WO2004033682A1 - 超耐熱性エンドグルカナーゼの製造法 - Google Patents

超耐熱性エンドグルカナーゼの製造法 Download PDF

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WO2004033682A1
WO2004033682A1 PCT/JP2003/012998 JP0312998W WO2004033682A1 WO 2004033682 A1 WO2004033682 A1 WO 2004033682A1 JP 0312998 W JP0312998 W JP 0312998W WO 2004033682 A1 WO2004033682 A1 WO 2004033682A1
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ala
seq
endoglucanase
amino acid
glu
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Shigezo Udaka
Kazuhiko Ishikawa
Yasuhiro Kashima
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National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405—Glucanases
    • C12N9/2434—Glucanases acting on beta-1,4-glucosidic bonds
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
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    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01004—Cellulase (3.2.1.4), i.e. endo-1,4-beta-glucanase

Definitions

  • the present invention utilizes a signal peptide derived from Bacillus brevis and improved by using a gene recombination method to partially modify a hyperthermostable protein.
  • the present invention relates to a method for producing and producing nddarcanase by Bacillus bacterium. . - book
  • Endalcanase is widely used as a cellulase in fiber processing, feed production, food processing, and production of fuels and plastic raw materials from biomass.
  • the cellulase (a type of endalcanase) secreted and produced is a type in which D-glucose is linear with] 3-1,4 bonds.
  • Cellulase is a general term for a group of enzymes that degrade oligosaccharides to cellobiose and further to glucose.
  • alkaline cellulase produced by one type of Bacillus bacterium that grows well in an alkaline environment is stable at pH 5 to 11, and is also stable to detergents and alkaline proteases.
  • cellulase decomposes microfibers on the surface of cotton garment to remove adhering dirt, and has come to be widely used as a detergent enzyme with strong detergency.
  • it is widely used due to the various properties of cellulase. .
  • Bacillus brevis a kind of Bacillus bacterium, as a host has been developed over many years of research, and Bacillus brevis 47 (Patent No. 2082727; No. 201583), a secretory vector that utilizes the promoter of the MW protein (MWP) gene, which is one of the major extracellular proteins, and a signal peptide region encoded by the gene, to produce a secretory protein production system.
  • MFP MW protein
  • Bacillus brevis HPD31 which has a particularly small amount of extracellular protease among Bacillus brevis, has been isolated, and a protein production system using the Bacillus brevis HPD31 as a host has been developed (Japanese Patent No. 1785518; No. 56277).
  • thermostable ⁇ -amylase Agric. Biol. Chem., 53, 2279-2289 (1989)
  • High production of human epidermal growth factor (EGF) Proc. Natl. Acad. Sci. USA , 86, 3589-3593 (1989), Japanese Patent Application Laid-Open No. 2-31682, Patent No. 2787585), Human Interleukin-2 (Biosci. B iotechnol. Biochem., 61, 1858-1861 (1997) ⁇ Hytointerleukin-6 (Biosci. Biotechnol. Biochem., 64, 665-669 (2000)). It has an extremely high production volume (1.5 g / L) and is already industrially produced as a sheep hair dye (J. Ind. Microbiol. Biotechnol., 21, 208-214 (1998)). Disclosure of the invention
  • endoglucanases found so far have an optimum temperature of around 35 ° C to 60 ° C, and mold-derived enzymes with low heat resistance are used to treat crystalline cellulose and fibers. At present, it is necessary to carry out the reaction at a higher temperature in order to increase the processing efficiency. Therefore, a hyperthermostable endoglucanase that does not lose its stable and strong catalytic activity even at a high temperature close to 100 ° C has been desired. Recently, endoglucanases that are resistant to such high temperatures have been found in the hyperthermophilic bacterium Pyrococcus, but after the gene encoding the enzyme has been incorporated into the expression vector, it is transferred to the host Escherichia coli.
  • An object of the present invention is to provide a method for efficiently producing a large amount of hyperthermostable endoglucanase using microorganisms, particularly bacteria.
  • Bacillus brevis is a host bacterium capable of highly expressing foreign genes derived from both prokaryotic and eukaryotic cells, and that the efficiency of secretory production depends on the target protein to be secreted and produced, especially the amino acid of the protein. Focusing on the fact that it depends on the amino acid sequence and structure at the terminal end, we conducted various studies and conducted studies.As a result, we efficiently separated heterologous proteins, particularly endoglucanases, that are industrially important by Bacillus and Brevis. They have invented a method for lactation.
  • the method of the present invention comprises the steps of: using a host vector system using Bacillus brevis, a sequence encoding an improved signal peptide region derived from Bacillus brevis:
  • n and m indicate that 0 to 2 Arg and 3 to 5 Leu are consecutively arranged.
  • XI is Pro or Ala, and X2 is Met or Asn.
  • the present invention is based on Bacillus brevis. Downstream of the DNA sequence encoding the native signal peptide region, an endoglucanase derived from hyperthermophilic archae with 1 to 20 amino acids added to the amino terminal (N-terminal).
  • the signal peptide of the cell surface protein gene derived from Bacillus brevis has the following amino acid sequence SEQ ID NO: 1; Met Lys Lys (Arg) n Val Val Asn Ser Val Leu (Leu) m
  • n and m indicate that 0 to 2 Arg and 3 to 5 Leu are arranged consecutively.
  • XI is Pro or Ala, and X2 is Met or Asn.
  • the endoglucanase is preferably an endoglucanase derived from an archaebacterium belonging to the genus Pyrococcus, and specific examples include an endoglucanase having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4.
  • the endorcanase may further be obtained by deleting 1 to 50 amino acids at the N-terminus in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, or by removing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 or the amino acid sequence thereof.
  • the number of amino acids added to the N_ terminus of the endorcanase is preferably 1 to 15, and specific examples of amino acids or amino acid sequences include Ala, Val, Thr, Asp, Asp-Pro, Ala-Glu-Asp-Pro (SEQ ID NO: 28), Ala-Glu_Glu-Ala-Ala-Asp-Pro (SEQ ID NO: 29), Ala-Ala-Ala-Glu-Glu-Asp- Pro (system number: 30), Ala-Glu-Ala-Ala-Ala-Asp-Pro (sequence number: 31), Asn-Ser-Asp-Ser-Glu-Asp-Pro (sequence number: 32) ), Ala-Glu-Glu-Ala-Ala-Thr-Thr-Thr-Asp-Pro (SEQ ID NO: 33) or Ala-Gul-Glu-Ala-Ala-Thr-Thr-Thr-Thr-Ala-Pro-Lys- Asp-Pro (SEQ ID NO
  • FIG. 1 is a diagram showing the process of constructing the expression plasmid PNUR2L6-X-EG of the present invention.
