KR20050090411A

KR20050090411A - 식물세포에서의 디엔에이 시퀀스의 발현을 위한 인공프로모터

Info

Publication number: KR20050090411A
Application number: KR1020057011705A
Authority: KR
Inventors: 구일레르모 셀만하우세인 소사; 알베르토 사라자르 로드리구에즈; 다이미 아브레우 레메디오스; 오스마니 라모스 곤잘레즈
Original assignee: 센트로 데 인제니에리아 제네티카 와이 바이오테크놀로지아
Priority date: 2002-12-27
Filing date: 2003-12-19
Publication date: 2005-09-13
Also published as: RU2005123815A; AU2003291914A1; US20060277628A1; JP2006512067A; ZA200505067B; BR0317765A; RU2326167C2; MXPA05006983A; EP1577395A1; AR042552A1; CN1738902A; CA2518966A1; WO2004058979A1

Abstract

본 발명은, 일단 어떤 클래스의 식물 세포에 도입되면, 그 3' 말단에 융합된 DNA 분자의 발현 수준을 높이 증진하도록 되는 키메르 재조합 DNA 분자에 특징이 있는 인공 프로모터에 관한 것이다. 여기서 기술된 프로모터의 기본적 유전 요소는 다음과 같다. : 엑손/인트론/엑손 영역이 따르는, 공통 TATA 박스를 갖는 코어 프로모터 및 번역 활성 잠재적 요소로 이들 모두가 인공적으로 구성된다. 전사 발현 제어 요소는 여기 기술된 프로모터의 엎스트림 삽입되어 질 수 있어 발현에 당대-, 기관- 또는 조직-특이성을 부여한다. 디자인된 인공 유전적 요소는 DNA 시퀀스와 식물 세포에 활성인 프로모터 사이에 기능적으로 삽입될 수 있어 그의 전사/번역 준위를 증진한다.

Description

식물세포에서의 디엔에이 시퀀스의 발현을 위한 인공 프로모터{Artificial Promotor for the expression of DNA sequences in plant cells}

본 발명은 생명공학에 관한 것으로, 보다 상세하게는 식물의 유전공학에 관한 것이다. 특히, 쌍떡잎 식물 및 외떡잎 식물 세포에서 이들에 융합된 뉴클레오티드의 높은 전사/번역 프로모터 활성을 나타내는 키메르 DNA 구조가 주어져, 보다 높은 유전자의 발현 준위 및 대상 DNA 시퀀스를 갖는 유전자 도입 식물을 수득할 수 있게 한다.

식물 유전공학은 신규한 생명공학적 생산품의 상업적 생산 및 기초적인 연구에 매우 생산적인 것으로 증명되어진 기술이다(Hammond J. Curr. Top. Microbiol. Immunol 1999, 240:1-19; Simoens C. and Van Montagu M. Reproduction Update 1995, 1:523-542).

분자 생물학 기술의 수단에 의해 유전자적으로 조작된 식물에 도입된 유전자 또는 DNA 시퀀스의 일시적 또는 공간적 특이성과 강도의 관점에서 적절한 발현을 보장하는 프로모터 신호의 선택은 식물 유전공학의 성공에 매우 중요하다. 이것이 왜 지난 이십년 동안에 요구된 각 도입 유전자의 발현을 확실하게 할 수 있는 프로모터 및 신호의 연구에 다양한 노력이 가해졌는가에 대한 이유이다. 따라서, 다른 유래의 프로모터(plant, viral, Ti or Ri Agrobacterium or chimerical)가 유전자 도입 식물 생산 분야에서 평가되어져 왔고 채택되어져 왔다.

식물 유전적 조작에서 보다 광범위하게 사용된 구조적인 프로모터는 콜리플라워 모자익 바이러스 (Cauliflower Mosaic Virus; CaMV) 35 S ARN 프로모터 (Odell J.T; Nagy F; Chua N.H. Nature 1985, 313:810-812); 에이. 튬페이션스 티아이 플라스미드(A. tumefaciens Ti plasmid) 로부터의 노팔린 합성 유전자(nopaline synthetase gene; nos) 프로모터(An G; Costa M.A; Mitra A; Ha S; Marton L. Plant Phisiol. 1986, 88:547-552), 라이스 액틴-1 유전자 프로모터 (McElroy D; Zhang W; Cao J; Wu R. Plant Cell 1990, 2:163-171) 및 메이즈 유비퀴틴-1(maize ubiquitin-1) 유전자 프로모터(Christensen A.H; Sharrock R.A; Quail P.H. Plant Mol. Biol. 1992, 18:675-689)가 있다.

그러나, 각 이들 자연적인 발현 시스템은 한계를 가지고 있는데, 그것은 주로 그의 발현 준위가 어떤 식물의 클라스에서도 충분히 높지 않기 때문인데, 예를 들어, 가장 광범위하게 사용되는 프로모터인 CaMV 35 S의 발현이 외떡잎 식물에서 보다 타바코 세포에서 보다 강한 반면에, 프로모터 발현은 쌍떡잎 식물 세포에서 낮고, 외떡잎 식물에서는 거의 감지될 수 없다(Topfer R; Maas C; Horicke-Grandpierre C; Schell J; Steinbiss H.H. Methods Enzymol. 1993, 217:67-78; Mitsuhara I; Ugaki M; Hirochika H; Ohshima M; Murakami T; Gotoh Y; et al. Plant Cell Physiol. 1996, 37:49-59). 유사하게, 라이스 액틴-1 및 메이즈 유비퀴틴-1 프로모터는 외떡잎 식물 세포에서 그의 다운스트림 유전자를 아주 효율으로 전사 개시 하지만, 타바코 세포에서 그 프로모터의 활성은 낮다 (Schledzewski K; Mendel R.R. Transgenic Research 1994, 3:249-255).

유전자 도입 식물에서 이종기원의 단백질 발현을 증가하기 위해, 자연적인 프로모터가 전사 또는 번역 인핸서(enhancer)와 결합된 다양한 키메르 프로모터가 디자인되어 왔다. 이들 인핸서 요소 중에서, 타바코 모자익 바이러스(TMV)로부터의 오메가 번역적 인핸서 (Gallie D.R; Sleat D.E; Watts J.W; Turner P.C; Wilson T.M.A. Nucleic Acids Res. 1987, 15:3257-3273 ), 타바코 에치 바이러스(TEV)로부터의 번역적 인핸서 (Carrington J.C; Freed D.D. J. Virol. 1990, 64:1590-1597), 옥토핀 신타제(octopine synthase)로부터의 프로모터 전사적 인핸서 (Fromm H; Katagiri F; Chua N.H. Plant Cell 1989, 1:977-984), 만노핀 신타제(mannopine synthase) (Comai L; Moran P; Maslyar D. Plant Mol Biol. 1990, 15:373-381) 및 CaMV 35S 프로모터 (Kay R; Chan A; Daly M; McPherson J. Science 1987, 236:1299-1302); 자연적인 엑손 및 인트론, 즉 메이즈 알콜 디하이드로지나제(maize alcohol dehydrogenase) 인트론 1 (Callis J; Fromm M; Walbot V. Genes Devel. 1987, 1:1183-1200; Last D.I; Brettell R.I.S; Chamberlaine D.A; Chaudhury A.M; Larkin P.J; et al. Theor Appl. Gen. 1991, 81:581-588), 메이즈 슈크로스 신타제로부터의 제일 엑손/인트론 (Maas C; Laufs J; Grant S; Korfhage C; Werr W. Plant Mol. Biol. 1991, 16:199-207), 라이스 액틴-1 유전자로부터의 제일 엑손/인트론 (McElroy D; Blowers A.D; Jenes B; Wu R. Mol. Gen. Genet. 1991, 231:150-160) 등이 언급될 수 있다. 이러한 새로운 디자인은 쌍떡잎 또는 외떡잎 식물의 식물 세포의 특정 클라스에 주로 강한 프로모터인 2X35S, Mac, Emu 와 그 외의 프로모터 (EP0459643; EP0651812)를 낳았다.(Schledzewski K; Mendel R.R. Transgenic Research 1994, 3:249-255).

쌍떡잎 식물 및 외떡잎 식물 세포 양자에서 유전자를 발현하기 위해 채택될 수 있는 강력한 프로모터의 개발이 있어 왔고, 이 개발은 많은 실험실의 연관된 주제로서, 단지 이것이 나타내는 과학적인 도전 또는 식물의 다양한 클라스를 형질전환하기 위한 유일한 유전적 구성을 가지는 것을 의미하는 세이빙(savings)으로서 뿐 아니라 생명공학적 생산품의 생산과 상업화를 보다 용이하게 하는 그 자체의 발현 시스템을 갖는 것을 의미한다. 특허출원 WO9943838에서 청구된 합성 프로모터는 TATA 박스로부터 전사개시점까지의 증가된 GC 함량(64 % 또는 그 이상)을 갖는 시퀀스로, 그 5' 말단이 35S, 메이즈 유비퀴틴-1 및 옥토핀 신타제 프로모터로부터 전사 인핸서 시퀀스에 융합되어 있다. 한편, 쌍떡잎 식물 및 외떡잎 식물에서뿐 아니라, 침묵 유전자에 동종으로 의존하는 시퀀스를 회피하는 발현을 탐지하기 위해 (Park Y.D; Papp I; Moscone E; Iglesias V; Vaucheret H; Matzke A; Matzke M.A. Plant J. 1996, 9:183-194), 특허출원 WO0058485은 두 식물 바이러스 지놈인 콤멜리나 옐로우 모틀 바이러스(Commelina Yellow Mottle Virus; CoYMV) 및 카사바 베인 모자익 바이러스 (Cassava Vein Mossaic Virus; CsVMV)로부터 온 시퀀스의 조합으로부터 유래된 인공 프로모터 및 또한 35S 프로모터로부터의 인핸서 시퀀스를 청구하고 있다.

다른 유전적 요소가 뉴클레오티드 시퀀스의 전사 또는 번역을 고양하게 하는 메카니즘은 여전히 명확하지 않다. 예를 들어, 많은 RNA 바이러스로부터의 리더 시퀀스가 5' 말단에 융합된 cap (m7G (5')ppp (5')N)의 존재와 별도로 다른 메신저 RNAs (mRNA)의 번역을 고양할 수 있다는 것이 보고되어 있다 (Sleat D.E; Wilson T.M.A. 1992. Plant virus genomes as sources of novel functions for genetic manipulations. In: T.M.A. Wilson & J.W. Davies (Eds), Genetic engineering with plant viruses. CRC Press, Inc. p.55-113; Gallie D.R; Sleat D.E; Watts J.W; Turner P.C; Wilson T.M. Nucleic Acids Res. 1987, 15:8693-8711). 그러나, RNA를 제외하고는 모든 이들 바이러스의 리더의 이차 구조는 복잡하지 않고 그의 번역적 인핸서 특성에 반응하는 그 뉴클레오티드 시퀀스 사이에 다른 공통적인 요소가 결정되지 않았다.

특히, TMV 오메가 분획의 번역 고양은 그의 시퀀스에서 반복되는 옥타머(octamer)인 ACATTTAC의 적어도 한개의 카피 및 결정적 모티브((CAA)n 영역의 두 카피는 높은 인핸서 수준을 부여하기에 충분함)로 여겨지는 25-베이스 (CAA)n 영역의 존재에 기인한다고 보고되어 있다 (Gallie D.R; Walbot V. Nucleic Acids Res. 1992, 20:4631-4638). 그러나, 포테이토 X 바이러스 (PVX) 리더로부터의 28-베이스인 CA-리치 영역은 그 자체로는 번역 인핸서 활성을 나타내지 않지만 (Pooggin M.M; Skryabin K.G. Mol. Gen. Genet. 1992, 234:329-331), 반면 PVX 리더의 CA 영역에 존재하는 CCACC 펜타뉴클레오티드는 18S rRNA의 3' 말단과 짝하는(pairing) 상호작용을 가질 것이라는 것이 보고되었다 (Tomashevskaya O.L; Solovyev A.G; Karpova O.V; Fedorkin O.N; Rodionova N.P; Morozov S.Y; Atabekov J.G. J. Gen. Virol. 1993, 74:2717-2724).

몇몇의 바이러스 리더는 최적의 번역 수준을 달성하기 위해 두 개를 요구하는 알팔파 모자익 바이러스 (Alfalfa Mosaic Virus; AlMV)의 RNA3 리더 내의 27-염기의 반복된 영역에서 발견된 소위 내부 컨트롤 영역 타잎 2 (ICR2) 모티브 (GGTTCGANTCC) 및 포테이토 바이러스 S (PVS) (Turner R; Bate N; Tewell D; Foster G.D. Arch. Virol. 1994, 134:321-333)같은 카라바이러스(carlavirus) 리더에서 보존된 CCTTTAGGTT 시퀀스와 같이 번역 인핸서 활성에 포함된 시퀀스 요소를 가진다는 것이 결정되었다 (van der Vossen E.A.G; Neeleman L; Bol J.F. Nucleic Acids Res. 1993, 21:1361-1367).

TEV 리더의 경우에 있어서, 각각 뉴클레오티드 28 내지 65와 66 내지 118 사이의 소위 CIRE-1 및 CIRE-2의 두 영역은 이 148 bp 바이러스 리더의 번역 증진 특성에 책임이 있는 것으로 밝혀져 왔다 (Niepel M; Gallie D.R. J. Virol. 1999, 73:9080-9088). 그러나, CIRE 영역 내부에서 이들 바이러스 리더의 인핸서 활성에 결정적인 것으로 고려되는 특정 요소는 명확히 밝혀지지는 않았다.

