 세 개 중복 영상의 두 세트를 보여주고 있다. 도11A는 표피를 포함한 대부분의 상부 세포층을 보여주고 있는 반면 도11B는 도관 단면과 이의 주변 세포를 보여주고 있다. 핵에 GFP의 축적이 일부 세포에서 뚜렷하다.

유전자이식 바나나 식물(쓰리 핸드 플랜티)을 상기 Sagi et al., 1995 문헌에 기술된 방법에 따라 조직배양으로 생산하였다. 바나나 배발생 세포 배양물내로 pAct-neo 키메라 유전자 작제물을 pMyGUS 및 pCvGUS와 함께 공동 충격한 후 각각 65 및 61개 제네티신-내성 식물을 발생되었다. 계속해서, 식물을 마이크로증식을 사용하여 시험관내에서 증식시켰다.

GUS 레포터 유전자에 융합된 pMy 및 pCv의 존재를 확인하기 위하여 GUS 발현을 나타낸 pMyGUS 및 pCvGUS로 형질전환된 수개의 바나나 식물을 선택하고 둘다, 프로모터 영역의 일부 및 레포터 유전자의 일부를 커버하는 프라이머를 사용하여 DNA를 추출하고 PCR 분석을 수행하였다. 전체 식물 DNA를 문헌[Dellaporta et al., Plant Mol. Biol Rep. 1: 19-21 (1983)]의 변형방법에 따라 바나나 잎으로부터 분리하였다. 요약하면, 30 내지 100 mg의 잎 또는 뿌리를 1.5 ml 마이크로퓨지관내 500 μl의 추출 완충액(100 mM 트리스-HCl, pH 8.0; 50 mM EDTA, pH 8.0; 500 mM NaCl; 10 mM β-머캅토에탄올; 2% 폴리비닐피롤리돈, MW=10,000)으로 분쇄시켰다. 33 μl의 20% SDS 용액을 첨가한 후 혼합물을 와동하고 10분간 65℃에서 배양하였다. 계속해서, 160 μl의 5M 아세트산 칼륨 용액(pH 5.2)을 첨가하고 관을 와동한 다음 마이크로퓨지에서 10분간 13,000 rpm으로 원심분리하였다. 파편-유리된 상등물을 새로운 관으로 옮긴 후 등량의 이소프로판올을 첨가하고 와동한 다음 10분간 13,000 rpm으로 원심분리하여 DNA를 침강시켰다. 펠렛을 조심스럽게 70%(v/v) 에탄올로 세척하고 라미나 기류에 접한 관을 열고 20 내지 25분간 공기 건조시킨 후 20 μl의 멸균 탈이온수중에 재현탁시켰다.

GUS 레포터 유전자에 융합된 pMy 프로모터의 존재를 약 450 bp의 단편을 증폭하기 위해 프라이머 MyA(서열 7) 및 프라이머 GUS1R(서열 10: 5'-CTT GTA ACG CGC TTT CCC ACC-3')을 사용하여 pMyGUS로 형질전환된 식물로부터의 잎 추출물에 대해 PCR로 확인하였다. GFP 레포터 유전자에 융합된 pCv 프로모터의 존재는 약 350 bp의 단편을 증폭하기 위해 프라이머 CvA(서열 9) 및 GUS1R을 사용하여 pCvGUS로 형질전환된 식물로부터의 잎 추출물에 대해 PCR로 확인하였다. 모든 프라이머는 Eurogentec (Seraing, Belgium)에 의해 상업적으로 합성되었다. 형질전환되지 않은 식물로부터의 추출물은 음성 대조군으로 사용되었다. 검사된 모든 식물의 PCR 산물은 DNA 겔 전기영동에서 예상된 밴드 크기를 보여준 한편 음성 대조군은 아무런 밴드도 보여주지 않았다(이 데이터는 제시되어 있지 않음).

