WO2004039838A1 - Kristalle von insulinanaloga und verfahren zu ihrer herstellung - Google Patents

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WO2004039838A1
WO2004039838A1 PCT/EP2003/011470 EP0311470W WO2004039838A1 WO 2004039838 A1 WO2004039838 A1 WO 2004039838A1 EP 0311470 W EP0311470 W EP 0311470W WO 2004039838 A1 WO2004039838 A1 WO 2004039838A1
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insulin
amino acid
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Harald Berchtold
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Aventis Pharma Deutschland Gmbh
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/62—Insulins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2299/00—Coordinates from 3D structures of peptides, e.g. proteins or enzymes

Definitions

  • Insulin analog crystals and process for their preparation
  • diabetes mellitus Around 120 million people worldwide suffer from diabetes mellitus. Among them are about 12 million type I diabetics, for whom the application of insulin is the only currently possible therapy. Those affected are dependent on insulin injections for life, usually several times a day. Although type II diabetes, which affects around 100 million people, is not generally accompanied by a lack of insulin, treatment with insulin is considered to be the cheapest or the only possible form of therapy in a large number of cases. As the duration of the disease progresses, a large number of patients suffer from so-called diabetic late complications. These are essentially micro- and macrovascular damage that, depending on the type and extent, result in kidney failure, blindness, loss of extremities or an increased risk of cardiovascular diseases.
  • EP 0 214 826 Insulin analogs with an accelerated onset of action are described in EP 0 214 826, EP 0 375437 and EP 0 678 522.
  • EP 0 214 826 relates inter alia to on substitutions of B27 and B28, but not in connection with the substitution of B3.
  • EP 0 678 522 describes insulin analogs which have different amino acids in position B29, preferably proline, but not glutamic acid.
  • EP 0 375 437 comprises insulin analogs with lysine or arginine in B28, which can optionally be additionally modified in B3 and / or A21.
  • EP 0 885 961 A1 discloses B3-lysine, B29-glutamate human insulin as a new, fast-acting insulin.
  • EP 0 419 504 discloses insulin analogs which are active against chemical
  • Insulin analogs are analogs of naturally occurring insulins, namely human insulin or animal insulins, which differ from the corresponding, otherwise identical, naturally occurring insulin by substituting at least one naturally occurring amino acid residue and / or adding at least one amino acid residue and / or organic residue.
  • the A chain of human insulin has the following amino acid sequence: Gly lle Val Glu Gin Cys Cys Thr Ser lle Cys Ser Leu Tyr Gin Leu Glu Asn Tyr Cys Asn (SEQ ID NO 1)
  • the B chain of human insulin has the following amino acid sequence: Phe Val Asn Gin His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr (SEQ ID NO 2).
  • the crystals of the insulin analogs of the present invention contain an insulin analog or a physiologically acceptable salt thereof, in which asparagine (Asn) in position B3 of the B chain is replaced by a naturally occurring basic amino acid residue and at least one amino acid residue in positions B27, B28 or B29 of the B chain is replaced by another naturally occurring amino acid residue, whereby phenylalanine (Phe) may optionally be absent in position B1 of the B chain.
  • asparagine (Asn) in position B3 of the B chain is replaced by a naturally occurring basic amino acid residue and at least one amino acid residue in positions B27, B28 or B29 of the B chain is replaced by another naturally occurring amino acid residue, whereby phenylalanine (Phe) may optionally be absent in position B1 of the B chain.
  • the insulin analog or its physiologically acceptable salt is preferably characterized by formula I.
  • A1-A5 the amino acid residues in positions A1 to A5 of the A chain of human insulin (see SEQ ID NO 1) or animal insulin,
  • A8-A10 the amino acid residues in positions A8, A9 and A10 of the A chain of human insulin (see SEQ ID NO 1) or animal insulin
  • A12-A19 the amino acid residues in positions A12 to A19 of the A chain of human insulin (see SEQ ID NO 1) or animal insulin
  • B8-B18 the amino acid residues in positions B8 to B18 of the B chain of human insulin (see SEQ ID NO 2) or animal insulin
  • B1 is a phenylalanine residue (Phe) or a hydrogen atom
  • B27, B28 and B29 the amino acid residues in positions B27, B28 and B29 of the B chain of human insulin (cf. SEQ ID NO 2) or animal insulin or in each case another naturally occurring amino acid residue, with at least one of the amino acid residues in positions B27, B28 and B29 of the B chain is replaced by another naturally occurring amino acid residue.
  • the crystals of the insulin analogs of the present invention contain an insulin analog of bovine insulin, porcine insulin, sheep insulin or human insulin or its physiologically acceptable salt, namely an insulin analogue or a physiologically acceptable salt of the formula I, which is characterized in that
  • A8 alanine (Ala), A9 serine (Ser), A10 valine (Val) and B30 alanine (Ala) mean (amino acid residues A8 to A10 and B30 des
  • B30 means alanine (Ala) (amino acid residue B30 from pig insulin) or B30 threonine (Thr) (amino acid residue B30 from human insulin, see SEQ ID NO 2).
  • An insulin analogue or a physiologically compatible salt thereof of the formula I with the amino acid residues A8 to A10 and B30 of human insulin which is further characterized in that
  • an insulin analogue or a physiologically acceptable salt thereof of the formula I characterized in that the amino acid residue in position B3 of the B chain is a histidine (His), lysine (Lys) or arginine residue (Arg).
  • His histidine
  • Lys lysine
  • Arg arginine residue
  • FIG. 1 Further preferred embodiments of the present invention are crystals containing an insulin analog or a physiologically tolerable salt thereof of the formula I, characterized in that at least one of the amino acid residues in positions B27, B28 and B29 of the B chain is replaced by a naturally occurring amino acid residue, which is selected from the group of neutral or acidic amino acids,
  • an insulin analogue or a physiologically acceptable salt thereof of the form I characterized in that at least one of the amino acid residues in positions B27, B28 and B29 of the B chain is a naturally occurring amino acid residue which is selected from the group isoleucine (III), aspartic acid (Asp) and glutamic acid (Glu), preferably characterized in that at least one of the amino acid residues in positions B27, B28 and B29 of the B chain is replaced by a naturally occurring amino acid residue, which is selected from the group of neutral amino acids, or particularly preferred that at least one of the amino acid residues in positions B27, B28 and B29 of the B chain is an isoleucine residue (III), or
  • an insulin analogue or a physiologically acceptable salt thereof of the formula I characterized in that at least one of the amino acid residues in positions B27, B28 and B29 of the B chain is a naturally occurring amino acid residue which is selected from the group of the acidic amino acids, preferably thereby characterized in that at least one of the amino acid residues in the Positions B27, B28 and B29 of the B chain is an aspartic acid residue (Asp), preferably characterized in that the amino acid residue in position B27 or B28 of the B chain is an aspartic acid residue (Asp), or characterized in that at least one of the amino acid residues in positions B27, B28 and B29 of the B chain is a glutamic acid residue (Glu).
  • Asp aspartic acid residue
  • Glu glutamic acid residue
  • a preferred embodiment of the present invention are also crystals containing an insulin analog or a physiologically tolerable salt thereof of the formula I, characterized in that the amino acid residue in position B29 of the B chain is an aspartic acid residue (Asp).
  • crystals containing an insulin analog or a physiologically tolerable salt thereof of the formula I characterized in that the amino acid residue in position B27 of the B chain is a glutamic acid residue (Glu),
  • an insulin analogue or a physiologically acceptable salt thereof of the formula I characterized in that the amino acid residue in position B28 of the B chain is a glutamic acid residue (Glu), or
  • an insulin analogue or a physiologically acceptable salt thereof of the formula I characterized in that the amino acid residue in position B29 of the B chain is a glutamic acid residue (Glu).
  • Crystals containing an insulin analog or a physiologically tolerable salt thereof are very particularly preferred, which is characterized in that the B chain has the sequence
  • amino acid residue in position B28 of the B chain is an isoleucine residue (III), preferably an insulin analog or a physiologically acceptable salt thereof , which is characterized in that the B chain has the sequence
  • the insulin analogs of the formula I can preferably be produced by genetic engineering.
