CN1348495A

CN1348495A - 棉花曲叶病毒启动子及其应用

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Publication number: CN1348495A
Application number: CN00800617.2A
Authority: CN
Inventors: 朱帧; 谢迎秋; 刘玉乐
Original assignee: Institute of Genetics of CAS
Current assignee: Institute of Genetics and Developmental Biology of CAS
Priority date: 1999-03-22
Filing date: 2000-02-18
Publication date: 2002-05-08
Anticipated expiration: 2020-02-18
Also published as: CN1173035C

Abstract

本发明提供了一种棉花曲叶病毒(CLCuV)双向启动子;一种利用棉花曲叶病毒双向启动子在植物不同组织中高水平表达外源基因的方法;和一种为了提高双向启动子中外壳蛋白基因启动子表达强度的来自CLCuV基因组的AC2蛋白因子。利用本发明的材料和方法可以提高外源基因在植物中的表达。

Description

棉花曲叶病毒启动子及其应用

本发明涉及分离出棉花曲叶病毒启动子，本发明还涉及利用这种启动子在植物中表达外源基因的方法。

现有技术

植物基因工程的根本目标是培育能使目的基因稳定而且高效表达的转基因植株。基因表达受控于转录起始处的核苷酸序列即启动子成分，它主要包括 RNA聚合酶启动转录的信号，以指导合成相应的信使 RNA 分子，进一步指导蛋白质的合成。

目前，已有许多不同来源的启动子被用于转化植物。其中一大类是从根癌农杆菌中分离出来的，另一大类为植物本身来源的启动子，上述启动子控制的目标基因表达量往往较低，或存在植物种属、植物器官、组织特异性。最广泛使用的启动子则来自于植物病毒。花椰菜花叶病毒 35S启动子 (CaMV35S)是双子叶植物转化中最常用的启动子之一，因为它在几乎所有组织中都能使外源基因高效表达。此外，为了提高外源基因的表达水平，通常将各种来源的增强子、顺式调控元件、非转译序列、内含子、外显子、 3 ' 端调控序列等等与启动子联合使用。如来自玉米胚乳蔗糖酶基因的内含子 1在烟草细胞内可使 GUS报道基因表达水平提髙 100倍，玉米胚乳蔗糖酶基因外显子 1的存在能使报道基因在单子叶和双子叶植物中的表达水平提高 10倍 (C. Mass等, 1991 , The combination of novel stimulatory element in the first exon of the maize Shrunken- 1 gene with the following intron-1 enhances reporter gene expression up to 1000-fold. Plant Mol. Biol., 16： 199—207)。

来自于植物双生病毒的启动子对于外源基因的表达具有潜在的应用价值。双生病毒 (Geminivirus)是一类具有双生颗粒形态的病毒。双生病毒成员众多，侵害的作物十分广泛。依据病毒基因组结构及所依赖的昆虫传播媒体，该类病毒被划分为三个亚组。亚组 I 和 II病毒的基因组为单组份，即只含有一个基因组成份，这两类双生病毒主要由叶蝉传播；它们的区别在于前者主要侵染单子叶植物，后者主要侵染双子叶植物。亚组 III病毒主要侵染双子叶植物，依赖粉虱传播，基因组大多为双组份，较大的为 DNA A，小的为 DNA B; 其中也有些为单组份。

双生病毒突出的特点是基因组 DNA 为单链环状，其核苷酸长度约为 2，400〜3，000nt。该类病毒基因组转录最显著的特征是通过同一启动子区进行两个方向的转录。这一启动子具有两个方向的转录功能，因此本发明称该启动子为双向启动子；其中一个方向的启动子调控病毒复制蛋白基因的表达，另一方向则调控外壳蛋白基因的表达，因此两个方向的启动子分别被称为复制蛋白基因启动子和外壳蛋白基因启动子。双生病毒启动子具有典型的真核启动子特征，转录起始位点上游均存在 TATA盒序列 (P. A. Eagle等， 1997， cw-elements that contribute to geminivrus transcriptional regulation and the efficiency of DNA replication. J. Virol. , 71 : 6947- 6955)。

X. Zhan等 (X. Zhan等, 1991 , Analysis of the potential promoter sequence of African cassava mosaic virus by transcient expression of the β -glucuronidase gene. J. Gen. Virol. , 72： 2849— 2852)分离了亚组 III的非洲木薯花叶病毒 (ACMV)基因组的双向启动子区，烟草原生质体瞬时表达表明，复制蛋白基因启动子驱动的 GUS (报道基因)活性比 CaMV35S启动子的低 40倍。外壳蛋白基因启动子本身活性极低， ACMV编码的 AC2蛋白在 CaMV35S启动子控制下可使外壳蛋白基因启动子活性增强 3倍 (Haley, A. 等, 1992 , Regulation of African cassava mosaic virus promoters by the AC 1 ,AC2,AC3 gene products. Virology, 188： 905—909)。

R. J. Hayes 等 (R. J. Hayes等， 1989, Replication of tomato golden mosaic virus DNA B in transgenic plants expressing open reading frames(ORFs) of DNA A: requirement of ORF AL2 for production of single-stranded DNA. Nucl. Acids Res. , 17： 10213— 10222)以 TGMV 作基因载体导入根癌农杆菌进行植物转化，发现 TGMV 外壳蛋白基因启动子被 AC2 激活后的新霉素磷酸转移酶 (报道基因）活性不如 CaMV35S启动子的强，比 CaMV35S 启动子低 2倍。

C. Brough等 (C. Brough等， 1992 , Kinetics of tomato golden mosaic virus DNA replication and coat protein promoter activity in Nicotiana tabacum protoplast. Virology , 187： 1一 9)发现，以非复制型的 TGMV 作载体进行植物转化，外壳蛋白基因启动子驱动的 GUS基因瞬时表达活性比 CaMV35S启动子强约 2倍。而复制型的 TGMV外壳蛋白基因启动子活性约为 CaMV35S启动子的 60— 90倍。

许煜泉等 (许煜泉等， 1998 , 烟草黄矮双生病毒中双向启动子的活性及其调节控制，病毒学报， 14: 68— 74)分离了亚组 III的烟草黄矮双生病毒的双向启动子区，以 GUS 作报道基因，在烟草原生质体和玉米细胞悬浮液中的瞬时表达表明，复制蛋白基因启动子活性最强，相当于 CaMV35S启动子的 15— 20%。外壳蛋白基因启动子活性最弱，但可被 CI : C2蛋白 (相当于 AC2蛋白)激活而使活性增强 3倍。

前人对双生病毒双向启动子的研究大多采用瞬时表达的方式， X. Zhan等 (X. Zhan等， 1991， Analysis of the potential promoter sequence of Africation cassava mosaic virus by transcient expression of the β -glucuronidase gene, J. Gen. Virol., 72： 2849 一 2852)虽釆用根癌农杆菌转化的方法对 ACMV复制蛋白基因启动子作了研究，但也发现比 CaMV35S低。综上文献报导，目前分离到的双生病毒复制蛋白基因的启动子活性普遍比 CaMV35S 的低。本发明从属于双生病毒亚组 III 的棉花曲叶病毒中分离启动子，以 GUS作报道基因，研究其表达强度。