  • the object to be produced in the method of the present invention is endoglucanase derived from archaebacteria.
  • archaea that produce the same include microorganisms of the genus Pyrococcus.
  • a specific example is the power of Pyrococuus horikoshii.
  • Specific examples of archaeal endodalcanase include those having the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 4.
  • An example of the nucleotide sequence of the nucleic acid encoding this amino acid sequence is the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 3.
  • the original amino acid sequence is not essential for its activity, and the amino acid sequence of a region that is not essential for the activity of the whole enzyme is replaced with one or more amino acids.
  • Addition of acid eg, terminal addition
  • deletion or deletion substitution with another amino acid
  • proteins having an amino acid sequence modified by amino acid insertion (into the sequence), etc. maintain their original activities.
  • the endalcanase of the present invention has not only the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 but also the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 which contains 1 to 50 amino acids at the N-terminal. Substitution of one to several amino acids by deletion or in the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 4 or in the amino acid sequence in which 1 to 50 amino acids at the C-terminal have been deleted, A variant of endoglucanase having an amino acid sequence modified by deletion, insertion and / or addition and maintaining the activity of endoglucanase thermostable enzyme is also within the scope of the endoglucanase of the present invention. Belongs to.
  • the number of amino acids involved in the modification of the amino acid sequence is desirably 1 to several, that is, 10 or less, preferably 7 or less, for example, 5 or less, for example, 3 or less. is there.
  • One or more, preferably 120, amino acids are added to the N-terminus of the endoglucanase in order to enhance the productivity of endoglucanase.
  • the number of amino acids to be added is, for example, 1 to 15 and is not particularly limited.
  • the type of amino acid to be added is not particularly limited. For example, as shown in Table 1, various amino acids can be used. Specific examples of various amino acids or amino acid sequences include the following.
  • amino acids and peptides mentioned above include acidic amino acids (Glu, Asp) and small neutral amino acids (Ala, Thr, etc.), which are considered to be advantageous in the process of crossing biological membranes due to secretion of endoglucanase.
  • Use ⁇ On the other hand, avoid basic amino acids (Arg, Lys) and highly hydrophobic amino acids (Leu, He, Phe, etc.) which are disadvantageous.
  • Gene constructs used to secrete and produce heterologous proteins using Bacillus brevis extracellularly include the promoter, SD sequence, appropriate signal peptide, DNA encoding the protein of interest, and Bacillus brevis bacteria. It has an appropriate sequence containing an appropriate control sequence (promoter, terminator, etc.) necessary for expressing the target protein gene at an appropriate position.
  • the vector that can be used for this construct is not limited to a particular type, as long as it can function in Bacillus brevis, and even if it autonomously propagates outside the chromosome, such as plasmid, It may be built into the system.
  • Plasmid derived from Bacillus brevis is particularly preferred. These include, for example, PHT926 (Japanese Patent Application Laid-Open No. 4-216605) and plasmids having improved drug resistance genes.
  • PUBllO J. Bacteriol., 134, 318-329 (1978) used in Bacillus subtilis (Bacillus subtilis) can also be used. Phages, transposons, and the like can also be used.
  • the promoter, SD, and the signal peptide before the improvement that can be used in the present invention are not particularly limited, and may be any as long as they function in the host, but include Bacillus brevis 47 or HPD31-derived motor, SD, and signal peptide. (J. Bac te riol., 170, 935-945 (1988), J, Bacteriol., 172, 1312-1320 (1990)) is effective.
  • the signal peptide used in the present invention is derived from Bacillus brevis (in the new classification, belongs to the genus Brevibacillus), and is preferably a modified and improved one. .
  • the original amino acid sequence of this signal peptide is shown in SEQ ID NO: 1, and an example of the amino acid sequence of the improved signal peptide is as follows:
  • n and m indicate that 0 to 2 Arg and 3 to 5 Leu are consecutively arranged.
  • XI is Pro or Ala, and X2 is Met or Asn.
  • Improved signal peptides are particularly necessary for expressing and secreting eukaryotic genes, including humans and animals, and their production efficiency is more than 10 times higher than when no improved signal peptides are used.
  • Appi. Microbial. Biotechnol., 42, 358-363 (1994); Japanese Patent Application Laid-Open No. 4-103891 In the first place, it is very difficult to introduce an expression vector into Bacillus brevis without improving the signal peptide.
  • a method for constructing a plasmid a conventional method is appropriately used, and examples thereof include a method described in Molecular cloning, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1982).
  • the host bacterium to be transformed with the vector incorporating the gene encoding the foreign gene product may be any microorganism capable of expressing a vector and a promoter.
  • Bacillus brevis bacteria are used. Used. Bacillus brevis is an aerobic Gram-positive bacterium, such as Bacillus brevis 47 (JP-A-60-58074 and JP-A-62-201583) and Bacillus brevis H102 (same species as HPD31). (JP-A-63-56277). Also, these mutants are included.
  • the method of transforming the microorganism may be a known method, for example, the method of Takaha shi et al. (J. Bacteriol., 156, 1130 (1983)) and the method of Takagi et al. '(Agric. Biol. Chem., 53, 3099-3100 (1989)).
  • the medium used for culturing the obtained transformant may be any medium as long as the transformant can grow and produce the desired foreign gene product.
  • the carbon source contained in the medium include glucose, glycerol, starch, molasses, and organic acids.
  • Nitrogen sources include organic nitrogen sources such as casein, peptone, soy peptone, yeast extract, meat extract, casamino acids and urea, and inorganic nitrogen sources such as ammonium sulfate and ammonium chloride. No. Moreover, you may culture
  • antibiotics such as ampicillin, erythromycin, neomycin, and chloramphenicol are added to the medium if necessary. Further, if necessary Tw een surfactant such as 40, glycine, defoaming agents, etc. are added.
  • the pH of the medium is 5 to 9.5, more preferably 6 to 8. Under aerobic conditions, the culture temperature is usually between 20 ° C and 40 ° C, and the culture time is between 48 and 200 hours.
  • the protein secreted extracellularly by the present invention can be separated and purified from the cultured medium according to a method well known to those skilled in the art. For example, after removing cells by centrifugation, salting out, ethanol precipitation, ultrafiltration, gel filtration, ion-exchange column chromatography, affinity chromatography, high-performance liquid chromatography, isoelectric point Separation and purification can be performed by a known appropriate method such as electrophoresis, or a combination thereof.