  • the production of the insulin of the formula I takes place mainly by genetic engineering using site-directed mutagenesis according to standard methods.
  • a gene structure coding for the desired insulin analog of formula I is constructed and expressed in a host cell - preferably in a bacterium such as E. coli or a yeast, in particular Saccharomyces cerevisiae - and - if the gene structure codes for a fusion protein - from which
  • Fusion protein released the insulin analog of formula I are analog methods described, for example, in EP-A-0 211 299, EP-A-0 227 938, EP-A-0 229 998, EP-A-0 286 956 and DE patent application P 38 21 159.
  • the fusion protein fraction can be split off chemically using cyanogen halogen (see EP-A-0 180 920).
  • preproinsulin precursor which has a fusion protein fraction (pre-sequence) according to US 5,358,857
  • the fusion protein fraction is split off at a later stage together with the splitting off of the C-peptide.
  • the insulin precursor is then subjected to oxidative sulfitolysis after e.g. by R.C. Marshall and A.S. Inglis in "Practical Protein Chemistry - A Handbook” (published by A. Darbre) 1986, pages 49-53 and then in the presence of a thiol to form the correct method
  • Disulfide bridges renatured, e.g. after that of G.H. Dixon and A.C. Wardlow in Nature (1960), pages 721-724.
  • insulin precursors can also be folded directly (EP-A-0 600 372; EP-A-0 668 292).
  • the C peptide is removed by tryptic cleavage - e.g. according to the method of Kemmler et al., J.B.C. (1971), pages 6786-6791 and the insulin analog of formula I using known techniques such as chromatography - e.g. EP-A-0 305 760 - and crystallization purified.
  • the B chain ends at the C-terminal with arginine or two arginine residues. These can be removed enzymatically using carboxypeptidase B.
  • the insulin analogs have full biological activity. This was demonstrated by intravenous administration to rabbits and the resulting lowering of blood glucose. The faster onset of action after subcutaneous application was with the euglycemic clamp technique shown on an empty dog (EP 0 885 961 A1, Examples 5 and 6). 0.3 IU / kg was administered. The reference product was human insulin. With the clamp technique, the blood glucose value is measured at short intervals after the insulin injection and exactly as much glucose is infused to compensate for the reduction. This has the advantage that no counterregulation occurs in the animals, as would be the case with a sharp drop in blood glucose after the administration of insulin. The amount and the time course of the infused glucose characterize the effect of the insulin.
  • Lys (B3), Glu (B29) - (SEQ ID NO 3) and Lys (B3), lle (B28) - (SEQ ID NO 4) insulin show a significantly faster onset of action than human insulin.
  • the maximum effect (glucose infusion rate) is achieved after 100 minutes with human insulin, with Lys (B3), Glu (B29) insulin (SEQ ID NO 3) after 80 minutes and with Lys (B3), lle (B28) insulin (SEQ ID NO 4) after only 60 minutes. Therefore, these analogs, when injected shortly before a meal, should better compensate for the postprandial increase in blood glucose than human insulin.
  • the insulin analogues described are suitable both for the therapy of type I and of type II diabetes mellitus, preferably in conjunction with a basal insulin.
  • the insulin analogs can also be used in the pharmaceutical preparations in the form of their physiologically tolerable salts, as alkali or as ammonium salts. Any proportion of one or more insulin analogs of the formula I or an insulin analog of the formula I can be present in a mixture of these insulin analogs independently of one another in dissolved, amorphous and / or crystalline form.
  • Insulins and insulin analogs are often provided as aqueous pharmaceutical formulations containing zinc ions.
  • Zinc ions are added to insulin preparations for two main reasons: Zn 2+ ions have a stabilizing effect on insulin preparations because they prevent the formation of
  • Insulin analogs in particular Lys B3, Glu B29 human insulin
  • zinc-free crystals of the insulin analogues according to the invention can also be used to prepare other pharmaceutical formulations, e.g. for solid formulations or emulsions for administration by inhaler, or for oral administration.
  • the object underlying the invention was therefore to provide zinc-free crystals of the insulin analogues described.
  • the insulin analogues described can be prepared in hexamer crystals which do not contain divalent ions such as e.g. Zinc ions. This is explained in more detail using the example of the insulin analog Lys B3, Glu B29 human insulin.
  • the (1 ⁇ -2Fo-Fc) electron density of the region around histidine B-10 is significantly different from the classic 2Zn type, in which a Zn 2+ ion is coordinated octahedrally by three symmetry-neighboring histindine B10 and three water molecules ,
  • the bond distances (Zn 2+ -His-B10) of the in the PDB database [Bernstein et al., J. Mol.Biol. 112, 535-542 (1977)] deposited structures of the 2Zn type lie between 1, 9 and 2.1 A and are significantly different from the observed bond distances by 2.3 ⁇ in the new, zinc-free crystal structure.
  • asparagine (Asn) in position B3 of the B chain is replaced by a naturally occurring basic amino acid residue and at least one amino acid residue in positions B27, B28 or B29 of the B chain by another naturally occurring neutral or acidic amino acid residue is exchanged, whereby phenylalanine (Phe
  • Another object of the invention are crystals as described above, the histidine B10 residues of three molecules of the insulin analog in a hexamer via hydrogen bonds with a water molecule, a dihydrogen phosphate ion (H 2 PO " ), a monohydrogen phosphate ion (HPO 4 2 " ) or a sulfate ion (SO 4 2" ) are connected.
  • H 2 PO " dihydrogen phosphate ion
  • HPO 4 2 " monohydrogen phosphate ion
  • SO 4 2 sulfate ion
  • Another object of the invention are crystals as described above, wherein the histidine B10 residues of the molecules of the insulin analog in a hexamer are each folded back to their own dimer and there is no hydrogen bonding of the histidine B10 residues to a water molecule.
  • the crystals according to the invention contain insulin analogues according to formula I described above, the amino acid residue in position B3 of the B chain of the insulin analog being in particular a histidine (His), lysine (Lys) or arginine residue (Arg); and wherein particularly preferably at least one of the amino acid residues in positions B27, B28 and B29 of the B chain is a naturally occurring amino acid residue which is selected from the group of isoleucine (III), aspartic acid (Asp) and glutamic acid (Glu).
  • the amino acid residue in position B3 of the B chain of the insulin analog being in particular a histidine (His), lysine (Lys) or arginine residue (Arg); and wherein particularly preferably at least one of the amino acid residues in positions B27, B28 and B29 of the B chain is a naturally occurring amino acid residue which is selected from the group of isoleucine (III), aspartic acid (Asp) and glutamic acid (Glu).
  • the crystals of the invention contain in particular an insulin analog, characterized in that the B chain has the sequence Phe Val Lys Gin His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Glu Thr
  • Another object of the invention is a pharmaceutical preparation, characterized in that it contains at least one crystal as described above, which may preferably contain an adjuvant that facilitates the uptake of the insulin analogue into the blood, and very particularly preferably wherein the pharmaceutical formulation has an insulin activity has rapid onset of action.
  • Another object of the invention is a pharmaceutical preparation, characterized in that it contains at least one crystal as described above and contains an auxiliary which is used in inhalative and / or oral formulations of insulin or insulin analogs.
  • Another object of the invention is a method for producing a crystal as described above, in which (a) a zinc-free, amorphous powder of an insulin analog as described above is dissolved in water in a concentration of 15-25 mg / ml,
  • the insulin analog is in particular Lys B3, Glu B29 human insulin.
  • Another object of the invention is a method for producing a crystal as described above, in which the precipitant is selected from a group comprising (a) ammonium dihydrogen phosphate,
  • ammonium dihydrogen phosphate or di-ammonium hydrogen phosphate at pH values between 3.0 and 8.0, or ammonium dihydrogen phosphate / di-ammonium hydrogen phosphate in combination with trisodium citrate at a pH value of 5.5 ⁇ 1.5 or ammonium sulfate in combination with PEG diverse molecular weights at a pH of 6.0 ⁇ 1.5 is used.
  • the invention also relates to the use of a crystal as described above for the manufacture of a medicament for the treatment of type I and / or II diabetes.
