JP2002507888A

JP2002507888A - 植物およびウイルスプロモーター

Info

Publication number: JP2002507888A
Application number: JP50515799A
Authority: JP
Inventors: シェンク，ペーア・マルティン・フィリップ; シャーギ，ラースロー; レミ，セルジュ; スウェネン，ロニー・レオン; ディーツゲン，ラルフ・ジョージ; ギーリング，アンドリュー・デイビッド・ウィリアム; マクマイケル，リー・アン; トーマス，ジョン・エドウィン; グロフ，クリストファー・ピーター・レスリー; エリオット，エイドリアン・ロス
Original assignee: University of Queensland UQ; Katholieke Universiteit Leuven
Current assignee: University of Queensland UQ; Katholieke Universiteit Leuven
Priority date: 1997-06-26
Filing date: 1998-06-26
Publication date: 2002-03-12
Also published as: CA2295301A1; WO1999000492A1; EP1021527A1; KR20010020526A; BR9810448A; CN1261402A; AUPO759397A0; US6391639B1; NZ502334A

Abstract

(57)【要約】本発明は、トランスジェニック植物で高レベル遺伝子発現を付与する植物およびウイルスプロモーターに関する。代表的プロモーターは、栽培品種Mysore、WilliamsおよびGoldfingerから単離したオーストラリアのバナナ感染バドナウイルスのゲノムから単離できる。本発明は、コード配列に操作可能に結合した記載したプロモーターを含む構築物を提供する。更に、植物細胞中での遺伝子の生産物の発現法、ゲノム内DNA構築物を有する植物細胞、およびトランスジェニック細胞を含む植物も提供される。

Description

【発明の詳細な説明】植物およびウイルスプロモーター技術分野本発明は、プロモーターを担持するトランスジェニック植物で高レベル遺伝子発現を付与する植物およびウイルスプロモーターに関する。本発明はまた植物形質転換のための組換え遺伝子の構築におけるプロモーターの利用にも関し、ある時間、ある組織中、ある割合での発現を可能にする。特に、本発明はバナナ感染バドナウイルス(Badnaviruses)の異なる単離体から単離したプロモーターに関する。背景技術植物の遺伝子工学は、植物育種および変えられた表現型に反映される新規の望ましい性質の挿入の代替法として証明されている。加えて、それは生物学的実験の有効なツールを提供する。植物遺伝子操作は、生物の細胞性レベルに焦点を当て、細胞生物学、分子生物学および遺伝子移入法の全ての態様の境界に関与する (Sharp et al.，Food Technology，Feb．1984，pp．112-119)。組織培養、ソマクローナルおよびガメトクローナル変化、細胞性選択法および組換えDNAの遺伝子工学ツールは、直接または間接的に遺伝子の促進された発現および移入に関する。この本質的な問題は、遺伝子発現の所望の割合、位置および時間をもたらす適当なプロモーターの選択である。植物遺伝子工学の適用の大半において、十分な量の遺伝子生産物が発現されることを確実にするために、強いプロモーターが必要である。これらの適用は、植物感染ウイルス、細菌、真菌または線虫類に対する疾病耐性または耐容性を得るため、除草剤、重金属および選択可能マーカー試薬に対する耐性を得るため、抗生因子(例えば、下水、塩、寒さおよび嫌気条件)に対する耐性を得るため、研究のために遺伝子および遺伝子生産物の機能的分析を行うため、遺伝子および遺伝子生産物の沈黙または促進のため(遺伝子発現の調整)、巨大分子および２次代謝物の組成の修飾のため(例えば、栄養価の増加または構造的組成の変化のため)、植物発育の修飾のため、および果実または穀物質の改善のため(例えば、収穫後貯蔵寿命または疾病耐性)の遺伝子操作を含む。プロモーターの機能および作用の形態は、単子葉および双子葉植物の両方で詳細に研究されている。殆どの場合、β−グルクロニダーゼ(GUS:Jefferson et al .，EMBO J．6，3901-3907[1987])をコードするuidA遺伝子またはアントシアニン製造またはクラゲ緑色蛍光タンパク質(GFP;Chalfie et al.，Science 263，802- 805[1994])をコードする遺伝子のようなレポーター遺伝子を、一過性または安定遺伝子発現系におけるプロモーター活性のアッセイに使用する。単子葉種由来のプロモーターは、しばしば、トランスジェニック双子葉における発現の統制されたパターンを示さないが、トランスジェニック単子葉において、それらは非常に統制されたパターンを示す(Shimamoto，Current Opinion in Biotechnology 5， 158-162[1994])。非常に統制された発現パターンは、完全な特性がなくてさえ、トランスジェニック単子葉における数個のプロモーターで証明されている。これらは、光誘導可能および葉特異的プロモーター、種子特異的プロモーター、分裂組織特異的プロモーター、根特異的プロモーター、花特異的プロモーター、ホルモン誘導可能プロモーター、病原体誘導可能プロモーターおよび構造的プロモーターを含む。単子葉および双子葉植物内で、あるグループ由来のプロモーターが、同じまたは類似の非常に統制された発現パターンを表すことが示されている(S himamoto，1994，前掲)。植物遺伝子工学の多くの目的のために、強く、殆ど構造的なプロモーターが植物内での十分な発現を確実とするために必要である。植物の遺伝子操作のための数個の強い、ほとんど構造的なプロモーターが、特許となっている(例えば、カリフラワーモザイクウイルスの35Sプロモーター米国特許第5,352,605号、第5,16 4,316号、第5,196,525号、第5,322,938号および第5,359,142号参照)。しかし、植物内で数個の遺伝子を発現する必要があるとき(遺伝子ピラミッド状形成)、１個以上の殆ど構造的なプロモーターが、しばしば有用であり得る。互いに同じプロモーターで制御されている数個の遺伝子で形質転換した植物において、遺伝子沈黙が起こることがしばしば観察されている(Flavell，Proc．Natl．Acad．Sci ．USA 91，3490-3496[1994];Finnegan and McElroy，Bio/Technology 12，883-8 88[1994];Matzke et al.，Mol．Gen．Genet．244，219-229[1994];Park et al. ，The Plant Journal 9，183-194[1996])。この問題は、相同性ベースの遺伝子干渉によるものであると考えられ、遺伝子ピラミッド形成のための異なるプロモーターの使用により避けることができる。発明の要約遺伝子発現の制御のための遺伝子工学に使用できる、植物細胞内で機能的なプロモーターの提供が本発明の目的である。 RNAおよび／またはポリペプチドをコードするDNAに操作可能に結合した１個またはそれ以上の望ましいプロモーターを含むキメラ遺伝子の少なくとも一部の提供が本発明の別の目的である。本発明の第１の態様に従って、植物細胞内で機能的なプロモーターが提供され、該プロモーターは：１)配列番号１、配列番号２または配列番号３に定義された配列を有するバドナウイルスから単離DNA；２)(１)のDNAのウイルス相同物または植物ゲノム由来変異体である単離DNA；３)(１)または(２)の単離DNAのプロモーター活性部分；４)ストリンジェントな条件下で(１)または(２)のDNAとハイブリダイズするDN A；または５)(４)の単離DNAのプロモーター活性部分を含む。本発明の第２の態様に従って、コード配列に操作可能に結合した第１の態様に従った少なくとも一つのプロモーターを有する少なくとも一つの遺伝子を含むDN A構築物が提供される。本発明の第３の態様に従って：１)コード配列に操作可能に結合した第１の態様の少なくとも一つのプロモーターを有する第１遺伝子；および２)コード配列に操作可能に結合したプロモーターを有する第２遺伝子(該第２遺伝子コード配列の発現生産物は、該第１遺伝子コード配列の発現生産物の活性を調整する) を含む、DNA構築物が提供される。本発明の第４の態様に従って、植物細胞内で生産物を発現させる方法が提供され、該方法は、第２の態様に従ったDNA構築物または該構築物のRNA転写物の植物の細胞への挿入を含み、該DNA構築物またはRNA転写体コード配列は該生産物をコードするものである。本発明の第５の態様に従って、植物細胞が提供され、ここで該植物細胞のゲノムは第２の態様または第３の態様に従ったDNA構築物を含む。本発明の第６の態様に従って、植物、植物組織または植物の再生物が提供され、ここで該植物、植物組織または再生物は第５の態様のDNA細胞を含む。図面の簡単な説明図１は、レポーター遺伝子(GUSまたはGFP)と融合した、栽培品種Mysore(My)、 Cavendish-タイプWilliams(Cv)およびGoldfinger(Go)から単離したオーストラリアのバナナ感染バドナウイルス由来のプロモーター−レポーター遺伝子構築物を示す。図２から５は、図１のプロモーター−レポーター遺伝子構築物を使用した一過性プロモーター活性アッセイの結果を記載する。図６は標準一過性条件下での異なるプロモーター活性の比較である。図７から１３は、図１のプロモーター−レポーター遺伝子構築物を使用した安定プロモーター活性アッセイの結果を記載する。図１４はトランスジェニックサトウキビ葉におけるGFP産生を基本にした半定量的プロモーター活性比較を示す。図１５は、トランスジェニックバナナ植物の異なる組織におけるGUS産生を基本にした定量的プロモーター活性比較を示す。