  • the expression and secretion vectors used in the examples are as follows. Based on pUBllO (Plasmid 15, 93-103 (1986)), which is frequently used in Bacillus subtilis, and its replication origin, the erythromy of pHWl (J. Bacteriol., 150, 804-814 (1982)) To a plasmid with a syn-resistance gene Promoter of the cell surface protein gene (mwp) of Bacillus brevis 47 (J. Bacteriol., 170, 176-186 (1988)) and a signal peptide-encoding region The inserted PNU210 (Methods Enzymol., 217, 23-33 (1993)) was created.
  • Plasmid pNU212 be changed one nucleotide of the translation initiation codon near the mwp of pNU210 to construct a BspHI site (creating a PNU211), among the Ncol site of the two positions in the P NU211, rhino signal peptide region was modified to only pNU212 (Appl. Microbiol. Biotechnol., 2, 358-363 (1994)).
  • Plasmid pNH326 was prepared by changing the mwp signonole stomach ij of pNH300 to the R2L6 signonole stomach (Appl. Microbiol. Biotechnol., 42, 358-363 (1994)) (Appl. Environ. Microbiol). , 66, 304-3 09 (2000)). Plasmid Rand 300 was constructed by inserting the pNU210 DNA fragment having the promoter regions of ⁇ 4 and ⁇ 5, the mwp signal sequence, and the multiple cloning site into pUBllO (Plasmid, 15, 93-103 (1986)). Vectors pNH300 and pNH326 have only the neomycin resistance gene and are used for selection of transformants using these plasmids.
  • Example 1 Preparation of an expression vector having a base sequence encoding an endalcanase having one or more amino acids added to the amino terminus m
  • Plasmid pET-EGPh (Appl.Environ.Microbiol., 68, 4 30-433) having 0RF (PH1171) (SEQ ID NO: 4) encoding an endoglucanase gene derived from Pyrococcus horikoshii
  • PCR was carried out to prepare a DNA fragment encoding endoglucanase.
  • the obtained fragment is digested with Ncol-Xbal, and the plasmid pNUR2L6 is ligated with a fragment of about 4.3 kb obtained by digestion with Ncol-Xbal.
  • an endoglucanase expression plasmid (PNUR2L6-EG) was prepared in which nothing was added to the N-terminus of secreted endorcanase.
  • the nucleotide sequence of the endoglucanase gene in this plasmid and its vicinity was confirmed to be correct using an ABI prism 310 DNA sequencer, with a base sequence of approximately 1.5 kb from the promoter region to the downstream region of the endalcanase gene. did.
  • PCR was performed using a forward primer (SEQ ID NO: 7) and a reverse primer (SEQ ID NO: 6) to prepare a DNA fragment encoding endoglucanase. did.
  • the resulting fragment was digested with Pstl-Xbal, and the plasmid pNUR2L6 was digested with Pstl-Xbal and ligated to a fragment of about 4.4 kb, whereby Ala was added to the N-terminus of secreted endglucanase.
  • Endoglucanase expression plasmid (PNUR2L6-A-EG) was prepared to be added. The correctness of this nucleotide sequence was confirmed in the same manner as in (1) above.
  • PCR was performed using primers of the synthetic oligonucleotides of SEQ ID NO: 8 (forward) and SEQ ID NO: 6 to prepare a DNA fragment encoding endoglucanase. . Thereafter, a plasmid expressing an endoglucanase in which Val was added to the amino terminal of the endorcanase was prepared in the same manner as in the above (1).
  • PCR was carried out using the synthetic oligonucleotides of SEQ ID NO: 9 (forward) and SEQ ID NO: 6 as primers to prepare a DNA fragment encoding endalcanase. Thereafter, a plasmid expressing endoglucanase in which AsP was added to the amino terminal of endoglucanase was prepared in the same manner as in (1) above.
  • PCR was performed using primers of the synthetic oligonucleotides of SEQ ID NO: 10 (forward) and SEQ ID NO: 6 to prepare a DNA fragment encoding endalcanase. Thereafter, a plasmid expressing endoglucanase in which Thr was added to the amino terminal of endoglucanase was prepared in the same manner as in (1) above.
  • PCR was performed using primers of the synthetic oligonucleotides of SEQ ID NO: 11 (forward) and SEQ ID NO: 6 to prepare a DNA fragment encoding endalcanase. Thereafter, a plasmid expressing endoglucanase having Asp-Pr0 added to the amino terminus of endalcanase was prepared in the same manner as in (1) above.
  • PCR was carried out using the above-mentioned type ⁇ ⁇ with the oligonucleotides of SEQ ID NO: 12 and SEQ ID NO: 6 as primers to prepare a DNA fragment encoding endoglucanase.
  • the obtained fragment was digested with BamHI-Xbal, and the plasmid pNUR2L6 was ligated to a fragment of about 4.3 kbp obtained by digestion with BamHI-Xbal to obtain a plasmid pNUR2L6cEG.
  • Oligonucleotides IP1 (SEQ ID NO: 13) and IP2 (SEQ ID NO: 14) complementary to each other are added to a DNA fragment of about 5.6 kbp obtained by digesting the obtained plasmid pNUR2L6cEG with Ncol-BamHI.
  • the double-stranded DNA fragment prepared by annealing the DNA fragment is ligated, and the end sequence of Ala-Glu Asp-Pro (SEQ ID NO: 28) is added to the N-terminus of secreted endoglucanase.
  • a canase expression plasmid (pNUR 2L6-AEDP-EG) was prepared. The nucleotide sequence was also confirmed.
  • the complementary oligonucleotides IP9 (SEQ ID NO: 19) and IP10 (SEQ ID NO: 20) were added to an approximately 5.6 kb DNA fragment obtained by digesting plasmid pNUR2L6cEG with Ncol-BamHI. Annealed double-stranded DNA fragments are joined together, and the sequence of Ala-Glu-Ala-AlaAla-Asp-Pro (SEQ ID NO: 31) is added to the N-terminus of secreted endoglucanase. Andalucanase expression plasmid was prepared. The nucleotide sequence was also confirmed. SEQ ID NO: 19; 5 CATGGCTTTC GCAGCAGAAG CAGCAGCA-3 '
  • PCR was carried out using the oligonucleotides of SEQ ID NO: 12 and SEQ ID NO: 27 as primers to prepare a DNA fragment encoding endalcanase. .
  • the obtained fragment was digested with BamHI-Xbal, and the plasmid pNUR2L6 was digested with BamHI-Xbal and ligated with a fragment of about 4.3 kbp obtained to obtain a plasmid pNUR2L6cEGt.
  • EGt is a polypeptide (from the first amino acid residue to the 430th amino acid residue, excluding the signal peptide) encoded by the endoglucanase gene shown in SEQ ID NO: 3, and EG is more carboxy-terminal than EGt. And 42 polypeptides with fewer amino acid residues.