위에서 상술한 바와 같이, 자연적 유래의 인트론과 그의 인접 시퀀스는, 특히 인트론이 유전자의 5' 말단의 부근에 있을 때, 다른 유전자 발현 시스템을 고양하기 위해 폭 넓게 채택되어 왔다. 그러나, 인트론 기원, 엑손의 옆 영역(exonic flanking region) 및 세포의 타잎과 같은 인자에 의존하는 유전자 발현의 인트론 매개 고양(IME)이 보고되어 있다. 발현의 강력한 IME는 주로 외떡잎 식물 세포에서 관찰되어 왔지만, 쌍떡잎 식물에서는 그것이 공통적으로 2 내지 5 배를 초과하지는 않는다. IME 뒤의 분자 메카니즘이 완전하게 개시되지는 않았다(Simpson G.G; Filipowicz W. Plant Mol. Biol. 1996, 32:1-41; Schuler M.A. 1998. Plant pre-MRNA splicing. In: J. Bailey-Serres & D.R. Gallie (Eds), A look beyond transcription: mechanisms determining MRNA stability and translation in plants. American Society of Plant Physiologists. P. 1-19; Lorkovic Z.J; Kirk D.A.W; Lambermon M.H.L; Filipowicz W. Trends in Plant Science. 2000, 5:160-167).

외떡잎 식물과 쌍떡잎 식물 세포 사이에서 관찰된 IME 발현의 다양성은 다른 클래스 식물 세포에서 적당한 예비-mRNA 프로세싱에 요구되는 충족요건의 공지된 차이에 기인될 수 있다. 사실 쌍떡잎 식물 세포에서가 아니라, 외떡잎 식물 세포에서 인트론 시퀀스에서 AU-리치 세그먼트의 존재는 그의 진행에 필요불가결한 것이 아니다; 외떡잎 식물 세포는 높은 GC-함량(50% 이상)과 복잡한 이차 구조(헤어핀-루프)를 가지고 인트론 제거(process)를 할 수 있어, 쌍떡잎 식물 세포가 복잡한 이차 구조로 인트론을 제거할 수 없다는 것을 나타낸다(Goodall G.J; Filipowicz W. The EMBO Journal 1991, 10:2635-2644; Lorkovic Z.J; Kirk D.A.W; Lambermon M.H.L; Filipowicz W. Trends in Plant Science. 2000, 5:160-167). 이들 이유는, 적어도 부분적으로는, 왜 인공적으로 뉴클레오티드 시퀀스 발현을 위해 IME 채택하는 현행 시스템이 클래스-특이적인가를 설명할 수 있다.

도 1은 전사 시작점으로부터 리치 액틴-1 (Act), 메이즈 유비퀴틴-1 (Ubi) 및 메이즈 슈크로스 신타제(Shrun) 유전자 시퀀스를 나타낸다. 상단 케이스에서는 제일 엑손이 하단 케이스에는 제일 인트론 5 영역이 도시되고, 반복되고 공통된 시퀀스 모티브의 위치는 밑줄쳐 졌다.

도 2는 유레카 인공 번역 인핸서 시퀀스로, 그의 관련 요소 및 제한 엔도뉴클레아제 인지 사이트가 도시된다.

도 3은 그 성분 분획의 각각을 나타낸 ART 엑손/인트론/엑손 인공 시퀀스이다(최하단케이스: 인공 인트론; UUUUUAU-형 시퀀스를 제작하기 위해 삽입된 염기는 이중 밑줄쳐짐; 단일 밑줄쳐진 것은 제한 엔도뉴클레아제에 대한 관련 인지 사이트를 표시함).

도 4는 ART 엑손/인트론/엑손 영역 (하단케이스에 인트론 염기, 상단케이스에 엑손 염기) 및 인공 번역 인핸서 유레카에 융합된 프로모터 (하단케이스의 이태릭체)를 나타내는 본 발명 대상(PARTE 프로모터)의 일차구조이다. 제한 엔도뉴클레아제에 대한 관련 인지 사이트는 밑줄쳐짐: TATA 박스는 이중 밑줄 그리고 번역 시작 코돈은 고딕체이다.

도 5는 PARTE 프로모터 (하단케이스 이태릭체는 프로모터, 하단케이스는 인트론, 상단케이스는 엑손)에 융합된 라이스 액틴-1 5'제어 영역(상단케이스의 이태릭체인 전사 시작점으로부터 -43에서 -310까지 영역)을 나타내는 APARTE 프로모터의 일차구조이다. 밑줄 부분은 제한 엔도뉴클레아제에 대한 관련 인지 사이트를 나타냄: TATA 박스는 이중 밑줄 그리고 번역 시작 코돈은 고딕체이다.

도 6은 그 성분 요소로: 상부케이스에 메이즈 ubi-1 유전자 전사 시작점으로부터 -299에서 -855까지 영역; 상부 케이스 고딕체로의 as-1-형 전사 인핸서; 상부케이스 이태릭체의 라이스 act-1 유전자의 전사 시작점으로부터 -43에서 -310까지 영역; 하부케이스의 PARTE 프로모터;를 나타내는 U3ARTE 프로모터의 일차구조이다(TATA 박스는 이중 밑줄, ART 인트론은 이태릭체 그리고 번역 시작점은 단일 밑줄쳐짐).

도 7은 본 발명의 인핸서 요소 대상을 갖는 프로모터 변형체이다.A: 35SEureka; B: 35SART; C: 35SARTE; D: PARTE; E: APARTE; F: 2A1PARTE; G: 2APARTE; H: U3ARTE. 35S 프로모터 (1.3Kb); 번역 인핸서 유레카;

ART엑손/인트론/엑손;인공프로모터코어; 라이스 액틴-1 유전자 5 활성영역(-43부터 -221까지);라이스 액틴-1 유전자 5'활성영역(-226부터 -310까지) ;ASP(as-1-형 인핸서); 메이즈 유비퀴틴-1 프로모터 5활성 영역(-299 부터 55).

도 8은 그 성분 요소로: 상부케이스 이태릭체에 전사 시작점으로부터 -31에서 -245까지 라이스 gluB-1 유전자 영역; PARTE 프로모터를 나타내는 GARTE 프로모터의 일차구조이다(프로모터는 하단케이스 이태릭체에, 인트론은 하단케이스에; 엑손은 상단케이스에; 관련 제한 사이트는 밑줄쳐지고; TATA 박스는 이중 밑줄, 그리고 번역 시작점은 고딕체임).

도 9는 pUC-GUSint 맵이다.

도 10은 pBPFΩ (omega) 7 맵이다.

도 11은 pBPFA19-linker 맵이다.

도 12는 가속된 마이크로프로젝틸 충격에 의해 도입된 GUSint 유전자를 고착하는 다른 유전적 컨스트럭션의 일시적 발현 수단에 의해 라이스 세포에 ART 및 유레카 요소 기능성의 X-Gluc 히스토케미칼 염색에 의한 비교적 입증을 나타낸다.

미생물의 기탁(Microorganism Deposits)

플라스미드 pC-EURGUSint; pC-ARTEGUSint; pGARTEGUSint y pC-U3ARTEGUSint는 부다페스트 조약 하에 'Fiers-Schell-Van Montagu' building, Technologiepark 927, B-9052 Gent-Zwijnaarde, Belgica 소재의 Belgian Coordinated Collection of Microorganism, Plasmid Collection (BCCM/LMBP) Universiteit Gent에 기탁되었다. 각 플라스미드 pC-EURGUSint; pC-ARTEGUSint; pGARTEGUSint는 각각 LMBP 4727; LMBP 4725; LMBP 4728의 어세스 번호로 2003년 5월 19일, 그리고 pC-U3ARTEGUSint는 4791의 번호로 2003년 11월 25일 기탁되었다.

본 특허 출원에서 제안된 발현 프로모터 시퀀스는 일련의 명확한 특색으로, 1) 이것은 쌍떡잎 식물에서 뿐 아니라 외떡잎 식물 세포에서 활성인 것으로 보편적으로 작용하여, 대상 DNA 시퀀스 및 유전자의 높은 발현 준위로 어떤(any) 클래스의 유전자 도입 식물의 획득을 가능하게 하고, 2) 이것은 IME에 의해서 뿐 아니라, 그의 번역을 촉진시킴으로써 mRNA 준위가 증가하는, 인공적으로 조합된 유전적 요소의 조합에 기초되며, 3) 이 프로모터에서 자연적 또는 바이러스 유전자에 동일한 시퀀스를 가진 긴 DNA 분획의 결핍은 식물에서 동종유래 재조합의 결과로서 새로운 바이러스 종 또는 균주의 출현 가능성과 RNA-매개 동종유래의 유전자 침묵의 위험을 최소화하고, 4) TATA 박스로부터 전사 시작점까지 시퀀스의 GC 함량은 필수적으로 높지 않고, 5) 본 프로모터 시퀀스의 다재다능성(versatility)은 그의 5' 말단 전사 제어 요소에 삽입될 수 있어, 발현을 위한 시간적인 조절, 기관 또는 조직-특이성을 부여하고; 6) 이것을 포함하는 인공적인 유전적 요소는 또한 식물 세포에서 활성인 프로모터와 DNA 시퀀스 사이에 기능적으로 삽입될 수 있어 그의 전사/번역을 증가하는 특색을 제공한다.

키메르의 엑손/인트론/엑손 영역은 모든(any) 클래스의 식물 세포에서 mRNA 축적의 높아진 활성을 기도하고, 인공적인 번역 인핸서와 그 기능적 합체는 본 특허출원의 두 가지 필수적인 요소를 구성하는데, 이는 이들 요소가 식물 세포에서 대상 DNA 시퀀스를 효율적으로 발현하게 하기 때문이다.

우리가 영역, 분자 또는 DNA 시퀀스가 인공적인 또는 키메르라고 칭할 때, 비록 그 시퀀스의 적은 분획이 자연적 기원을 가질 수 있지만, 우리는 이것의 생체외에서(in vitro) 디자인되고 합성된 것을 언급하는 것이고, 따라서 이것은 동일한 일차 DNA 구조를 갖는 유전적 요소가 아님을 명확히 하는 것이 중요하다.

발현의 IME를 증진할 수 있는 그의 상응하는 인접 엑손의 시퀀스를 갖는 인트론을 디자인하기 위해, 우리는 어떤 시퀀스 모티브와 유전적 구성요소가 보고된 전사 인핸서 활성을 갖는 식물 인트론에 공통되는 것인지를 연구했다. 동시에 우리는 그 GC 함량과는 별개로, 쌍떡잎 식물 및 외떡잎 식물에서 이 인트론의 적절하고 효과적인 제거(processing)을 달성하는 과제를 해결하였다.

광범위하게 사용되는 전사 인핸서 프로모터인 라이스 액틴-1, 메이즈 유비퀴틴-1 및 슈크로즈 신타제-1 인트론 시퀀스를 비교할 때, 이들 전부에서 공통되고 반복된 시퀀스 모티브가 검출될 수 있다(도 1). 이들 인트론이 부여하는 유전자 발현의 IME에 대한 이들 모티브의 이행능력이 입증되지는 않았지만, 다양한 식물 프로모터에서의 TATA 박스의 5' 영역에서와 이들 영역에서의 CTCC 모티브(또는 그의 동종 시퀀스인 CTC, TCC 및 TC)의 높은 보존 준위는 이것이 전사 인자의 결합에 유리할 수 있어, RNA-폴리머라제 II 활성을 촉진할 수 있다는 가능성을 나타낸다. 동시에, 보고된 번역적 인핸서 활성을 갖는 바이러스 리더 내 및 제일 엑손(리더를 번역하지 않은 비번역 mRNA로 잔존하는 영역) 내의 보존 및 풍부한 C 및 A-리치 시퀀스는 이러한 시퀀스가 얻어진 mRNA의 안정성 및 그의 번역능을 증진할 수 있다는 것을 암시한다.

상술된 이론의 어느 것도 완전한 과학적 입증이 없고, 따라서 특정된 반복된 시퀀스 모티브를 포함하는, 인접한 엑손 시퀀스를 갖는 인공적 인트론의 구성이 높은 전사 수준과 mRNA의 축적을 증진하는 영역이 된다는 것이 불명확하다는 것은 강조될 수 있다. 그러나 우리의 연구 결과는 이것을 나타낸다.

다른 인트론(그의 상응하는 엑손을 갖는 것) 간의 상기 언급된 비교 연구로부터, 우리가 유전자 발현의 IME에 관련된 것으로 고려한 모티브에 풍부한 라이스 안틴-1 및 메이즈 유비퀴틴-1 인트론/엑손 시퀀스 분획을 조합한 인공적인 엑손/인트론/엑손을 디자인하기로 하였다. 이 목적을 달성하기 위하여, 우리는 얻어진 인공적 인트론이 쌍떡잎 식물 세포에서 유효하게 제거되어서, 유전자 발현의 증가가 이들 클라스의 식물에서도 역시 일어날 수 있다는 것을 고려하여야 한다. 그럼에도 불구하고, 우리가 프라임 물질로 사용한 인트론 시퀀스가 높은 GC 함량과 풍부한 헤어핀-루프를 갖는 복잡한 이차 구조를 가지고, 그의 AG 어셉터 3' 스플라이싱 사이트의 시퀀스는 분기점 공통 시퀀스(branch point consensus sequence)와 약간 다르고, 따라서 이들 인트론은 쌍떡잎 식물 세포에서는 어렵게 제거될 수 있다는 것을 밝혀냈다.