棉花曲叶病毒是新近发现的双生病毒，最近几年在巴基斯坦、苏丹、印度流行严重。据巴基斯坦 1993— 1994年统计，棉花受害面积达 900， 000公顷，产量损失高达 80 (M. Ali等， 1995， Cotton leaf curl virus in the Punjab, current situation and review of work. Multan: Central Cotton Research Institute /Ministry of food, Agriculture and Livestock, Government of Pakistan/Asian Development Bank)。研究证实, CLCuV 由粉虱传播，侵害的作物非常广泛，包括法国豌豆、秋葵、烟草、番茄、棉花等，主要产生叶脉增厚和叶片变黄等症状。目前已发现了至少 9种不同的 CLCuV株系， X.Zhou(X. Zhou等 1998 , Four DNA-A variants among Pakistani isolates of cotton leaf curl virus and their affinities to DNA-A of geminivirus isolates from okra. J. Gen. Virol., 79： 915— 923)等根据不同株系的基因组 DNA序列，研究了 CLCuV的进化。至今尚未见有关将 CLCuV的双向启动子应用于植物基因工程的报导。

植物基因工程在植物的抗病、抗虫、抗除草剂、抗逆境、改良作物品质、提高作物固氮能力、雄性不育、延熟保鲜、改变花色和花型等方面取得了较大突破。然而，目标基因表达量低或不稳定等不良因素往往制约了植物基因工程飞速发展的步伐。开发新型的高效启动子不失为一较理想的策略。

目前使用的启动子的强度普遍较低，或存在植物种属、器官、组织的特异性。发明概述

本发明的目的是提供一种普遍适用于双子叶植物或单子叶植物转化的超强启动子系统，使外源基因的表达量在现有的基础上进一步提高，更广范围地在植物体内进行组成型表达。

本发明提供了一种植物病毒的双向启动子。本发明提出的双向启动子为双生病毒基因组的一部分，在基因组学上又称为大基因间区 (Large intergenic region, LIR)。 LIR包含了双生病毒基因组双向转录的启动子区及其调控元件，对于病毒的复制及双向转录至关重要。

具体地说，本发明的启动子为棉花曲叶病毒基因组的一部分。更具体地说，本发明的启动子具有图 1和 SEQ ID NO: 1所示的序列。其中，上行数字表示启动子片段的核苷酸序排序，以 G为 1 ; 下行数字表示启动子在 CLCuV原始基因组中的位置；下划线的碱基序列为通过 PCR方法合成该启动子片段所用的引物序列。

本发明的启动子最好是全长的启动子，即核苷酸 1〜436 间的序列，该启动子可使启动子控制的外源基因在植物及根农杆菌中 (但不限于此)高效表达，该启动子也能与其他来源的启动子连用以调控外源基因高效表达。更具体地说，本发明的启动子具有 SEQ ID NO: 1所示的序列。

本发明的启动子也可以是 SEQ ID NO: 1所示的启动子上游核苷酸 1〜184间的截短的启动子，该截短的启动子可使启动子控制的外源基因在根中高效表达，该截短的启动子还能使得启动子控制的外源基因在其他器官如茎、叶中高效表达，该截短的启动子也能与其他来源的启动子连用以调控外源基因在根中高效表达。

本发明的启动子也可以是 SEQ ID NO: 1所示的启动子上游 1〜278间的截短的启动子，该截短的启动子可使启动子控制的外源基因在 (但不限于此)植物及根农杆菌中高效表达，该截短的启动子也能与其他来源的启动子连用以调控外源基因在根中高效表达。

本发明的启动子也可以是 SEQ ID NO: 1所示的启动子上游 1〜294间的截短的启动子，该截短的启动子可使启动子控制的外源基因在植物及根农杆菌中 (但不限于此)高效表达，该截短的启动子也能与其他来源的启动子连用以调控外源基因高效表达。

本发明的双向启动子来自棉花曲叶病毒 (CLCuV)基因组的 LIR区，是天然提纯的或 PCR方法分离的或者参照图 1所示的序列化学合成的。 CLCuV属于双生病毒亚组 III，该病毒存在相当大的变异，目前在巴基斯坦就已发现了 9种不同的株系。在本发明的一个优选实施方案中，所述的启动子是从一种未知的 CLCuV病毒株系中分离的双向启动子，其 DNA序列如图 1所示。

本发明提供的启动子可分别使用不同的方向驱动外源基因的表达，也可同时在启动子的两个方向连接外源基因，也可将其中的调控序列分别与其他启动子组成复合启动子使用。本领域熟练技术人员应知道，将启动子除 TATA盒核心区外的其他序列通过碱基突变或缺失等发生变化，一般不会使启动子活性完全丧失，因此也可根据需要将启动子的调控元件发生改变后使用。因而，与图 1 所示序列具有 80 %同源性的 DNA序列也包括在本发明的范围之内。

本发明提供的启动子最好是包含了基因转录起始位点 (通常称为 + 1)上游的序列，不包含转录起始位点至转译起始位点 (通常为 ATG密码子)之间的序列。真核生物转录起始位点的特征一般为 YYYAYA(Y为嘧啶)，转录起始于第 4位的 A。根据已发表的其它双生病毒的资料及同源性比较，复制蛋白基因方向启动子的转录起始位点为基因组第 2606核苷酸位置的 A, 外壳蛋白基因方向启动子的转录起始位点为基因组第 255核苷酸位置的 T。

本发明还提供了一种将所说的双向启动子应用于植物中表达外源基因的方法。该方法包括以下步骤：

a. 将克隆到的双向启动子与待表达的外源基因相连，以此构建植物表达载体； b. 将构建好的植物表达载体导入植物细胞；

c 在适宜的培养条件下将转化后的植物细胞再生，得到表达外源基因的植株。上述方法中所说的双向启动子是一种植物病毒来源的双向启动子。

具体地说，该启动子来源于棉花曲叶病毒。优选该启动子具有 SEQ ID NO: 1 所示的序列或如上文所述的截短的启动子。该启动子是天然提纯的或化学合成的。

上述方案中使用的启动子由于在两个方向均有功能，因此被称为双向启动子。它可以在不同方向连接基因。

上述方案中使用的启动子最好是包含了基因转录起始位点 (通常称为 + 1)上游的序列，不包含转录起始位点至转译起始位点 (通常为 ATG密码子)之间的序列。真核生物转录起始位点的特征一般为 YYYAYA(Y为嘧啶)，转录起始于第 4位的 A。根据已发表的其它双生病毒的资料及同源性比较，复制蛋白基因方向启动子的转录起始位点为基因组第 2606核苷酸位置的 A，外壳蛋白基因方向启动子的转录起始位点为基因组第 255核苷酸位置的 T。

上述方案中使用的启动子最好是包含了启动子本身的调控外源基因表达的所有顺式调控元件，如根特异性、叶肉细胞特异性、种子胚乳特异性、花器官特异性、果实特异性、维管组织特异性等等组织特异性元件及诱导性调控元件如损伤诱导等，以及所有的增强外源基因表达的增强子元件、降低外源基因表达的负调控元件等。本领域熟练技术人员应知道，组成型表达的启动子往往由许多模块化 (Modular) 的顺式调控元件组成，这些调控元件决定了基因表达的特性，可与其它所有来源的在植物中表达外源基因的启动子组合在一起使用。因此，双向启动子的顺式调控元件也包括在本发明的范围之内。