  • Example 1 Production of the new zinc-free hexamer crystal form:
  • Amorphous, zinc-free powder of Lys B3, Glu B29-Human insulin is unbuffered in aqua dest./ ⁇ CI at pH around 2.0. This procedure allows a clear solution to form at insulin concentrations around 20 mg / ml. The crystallization takes place in 24-well Linbro plates using the hanging-drop method. The following reagent of the "Protein Crystallization Screening Kit” from Hampton Research Inc. is used as a precipitant: 1. 0.4 M ammonium dihydrogen phosphate, pH 4.2.
  • Amorphous, zinc-free powder of Lys B3, Glu B29 human insulin is unbuffered in aqua dest./HCI at pH around 2.0. This procedure allows a clear solution to form at insulin concentrations around 20 mg / ml.
  • the crystallization takes place according to the hanging-drop method in 24-well Linbro plates.
  • the following reagent of the "Protein Crystallization Screening Kit” from Hampton Research Inc. is used as precipitant: 1 M ammonium dihydrogen phosphate, 0.1 M trisodium citrate, pH 5.6.
  • Amorphous, zinc-free powder of Lys B3, Glu B29 human insulin is unbuffered in aqua dest./HCI at pH around 2.0. This procedure allows a clear solution to form at insulin concentrations around 20 mg / ml. The crystallization takes place in 24-well Linbro plates using the hanging-drop method. The following reagent of the "Protein Crystallization Screening Kit” from Hampton Research Inc. is used as precipitant: 0.2 M ammonium sulfate, 20% PEG 3350, pH 6.0.
  • the crystals obtained according to Examples 1-3 are well ordered and enable an X-ray structure analysis, which shows a previously unknown structural arrangement of the region around the histidine B10 side chain for an insulin with glutamate B21 side chain.
  • the N-terminus of the B chains is unplugged without a significant secondary structure feature; there is no D-helix secondary structure as in the alternative R state.

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Abstract

Die Erfindung betrifft Kristalle eines Insulinanalogons, in welchem Asparagin (Asn) in Position B3 der B-Kette durch einen natürlich auftretenden basischen Aminosäurerest ausgetauscht ist und wenigstens ein Aminosäurerest in den Positionen B27, B28 oder B29 der B-Kette durch einen anderen natürlich auftretenden neutralen oder sauern Aminosäurerest ausgetauscht ist, wobei fakultativ Phenylalanin (Phe) in Position B1 der B-Kette fehlen kann, wobei die Kristalle in der Raumgruppe R3 (Nr. 146) mit den Zellachsen A=81,5 Å ± 1 Å und C=33,3 Å ± 1 Å vorliegen, ihre Herstellung und Verwendung sowie eine pharmazeutische Zusammensetzung enthaltend diese Kristalle.

Description

Beschreibung
Kristalle von Insulinanaloga und Verfahren zu ihrer Herstellung
Die Erfindung betrifft Kristalle eines Insulinanalogons, in welchem Asparagin (Asn) in Position B3 der B-Kette durch einen natürlich auftretenden basischen Aminosäurerest ausgetauscht ist und wenigstens ein Aminosäurerest in den Positionen B27, B28 oder B29 der B-Kette durch einen anderen natürlich auftretenden neutralen oder sauren Aminosäurerest ausgetauscht ist, wobei fakultativ Phenylalanin (Phe) in Position B1 der B-Kette fehlen kann, wobei die Kristalle in der Raumgruppe R3 (Nr. 146) mit den Zellachsen A=81 ,5 A ± 1 A und C= 33,3 A ± 1 A vorliegen.
Weltweit leiden etwa 120 Mio. Menschen an Diabetes mellitus. Darunter sind etwa 12 Mio. Typ I-Diabetiker, für die die Applikation von Insulin die einzig derzeit mögliche Therapie darstellt. Die Betroffenen sind lebenslang, in der Regel mehrmals täglich, auf Insulininjektionen angewiesen. Obgleich Typ Il-Diabetes, an dem etwa 100 Mio. Menschen leiden, nicht grundsätzlich mit einem Mangel an Insulin einhergeht, wird doch in einer Vielzahl von Fällen die Behandlung mit Insulin als günstigste oder einzig mögliche Therapieform angesehen. Mit fortschreitender Dauer der Krankheit leidet eine große Zahl der Patienten an sogenannten diabetischen Spätkomplikationen. Es handelt sich dabei im wesentlichen um mikro- und makrovaskuläre Schädigungen, die je nach Art und Umfang Nierenversagen, Erblindung, Verlust von Extremitäten oder ein erhöhtes Risiko für Herz/Kreislauferkrankungen zur Folge haben. Als Ursache werden in erster Linie chronisch erhöhte Blutglucosespiegel verantwortlich gemacht, da auch bei sorgfältiger Einstellung der Insulintherapie ein normales Blutglucoseprofil, wie es der physiologischen Regulation entsprechen würde, nicht erreicht wird (Ward, J. D. (1989) British Medical Bulletin 45, 111-126; Drury, P.L. et al. (1989) British Medical Bulletin 45, 127-147; Kohner, E.M. (1989) British Medical Bulletin 45, 148-173).
Beim Gesunden ist die Insulinsekretion eng an die Glucosekonzentration des Blutes angelehnt. Erhöhte Glucosespiegel, wie sie nach den Mahlzeiten auftreten, werden durch eine gesteigerte Insulinfreisetzung rasch kompensiert. Im nüchternen Zustand sinkt der Plasmainsulinspiegel auf einen basalen Wert ab, der ausreicht, eine kontinuierliche Versorgung insulinsensitiver Organe und Gewebe mit Glucose zu gewährleisten. Eine Optimierung der Therapie, die sogenannte intensivierte Insulintherapie, zielt heute primär darauf ab, Schwankungen der Blutglucosekonzentration, speziell Entgleisungen nach oben, möglichst gering zu halten (Bolli, G. B. (1989) Diabetes Res. Clin. Pract. 6, S3-S16; Berger, M. (1989) Diabetes Res. Clin. Pract. 6, S25-S32). Dies führt zu einer signifikanten Verminderung des Auftretens und des Fortschreitens diabetischer Spätschäden (The Diabetes Control and Complications Trial Research Group (1993) N. Engl. J. Med. 329, 977-986).
Aus der Physiologie der Insulinsekretion läßt sich ableiten, daß für eine verbesserte, intensivierte Insulintherapie unter Verwendung subcutan applizierter Präparate zwei Insulinzubereitungen mit unterschiedlicher Pharmakodynamik benötigt werden. Zur Kompensation des Blutglucoseanstiegs nach den Mahlzeiten muß das Insulin rasch anströmen und darf nur einige Stunden wirken. Zur basalen Versorgung, insbesondere in der Nacht, sollte ein Präparat zur Verfügung stehen, das lange wirkt, kein ausgeprägtes Maximum aufweist und nur sehr langsam anströmt.
Die auf humanen und tierischen Insulinen basierenden Präparate erfüllen die Ansprüche einer intensivierten Insulintherapie jedoch nur begrenzt. Rasch wirksame Insuline (Alt-Insuline) gelangen zu langsam ins Blut und an den Wirkort und weisen eine zu lange Gesamtwirkdauer auf. Die Folge ist, daß die postprandialen Glucosespiegel zu hoch liegen und mehrere Stunden nach der Mahlzeit die
Blutglucose zu stark absinkt (Kang, S. et al. (1991 ) Diabetes Care 14, 142-148; Home, P.J. et al. (1989) British Medical Bulletin 45, 92-110; Bolli, G. B. (1989) Diabetes Res. Clin. Pract. 6, S3-S16). Die verfügbaren Basalinsuline wiederum, vorallem NPH- Insuline, weisen eine zu kurze Wirkdauer auf und besitzen ein zu stark ausgeprägtes Maximum.
Neben der Möglichkeit, das Wirkprofil über galenische Prinzipien zu beeinflussen, bietet sich mit Hilfe der Gentechnik heute die Alternative, Insulinanaloga zu entwerfen, die bestimmte Eigenschaften wie Wirkungseintritt und -dauer allein durch ihre strukturellen Eigenschaften erzielen. Durch die Verwendung geeigneter Insulinanaloga könnte daher eine wesentlich bessere, den natürlichen Verhältnissen enger angeglichene Einstellung der Blutglucose erreicht werden.