우리들에 의해 디자인된 엑손/인트론/엑손의 이차 구조를 단순화하여, 이것이 어떤 클라스의 식물 세포에서도 진행될 수 있도록 하기 위해, 그의 시퀀스에 약간의 세심한 변경을 하고 그 프로세싱을 활성화하는 시퀀스 UUUUUAU-형을 삽입하기로 결정하였다 (Gniadkowski M; Hemmings-Mieszczak M; Klahre U; Liu H.X; Filipowicz W. Nucleic Acids Res. 1996, 24:619-627). 그외에도, 키메르 시퀀스는 제이 엑손에 융합되고, 쌍떡잎 식물(예를 들어, 타바코)에서 그의 효과적인 진행의 이점을 취하는 메이즈 액틴-1 유전자 제이 인트론 (IVS2)에 삽입된다 (Goodall G.J; Filipowicz W. The EMBO Journal 1991, 10:2635-2644). 각 인공적 엑손/인트론/엑손 변형체의 추정 이차 구조는 PCFOLD 4.0 프로그램을 사용하여, 컴퓨터적 방법으로 연구되었다 (Zuker M. Meth. Enzymology 1989, 180:262-288). 여기서 만들어진 인공적인 엑손/인트론/엑손 시퀀스는 이러한 점으로부터 ART로 지칭될 것이다.

이미 상술된 바와 같이, 본 특허출원의 제이의 관련 구성물은 유전자 발현 준위를 증가하기 위하여 키메르 엑손/인트론의 다운스트림으로 융합된 인공적 번역 인핸서이다.

인공적 번역 인핸서는 몇 바이러스 리더 상에 형성된 이차 구조 및 시퀀스의 분석으로부터 디자인된다. 이 분석으로부터, 번역 인핸서에는 세 가지의 필수적 요소가 있다는 결론을 얻었다: 1) 이차 구조의 낮은 복잡성; 2) C 및 A-리치 시퀀스 세그먼트; 3) 노출되고 자주 반복되고 및/또는 낮은 녹는점 꼬리를 갖는 구조의 헤어핀 안에 있는, 공통 HCAYYY 시퀀스와 83%까지의 동종성을 갖는 모티브 (H= C or U or A; Y= C or U , 표 1참고).

몇가지 RNA 바이러스 리더 분획에서 구조적으로 보전된 시퀀스 (H=C/U/A; Y=C/U).

바이러스리더	시퀀스
TMV	ACAUUUAC
TEV (CIRE-1)	GCAUUCUA
TEV (CIRE-2)	UCAUUUCU
PVS	ACCUUUAG
AlMV(RNA3)	UAAUUCG
AlMV(RNA3)	ACUUUUC
PVX	CCAAUUG
BMV	AACAUCGG
RSV	CCAUUCA
Consensus	HCAYYY

상기에서 지적된 전제로부터, 각각이 헤어핀-루프 구조인 시퀀스 HCAYYY-형이 C 및 A-리치 시퀀스의 45-베이스 내에 삽입된 인공적 번역 인핸서가 디자인되었다. 이 인공적 번역 인핸서는 그 조합에 채택된 이론적 전제를 제공하는 RNA 바이러스 리더와 55% 이하의 동종성을 가지고, 100%의 동종성을 갖는 6 뉴클레오티드보다 많은 시퀀스 세그먼트는 없다. 이것이 왜 우리가 우리의 번역 인핸서가 이미 보고된 또는 보호된(EP 0270611) 어떤 번역 인핸서의 유도체가 아니고, 이들로부터 직접적으로 유도된 시퀀스를 가지지도 않는다는 것을 확신하는 이유이다.

대상 유전자의 융합 및 그 조작을 용이하게 하기 위해, 제한 사이트가 본 번역 인핸서에 부가된다. 마지막으로, 우리가 만든 인공적 엑손/인트론에 새로운 번역 인핸서를 융합하기 전에, 그의 기능성은, TMV 오메가 분획과 비교할 때 키메르 유전자의 발현을 고양하는 동일한 능력을 생체내에서 보여준다. 우리를 위해 만들어진 이 인공적 번역 인핸서는 유레카(Eureka)라고 지칭될 것이다(도 2).

본 특허에 청구된 프로모터 시퀀스를 구성하기 위해, CaMV 35 S -24 내지 -4 영역(전사 시작점으로부터)에 융합된 공통 TATA 박스 (Joshi C.P. Nucleic Acids Res. 1987, 15:6643-6653)에 의해 형성된 코어 프로모터가 먼저 디자인되고, 액틴-1 -5 내지 +27 프로모터 영역이 다음을 이루어서 전사 시작점 및 C 및 A-리치 영역을 제공한다. 메니즈 유비퀴틴-1 영역인 전사 시작점으로부터 +26 내지 +72는 다운스트림 융합되어, AC- 및 TC-리치 영역을 제공하고, 제1 인공 엑손을 얻고, 제 1 인공 엑손은 그의 IVS2 인트론의 5' 스플라이싱 사이트 앞의 12 base와 그 자체를 포함하는 메이즈 액틴-1 제2 엑손에 연결된다. 염기 변화, 부가 또는 탈락이, RNA 성숙에 영향을 미칠 수 있는 추정적 이차 구조를 회피하기 위해 컴퓨팅 방법의 예단에 따라 이 결합 주위에서 일어난다. 우리를 위하여 디자인된 인공적인 인트론은 메이즈 유비퀴틴-1 제일 인트론의 5' 영역으로부터 37 염기에 융합되고, 전사 시작점으로부터 염기 +89 내지 +126에 상응하는, IVS2 인트론의 제 일 54 염기로 구성되고, 그 뒤에 라이스 액틴-1 제일 인트론으로부터 375 염기(이 유전자 전사 시발 사이트로부터 위치 +103 에서 +477까지)가 따르는데, 이는 메이즈 유비퀴틴-1 인트론 3' 말단으로부터 33 염기(전사 시작점으로부터 위치 +1051 에서 +1083까지)에 융합되고 액틴-1 IVS2 인트론의 제이의 절반(이의 3' 프로세싱 시작점으로부터 위치 -52에서 +5까지)과, 제한사이트 및 번역 시작 공통 시퀀스를 포함하는 29-염기 키메르 시퀀스 (Lutcke H.A; Chow K.C; Mickel F.S; Moss K.A; Kern H.F; Scheele G.A. The EMBO Journal. 1987, 6:43-48)에 연결된다. 우리를 위해 만들어진 인공적 엑손/인트론/엑손 ART 시퀀스는 도 3에 도시된다. 구성된 인공적 엑손/인트론/엑손의 유효한 프로세싱이 일단 타바코 및 라이스 세포 양자에서 일시적인 발현에 의해 시험되면, 번역 인핸서 유레카는 그의 3' 말단에 융합되며, 이는 본 발명의 대상 프로모터 시퀀스 (PARTE 프로모터)의 최종구조로 도 4에 나타난다.

공통적으로 사용된 라이스 액틴-1 유전자 제일 엑손/인트론/엑손보다 우리에 의해 디자인된 인핸서 요소 ART는 유전자 발현 인핸서로서 보다 높은 효능을 보였음이 강조되어야 한다.; 유레카 분획은 그 활성에 부가적인 인핸서이다.

이 연구에서, 우리가 기초한 이론적 개념의 유효성을 입증하는, 어떤(any) 클라스의 형질 도입 식물 세포에서 DNA 시퀀스의 발현을 고양하는 아주 효과적인 두 인공적 유전적 요소가 처음으로 달성되어 질 수 있었다. 52% 이하의 AT 함량을 갖는 인공적 프로모터가 쌍떡잎 식물 세포에서 적정하게 프로세싱되어 발현의 높은 IME를 촉진하는 것은 또한 처음이다. ARN 바이러스 리더와 낮은 동종성을 갖는, 완전히 인공적인 고효율의 번역 인핸서의 구성 또한 신규하다.

다른 전사 인핸서 시퀀스가 본 발명의 프로모터 시퀀스 대상 5'에 융합된다. 따라서, 라이스 액틴-1 영역 -43 내지 -310까지(전사 시작점으로부터)가 도 5에 도시된 바와 같이 프로모터 PARTE의 5' 말단에 융합되어 프로모터 영역 APARTE을 형성하고, 또한 as-1-형 전사 인핸서 요소 (Benfey P.N; Chua N.H. Science, 1990, 250:959-966) 및 메이즈 유비퀴틴-1 프로모터의 5' 영역으로부터 556-염기 분획(전사 시발 사이트로부터 -299에서 -855까지)을 가진, 최종적으로 그 구조가 도 6에 도시된 U3ARTE 프로모터를 수득한다.

많은 프로모터 시퀀스 변형체가 기술된 유전적 요소(도 7참고)로부터 구성되었고, 생체내 분석의 수단(in vivo assays)에 의해 그의 기능성을 입증하며, 채택된 모든 인핸서 및 활성자 영역 유전자 발현 이상의 결합상승효과(synergic effect)를 입증한다.

전사 인핸서로 본 구성에 채택된 as-1 요소(도 6 참고)는, 이것이 옥토핀 신타제 팔린드롬의 고양자(Ellis J.G; Llewellyn D.J; Walker J.C; Dennis E.S; Peacock W.J. EMBO J. 1987, 6:3203-3208; EP0278659)와 50% 이하의 동종성을 가지고, 엘리스 등(Ellis et al)에 의해 수행된 연구(Bouchez D; Tokuhisa J.G; Llewellyn D.J; Dennis E.S; Ellis J.G. EMBO J. 1989, 8:4197-4204; USPat. 5,837,849)에서 청구된 시퀀스 변형체의 어느 타잎에도 동일하지 않고(85% 이하의 동일성), 여기에서 발견된 TGACG 모티브가 유일한 플랭크 시퀀스 (flank sequence) 부분에서 발견되었기 때문에 혁신적인 디자인을 가진다

비록 라이스 액틴-1 유전자가 다른 유전자를 발현하기 위해 기술되고 사용되었지만(McElroy D; Zhang W; Cao J; Wu R. Plant Cell 1990, 2:163-171; WO9109948), 우리의 연구는 이종기원의 발현 인핸서로서 그것의 용도와 5' 영역의 전사 인핸서 활성을 밝혔다는 것을 강조하는 것이 중요하다. 유사하게, 메이즈 유비퀴틴-1의 5' 전사 인핸서 영역의 용도가 청구되었지만(EP0342926), 우리가 채택한 556-염기 분획은 이 인핸서 기능성에 필수적인 것으로 정의된 "열 쇼크" 요소(이것은 이 프로모터 시퀀스의 위치 -118에서 -214 사이에서 발견됨)를 포함하지 않고, 따라서 이것은 최초의 것이고, 우리에 의해 사용된 유비퀴틴 시퀀스의 전사 인핸서 활성을 제거하지 않는다.

PARTE 프로모터는 또한 라이스 gluB-1 유전자(Takaiwa F; Oono K; Kato A. Plant Mol. Biol. 1991, 16:49-58)의 전사 시작점으로부터 -31에서 -245 영역에 상응하는 작은 214-염기 분획(transient expression assay)에 융합되어 신규한 프로모터 영역 GARTE를 형성한다 (도 8). 일시적 발현 어세이는 새로운 인공적 프로모터 GARTE가 종자 배젓에서 DNA 시퀀스를 발현하기에 아주 효율적이다는 것을 입증한다.

따라서, 우리는 이들 키메르의 5' 전사 인핸서들의 기능적 조합은 신규하고, 식물 세포에서 이들이 속하는 클라스에 상관없이 DNA 시퀀스의 높은 발현 준위를 달성하게 하는 유전적 요소를 생산하는데 아주 유용하다고 결론지었다.

명확하게, 높은 발현 준위를 달성하고 및/또는 발현에 대해 시간적인 조절, 기관 또는 조직 특이성 부여하기 위해 다른 프로모터로부터 다른 5' 조절자 영역이 본 발명의 대상물에 cys-융합될 수 있다.

유전 공학 기술에 경험이 있는 사람에게, 여기서 기술된 것이 외떡잎 식물 또는 쌍떡잎 식물 세포에서 DNA 시퀀스의 전사/번역을 고양하기 위해 식물 세포에서 전사 프로모터 요소와 조합으로, ART 및 유레카의 사용을 가능하게 한다. 유사하게, 우리를 ART 및 유레카의 디자인으로 이끄는, 우리의 관찰로부터 얻어진 이론적 개념이 분자 생물학 기술 분야에서 경험이 있는 이들에 의해 식물 세포에 새로운 DNA 발현 인핸서 시퀀스를 구성하기 위해 채택될 수 있다.

최근 이십년 동안에 식물 유전공학의 증가하는 발전을 고려하면, 어떤 유전자 및 전사 터미네이터 시퀀스에 결합된 본 발명의 대상 프로모터는 모든 식물세포에 유전적 형질전환 벡터에, 잘-확립되고, 효과적인 기술의 사용에 의해 삽입될 수 있으며, 대상 유전자를 발현할 수 있는 유전자 도입 식물을 수득하는 것이 명백하다.

본 특허 출원에서, 유전적 형질전환 벡터는 식물세포에 그 안에 이미 삽입된 DNA 분획을 도입하기 위한 수반 담체로 작용하는 DNA 분자(박테리아 세포 또는 바이러스 내부에 포함되거나 또는 정제된 것)를 언급한다.

실시예 1: 식물 세포에 DNA 시퀀스의 발현을 위한 새로운 키메르 시스템의 구성 요소의 컨스트럭션

모든 합성된 DNA 분획은 그의 컬렉트 클로닝을 보다 용이하게 만들기 위해 말단을 다른 타잎-II 제한 엔도뉴클레아제 제한 사이트에 붙임으로 제작된다.

a) 유레카 번역 인핸서 클로닝.

번역 인핸서 유레카에 상응하는 86 염기 쌍(bp)의 DNA 분획(SEQ ID NO: 1)은 합성 DNA 분획의 디자인에 포함되는 양 효소에 말단을 붙이는데 유리한 제한 효소 Pst I 및 Sac I로 이미 단리된 벡터 pBluescript II SK (Stratagene, USA)에 클론된다. 얻어진 플라스미드는 pBS-Eureka로 명명된다.

b) 인공 엑손/인트론/엑손 영역 ART의 어셈블.