  • the obtained plasmid pNUR2L6cEGt is digested with Ncol-BamHI to a DNA fragment of about 5.6 kb, and the complementary oligonucleotides IP15 (SEQ ID NO: 25) and IP16 (SEQ ID NO: 26) are annealed to each other.
  • Endalcanase expression plasmid was prepared such that the sequence of Ala_Glu-Glu-Ala_Ala-Thr-Thr-Thr-Ala-Pro_Lys_Asp-Pro (SEQ ID NO: 34) was added to the end.
  • the nucleotide sequence of about 1.5 kbp from the promoter region to the downstream region of the endalcanase gene was confirmed to be correct for the endoglucanase gene in this plasmid and the base sequence in the vicinity using the ABI prism 310 DNA sequencer. did.
  • PCR was performed using the synthetic oligonucleotides of SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6 as primers to prepare a DNA fragment encoding endoglucanase. .
  • the obtained fragment is digested with Ncol-Xbal, and the plasmid pNU212 is digested with Ncol-Xbal and ligated to a fragment of about 4.3 kb obtained by digestion with Ncol-Xbal.
  • No endoglucanase expression plasmid (PNU212-EG) was prepared.
  • the present expression plasmid has a signal peptide of the original sequence instead of the improved sequence. The nucleotide sequence was also confirmed.
  • PCR was performed using the synthetic oligonucleotides of SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 6 as primers to prepare a DNA fragment encoding endoglucanase.
  • the obtained fragment is digested with Pstl-Xbal, and the plasmid PNU212 is digested with Pstl-Xbal.
  • An expression plasmid (PNU212-A-EG) was prepared so that Ala was added to the N-terminus of secreted endalcanase by ligation with the obtained fragment of about 4.3 kb. The nucleotide sequence was also confirmed.
  • PCR was performed using the pET-EGPh of the above (1) as type I and the synthetic oligonucleotides of SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 27 as primers to prepare a DNA fragment encoding endoglucanase.
  • the subsequent plasmid preparation process was exactly the same as in (15) above, but the resulting expression plasmid was pNU212-A-EGt. The nucleotide sequence was also confirmed.
  • PCR was carried out using EG3 (SEQ ID NO: 7) and EG2 (SEQ ID NO: 6) as primers to prepare a DNA fragment encoding Endokalkanase.
  • the obtained fragment is digested with Pstl-Xbal, and the plasmid pNH326 is digested with Pstl-Xbal and ligated with a fragment of about 3.9 kbp to obtain the secreted endoglucanase N.
  • Endglucanase expression plasmid was prepared so that Ala was added to the end.
  • the nucleotide sequence of about 1.5 kbp from the promoter region to the downstream region of the endoglucanase gene was confirmed to be correct. confirmed.
  • PCR was performed using EG3 (SEQ ID NO: 7) and EG8 (SEQ ID NO: 27) as primers to prepare a DNA fragment encoding Endokalkanase. did.
  • the obtained fragment is digested with Pstl-Xbal, and the plasmid pNH326 is digested with Pstl-Xbal and ligated to a fragment of about 3.9 kbp, thereby obtaining secreted endoglucanase.
  • An expression plasmid was prepared.
  • nucleotide sequence of about 1.5 kbp from the promoter region to the downstream region of the endoglucanase gene using the AB Iprims310 DNA sequencer is correct for the base sequence of the endalcanase gene in this plasmid and its vicinity. It was confirmed.
  • Example 2 Secretory production of endoglucanase by Bacillus brevis having an expression vector
  • Bacillus' brevis strain HPD31 or 31-0K was transformed with the various expression vectors and plasmids constructed in (1) to (18) of Example 1, and the resulting transformants were aerobically transformed. In this way, end dalcanase was secreted and produced in the culture solution.
  • each bacterium was produced using a production medium (3% polypeptone-S, 0.8% yeast extract, 3% glucose, and other metal salts as required, Tween-40, erythromycin, etc.). , Neomycin etc.) and shaking culture at 30 ° G for several days. Table 1 shows the results of measuring the endoglucanase activity in the supernatants of those culture solutions.
  • the amount of endoglucanase secreted was measured by measuring the activity using carboxymethyl cellulose (CMC) as a substrate.
  • CMC carboxymethyl cellulose
  • 0.2 ml of a 1% CMC aqueous solution and 0.2 ml of a 0.2 M acetate buffer (pH 5.6) were mixed, and the mixture was dialyzed against 50 mM tris-hydrochloric acid buffer (pH 8.0) overnight.
  • the culture supernatant was added and reacted at 85 ° C.
  • 0.2 ml of the reaction solution and 0.4 ml of Somogi copper solution were mixed, heated in a boiling bath for 20 minutes, and then mixed with 0.4 ml of Nellson reagent.
  • the absorbance at 500 nm of this solution was measured, and the amount of reducing terminal (Main) was measured from a calibration curve separately prepared using glucose.
  • blank 1 using 50 mM Tris-HCl buffer (pH 5.6) instead of the culture solution, and blank 2 using water instead of CMC were treated in the same manner to determine the amount of reducing terminal. It was measured. Main value and blank 1 and By calculating the difference between the blanks and blank 2, the amount of reducing ends increased by the reaction was determined.
  • One unit of activity (U) was defined as the amount of enzyme that produced a reducing power equivalent to 1 mg of dulose per minute from CMC.
  • the specific activity of the purified enzyme was 8.5 ⁇ U / mg protein.
  • PNH326 Improved sequence A EG 0.53 1.05
  • the culture solution containing endglucanase obtained by the expression vectors of (2) and (13) in Example 1 was centrifuged to remove the cells, and then subjected to ammonium sulfate precipitation, anion exchange chromatography, and hydrophobicity. Purification was performed by electrophoresis using sexual interaction chromatography or gel filtration chromatography. The protein's molecular weight, enzyme activity, heat resistance, optimal pH, substrate specificity, etc. were consistent with those produced in E. coli. The amino acid sequence of the amino terminal was determined. In both cases (2) and (13), it was found that endoglucanases with the A- or AEEAATTTAPKDP potentiated P were produced, and their added amino acids were produced. It was shown that the acid phosphate did not significantly affect the properties of the enzyme.