pMyGUS로 형질전환된 25개 유전자이식 라인 및 pCvGUS로 형질전환된 30개 식물 라인을 무작위로 선택하고 조직화학 GUS-염색에 의해 스크리닝하였다. GUS 염색은 흑백사진복사본에서 검정색으로 나타난다. 이들 결과를 기초로, 보다 상세한 GUS 검정을 위해 15개 및 12개 개개 라인을 선택하여 기관-특이성 발현과 조직-특이성 발현을 측정하였다. 이 결과를 요약하면 다음과 같다. 일반적으로, 바나나 식물의 두 그룹이 양 작제물: "약 발현체" 및 "강 발현체"에 대해 비슷한 조직 특이성을 나타낸 것으로 밝혀졌다. 강 발현체에서는 반응이 X-Gluc 염색(100 mM 트리스-HCl), pH 8.0; 10 mM EDTA, pH 8.0; 0.5 mM K-시안화제일철; 0.5 mM K-시안화제이철; 1% 아스코르브산; 0.1% X-Gluc[5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-β-D 글루쿠로나이드]; 0.2% SDS) 후 20 내지 30분에 나타나는 반면에 약 발현체에서는 최초로 색깔이 나타나는 것이 지연(2 내지 3시간)되었고 염색 농도도 강 발현체의 것에 도달하지 못하였다. pMyGUS로 형질전환된 15개 라인가운데 약 60%는 고 발현체로서 간주될 수 있는 한편 pCvGUS로 형질전환된 12개 라인가운데 30%는 강 GUS-염색을 보여주었다. 도12 및 도13은 각각 pMyGUS 또는 pCvGUS로 형질전환된 바나나 식물의 상이한 X-gluc-염색된 조직 유형의 종횡 단편뿐만 아니라 형질전환되지 않은 대조 식물의 종횡 단편(도13G, 도13H 및 도13I)을 보여준다. 양 작제물은 유사한 조직 특이성을 유도하였다. 염색 농도는 발아(도12D 및 도13D) 및 뿌리정상 분열조직(도12F 및 도13F), 지하경(도12E, 도12F 및 도13E) 및 잎꼭지 및 슈도스템(도12B, 도12C, 도13B 및 도13C)에서 주로 가장 강하였다. 잎의 상부에서 염색 농도가 보통 약하였고(도12A 및 도13A) 일부 경우에 고르지 못한 염색 패턴을 보였는데 이는 염색동안에 차별적인 기질 흡수에 의해 유발된 것 같지 않았다. 바나나 식물에서의 구성성 발현은 양 프로모터에 대해 관찰될 수 있었던 반면 일부 라인은 또한 보다 불규칙적인 염색 패턴을 보여주었는데 이는 가능한 유전자 사일런스에 의한 것일 수 있다. pAHC27(pUbi, GUS 레포터 유전자 및 nos 터미네이터를 함유한 플라스미드; 상기 Christensen and Quail)로 상기 Sagi et al., 1996에 의해 형질전환된 대조 식물은 유사한 준구성성 염색 패턴을 보여주었다(이 데이터는 제시되어 있지 않음). 24시간 X-Gluc 염색 용액에서 배양된 비형질전환 바나나 식물의 잎, 슈도스템 및 발아 분열조직은 아무런 GUS 활성도 나타내지 않았다(각각, 도13G, 도13H 및 도13I). 이러한 담갈색은 흑백사진복사본에서 회색으로 보인다.