인공 엑손/인트론/엑손 영역 ART는 디자인된 DNA 분획을, 하나 뒤에 다른 것을, 클로닝, 어셈블링함에 의해 구성된다. 먼저, 코어 프로모터 제일 엑손 및 인공 인트론 부를 포함하는 DNA 합성적 분획인 P35AcU (SEQ ID NO: 2)는 Eco RI 및 Spe I 제한 효소로 단리된 pBluescript II SK 벡터에 클론되어, 플라스미드 pBS-AcU를 수득한다. 그 후, 이런 플라스미드는 Spe I 및 Sac I로 단리되어, 인공 인트론 부를 코드하는 DNA 합성적 분획 I-U/Ac (SEQ ID NO: 3)을 이것에 삽입한다. 이것이 pBS-AcUAc 플라스미드를 수득하는 방법이다.

다음으로, 인공 인트론의 말단을 고착하는 DNA 합성적 분획 I-Ac/U (SEQ ID NO: 4)은 제한 효소 Bam HI 및 Sac I로 단리된 pBS-AcUAc 플라스미드에 삽입되어, 플라스미드 pBS-AcUAcU를 생산한다.

분획 IniT (SEQ ID NO: 5)가 SpeI / SacI-단리 pBS-AcUAcU 안에 삽입될 때, 인공 엑손/인트론/엑손 ART는 완성되어(SEQ ID NO: 6) pBS-ART가 되며, pBluescript II 벡터의 제한 사이트 EcoRI와 SacI사이의 일차 구조가 시퀀스 SEQ ID NO: 7에 도시되었다.

c) PARTE 프로모터 컨스트럭션.

본 발명의 대상 프로모터 시퀀스 (PARTE 프로모터)를 구성하기 위해, 코어 프로모터 및 엑손/인트론/엑손 영역 ART(3' 영역이 제외)를 포함하는 DNA 분획은, XhoI / PstI 단리에 의해 pBS-ART 플라스미드로부터 수득되고, 같은 엔자임으로 단리된 pBS-Eureka 플라스미드 안에 이것을 삽입하는 된다. 따라서, 플라스미드 pPARTE (도 4, 도 7D)를 얻으며, EcoRI 와 SacI 사이트 사이의 시퀀스가 시퀀스 SEQ ID NO: 9에 도시된다.

실시예 2: 식물 세포에서 유레카 및 ART 인핸서 요소 기능성 입증.

a) 타바코 세포에서의 번역 인핸서 유레카 기능성.

타바코 및 라이스 세포에서 유레카의 인핸서 파워를 검증하기 위해, 일련의 보조(auxiliary) 유전 컨스트럭션이 제작되었다.

Sna BI 사이트에 삽입된 포테이토 ST-LS1 유전자 IV2 인트론을 갖는 레포터 유전자 uidA (GUSint)는 플라스미드 pUC-GUSint의 Nco I / Sac I 단리에 의해 수득되고(도 9), 플라스미드 pBS-Eureka의 동일 사이트에서 클론되어, 벡터 Pbs-EURGUSint를 얻는다. 이것은 더욱이 제한 효소 PstI, SalI로 단리되고, S-1 뉴클레아제로 처리되어 플라스미드 pBS-ΔEURGUSint를 얻으며; 이는 pBPFΩ (오메가) 7 벡터(도 10)에 삽입되는, GUSint 유전자에 융합된 유레카 인핸서를 포함한 DNA 분획을 얻기 위해 Xho I / Kpn I로 단리된다. 따라서, CaMV 35S 프로모터 (1.3 kb version), 유레카 인핸서 및 Agrobacterium tumefaciens nos 유전자 전사 종료 신호 (tNOS)의 제어하에 GUSint 유전자 발현을 하는 pBPF-EURGUSint 벡터 (도 7A)를 얻었다.

컨스트럭션 pBPF-EURGUSint의 발현을 평가하기 위한 대조로서, pBPFΩ(omega) 7 벡터 SmaI 와 KpnI 사이트 사이에서, SalI / Klenow 와 KpnI 단리에 의해 플라스미드 pUC-GUSint로부터 얻어진, GUSint 유전자를 클로닝한 플라스미드 pBPFΩ(omega)-GUSint가 구성된다. 이 플라스미드는 유레카 대신에 GUSint를 조절하는 번역 인핸서 Ω (omega)의 존재를 제외하고는 pBPF-EURGUSint에 유사하다.

다른 대조 플라스미드는 Klenow 및 플라스미드 자가-결찰(self-ligation) 처리, Xho I - Nco I 단리에 의해 플라스미드 pBPFΩ(omega)-GUSint의 인핸서 오메가를 제거함에 의해 구성되어, pBPF-GUSint 벡터를 수득한다.

플라스미드 pBPFΩ(omega)-GUSint, pBPF -GUSint, y pBPF-EURGUSint는 HindIII 단리되어 식물에서 GUSint 발현에 대한 카셋트(cassettes)를 얻는다; 이들은 HindIII-단리 이성분의 벡터 pCAMBIA2300에 클론되어, 각각 이성분의 벡터들인 pC-Ω(omega)7GUSint, pC-GUSint y pC-EURGUSint로 된다.

수득된 이성분의 플라스미드는 A. tumefaciens 균주 LBA4404에 도입되고, 안 등 (An G. Plant Physiol. 1985, 79:568-570)에 의해 기술된 기법에 몇가지 변경을 가한 방법에 따라 NT1 타바코 세포에서 일시적 발현 시험을 함에 의해 인핸서 유레카의 기능성을 분석하였다. 각 이성분의 벡터를 수반하는 Agrobacterium과 타바코 세포를 공배양한 4일 후, 이 세포들은 제퍼슨(Jefferson R.A. 1988. Plant reporter genes: the GUS gene fusion system. In: J.K. Setlow (Ed), Genetic Engineering. Vol.10, Plenum Publishing Corporation. P.247-263)에 의해 기술된 것과 같이 수집되고 처리되어, 그의 β-글루쿠로니다제(glucuronidase; GUS) 활성을 결정하였다. 각 시험은 각 회의 컨스트럭트 당 5 레프리카로 세번 반복하였다. 그 결과는 다음 표에 나타냈다.

타바코 세포에서 번역 인핸서 유레카의 기능성 입증

실험	GUS 활성(Pm 4-MU/min/mg 전체 단백질)				유레카/ Ω (오메가) 비	유레카 / Ω (오메가) 비율 배지
실험	세포 대조군	pC-GUSint	pC-Ω (omega) 7GUSint	pC-EURGUSint	유레카/ Ω (오메가) 비	유레카 / Ω (오메가) 비율 배지
I	0.31±0.01	1.93±1.17	7.15±2.26	7.50±2.60	1.04	1.00±0.33
II	1.10±0.28	2.11±0.18	8.56±1.60	11.22±2.80	1.31
III	0.79±0.19	4.84±1.66	33.2±3.6	21.1±6.1	0.64

표 2에 나타난 결과에서 볼 수있는 바와 같이, 완벽하고, 인공적이며, 효과적인 번역 인핸서로 처음으로 개발된 것으로 입증된 TMV 오메가 리더 시퀀스의 것과 비교하여, 유레카레서의 인핸서 활성 간에 현저한 차이가 없다. 이것은 또한, 모티브 HCAYYY (H=C/T/A; Y=C/T)에 동종인 시퀀스를 갖는 C와 A가 풍부한 시퀀스의 영역을 조합함에 의해 3' 방향 말단에 다운스트림으로 융합된 DNA 시퀀스의 번역을 고양하는 현저한 특성을 갖는 유전적 요소를 구성할 수 있다는 우리의 이론적 개념을 확인한다.

b) 타바코 세포에서 인공적 엑손/인트론/엑손 ART의 기능성.

타바코 세포에서 ART 요소의 기능성을 시험하기 위해, 이것을 Nco I - Sac I로 단리하는 플라스미드 pUC-GUSint로부터 먼저 GUSint 분획이 수득되고, 이것은 동일한 효소로 단리된 pBS-ART 안에 클론되어, 플라스미드 pBS-ARTGUSint를 얻는다. 다음으로, 이 플라스미드는 SalI - BglII로 단리되고 S1-뉴클레아제로 처리되어, pBS-ΔARTGUSint를 수득하며, 이는 XhoI - KpnI로 단리되어 ARTGUSint 분획을 수득하고, 동일한 효소로 단리된 벡터 pBPFΩ(omega)7-GUSint 안에 클론되어 플라스미드 pBPFARTGUSint (도 7B)를 얻으며, 여기서 GUSint 발현은 CaMV 35S 프로모터 (1.3 kb version), 인공 엑손/인트론/엑손 영역 ART 및 A. tumefaciens nos 유전자 전사 종료 신호(tNOS)의 제어하에 일어난다.

플라스미드 pBS-ΔARTGUSint로부터 XhoI / PstI 단리에 의해, 요소 ART를 포함하는 밴드가 수득되며, 이것은 동일한 효소로 단리된 pBS-EURGUSint 벡터 안에 융합되어 플라스미드 pBS-ARTEGUSint를 수득한다. 이것으로부터 XhoI / KpnI 단리에 의해, DNA 분획이 수득되어, 유전적 요소 ART 및 유레카의 신호 하에 GUSint 유전자를 취하여 동일하게 단리된 pBPFΩ(omega)7 벡터에 도입해 pBPFARTEGUSint 플라스미드를 생산한다(도 7C).

플라스미드 pBPFARTGUSint 및 pBPFARTEGUSint는 HindIII로 단리되어 식물에서 GUSint 발현용 카셋트를 얻는다; 이들은 이성분의 벡터 pCAMBIA2300에 클론되어 각각 이성분의 플라스미드 pC-ARTGUSint y pC-ARTEGUSint로된다.

수득된 이성분의 플라스미드는 Agrobacterium tumefaciens 균주 LBA4404에 도입되고, 이 실시예 a) 부분에 기술된 방법을 사용하여 NT1 타바코 세포에서 일시적 발현 시험을 함에 의해 번역 인핸서 유레카의 기능성을 분석하였다. 이 결과는 다음 표 3에 나타냈다.

타바코 세포에서 유전적 요소 ART 및 유레카의 기능성 입증

실험	GUS 활성 (Pm 4-MU/min/mg 전체 단백질)				35SART / 35S Rate	35SARTE/35S Rate
실험	세포 대조군	pC-GUSint	pC-ARTGUSint	pC-ARTEGUSint	35SART / 35S Rate	35SARTE/35S Rate
I	1.13±0.27	4.39±0.96	5.26±1.69	26.3±3.5	1.2	6.0
II	1.77±0.58	6.11±2.45	12.92±2.36	32.0±6.1	2.1	5.2
III	0.69±0.30	2.46±0.77	3.94±1.14	13.5±2.8	1.6	5.5
Media±SD					1.63±0.33	5.57±0.29

타바코 세포에서 ART 기능성 평가의 결과는 인공적 인트론이 올바르게 프로세싱되고, 쌍떡잎 식물 세포에서 발현 인핸서 활성을 가짐을 밝혔다. 본 실험의 결과는 또한 발현 준위에 대한 긍정적인 상승작용은 컨스트럭트 pBPFARTEGUSint에서 ART와 유레카 요소 사이의 상호작용으로부터 얻어졌고, 여기서 공지된 자연적 프로모터 CaMV 35S의 발현 능력의 5 배의 증가가 있다는 것을 보여준다.

또한, 디자인된 인공적 유전적 요소(ART 및 유레카)는 식물 세포에서 활성인 모든(any) 프로모터(이 경우, CaMV 35S 프로모터)와 그의 전사/번역을 증가하는 다른 DNA 시퀀스 (본 경우에 GUSint) 사이에 기능적으로 삽입될 수 있다는 것이 입증된다.

c) 라이스 세포에서의 인핸서 유레카 및 ART 기능성.

일련의 새로운 컨스트럭션이 외떡잎 식물 세포에서 본 인공적 인핸서의 기능성을 입증하기 위해 제작되었다. 먼저, 인공적 엑손/인트론 ART에 그의 5' 말단이 융합된 uidA (gus) 유전자를 고착하는 플라스미드 pBPFARTGUSint로부터 XhoI - KpnI 분획이 같은 제한 효소로 단리된 pBPFA19-linker 벡터 (도 11)에 삽입되어 플라스미드 pBPFA19ARTGUSint를 형성한다. 이 플라스미드에서, pBPFA19-linker에 존재하는 라이스 액틴-1 엑손/인트론/엑손 영역이 인공적 요소 ART에 의해 치환되고, 다른 제어요소인 키메르 프로모터 A 19 (여기서 네겹의 옥토핀 산타제 as-1-형 인핸서는 CaMV 35S 프로모터(400 bp version)에 융합됨) 및 tNOS 전사 종료 신호는 잔존한다.

유사하게, 플라스미드 pBS-ARTEGUSint로부터 XhoI - KpnI 밴드는 pBPFA19-linker 벡터에 클론되어 컨스트럭션 pBPFA19ARTEGUSint를 얻는다. 대조로서 사용된 컨스트럭션인 pBPFA 19GUSint는 플라스미드 pUC-GUSint로부터 GUSint 분획을 NcoI / SacI 단리 pBPFA19-linker 벡터 안에 클로닝함에 의해 제작된다. 사용된 다른 대조 플라스미드는 pBPFΩ(omega)-GUSint이다.