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Abstract

バチルス・ブレビス（Bacillus brevis）由来のシグナルペプチド領域をコードするDNA配列の下流に、超好熱性古細菌由来でアミノ末端（Ｎ−末端）に１ないし20個のアミノ酸を付加したエンドグルカナーゼをコードする核酸配列が接続された遺伝子発現ベクターを有するバチルス（Bacillus）属細菌を培養し、エンドグルカナーゼを産生および分泌させることを特徴とする、古細菌由来超耐熱性エンドグルカナーゼの製造方法。

Description

8
超耐熱性エンドグルカナーゼの製造法
技術分野
本発明はバチルス · ブレビス由来であって改良したシグナルぺプ チドを利用して、 遺伝子組み換え法により一部改変した超耐熱性ェ 明
ンドダルカナーゼをバチルス属細菌で分泌生産させる方法に関する ものである。。 - 書
エンドダルカナーゼはセルラーゼ等と して、 繊維加工、 飼料製造 、 食品加工、 バイオマスよ りの燃料やプラスチック原料の製造等に 幅広く利用されている。
背景技術
異種タンパク質の分泌生産としてはこれまでにバチルス属細菌に よる分泌生産の総説 （Microbiol. Review, 57, 109-137 (1993)、 メタノ一ル資化性酵母 Pichia pastorisによる分泌生産の総説 〔Bio /Technology, 11， 905-910 (1993)〕 ， Aspergi 1 lus属等の力ビによ る工業生産の報告 （Bio/Technology 6， 1419-1422 (1988) ； Bio/T echnology, 9， 976-981 (1991)) 等のように多数報告されている。 しかしながら、 これらの宿主を用いる生産系によって、 古細菌由来 の超耐熱性エンドグルカナーゼを高効率で分泌生産した成功例は知 られていない。 大腸菌を用いれば、 ごく少量の酵素 （ l mg/L程度） を得ることは可能であるが、 効率的な菌体外への大量生産は全く期 待できない。
·' 本発明の 1つの実施態様において分泌生産されるセルラーゼ （ェ ンドダルカナーゼの一種） は、 D-グルコースが ]3 - 1，4結合で直鎖状 2003/012998 につながったホモ多糖であるセルロースをセロオリ ゴ糖に分解する 反応を触媒する酵素であり、 真菌類、 放線菌、 真性細菌、 古細菌を 含む多数の微生物によ り、 生成分泌される。 また、 セルラーゼはォ リ ゴ糖をセロビオースへ、 さらにグルコースにまで分解する酵素群 の総称である。
例えば、 アルカ リ性の環境下でよく生育するバチルス属細菌の一 種が生産するアルカリセルラーゼは、 pH5〜11で安定なうえ、 界面 活性剤やアル力 リプロテアーゼにも安定である故、 洗剤に配合され ると木綿衣類の表面微少繊維をセルラーゼが分解し、 付着の汚れを 除去するので強力な洗浄力を有する洗剤用酵素として広く使用され るようになった。 その他セルラーゼの多様な性質によって、 幅広く 利用されている。 .
—方、 バチルス属細菌の一種、 バチルス · ブレビスを宿主と して 異種タンパク質を効率良く分泌生産するシステムは長年にわたる研 究によって開発され、 バチルス · ブレビス 47 (特許第 2082727号、 特開昭 62-201583号公報） の主要菌体外タンパク質の一種である MW タンパク質 （MWP) 遺伝子のプロモーターおよびその遺伝子にコ ー ドされるシグナルぺプチド領域を利用した分泌べクターを作成し、 タンパク質の分泌生産系が確立されている （Methods in Enzymolog y, 217, 23-33 (1994)) 。 さらに、 バチルス ' ブレビスの中で菌体 外プロテアーゼの生産量が特に少ないバチルス · ブレビス HPD31が 分離され、 これを宿主と したタンパク質生産系が開発されている （ 特許第 1785518号、 特開昭 63-56277号公報） 。
耐熱性 α -アミ ラーゼの高効率分泌生産 （Agric. Biol. Chem.， 5 3, 2279-2289 (1989) ゃヒ ト上皮増殖因子 （EGF) の高生産 （Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 3589-3593 (1989) 、 特開平 2- 31682 号公報、 特許第 2787585号） 、 ヒ トイ ンターロイキン - 2 (Biosci. B iotechnol. Biochem. , 61， 1858—1861 (1997) ゃヒ トイ ンターロイ キン - 6 (Biosci. Biotechnol. Biochem. , 64, 665-669 (2000) な どの分泌生産に成功している。 なかでも E G Fについては極めて高 い生産量 （1.5g/L) が得られ、 既に羊の採毛薬として工業的に生産 されている （J. Ind. Microbiol. Biotechnol. , 21, 208-214 (199 8)。 発明の開示
しかしながら、 これまで見出されたほとんどのェンドグルカナー ゼは、 至適温度が 35°Cから 60°C付近であり、 結晶状のセルロースや 繊維の処理にも、 耐熱性の低いカビ由来の酵素が使用されているの が現状であるが、 処理効率を高めるにはよ り高温下で反応を行う必 要がある。 従って、 100°C近い高温でもなお、 安定かつ強力な触媒 活性を失わない超耐熱性ェンドグルカナーゼが渴望されていた。 最近、 そのよ うな高温に耐性を示すェンドグルカナーゼが超好熱 性細菌ピロコッカスから見出されているが、 その酵素をコ一ドする 遺伝子を発現べクターに組込んでから、 宿主の大腸菌に導入して少 量の生産 （ l mgZL程度） が得られているに過ぎない （Appl. Envir on. Microbiol. 68, 430-433 (2002)) 。 本発明は、 微生物.、 特に 細菌類を用いて超耐熱性ェンドグルカナーゼを効率的、 大量に製造 する方法を提供するのを目的とする。
本発明者らは、 バチルス · ブレビスが原核 · 真核いずれの細胞由 来の外来遺伝子でも高発現できる宿主菌であること、 および分泌生 産の効率は分泌生産させる目的タンパク質、 特にそのタンパク質の ァミノ末端側のアミ ノ酸配列 ·構造によつて左右されることに着目 し、 種々検討を加え研究した結果、 産業上重要な異種タンパク質、 特にェンドグルカナーゼを効率良くバチルス · ブレビスによって分 泌生産する方法を発明するに至った。
すなわち、 本発明の方法は、 バチルス · ブレビスを用いる宿主べ クタ一系によ り、 バチルス · ブレビス由来の改良シグナルペプチド 領域をコードする配列 ：
配列番号 1 ； Met Lys Lys (Arg)n Val Val Asn Ser Val Leu (Leu)m