Insulinanaloga mit beschleunigtem Wirkungseintritt werden in EP 0 214 826, EP 0 375437 und EP 0 678 522 beschrieben. EP 0 214 826 bezieht sich u.a. auf Substitutionen von B27 und B28, jedoch nicht in Verbindung mit der Substitution von B3. EP 0 678 522 beschreibt Insulinanaloga die in der Position B29 verschiedene Aminosäuren, vorzugsweise Prolin, aufweisen, jedoch nicht Glutaminsäure. EP 0 375 437 umfaßt Insulinanaloga mit Lysin oder Arginin in B28, die optional zusätzlich in B3 und/oder A21 modifiziert sein können. In EP 0 885 961 A1 wird B3- Lysin, B29-Glutamat-Humaninsulin als neues, schnellwirkendes Insulin offenbart.
In der EP 0 419 504 werden Insulinanaloga offenbart, die gegen chemische
Modifikationen geschützt sind, indem Asparagin in B3 und wenigstens eine weitere Aminosäure in den Positionen A5, A15, A18 oder A21 verändert sind. Die hier beschriebenen Insulinanaloga weisen jedoch nur eine Modifikation in der Position B3 und keine weitere aus der erwähnten Gruppe auf. Ein Hinweis, daß diese Verbindungen eine veränderte Pharmakodynamik mit der Folge eines schnelleren Wirkungseintritts besitzen, ist nicht gegeben.
Insulinanaloga sind Analoga von natürlich vorkommenden Insulinen, nämlich Humaninsulin oder tierischen Insulinen, welche sich durch Substitution wenigstens eines natürlich auftretenden Aminosäurerestes und/oder Addition wenigstens eines Aminosäurerestes und/oder organischen Restes von dem entsprechenden, ansonst gleichen natürlich vorkommenden Insulin unterscheiden.
Die A-Kette von Humaninsulin weist dabei die folgende Aminosäuresequenz auf: Gly lle Val Glu Gin Cys Cys Thr Ser lle Cys Ser Leu Tyr Gin Leu Glu Asn Tyr Cys Asn (SEQ ID NO 1 ) Die B-Kette von Humaninsulin weist dabei die folgende Aminosäuresequenz auf: Phe Val Asn Gin His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr (SEQ ID NO 2).
Die Kristalle der Insulinanaloga der vorliegenden Erfindung enthalten ein Insulinanalogon oder ein physiologisch verträgliches Salz desselben, in welchem Asparagin (Asn) in Position B3 der B-Kette durch eine natürlich auftretenden basischen Aminosäurerest ausgetauscht ist und wenigstens ein Aminosäurerest in den Positionen B27, B28 oder B29 der B-Kette durch einen anderen natürlich auftretenden Aminosäurerest ausgetauscht ist, wobei fakultativ Phenylalanin (Phe) in Position B1 der B-Kette fehlen kann.
Vorzugsweise ist das Insulinanalogon oder dessen physiologisch verträgliches Salz, gekennzeichnet durch Formel I
(A1 -A5)-Cys-Cys-A8-A9-A10-Cys-(A12-A19)-Cys-Asn
B1-Val-B3-Glu-His-Leu-Cys-(B8-B18)-Cys-(B20-B26)-B27-B28-B29-B30
worin bedeuten
(A1-A5) die Aminosäurereste in den Positionen A1 bis A5 der A-Kette von Humaninsulin (vgl. SEQ ID NO 1 ) oder tierischem Insulin,
(A8-A10) die Aminosäurereste in den Positionen A8, A9 und A10 der A-Kette von Humaninsulin (vgl. SEQ ID NO 1 ) oder tierischem Insulin, (A12-A19) die Aminosäurereste in den Positionen A12 bis A19 der A-Kette von Humaninsulin (vgl. SEQ ID NO 1 ) oder tierischem Insulin, (B8-B18) die Aminosäurereste in den Positionen B8 bis B18 der B-Kette von Humaninsulin (vgl. SEQ ID NO 2) oder tierischem Insulin,
(B20-B26) die Aminosäurereste in den Positionen B20 bis B26 der B-Kette von Humaninsulin (vgl. SEQ ID NO 2) oder tierischem Insulin,
der Aminosäurerest in Position B30 der B-Kette von Humaninsulin (vgl. SEQ ID NO 2) oder tierischem Insulin,
B1 ein Phenylalaninrest (Phe) oder ein Wasserstoffatom,
B3 ein natürlich auftretender basischer Aminosäurerest,
B27, B28 und B29 die Aminosäurereste in den Positionen B27, B28 und B29 der B-Kette von Humaninsulin (vgl. SEQ ID NO 2) oder tierischem Insulin oder jeweils ein anderer natürlich auftretender Aminosäurerest, wobei wenigstens einer der Aminosäurereste in den Positionen B27, B28 und B29 der B-Kette durch einen anderen natürlich vorkommenden Aminosäurerest ausgetauscht ist.
Von den zwanzig natürlich auftretenden Aminosäuren, die genetisch kodierbar sind, werden hier die Aminosäuren Glycin (Gly), Alanin (Ala), Valin (Val), Leucin (Leu), Isoleucin (lle), Serin (Ser), Threonin (Thr), Cystein (Cys), Methionin (Met), Asparagin (Asn), Glutamin (Gin), Phenylalanin (Phe), Tyrosin (Tyr), Tryptophan (Trp) und Prolin (Pro) als neutrale Aminosäuren, die Aminosäuren Arginin (Arg), Lysin (Lys), und Histidin (His) als basische Aminosäuren und die Aminosäuren Asparaginsäure (Asp) und Glutaminsäure (Glu) als saure Aminosäuren bezeichnet.
Vorzugsweise enthalten die Kristalle der Insulinanaloga der vorliegenden Erfindung ein Insulinanalogon von Rinderinsulin, Schweineinsulin, Schafinsulin oder Humaninsulin oder dessen physiologisch verträgliches Salz, nämlich ein Insulinanalogon oder ein physiologisch verträgliches Salz der Formel I, das sich dadurch auszeichnet, daß
A8 Alanin (Ala), A9 Serin (Ser), A10 Valin (Val) und B30 Alanin (Ala) bedeuten (Aminosäurereste A8 bis A10 und B30 des
Rinderinsulins),
A8 Threonin (Thr), A9 Serin (Ser) und
A10 Isoleucin (lle) bedeuten (Aminosäurereste A8 bis A10 der Insuline von
Mensch oder Schwein), wobei B30 Alanin (Ala) (Aminosäurerest B30 von Schweineinsulin) oder B30 Threonin (Thr) bedeutet (Aminosäurerest B30 von Humaninsulin, vgl. SEQ ID NO 2).
Besonders bevorzugt ist ein Insulinanaloga oder ein physiologisch verträgliches Salz desselben der Formel I mit den Aminosäureresten A8 bis A10 und B30 von Humaninsulin, welches sich ferner dadurch auszeichnet, daß
(A1-A5) die Aminosäurereste in den Positionen A1 bis A5 der A-Kette von Humaninsulin (vgl. SEQ ID NO 1 ),
(A12-A19) die Aminosäurereste in den Positionen A12 bis A19 der A-Kette von Humaninsulin (vgl. SEQ ID NO 1 ),
(B8-B18) die Aminosäurereste in den Positionen B8 bis B18 der B-Kette von Humaninsulin (vgl. SEQ ID NO 2) und
(B20-B26) die Aminosäurereste in den Positionen B20 bis B26 der B-Kette von Humaninsulin (vgl. SEQ ID NO 2) bedeuten. Weitere bevorzugte Ausgestaltungen der vorliegenden Erfindung sind Kristalle enthaltend ein Insulinanalogon oder ein physiologisch verträgliches Salz desselben der Formel I, dadurch gekennzeichnet, daß der Aminosäurerest in Position B1 der B- Kette ein Phenylalaninrest (Phe) ist oder
ein Insulinanalogon oder ein physiologisch verträgliches Salz desselben der Formel I, dadurch gekennzeichnet, daß der Aminosäurerest in Position B3 der B-Kette ein Histidin- (His), Lysin- (Lys) oder Argininrest (Arg) ist.