라이스 세포에서 유전자 발현을 고양하기 위한 ART 및 유레카 능력의 정성적 분석은 각종 인디카 펄라(indica Perla)의 유합조직에서 일시적 발현을 분석함에 의해 수행된다. 유합조직은 차아염소산 나트륨(sodium hipoclorite) 및 알코올로 미리 멸균된 성숙된 종자로부터 얻어져, 21일 동안 암실에서 N6-2 배지: N6 염 및 비타민(Chu C.C et al. Scientia Sinic 1975, 18:659); 0.1g/L 미요-이노시톨; 1 g/L 카제인 히드롤리세이트; 2mg/L 2,4 D; 30g/L 슈크로스; 3g/L 피타겔, pH 5.7);에서 배양된다. 형질전환(transformation)은 미세-돌출 충격(micro-projectile bombardment)으로 수행되는데: 충격전에 유합조직은 삼투 전처리를 위해 0.4 M 만니톨로 보충된 N6-2 배지에서 아 배양(sub-cultivate)된다. 1 ㎛ 구형 금 입자(BioRad)가 공개된 기법(Russell D.R., Wallace K.M., Bathe J.H., et al. Plant Cell Rep. 1993, 12:165-169)에 따른 충격을 위한 미세-돌출로서 사용된다. 형질전환은 PDS-1000/He 시스템 (BioRad)을 채택하여 수행되었다. 충격 동안, 30 유합조직이 플레이트의 중앙에 위치되고, 그 조건은: 1100 psi의 압력, 6 cm의 거리, 플레이트 당 원 샷이었다. 충격 후, 유합조직은 동일한 삼투 배지에 16시간 동안 암t실에 남겨져, 그런 다음 만니톨이 없는 N6-2 배지에서 2일 동안 아배양된다. GUS 활성은 히스토케미칼 방법(Jefferson R.A. 1988. Plant reporter genes: the GUS gene fusion system. In: J.K. Setlow (Ed), Genetic Engineering. Vol.10, Plenum Publishing Corporation. P.247-263)에 의해 X-Gluc로 밝혀진다. 평가는 입체현미경에서 각 유합조직에서의 영역과 블루 포인트를 카운팅함에 의해 수행된다(도 12). 표 4는 각 3 레플리카로 4번의 실험 후 얻어진 결과를 나타낸다.

라이스 세포에서 ART 및 유레카 기능성 비교 입증

실험	블루 영역 및 포인트를 갖는 유합조직 %
실험	pBPFΩ (omega)-GUSint	pBPFA19GUSint	pA19ARTGUSint	pA19ARTEGUSint
I	40	60	100	100
II	43	80	93	97
III	33	70	87	90
IV	27	83	93	90
Media±SD	36±6	73±8	93±3	94±4

여기서 볼 수 있는 바와 같이, 이들 실험결과는 또한 외떡잎 식물 세포에서 유전자 발현 인핸서 요소로서 ART 및 유레카의 기능성을 확인한다. 본 분석에서, 인공 엑손/인트론/엑손 ART (pA19ARTGUSint)에 의해 전개된 IME 활성은, 유전자 발현 인핸서 능력이 인지된 유전적 요소인 라이스 액틴-1 유전자 제일 엑손/인트론/엑손 (pBPFA19GUSint)에서 관찰된 것 보다 높다는 것을 조명하는 것이 중요하다. 부가적으로, 비록 본 실험에서 컨스트럭션 pA19ARTGUSint와 pA19ARTEGUSint에 대해 얻어진 결과 간에 현저한 차이가 인식될 수 없지만, 도 12에서는 마지막 컨스트럭션에 유레카 분획의 존재는 발현을 강력하게 증가시키는데, 이는 유합조직의 X-Gluc 히스토케미칼 염색 후 블루 칼라된 영역의 크기와 강도가 pA19ARTEGUSint를 충격하기 때문인 것으로 이는 괄목할만한 것이다(도 12).

결론적으로, 본 실시예는 인공적 유전적 요소 ART 및 유레카의 모든 종의 식물 세포에서 유전자 발현 인핸서로서의 기능성을 보여준다. 게다가, 이들 인핸서 요소는 이들이 융합되는 프로모터와 별개로 아주 효율적이고 발현 준위를 증가시킨다는 것을 보여준다. 마지막으로, ART 및 유레카는 다운스트림 유전자의 발현을 더욱 보다 상승적으로 고양하기 위해 조합될 수 있다는 것을 또한 입증한다.

ART 및 유레카는 그의 전사/번역을 증가히기 위해 어떤 식물 활성 프로모터 (예를들어, A19)와 어떤 DNA 시퀀스(GUSint 유전자) 사이에 기능적으로 삽입될 수 있다는 것을 보여준다.

실시예 3: 다른 5' 전사 인핸서 영역을 채택하는 PARTE 발현 시스템 변형체.

a) PARTE 프로모터에 라이스 액틴-1 5'전사 활성자 영역의 부가.

PARTE 프로모터에 라이스 액틴-1 유전자로부터 5' 전사 인핸서 영역을 cys-fuse하기 위해 pPARTE 플라스미드는 효소 EcoRI 및 EcoRV로 단리되어, 합성적 DNA 분획 En-Ac1 (라이스 액틴-1 유전자 전사 시작점으로부터 -43 에서 -221까지; SEQ ID NO: 10)이 이들 효소를 결찰하는 익스트림(extremes)으로 삽입한다. 얻어진 플라스미드인 pA1PARTE는 Eco RV 및 Hind III로 단리되어 합성적 DNA 분획 En-Ac2 (라이스 액틴-1 전사 시작점으로부터 -226 에서 -310까지; SEQ ID NO: 11)이 이에 삽입되어, 액틴-1 유전자 프로모터 5' 활성자 영역을 이루어 플라스미드 pAPARTE (도 5, 도 7E)를 수득하고, 제한 사이트 HindIII와 SacI 사이의 뉴클레오티드 시퀀스는 시퀀스 SEQ ID NO: 12에 보여진다.

b) APARTE 프로모터에 as-1-형 전사 인핸서 시퀀스의 부가.

플라스미드 pA1PARTE는 NruI 및 SalI로 단리되어, 언급된 제한 효소에 접착 말단을 가지고 as-1-형 전사 인핸서 시퀀스를 코드하는 ASP로 불리는 DNA 합성적 분획(SEQ ID NO: 13)이 이에 삽입되어, 컨스트럭션 pASPΔA1PARTE를 생산한다. 이 플라스미드는 Sal I로 단리되고, S1 뉴클레아제로 처리되고 그리고 나서 Pst I로 단리되어 대략 900 bp DNA 분획을 얻고 후에, NruI 및 PstI로 단리된 벡터 pA1PARTE에 클론되어, 최종적으로 라이스 액틴-1 5' 전사 활성화 영역 내의 NruI 사이트에 삽입된 ASP 인핸서를 갖는 플라스미드 pASPA1PARTE를 수득한다. 이것을 EcoRV - XhoI로 단리함에 의해, 제이 ASP 인핸서가 플라스미드 pASPA1PARTE에 삽입되어, 벡터 p2A1PARTE(제한 사이트 KpnI와 SacI 사이의 뉴클레오티드 시퀀스는 시퀀스 SEQ ID NO: 14에서 보여진다.)로 되고, 도 7F에 그 구조를 나타냈다.

pA1PARTE에 대해서 상기에 설명된 바와 같이, En-Ac2 분획이 또한 pASPA1PARTE에 삽입되어 컨스트럭션 pASPAPARTE을 얻고, 여기서 제이 ASP 인핸서는 이것을 EcoRV - SalI로 단리함에 의해 삽입되어 최종적으로 벡터 p2APARTE (도 7G)를 수득한다. 사이트 SalI와 SacI 사이의 그 뉴클레오티드 시퀀스는 SEQ ID NO: 15에 도시된다.

c) U3ARTE 프로모터 컨스트럭션.

먼저, 메이즈 ubi-1 유전자 전사 시발 사이트로부터 -299 에서 -680까지의 영역에 상당하는, 약 395 bp DNA 분획인 프라이머 Oli-U1 (SEQ ID NO: 16) 및 Oli-U2 (SEQ ID NO: 17)를 사용하여 이것은 중합체연쇄반응(Polymerase Chain Reaction; PCR)으로 증폭된다. 증폭된 분획은 제한 효소 KpnI 및 XhoI (양 사이트는 프라이머에 포함됨)로 단리되고 유사하게 처리된 pBluescript II SK 벡터에 클론되어, 컨스트럭션 pBS-Ubi1을 수득한다. 그 후, -680에서 -855까지의 메이즈 ubi-1 유전자(시퀀스 SEQ ID NO: 18)를 코드하는 합성적 DNA 분획(En-U2)이 NcoI / KpnI 단리 pBS-Ubi1 벡터에 클론되어, 메이즈 유비퀴틴-1 유전자 5' 활성자 영역(-299에서 -855까지, 시퀀스 SEQ ID NO: 19)을 포함하는 컨스트럭션 pBS-Ubi2로 된다.

이 메이즈 유비퀴틴-1 유전자로부터 5' 전사 활성자 클론 영역은, Xho I - Kpn I 단리에 의해 플라스미드 pBS-Ubi2로부터 수득되고, 이 벡터의 SalI - KpnI 단리에 의해 프로모터 2APARTE에 5' cis-삽입되어 소위 컨스트럭트 pU3ARTE (도 6, 도 7H)를 얻은 "열 쇼크"박스를 포함하지 않는다. 사이트 Kpn I와 Sac I 사이의 벡터 pU3ARTE의 시퀀스는 시퀀스 SEQ ID NO: 20에 도시된다.

d) GARTE 프로모터 컨스트럭션.

본 발명 대상의 적응성을 입증하기 위해, 프로모터로부터의 5' 제어 영역을 기관, 조직 또는 전개-특이성에 융합하기로 결정하였고, 이는 상술된 특성을 갖는 높은 발현 수준을 제공한다. 따라서, 글루테린(gluteline) 기관 특이적 발현을 제어하는 라이스 gluB-1 유전자 5' 제어 영역이 cys 및 5'으로 PARTE 프로모터에 융합된다. 이 목적을 달성하기 위해, gluB-1 전사 시작점(SEQ ID NO: 21)으로부터 -31에서 -245 영역 및 알맞은 클로닝 사이트에 대응하는 214 염기 쌍 분획 (GLU)이 합성되어, 이것은 EcoRI 및 XhoI 단리 pPARTE 플라스미드에 삽입되어, pGARTE 벡터 (도 8)를 생산하고, XhoI과 SacI 사이트 사이의 그 일차 구조는 시퀀스 SEQ ID NO: 22에 도시된다.

실시예 4: 타바코 및 라이스 세포에서 PARTE 발현 시스템의 다른 변형체의 기능성.

외떡잎 식물 및 쌍떡잎 식물 세포에 본 발명의 각 프로모터 변형체 대상의 발현 준위를 평가하기 위해, 이성분의 벡터 pC-ARTE-GUSint에서 GUSint 발현을 조절하는 CaMV 35S 프로모터를 SmaI - SpeI 단리함에 의해 삭제하고 컨스트럭션 pAPARTE, p2A1PARTE, p2APARTE 및 pU3ARTE으로부터 KpnI / S1 뉴클레아제-SpeI 분획을 그 위치에 삽입한 새로운 이성분의 벡터 pC-APARTEGUSint, pC-2A1PARTEGUSint, pC-2APARTEGUSint y pC-U3ARTEGUSint를 생산한다.

a) 타바코에 대한 분석.

이성분의 벡터 pC-APARTEGUSint, pC-2A1PARTEGUSint, pC-2APARTEGUSint y pC-U3ARTEGUSint는, 실시예 2의 (a)부분에서 기술된 바와 같이 NT1 타바코 세포에서 일시적 발현 분석 실험을 수행하기 위해 A. tumefaciens 세포에 도입된다. 사용된 대조 플라스미드인 pC-GUSint는 CaMV 35S 프로모터(1,3 kb version) 및 tNOS 터미네이터에 의해 제어되는 GUS 발현을 갖는다. 실험은 이회 수행되었고(각 처리마다 5 레플리카), 그 결과는 아래 표에 나타냈다:

타바코 세포에서 PARTE 발현 시스템의 다른 변형체의 기능성

	GUS 활성 (Pm 4-MU/min/mg 전체 단백질)
실험	세포 대조군	pC-GUSint	pC-APARTEGUSint	pC-2A1PARTEGUSint	pC-2APARTEGUSint	pC-U3ARTEGUSint
I	0.46±0.37	3.55±1.23	4.89±1.67	23.1±6.9	28.4±5.8	29.2±6.1
II	1.30±0.81	7.02±2.78	6.63±4.26	24.7±4.2	21.0±4.3	32.6±9.0

본 결과는 본 발명 대상에서 다른 프로모터 변형체의 기능성을 확증하는 것이 명백하고, 또한 PARTE에 융합된 5' 전사 제어 영역에 의존하여 그 활성을 제어하는 것이 가능하다는 것을 보여준다. 쌍떡잎 식물 세포에서, 자연적 프로모터 CaMV 35S에 의해 조절될 때 달성된 것보다 본 유전적 컨스트럭션을 가지고 월등한 발현 준위에 도달한 것은 강조되어야 한다.

b) 라이스에 대한 분석.

PARTE 프로모터의 다른 변형체 활성의 일시적 평가를 수행하기 위하여 실시예 2의 (c)부분에 기술된 바와 같이 이성분의 벡터 pC-APARTEGUSint, pC-2A1PARTEGUSint, pC-2APARTEGUSint y pC-U3ARTEGUSint를 라이스 유합조직에 충격을 가했다. 대조 플라스미드 pAct1-F(McElroy D; Zhang W; Cao J; Wu R. Plant Cell 1990, 2:163-171)는 라이스 액틴-1 유전자 프로모터 및 tNOS 터미네이터의 제어하에 gus 유전자 발현을 가진다. 발현 카셋트는 이들 플라스미드로 부터 KpnI - XbaI 단리에 의해 추출되고 동일한 제한 효소로 단리된 이성분의 플라스미드 pCAMBIA 2300에 삽입되어 벡터 pC-Act1F를 생산한다.