상기 시험 시스템 (3)에서 반정량 웨스턴 블롯 분석을 상기된 유전자이식 사탕수수 식물의 잎 추출물에 대해 실시하였다. 이 방법은 유전자이식 식물에서 생성된 GFP의 정량을 기초로 한 믿을만한 프로모터 평가를 제공한다. 상기된 형광현미경에 의한 사전 평가에 따르면, 잎에서 가장 강한 GFP 생성을 보여준 5개의 독립적인 식물 라인이 작제물 pMyGFP, pCvGFP 및 pUbiGFP 각각에 대해 선별되었다. 이들 15개 라인 각각으로부터 가장 어린 잎의 단백질 추출물을 150 mg을 50 mM 헤페스-KOH, 10 mM MgCl₂, 1mM EDTA, 1 mM EGTA, 5 mM DTT, 1 mM PMSF, 1 mM 벤즈아미드, 1 mM 벤즈아미딘, 5 mM E-아미노카프로산, 2 μM 루펩틴, 2μM 안티페인, 0.1%(v/v) 트리톤 X-100, 2%(w/v) 폴리비닐폴리피롤리돈, pH 7.5 및 약 0.1g의 산 세척 모래가 함유된 1.5 ml의 빙냉 추출 완충에서 분쇄시켜 수득하였다. 웨스턴 블롯 검정을 문헌[Grof et al., in Sugarcane: Research Towards Efficient and Sustainaable Production (J. R. Wilson, D. M. Hogarth, J. A. Campbell and A. L. Garside, ed's.) pp. 124-126; CSIRO Division of Tropical Crops and Pastures, Brisbane (1996)]에 기술된 방법에 따라 실시하였다. GFP에 대한 두 개의 마우스 모노클로날 항체의 혼합물로 이루어진 시판 항체를 뵈링거 만하임으로부터 입수하였다(Cat. No. 1814 460). 도13은 pMyGFP 및 pCvGFP(도14A), pMyGFP 및 pUbiGFP(도14B) 및 pCvGFP 및 pUbiGFP(도14C)로 형질전환된 식물의 5개 독립된 라인 각각의 잎 추출물을 사용한 대조 면역블롯을 보여준다. 각 면역블롯의 제1레인과 마지막 레인은 각각 kDa로 미리염색된 만화경 크기 마커(Biorad)와 미형질전환 식물로부터의 잎 추출물을 함유한다. 일부 경우에 이중 밴드가 검출되었다. 이는 전구체의 일부 절단 또는 불완전 변성에 의한 것일 수 있다. 도14에 나타낸 모든 밴드의 상대 비교는 농도가 pCvGFP로 형질전환된 사탕수수 식물에서 가장 높았고 이어서 pUbiGFP로 형질전환된 식물, pMyGFP로 형질전환된 식물 순임을 보여준다. 이들 결과는 상기된 형광현미경을 이용한 관찰과 상응하며 pCv가 유전자이식 사탕수수 식물에서의 강한 발현에 적합한 프로모터임을 증명한다. 비록 pMy가 보다 약한 발현을 유도하였으나 이 또한 사탕수수 식물에서 활동적이라 하겠다.

상기 시험 시스템 (4)에서, 유전자이식 바나나 식물의 다른 기관에서의 GUS 활성을 문헌[Jefferson, Plant Mol. Biol. Rep. 5: 387-405 (1987)]의 변형된 방법에 따라 형광측정 GUS 검정법을 사용하여 정량하였다. 간단히 설명하면, 200 내지 300 mg의 식물 조직을 마이크로튜브 관에서 400 μl의 GUS 추출 완충액(50 mM 인산나트륨 완충액, pH 7.0; 10 mM EDTA, pH 8.0; 10 mM β-머캅토에탄올; 0.1% 나트륨 라우릴 사르코신; 0.1% 트리톤 X-100; 2% 폴리비닐피롤리돈, MW=10,000)중의 멸균 세척 모래로 분쇄시키고 얼음에 옮긴 다음 10,000 rpm으로 10분간 원심분리하였다. 상등액을 조심스럽게 새로운 마이크로튜브 관에 옮겼다. 단백질 농도를 Bradford 검정(BioRad Laboratories)으로 측정하였다. 50 μl의 예열된(37℃) 단백질 추출물을 200 μl의 예열된(37℃) MUG-검정 완충액 (20%(v/v) 메탄올이 함유된 GUS-추출 완충액중의 1mM 4-메틸움벨리페릴 β-D-글루쿠로니드(MUG, Sigma))에 첨가하여 각 샘플에 대해 형광측정 효소 GUS 검정을 실시하였다. 37℃에서 120분간 배양한 후 10 μl 연속 희석액 (2 내지 80배)을 미세역가 평판중의 0.2 M Na₂CO₃190 μl에 첨가하여 반응을 정지시켰다. 루미네슨스 스펙트로플루오미터 (LS 50B, Perkin Elmer)에서 365 nm로 여기 후 455 nm에서 흡광도를 측정하였다. 형질전환되지 않은 식물의 단백질 추출물을 제로 샘플을 위해 사용하고 10 μM 내지 60 μM의 농도를 가진 GUS 추출 완충액중의 4-메틸룸벨리페론(MU, Sigma 또는 Duchefa)를 표준으로서 사용하였다. 도15는 pMyGUS로 형질전환된 세 개 라인(MY1, MY2 및 MY3), pCvGUS로 형질전환된 두 개 라인(CV1 및 CV2) 및 pAHC27로 형질전환된 두 개 라인(UBI, 제시된 평균)의 잎 및 슈도스템/지하경 추출물에 대해 얻은 결과(표준편차 오차 바아와 함께 세회 이상 측정 후 평균낸 것으로 시간 및 mg 단백질당 nm MU)를 요약한 것이다. pMyGUS 발현 식물은 pAHC27로 형질전환된 대조 식물과 비교하여 잎에서 29배 큰 GUS 활성을, 슈도스템/지하경 조직에서 3 내지 4 큰 활성을 유도한다. pCvGUS 발현 식물은 pAHC27로 형질전환된 대조 식물과 비교하여 잎에서 4 내지 5배 큰 GUS 활성을, 슈도스템/지하경 조직에서 비슷한 활성을 유도한다. 형질전환되지 않은 바나나 식물(NEG)은 아무런 활성도 보이지 않았다.