Weitere bevorzugte Ausgestaltungen der vorliegenden Erfindung sind Kristalle enthaltend ein Insulinanalogon oder ein physiologisch verträgliches Salz desselben der Formel I , dadurch gekennzeichnet, daß wenigstens einer der Aminosäurereste in den Positionen B27, B28 und B29 der B-Kette durch einen natürlich auftretenden Aminosäurerest ersetzt ist, welcher ausgewählt ist aus der Gruppe der neutralen oder der sauren Aminosäuren,
ein Insulinanalogon oder ein physiologisch verträgliches Salz desselben der Forme I, dadurch gekennzeichnet, daß wenigstens einer der Aminosäurereste in den Positionen B27, B28 und B29 der B-Kette ein natürlich auftretender Aminosäurerest ist, welcher ausgewählt ist aus der Gruppe Isoleucin (lle), Asparaginsäure (Asp) und Glutaminsäure (Glu), vorzugsweise dadurch gekennzeichnet, daß wenigstens einer der Aminosäurereste in den Positionen B27, B28 und B29 der B-Kette durch einen natürlich auftretenden Aminosäurerest ersetzt ist, welcher ausgewählt ist aus der Gruppe der neutralen Aminosäuren, oder besonders bevorzugt, daß wenigstens einer der Aminosäurereste in den Positionen B27, B28 und B29 der B-Kette ein Isoleucinrest (lle) ist, oder
ein Insulinanalogon oder ein physiologisch verträgliches Salz desselben der Formel I, dadurch gekennzeichnet, daß wenigstens einer der Aminosäurereste in den Positionen B27, B28 und B29 der B-Kette ein natürlich auftretender Aminosäurerest ist, welcher ausgewählt ist aus der Gruppe der sauren Aminosäuren, vorzugsweise dadurch gekennzeichnet, daß wenigstens einer der Aminosäurereste in den Positionen B27, B28 und B29 der B-Kette ein Asparaginsäurerest (Asp) ist, vorzugsweise dadurch gekennzeichnet, daß der Aminosäurerest in Position B27 oder B28 der B-Kette ein Asparaginsäurerest (Asp) ist, oder dadurch gekennzeichnet, daß wenigstens einer der Aminosäurereste in den Positionen B27, B28 und B29 der B- Kette ein Glutaminsäurerest (Glu) ist.
Eine bevorzugte Ausgestaltung der vorliegenden Erfindung sind auch Kristalle enthaltend ein Insulinanalogon oder ein physiologisch verträgliches Salz desselben der Formel I, dadurch gekennzeichnet, daß der Aminosäurerest in Position B29 der B- Kette ein Asparaginsäurerest (Asp) ist.
Weitere bevorzugte Ausgestaltungen sind Kristalle enthaltend ein Insulinanalogon oder ein physiologisch verträgliches Salz desselben der Formel I, dadurch gekennzeichnet, daß der Aminosäurerest in Position B27 der B-Kette ein Glutaminsäurerest (Glu) ist,
ein Insulinanalogon oder ein physiologisch verträgliches Salz desselben der Formel I, dadurch gekennzeichnet, daß der Aminosäurerest in Position B28 der B-Kette ein Glutaminsäurerest (Glu) ist, oder
ein Insulinanalogon oder ein physiologisch verträgliches Salz desselben der Formel I, dadurch gekennzeichnet, daß der Aminosäurerest in Position B29 der B-Kette ein Glutaminsäurerest (Glu) ist.
Ganz besonders bevorzugt sind Kristalle enthaltend ein Insulinanalogon oder ein physiologisch verträgliches Salz desselben, das sich dadurch auszeichnet, daß die B- Kette die Sequenz
Phe Val Lys Gin His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Glu Thr aufweist (SEQ ID NO 3), oder ein Insulinanalogon oder ein physiologisch verträgliches Salz desselben, das sich dadurch auszeichnet, daß der Aminosäurerest in Position B27 der B-Kette ein Isoleucinrest (lle) ist, vorzugsweise ein Insulinanalogon oder ein physiologisch verträgliches Salz desselben, das sich dadurch auszeichnet, daß die B-Kette die Sequenz
Phe Val Lys Gin His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr lle Pro Lys Thr
aufweist (SEQ ID NO 4), oder ein Insulinanalogon oder ein physiologisch verträgliches Salz desselben der Formel I, dadurch gekennzeichnet, daß der Aminosäurerest in Position B28 der B-Kette ein Isoleucinrest (lle) ist, vorzugsweise ein Insulinanalogon oder ein physiologisch verträgliches Salz desselben, das sich dadurch auszeichnet, daß die B-Kette die Sequenz
Phe Val Lys Gin His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr lle Lys Thr
aufweist (SEQ ID NO 5).
Die Insulinanaloga der Formel I lassen sich vorzugsweise gentechnologisch herstellen.
Die Herstellung der Insulin der Formel I erfolgt hauptsächlich gentechnologisch mittels site-directed mutagenesis nach Standardmethoden.
Dazu wird eine für das gewünschte Insulinanalogon der Formel I kodierende Genstruktur konstruiert und in einer Wirtszelle - vorzugsweise in einem Bakterium wie E. coli oder eine Hefe, insbesondere Saccharomyces cerevisiae - zur Expression gebracht und -falls die Genstruktur für ein Fusionsprotein codiert - aus dem
Fusionsprotein das Insulin-Analogon der Formel I freigesetzt; analoge Methoden sind z.B. beschrieben in EP-A-0 211 299, EP-A-0 227 938, EP-A-0 229 998, EP-A-0 286 956 und der DE-Patentanmeldung P 38 21 159.
Die Abspaltung des Fusionsproteinanteils kann nach Zellenaufschluß chemisch mittels Halogencyan (siehe EP-A-0 180 920) erfolgen.
Bei der Herstellung mittels eines Präproinsulinvorläufers der einen Fusionsproteinanteil (Präsequenz) nach US 5,358,857 besitzt, erfolgt die Abspaltung des Fusionsproteinanteils auf einer späteren Stufe zusammen mit der Abspaltung des C-Peptides.
Der Insulinvorläufer wird dann der oxidativen Sulfitolyse nach der z.B. von R.C. Marshall und A.S. Inglis in "Practical Protein Chemistry - A Handbook" (Herausgeber A. Darbre) 1986, Seiten 49 - 53 beschriebenen Methode unterworfen und anschließend in Gegenwart eines Thiols unter Ausbildung der korrekten
Disulfidbrücken renaturiert, z.B. nach der von G.H. Dixon und A.C. Wardlow in Nature (1960), Seiten 721 - 724 beschriebenen Methode.
Die Insulinvorläufer können jedoch auch direkt gefaltet werden (EP-A-0 600 372; EP- A-0 668 292).
Das C-Peptid wird mittels tryptischer Spaltung entfernt - z.B. gemäß der Methode von Kemmler et al., J.B.C. (1971 ), Seiten 6786 - 6791 und das Insulinanalogon der Formel I mittels bekannter Techniken wie Chromatographie - z.B. EP-A-0 305 760 - und Kristallisation gereinigt.
Bei diesen Verfahren endet die B-Kette C-terminal mit Arginin oder zwei Argininresten. Diese können enzymatisch mittels Carboxypeptidase B entfernt werden.