図１６から１８は、各々配列番号１、配列番号２および配列番号３として示した配列由来のプロモーターpMy、pCvおよびpGoにおける推定のプロモーター要素を示す。本発明の実施のための最良の形態および他の形態本明細書中で以下の略語を使用する： ER 小胞体 GFP クラゲAequorea victoriaの緑色蛍光タンパク質 GUS Escherichia Coliのβ−グルクロニダーゼ MU ４−メチルウンベリフェロン MUG ４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−グルクロニド Nos Agrobacterium tumefaciensのノパリンシンターゼターミネーター p35S カリフラワーモザイクウイルス35Sプロモーター PCR ポリメラーゼ連鎖反応 pCv 配列番号２の配列に従ったプロモーター領域 PEG ポリエチレングリコール pGO 配列番号３の配列に従ったプロモーター領域 pMy 配列番号１の配列に従ったプロモーター領域 pUbi メイズユビキチンプロモーター ScBv サトウキビ桿状バドナウイルス明細書を通して使用する用語が明確で一定の意味を有するように、以下の定義を提供する：バドナウイルス：桿状DNAウイルスコード配列：機能的RNA転写物をコードする核酸配列であり、続いてポリペプチドに翻訳され得るか、またはされ得ない。構造的プロモーター：生物の大半の細胞で活性なプロモーター。殆ど構造的なる用語の使用により、このプロモーターが植物発育中、細胞の全てタイプで殆どの場合活性であるが、植物発育の異なる段階中の異なるタイプの細胞で異なる割合で活性であり得ることを意味する。相同物：配列番号１のヌクレオチド１５３８−２１０５、配列番号２のヌクレオチド８５０−１３２２または配列番号３のヌクレオチド８５９−１２９７または２００bpより長いそれらの部分と、６０％またはそれ以上の配列同一性(相同性)を有し、配列番号１、配列番号２または配列番号３と対応するDNA配列と実質的に同じ機能である、他の生物またはウイルス単離由来の核酸配列。好ましくは、相同物は少なくとも７０％、またはより好ましくは７５％の配列同一性を有する。植物ゲノム由来変異体：植物ゲノムに存在し、配列番号１(ヌクレオチド１５３８−２１０５)、配列番号２(ヌクレオチド８５０−１３２２)または配列番号３(ヌクレオチド８５９−１２９７)または２００bpより長いそれらの部分と６０％またはそれ以上の配列同一性(相同性)を有するDNA。好ましくは、植物ゲノム由来変異体は少なくとも７０％、またはより好ましくは７５％の配列同一性を有する。プロモーター：遺伝子のコード配列に、その５'で隣接するDNA配列であり、コード配列の転写の開始に関与する要素または要素群を含む。 DNAのヌクレオチドの一文字表記は、The Biochemical Journal 219:345-373(1 984)に記載のIUPAC-IUB標準に従う。実施例中のパーセントは特記しない限り、重量／容量(w/v)で示す。本発明の発明者らは、栽培品種Mysore、WilliamsおよびGoldfinger由来のオーストラリアのバナナ感染バドナウイルスのウイルスゲノムのPCR−増幅cDNA配列で、３つのプロモーター配列を同定している。これらのプロモーター、ならびにバナナ感染バドナウイルスの相同物および植物ゲノム由来変異体は、別々に、または適当なコード配列と組合わせて使用でき、適当なレベルで目的の遺伝子(群)の発現ができるトランスジェニック植物を製造する。本発明の３つのプロモーターを含むDNAは、栽培品種Mysore、WilliamsおよびG oldfingerから単離されたオーストラリアのバナナ感染バドナウイルスのような、バドナウイルスのゲノム由来のウイルスDNAのクローニングにより得ることができる。感染オーストラリアのバナナ植物(栽培品種Mysore、WilliamsおよびGol dfinger)から単離されたバドナウイルスDNAは、制限酵素でフラグメントとし、フラグメントをEscherichia Coliのような宿主細胞で複製できるプラスミドにサブクローン化できる。あるいは、これらのプロモーター配列を、ゲノムDNAの直接ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)増幅により製造できる。必要なプライマーは配列番号１、配列番号２および配列番号３の配列データから設計できる。配列番号１、配列番号２および配列番号３に示すような配列を有するプロモーターの製造のさらに別の方法は、DNA合成である。これは、１０から１００ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドが簡便に合成できる所で、より大きなプロモーター配列のプロモーター活性部分が望ましい場合、特に適当である。相補的オリゴヌクレオチドがまた望ましいヌクレオチド配列の二本鎖分子から合成できる。上記のように、本発明は配列番号１、配列番号２または配列番号３の配列を有するプロモーターだけでなく、配列番号１、配列番号２または配列番号３配列のバナナ感染バドナウイルスの相同物および植物ゲノム由来変異体も含む(例えば、植物ゲノム統合バドナウイルスまたはレトロトランスポゾン)。本発明は、更に、配列番号１、配列番号２または配列番号３の各々ヌクレオチド１５３８−２１０５、ヌクレオチド８５０−１３２２またはヌクレオチド８５９−１２９７を含むDNAと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるDNAを含む。相同物および植物ゲノム由来変異体は、配列番号１(ヌクレオチド１５３８−２１０５)または配列番号２(ヌクレオチド８５０−１３２２)または配列番号３(ヌクレオチド８５９−１２９７)のDNA配列と、約６０％と同じ位低い同一性を有することができる。本発明のプロモーターが配列番号１(ヌクレオチド１５３８−２１０５)または配列番号２(ヌクレオチド８５０−１３２２)または配列番号３(ヌクレオチド８５９−１２９７)のDNA配列とハイブリダイズできるストリンジェントな条件は、下記のように定義できる：洗浄液−０.１×SSPE、０.１％SDS 洗浄温度−６５℃ 洗浄回数−２回（１×SSPEは１８０mM NaCl、１０mM NaH₂PO₄、１mM EDTA(pH７.４)）本発明のプロモーター配列の好ましいプロモーター活性部分は、配列番号１のヌクレオチド１５３８−２１０５、配列番号２のヌクレオチド８５０−１３２２および配列番号３のヌクレオチド８５９−１２９７である。より更に好ましくは、配列番号１のヌクレオチド１８０６−２１０５、配列番号２のヌクレオチド１０２３−１３２２および配列番号３のヌクレオチド９９８−１２９７である。本発明の第２および第３の態様に従ったDNA構築物は、コード配列に操作可能に結合した１個またはそれ以上のプロモーターを含み得る。これらの付加的プロモーターは、同一プロモーター、同じプロモーターの誘導体または異種プロモーターであり得る。加えて、エンハンサーまたはサイレンサーのような操作可能に結合した制御要素は、DNA構築物中に含まれ得る。第２および第３の態様のDNA構築物において、プロモーターまたはプロモーター群が操作可能に結合するコード配列は、アンチセンスRNAとして、リボザイムとしてまたは構造的成分として機能するRNAをコードでき、または酵素、構造的成分として機能するポリペプチドに翻訳され、または他の生理学的作用を有する。コード配列は、１個以上のRNAまたは１個以上のポリペプチドをコードできる。更に、コード領域は少なくとも１つのRNAおよび少なくとも一つのポリペプチドの組合わせをコードできる。本発明のプロモーターを使用してトランスジェニック植物内で有用に発現できるトランスジーン生産物の例は：１)植物感染ウイルス、細菌、真菌または線虫に対する疾病耐性または耐容の獲得、２)草食動物に対する耐性の獲得、３)除草剤、重金属または選択可能マーカー試薬に対する耐性の獲得、４)抗生因子(例えば、下水、塩、寒さおよび嫌気条件)に対する耐性の付与、５)研究のための遺伝子および遺伝子生産物の機能的分析の実施、６)遺伝子および遺伝子生産物の沈黙または促進の付与(遺伝子発現の調整)、７)巨大分子および２次代謝物の組成の修飾(例えば、栄養価の増加または構造的組成の変化のため)、８)植物発育の修飾、または９)果実または穀物質の改善(例えば、収穫後貯蔵寿命または疾病耐性) を助ける生産物である。本発明の第３の態様を参照して、DNA構築物の第１遺伝子は、第２の態様のDNA 構築物を含む遺伝子の全ての変異体および選択を含む。DNA構築物の第２遺伝子は、１)第１遺伝子の発現性産物の効果を補う、または促進する；２)第１遺伝子の発現を打ち消す；または３)第１遺伝子プロモーター(群)の活性を修飾するいずれかである発現生産物を有し得る。これらの選択は、第２遺伝子と第１遺伝子のプロモーター(群)により介在される強い発現の結合により、遺伝子発現の高い制御を可能にする。本発明が第２および第３の態様のDNA構築物を含む遺伝子操作されたトランスジェニック植物細胞を含むことは、発明の要約から明らかである。これらのDNA 構築物はまた、植物細胞内で安定にまたは一過性に発現される、１個またはそれ以上の目的のコード配列の組換えウイルス配列を含むこともできる。あるいは、 RNA転写物は、植物細胞の形質転換に使用できるこれらの構築物から製造できる。 et al．(Bio/Technology 13，481-485[1995])，May et al．(Bio/Technology 13 ，485-492[1995])，Zhong et al.，Plant Physiol．110，1097-1107[1996])に記載されている。本発明のDNA構築物は、Agrobacterium−介在形質転換、DNA−被覆タングステンまたは金粒子での微粒子銃砲撃、原形質の電気穿孔またはポリエチレングリコール(PEG)−介在DNA形質転換、真空浸潤および他の機械的DNA移入法を含む方法を使用して、標的植物細胞のゲノムに有利に挿入する。