上述方案中使用的启动子最好是不仅包含病毒基因转录所需的核心启动子序列如 TATA盒，还包含了其它顺式调控元件，也包含了与病毒复制相关的序列如非常保守的发夹环结构及其周边序列 5 ' -

GCTCCAAAAAGCGGCCATCCGTATAATATTACCGGATGCCGCGCTTT TTTTTTTGTG-3 ' 。将启动子除 TATA盒等核心区外的其他序列通过碱基突变或缺失等发生变化，一般不会使启动子活性完全丧失，因此也可根据需要将双向启动子的调控元件发生改变后使用。因而，与图 1 所示序列具有 80% , 最好是具有 99 % 同源性的 DNA序列也包括在本发明的范围之内。

上述方案中使用的启动子最好是可增添各种来源 (包括 CLCuV 本身)的调控元件如 CaMV 35S 启动子，章鱼碱合成酶基因 (o )启动子 (L. Comai 等， 1985 , Expression in plants of a mutant acroA gene from Salmonella typhimurium confers tolerance to glyphosate. Nature, 317: 741— 744), 甘露碱合成酶基因 ( )启动子 (K. E. .McBride等, 1990 , Improved binary vectors for Agrobacterium-medidated plant transformation. Plant Mol.Biol. , 14： 269— 276)等来源的顺式调控元件 (如增强子元件)等，组成复合启动子使用。此外，该双向启动子也可置于各种转译增强因子等调控序列的上游来调控外源基因的表达，转译增强因子如来自苜蓿花叶病毒 (AMV) 的非转译序列 AMV(S. A Jobling 等， 1987 , Enhanced translation of chimaeric message RNAs containing a plant viral untranslated leader sequence. Nature, 325： 622 一 625), 以及来自烟草花叶病毒 (TMV)的 Ω因子 (K. Richards等， 1978， Nucleotide sequence at the 5 ' extremity of tobacco mosaic virus RNA, Eur. J. Biochem. , 84： 513 一 519)等。在嵌合基因构建物中，也可以部分或全部地插入其它的所有旨在增强外源基因表达的 DNA序列，其中包括但不限于：内含子如水稻肌动蛋白基因内含子 1 , 来自玉米蔗糖合成酶基因 Shi内含子 1、玉米 Ubquin内含子 1、玉米乙醇脱氢酶基因 1一 S内含子 1等等内含子以及外显子如玉米蔗糖合成酶基因 SM外显子 1及 3 ' 端表达调控序列如 ΡΙ-Π基因终止子。

本发明的方法中双向启动子可以是以复制蛋白基因方向与外源基因相连，也可以外壳蛋白基因方向与外源基因相连。 CLCuV 外壳蛋白基因启动子本身活性极低，它可受病毒基因组编码的 AC2 蛋白的激活调控。因而在本发明的方法中，当启动子以外壳蛋白基因方向与启动子相连时，可使用本发明提供的 AC2 蛋白基因 (DNA 序列见图 2)。

本发明提出的 AC2 蛋白基因可与各种来源的启动子融合，达到调控外壳蛋白基因启动子表达的目的。其中的启动子包括但不限于 CLCuV 本身来源的启动子、 CaMV35S启动子、番茄 E8启动子、 Gt3启动子、 role启动子、 CoYMV启动子、 rbcs 启动子、 hsp70启动子、 ΡΙ-Π启动子等等。

本发明提出的方案中使用了 GUS 作报道基因，出于本发明的目的，报道基因定义为融合于目标启动子下游的一段核苷酸序列，启动子的转录可使报道基因转录并转译生成一些易于测定的生物化学物质，如 β -葡糖苷酸酶 (GUS)。本发明通过测定 e -葡糖苷酸酶活性来测定启动子在烟草和棉花细胞中的表达强度。

本发明提出的方案中的外源基因，是指所有旨在改变植物本身遗传性状的基因。其中包括但不限于所有的非编码蛋白基因如 RNA基因 (包括但不限于所有的正义 RNA基因和反义 R A基因等等)，以及所有的编码基因 (包括但不限于抗虫、抗病、抗逆、抗除草剂、品质改良基因等)都可与该启动子组成嵌合表达结构并置于载体中，在细胞中表达。

重组 DNA 的技术包括但不限于分子克隆实验指南 (J. Sambrook 等， 1989， " Molecular cloning, a laboratory manual. " Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, N.Y.). 转化植物的方法使用了许多对本领域熟练技术人员来说非常熟知的技术，其中包括但不限于基因枪转化、农杆菌叶盘转化、 PEG转化等。以上技术都涉及使用 DNA载体来传递用于转化的核苷酸序列，适用于本发明的载体包括但不限于带有用于选择转基因材料的标记基因的载体。

本发明提出的启动子可用于在双子叶植物 (包括但不限于棉花、烟草)中表达基因，还能用在单子叶植物中驱动基因的表达，但是双子叶植物启动子在单子叶植物中的表达水平有所不同。烟草是常用的模式植物，因为它易于再生，用根农杆菌 Ti 质粒载体转化的效率特别高。双子叶植物如 (但不限于此)棉花、番茄、油菜、法国豌豆、秋葵、大豆、烟草等等，单子叶植物如禾本科植物水稻、小麦、玉米、大麦、燕麦等等是优选的转基因宿主。

本发明提出的对转化植株的基因表达产物的检测，以评价启动子的表达强度，并且分析启动子在植物体内的表达的组织化学定位，使用了许多对本领域熟练技术人员来说非常熟知的技术，其中包括但不限于用于 GUS 酶活性分析的荧光分光光度法，用于组织化学分析的徒手切片法，冰冻切片法等技术。

本发明最后还提出了一种方案，即为了提高双向启动子中外壳蛋白基因启动子的表达强度，使用来自 CLCuV基因组的 AC2蛋白因子。

本发明提出的 AC2蛋白基因是从 CLCuV病毒侵染的植物组织总 DNA中分离的。它来源于棉花曲叶病毒基因组，可采用 PCR方法分离或天然提纯或通过化学的方法合成的。

本发明的 AC2蛋白的核酸序列及相应的氨基酸序列 (见 SEQ ID NO: 2), 若通过缺失或点突变等方式改变其中的碱基，不会使 AC2蛋白完全丧失功能。

本发明提出的 AC2 蛋白若通过增添其它蛋白的序列以组成融合蛋白等，不会使 AC2蛋白完全丧失功能。

本发明提出的 AC2 蛋白基因可与各种来源的能在植物中表达的启动子融合，达到调控外壳蛋白基因启动子表达的目的。其中的启动子包括但不限于 CLCuV 本身来源的启动子、 CaMV35S启动子、番茄 E8启动子、 Gt3启动子、 role启动子、 CoYMV启动子、 rbcs启动子、 hsp70启动子、 PI-II启动子。

有益效果

本发明提出的双向启动子在两个方向上都有功能。其中一个方向，即复制蛋白 (Replication protein, RP)基因启动子全长即添加了 149〜436 间的调控元件可使外源基因在双子叶植物中的平均表达量是 CaMV35S启动子的 5.4倍，最高个体达 10倍。