실시예 4의 결과는 서열 1 및 서열 2에 제시된 서열이 모두 안정한 조건하에 유전자이식 식물에서 프로모터로서 활성적임을 보여준다. 또한, 이 결과는 두 프로모터가 유전자이식 사탕수수 및 바나나에서 안정한 조건하에 옥수수 폴리유비퀴틴 프로모터보다 고속으로 강하게 발현함을 증명한다. 이들 결과는 서열 1 및 서열 2의 프로모터가 식물에서의 유전자 발현 및 유전공학에서 귀중한 도구임을 확인시켜 주고 있다.

실시예 5

추정 프로모터 요소의 동정

ANGIS 프로그램 패키지 TFSEARCH [Heinemeyer et al., Nucleic Acids Res. 26, 364-370 (1998)]의 프로그램 시그날 스캔을 사용하고 카울리모바이러스 또는 배드나바이러스 아그룹의 다른 식물 바이러스 게놈의 프로모터 서열에서 동정된 추정 프로모터 요소[예, Chem et al., J. Virol. 70, 8411-8421 (1996); Verdaguer et al., Plant Mol. Biol. 31, 1129-1139 (1996); Yin and Beachy, The Plant Journal 7, 969-980 (1995)]와 비교하여 추정 프로모터 요소를 동정하였다.

도16, 도17 및 도18은 서열 1, 서열 2 및 서열 3의 서열에서 동정된 코어 프로모터 영역에서의 추정 프로모터 요소를 도시한 것이다. 이들 요소는 G/C 다수영역으로 둘러쌓인 TATA 박스[TATA: Breathnach and Chambon, Ann. Rev. Biochem. 50, 349-383 (1981); Bucher, J. Mol. Biol. 212: 563-578 (1990)], 이니시에이터 (INI; 전사출발 부위; O'Shea-Greenfield and Smale, J. Biol. Chem. 267, 1391-1402 (1992), 상기 Bucher (1990)), 바이러스 C/EBP (CCAAT/인핸서 결합 단백질) 부위(C/EBP: Graves et al., Cell 44, 565-576 (1986); Bakker and Parker, Nucl. Acids Res. 19, 1213-1217 (1991), Grange et al., Nucl. Acids Res. 19, 131-139 (1991)], GATA 결합 인자 1(GATA-1: Merika and Orkin, Mol. Cell. Biol. 13: 3999-4010 (1993)] 및 활성화 전사 인자[ATF: Rooney et al., Mol. Cell. Biol. 10, 5138-5149 (1990)]을 포함한다.