本発明のDNA構築物を含むトランスジェニック植物細胞は、具体的な植物に適当な条件を使用して繁殖できる。同様に、全植物、または植物の繁殖材料を、既知の方法および条件を使用して、最初のトランスジェニック細胞から製造できる。本発明のプロモーターは、単子葉および双子葉植物ならびに裸子植物およびシダで使用できる。例えば、プロモーターは、以下の単子葉種で活性である：サトウキビ、バナナ、メイズ、キビ、モロコシ。本発明のプロモーターが活性な双子葉種は、タバコ、キャノーラ、チプ・ツリー(Tipu tree)およびNicotiana benth amianaを含む。本発明のプロモーターが活性な裸子植物およびシダ種は、それぞれラジアータマツおよびフィッシュボーン・シダ(fishborne fern)である。本発明がより理解されるように、幾つかの非限定的実施例を下に記す。一般法 DNAの操作は、Sambrook et al．(その全体を本明細書に相互参照として包含させるMolecular Cloning:a Laboratory Manual，2nd Ed.，Cold Spring Harbour Laboratory Press，Cold Spring Harbour NY[1989])に記載のような既知の方法を使用して行った。試薬および他の材料は、商品から得、そうでなければ特記した。実施例１新規プロモーターのクローニング単離したバドナウイルスは、Centre for Wet Tropics Agriculture，South Jo hnstone，North Queensland，Australiaからのバナナ栽培品種Mysore(MusaグループAAB)および漕illiams(MusaグループAAA)およびDeeral，North Queensland， Australiaの畑からのGoldfinger(MusaグループAAAB)の感染葉材料から得た。栽培品種Mysore由来のバドナウイルスを、ココアスウォルンシュートバドナウイルスの精製に使用するためのプロトコールを修飾して使用して単離した(Lot e t al.，J．Gen．Virol．72，1735-1739[1991])。薄層組織を６容量の抽出緩衝液 (５mMジエチルジチオカルバミン酸ナトリウム(DIECA)、０.２％チオグリセロール、０.５％ポリエチレングリコール(PEG)6000および０.５％(v/v)セルクラスト (Novo Industries)を含む５０mM NaH₂PO₄／Na₂HPO₄緩衝液(pH６.１))中で混合することにより均質化した。更に２容量の抽出緩衝液を添加し、調整物を１００ rpmで室温で５時間振り、一晩４℃でインキュベートした。均質物を４層のチーズクロスで濾過し、濾液を３,９５０rpm(３,０００×ｇ)で２０分、１０℃でSW HS4ローター(Sorvall)で遠心した。０.２ＭまでのNaClおよび９.５％までのPEG6 000を上清に添加し、１５分撹拌し、次いで３時間室温に保った。PEG沈殿を７, ０００rpm(１０,０００×ｇ)で２０分、１０℃でSW HS4ローターで遠心することによりペレット化した。ペレットを再懸濁緩衝液(５０mM NaH₂PO₄／Na₂HPO₄、p H６.８、０.２Ｍ NaCl、０.１％Na₂SO₃および５mM EDTA含有)の元の抽出液容量の１／３０に再懸濁した。懸濁液をSS34ローター(Sorvall)の８,１８０rpm(８ ,０００×ｇ)での遠心により浄化し、上清を保持し、再び再懸濁緩衝液の元の抽出液容量の１／３０に再懸濁した。遠心を繰り返し、上清をプールし、最終ペレットを廃棄した。セライト(２ｇ／出発物質３０ｇ)を上清に添加し、混合し、穏やかな吸引下、ブフナー漏斗で濾過した。０.２ＭまでのNaClおよび７％までのP EG6000を濾液に添加し、混合物を４cmセライトカラムに移した。カラムは、２cm 直径３０mlシリンジ中に調整し、再懸濁緩衝液で平衡化した。ウイルスを穏やかな吸引下、５％、３％、１％、次いで０％PEG6000を含む再懸濁緩衝液の２５ml づつの段階的添加で溶出した。各段階からの溶出液を６,９５０ rpm(７,０００×ｇ)で、１０分、１０℃でSA600ローター(Sorvall)中で遠心し、上清を５０,０００rpm(２５,５００×ｇ)で５０分、70Tiローター(Beckman)で遠心した。ペレットを１００μl ５０mMクエン酸三ナトリウム緩衝液pH７.０に再懸濁し、アリコートを等量の２％ホスホタングステンカリウム陰性染色で染色し、ウイルスの存在を電子顕微鏡で試験した。ウイルス含有フラクションをプールし、クエン酸緩衝液中の１０−４０％スクロース密度勾配上に重層し、３５,０００rpm(１６,５００×ｇ)で、SW41ローター(Beckman)で遠心した。勾配をISCOフラクシオネーターを使用して、吸光度２５４nmで追跡し、分画して、０.５mlフラクションを取った。吸光度のピーク下のフラクションをプールし、クエン酸緩衝液で希釈し、５３,０００rpm(２９,０００×ｇ)で３０分、４℃で75Tiローター(Beckman)で遠心することによりペレット化した。ペレットを５０μlクエン酸緩衝液に再懸濁し、アリコートを等量の２％ホスホタングステンカリウム溶液で染色し、ウイルス濃度および純度を電子顕微鏡で試験した。ウイルスDNAを、全核酸抽出法(Lot et al.，J．Gen．Virol．72，1735-1739[1 991])を使用して調整した。この比率は、XhoIIを使用して分画し、予めBamHIで切断し、脱リン酸化したpBluescript II SK+(Stratagene)にサブクローン化した。これらのクローンから得た配列をプライマーL2838−前部の設計の基本として使用し、それを縮重バドナＴプライマーと組合わせて(Lockhart and Olszewski in Breeding Bananas and Plantain for Resintance to Diseases and Pests，p p．105-113，J．Ganry，ed.，Montpellier，France，CIRAD/INIBAP，1993の引用文献参照)、PCR増幅に使用した。このプライマーの配列は下記である。 PCR混合物(２.５μl １０×PCR緩衝液(Gibco BRL)、０.６２５μl ５０mM MgCl₂溶液、１.１２５μl ２０μM L2838-前部プライマー、２.５μl ４μM バドナＴプライマー、０.５μl １０mM dNTPs、０.２μl Taq DNAポリメラーゼ(Gibco BRL)、１６.５５μl H₂Oおよび１μlの精製バドナウイルスDNAの１：２００希釈を含む)Hybaid OmniGene Thermocycler(Stratagene)中、計画された条件(９４℃ ２分；３５サイクルの９４℃ ０.５分、６２℃ ０.５分、７２℃ ２分)で、製造者の指示に従ってインキュベートした。他のPCR生産物からの電気泳動的分離の後、２kb生産物をpCR-Script SK+(Stratagene)に、製造者の指示に従ってサブクローンした。このクローンをpCRBSV2と名付けた。 Cavendish−タイプ栽培品種WilliamsおよびGoldfinger由来のバドナウイルス粒子を、Ahlawat et al.，Plant Disease 80，590-592(1996)の方法の修飾小規模ウイルス粒子濃度を使用して調整した。薄層組織を、液体窒素中乳鉢と乳棒で粉に挽いた。２容量のミニプレプ(miniprep)抽出緩衝液(０.２Ｍ KH₂PO₄／K₂HP O₄、pH７.０、１５mM EDTA）２％ PVP、２％PEG6000および０.４％ Na₂SO₃含有)を添加した。更に挽いた後、抽出物を４層のチーズクロスで濾過した。次いで、濾液を７,０００rpm(１０,０００×ｇ)で１５分、４℃でSW HS4ローター(So rvall)で遠心し、上清を集めた。上清に、１／１５容量の３３％(v/v)Triton X- 100を添加し、上清を短く振り、次いで、０.２Ｍ KH₂PO₄／K₂HPO₄緩衝液(pH７. ０)中の３０％スクロースの５mlのパッドを通して、４５,０００rpm(２４,０００×ｇ)で４５分、４℃で70Tiローター(Beckman)中で遠心した。ペレットを穏やかに蒸留水で洗浄し、１００μlの０.１Ｍ KH₂PO₄／K₂HPO₄緩衝液(pH７.０)に再懸濁した。３０ml容量のクロロホルムをこの再懸濁液に添加し、混合することにより乳化し、エマルジョンを１３,０００rpmで５分、ベンクトップ微量遠心管で遠心した。上清を取り、アリコートを等量の２％ホスホタングステンカリウム溶液で染色し、電子顕微鏡で試験した。免疫捕獲−PCRを、１μg／mlの濃度の５０mM炭酸緩衝液(pH９.６)中の２５μl のサトウキビ桿状ウイルス(ScBV)抗体(Agdia)で被覆した薄壁０.６ml PCR試験管(Quantum)で行った。３時間(Goldfinger単離物に関しては４時間)の室温でのインキュベーション後、試験管を３回(Goldfinger単離物に関しては２回)のPBST (１３７mM NaCl、６.４mM Na₂HPO₄×2H₂O、１.４mM KH₂PO₄、pH７.４、０.１％トゥイン２０(Sigma)含有)とのヴォルテックス処理により洗浄した。２５μl の濃縮ウイルス抽出物の添加後、試験管を３時間、室温(Goldfinger単離物に関しては４℃で一晩)インキュベーションし、次いで３回PBSTで、１回H₂Oで洗浄し、それをPCR前に除去した。縮重プライマーバドナＴおよびバドナ３(Lockha rtおよびOlszewski，前掲)をPCR増幅に使用した。バドナ３の配列は下記である。 PCR混合物(Williams単離物に関しては５μl緩衝液Ａ(Gibco BRL)、５μl緩衝液Ｂ(Gibco BRL)、５μl ４μM バドナ３プライマー、５μl ４μM バドナＴプライマー、２.５μl １mM dNTPs、２μl Elongase(Gibco BRL)および２５.５μl H₂OおよびGoldfinger単離物に関しては２.