该方向的全长启动子可在植物根、茎、叶器官中高效表达外源基因 (见下表)，其中根部表达强度最高。

CLCuV复制蛋白基因全长启动子驱动的 GUS表达活性

在转基因烟草不同器官中的比较

注：表中的数据来自农杆菌转化获得的稳定表达 GUS基因的 6株转化植株 (T。代) 苗期测定结果。数字以平均值土标准差表示，单位为 pmoles MU/mg 蛋白 /min， CLCuV PRP 表示 CLCuV 复制蛋白基因启动子， CaMV 35S表示 CaMV 35S启动子。进一步的组织化学定位证实，复制蛋白基因全长启动子在叶片的叶肉细胞 (包括栅栏组织、海绵组织)和维管束均有表达活性；茎部横切面染色结果表明，内外韧皮部、皮层及木质部周围的薄壁细胞也有 GUS染色。在花器官中，花萼，花瓣，子房，柱头，花药均显示染色。未成熟果实的外果壁、成熟种子的胚和胚乳均有染色反应。

复制蛋白基因启动子是 1〜184 区域的截短的启动子时，可使其控制的外源基因在根中高效表达，该截短的启动子还能使其控制的外源基因在其他器官如茎、叶中高效表达，其中在叶中的表达量为 CaMV 35S启动子的 2.4倍。

复制蛋白基因启动子是 1〜278 区域的截短的启动子时，可使其控制的外源基因高效表达，其中在植物叶中的表达量为 CaMV 35S启动子的 6.6倍。

复制蛋白基因启动子是 1〜294 区域的截短的启动子时，可使其控制的外源基因高效表达，其中在植物叶中的表达量为 CaMV 35S启动子的 10.9倍。

对各缺失启动子控制下的 GUS 基因表达载体转化植株进行了根、茎、叶不同部位的组织化学染色。确定了 141至 184含有根特异性表达所必须的调控元件。去除该元件后，使得复制蛋白基因启动子失去在根中控制外源基因表达的特性，但不排除该启动子控制的外源基因在其他器官中的表达。

复制蛋白基因启动子是 1〜436 的全长序列时，启动子在根癌农杆菌中的活性为 CaMV 35S启动子的 2倍。另一方向的启动子即外壳蛋白基因启动子单独的表达活性非常低，仅为本底的 5倍 (图 4)，但经 AC2蛋白因子的激活后，瞬时表达活性提高 (见下表)。 AC2基因可作为一种基因表达调控的开关，控制外壳蛋白基因启动子驱动的基因表达的开启与关闭。

CLCuV 外壳蛋白基因启动子驱动的 GUS基因在棉花和烟草叶片组织中的瞬时表达活性相对比较

注：用每种构建物植物表达产物经组织化学染色后的蓝色斑点数目和强度表示启动子的瞬时表达活性相对值。用 +/—表示极低的活性， + +表示高活性， + + + 表示较高活性， + + + +表示极高的活性。 CP启动子表示外壳蛋白基因方向启动子： RP 启动子表示复制蛋白基因方向启动子； CaMV35S 启动子表示花椰菜花叶病毒 35S启动子； AC2表示 CLCuV 的 AC2蛋白基因。附图简要说明

图 1显示来自 CLCuV双向启动子的序列。注：上行数字表示序列的碱基序号，下行数字表示相应于 CLCuV基因组的碱基序号。单划线部分为 PCR扩增引物。 E 代表最短的启动子序列 (1〜149)， B(l〜184)、 C(l〜278)、 D(l〜294)、 A(l〜436)分别代表增加调控元件后的序列。箭头表示具体核苷酸位置。

图 2显示来自 CLCuV的 AC2基因的核酸序列及推测的氨基酸序列。注：以 CLCuV 侵染的烟草叶片总 DNA为模板，通过 PCR方法获得 AC2基因。 PCR产物全长 521 Nt, 包括 450 Nt 的编码序列 (即 145个氨基酸)、两个终止子 (星号表示) 及 52 Nt 非编码序列 (小写字母表示)。划线部分的序列表示 PCR扩增引物。上行数字表示序列的碱基序号，下行数字表示相应于氨基酸的序号。

图 3 为一条线图，表示经质粒载体 pRPGUS2300 转化后，稳定转化的烟草不同植株的 GUS 酶活性。转基因植株叶器官 GUS 活性测定荧光值的激发波长为 365nm, 发射波长为 455nm。 CLCuV PRP: CLCuV 复制蛋白基因启动子转基因植株； CLCuV PCP : CLCuV 外壳蛋白基因启动子 -GUS 转基因植株； CaMV P35S: CaMV 35S启动子 -GUS转基因植株； CK: 未转 GUS基因的对照组织。 GUS 活性计算值为未除去本底的数值，单位为 pmoleMU/ mg蛋白质 /min。

图 4为一条线图，表示经质粒载体 pRPGUS2300、 pCPGUS2300、 pBI121转化后，稳定转化的烟草中 GUS酶活性平均值。转基因植株叶器官 GUS活性测定荧光值的激发波长为 365nm，发射波长为 455nm。 CLCuV PRP: CLCuV 复制蛋白基因启动子 -GUS 转基因植株； CLCuV PCP: CLCuV 外壳蛋白基因启动子 -GUS 转基因植株； CaMV P35S: CaMV 35S启动子 -GUS转基因植株； CK: 未转 GUS基因的对照植株。 GUS 平均活性计算值为未除去本底的数值，在条线图的上方以数字表示，单位为 pmoleMU/ mg蛋白 /min。

图 5为一条线图，表示经 pRPGUS2300 转化后，稳定转化的烟草中根、茎、叶不同器官中 GUS 酶活性。 GUS 活性测定荧光值的激发波长为 365nm, 发射波长为 455nm。 CLCuV PRP: CLCuV 复制蛋白基因启动子 -GUS转基因植株； CaMV P35S: CaMV 35S启动子 -GUS转基因植株； CK: 未转 GUS基因的对照植株。 GUS 活性计算值为未除去本底的数值，单位为 pmole MU/ mg蛋白 /min。

图 6为一条线图，表示经 pRPGUS2300 转化后，稳定转化的烟草中根、茎、叶等营养器官及繁殖器官中 GUS 酶活性。 GUS 活性测定荧光值的激发波长为 365nm, 发射波长为 455nm。 CLCuV PRP: CLCuV 复制蛋白基因启动子 -GUS转基因植株； CK: 未转 GUS基因的对照植株。 GUS活性计算值为未除去本底的数值，单位为 pmole MU/ mg蛋白 /min。

图 7为一条线图，表示 CLCuV复制蛋白基因启动子经 5 ' 端缺失后与 GUS嵌合基因连接的质粒载体的示意图。 pA 为全长启动子载体， pB、 pC、 pD、 pE 分别为 1〜294, 1〜278， 1〜184， 1〜149时的启动子不同载体。 CK为对照即无启动子的质粒载体 pCAGUS。

图 8为一条线图，表示 CLCuV复制蛋白基因启动子与 GUS嵌合基因连接的质粒载体转化的根癌农杆菌中 GUS 酶活性。 GUS 活性测定荧光值的激发波长为 365nm, 发射波长为 455nm。 CLCuV PRP: CLCuV 复制蛋白基因启动子 -GUS转基因植株； CaMV P35S: CaMV 35S启动子 -GUS转基因植株； CK为对照即无启动子的质粒载体 pCAGUS转化菌株。 GUS活性计算值为未除去本底的数值，单位为 pmole MU/ mg蛋白 /min。