Die Insulinanaloga besitzen volle biologische Aktivität. Dies wurde durch intravenöse Applikation an Kaninchen und der daraus resultierenden Blutglucosesenkung gezeigt. Der schnellere Wirkungseintritt nach subcutaner Applikation wurde mit der euglykämischen Clamp Technik am nüchternen Hund gezeigt (EP 0 885 961 A1 , Beispiele 5 und 6). Es wurden 0,3 lE/kg verabreicht. Referenzpräparat war Humaninsulin. Bei der Clamptechnik wird nach der Insulininjektion in kurzen Zeitabständen der Blutglucosewert gemessen und genau soviel Glucose infundiert, um die Absenkung zu kompensieren. Dies hat den Vorteil, daß bei den Tieren keine Gegenregulation auftritt, wie es bei einem starken Abfall der Blutglucose nach der Gabe von Insulin der Fall wäre. Die Menge und der zeitliche Verlauf der infundierten Glucose charakterisieren die Wirkung des Insulins. Lys(B3), Glu(B29)- (SEQ ID NO 3) und Lys(B3), lle(B28)- (SEQ ID NO 4) Insulin weisen einen deutlich schnelleren Wirkungseintritt als Humaninsulin auf. Die maximale Wirkung (Glucoseinfusionsrate) wird mit Humaninsulin nach 100 Minuten erreicht, mit Lys(B3), Glu(B29)-lnsulin (SEQ ID NO 3) dagegen nach 80 Minuten und mit Lys(B3)-, lle(B28)-lnsulin (SEQ ID NO 4) bereits nach 60 Minuten. Daher sollten diese Analoga, wenn sie kurz vor einer Mahlzeit injiziert werden, den postprandialen Anstieg der Blutglucose besser kompensieren als Humaninsulin.
Die beschriebenen Insulinanaloga eignen sich sowohl zur Therapie des Typ I- als auch des Typ Il-Diabetes mellitus vorzugsweise in Verbindung mit einem Basalinsulin.
Die Insulin-Analoga können in den pharmazeutischen Zubereitungen auch in Form deren physiologisch verträglichen Salze, als Alkali- oder als Ammoniumsalze, eingesetzt werden. Ein beliebiger Anteil eines oder mehrerer Insulin-Analoga der Formel I oder ein Insulin-Analogon der Formel I kann in einer Mischung weiterer dieser Insulin-Analoga unabhängig voneinander jeweils in gelöster, amorpher und/oder kristalliner Form vorliegen.
Insuline und Insulinanaloga werden häufig als wässrige pharmazeutische Formulierungen bereitgestellt, die Zinkionen enthalten.
Die Zugabe von Zinkionen zu Insulinpräparationen erfolgt im wesentlichen aus zwei Gründen: Zn2+-lonen wirken stabilisiernd auf Insulinpräparationen da diese die Bildung von
Insulin-Hexameren förderen [Brange et al. Diabetic Medicine, 3, 532-536 (1986). 2. In Abhängigkeit von der Zn2+-lonen Konzentration kann der zeitliche Verlauf d und Abströmkinetik von Insulinpräparationen gesteuert werden.
Bei schnellwirkenden Insulinen führen die Punkte 1 und 2 zu einer Problematik. Aufgrund der erhöhten galenischen Stabilität der Präparation sind hohe Konzentrationen an Insulin-Hexameren vorteilhaft. Da Zn2+-lonen die An- und Abström-kinetik des Insulinanalogons jedoch verzögern, wirken sie entgegengesetzt zur gewünschten Kinetik der Wirkstoff-Freisetzung. Daher hat man sich entschieden, eines der beschriebenen Insulinanaloga, nämlich Lys B3, Glu B29-Humaninsulin, in Form einer zinkfreien, wässrigen Formulierung bereitzustellen (Internationale Patentanmeldung PCT/EP02/02625).
Zur Herstellung der zinkfreien, wässrigen Formulierung der beschriebenen
Insulinanaloga, insbesondere Lys B3, Glu B29-Humaninsulin besteht das Bedürfnis, zinkfreie Kristalle der Insulinanaloga einsetzen zu können. Darüber hinaus können zinkfreie Kristalle der erfindungsgemäßen Insulinanaloga auch zur Herstellung anderer pharmazeutischer Formulierungen verwendet werden, z.B. bei festen Formulierungen oder Emulsionen zur Verabreichung per Inhalator, oder bei oraler Verabreichung.
Die der Erfindung zugrundeliegende Aufgabe war somit die Bereitstellung zinkfreier Kristalle der beschriebenen Insulinanaloga. Dabei sollte auch ein Ersatz von Zinkionen durch andere zweiwertige Ionen, die für pharmazeutische Formulierungen aufgrund ihrer Toxizität ungeeignet sind, vermieden werden.
Es wurde nun überraschenderweise gefunden, dass die beschriebenen Insulinanaloga in Hexamer-Kristallen hergestellt werden können, die keine zweiwertigen Ionen wie z.B. Zinkionen, enthalten. Am Beispiel des Insulinanalogons Lys B3, Glu B29- Humaninsulin sei dies näher erläutert.
Diese neue Kristallform von Lys B3, Glu B29-Humaninsulin ist kristallograpisch isomorph zum klassischen 2Zn-lnsulin-Typ der in der Literatur für Schweineinsulin und Humaninsulin beschrieben ist [Baker et al., Phil.Trans.Roy.Soc. 319, 369-454(1988) ]. Die neuen zinkfreien Hexamer-Kristalle gehören der rhomboedrischen Raumgruppe R3 (Nr. 146) an mit zwei Insulinmonomeren pro asymmetrischer Einheit. Die Elementarzellachsen bei -70°C (durch Anwendung der Schockgefriermethode) wurden ermittelt zu: A = 81 ,5 A, C = 33,3 A. Die Röntgenstrukturanalyse der neuen Kristallform bei 1 ,8 A Auflösung ergab, dass sich an Stelle der Zn2+-lonen (im klassischen 2Zn-Typus) mit Bindungsabständen (Zn2+-His-B10) um 2,0 A in der neuen Kristallform von Lys B3, Glu B29-Humaninsulin nur ein sehr kleiner Elektronendichtepeak befindet der mit einem Wassermolekül (H2O) entspricht (Bindungsabstand H2O -His-B10 um 2,3 A). Sowohl die Quantität der Elektronendichte als auch der Bindungsabstand zeigen für ein Insulin mit Glutamat-B21 -Seitenkette ein bisher unbekanntes strukturelles Arrangement der Region um die Histidin-B10-Seiten- kette.
Die (1σ-2Fo-Fc)-Elektronendichte der Region um Histidin B-10 ist signifikant unterschiedlich zum klassischen 2Zn-Typus, in welchem ein Zn2+-lon oktaedrisch von je drei Symmetrie-benachbarten Histindin-B10 und je drei Wassermolekülen koordiniert werden. Die Bindungsabstände (Zn2+-His-B10) der in der PDB-Daten-bank [Bernstein et al., J.Mol.Biol. 112, 535-542 (1977)] hinterlegten Strukturen des 2Zn- Typus liegen zwischen 1 ,9 und 2,1 A und sind signifikant unterschiedlich zu den beobachteten Bindungsabstände um 2,3Ä in der neuen, zinkfreien Kristallstruktur. Das besondere an der hier beschriebenen neuen Hexamer-Kristallform von Lys B3, Glu B29-Humaninsulin ist, dass diese Insulin-Hexamere enthält ohne die ansonsten hierfür notwendigen zweiwertigen Kationen (z.B. Zn2+, Co2+, Cd2+). Bisher hat man angenommen, dass die Ausbildung von Insulin-Hexameren ohne zweiwertige Kationen nur dann möglich ist wenn die abstoßenden Kräfte der Glutamat-B21 Seitenkette durch Protein-Engineering (z.B. durch den Austausch von B21-Glu zu Gin) reduziert werden kann [Bentley et al., J.Mol.Biol. 228,1163-1176 (1992). Die Beibehaltung der Glu-B21 -Seitenkette - welche den Zerfall von Insulin-Hexameren fördert - ist jedoch vor allem für schnellwirkende Insuline zum Erhalt einer schnellen An- und Abströmkinetik wichtig. Gegenstand der Erfindung sind demgemäß Kristalle eines Insulinanalogons, in welchem Asparagin (Asn) in Position B3 der B-Kette durch einen natürlich auftretenden basischen Aminosäurerest ausgetauscht ist und wenigstens ein Aminosäurerest in den Positionen B27, B28 oder B29 der B-Kette durch einen anderen natürlich auftretenden neutralen oder sauern Aminosäurerest ausgetauscht ist, wobei fakultativ Phenylalanin (Phe) in Position B1 der B-Kette fehlen kann, wobei die Kristalle in der Raumgruppe R3 (Nr. 146) mit den Zellachsen A=81 ,5 A ± 1 A und C= 33,3 A ± 1 A vorliegen; wobei insbesondere die Moleküle des Insulinanalogons in Form von zinkfreien Hexameren, bestehend aus jeweils drei Dimeren, vorliegen.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind Kristalle wie oben beschrieben, wobei die Histidin B10-Reste jeweils dreier Moleküle des Insulinanalogons in einem Hexamer über Wasserstoffbrückenbindungen mit einem Wassermolekül, einem Dihydrogenphosphat-Ion (H2PO "), einem Monohydrogenphosphat-Ion (HPO4 2") oder einem Sulfat-Ion (SO4 2") verbunden sind.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind Kristalle wie oben beschrieben, wobei die Histidin B10-Reste der Moleküle des Insulinanalogons in einem Hexamer jeweils auf das eigene Dimer zurückgefaltet sind und keine Wasserstoffbrückenbildung der Histidin B10-Reste zu einem Wassermolekül vorhanden ist.