５μl １０×PCR緩衝液(G ibco BRL)、０.７５μl ５０mM MgCl₂、２.５μl ４μM バドナ３プライマー、２.５μl ４μM バドナＴプライマー、１.２５μl １mM dNTPs、０.４ μl Taqポリメラーゼ(Gibco BRL、５単位／μl)および１５.１μl H₂O含有)を、免疫捕獲したウイルス粒子を含む試験管に添加し、２０μl鉱物油と重層し、計画された条件(４サイクルの９４℃ ０.５分、３７℃ ０.５分、７２℃２分および３０サイクルの９４℃ ０.５分、５５℃ ０.５分、７２℃ ２分）で、 Hybaid OmniGene Thermocycler(Stratagene)で製造者の指示に従ってインキュベートした。他のPCR生産物からの電気泳動単離後、１.３kb生産物をPCR2.1(Invit rogen)に、製造者の指示に従ってサブクローンした。これらのクローンをpCRBSV Cv(Williams単離物)およびPCRGF2(Goldfinger単離物)と名付けた。配列決定は、最初に、プライマーおよびベクターに存在するプライマー部位で行い、後者は、FS Terminator Premix(PRISM Ready Reaction DyeDeoxy Termina tor Cycle Sequencing Kit，Applied Biosystems)およびAutomated DNA Sequenc er(Applied Biosystems)を使用して得た。全ての３つのPCR生産物の完全長配列を得、Austrarlian National Genomic Information Service(ANGIS)プログラムパッケージを使用して、バドナウイルス配列として同定した。PCR生産物の完全配列を、配列番号１、配列番号２および配列番号３に記載する。３個の配列全てバドナウイルスORF３のコード領域を、３'末端(各々ヌクレオチド１−１５３７、１−８４９および１−８５８)に、および非コード領域を５'末端(各々ヌクレオチド１５３８−２１０５、８５０−１３２２および８５９−１２９７) に含む。非コード領域の３'末端を更にプロモーター配列要素と、下記実施例５に詳述するように分析した。実施例２キメラ遺伝子の構築数個の構築物を、図１に記載のようなGUSまたはGFPのいずれかをコードするレポーター遺伝子との融合において、上記PCR生産物をプロモーターとして使用して製造した。 pUbiGUSは、微粒子銃またはPEG−介在形質転換法を使用した植物細胞形質転換のプロモーター−レポーターカセットの構築物の基本として使用した(図１Ａ)。 pUbiGUSはメイズユビキチンプロモーター(Christensen et al.，Plant Mol．Bio l．18，675-689[1992];Chrintensen and Quail，Transgen．Res．5，213-218[19 96])、GUSレポーター遺伝子(Jefferson et al.，EMBO J．6，3901-3907[1987]) およびAgrobacterium tumefaciens由来のノパリンシンターゼ(nos)ターミネーター配列をpUC118中に含む。 pMyGUSは、Mysore(３'末端にBadnaTプライマー)由来のバドナウイルスPCRフラグメントを、メイズユビキチンプロモーターの代わりに含む(図１Ｂ)。それは、 pCRBSV2由来の平滑末端BamHI／NotI切断２kbフラグメントを、pUbiGUSの平滑末端脱リン酸化BamHI／HindIII切断４.８kbフラグメントにライゲートすることにより構築した。 pCvGUSは、Williams(３'末端にBadnaTプライマー)由来のバドナウイルスPCRフラグメントを、メイズユビキチンプロモーターの代わりに含む(図１Ｃ)。それは、pCRBSVCv由来の平滑末端BamHI／NotI切断１.３kbフラグメントを、pUbiGUSの平滑末端脱リン酸化BamHI／HindIII切断４.８kbフラグメントにライゲートすることにより構築した。加えて、pUbiGFPを微粒子銃またはPEG−介在形質転換法を使用した植物細胞形質転換のプロモーター−レポーターカセットの構築物の基本として使用した(図１Ｄ)。pUbiGFPは、メイズユビキチンプロモーター、修飾GFPレポーター遺伝子 (sGFP(S65T);Chiu et al.，Current Biol．6，325-30[1996])およびノパリンシンターゼ(nos)ターミネーターを含む。 pMyGFPはMysore(３'末端にBadnaTプライマー)由来のバドナウイルスPCR生産物を、メイズユビキチンプロモーターの代わりに含む(図１Ｅ)。それは、pCRBSV2 由来の平滑末端BamHI切断２kbフラグメントを、pUbiGFPの平滑末端脱リン酸化Xb aI切断４.２kbフラグメントにライゲートすることにより構築した。 pCvGFPは、Williams(３'末端にBadnaTプライマー)由来のバドナウイルスPCR生産物を、メイズユビキチンプロモーターの代わりに含む(図１Ｆ)。それは、pCRB SVCv由来の平滑末端Xbal／BamHI切断１.３kbフラグメントを、pUbiGFPの平滑末端脱リン酸化XbaI／BamHI切断４.８kbフラグメントにライゲートすることにより構築した。 pGoGFPは、Goldfinger(３'末端にBadnaTプライマー)由来のバドナウイルスPCR 生産物を、メイズユビキチンプロモーターの代わりに含む(図１Ｇ)。それは、pC RGF2由来のEcoRV／BamHI切断１.３kbフラグメントを、pCvGFPのEcoRV／BamHI切断４.８kbフラグメントにライゲートすることにより構築した。更に、pBIN-mGFP5-ERおよびpArt27/35SGUSを、Agrobacterium−介在植物形質転換のプロモーター−レポーターカセットの構築の基本として使用した(各々図１Ｈおよび図１Ｉ）。pBIN-mgfp5-ER(MRC Laboratory of Molecular Biology，A ddenbrookes Hospital，Cambridge，UKのJ．Haseloff博士から寄贈)は、カリフラワーモザイクウイルス35Sプロモーター、GFPレポーター遺伝子mgfp5-ERのER− 標的化変異バージョンおよびnosターミネーターを含む。pArt27/35SGUSは、カリフラワーモザイクウイルス35Sプロモーター(Odell et al.，Nature 313，810-81 2[1985])、GUSレポーター遺伝子およびnosターミネーターをpArt27中に含む(Gle ave，Plant Mol．Biol．20，1203-1207[1992])。pArtUbiGUSは、メイズユビキチンプロモーターを、pArt27/35SGUSの35Sプロモーターの代わりに含む(図１Ｊ)。 pArtMyGUSは、Mysore(３'末端にBadnaTプライマー)由来のPCRフラグメントを、35Sプロモーターまたはメイズユビキチンプロモーターの代わりに含む(図１Ｋ )。それは、pMyGFP由来のHindIII/BamHI切断１.６kbフラグメントを、pArtUbiGU S由来のHindIII−および一部BamHI切断１３kbフラグメントにライゲートすることにより構築した。 pCvmGFP5-ERは、Williams(３'末端にBadnaTプライマー)由来のPCRフラグメントを、35Sプロモーター代わりに含む(図１Ｌ)。それは、pCvGFP由来のEcoRV/Bam HI切断１.３kbフラグメントを、pBIN-mgfp5-ER由来のHindIII(平滑末端)／BamHI 切断１３kbフラグメントにライゲートすることにより構築した。全てのプラスミドDNAは、Qiaprep Spin Miniprep Kit(Qiagen)を使用して、Es cherichia Coli DH5aから調整した。キメラ遺伝子構築物は、この目的で開発し、最適化されたインビボ一過性および安定発現系を使用して、プロモーター活性の評価に有用であることが判明した。実施例３一過性条件下での植物細胞内でのプロモーター活性のアッセイ数個のインビボ試験系が、一過性条件下での実施例２のプロモーター−レポーター遺伝子構築物のアッセイに利用可能であった。これらのシステムは：１)GUSアッセイを使用した単子葉種(バナナ、メイズ、キビ、モロコシ)、双子葉種(タバコ、キャノーラ、Nicotiana benthamiana、Tipuana tipu)、裸子植物(Pinus radiata)およびシダ(Nephrolepis cordifolia)の葉および他の植物器官への微粒子銃遺伝子移入；２)GFPアッセイを使用したメイズ葉およびサトウキビカルスへの微粒子銃遺伝子移入；および３)内部標準との比較GUSアッセイを使用したメイズ葉への微粒子銃遺伝子移入であった。以下の方法を上記の最初の試験系に使用した。メイズ(スウィートコーン、栽培品種Iochief Improved)、バナナ(栽培品種Wil liams)、キビ、モロコシおよびN．benthamiana葉を温室栽培植物から切り、３− ４cm長さの切片に細分した。これらを塩素溶液(０.１ NaOCl、０.１％トウイン２０)で３０分、穏やかに撹拌しながら表面滅菌した。続いて、それらを滅菌脱イオン水で濯ぎ、背軸側を上に滅菌“高塩MS”培地(Murashige and Skoog， Physiologia Plantarum 15，473-497[1962]に従ったMS−培地、０.２Ｍマンニトールおよび０.２Ｍソルビトール含有)を含むペトリ皿に、５時間置き、細胞膨張を減少させた。微粒子銃のために、葉片をマンニトールおよびソルビトール無しの上記MS培地に向軸側を上にして移した。直径１.６μmの金粒子を、DNAの担体として使用した。これらを、７０％エタノールで洗浄し、３分ボルテックス処理し、１５分インキュベートし、３０秒の遠心後液体を除去することにより調整した。以下の段階を３回繰り替えした：粒子を脱イオン滅菌水に再懸濁し、１分ボルテックス処理し、１分インキュベートし、微量遠心管中３０秒遠心することによりペレット化した。