图 9为一条线图，表示 5 ' 端缺失的 CLCuV复制蛋白基因启动子与 GUS嵌合基因连接的质粒载体转化的烟草叶片中 GUS酶活性。 GUS活性测定荧光值的激发波长为 365nm，发射波长为 455nm。 pB、 pC、 pD、 pE分别为 1〜294， 1〜278, 1〜 184, 1〜149时的启动子不同载体。 pBI121为 CaMV 35S启动子的载体。 CK为对照，即无启动子的质粒载体 pCAGUS转化植株。

实施例

通过在棉花叶片中瞬时表达携带有启动子序列与 GUS 基因融合而形成的构建物的农杆菌转化烟草测定 GUS 活性，评价双向启动子的效率。下文将说明载体的制备方法和转化方法。

启动子的克隆

按 B. D. Harrison等 (B. D. Harriso等， 1997, Detection and relationships of cotton leaf curl virus and allied whitefly-transmitted geminiviruses occuring in Pakistan. Ann. Appl. Biol. , 130： 61— 75)的方法，从受 CLCuV侵染的烟草叶片中提取总 DNA, 以下面的寡核苷酸为引物 (5 ' 端引物： 5 ' -

CGGGAGCTCATGATTACGGGAGCGTAAAATAC-3 ' ； 3 ' 端引物： 5 ' - CGCGGTACCATGGTGGCAATCGGTGTACACTC-3 ' ), 通过 PCR的技术得到双向启动子片段 P1P2。两端引物中分别添加了 Kpnl-Sacl 双酶解位点。 PCR扩增片段经 Kpnl-Sacl 限制性酶切之后，插入质粒 pGEM7Zf(+) (购自 Promega 公司）的相同双酶解位点中，得到 pGEM7ZPlP2。

包含嵌合 RP启动子一 GUS基因的表达载体构建

质粒 pAMVGUS融合有一段 2.137 kb含 GUS基因和 nos终止子结构的 Ncol-Sall 双酶解片段。将该片段克隆在 pGEM7ZPlP2 的 P1 方向启动子 (复制蛋白基因启动子)的下游，即 Ncol-Xhol 双酶解位点中，得到质粒 pRPGUS。该质粒可作瞬时表达载体，为进一步构建植物转化载体，将 pRPGUS包含有 RP启动子一 GUS— nos 终止子的表达结构的约 2.5kb Sacl-Xbal片段，插入 pCAMBIA2300(购自 CAMBIA 公司)的相同双酶解位点中，得到适合于农杆菌转化的植物表达载体 pRPGUS2300。植物表达载体对照 pBI121含有来自于 CaMV的 35S启动子一 GUS基因表达结构。

包含嵌合 CP启动子一 GUS基因的表达载体构建

质粒 pDMC203 融合有一段含 GUS 基因和 nos 终止子结构的片段。将 _PGEM7ZP1P2经 XhoI-BspHI双酶解后得到的启动子片段插入 pDMC203 的 Xhol- Ncol 双酶解位点中，得到质粒 pCPGUS。该质粒可作瞬时表达载体。为进一步构建植物转化载体，将 pCPGUS包含有 CP启动子一 GUS— nos终止子的表达结构的约 2.5kb Bglll-Xhol双酶解片段插入植物表达载体 pCAMBIA2300(购自 CAMBIA公司)得到适合于农杆菌转化的植物表达载体 pCPGUS2300。

反式作用因子 AC2的分离及其表达载体的构建

以受 CLCuV侵染的烟草叶片中提取的总 DNA为模板，以下面的寡核苷酸为引物 (5 ' 端引物： 5 ' -CGCGAATTCCTAGACGAGGAAAAGAAGAC-3 ' ； 3 ' 端引物： 5 ' -CGGGTCGACTCTATTAATTGAAATTACACCGAG-3 ' )，通过 PCR 的技术得到 AC2基因片段。将其 5 ' 端用 EcoRI酶解， 3 ' 端用 Klenow酶补平后插入克隆载体 pBluescriptKS(+)的 Smal-EcoRI双酶解位点中得到 pBlueAC2P。质粒 pBPF Ω 7 包含有非转译增强序列 Ω因子、 CaMV35S 启动子和 nos 终止子的基因表达载体。将 _PBlueAC2P经 EcoRI-Xbal双酶解后插入 pBPF Ω 7载体中的相同双酶解位点中，得到 pBPFAC2表达载体。再将 pBPFAC2经 Hindlll酶解后插入 pCPGUS2300 的相同酶解位点中，得到复合表达载体 pCPGUS230AC2。

棉花和烟草叶片的瞬时表达与分析

棉籽经浓硫酸脱绒后用自来水冲净。剥出种仁，分别用 30%次氯酸钠浸泡 15 分钟、 0.1 %氯化汞浸泡 4 分钟、 10%H₂O₂浸泡 20 分钟消毒，无菌水冲洗后接种于发芽培养基 (GA7培养盒)中；烟草种子的消毒采用 30%次氯酸钠浸泡 10 分钟。上述处理过的棉花和烟草种子均于光照 /黑暗周期比为 16/8小时，温度为 25° C的条件下培养 30-40天，将无菌苗的叶片用于转化。叶片平铺在无激素的 MS基本培养基上，用 pRPGUS、 pCPGUS、 pCPGUS230AC2质粒 DNA进行基因枪的转化。金粉的制备和转化的方法参照文献 (任延国等， 1998，水稻 psbA 启动子诱导的 GUS 基因在烟草叶绿体中的瞬间表达，农业生物技术学报， 3: 78-83)。暗培养 3天后，进行组织化学染色 (R. A. Jefferson, 1987, Assaying chimeric genes in plants: the GUS gene fusion system. Plant Mol. Biol. Rep. 5： 387—405), 并经 70%乙醇脱色以除去叶绿素。结果表明，外壳蛋白基因启动子单独的表达活性非常低，但经 AC2 蛋白因子的激活后，瞬时表达活性提高。

烟草的转化与分析

将目的质粒转入根癌农杆菌 LBA4404,然后挑取单菌落于 20ml YEB 培养基 (含卡那霉素，利福霉素各为 50微克 /毫升)中 28° C过夜培养，再按 2%体积的量转接到无抗生素的 YEB 培养基中继续培养 3小时，菌液用 MS液体培养基稀释 3倍。

采用叶盘法进行烟草的转化，详细方法参照文献 (R. B. Horsch, 1985, A simple method and general method for transfering genes into plant. Science, 227： 1229— 1230)。取无菌苗的叶片，用打孔器打出圆形叶片，浸入含农杆菌的 MS培养基中， 10分钟后，在滤纸上吸干，转入共培养培养基于 25° C暗培养 2— 3天后，将叶盘转入继代培养基。光照培养 (光 /暗周期为 16/8小时，下同) 3天后转入筛选培养基，继续培养 7— 10天后，转入再生培养基，待芽长至 3— 4cm时切下芽转入生根培养基。生根后，取长势较一致的植株进行 GUS 酶活性测定。测定方法参照文献 (R. A. Jefferson, 1987， Assaying chimeric genes in plants: the GUS gene fusion system. Plant Mol. Biol. Rep., 5： 387— 405)。测定结果表明， CLCuV RP启动子驱动的 GUS酶活性平均值是 CaMV35S启动子的 5— 6倍。