충격 실험은 평가된 각 컨스트럭션에 대해 3 레플리카로 삼회 수행되어 되었다. 얻어진 결과는 다음 표에 나타낸다.

라이스 세포에서 PARTE 프로모터 발현 시스템의 다른 변형체의 기능성.

실험	블루 영역 및 점을 갖는 유합조직의 %
실험	pC-Act1F	pC-APARTEGUSint	pC-2A1PARTEGUSint	pC-2APARTEGUSint	pC-U3ARTEGUSint
I	67	73	92	100	100
II	63	88	95	91	92
III	81	85	90	87	100
Media±SD	70±4	82±6	92±2	93±5	97±4

이 표에 나타난 결과는, 라이스 액틴-1 유전자의 자연적 프로모터의 것 보다 우수한 발현 준위를 이루는 외떡잎 식물 세포에서 PARTE 프로모터의 다른 변형체의 기능성을 보증한다. 따라서, cys에 위치되어 그 조절하에 DNA 시퀀스의 높은 발현 준위를 달성하기 위한 효과적인 유전적 도구로서 본 발명 대상의 유용성은 확인된다.

c) 라이스 종자에 대한 분석.

라이스 세포 배젓에서 GARTE 프로모터의 조직 특이성을 평가하기 위해, nos 터미네이터 (tNOS)를 갖는 GUSint 유전자에 융합된 유레카 분획을 포함하는, pBPFARTEGUSint 벡터로부터 약 2.5 Kb의 SalI / Klenow - PstI 분획이 pGARTE 벡터 XbaI / Klenow - PstI 단리에 클론되어, 결과적으로 컨스트럭션 pGARTEGUSint을 얻는다.

pGARTEGUSint 내의 GARTE 프로모터가 Xho I - Nco I 단리에 의해 치환된 대조 플라스미드 또한, pGEM-T-GluB-1 플라스미드의 SalI - NcoI 단리로 부터 수득된 종자 배젓-특이적이고 아주 효과적인 라이스 글루테린 B-1 프로모터에 의해 구성된다. 따라서 우리는 pGluGUSint를 수득했다.

GARTE 프로모터의 평가와 GluB1의 것과의 비교는 Y-S. Hwang (Hwang Y-S; McCullar Cass; Huang N. Plant Science. 2001, 161:1107-1116)에 따라 비닐하우스 배양의 라이스 변종 인디카 펠라의 이어 카리오프시스(ear cariopsis)로부터 분리된 미성숙 배젓(폴린화 후 8-9일)을 충격함에 의해 수행된다. 배젓에서의 GUS 활성을 측정하기 위해 형광계 분석(Fluorometric assay)이 평가될 플라스미드 DNA로 커버된 금 미세-입자로 충격후 24시간에 제퍼슨(Jefferson R.A. 1988. Plant reporter genes: the GUS gene fusion system. In: J.K. Setlow (Ed), Genetic Engineering. Vol.10, Plenum Publishing Corporation. P.247-263)에 따라 수행되었다. 각 5 레플리카로 두번의 별도 실험으로 얻어진 GUS 활성의 결과는 표 7에 나타난다.

라이스 종자 배젓에서 GARTE 프로모터의 기능성.

실험	GUS 활성 (Pm 4-MU/hr/mg 전체 단백질)		GARTE/GluB-1 rate
실험	pGluGUSint	pGARTEGUSint	GARTE/GluB-1 rate
I	34±9	79±22	2.3
II	27±5	52±13	1.9

이들 결과에서 우리에 의해 디자인된 인공적 요소에 기초한 키메르 프로모터 GARTE는 종자 배젓에서 유전자를 발현하는데 아주 효과적임을 확인할 수 있다; 비록 GARTE 프로모터 상에 삽입된 GLU 시퀀스는 발현에 특이성을 부여할 수 있지만, 그 자체로는 높은 수준을 보장하지는 않으며, 또한 프로모터에 따른 다른 요인에 의존한다(Takaiwa F; Yamanouchi U; Yoshihara T; Washida H; Tanabe F; Kato A; Yamada K. Plant Mol Biol. 1996, 30:1207-1221).

나타난 데이타는 본 발명의 요소 대상에 제어적 영역을 엎스트림 삽입은 진화(development)-, 기관- 또는 조직-특이성을 갖는 DNA 시퀀스의 발현을 효과적으로 수행하기 위해 이를 사용할 수 있게 한다는 것을 재확인한다. 분자생물학 분야의 종사자에게, GARTE 프로모터에 삽입된 GluB-1 프로모터 제어 시퀀스가 생물적 스트레스(예를 들어 병원체 공격), 비생물적 인자(예를 들어, 부상, 극단적으로 높거나 낮은 온도, 염분, 가뭄, 어떤 화학물질의 존재), 산화적 스트레스, 다른 기관 및 조직 진화 단계 등에 반응하는 제어 시퀀스로 성공적으로 치환할 수 있음은 명백하다.

본 발명의 제어 영역 대상하에 클론된 DNA 시퀀스는 식물 세포에 도입될 수 있고, 공지된 생물학적 또는 물리-화학적 형질전환 방법에 의해 삽입될 수 있고, 또한 이들 유전적으로 변형된 세포로부터, DNA 시퀀스가 이들이 융합되는 프로모터 변형체에 따라 편리하게 발현하는 번식력있는 식물을 재생하는 것이 가능함은 또한 명백하다. 따라서, 본 발명은 해충, 질병, 각종 스트레스에 높은 수준의 저항성, 높은 농업적 생산성을 갖거나 또는 의학적 또는 산업적 적용, 다른 용도를 갖는 화합물을 생산하는 아주 효과적인 유전자 도입 식물의 생산에 기여하는 그 잠재성을 밝힌다.