당업자는 본 발명의 범위내에서 상기 예시된 프로모터 및 프로모터-함유 작제물에 많은 변형을 가할 수 있음을 인지할 것이다.

Claims (18)

1. (1) 배드나바이러스로부터 분리되어 서열 1, 서열 2 또는 서열 3으로 정의된 서열을 갖는 DNA, (2) (1)의 DNA의 바이러스 상동물 또는 식물 게놈-유래된 변이체인 분리된 DNA, (3) (1) 또는 (2)의 분리된 DNA의 프로모터-활성 부분, (4) (1) 또는 (2)의 DNA와 긴축조건하에서 하이브리드화하는 분리된 DNA 또는 (5) (4)의 분리된 DNA의 프로모터-활성 부분을 포함하는, 식물세포에서 작동하는 프로모터.
2. 제1항에 있어서, 서열 1의 염기 1538-2105, 서열 2의 염기 850-1322 또는 서열 3의 염기 859-1297을 포함하는 프로모터.
3. 제1항에 있어서, 서열 1의 염기 1806-2105, 서열 2의 염기 1023-1322 또는 서열 3의 염기 998-1297을 포함하는 프로모터.
4. 제1항에 따른 프로모터 하나 이상이 암호서열에 작동적으로 연결된 DNA 작제물.
5. 제4항에 있어서, 상기 하나 이상의 프로모터가 서열 1의 염기 1538-2105, 서열 2의 염기 850-1322 또는 서열 3의 염기 859-1297을 포함하는 DNA 작제물.
6. 제4항에 있어서, 상기 하나 이상의 프로모터가 서열 1의 염기 1806-2105, 서열 2의 염기 1023-1322 또는 서열 3의 염기 998-1297을 포함하는 DNA 작제물.
7. 제4항에 있어서, 상기 암호서열이 RNA 또는 폴리펩타이드를 암호화한 DNA 작제물.
8. (1) 제1항에 따른 프로모터 하나 이상이 암호서열에 작동적으로 연결된 제1 유전자 및 (2) 프로모터가 암호서열에 작동적으로 연결된 제2 유전자를 포함하고 상기 제2 유전자 암호서열의 발현산물이 상기 제1 유전자 암호서열의 발현산물의 활성을 조절하는 DNA 작제물.
9. 제8항에 있어서, 상기 제1 유전자 프로모터가 서열 1의 염기 1538-2105, 서열 2의 염기 850-1322 또는 서열 3의 염기 859-1297을 포함하는 DNA 작제물.
10. 제8항에 있어서, 상기 제1 유전자 프로모터가 서열 1의 염기 1806-2105, 서열 2의 염기 1023-1322 또는 서열 3의 염기 998-1297을 포함하는 DNA 작제물.
11. 제8항에 있어서, 상기 제1 유전자가 RNA 또는 폴리펩타이드를 암호화한 DNA 작제물.
12. 산물을 암호화한 제2항에 따른 DNA 작제물 또는 이의 RNA 전사물을 식물세포내로 도입하여 식물세포에서 상기 산물을 발현하는 방법.
13. 게놈이 제4항 또는 제8항에 따른 DNA 작제물을 포함하는 식물세포.
14. 제13항에 있어서, 상기 식물이 단자엽, 쌍자엽, 겉씨식물 또는 양치류인 식물세포.
15. 제14항에 있어서, 상기 단자엽이 사탕수수(sugarcane 또는 sorghum), 바나나, 옥수수 및 수수(millet) 중에서 선택된 종인 식물세포.
16. 제14항에 있어서, 상기 쌍자엽이 담배, 캐놀라, 티푸나무 및 니코티아나 벤타미아나 중에서 선택된 종인 식물세포.
17. 제14항에 있어서, 상기 겉씨식물 종이 라디아타 파인인 식물세포.
18. 제13항의 세포을 포함하는 식물, 식물조직 또는 식물의 재생(reproductive)물질.