Die erfindungsgemäßen Kristalle enthalten dabei Insulinanaloga gemäß der oben beschriebenen Formel I, wobei insbesondere der Aminosäurerest in Position B3 der B- Kette des Insulinanalogons ein Histidin-(His), Lysin-(Lys) oder Argininrest (Arg) ist; und wobei besonders bevorzugt wenigstens einer der Aminosäurereste in den Positionen B27, B28 und B29 der B-Kette ein natürlich auftretender Aminosäurerest ist, welcher ausgewählt ist aus der Gruppe Isoleucin (lle), Asparaginsäure (Asp) und Glutaminsäure (Glu).
Die erfindungsgemäßen Kristalle enthalten dabei insbesondere ein Insulinanalogon dadurch gekennzeichnet, dass die B-Kette die Sequenz Phe Val Lys Gin His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Glu Thr
aufweist (SEQ ID NO 3).
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist eine pharmazeutische Zubereitung, dadurch gekennzeichnet, dass sie mindestens einen Kristall wie oben beschrieben enthält, wobei bevorzugt ein Hilfsstoff enthalten sein kann, der die Aufnahme des Insulinanalogons ins Blut erleichtert und ganz besonders bevorzugt wobei die pharmazeutische Formulierung eine Insulinaktivität mit schnellem Wirkungseintritt aufweist.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist eine pharmazeutische Zubereitung, dadurch gekennzeichnet, dass sie mindestens einen Kristall wie oben beschrieben und einen Hilfsstoff enthält, der bei inhalativen und / oder oralen Formulierungen von Insulin oder Insulinanaloga Anwendung findet.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung eines Kristalls wie oben beschrieben, bei dem (a) ein zinkfreies, amorphes Pulver eines Insulinanalogons wie oben beschrieben in einer Konzentration von 15-25 mg/ml in Wasser gelöst wird,
(b) eine Präzipitation mit einem geeigneten Präzipitanten erfolgt, und
(c) die Kristalle isoliert und getrocknet werden;
wobei das Insulinanalogon insbesondere Lys B3, Glu B29-Humaninsulin ist.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung eines Kristalls wie oben beschrieben, bei dem der Präzipitant ausgewählt wird aus einer Gruppe enthaltend (a) Ammoniumdihydrogenphosphat,
(b) eine Kombination aus Ammoniumdihydrogenphosphat und Tri-Natriumcitrat; und (c) eine Kombination aus Ammoniumsulfat und Polyethylenglycol diverser Molekulargewichte;
wobei bevorzugt als Präzipitant Ammoniumdihydrogenphosphat oder Di- Ammoniumhydrogenphosphat bei pH Werten zwischen 3,0 und 8,0, oder Ammoniumdihydrogenphosphat/Di-Ammoniumhydrogenphosphat in Kombination mit Tri-Natriumcitrat bei einem pH-Wert von 5,5 ± 1 ,5 oder Ammoniumsulfat in Kombination mit PEG diverser Molekulargewichte bei einem pH-Wert von 6,0 ± 1 ,5 Anwendung findet.
Auch Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung eines Kristalls wie oben beschrieben zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Diabetes der Typen I und / oder II.
Die Erfindung wird anhand der Beispiele näher erläutert, ohne sich darauf zu beschränken.
Beispiel 1 : Herstellung der neuen zinkfreien Hexamer-Kristallform:
Amorphes, zinkfreies Pulver von Lys B3, Glu B29-Humaninsulin wird ungepuffert in aqua dest./ΗCI bei pH um 2.0 gelöst. Dieses Vorgehen erlaubt, dass sich bei Insulinkonzentrationen um 20 mg/ml eine klare Lösung ausbildet. Die Kristallisation findet nach der Hanging-drop Methode in 24-well Linbro-Platten statt. Als Präzipitant wird das nachfolgende Reagens des „Protein Crystallization Screening Kit" der Firma Hampton Research Inc. verwendet: 1. 0,4 M Ammoniumdihydrogenphosphat, pH 4,2.
Beispiel 2: Herstellung der neuen zinkfreien Hexamer-Kristallform:
Amorphes, zinkfreies Pulver von Lys B3, Glu B29-Humaninsulin wird ungepuffert in aqua dest./HCI bei pH um 2.0 gelöst. Dieses Vorgehen erlaubt, dass sich bei Insulinkonzentrationen um 20 mg/ml eine klare Lösung ausbildet. Die Kristallisation findet nach der Hanging-drop Methode in 24-well Linbro-Platten statt. Als Präzipitant wird das nachfolgende Reagens des „Protein Crystallization Screening Kit" der Firma Hampton Research Inc. verwendet: 1 M Ammoniumdihydrogenphosphat, 0,1 M Tri- Natriumcitrat, pH 5,6.
Beispiel 3: Herstellung der neuen zinkfreien Hexamer-Kristallform:
Amorphes, zinkfreies Pulver von Lys B3, Glu B29-Humaninsulin wird ungepuffert in aqua dest./HCI bei pH um 2.0 gelöst. Dieses Vorgehen erlaubt, dass sich bei Insulinkonzentrationen um 20 mg/ml eine klare Lösung ausbildet. Die Kristallisation findet nach der Hanging-drop Methode in 24-well Linbro-Platten statt. Als Präzipitant wird das nachfolgende Reagens des „Protein Crystallization Screening Kit" der Firma Hampton Research Inc. verwendet: 0,2 M Ammoniumsulfat, 20% PEG 3350, pH 6,0.
Beispiel 4: Röntgenstrukturanalyse
Die gemäß der Beispiele 1 - 3 erhaltenen Kristalle sind wohl geordnet und ermöglichen eine Röntgenstrukturanalyse, welche für ein Insulin mit Glutamat-B21- Seitenkette ein bisher unbekanntes strukturelles Arrangement der Region um die Histidin-B10-Seitenkette aufzeigt.
Zinkhaltige Humaninsulin-Kristalle des 2Zn-Typus weisen als Raumgruppe R3 (146) und Zellachsen von A=82.5, C=34.0 A auf. Zinkfreie Kristalle der Verbindung I sind isomorph und weisen typischerweise Zellachsen von A=81.5, C=33.3 A auf. Die Insulinmoleküle in der zinkhaltigen Kristallstruktur von Humaninsulin und der zinkfreien Kristallstruktur von Lys B3, Glu B29-Humaninsulin im sogenannten T6- bzw. 2Zn- Typus gefaltet. Im 2Zn-lnsulin (T6) liegen alle 6 Monomere im sogenannten T = tensed Zustand vor. Der N-Terminus der B-Ketten ist ausgesteckt ohne signifikantes Sekundärstrukturmerkmal, es liegt keine D-Helix-Sekundärstuktur wie im alternativen R-Zustand vor. Signifikante Unterschiede in den Kristallstrukturen von Humanainsulin und der Verbindung I ergeben sich im Arrangement der Region um die Histidin-B10- Seitenkette. Für alle Herstellungsmethoden gemäß der Beispiele 1 - 3 liegen hochauflösende Einkristall Röntgenstukturanalysen vor, die den zinkfreien Zustand dieser Insulinhexamer-Kristalle beweisen. Als Elementarzellachsen und Kristallsymmetrie wurde bestimmt:
Herstellungsverfahren 1 : A=81.52, C=33.31 A, R3 (Raumgruppe Nr. 146) Herstellungsverfahren 2: A=81.51 , C=33.43 A, R3 (Raumgruppe Nr. 146) Herstellungsverfahren 3: A=81.38, C=33.22 A, R3 (Raumgruppe Nr. 146).