続いて、金粒子を滅菌５０％(v/v)グリセロールに６０mg／mlの濃度で再懸濁し、使用前に５分ボルテックス処理した。使用した各プラスミド構築物(pMyGUS、pCvGUSおよびpUbiGUS；実施例２)に関して、４つのDNA誘導体のセットを調整した：５０μlの金粒子を滅菌１.５ml試験管に移し、更に２.５分、激しくボルテックス処理した。試験管のボルテックス処理を続けながら、１０μl DNA(０.５μg／μl)、５０μl滅菌２.５ＭCaCl₂ 溶液および２０μl ０.１Ｍスペルミジン溶液(滅菌し、２０μlアリコートで、 −７０℃で使用前貯蔵)をこの順序で添加した。混合物を更に２分ボルテックス処理し、１分インキュベートし、１０秒の遠心によりペレット化した。ペレットを１４０μl ７０％エタノールおよび１４０μl １００％エタノールで、ペレットをかき乱すことなく洗浄し、５０μl １００％エタノールに穏やかに再懸濁し、その後、滅菌マクロキャリアープラスチックディスクに１０μl部づつに均等に等分し、それを続いてデシケーターで乾燥させた。マクロキャリアーを破裂板から４cmの距離に置き、調整した葉を、PDS-1000/He Biolistic Particle D elivery System(BioRad)中のマクロキャリアーから８cmに置き、それを９００ps iおよび１,５５０psiの間の圧力を使用して、Sandford et al.，Meth．Enzymol ．217:483-509(1993)およびHeiser，BioRad US/EG Bulletin 1688(1993)に記載の方法に従ってDNA送達に使用した。タバコ(栽培品種Xanthi)、キャノーラ、チプ・ツリー(Tipuana tipu)、松の木 (Pinusradiata)およびフィッシュボーン・シダ(Nephroleis cordifolia)の葉および他の植物器官を、University of Queensland，St．Lucia，Australiaの温室、生育棚および観賞用庭で生育させた植物から新たに切った。全ての植物材料は、予め湿らせた円形濾紙を含むペトリ皿に向軸側を上に置いた。金粒子の調整、金粒子へのDNAのコーティングおよび微粒子銃は、注文製ヘリウム圧駆動粒子流入銃を使用して、Finer et al．(Plant Cell Rep．11:323-328 [1992])の修飾法に従って行った：６０mg金粒子を、１mL ７０％エタノールに２分再懸濁し、続いて、１０秒、微量遠心管中で回転させて洗浄し、脱イオン水に再懸濁した。ストック(室温で６−８週間貯蔵すべき)を、１０秒の遠心および金粒子の５００μL ５０％(v/v)グリセロール溶液への再懸濁により調整した。微粒子銃に使用すべき各構築物に関して、金粒子を激しく再懸濁し、５０μLを新しい試験管に移し、更に１分ボルテックス処理した。ボルテックス処理中、新たに調整したプラスミドDNA(Qiaprep Mini spin kit)を５μL(０.２５μg／μL) GUS−構築物、５０μL ２.５Ｍ CaCl₂溶液および２０μL ０.１Ｍスペルミジン溶液を含む混合物として添加した。更に１分ボルテックス処理後、粒子を５− １０分静置させ、次いで、５秒遠心した。過剰な上清を除去し、粒子を２０μL の上清に再懸濁した。ボルテックス処理中、３μLを各砲撃のために取出し、３m m Swinneyプラスチックシリンジフィルターホルダー(Gelman Sciences)の中心に置いた。植物材料を１８cmの距離で、７バール(１００psi)のヘリウム駆動圧およびチャンバー中の−０.８５バール(−８５kPa)の陰圧を使用して、砲撃した。砲撃後、全ての植物材料を生育棚(２５℃、照明１６時間)に４８時間保ち、その後、３７℃で１２時間のインキュベーションのためにX-Gluc-溶液(５０ml／ｌ DMSOに溶解した１.２５ｇ／ｌ５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β −Ｄグルクロン酸)、５mMフェリシアン化物、５mMフェロシアン化物、０.３％(v /v)トリトンＸ−１００、１０％(v/v)メタノール、１０mM EDTA(pH８.０)、０. １Ｍリン酸ナトリウム緩衝液pH７.０)に保った。青色スポットの数およびサイズで測定したGUS活性は、プロモーター活性のインディケーターとして使用した。青色GUSスポットは、本図に提供した写真の白黒複写では黒いスポットとして見える。数セットの実験を、各々プロモーター− レポーター構築物pMyGUSおよびpCvGUSを使用して行った。比較のために、pUbiGU Sを単子葉に包含させ、pBI221(CaMV 35Sプロモーター、GUSレポーター遺伝子およびnosプロモーターを含む一般に使用される植物形質転換ベクター、Stratagen e)を双子葉、裸子植物およびシダ植物材料に包含させた。単子葉の一過性形質転換実験およびGUSアッセイで使用した全ての３つのプロモーター(pMy、pCvおよびpUbi)は、メイズ、バナナ、キビおよびモロコシの葉で明らかなプロモーター活性を示すが、無プロモーターGUS構築物またはDNA無しを使用した対象実験では、活性は示されない。例として、図２はpMyGUS(図２Ａ)、 pCvGUS(図２Ｂ)およびpUbiGUS(図２Ｃ)で、１５５０psiの圧で砲撃したメイズ葉の典型的例を示す。同様に、双子葉、裸子植物およびシダ種の一過性形質転換実験およびGUSアッセイで使用した全ての３つのプロモーター(pMy、pCvおよびp35S )は、試験した植物器官で明らかなプロモーター活性を示した。それらは、タバコ、N．benthamiana、チプ・ツリーおよびフィッシュボーン・シダの葉、キャノーラの葉および幹、およびPinus radiataの幹および雄花序の花弁であった。例として、図３は、pMyGUS(各々図３Ａ、図３Ｄおよび図３Ｇ)、pCvGUS(各々図３Ｂ、図３Ｅおよび図３Ｈ)およびpBI221(各々図３Ｃ、図３Ｆおよび図３１)で砲撃したキャノーラ、タバコおよびチプ・ツリーの双子葉の結果を記載する。図４は、pMyGUS(各々図４Ａおよび図４Ｄ)、pCvGUS(各々図４Ｂおよび図４Ｅ)および pBI221(図４Ｃおよび図４Ｆ)で砲撃したPinus radiataの雄花序の花弁およびフィッシュボーン・シダの葉の典型的結果を記載する。構築物であるpMyGUSおよび pCvGUSでの形質転換により産生された青色スポットの数および強度は、配列番号１および配列番号２が全ての試験した種で明らかなプロモーター活性を示すことを証明した。以下の方法を上記の第２の試験系に使用した。メイズ葉を、上記の粒子流入銃を使用したpGoGFPでの微粒子銃に使用した。砲撃２４時間後のGFP発現の可視化は、GFP Plusフィルターセットを備えたLeica M Z6立体顕微鏡の蛍光モジユール(Leica Microscopy and Scientific Instruments ，Switzerland)を使用して達成した。緑色蛍光細胞の検出をプロモーター活性のインディケーターとして使用した。緑色蛍光細胞は、写真の白黒複写では白色として見える。図２Ｄに示す結果は、配列番号３がメイズ葉において一過性条件下でプロモーター活性を有することを証明した。胚形成サトウキビカルスを、頂端分裂組織の丁度上から１０cm領域中から取った若い葉組織で開始した(Taylor et al.，Plant CellTissue Organ Cult．28，6 9-78[1992])。カルスを、MS塩およびビタミン(Sigma)、０.５ｇ／ｌカゼイン加水分解物(Gibco Peptone 140)、２０ｇ／ｌスクロース、１０％v/vココナッツ水、3mg／ｌ２，４−Ｄ、pH６.０から成り、０.８％寒天で固化した培地(MSC3) で誘導する(Grade J，Davis)。カルスを３０℃で、１４日毎に規則的な継代をしながら継続的な暗所下誘導し、６週間の選択継代が必要であった。微粒子銃砲撃を、粒子流入銃(Finer et al.，Plant Cell Rep．11，323-328[1 992])を、２，１００kPaガス放出圧、２８mmHg真空および０.５msecガス放出間隔で使用して行った。プラスミドDNAをタングステン粒子(M10、Sylvania Chemic als)に沈殿させ、７cmの中心領域中の５−１０mm直径の個々のカルスの砲撃を先述のような浸透性(osmoticum)培地上で行った(Bower et al.，Mol．Breeding 2 ，239-249[1996])。５μg量のpMyGFP、pCvGFPまたはpUbiGFP(実施例２)を、各々５μgのpEmuKN(Ch amberlain et al.，Aust．J．Plant Physiol．21，95-112[1994])と微粒子銃砲撃のために使用し、サトウキビカルス中のプロモーター活性を評価し、カナマイシン選択(実施例４参照)下のトランスジェニックカルスの再生を可能にした。サトウキビ組織中のGFP発現を、上記の蛍光顕微鏡を使用した砲撃後に、２日および７日ならびに２ヶ月および１２ヶ月に可視化した(実施例４の安定発現の結果) 。図５は、蛍光顕微鏡下、砲撃２日後にpMyGFP(図５Ａ)、pCvGFP(図５Ｂ)および pUbiGFP(図５Ｃ)で砲撃したサトウキビカルスを撮った写真である。全３つの構築物pMyGFP、pCvGFPおよびpUbiGFPの蛍光スポットの数および強度は、両方の新規プロモーター(pMyおよびpCv)が一過性プロモーター活性をサトウキビカルスで示すことを証明した。以下の方法を上記の第３の試験系で使用した。一過性形質転換条件下でのpMyおよびpCvの４つの他の既知のプロモーターとの比較を、粒子砲撃中の内部標準として、構築物pUbiGFPを使用したメイズ葉で行った。内部標準の使用は、各砲撃の効果のモニターとして働き、一過性遺伝子発現アッセイでしばしば観察される高い可変性の補正をする。メイズ葉(スイートコーン、栽培品種Iochief Improved)を調整し、上記のように微粒子銃に使用した。