进一步的组织化学定位，仍参照文献 (R. A. Jefferson, 1987, Assaying chimeric genes in plants: the GUS gene fusion system. Plant Mol. Biol. Rep., 5： 387— 405)的方法，进行徒手切片并染色或按文献的方法进行染色、固定及冰冻切片。观察结果表明，除花粉外， RP启动子在植物绝大多数器官和组织中表达，基本属组成型表达。

双子叶植物棉花的农杆菌转化

将质粒载体 pRPGUS2300通过电激的方法导入根农杆菌 LBA4404, 用根农杆菌介导转化法转化棉花，其操作程序如下：棉籽经硫酸脱绒后用自来水冲洗，经 10%H₂O₂浸泡 2— 4小时后置于无菌水中 12—14小时，剥去种皮，放置于 1/2 MS 的发芽培养基上。在 28'C暗培养下发芽 3— 5天后，将无菌苗下胚轴切成 0.5— lcm 切段。取 20ml经高压灭菌的液体 YEB培养基加入相应的抗生素 (卡那霉素 50mg/L、利福霉素 25mg/L)，挑取在平板上的单菌落，接种于 20ml 含有上述抗菌素的液体 YEB培养基中， 28Ό的恒温摇床上过夜 (150— 180rpm)。取 400 μ 1此菌液转接于不含抗生素的液体 ΥΕΒ培养基中 (20ml), 并添加 2.5ml 100mmol/L的乙酰丁香酮，继续振荡培养 3— 5 小时。转化程序：将下胚轴用稀释至 5 X 10⁸个 /ml 的根农杆菌菌液浸泡 10分钟左右，覆盖有滤纸的共培养培养基 (MS无机盐， B5有机成分， 30g/L 葡萄糖和 2,4— D及 KT各 0.1mg/L， pH5.8)上培养。筛选转化体：转化后的下胚轴经三天暗培养后，转入添加了 80mg/L卡那霉素、 500mg/L头孢霉素的选择培养基上，经 2— 3个月培养（20— 30天继代一次）诱导出转化愈伤，在 MS培养基（MS 无机盐、 B5有机成分， 30g/L葡萄糖， pH5.8)上继代 4一 5次以诱导胚状体的形成。 5-6个月后将发育好的胚状体转移到分化培养基 (MS无机盐、 B5有机成分，去除激素及 NH₄N0₃、 KN0₃加倍并添加谷氨酰胺 lg/L、天门冬酰胺 0.5g/L, pH5.8)进行胚状体的分化。每月继代一次，当小植株长出完整和健壮的根系并具有 3— 4 片真叶之后，将其移栽或嫁接。

单子叶植物水稻的转化

1. 载体构建：用 Sacl/Xbal双酶解质粒 pRPGUS, 回收 PRP—GUS— Tnos 片段并插入 pCAMBIA1300载体的 Sacl/Xbal位点，得到质粒 pRPGUSHyg。植物选择标记为潮霉素。

2. 基因枪转化：

取开花后 12-15 天的灭菌幼胚或幼胚来源的胚性愈伤组织 (从鲜黄、致密的胚性愈伤组织上分离出胚性小愈伤组织颗粒，直径大约 1mm)作为基因枪转化的受体。待幼胚在诱导培养基培养 2-3 天后,仔细挑选无污染且盾片膨大的幼胚转移到盛有高渗培养基 (诱导培养基 +0.5M甘露醇)的平皿 (直径 9cm)上, 并摆放在平皿中央 2-3cm的枪击范围内 (注意盾片端朝上)，高渗预培养 4小时后进行枪击，胚性愈伤组织也需经高渗处理后再进行枪击。称取 60mg 的金粉 (直径 Ι .Ο μ πι)于 1.5ml的 Eppendorf管中，加入 1ml 70%乙醇，在旋涡振荡器上振荡 15分钟，然后 13,000_rpm离心 3分钟,仔细去掉上清，再加入 70%乙醇重复上述步骤一次。然后加入 1ml 的无菌重蒸水重悬， 13,000卬 m离心去上清，这一步骤重复三次，最后加入 1ml 无菌水。储存于— 20°C冰箱。充分振荡起金粉悬液后取 50 μ 1，置于一灭菌的 Eppendorf管中，加入 5 μ 1的 DNA (l .O g/ μ ΐ)溶液,在涡旋振荡状态下缓慢加入 50 μ 1 2.5Μ 氯化钙溶液 (高压灭菌）以及 20 μ 1 0.1 M亚精胺溶液 (抽滤灭菌)，充分振荡约 3 分钟,静置 10分钟（以保证 DNA大分子在金粉表面的充分沉降), 10，000rpm离心 5秒钟，弃上清 (尽可能去除干净）再加入 250 μ 1无水乙醇,振荡， 10,000rpm离心 5秒钟，去上清，最后加 60 1 无水乙醇,重悬，供 5 枪之用（5- 10 μ 1 —枪）。将基因枪 (PDS-1000/He)放置于超净工作台上，以利于无菌操作。用 70%的乙醇消毒真空室,可裂圆片及微弹载体用 70%乙醇浸泡 30 分钟，晾干备用，阻挡网经高压灭菌。取包被 DNA 的金粉悬液 (5-10 μ 1)均匀点在无菌微弹载体的中央区域，于超净工作台上吹干备用。将可裂圆片 (规格为 l , 100psi ) 装入固定盖、旋紧。将载有微弹的微弹载体及阻挡网装入微弹发射装置中。基因枪的轰击步骤包括：（1) 打开稳压电源、真空泵及氦气瓶阀的开关，调整系统压力为 l，300psi。 (2) 将受体材料小心地放入样品室，射程可选 60mm或 70mm。（3) 抽真空 (真空度为 27-28 英寸汞柱)。 (4) 轰击。（5) 排气,取出样品，用封口膜封上。枪击后的材料于高渗培养基上过夜后,转移到诱导培养基上培养 5-7天。将上述材料转入含有 hyg B的选择培养基上选择培养三次,暗培养，每次 3-4周，粳稻使用 hygB 浓度依次为 30 mg/K 40 mg/1和 50 mg/L 籼稻使用 hygB浓度依次为 10 mg/l、 20 mg/1和 40 mg/l o 将抗性愈伤组织转至含 hyg B 30mg/l的分化培养基上,先暗培养 10天，再光照培养，待分化出的抗性小芽长至 2-3cm 时,将其转至含 hyg B 30-50mg/l的生根培养基上 (Hyg B籼稻用 30mg/L,粳稻用 50mg/L)。待长至完整的植株后,将其从固体培养基转至营养液中开放式培养。待生成新根后,将苗转入温室或大田。附培养基配制配方：

1.基本培养基（1 L):