1 5 10
Ala Ser Ala Leu Ala Leu The Val Ala XI X2 Ala Phe Ala
15 20 25
(ただし、 n， mはそれぞれ Argが 0〜 2個及び Leuが 3〜 5個連続 に配列することを示す。 また XIは Proまたは Ala, X2は Metまたは Asn である。 ）
(特開平 4- 103891； 特開平 7-170984； Appl. Microbiol. Biotech nol. , 2, 358-363 (1994) ； Biosci. Biotechnol. Biochem. , 61, 1858-1861 (1997)) の下流に、 ァミ ノ末端に 1ないし複数個、 例え ば 1〜20個、 のァミ ノ酸を付加したェンドグルカナーゼ遺伝子配列 を結合した発現ベクターを構築し、 その発現ベクターをバチルス · ブレビスに導入し、 得られた形質転換体を培養し、 生じたタンパク 質を菌体外に効率良く分泌生産させ、 菌体外に放出されたタンパク 質を回収することによって、 多量の目的異種タンパク質、 特にェン ドグルカナーゼを得る方法である。
この方法で異種タンパク質、 特にェンドグルカナーゼのアミノ末 端に少なく とも 1ないし複数個のァミ ノ酸を付加することが必須で あり、 シグナルぺプチドの改良のみでは効率的生産は達成できない 。 逆に、 分泌させる異種タンパク質のみを改変して、 改良シグナル ペプチドを用いなければ矢張り効率生産を得ることができない。 こ の両者の条件が効率的分泌に必要である。
従って、 本発明は、 バチルス · ブレビス （Bacillus brevis) 由 来のシグナルぺプチド領域をコー ドする DNA配列の下流に、 超好熱 性古細菌由来でァミ ノ末端 （N—末端） に 1ないし 20個のアミノ酸 を付加したェンドグルカナーゼをコ一ドする核酸配列が接続された 遺伝子発現ベクターを有するバチルス （Bac i l lus ) 属細菌を培養し 、 ェンドグルカナーゼを産生および分泌させることを特徴とする、 古細菌由来超耐熱性ェンドグルカナーゼの製造方法を提供する。
前記シグナルペプチドとしては、 バチルス · ブレビス由来で細胞 表層タンパク質遺伝子のシグナルぺプチドは、 下記のァミ ノ酸配列 配列番号 1 ； Met Lys Lys (Arg) n Val Val Asn Ser Val Leu (Leu)m
' 1 5 10
Ala Ser Ala Leu Ala Leu The Val Ala XI 12 Ala Phe Ala
15 20 25
(ただし、 n， mはそれぞれ Argが 0 ~ 2個及び Leuが 3〜 5個連続 に配列することを示す。 また XIは Proまたは Al a , X2は Me tまたは Asn である。 ）
を有し、 好ましく は配列番号 ： 2に示すァミ ノ酸配列を示すもの である。
前記エンドグルカナーゼとしては、 ピロコッカス （Pyro c o c cus) 属古細菌由来のェンドグルカナーゼが好ましく、 具体例として配列 番号 4に示すァミ ノ酸配列を有するェンドグルカナーゼが挙げられ る。 前記エンドダルカナーゼは更に、 配列番号 4に記載のアミ ノ酸 配列において N—末端における 1〜50個のァミノ酸の欠失によ り、 あるいは配列番号 4に記載のアミ ノ酸配列又はその C 一末端の 1〜 50個のァミ ノ酸が欠失したァミノ酸配列において 1〜数個のァミノ 酸の置換、 欠失、 揷入および/または付加によ り修飾されたァミノ 酸配列を有するものであってもよい。 前記エンドダルカナーゼの N _末端に付加されるアミ ノ酸の数は 、 好ましくは 1〜15個であり、 具体的なアミノ酸、 またはアミノ酸 配列の例としては、 Ala, Val、 Thr、 Asp, Asp-Pro, Ala-Glu-Asp-P ro (配列番号 ： 28) 、 Ala- Glu_Glu-Ala- Ala-Asp- Pro (配列番号 ： 2 9) 、 Ala-Ala-Ala-Glu-Glu-Asp-Pro (配歹 lj番号 ： 30) 、 Ala-Glu-Al a-Ala-Ala-Asp-Pro (配列番号 ： 31) 、 Asn - Ser - Asp- Ser - Glu - Asp - P ro (配列番号 ： 32)、 Ala-Glu-Glu-Ala-Ala-Thr-Thr-Thr-Asp-Pro ( 配列番号 ： 33) または Ala- Gul- Glu-Ala-Ala- Thr- Thr- Thr- Ala- Pro- Lys-Asp-Pro (配列番号 ： 34) が挙げ,られる。 図面の簡単な説明
図 1 は、 本発明の発現プラスミ ド PNUR2L6-X-EGの構築過程を示す 図である。 発明の実施の形態
本発明の方法において製造の対象にするのは、 古細菌由来のェン ドグルカナーゼであり、 その生産微生物である古細菌の例と してピ ロコッカス （Pyrococcus) 属の微生物が挙げられ、 より具体的な例 と して、 ピロコッカス * ホ リ コシ (Pyrococuus horikoshii) 力 挙 げられる。 古細菌由来のエンドダルカナーゼの具体例と しては、 配 列番号 ： 4に記載のアミ ノ酸配列を有するものが挙げられる。 また 、 このアミノ酸配列をコー ドする核酸の塩基配列の一例として配列 番号 3に示す塩基配列が挙げられる。
ェンドグルカナーゼのごとき加水分解酵素の場合、 その活性のた めには本来のアミノ酸配列が必須ではなく、 酵素全体の内、 活性に 必須でない領域のアミ ノ酸配列を、 1又は複数のアミ ノ酸の付加 （ 例えば末端への付加） 、 除去または欠失、 他のアミノ酸による置換 、 アミノ酸の挿入 （配列内部への） 、 などにより修飾されたァミノ 酸配列を有するタンパク質でも、 本来の活性を維持していることが よく知られている。
従って、 本発明のエン ドダルカナーゼは、 配列番号 ： 4に示すァ ミノ酸配列を有するもののみならず、 配列番号 4に記載のアミ ノ酸 配列において N—末端における 1〜 50個のアミ ノ酸の欠失によ り、 あるいは配列番号 4に記载のァミノ酸配列又はその C一末端の 1〜 50個のァミノ酸が欠失したァミ ノ酸配列において 1〜数個のアミノ 酸の置換、 欠失、 挿入および/または付加により修飾されたァミ ノ 酸配列を有し、 且つェンドグルカナーゼの耐熱性酵素の活性を維持 しているェンドグルカナーゼの変異体も本発明ェンドグルカナーゼ の範囲に属する。 上記のァミ ノ酸配列の修飾に係るァミ ノ酸の数は 1〜数個、 即ち 10個以下であることが望ましく、 好ましく は 7個以 下、 例えば 5個以下、 例えば 3個以下である。