比較に使用した４つのプロモーター−GUS構築物は、pBI 221、pMG221、pUbiGUSおよびpACT1-Dであり、各々、uidA遺伝子およびnosターミネーターに融合したカリフラワーモザイクウイルスの35Sプロモーター(Mitsuhar a et al.，Plant Cell Physiol．37:49-59[1996])、メイズシュルンケン−１遺伝子由来の３'エクソン／イントロン挿入を有する促進された35Sプロモーター(M ass et al.，Plant Mol．Biol．16:199-207[1991])、メイズポリユビキチンプロモーター(Christensen and Quail，1996，前掲)およびコメアクチンＩ遺伝子プロモーター(McElroy et al.，Plant Cell 2:163-171[1990])を各々を含む。各実験に関して、一連の４つのDNA送達物は、上記のように、構築物pBI221、pMG221 、pUbiGUS、pACT1-D、pMyGUSおよびpCvGUSの各々に関して、０.５μL(０.２５μ g／μL)pUbiGFPを内部標準として包含させる修飾をして、調整した。４８時間後、GFPを産生する細胞の数を、蛍光立体顕微鏡下、各構築物の全葉で測定した。続いて、全ての葉を、上記のようにX-gluc染色溶液中でインキュベートし、GUS 産生スポットの数を各構築物で測定した。標準化活性の値は、GUS−産生スポットの数を、GFP産生細胞の数で割ることにより得た(図６)。全ての値を、pBI221 で得た値に対して標準化した。図６に要約する結果は、メイズ葉で一過性条件下でpMyおよびpCvで得た活性が、単子葉植物で高レベル遺伝子発現に関して先に使用されているプロモーターの範囲内であることを示す：pMyはp35Sより１.５倍高いそして、pUbiの約半分の一過性活性を導く；一方、pCvはp35Sより３倍高いおよびpUbiと殆ど同じ活性を導く。実施例３の結果は、配列番号１、配列番号２および配列番号３が各々活性プロモーターとしてインビボで働くことを示す。結果は、更に、配列番号１および配列番号２のプロモーターが、一過性条件下で強く発現され、それらが植物での遺伝子発現および遺伝子工学の有効なツールを提供できることを証明する。実施例４安定条件下での植物細胞内でのプロモーター活性のアッセイ数個のインビボ試験系が、植物細胞での安定発現の条件下での実施例２のプロモーター−レポーター遺伝子構築物のアッセイに利用可能であった。これらのシステムは：１)３０日以後のGFPアッセイを使用したサトウキビおよびタバコカルスへの微粒子銃遺伝子移入；２)形質転換および再生植物のGUSおよびGFPアッセイ(バナナ、サトウキビ)；３)トランスジェニックサトウキビにおけるGFPの半定量的比較ウエスタンブロット分析；および４)トランスジェニックバナナ植物の異なる器官の定量的比較GUS活性アッセイであった。上記試験系(１)を使用して、実施例３に記載のサトウキビ形質転換法を、以下に記載する方法で使用した。砲撃後、サトウキビカルスを４０μg／ｌゲネチシン(Sigma)を含む選択的カルス誘導培地(MSC3)においた。GFP活性を、実施例３に記載の方法を使用して、砲撃後２ヶ月追跡した。緑色蛍光は、写真の白黒複写では灰色に見える。図７は、pMyGFP(図７Ａ)、pCvGFP(図７Ｂ)およびpUbiGFP(図７Ｃ)で砲撃したサトウキビカルスを、砲撃２ヶ月後蛍光顕微鏡下で撮った写真である。両方の構築物pMyGFPおよびpCvGFPの蛍光カルスの強度は、pUbiGFPで産生ものと同等であり、両方の新規プロモーターがメイズユビキチンプロモーターよりも、サトウキビで類似の安定な活性を示すことを示唆する。上記試験系(１)を使用して、トランスジェニックタバコカルスおよび苗木を、 Ellis et al．(EMBO J．6:11-16[1987])に記載の方法に従って、バイナリーベクターpBIN-mgfp5-ER、pArtMyGUSまたはpCvmGFP5-ERを含むAgrobacterium tumefac iens株LBA4401を使用して製造した。蛍光顕微鏡を、pBIN-mgfp5-ERおよびpCvmGF P5-ERで形質転換したカルスおよび根を形成するトランスジェニック芽の分析に使用した。図８は、pCvmGFP5-ER(各々図８Ａおよび８Ｃ)およびpBIN-mgfp5-ER( 図８Ｂおよび図８Ｄ)で形質転換したおよび非形質転換カルス(図８Ｅ) タバコカルスおよび根の結果を記載する。タバコ植物内のプロモーター活性の定量は得られていないが、結果は、pCvが双子葉植物の形質転換に有用である可能性を示唆する。上記試験系(２)を使用して、トランスジェニックサトウキビおよびバナナ植物を産生し、それはレポーター遺伝子との融合でプロモーターpMy、pCvおよびpUbi を含む。上記のように、６回の砲撃からpMyGFPで形質転換した４０個の独立したサトウキビカルスを、１２５本のサトウキビ植物の再生に使用し、それを２１個の独立した系に分類した。５回の砲撃からpCvGFPで形質転換した７２個の独立したサトウキビカルスを、１０９本のサトウキビ植物の再生に使用し、それを１８個の独立した系に分類した。比較のために、１２回の砲撃からpUbiGFPで形質転換した４０個の独立したサトウキビカルスを、３７本のサトウキビ植物の再生に使用し、それは１６の独立した系起源であった。GFP蛍光をトランスジェニック細胞の同定およびそれらの独立した状態の確立に使用した。植物をガラス温室施設中の鉢に移し、植物の高さが７０−１２０cmに到達するまで生育させた(形質転換後１２ヶ月)。GFPレポーター遺伝子に融合したpMyおよびpCvの存在を確認するために、pMyGFPおよびpCvGFPで形質転換した数個の植物をDNA抽出のために選択し、プロモーター領域の一部およびGFPレポーター遺伝子の両方をカバーするプライマーを使用してPCR分析した。全植物DNAを、Chang et al.，Plant Mol．Biol．R ep．9:389-410(1993)の方法に従って、サトウキビ葉から単離した(各２００mg) 。 GFPレポーター遺伝子に融合したpMyプロモーターの存在を、プライマーpMyA(配列番号７：５'−AGAGGCGCCCCTGGTATTGG−３')を使用したpMyGFPで形質転換した植物由来の葉抽出物のPCRで確認し、GFP-B(配列番号８；５'−AGATGGTGCGCTCCTG GACG−３')を約６５０bpのフラグメントの増幅に使用した。GFPレポーター遺伝子に融合したpCvプロモーターの存在を、pCvGFPで形質転換した植物由来の葉のプライマーCvA(配列番号９；５'−CCTAACGATGCGGGAAGCCG−３')および約５５０b pのフラグメントの増幅に使用したGFP-BとのPCRにより確認した。非形質転換植物由来の抽出物は陰性コントロールとして働いた。全てのプライマーは、Pacifi c Oligos，Lismore，Australiaにより合成された。分析した全植物のPCR産物は、DNAゲル電気泳動で予期されるバンドサイズを示したが、一方陰性コントロールはバンドを示さなかった(データは示していない)。 GFP産生を評価するために、各トランスジェニック由来の数本のサトウキビ植物の最も若い葉を、上記のように立体蛍光顕微鏡下で分析した。葉のGFPの量を、０から５の範囲の相対的数の割り当て(０は検出可能なGFPが存在しないおよび５は最大レベルのGFP産生)により評価した。加えて、根材料を、選択した植物から分析した(データは示していない)。pMyGFPで形質転換した植物の相対的数は０ −２の範囲であり、一方、pCvGFPまたはpUbiGFPで形質転換した植物は、０−５の範囲の数で、葉においてより強いGFPの存在を示す。図９は、pMyGFP(各々図９Ａおよび図９Ｄ)、pCvGFP(各々図９Ｂおよび図９Ｅ)、pUbiGFP(図９Ｃ、葉のみ) で形質転換したサトウキビ植物の葉および根、および非形質転換コントロール植物(図９Ｆ)の葉の蛍光顕微鏡下で撮った写真の複写を示す。pMyGFPで形質転換した植物は、通常、管状葉組織の周りで最強の発現を示すが、一方pCvGFPまたはpU biGFPで形質転換したサトウキビ植物の葉は、典型的に分析した全細胞を通して構造的発現を示した。プロモーターの傷誘導性を、pMyGFP、pCvGFPおよびpUbiGF Pで形質転換したサトウキビ植物および非形質転換植物の傷ついた葉で、金属鯨毛(５４／cm²)で試験した。４８時間後に行ったGFP蛍光の評価は、pCvGFPおよび pUbiGFPで形質転換した葉の傷害領域の周りの増加したGFP産生を示したが、一方、pMyGFPで形質転換した葉または非形質転換葉で、蛍光の増加は観察されなかった。図９Ｉは、pCvGFPで形質転換したサトウキビ植物由来の、損傷４８時間後の葉の部分を記載する。異なる葉細胞層のより詳細な研究を、Biorad MRC600光源および４８８nmの励起の適当なフィルターを備えた共焦顕微鏡(Zeiss)で、５０９nmで測定した放出を使用して行った。図１０は、pMyGFP(図１０Ａ)、pCvGFP(図１０Ｂ)、pUbiGFP( 図１０Ｃ)で形質転換した植物および非形質転換植物(図１０Ｄ)由来の向軸側を上に向けたサトウキビ葉の９μm距離での９連続スキャンの重ね合わせたＺシリーズのデジタルイメージを示す。シンプラストの全ての細胞タイプが、GFPの存在を示すことが観察され、試験したプロモーターの殆ど構造的な発現を示す。先に観察されたように、最強GFP蛍光はpCvGFPで、続いてpUbiGFPおよび pMyGFPで形質転換したサトウキビ葉で観察されるが、一方後者の構築物は管状組織を囲むもの以外の細胞で低い発現を導いた(図１０)。図１１は、pCvGFPで形質転換した葉に関する図１０Ｂで示したＺシリーズの３つの重ね合わせたイメージの２つのセットを記載する。図１１Ａは、表皮を含む上部細胞層の殆どをカバーし、一方図１１Ｂは、管状管束を通った切片を、その回りの細胞と共に示す。核へのGFPの蓄積は、ある細胞では顕著であった。al.