大量元素 N₆

微量元素 MS

^fe盐 MS

有机成分 B₅

MgCl2 500 mg

谷氨酰胺 250 mg

脯氨酸 500 mg

水解酪蛋白 300 mg

蔗糖 30000 mg

Gelrite 2200 mg 2.诱导培养基（1 L): 基本培养基补加以下成分

2, 4- D 2 mg

3.选择培养基（1 L):基本培养基补加以下成分

2, 4-D 2 mg

Hyg B 30,40,50 mg (粳稻） W

10, 20， 40或 50 mg (籼稻)

4.分化培养基（1 L): 基本培养基补加以下成分

KT 2-4 mg

6-BA 0.5-1 mg

NAA 0.25-0.5 mg

Hgy B 30 mg

甘露醇 20-30 g 5. 生根培养基（1 L):

大量兀素 1/2MS

微量元素 1/2MS

^fe盐 1/2MS

有机成分 1/2B₅

MgCl2 500 mg

谷氨酰胺 250 mg

水解酪蛋白 300 mg

蔗糖 20000 mg

Gelrite 2200 mg 包含 5 ' 端缺失的 RP启动子一 GUS嵌合基因表达载体的构建

pDMC202(CAMBIA 公司）为无启动子的 GUS-T nos 中间质粒，首先将 PGEM7ZP1P2的 Nco I/Nsi I双酶解片段插入 pDMC202的 Nco I/Pst I位点，得到 p7RPGUS202。为了快速构建一系列 5 ' 端缺失的启动子突变体，以 p7RPGUS202 为基础，将其 Hind in/Bgl ll双酶解片段 (包含全长启动子 -GUS-T nos)插入植物表达载体 pCAMBIA2300的 Hind III/BamH I位点，得到质粒 pA。启动子突变体 pB是通过 EcoR I 酶解 p7RPGUS202 , 回收缺失启动子 -GUS-T nos 的片段，插入 pCAMBIA2300 的 EcoR I位点得到的。 pC 的获得是通过 BamH I/EcoR I双酶解 p7RPGUS202, 回收缺失启动子 -GUS-T nos的片段，插入 pCAMBIA2300的 BamH I/EcoR I位点。 pD的构建是通过 Apa I酶解 p7RPGUS202，并用 DNA聚合酶 I Klenow 补平末端，再用 BamH I酶解 p7RPGUS202, 回收缺失启动子 -GUS-T nos的片段，插入 pCAMBIA2300的 Sma I/BamH I位点。 pE的获得是先通过 Ssp I/Nco I双酶解 p7RPGUS202, 得到 141bp的缺失启动子片段并插入 pDMC202的 Pvu II/Nco I双酶解位点以构建中间质粒 pSNRPGUS, 再将其用 Xho Ι/Bgl II双酶解，回收缺失启动子 -GUS-T nos的片段，插入 pCAMBIA2300的 Sal I/BamH I位点。

将 pDMC202 用 EcoR I/Hind III 双酶解，回收 GUS-T nos 片段并分别插入 pBinl9、 pCAMBIA2300(CAMBIA公司)载体的 EcoR I/Hind III双酶解位点，获得质粒 pBinGUS、 pCAGUS, 作为无启动子的阴性对照。阳性对照采用 pBI121，它含有 35S启动子 -GUS-T nos的表达结构。

对 PCR 阳性植株的叶片组织 GUS活性测定结果表明，自启动子 1〜149长时，启动子仍具有较强的 GUS活性。复制蛋白基因启动子添加了 149〜184区域的调控元件后，使得启动子控制的外源基因在根中高效表达，该元件还能使得启动子控制的外源基因在其他器官如茎、叶中高效表达，其中在叶中的表达量为 CaMV 35S启动子的 2.4倍。

复制蛋白基因启动子添加了 149〜278 区域的调控元件后，使得启动子控制的外源基因高效表达，其中在植物叶中的表达量为 CaMV 35S启动子的 6.6倍。

复制蛋白基因启动子添加了 149〜294 区域的调控元件后，使得启动子控制的外源基因高效表达，其中在植物叶中的表达量为 CaMV 35S启动子的 10.9倍。

对各缺失启动子控制下的 GUS 基因表达载体转化植株进行了根、茎、叶不同部位的组织化学染色。确定了 141至 184含有根特异性表达所必须的调控元件。去除该元件后，使得复制蛋白基因启动子失去在根中控制外源基因表达的特性，但不排除该启动子控制的外源基因表达在其他器官中的表达。

对各缺失启动子控制下的 GUS 基因表达载体转化植株进行了根、茎、叶不同部位的组织化学染色。根部染色结果表明，全长启动子及 1〜184 时的启动子在根尖分生区及根中部维管束中均有较高的活性。

叶片横截面染色结果表明，全长启动子及！〜 149 时的启动子在叶肉及维管组织均有较强的活性，但染色强度存在差异。上述各转化体的 GUS 活性组织化学定位结果与 35S启动子相似，均在叶脉维管组织和叶肉组织显示了较强的蓝色。

茎的横截面染色结果表明，全长启动子及 1〜278 时的启动子在内、外韧皮部、木质部周围薄壁细胞及皮层薄壁细胞均有活性。然而， 1〜184 时的启动子仅在维管束中有活性，薄壁细胞检测不到 GUS活性。结果表明， 149至 184含有韧皮部特异性的调控元件。

转化烟草植株的 PCR检测

按文献 (R. B. Horsch, 1985， A simple method and general method for transfering genes into plant. Science, 227： 1229- 1230) 的方法进行烟草转化及再生植株的筛选。称取卡那霉素抗性植株叶片 100mg，按 B. D. Harrison等 (B. D. Harrison等， 1997， Detection and relationships of cotton leaf curl virus and allied whitefly-transmitted geminiviruses occuring in Pakistan. Ann. Appl. Biol., 130： 61—75)的方法提取基因组总 DNA, 最终 DNA溶解于 50 μ 1 TE缓冲液中。按 B. D. Harrison等 (B. D. Harriso 等, 1997， Detection and relationships of cotton leaf curl virus and allied whitefly- transmitted geminiviruses occuring in Pakistan. Ann. Appl. Biol., 130： 61— 75)的方法以提取的总 DNA为模板，进行 GUS基因的一部分片段的 PCR扩增 (441bp), 引物序列为： 5 ' 端引物： 5 ' -CTGCGACGCTCACACCGATACC-3 ' ； 3 ' 端引物： 5 ' -TCACCGAAGTTCATGCCAGTCCAG-3 ' 。转化烟草植株的 PCR检测结果表明， GUS基因稳定整合于转基因植株中。

包含嵌合 RP全长启动子一 GUS 基因的农杆菌表达载体构建及在农杆菌中的瞬时表达分析

pDMC202(CAMBIA 公司）为无启动子的 GUS-Tnos 中间质粒，首先将 PGEM7ZP1P2的 Nco I/Nsi I双酶解片段插入 pDMC202的 Nco I/Pst 1位点，得到 p7RPGUS202。将其 Hind III/Bgl II 双酶解片段 (包含全长启动子 -GUS-Tnos)插入 pBinl9载体的 Hind III/BamH I位点，得到 pBinRPGUS。将 pDMC202用 EcoR I/Hind III双酶解，回收 GUS-Tnos片段并分别插入 pBinl9、 pCAMBIA2300(CAMBIA公司)载体的 EcoR I/Hind III双酶解位点，获得质粒 pBinGUS, 作为无启动子的阴性对照。阳性对照采用 pBI121，它含有 35S 启动子 -GUS-Tnos 的表达结构。将上述大肠杆菌质粒转入根癌农杆菌中，从电激转化的农杆菌中挑取单菌落， 28'C振摇 16 小时后提取总蛋白，蛋白提取及 GUS活性的定量测定按 Jefferson的方法进行。