<110> Center for Genetic Engineering and Biotechnology <120> Artificial promoter for the expression of DNA sequences in plant cells. <130> Promoter for DNA expression in plants <160> 22 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 86 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Enhancer of translation Eureka. <400> 1 gaaacaaatt gaacatcatt ctatcaatac aacacaaaca caacacaact caatcattta 60 tttgacaaca caactaaaca accatg 86 <210> 2 <211> 198 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic fragment P35AcU. <400> 2 gaattctata tataggaagt tcatttcatt tggagccccc caaccctacc accaccacca 60 ccaccacctc ctccttcaca caacacacac acaacagatc tcccccatcc tccctcccgt 120 cgcgccgcgc aacacctggt aagatggctg tgcgctcaga tatatatagt gatatgcact 180 acaaagatca taactagt 198 <210> 3 <211> 231 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic fragment I-U/Ac. <400> 3 ctagaccgcc gcctcccccc ccccccctct ctaccttctc tctttctttc tccgtttttt 60 ttttccgtct cgtctcgatc tttggccttg gtagtttggg ggcgagaggc ggcttcgtcg 120 cccagatcgg tgcgcgtttt tttatttgga ggggcgggat ctcgcggctg ggtctcggcg 180 tgcggccgga ttctcgcggg gaatggggct ctcggatgtg gatccgagct c 231 <210> 4 <211> 255 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic fragment I-Ac/U. <400> 4 gatctgatcc gccgttgttg ggggagatat ggggcgttta aaatttcgcc atgctaaaca 60 agatcaggaa gaggggaaaa gggcactatg gtttaatttt tatatatttc tgctgctgct 120 cgtcaggatt agatgtgctt gatctttctt tcttcttttt gtgggtagaa tttgaatccc 180 tcagcattgt tcatcggtag tttttctttt gtcgatgctc accctgttgt ttggtgtttt 240 tatactagtg agctc 255 <210> 5 <211> 93 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic fragment IniT. <400> 5 ctagtggcta tcctgacacg gtctctttgt caaatatctc tgtgtgcagg tataactgca 60 ggaaacaaca acaataacca tggtctagag ctc 93 <210> 6 <211> 692 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Artificial Exon/Intron/Exon ART. <400> 6 accaccacca ccaccaccac ctcctccttc acacaacaca cacacaacag atctccccca 60 tcctccctcc cgtcgcgccg cgcaacacct ggtaagatgg ctgtgcgctc agatatatat 120 agtgatatgc actacaaaga tcataactag accgccgcct cccccccccc ccctctctac 180 cttctctctt tctttctccg tttttttttt ccgtctcgtc tcgatctttg gccttggtag 240 tttgggggcg agaggcggct tcgtcgccca gatcggtgcg cgttttttta tttggagggg 300 cgggatctcg cggctgggtc tcggcgtgcg gccggattct cgcggggaat ggggctctcg 360 gatgtggatc tgatccgccg ttgttggggg agatatgggg cgtttaaaat ttcgccatgc 420 taaacaagat caggaagagg ggaaaagggc actatggttt aatttttata tatttctgct 480 gctgctcgtc aggattagat gtgcttgatc tttctttctt ctttttgtgg gtagaatttg 540 aatccctcag cattgttcat cggtagtttt tcttttgtcg atgctcaccc tgttgtttgg 600 tgtttttata ctagtggcta tcctgacacg gtctctttgt caaatatctc tgtgtgcagg 660 tataactgca ggaaacaaca acaataacca tg 692 <210> 7 <211> 750 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Sequence of the vector pBS-ART between the sites EcoRI and SacI. <400> 7 gaattctata tataggaagt tcatttcatt tggagccccc caaccctacc accaccacca 60 ccaccacctc ctccttcaca caacacacac acaacagatc tcccccatcc tccctcccgt 120 cgcgccgcgc aacacctggt aagatggctg tgcgctcaga tatatatagt gatatgcact 180 acaaagatca taactagacc gccgcctccc cccccccccc tctctacctt ctctctttct 240 ttctccgttt tttttttccg tctcgtctcg atctttggcc ttggtagttt gggggcgaga 300 ggcggcttcg tcgcccagat cggtgcgcgt ttttttattt ggaggggcgg gatctcgcgg 360 ctgggtctcg gcgtgcggcc ggattctcgc ggggaatggg gctctcggat gtggatctga 420 tccgccgttg ttgggggaga tatggggcgt ttaaaatttc gccatgctaa acaagatcag 480 gaagagggga aaagggcact atggtttaat ttttatatat ttctgctgct gctcgtcagg 540 attagatgtg cttgatcttt ctttcttctt tttgtgggta gaatttgaat ccctcagcat 600 tgttcatcgg tagtttttct tttgtcgatg ctcaccctgt tgtttggtgt ttttatacta 660 gtggctatcc tgacacggtc tctttgtcaa atatctctgt gtgcaggtat aactgcagga 720 aacaacaaca ataaccatgg tctagagctc 750 <210> 8 <211> 757 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Artificial Exon/Intron/Exon ARTE. <400> 8 accaccacca ccaccaccac ctcctccttc acacaacaca cacacaacag atctccccca 60 tcctccctcc cgtcgcgccg cgcaacacct ggtaagatgg ctgtgcgctc agatatatat 120 agtgatatgc actacaaaga tcataactag accgccgcct cccccccccc ccctctctac 180 cttctctctt tctttctccg tttttttttt ccgtctcgtc tcgatctttg gccttggtag 240 tttgggggcg agaggcggct tcgtcgccca gatcggtgcg cgttttttta tttggagggg 300 cgggatctcg cggctgggtc tcggcgtgcg gccggattct cgcggggaat ggggctctcg 360 gatgtggatc tgatccgccg ttgttggggg agatatgggg cgtttaaaat ttcgccatgc 420 taaacaagat caggaagagg ggaaaagggc actatggttt aatttttata tatttctgct 480 gctgctcgtc aggattagat gtgcttgatc tttctttctt ctttttgtgg gtagaatttg 540 aatccctcag cattgttcat cggtagtttt tcttttgtcg atgctcaccc tgttgtttgg 600 tgtttttata ctagtggcta tcctgacacg gtctctttgt caaatatctc tgtgtgcagg 660 tataactgca ggaaacaaat tgaacatcat tctatcaata caacacaaac acaacacaac 720 tcaatcattt atttgacaac acaactaaac aaccatg 757 <210> 9 <211> 815 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Sequence of the vector pPARTE between the sites EcoRI and SacI. <400> 9 gaattctata tataggaagt tcatttcatt tggagccccc caaccctacc accaccacca 60 ccaccacctc ctccttcaca caacacacac acaacagatc tcccccatcc tccctcccgt 120 cgcgccgcgc aacacctggt aagatggctg tgcgctcaga tatatatagt gatatgcact 180 acaaagatca taactagacc gccgcctccc cccccccccc tctctacctt ctctctttct 240 ttctccgttt tttttttccg tctcgtctcg atctttggcc ttggtagttt gggggcgaga 300 ggcggcttcg tcgcccagat cggtgcgcgt ttttttattt ggaggggcgg gatctcgcgg 360 ctgggtctcg gcgtgcggcc ggattctcgc ggggaatggg gctctcggat gtggatctga 420 tccgccgttg ttgggggaga tatggggcgt ttaaaatttc gccatgctaa acaagatcag 480 gaagagggga aaagggcact atggtttaat ttttatatat ttctgctgct gctcgtcagg 540 attagatgtg cttgatcttt ctttcttctt tttgtgggta gaatttgaat ccctcagcat 600 tgttcatcgg tagtttttct tttgtcgatg ctcaccctgt tgtttggtgt ttttatacta 660 gtggctatcc tgacacggtc tctttgtcaa atatctctgt gtgcaggtat aactgcagga 720 aacaaattga acatcattct atcaatacaa cacaaacaca acacaactca atcatttatt 780 tgacaacaca actaaacaac catggtctag agctc 815 <210> 10 <211> 184 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic fragment En-Ac1. <400> 10 atcaccgtga gttgtccgca ccaccgcacg tctcgcagcc aaaaaaaaaa aaagaaagaa 60 aaaaaagaaa aagaaaaaac agcaggtggg tccgggtcgt gggggccgga aaagcgagga 120 ggatcgcgag cagcgacgag gccggccctc cctccgcttc caaagaaacg ccccccatca 180 attc 184 <210> 11 <211> 94 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic fragment En-Ac2. <400> 11 aagcttgata tccatagcaa gcccagccca acccaaccca acccaaccca ccccagtgca 60 gccaactggc aaatagtctc cacaccccgg cact 94 <210> 12 <211> 1087 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Sequence of the vector pAPARTE between the sites HindIII and SacI. <400> 12 aagcttgata tccatagcaa gcccagccca acccaaccca acccaaccca ccccagtgca 60 gccaactggc aaatagtctc cacaccccgg cactatcacc gtgagttgtc cgcaccaccg 120 cacgtctcgc agccaaaaaa aaaaaaagaa agaaaaaaaa gaaaaagaaa aaacagcagg 180 tgggtccggg tcgtgggggc cggaaaagcg aggaggatcg cgagcagcga cgaggccggc 240 cctccctccg cttccaaaga aacgcccccc atcaattcta tatataggaa gttcatttca 300 tttggagccc cccaacccta ccaccaccac caccaccacc tcctccttca cacaacacac 360 acacaacaga tctcccccat cctccctccc gtcgcgccgc gcaacacctg gtaagatggc 420 tgtgcgctca gatatatata gtgatatgca ctacaaagat cataactaga ccgccgcctc 480 cccccccccc cctctctacc ttctctcttt ctttctccgt tttttttttc cgtctcgtct 540 cgatctttgg ccttggtagt ttgggggcga gaggcggctt cgtcgcccag atcggtgcgc 600 gtttttttat ttggaggggc gggatctcgc ggctgggtct cggcgtgcgg ccggattctc 660 gcggggaatg gggctctcgg atgtggatct gatccgccgt tgttggggga gatatggggc 720 gtttaaaatt tcgccatgct aaacaagatc aggaagaggg gaaaagggca ctatggttta 780 atttttatat atttctgctg ctgctcgtca ggattagatg tgcttgatct ttctttcttc 840 tttttgtggg tagaatttga atccctcagc attgttcatc ggtagttttt cttttgtcga 900 tgctcaccct gttgtttggt gtttttatac tagtggctat cctgacacgg tctctttgtc 960 aaatatctct gtgtgcaggt ataactgcag gaaacaaatt gaacatcatt ctatcaatac 1020 aacacaaaca caacacaact caatcattta tttgacaaca caactaaaca accatggtct 1080 agagctc 1087 <210> 13 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic fragment ASP. <400> 13 gtcgactgac gcttcgaatg acgcacatgc c 31 <210> 14 <211> 1065 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Sequence of the vector p2A1PARTE between the sites KpnI and SacI. <400> 14 ggtaccgggc cccccctcga ctgacgcttc gaatgacgca catgccatca ccgtgagttg 60 tccgcaccac cgcacgtctc gcagccaaaa aaaaaaaaag aaagaaaaaa aagaaaaaga 120 aaaaacagca ggtgggtccg ggtcgtgggg gccggaaaag cgaggaggat cgctgacgct 180 tcgaatgacg cacatgcccg agcagcgacg aggccggccc tccctccgct tccaaagaaa 240 cgccccccat caattctata tataggaagt tcatttcatt tggagccccc caaccctacc 300 accaccacca ccaccacctc ctccttcaca caacacacac acaacagatc tcccccatcc 360 tccctcccgt cgcgccgcgc aacacctggt aagatggctg tgcgctcaga tatatatagt 420 gatatgcact acaaagatca taactagacc gccgcctccc cccccccccc tctctacctt 480 ctctctttct ttctccgttt tttttttccg tctcgtctcg atctttggcc ttggtagttt 540 gggggcgaga ggcggcttcg tcgcccagat cggtgcgcgt ttttttattt ggaggggcgg 600 gatctcgcgg ctgggtctcg gcgtgcggcc ggattctcgc ggggaatggg gctctcggat 660 gtggatctga tccgccgttg ttgggggaga tatggggcgt ttaaaatttc gccatgctaa 720 acaagatcag gaagagggga aaagggcact atggtttaat ttttatatat ttctgctgct 780 gctcgtcagg attagatgtg cttgatcttt ctttcttctt tttgtgggta gaatttgaat 840 ccctcagcat tgttcatcgg tagtttttct tttgtcgatg ctcaccctgt tgtttggtgt 900 ttttatacta gtggctatcc tgacacggtc tctttgtcaa atatctctgt gtgcaggtat 960 aactgcagga aacaaattga acatcattct atcaatacaa cacaaacaca acacaactca 1020 atcatttatt tgacaacaca actaaacaac catggtctag agctc 1065 <210> 15 <211> 1135 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Sequence of the vector p2APARTE between the sites SalI and SacI. <400> 15 gtcgactgac gcttcgaatg acgcacatgc catccatagc aagcccagcc caacccaacc 60 caacccaacc caccccagtg cagccaactg gcaaatagtc tccacacccc ggcactatca 120 ccgtgagttg tccgcaccac cgcacgtctc gcagccaaaa aaaaaaaaag aaagaaaaaa 180 aagaaaaaga aaaaacagca ggtgggtccg ggtcgtgggg gccggaaaag cgaggaggat 240 cgctgacgct tcgaatgacg cacatgcccg agcagcgacg aggccggccc tccctccgct 300 tccaaagaaa cgccccccat caattctata tataggaagt tcatttcatt tggagccccc 360 caaccctacc accaccacca ccaccacctc ctccttcaca caacacacac acaacagatc 420 tcccccatcc tccctcccgt cgcgccgcgc aacacctggt aagatggctg tgcgctcaga 480 tatatatagt gatatgcact acaaagatca taactagacc gccgcctccc cccccccccc 540 tctctacctt ctctctttct ttctccgttt tttttttccg tctcgtctcg atctttggcc 600 ttggtagttt gggggcgaga ggcggcttcg tcgcccagat cggtgcgcgt ttttttattt 660 ggaggggcgg gatctcgcgg ctgggtctcg gcgtgcggcc ggattctcgc ggggaatggg 720 gctctcggat gtggatctga tccgccgttg ttgggggaga tatggggcgt ttaaaatttc 780 gccatgctaa acaagatcag gaagagggga aaagggcact atggtttaat ttttatatat 840 ttctgctgct gctcgtcagg attagatgtg cttgatcttt ctttcttctt tttgtgggta 900 gaatttgaat ccctcagcat tgttcatcgg tagtttttct tttgtcgatg ctcaccctgt 960 tgtttggtgt ttttatacta gtggctatcc tgacacggtc tctttgtcaa atatctctgt 1020 gtgcaggtat aactgcagga aacaaattga acatcattct atcaatacaa cacaaacaca 1080 acacaactca atcatttatt tgacaacaca actaaacaac catggtctag agctc 1135 <210> 16 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Oligonucleotide primer Oli-U1. <400> 16 gaaggtaccg ccatggtcta aaggacaatt g 31 <210> 17 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Oligonucleotide primer Oli-U2. <400> 17 ctcctcgagg gcgtttaaca ggctggc 27 <210> 18 <211> 186 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic fragment En-U2. <400> 18 ggtaccgagc attgcatgtc taagttataa aaaattacca catatttttt ttgtcacact 60 tgtttgaagt gcagtttatc tatctttata catatattta aactttactc tacgaataat 120 ataatctata gtacaacaat aatatcagtg ttttagagaa tcatataaat gaacagttag 180 acatgg 186 <210> 19 <211> 563 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Sequence of the transcriptional activator from the maize ubiquitin-1 gene (-299 to -855 region). <400> 19 ggtaccgagc attgcatgtc taagttataa aaaattacca catatttttt ttgtcacact 60 tgtttgaagt gcagtttatc tatctttata catatattta aactttactc tacgaataat 120 ataatctata gtacaacaat aatatcagtg ttttagagaa tcatataaat gaacagttag 180 acatggtcta aaggacaatt gagtattttg acaacaggac tctacagttt tatcttttta 240 gtgtgcatgt gttctccttt ttttttgcaa atagcttcac ctatataata cttcatccat 300 tttattagta catccattta gggtttaggg ttaatggttt ttatagacta atttttttag 360 tacatctatt ttattctatt ttagcctcta aattaagaaa actaaaactc tattttagtt 420 tttttattta ataatttaga tataaaatag aataaaataa agtgactaaa aattaaacaa 480 atacccttta agaaattaaa aaaactaagg aaacattttt cttgtttcga gtagataatg 540 ccagcctgtt aaacgccctc gac 563 <210> 20 <211> 1692 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Sequence of the vector pU3ARTE between the sites KpnI and SacI. <400> 20 ggtaccgagc attgcatgtc taagttataa aaaattacca catatttttt ttgtcacact 60 tgtttgaagt gcagtttatc tatctttata catatattta aactttactc tacgaataat 120 ataatctata gtacaacaat aatatcagtg ttttagagaa tcatataaat gaacagttag 180 acatggtcta aaggacaatt gagtattttg acaacaggac tctacagttt tatcttttta 240 gtgtgcatgt gttctccttt ttttttgcaa atagcttcac ctatataata cttcatccat 300 tttattagta catccattta gggtttaggg ttaatggttt ttatagacta atttttttag 360 tacatctatt ttattctatt ttagcctcta aattaagaaa actaaaactc tattttagtt 420 tttttattta ataatttaga tataaaatag aataaaataa agtgactaaa aattaaacaa 480 atacccttta agaaattaaa aaaactaagg aaacattttt cttgtttcga gtagataatg 540 ccagcctgtt aaacgccctc gactgacgct tcgaatgacg cacatgccat ccatagcaag 600 cccagcccaa cccaacccaa cccaacccac cccagtgcag ccaactggca aatagtctcc 660 acaccccggc actatcaccg tgagttgtcc gcaccaccgc acgtctcgca gccaaaaaaa 720 aaaaaagaaa gaaaaaaaag aaaaagaaaa aacagcaggt gggtccgggt cgtgggggcc 780 ggaaaagcga ggaggatcgc tgacgcttcg aatgacgcac atgcccgagc agcgacgagg 840 ccggccctcc ctccgcttcc aaagaaacgc cccccatcaa ttctatatat aggaagttca 900 tttcatttgg agccccccaa ccctaccacc accaccacca ccacctcctc cttcacacaa 960 cacacacaca acagatctcc cccatcctcc ctcccgtcgc gccgcgcaac acctggtaag 1020 atggctgtgc gctcagatat atatagtgat atgcactaca aagatcataa ctagaccgcc 1080 gcctcccccc ccccccctct ctaccttctc tctttctttc tccgtttttt ttttccgtct 1140 cgtctcgatc tttggccttg gtagtttggg ggcgagaggc ggcttcgtcg cccagatcgg 1200 tgcgcgtttt tttatttgga ggggcgggat ctcgcggctg ggtctcggcg tgcggccgga 1260 ttctcgcggg gaatggggct ctcggatgtg gatctgatcc gccgttgttg ggggagatat 1320 ggggcgttta aaatttcgcc atgctaaaca agatcaggaa gaggggaaaa gggcactatg 1380 gtttaatttt tatatatttc tgctgctgct cgtcaggatt agatgtgctt gatctttctt 1440 tcttcttttt gtgggtagaa tttgaatccc tcagcattgt tcatcggtag tttttctttt 1500 gtcgatgctc accctgttgt ttggtgtttt tatactagtg gctatcctga cacggtctct 1560 ttgtcaaata tctctgtgtg caggtataac tgcaggaaac aaattgaaca tcattctatc 1620 aatacaacac aaacacaaca caactcaatc atttatttga caacacaact aaacaaccat 1680 ggtctagagc tc 1692 <210> 21 <211> 223 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic fragment GLU. <400> 21 ctcgagatac atattaagag tatggacaga catttcttta acaaactcca tttgtattac 60 tccaaaagca ccagaagttt gtcatggctg agtcatgaaa tgtatagttc aatcttgcaa 120 agttgccttt ccttttgtac tgtgttttaa cactacaagc catatattgt ctgtacgtgc 180 aacaaactat atcaccatgt atcccaagat gcttttttaa ttc 223 <210> 22 <211> 1032 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Sequence of the vector pGARTE between the sites XhoI and SacI. <400> 22 ctcgagatac atattaagag tatggacaga catttcttta acaaactcca tttgtattac 60 tccaaaagca ccagaagttt gtcatggctg agtcatgaaa tgtatagttc aatcttgcaa 120 agttgccttt ccttttgtac tgtgttttaa cactacaagc catatattgt ctgtacgtgc 180 aacaaactat atcaccatgt atcccaagat gcttttttaa ttctatatat aggaagttca 240 tttcatttgg agccccccaa ccctaccacc accaccacca ccacctcctc cttcacacaa 300 cacacacaca acagatctcc cccatcctcc ctcccgtcgc gccgcgcaac acctggtaag 360 atggctgtgc gctcagatat atatagtgat atgcactaca aagatcataa ctagaccgcc 420 gcctcccccc ccccccctct ctaccttctc tctttctttc tccgtttttt ttttccgtct 480 cgtctcgatc tttggccttg gtagtttggg ggcgagaggc ggcttcgtcg cccagatcgg 540 tgcgcgtttt tttatttgga ggggcgggat ctcgcggctg ggtctcggcg tgcggccgga 600 ttctcgcggg gaatggggct ctcggatgtg gatctgatcc gccgttgttg ggggagatat 660 ggggcgttta aaatttcgcc atgctaaaca agatcaggaa gaggggaaaa gggcactatg 720 gtttaatttt tatatatttc tgctgctgct cgtcaggatt agatgtgctt gatctttctt 780 tcttcttttt gtgggtagaa tttgaatccc tcagcattgt tcatcggtag tttttctttt 840 gtcgatgctc accctgttgt ttggtgtttt tatactagtg gctatcctga cacggtctct 900 ttgtcaaata tctctgtgtg caggtataac tgcaggaaac aaattgaaca tcattctatc 960 aatacaacac aaacacaaca caactcaatc atttatttga caacacaact aaacaaccat 1020 ggtctagagc tc 1032