，(1995，前掲)に記載の方法に従って、組織培養中で製造した。pAct-neoキメラ遺伝子構築物とpMyGUSおよびpCvGUSとのバナナ胚形成カルスへの共砲撃後、６５本および６１本のゲネチシン耐性植物が各々再生された。植物を続いて微細繁殖を使用してインビトロで増幅させた。 GUSレポーター遺伝子に融合したpMyおよびpCvの存在を確認するために、GUS発現を示すpMyGUSおよびpCvGUSで形質転換した数個のバナナ植物を、DNA抽出のために選択し、プロモーター領域の一部およびレポーター遺伝子の一部の両方をカバーするプライマーを使用してPCR分析した。全DNAを、Dellaporta et al.，(Pl ant Mol．Biol．Rep．1:19-21[1983])の修飾法に従って、バナナ葉から単離した。簡単に、３０−１００mgの葉または根組織を５００μlの抽出緩衝液(１００mM トリス−HCl、pH８.０；５０mM EDTA、pH８.０；５００mM NaCl；１０mM β−メルカプトエタノール；２％ポリビニルピロリドン、MW＝１０,０００)と、１.５mlマイクロチューブ中で挽いた。３３μlの２０％SDS溶液の添加後、混合物をボルテックス処理し、１０分、６５℃でインキュベートした。続いて、１６０μlの５Ｍ酢酸カリウム溶液(pH５.２)を添加し、試験管をボルテックス処理し、微量遠心管中で、１０分、１３,０００rpmで遠心した。無残骸上清を新しい試験管に移した後、DNAを等量のイソプロパノールを添加することにより沈殿させ、ボルテックス処理し、１０分、１３,０００rpmで遠心した。ペレットを７０％ (v/v)エタノール中で注意深く洗浄し、２０−２５分、層流空気流に試験管の開放部を向けることにより空気乾燥し、その後２０μlの滅菌脱イオン水に再懸濁した。 GUSレポーター遺伝子に融合したpMyプロモーターの存在を、pMyGUSで形質転換した植物由来の葉抽出物の、約４５０bpのフラグメントを増幅するためのプライマーpMyA(配列番号７)およびプライマーGUSIR(配列番号１０；５'−CTT GTA ACG CGC TTT CCC ACC−３')を使用したPCRにより確認した。GFPレポーター遺伝子に融合したpCvプロモーターの存在を、pCvGUSで形質転換した植物由来の葉抽出物の約３５０bpのフラグメントを増幅するためのプライマーCvA(配列番号９)およびGUSIRを使用したPCRにより確認した。全てのプライマーを、Eurogenetec(Sera ing，Belgium)により商業的に合成した。非形質転換植物由来の抽出物は、陰性コントロールとして働いた。分析した全植物のPCR生産物は、DNAゲル電気泳動で予期されたバンドサイズを示したが、陰性コントロールはバンドを示さなかった（データは示していない）。 pMyGUSで形質転換した２５個のトランスジェニック系およびpCvGUSDで形質転換した３０個の植物系を無作為に選択し、組織学的GUS染色によるスクリーニングに付した。GUS染色は、写真の白黒複写では暗色部分として見える。これらの結果を元にして、１５個および１２個の各々の系をより詳細なGUSアッセイのために選択し、器官および組織特異的発現を測定した。結果の要約は下記である。一般に、バナナ植物の二つのグループが、両方の構築物で見られた；同じ組織特性の“弱いエクスプレッサー(expressors)”および“高いエクスプレッサー”。強いエクスプレッサーにおいて、反応はX-Gluc染色(１００mM トリス−HCl、pH ８.０；１０mM EDTA、pH８.０；０.５mM Ｋ−フェリシアン化物；０.５mM Ｋ −フェロシアン化物；１％アスコルビン酸；０.１％ X-Gluc[５−ブロモ−４− クロロ−３−インドリル−β−Ｄグルクロニド]；０.２％SDS)の２０−３０分内に見ることができるが、一方弱いエクスプレッサーにおいて、最初の発色の発現は遅く(２−３時間)、相対的強度は、高いエクスプレッサーが到達するものにめったに到達しない。pMyGUSで形質転換した１５系のうち、約６０％が高エクスプレッサーとして見なされるが、pCvGUSで形質転換した１２系のうち３０％が強い GUS−染色を示した。図１２および図１３は、pMyGUSまたはpCvGUSで各々形質転換したバナナ植物および非形質転換コントロール植物(図１３Ｇ、図１３Ｈおよび図１３Ｉ)の異なるバナナ植物のX-gluc染色組織タイプの長手方向および横断面を記載する。両方の構築物は同じ組織特異性を導いた。染色強度は、芽(図１２Ｄおよび図１３Ｄ)および根頂端分裂組織(図１２Ｆおよび図１３Ｅ)の両方で最強であり、根の管状組織(図１２Ｆおよび図１３Ｆ)、根茎(図１２Ｅ,図１２Ｆおよび図１３Ｅ)および葉柄および擬似茎(pseudostem)(図１２Ｂ、図１２Ｃ、図１３Ｂおよび図１３Ｃ)で優勢であった。葉の上部領域の染色強度は通常弱く(図１２Ａおよび図１３Ａ)、ある場合、染色中の差異的基質取り込みによりもたらされると考えられていなかった寄せ集め染色パターンを示した。バナナ植物での構造タイプ発現が両方のプロモーターで観察されるが、ある系はまた恐らく遺伝掲）によりpAHC27(pUbi、GUSレポーター遺伝子およびnosターミネーターを含むプラスミド；Christensen and Quail，前掲)で形質転換したコントロール植物は、類似の殆ど構造的な染色パターンを示した(データは示していない)。X-Gluc染色溶液中、２４時間インキュベートした非形質転換バナナ植物の葉、擬似茎および根分裂組織は、GUS活性を示さなかった(各々図１３Ｇ)図１３Ｈおよび図１３Ｉ)。この明茶色は写真の白黒複写では灰色に見える。上記試験系(３)を使用して、半定量的ウエスタンブロット分析を、上記トランスジェニックサトウキビ植物の葉抽出物で行った。この方法は、トランスジェニック植物の葉で産生されたGFPの定量を基本にした信頼性のあるプロモーター評価を可能にする。上記の蛍光顕微鏡での先の評価に従って、葉で最強GFP産生を示す５個の独立した植物系を各構築物pMyGFP、pCvGFPおよびpUbiGFPで選択した。これらの１５系の各々のもつとも若い葉のタンパク質抽出物を、１５０mgを、５０mM Hepes-KOH、１０mM MgCl₂、1mM EDTA、１mM EGTA、５mM DTT、１mM PMSF、1mM ベンズアミド、１mM ベンズアミジン、５mM Ｅ−アミノカプロン酸、２μMロイペプチン、２μMアンチパイン、0.１％(v/v)トリトンＸ−１００、２％(w/v)ポリビニルポリピロリドン、pH７.５および約０.１gの酸洗浄砂を含む１.５mLの氷冷抽出緩衝液中で挽くことにより得た。ウエスタンブロット分析は、Grof et al．Sugarcane:Research Towards Efficient and Sustainable P roduction（J．R．Wilson，D．M．Hogarth，J．A．Campbell and A．L．Garside 編）pp．124-126;CSIRO Division of Tropical Crops and Pastures，Brisbane( 1996)に記載の方法に従って行った。GFPに対して指向する二つのマウスモノクローナル抗体の混合物を含む商品抗体調整物を、BoehringerMannheim(C at．No．1814 460)から得た。図１３は、pMyGFPとpCvGFP(図１４Ａ)、pMyGFPとp UbiGFP(図１４Ｂ)およびpCvGFPとpUbiGFP(図１４Ｃ)で形質転換した５個の独立した系の葉抽出物を使用した比較免疫ブロットを記載する。各免疫ブロットの第１レーンおよび最後のレーンは、kDaの予備染色万華鏡サイズマーカー(Biorad) および非形質転換植物由来の葉抽出物を各々含む。ある場合、２重バンドが検出された。これは、前駆体の部分的開裂および不完全変性によるものであり得る。図１４に記載の全バンドの相対的比較は、強度がpCvGFPで形質転換したサトウキビ植物で最大であり、pUbiGFPで形質転換した植物およびpMyGFPで形質転換した植物が続く。これらの結果は、上記の蛍光顕微鏡を使用した先の観察と対応し、 pCvがトランスジェニックサトウキビ植物での強い発生に適したプロモーターであることを証明した。pMyは弱い発現を導いたが、サトウキビ植物ではそれにもかかわらず活性であった。上記試験系(４)を使用して、トランスジェニックバナナ植物の異なる器官のGU S活性を、Jefferson(Plant Mol．Biol．Rep．5:387-405[1987])の修飾法に従って蛍光GUSアッセイを使用して定量した。簡単に、２００−３００mgの植物組織を、４００μl GUS抽出緩衝液(５０mMリン酸ナトリウム緩衝液、pH７.０；１０ mM EDTA、pH８.０；１０mM β−メルカプトエタノール；０.１％ラウリルサルコシンナトリウム；０.１％トリトンＸ−１００；２％ポリビニルピロリドン、M W＝１０,０００)中、マイクロチューブ中、滅菌洗浄砂と挽き、それを次いで氷に移し、１０,０００rpmで１０分遠心した。上清を注意深く新しいマイクロチューブに移した。タンパク質濃度をBradfordアッセイ(BioRad Laboratories)で測定した。蛍光酵素GUSアッセイを、５０μlの予め暖めた(３７℃)タンパク質抽出物を、２００μlの予め暖めた(３７℃)MUG−アッセイ緩衝液(２０％(v/v)メタノール含有GUS−抽出緩衝液中の1mM ４−メチルウンベリフェリルβ−Ｄ−グルクロニド(MUG、Sigma))に添加することにより各サンプルで行った。３７℃で１２０分のインキュベーション後、１０μlの連続希釈(２−８０倍)を、マイクロタイタープレートの１９０μlの０.２Ｍ Na₂CO₃溶液に添加し、反応を停止させた。光学密度を、Luminescence Spectrofluorometer(LS 50B，Perkin Elmer)で３６５nmで励起後に４５５nmで測定した。非形質転換植物のタンパク質抽出物を、１０μMから６０μMの範囲の濃度の標準として使用して、GUS抽出緩衝液中のゼロサンプルおよび４−メチルウンベリフェロン(MU、SigmaまたはDuch efa)溶液を使用した。