Claims

Patentansprüche
1. Kristalle eines Insulinanalogons, in welchem Asparagin (Asn) in Position B3 der B-Kette durch einen natürlich auftretenden basischen Aminosäurerest ausgetauscht ist und wenigstens ein Aminosäurerest, in den Positionen B27, B28 oder B29 der B- Kette durch einen anderen natürlich auftretenden neutralen oder sauern Aminosäurerest ausgetauscht ist, wobei fakultativ Phenylalanin (Phe) in Position B1 der B-Kette fehlen kann, wobei die Kristalle in der Raumgruppe R3 (Nr. 146) mit den Zellachsen A=81 ,5 A ± 1 A und C= 33,3 Ä ± 1 A vorliegen.
2. Kristalle gemäß Anspruch 1 , wobei die Moleküle des Insulinanalogons in Form von zinkfreien Hexameren, bestehend aus jeweils drei Dimeren, vorliegen.
3. Kristalle gemäß Anspruch 2, wobei die Histidin B10-Reste jeweils dreier Moleküle des Insulinanalogons in einem Hexamer über Wasserstoffbrückenbindungen mit einem Wassermolekül verbunden sind.
4. Kristalle gemäß Anspruch 2, wobei die Histidin B10-Reste jeweils dreier Moleküle des Insulinanalogons in einem Hexamer über Wasserstoffbrückenbindungen mit einem Dihydrogenphosphat-Ion (H2PO ") verbunden sind.
5. Kristalle gemäß Anspruch 2, wobei die Histidin B10-Reste jeweils dreier Moleküle des Insulinanalogons in einem Hexamer über Wasserstoffbrückenbindungen mit einem Monohydrogenphosphat-Ion (HPO4 2") verbunden sind.
6. Kristalle gemäß Anspruch 2, wobei die Histidin B10-Reste jeweils dreier Moleküle des Insulinanalogons in einem Hexamer über Wasserstoffbrückenbindungen mit einem Sulfat-Ion (SO4 2") verbunden sind.
7. Kristalle gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 6, wobei die Histidin B10-Reste der Moleküle des Insulinanalogons in einem Hexamer jeweils auf das eigene Dimer zurückgefaltet sind und keine Wasserstoffbrückenbildung der Histidin B10-Reste zu einem Wassermolekül vorhanden ist.
8. Kristalle gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei das Insulinanalogon eine Verbindung der Formel I ist,
(A1 -A5)-Cys-Cys-A8-A9-A10-Cys-(A12-A19)-Cys-Asn
S — S
B1-Val-B3-Glu-His-Leu-Cys-(B8-B18)-Cys-(B20-B26)-B27-B28-B29-B30
worin bedeuten
(A1-A5) die Aminosäurereste in den Positionen A1 bis A5 der A-Kette von Humaninsulin oder tierischem Insulin,
(A8-A10) die Aminosäurereste in den Positionen A8, A9 und A10 der A-Kette von Humaninsulin oder tierischem Insulin,
(A12-A19) die Aminosäurereste in den Positionen A12 bis A19 der A-Kette von Humaninsulin oder tierischem Insulin,
(B8-B18) die Aminosäurereste in den Positionen B8 bis B18 der B-Kette von Humaninsulin oder tierischem Insulin,
(B20-B26) die Aminosäurereste in den Positionen B20 bis B26 der B-Kette von Humaninsulin oder tierischem Insulin, (B30) der Aminosäurerest in Position B30 der B-Kette von Humaninsulin tierischem Insulin,
B1 ein Phenylalaninrest (Phe) oder ein Wasserstoffatom,
B3 ein natürlich auftretender basischer Aminosäurerest,
B27, B28 und B29 die Aminosäurereste in den Positionen B27, B28 und B29 der B-Kette von Humaninsulin oder tierischem Insulin oder jeweils ein anderer natürlich auftretender Aminosäurerest, wobei wenigstens einer der Aminosäurereste in den Positionen B27, B28 und B29 der B-Kette durch einen anderen natürlich auftretenden Aminosäurerest ausgetauscht ist, welcher ausgewählt ist aus der Gruppe der neutralen oder sauren Aminosäuren.
9. Kristalle nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass der Aminosäurerest in Position B3 der B-Kette des Insulinanalogons eine Histidin-(His), Lysin-(Lys) oder Argininrest (Arg) ist.
10. Kristalle nach einem oder mehreren der Ansprüche 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, dass wenigstens einer der Aminosäurereste in den Positionen B27, B28 und B29 der B-Kette ein natürlich auftretender Aminosäurerest ist, welcher ausgewählt ist aus der Gruppe Isoleucin (lle), Asparaginsäure (Asp) und Glutaminsäure (Glu).
11. Kristalle nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass die B-Kette die Sequenz
Phe Val Lys Gin His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Glu Thr aufweist (SEQ ID NO 3).
12. Pharmazeutische Zubereitung, dadurch gekennzeichnet, dass sie mindestens einen Kristall nach einem der Ansprüche 1 bis 11 enthält.
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13. Pharmazeutische Zubereitung nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass sie ferner einen Hilfsstoff enthält, der die Aufnahme des Insulinanalogons ins Blut erleichtert.
10 14. Pharmazeutische Zubereitung nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass sie mindestens einen Kristall nach einem der Ansprüche 1 bis 11 und einen Hilfsstoff enthält, der bei inhalativen und / oder oralen Formulierungen von Insulin oder Insulinanaloga Anwendung findet.
15 15. Verwendung eines Kristalls gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 11 zur Herstellung einer pharmazeutischen Zubereitung, welche eine Insulinaktivität mit schnellem Wirkungseintritt aufweist.
16. Verfahren zur Herstellung eines Kristalls gemäß einem der Ansprüche 1 bis 11 , 20 bei dem
(d) ein zinkfreies, amorphes Pulver eines Insulinanalogons gemäß der Ansprüche 1 bis 11 in einer Konzentration von 15-25 mg/ml in Wasser gelöst wird,
(e) eine Präzipitation mit einem geeigneten Präzipitanten erfolgt, und 25 (f) die Kristalle isoliert und getrocknet werden.
17. Verfahren gemäß Anspruch 16, wobei das Insulinanalogon Lys B3, Glu B29- Humaninsulin ist.
30 18. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 16 oder 17, bei dem der Präzipitant ausgewählt wird aus einer Gruppe enthaltend (d) Ammoniumdihydrogenphosphat, (e) eine Kombination aus Ammoniumdihydrogenphosphat und Tri-Natriumcitrat; und
(f) eine Kombination aus Ammoniumsulfat und Polyethylenglycol diverser Molekulargewichte.
19. Verfahren zur Herstellung der Kristalle gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 , 2, 4, 5 und 7 bis 11 nach einem Verfahren gemäß Anspruch 18, wobei als Präzipitant Ammoniumdihydrogenphosphat oder Di-Ammoniumhydrogenphosphat bei pH Werten zwischen 3,0 und 8,0 Anwendung findet.
20. Verfahren zur Herstellung der Kristalle gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 11 nach einem Verfahren gemäß Anspruch 18, wobei als Präzipitant entweder Ammoniumdihydrogenphosphat/Di-Ammoniumhydrogenphosphat in Kombination mit Tri-Natriumcitrat bei einem pH-Wert von 5,5 ± 1 ,5 oder Ammoniumsulfat in Kombination mit PEG diverser Molekulargewichte bei einem pH- Wert von 6,0 ± 1 ,5 Anwendung findet.
21. Verwendung eines Kristalls nach einem der Ansprüche 1 - 11 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Diabetes der Typen I und / oder II.
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