首先将全长启动子片段与 GUS基因融合的植物表达载体 pBinRPGUS导入根癌农杆菌，同时以 35S 启动子作对照，测定了菌体总蛋白中 GUS活性。研究结果表明，复制蛋白基因启动子在农杆菌中的活性是 35S 启动子的 2 倍，比农杆菌本底高 45倍，属强启动子类型。 CLCuV 复制蛋白基因启动子 5 ' 端缺失体在农杆菌中的活性分析

作为无启动子的阴性对照质粒 pBinGUS、 pCAGUS, 阳性对照采用 pBI121(含有 35S启动子 -GUS-T nos的表达结构)。将前文构建的含有 CLCuV 复制蛋白基因启动子 5 ' 端缺失体的重组 DNA质粒 pA、 pB、 pC、 pD、 pE按照 BIO-RAD公司电激仪的操作程序，采用电激法转入根癌农杆菌。进一步对复制蛋白基因启动子 5 ' 端顺式元件在农杆菌中的活性进行了分析。结果表明，各种启动子缺失体在农杆菌中的活性不同。 1〜278， 1〜294时启动子仍具有较髙的活性， 1~294时启动子活性是全长启动子的 4倍。但 1〜184, 1〜149时启动子驱动的 GUS活性与本底相似。

Claims

权利要求

1. 一种分离的棉花曲叶病毒 (CLCuV)双向启动子。
2. 按照权利要求 1所述的启动子，它含有 SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列。 3. 按照权利要求 1所述的启动子，它含有 SEQ ID NO: 1所示的启动子上游核苷酸 1〜184的截短的启动子。
4. 按照权利要求 1所述的启动子，它含有 SEQ ID NO: 1所示的启动子上游 1〜278的截短的启动子。
5. 按照权利要求 1所述的启动子，它含有 SEQ ID NO: 1所示的启动子上游 1〜294的截短的启动子。
6. 按照权利要求 1 所述的启动子，其特征在于，其核苷酸序列与权利要求 2 所示的序列具有 80%的同源性。
7. 按照权利要求 1 所述的启动子，其特征在于，它来源于棉花曲叶病毒基因组，是 PCR方法分离的、天然提纯的或通过化学的方法合成的。
8. 一种利用棉花曲叶病毒双向启动子在植物不同组织中高水平表达外源基因的方法，该方法包括以下步骤：

a. 将克隆到的来源于棉花曲叶病毒双向启动子与待表达的外源基因相连，以此构建植物表达载体；

b. 将构建好的植物表达载体导入植物细胞；

c 在适宜的培养条件下将转化后的植物细胞再生，得到表达外源基因的植株。，
9. 按照权利要求 8所述的方法，其特征在于，步骤 a中来源于棉花曲叶病毒双向启动子具有权利要求 2所示的核苷酸序列。
10.按照权利要求 8所述的方法，其特征在于，步骤 a中来源于棉花曲叶病毒双向启动子的核苷酸序列与权利要求 2所示的序列具有 80%的同源性。
11.按照权利要求 8所述的方法，其特征在于，步骤 a中双向启动子是以复制蛋白基因方向与外源基因相连的。
12.按照权利要求 8所述的方法，其特征在于，步骤 a中双向启动子是以外壳蛋白基因方向与外源基因和 AC2蛋白的基因相连的。
13.按照权利要求 8所述的方法，其特征在于，步骤 a中双向启动子中复制蛋白基因方向启动子是转录起始位点，即基因组第 2606核苷酸位置的 A上游的序列，外壳蛋白基因方向启动子是转录起始位点，即基因组第 255核苷酸位置的 T上游的序列。
14. 按照权利要求 8所述的方法，其特征在于，步骤 a中双向启动子是嵌合启动子，含有权利要求 1一 5 中任一权利要求所述的启动子 DNA 的必需的部分，该部分启动子 DNA 能在植物中起作用并能与基因的编码序列相连接而使基因表达。
15. 按照权利要求 8所述的方法，其特征在于，步骤 a中双向启动子被置于各种转译增强因子序列的上游来调控外源基因的表达。
16. 按照权利要求 15 所述的方法，其中，转译增强因子是来自苜蓿花叶病毒的非转译序列 AMV，以及来自烟草花叶病毒 (TMV)的 Ω因子。
17. 按照权利要求 12所述的方法，其特征在于，所述的 AC2蛋白基因是与所有来源的启动子融合使用的，其中所述的所有来源的启动子包括 CLCuV 本身来源的启动子以及其它的所有组成型启动子、组织特异型启动子、诱导型启动子。
18. 按照权利要求 17所述的方法，其中所述的启动子是 CLCuV双向启动子、 CaMV35S启动子、番茄 E8启动子、 Gt3启动子、 role启动子、 CoYMV启动子、 rbcs启动子、 hsp70启动子、或 ΡΙ-Π启动子。
19. 按照权利要求 8 所述的方法，其特征在于，所述的外源基因包括所有旨在改变植物遗传性状的基因。
20. 按照权利要求 8 所述的方法，其特征在于，所述的植物包括双子叶植物和单子叶植物。
21. 按照权利要求 20 所述的方法，其中，所述的双子叶植物是棉花、番茄、油菜、法国豌豆、秋葵、大豆、烟草，以及单子叶植物是禾本科植物水稻、小麦、玉米、大麦、高粱、燕麦。
22. 一种嵌合启动子，包含有权利要求 1 至 7中任意一项所述的启动子和一种调控基因表达的调控元件，该调控元件包括能增强外源基因表达或调控基因在植物中表达部位的各种来源的 DNA序列。
23. 按照权利要求 22所述的嵌合启动子，其中所述的调控基因表达的调控元件是增强子、组成型表达、组织特异性表达、诱导型表达的调控元件。
24. 按照权利要求 22所述的嵌合启动子，其特征在于，在启动子下游包含任意一种旨在增强外源基因表达的序列。
25. 按照权利要求 24所述的嵌合启动子，其中旨在增强外源基因表达的序列是水稻 ^>J1内含子 1、玉米 Ubiquitin内含子 1、玉米蔗糖合成酶基因 Shi内含子 1、玉米乙醇脱氢酶 1一 S基因内含子 1、玉米蔗糖合成酶外显子 1、 3 ' 端表达调控序列 PI-II基因终止子。
26. 一种为了提高双向启动子中外壳蛋白基因启动子表达强度的来自 CLCuV 基因组的 AC2蛋白因子。
27. 按照权利要求 26所述的 AC2蛋白因子，它具有 SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列。
28. 按照权利要求 26所述的 AC2蛋白因子，其特征在于，其氨基酸序列与权利要求 27的序列具有 80%的同源性。
29. 按照权利要求 26所述的 AC2蛋白因子，其特征在于，它来源于棉花曲叶病毒基因组，是天然提纯的或通过化学的方法合成的。