図１５は、pMyGUS(MY1、MY2およびMY3)で形質転換した３個の系、pCvGUS(CV1およびCV2)で形質転換した２個の系およびpAHC27(UBI、平均を示す)で形質転換した２個の系の葉および擬似茎／根茎抽出物で得た結果を要約する(nmol MU／時間およびmgタンパク質で、少なくとも３回の測定の平均を標準偏差バーと共に)。pMyGUSを発現する植物は、pAHC27で形質転換した同等の植物よりも、５から２９倍高いGUS活性を葉で、および３から４倍高い活性を擬似茎／根茎粗組織で導いた。pCvGUSを発現する植物は、pAHC27で形質転換した植物と比較して、４から５倍高いGUS活性を葉で、および同様の活性を擬似茎／根茎粗組織で導いた。非形質転換バナナ植物(NEG)は活性を示さなかった。実施例４の結果は、配列番号１および配列番号２に示す配列が、両方とも安定な条件下でトランスジェニック植物内のプロモーターとして両方とも活性であることを示す。結果は、更に、両方のプロモーターがまた、トランスジェニックサトウキビおよびバナナで、メイズポリユビキチンプロモーターよりも高い割合で強く発現されることを証明した。これらの結果は、配列番号１および配列番号２のプロモーターが、植物での遺伝子発現および遺伝子工学の有効なツールを提供することを確認する。実施例５プロモーターと推定される要素の同定プロモーターと推定される要素を、ANGISプログラムパッケージ、TFSEARCHのプログラムSignal Scanを使用し(Heinemeyer et al.，Nucleic Acids Res．26， 364-370[1998])、コーリモまたはバドナウイルスサブグループの他の植物ウイルスゲノムのプロモーター配列で同定されたプロモーターと推定される要素との比較により同定した(例えば、Chen et al.，J．Virol．70，8411-8421[1996];Verd aguer et al.，Plant Mol．Biol．31，1129-1139[1996];Yin and Beachy，The P lant Journal 7，969-980[1995])。図１６、図１７および図１８は、各々配列番号１、配列番号２および配列番号３のDNA配列で同定されたコアプロモーター領域のプロモーターと推定される要素を記載する。これらの要素は、Ｇ／Ｃに富む領域に囲まれたTATAボックス(TAT A;Breathnach and Chambon，Ann．Rev．Biochem．50，349-383[1981];Bucher，J ．Mol．Biol．212:563-578[1990])、イニシエーター(INI:転写開始部位;O'Shea- Greenfield and Smale，J．Biol．Chem．267，1391-1402[1992]，Bucher［1990 ］前掲)、ウイルスC/EBP(CCAAT／エンハンサー結合タンパク質)部位(C/EBP:Grav es et al.，Cell 44，565-576[1986];Bakker and Parker，Nucl．Acids Res．19 ，1213-1217[1991]，Grange et al.，Nucl．Acids Res．19，131-139[1991]、GA TA結合因子１(GATA-1;Merika and Orkin，Mol．Cell．Biol．13:3999-4010[1993 ])および活性化転写因子(ATF;Rooney et al.，Mol．Cell．Biol．10，5138-5149 [1990])を含む。当業者には、本発明の広い境界線および範囲から逸脱することなく、上記に例示のプロモーターおよびプロモーター含有構築物で、多くの変化をなし得ることは明白である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (71)出願人ザ・ステイト・オブ・クイーンズランド・スルー・イッツ・デパートメント・オブ・プライマリー・インダストリーズオーストラリア4000クイーンズランド州ブリスベーン、アン・ストリート80番、プライマリー・インダストリーズ・ビルディング、コーオペレイティブ・リサーチ・センター・フォー・トロピカル・プラント・パソロジー (71)出願人ザ・ユニバーシティ・オブ・クイーンズランドオーストラリア4067クイーンズランド州セント・ルチア、コーオペレイティブ・リサーチ・センター・フォー・トロピカル・プラント・パソロジー (71)出願人ビューロー・オブ・シュガー・エクスペリメント・ステイションズオーストラリア4068クイーンズランド州インドアルーピリー、マイアーズ・ロード50 番、コーオペレイティブ・リサーチ・センター・フォー・トロピカル・プラント・パソロジー (71)出願人クイーンズランド・ユニバーシティ・オブ・テクノロジーオーストラリア4000クイーンズランド州ブリスベーン、ジョージ・ストリート２番、コーオペレイティブ・リサーチ・センター・フォー・トロピカル・プラント・パソロジー (71)出願人カトリーケ・ウニフェルジテイト・ルーヴェンベルギー、ベー―3000ルーヴェン、ナーメストラート22番 (72)発明者シェンク，ペーア・マルティン・フィリップオーストラリア4105クイーンズランド州テニソン、ランスロット・ストリート76番 (72)発明者シャーギ，ラースローベルギー、ベー―3001ヘフェルレー、ワーフェルセバーン27／12番 (72)発明者レミ，セルジュベルギー、ベー―3910ネールペルト、スターションストラート４番 (72)発明者スウェネン，ロニー・レオンベルギー、ベー―3052ブランデン、バンハーゲストラート73番 (72)発明者ディーツゲン，ラルフ・ジョージオーストラリア4556クイーンズランド州バダーリム、ナイズ・クレセント72番 (72)発明者ギーリング，アンドリュー・デイビッド・ウィリアムオーストラリア4073クイーンズランド州シナモン・パーク、ペッパートゥリー・ストリート28番 (72)発明者マクマイケル，リー・アンオーストラリア4068クイーンズランド州インドアルーピリー、オールメイダ・ストリート44番 (72)発明者トーマス，ジョン・エドウィンオーストラリア4070クイーンズランド州アンステッド、マウント・クロスビー・ロード539番 (72)発明者グロフ，クリストファー・ピーター・レスリーオーストラリア4061クイーンズランド州ザ・ギャップ、チェペン・ストリート３番 (72)発明者エリオット，エイドリアン・ロスオーストラリア4066クイーンズランド州オーチェンフラワー、グライムズ・ストリート26番

Claims

【特許請求の範囲】１．１)配列番号１、配列番号２または配列番号３に定義された配列を有するバドナウイルスからの単離DNA；２)(１)のDNAのウイルス相同物または植物ゲノム由来変異体である単離DNA；３)(１)または(２)の単離DNAのプロモーター活性部分；４)ストリンジェントな条件下で(１)または(２)のDNAとハイブリダイズするDN A；または５)(４)の単離DNAのプロモーター活性部分を含む、植物細胞内で機能的なプロモーター。２．配列番号１のヌクレオチド１５３８−２１０５、配列番号２のヌクレオチド８５０−１３２２または配列番号３のヌクレオチド８５９−１２９７を含む、請求項１記載のプロモーター。３．配列番号１のヌクレオチド１８０６−２１０５、配列番号２のヌクレオチド１０２３−１３２２または配列番号３のヌクレオチド９９８−１２９７を含む、請求項１記載のプロモーター。４．コード配列に操作可能に結合した請求項１記載の少なくとも一つのプロモーターを有する少なくとも一つの遺伝子を含む、DNA構築物。５．少なくとも一つのプロモーターが、配列番号１のヌクレオチド１５３８− ２１０５、配列番号２のヌクレオチド８５０−１３２２または配列番号３のヌクレオチド８５９−１２９７を含む、請求項４記載のDNA構築物。６．少なくとも一つのプロモーターが、配列番号１のヌクレオチド１８０６− ２１０５、配列番号２のヌクレオチド１０２３−１３２２または配列番号３のヌクレオチド９９８−１２９７を含む、請求項４記載のDNA構築物。７．コード配列がRNAまたはポリペプチドをコードする、請求項４記載のDNA構築物。８．１)コード配列に操作可能に結合した請求項１記載の少なくとも一つのプロモーターを有する第１遺伝子；および２)コード配列に操作可能に結合したプロモーターを有する第２遺伝子(該第２遺伝子コード配列の発現生産物は、該第１遺伝子コード配列の発現生産物の活性を調整する) を含む、DNA構築物。９．少なくとも一つのプロモーターが、配列番号１のヌクレオチド１５３８− ２１０５、配列番号２のヌクレオチド８５０−１３２２または配列番号３のヌクレオチド８５９−１２９７を含む、請求項８記載のDNA構築物。１０．少なくとも一つのプロモーターが、配列番号１のヌクレオチド１８０６ −２１０５、配列番号２のヌクレオチド１０２３−１３２２または配列番号３のヌクレオチド９９８−１２９７を含む、請求項８記載のDNA構築物。１１．コード配列がRNAまたはポリペプチドをコードする、請求項８記載のDNA 構築物。１２．請求項４または８に記載のDNA構築物または該構築物のRNA転写物の植物の細胞への挿入を含み、該DNA構築物またはRNA転写体コード配列は該生産物をコードするものである、植物細胞内で生産物を発現させる方法。１３．植物細胞のゲノムが、請求項４または８に記載のDNA構築物を含む、植物細胞。１４．植物が単子葉植物、双子葉植物、裸子植物またはシダである、請求項１３記載の植物細胞。１５．単子葉植物がサトウキビ、バナナ、メイズ、キビまたはモロコシから選択される種である、請求項１４記載の植物細胞。１６．双子葉植物が、タバコ、キャノーラ、チプ・ツリーまたはNicotiana be nthamianaから選択される種である、請求項１４記載の植物細胞。１７．裸子植物がラジアータマツである、請求項１４記載の植物。１８．請求項１３記載の細胞を含む、植物、植物組織または植物の再生物。