上記の、 ェンドグルカナーゼの N—末端には、 エンドグルカナー ゼの生産性を増強するため、 1〜複数個、 好ましくは 1 20個のァ ミ ノ酸を付加する。 付加するアミ ノ酸の数は、 例えば 1 〜15個てい どであり、 特に限定されない。 付加するアミ ノ酸の種類は特に限定 されず、 例えば表 1に示す如く、 種々のアミ ノ酸を用いることが出 来る。 種々のアミ ノ酸又はアミ ノ酸配列の具体例と して、 例えば次 のものが挙げられる。
Ala, Val、 Thr、 Asp、 Asp-Pr o ,
Ala- Glu- Asp-Pro (配列番号 ： 28) 、
Ala- Glu- Glu- Ala- Al a- Asp- Pro (配列番号 ： 29) 、
Al a- Ala- Ala-Glu- Glu- Asp- Pro (配列番号 ： 30) 、
Al a- Glu- Ala- Ala- Al a- Asp- Pr o (配列番号 ： 31 ) 、
Asn-Ser-Asp-Ser-Glu-Asp-Pr o (配列番号 ： 32 )、 Ala-Glu-Glu-Ala-Ala-Thr-Thr-Thr-Asp-Pro (配列番号 ： 33) Ala-Gul-Glu-Ala-Ala-Thr-Thr-Thr-Ala-Pro-Lys-Asp-Pro (配列 番号 ： 34)
上記のアミノ酸やペプチドには、 エンドグルカナーゼが分泌され るために生体膜を通過する過程で有利になると考えられる酸性ァミ ノ酸 （Glu， Asp) や小さい中性アミノ酸 （Ala, Thrなど） を用い δ 一方、 不利になるようなアミ ノ酸である塩基性アミ ノ酸 （Arg， Lys ) や疎水性の強いアミ ノ酸 （Leu, H e, Pheなど） を避ける。
バチルス . ブレビスを用いる異種タンパク質を菌体外に分泌生産 するために使用される遺伝子構築物は、 一般にプロモーター、 SD配 列、 適切なシグナルペプチド、 目的タンパク質をコードする DNA、 およびバチルス · ブレビス菌中で目的タンパク質遺伝子を発現させ るために必要な制御配列 （プロモーター、 ターミネータ一等） を含 む適切な配列を適切な位置に有するものである。 この構築物のため に使用できるベクターは特定の種類に制限されず、 バチルス · ブレ ビス菌中で機能し得るものであればよく、 プラスミ ドのように染色 体外で自律増殖するものであっても染色体に組込まれるものであつ てもよい。
バチルス · ブレビス由来のプラスミ ドは特に好ましい。 これらに は、 例えば PHT926 (特開平 4-216605号公報） 、 およびこれらを改良 した薬剤耐性遺伝子を有するプラスミ ドが含まれる。 バチルス · サ チルス （枯草菌） で利用されている pUBllO ( J. Bac t eri o l . , 134 , 318-329 ( 1978 ) ) も利用できる。 また、 ファージ、 トランスポゾン. 等も利用しうる。 本発明に使用できるプロモーター、 SD、 改良前の シグナルペプチドは特に限定されず、 宿主内で機能するものであれ ばいずれでもよいが、 バチルス · ブレビス 47または HPD31由来のプ 口モーター、 SD、 シグナルペプチドをコードする遺伝子 （J. Bac t e riol. , 170, 935-945 (1988)， J, Bacteriol. , 172, 1312-1320 (1 990)) を用いるのが有効である。
本発明で使用するシグナルペプチドは、 バチルス ' ブレビス （Ba cillus brevis) (新分類では、 プレビバチルス （Brevibacillus) 属に属する） 由来のものであり、 好ましくはそれを修飾して改良し たものである。 このシグナルぺプチドの本来のアミノ酸配列を配列 番号 ： 1に示し、 改良されたシグナルペプチドのアミ ノ酸配列の一 例を下記 ：
配列番号 1 ； Met Lys Lys (Arg)n Val Val Asn Ser Val Leu (Leu)m
1 5 10
Ala Ser Ala Leu Ala Leu The Val Ala XI X2 Ala Phe Ala
15 20 25
(ただし、 n， mはそれぞれ Argが 0〜 2個及び Leuが 3〜 5個連続 に配列することを示す。 また XIは Proまたは Ala, X2は Metまたは Asn である。 ）
に示し、 その具体的な配列の一例を配列番号 ： 2に示す。
改良されたシグナルペプチドは、 ヒ ト、 動物を含む真核生物の遺 伝子を発現 · 分泌させる場合に特に必要で、 改良されたシグナルぺ プチドを使用しない場合に比べその生産効率は 10倍以上になる （Ap pi. Microbial. Biotechnol. , 42, 358-363 (1994) ； 特開平 4-1038 91号公報） 。 そもそも、 シグナルペプチドの改良なしには発現べク ターをバチルス · ブレビスへ導入することが非常に困難である。 プ ラスミ ドを構築する方法と しては、 常法が適宜用いられ、 例えば、 Molecular cloning , a Laboratory Manual , Cold Spring Harbor L aboratory (1982) に記載の方法等が例示される。
前記条件にて構築された発現べクターに改変エンドグルカナーゼ 遺伝子を挿入したプラスミ ドを用いて、 微生物を形質転換すれば、 03012998 改変エンドダルカナーゼを効率良く分泌生産しうる形質転換体を得 ることができる。 外来遺伝子産物をコー ドする遺伝子を組込んだベ クタ一で形質転換する宿主菌と しては、 ベクター、 プロモーターが 発現可能な微生物であれば何れでもよく、 本発明ではバチルス · ブ レビス細菌が用いられる。 バチルス · ブレビスとは好気性のグラム 陽性桿菌であり、 例えばバチルス · ブレビス 47 (特開昭 60- 58074号 公報、 特開昭 62- 201583号公報） 、 バチルス · ブレビス H102 (HPD31 と同一の菌種） （特開昭 63 - 56277号公報）等が挙げられる。 また、 これらの変異株も含まれる。
微生物を形質転換する方法は公知の方法でよく、 例えば、 Takaha shi らの方法 (J. Bacteriol. , 156， 1130 (1983)) 、 や Takagiら の方法 '（Agric. Biol. Chem. , 53, 3099 - 3100 (1989)) 等が例示さ れる。
得られた形質転換体の培養に用いる培地は、 形質転換体が生育し て、 目的とする外来遺伝子産物を生産しうるものであればいかなる ものでもよい。 該培地に含有される炭素源と しては、 グルコース、 グリ セロール、 でんぷん、 糖蜜、 有機酸等が挙げられる。 窒素源と しては、 カゼイン、 ペプ ト ン、 大豆ペプ ト ン、 酵母エキス、 肉ェキ ス、 カザミ ノ酸、 尿素等の有機窒素源と硫酸アンモニゥム、 塩酸ァ ンモニゥム等の無機窒素源等が挙げられる。 また、 糖と無機窒素源 を主とする合成培地を用いて培養してもよい。 栄養要求性を示す菌 は、 その生育に必要な栄養物質を培地に添加すればよい。 該栄養物 質と しては、 アミ ノ酸類、 ビタ ミ ン類、 核酸塩基等が挙げられる。