Claims

a) 다음이 따르는 5' 전사 제어 요소,

b) TATA 박스, 64% 이하의 GC 함량을 갖는 뉴클레오티드 시퀀스 및 그의 3' 말단에서 융합된 전사 시작점을 포함하는 인공 코어 프로모터,

c) 식물 세포에서 그것을 융합한 유전자의 발현을 고양할 수 있는 인공 인트론, 제일 키메르 엑손 및 다운스트림 삽입된 모든(any) 유전자의 번역 고양 특성을 갖는 제이 키메르 엑손에 의해 합치된, 번역될 수는 없지만 전사될 수 있는 합성적 뉴클레오티드 시퀀스;

를 포함하는 그 3' 말단에 융합된 DNA 시퀀스의 식물 세포에서의 발현을 증진하는 재조합 DNA 분자임을 특징으로 하는 인공 프로모터.
제 1항에 있어서, 5' 전사 제어 요소가 인공적인 것인 재조합 DNA 분자임을 특징으로 하는 인공 프로모터.
제 1항에 있어서, 5' 전사 제어 요소가 식물 세포에서 유전자 발현을 자연적으로 고양 및/또는 제어하는 DNA 시퀀스에 동종인 것인 재조합 DNA 분자임을 특징으로 하는 인공 프로모터.
제 3항에 있어서, 5' 전사 제어 요소가 라이스 액틴-1 유전자 유래인 인공 프로모터.
제 4항에 있어서, 5' 전사 제어 요소가 라이스 액틴-1 유전자 전사 시작점으로부터 -43에서 -310까지 영역을 포함하는 인공 프로모터.
제 5항에 있어서, 5' 전사 제어 요소 뉴클레오티드 시퀀스가 SEQ ID NO: 10 내의 시퀀스에 또는 그의 분획에 상당하는 인공 프로모터.
제 5항에 있어서, 5' 전사 제어 요소 뉴클레오티드 시퀀스가 SEQ ID NO: 11 내의 시퀀스에 또는 그의 분획에 상당하는 인공 프로모터.
제 3항에 있어서, 5' 전사 제어 요소가 메이즈 유비퀴틴-1 유전자 유래인 인공 프로모터.
제 8항에 있어서, 뉴클레오티드 시퀀스가 메이즈 유비퀴틴-1 유전자 전사 시작점으로부터 -299에서 -855까지 영역을 포함하는 인공 프로모터.
제 9항에 있어서, 5' 전사 제어 요소가 SEQ ID NO: 19 내의 시퀀스에 또는 그의 분획에 상당하는 인공 프로모터.
제 2항 또는 제 3항에 있어서, 그 5' 전사 제어 요소가 as-1-형(as-1-like) 전사 인핸서인 인공 프로모터.
제 11항에 있어서, as-1-형 전사 인핸서의 뉴클레오티드 시퀀스가 SEQ ID NO: 13 내의 뉴클레오티드 7 내지 26 또는 상보(complementary) 시퀀스에 상응하는 시퀀스 분획에 본질적으로 동일한 인공 프로모터.
제 3항에 있어서, 그 5' 전사 제어 요소가 바이러스 프로모터 유래인 인공 프로모터.
제 13항에 있어서, 그 5' 전사 제어 요소가 CaMV 35S 프로모터 유래인 인공 프로모터.
제 2항 또는 제 3항에 있어서, 5' 전사 제어 요소가 진화-, 기관- 또는 조직-특이성을 가지고 식물 세포에서 유전자 발현을 조절하는 인공 프로모터.
제 15항에 있어서, 그 5' 전사 제어 요소가 종자에서 발현을 제어하는 인공 프로모터.
제 16항에 있어서, 그 5' 전사 제어 요소가 라이스 글루테린 B-1 유전자 유래인 인공 프로모터.
제 17항에 있어서, 그 5' 전사 제어 요소가 라이스 글루테린 B-1 유전자 전사 시작점으로부터 -31에서 -245까지 영역의 분획을 포함하는 인공 프로모터.
제 18항에 있어서, 5' 전사 제어 요소가 SEQ ID NO: 21 내의 시퀀스에 또는 그의 분획에 상당하는 인공 프로모터
제 15항에 있어서, 5' 전사 제어 요소가 생물적 또는 비생물적 스트레스 하에 식물세포에서 유전자 발현을 제어하는 인공 프로모터
제 15항에 있어서, 그 5' 전사 제어 요소가 상처입은 식물 조직에서 유전자 발현을 제어하는 인공 프로모터.
제 1항에 있어서, 5' 전사 제어 영역이 다른 기원으로부터 효과적으로 융합된 2 이상의 제어자 요소를 포함하여, 청구항 2 내지 21에 언급된 어떤(any) 특성에 개별적으로 반응하는 인공 프로모터.
제 1항에 있어서, 인공 엑손/인트론/엑손 영역으로부터 제일 엑손이 시퀀스 모티브 C 및 A 리치를 포함하는 인공 프로모터.
제 1항에 있어서, 인공 엑손/인트론/엑손 영역으로부터 제일 엑손이 모티브 CTCC 및/또는 그의 동종 시퀀스 CTC, TCC 및 TC가 자주 반복되는 시퀀스를 포함하는 인공 프로모터.
제 1항에 있어서, 인공 엑손/인트론/엑손 영역으로부터 인트론이 CTCC 모티브 및/또는 그의 동종 시퀀스 CTC, TCC 및 TC가 자주 반복되는 시퀀스를 포함하는 인공 프로모터.
제 23항 내지 제 25항 중 어느 한 항에 있어서, 인공 엑손/인트론/엑손 영역의 뉴클레오티드 시퀀스가 SEQ ID NO: 6 또는 그의 분획에 상응하는 인공 프로모터.
제 1항에 있어서, 인공 엑손/인트론/엑손 영역으로부터 제이 엑손이 높은 C 및 A 함량을 갖는 시퀀스 모티브를 포함하는 인공 프로모터.
제 1항에 있어서, 인공 엑손/인트론/엑손 영역으로부터 제이 엑손이 모티브 HCAYYY (H= C or T or A; Y= C or T)와 적어도 83%의 동종성을 갖는 시퀀스를 포함하는 인공 프로모터.
제 27항 또는 제 28항에 있어서, 인공 엑손/인트론/엑손 영역으로부터 제이 엑손의 뉴클레오티드 시퀀스가 SEQ ID NO: 1 내의 시퀀스에 상응하는 인공 프로모터.
제 23항 내지 제 29항 중 어느 한 항에 있어서, 인공 엑손/인트론/엑손 영역의 뉴클레오티드 시퀀스가 SEQ ID NO: 8 또는 그의 분획과 상응하는 인공 프로모터.
제 1항 내지 제 30항 중 어느 한 항에 있어서, 인공 엑손/인트론/엑손 영역의 뉴클레오티드 시퀀스가 SEQ ID NO: 20 내의 시퀀스에 적어도 부분적으로 상응하는 인공 프로모터.
식물에서 작용하는 프로모터에 융합될 때, 상기 프로모터에 의해 제어된 DNA 시퀀스의 발현을 고양하는데 기여하도록 하는 청구항 1항 내지 31항에 따른 인공 프로모터로부터 DNA 분획.
제 32항에 있어서, 프로모터에 융합된 유전자의 번역을 고양할 수 있는 인공 프로모터 분획.
제 33항에 있어서, 모티브 HCAYYY (H= C or T or A; Y= C or T)와 적어도 83%의 유사성을 갖는 시퀀스를 포함하는 인공 프로모터 분획.
제 33항에 있어서, 시퀀스 모티브 C 및 A 리치를 갖는 인공 프로모터 분획.
제 33항에 있어서, 뉴클레오티드 시퀀스는 SEQ ID NO: 1 상의 것에 상응하는 인공 프로모터 분획.
제 33항 내지 제 36항 중 어느 한 항에 있어서, 식물 세포에서 CaMV 35S 프로모터로부터 생산된 mRNA의 번역을 증진하는데 기여하는 인공 프로모터 분획.
제 32항에 있어서, 엑손/인트론/엑손 영역에 상응하는 인공 프로모터 분획.
제 38항에 있어서, 제일 엑손은 시퀀스 모티브 C 및 A 리치를 포함하는 인공 프로모터 분획.
제 38항에 있어서, 제일 엑손은 모티브 CTCC 및/또는 그의 동종성 시퀀스 CTC, TCC 및 TC가 자주 반복되는 시퀀스를 포함하는 인공 프로모터 분획.
제 38항에 있어서, 그 인트론은 모티브 CTCC 및/또는 그의 동종성 시퀀스 CTC, TCC 및 TC가 자주 반복되는 시퀀스를 포함하는 인공 프로모터 분획.
제 38항에 있어서, 뉴클레오티드 시퀀스는 SEQ ID NO: 6 내의 시퀀스에 상응하는 인공 프로모터 분획.
제 38항에 있어서, 뉴클레오티드 시퀀스는 SEQ ID NO: 8 내의 시퀀스에 상응하는 인공 프로모터 분획.
제 38항 내지 제 43항 중 어느 한 항에 있어서, 식물 세포에서 CaMV 35S 프로모터의 제어하에 유전자의 발현을 고양하는데 기여하는 인공 프로모터 분획.
제 32항에 있어서, as-1-형 전사 인핸서에 상응하는 인공 프로모터 분획.
뉴클레오티드 시퀀스가 SEQ ID NO: 13 안의 뉴클레오티드 7 내지 26 또는 그의 상보적인 시퀀스에 상응하는 분획과 필수적으로 동일한 인공 프로모터 분획.
제 32항에 있어서, 5' 전사 제어 요소에 상응하는 인공 프로모터 분획.
제 47항에 있어서, 5' 전사 제어 요소는 라이스 액틴-1 유전자 유래인 인공 프로모터 분획.
제 48항에 있어서, 뉴클레오티드 시퀀스는 라이스 액틴-1 유전자 전사 시작점으로부터 -43에서 -310까지의 분획을 포함하는 인공 프로모터 분획.
제 49항에 있어서, 뉴클레오티드 시퀀스는 SEQ ID NO: 10 내의 시퀀스 또는 그 분획에 상응하는 인공 프로모터 분획.
제 49항에 있어서, 뉴클레오티드 시퀀스는 SEQ ID NO: 11 내의 시퀀스 또는 그 분획에 상응하는 인공 프로모터 분획.
제 47항에 있어서, 5' 전사 제어 요소는 메이즈 유비퀴틴-1 유전자 유래인 인공 프로모터 분획.
제 52항에 있어서, 뉴클레오티드 시퀀스는 메이즈 유비퀴틴-1 유전자 전사 시작점으로부터 -299 내지 -855 영역을 포함하는 인공 프로모터 분획.
제 53항에 있어서, 5' 전사 제어 요소는 SEQ ID NO: 19 내의 시퀀스 또는 그 분획에 상응하는 인공 프로모터 분획.
청구항 1 내지 31의 어느 하나에 상응하는 인공 프로모터를 포함하는 식물 세포내의 DNA 시퀀스의 발현용 카셋트.
청구항 32 내지 54의 어느 하나에 상응하는 DNA 분획에 기능적으로 융합된 전사 인핸서 요소를 포함하는 식물 세포내의 DNA 시퀀스의 발현용 카셋트.
청구항 55 또는 56의 특징이 있는 발현 카셋트의 하나를 포함하는 식물세포 형질전환(transformation)용 DNA 벡터.
청구항 57 상의 벡터를 수반하는 박테리아 세포 및 그 자손
청구항 57 상의 벡터로 형질전환된 식물세포 및 그 자손
제 59항에 있어서, 청구항 57에 기술된 벡터에 의하여 도입된 발현 카셋트에 인공 프로모터의 제어 하에 DNA 분획을 발현하는 식물세포.
제 59항에 있어서, 그 게놈에 안정하게 합체(integrated)된 청구항 55 또는 56에 특징된 발현 카셋트를 갖는 식물세포.
청구항 61에 특징된 식물세포로부터 재발생된(regenerated) 형질도입(transgenic) 식물.
제 62항에 있어서, 청구항 57에 기술된 벡터에 의하여 도입된 발현 카셋트에 포함된 인공 프로모터의 제어 하에 DNA 분획을 발현하는 형질도입 식물.
청구항 63에 특징된 형질도입 식물의 자손
제 64항에 있어서, 쌍떡잎식물인 식물.
제 65항에 있어서, 가지과(Solanaceae)인 식물.
제 66항에 있어서, 타바코, 토마토 또는 포테이토 종의 하나에 속하는 식물.
제 64항에 있어서, 외떡잎식물인 식물.
제 68항에 있어서, 벼과(graminae)인 식물.
제 69항에 있어서, 라이스, 슈가케인, 메이즈, 밀 또는 보리 종의 하나에 속하는 식물.
청구항 57에 기술된 벡터에 의하여 도입된 발현 카셋트에 포함된 인공 프로모터의 제어 하에 위치된 DNA 분획의 발현 결과로 청구항 60 또는 63에 따른 식물 또는 세포에 의하여 생산된 재조합 단백질의 정제 또는 용도.