また、 培養に際して必要であれば、 培地に抗生物質、 例えばアン ピシ リ ン、 エ リ ス ロマイ シン、 ネオマイ シン、 ク ロ ラムフエニコー ル等が加えられる。 さらに必要であれば Tween40等の界面活性剤、 グリ シン、 消泡剤等が加えられる。 培地の pHは 5〜9.5であり、 より好ましく は 6〜8である。 好気的 条件下で、 培養温度は通常 20°C〜40°Cであり、 培養時間は 48〜200 時間である。
本発明によって菌体外に分泌されたタンパク質は、 当該者によく 知られた方法に従って培養後の培地から分離精製することができる 。 例えば、 菌体を遠心分離等によ り除去した後、 塩析、 エタ ノール 沈殿、 限外濾過、 ゲル濾過、 イオン交換カラムクロマトグラフィー 、 ァフィ二ティーク口マトグラフィ、 高速液体クロマ トグラフィー 、 等電点電気泳動等の既知の適切な方法、 またはこれらを組み合わ せることによつて分離精製することができる。 実施例
本発明は以下の実施例および添付の図面によつて、 さらに具体的 に説明されるが、 これらはいかなる意味でも本発明を限定するもの と解してはならない。
実施例において使用された発現 · 分泌べクターは次の種類がある 。 枯草菌などで頻用される pUBllO (Plasmid 15， 93-103 (1986)) をベースと して、 その複製起点、 pHWl (J. Bacteriol. , 150, 804- 814 (1982)) のエ リ ス ロマイ シン耐性遺伝子を有するプラスミ ドへ バチルス · ブレビス 47菌の細胞表層タンパク質遺伝子 （mwp) (J. Bacteriol. , 170， 176-186 (1988)) のプロモーター領域、 さ らに シグナルペプチドをコードする領域を挿入した PNU210 (Methods En zymol. , 217, 23-33 (1993)) が作成された。
プラスミ ド pNU212は pNU210の mwpの翻訳開始コ ドン近傍の 1塩基 を変更して BspHIサイ トを造成し （PNU211の作成） 、 PNU211にある 2ケ所の Ncolサイ トのうち、 シグナルペプチド領域のサイ トのみに 変更して p NU212を作成した (Appl. Microbiol. Biotechnol. , 2, 358-363 (1994)) 。
プラスミ ド pNH326は pNH300の mwpシグナノレ酉己歹 ijを R2L6シグナノレ酉己 列 （Appl. Microbiol. Biotechnol. , 42, 358-363 (1994)) に変更 して作成したものである (Appl. Environ. Microbiol. , 66, 304 - 3 09 (2000)) 。 プラスミ ド ρ匪 300は Ρ4、 Ρ5のプロモーター領域、 mwp シグナル配列、 並びにマルチクローニングサイ トを有する pNU210の DNA断片を pUBllO (Plasmid, 15, 93-103 (1986)) に挿入して作成 した。 ベクタ一 pNH300及び pNH326はネオマイシン耐性遺伝子のみを 有し、 これらプラスミ ドによる形質転換株の選択に使用する。
実施例 1. ァミ ノ末端へ 1ないし複数個のアミ ノ酸を付加したェ ン ドダルカナーゼをコ一ドする塩基配列を有する発現べクターの調 m
発現 . 分泌べクターの構築の代表例と して、 ァミ ノ末端にァミ ノ 酸を付加したェンドグルカナーゼ遺伝子を発現べクターに組込む様 式を図 1 に示した。
(1) プラスミ ド PNUR2L6- EGの構築
プラスミ ド pNU212を BspHI- Hindlll にて消化して得られる約 4.3k bの断片に、 pNH326を BspHI- Hindlll にて消化して得られる約 100bp の断片を連結し、 プラスミ ド pNUR2L6を得た。
ピロ コ ッカス · ホリ コシ (Pyrococcus horikoshii 由来のェン ドグルカナーゼ遺伝子をコードする 0RF (PH1171) (配列番号 4 ) を有するプラスミ ド pET- EGPh (Appl. Environ. Microbiol. , 68, 4 30-433 (2002)) を铸型と して、 順方向プライマー （配列番号 5 ) および逆方向プライマー （配列番号 6 ) を用いて PCRを行い、 ェン ドグルカナ一ゼをコ一ドする DNA断片を調製した。
得られた断片を Ncol- Xbalによって消化し、 プラスミ ド pNUR2L6を Ncol - Xbalにて消化して得られる約 4.3kbの断片と連結することによ つて、 分泌されるエンドダルカナーゼの N末端には何も付加されな い、 エンドグルカナーゼ発現プラスミ ド （PNUR2L6- EG) を調製した 。 本プラスミ ド中のエンドグルカナーゼ遺伝子およびその近傍の塩 基配列は ABI prism 310 DNAシークェンサ一を用いてプロモーター 領域からエンドダルカナーゼ遺伝子の下流領域までの約 1.5kbの塩 基配列が正しいことを確認した。
酉己歹 (J番号 5 ； 5'-CATGCCATGG CTTTCGCTGA AAATACAACA TATCAAACAC CGA-3'
配列番号 6 ； 5 GCTCTAGATC AAGAACTTTT GGAACAACTA T
(2) プラスミ ド PNUR2L6- A-EGの構築
上記 pET- EGPhを铸型と して、 順方向プライマー （配列番号 7 ) お よび逆方向プライマー （配列番号 6 ) を用いた PCRを実施し、 ェン ドグルカナーゼをコ一ドする DNA断片を調製した。 得られた断片を P stl - Xbalによって消化し、 プラスミ ド pNUR2L6を Pstl- Xbalにて消化 して得られる約 4.4kbの断片と連結することによって、 分泌される ェンドグルカナーゼの N末端に Alaが付加されるように、 ェンドグ ルカナーゼ発現プラスミ ド （PNUR2L6-A- EG) を調製した。 この塩基 配列の正しいことを上記 （ 1 ) と同様の方法で確認した。
配列番号 7 ； 5'-AACTGCAGAA AATACAACAT ATCAAACACC GA-3' 配歹' J番号 6 ； 5 GCTCTAGATC AAGAACTTTT GGAACAACTA T - 3'
(3) プラスミ ド PNUR2L6- V- EGの構築
上記と同一の铸型を使用し、 配列番号 8 (順方向） および配列番 号 6の合成ォリ ゴヌク レオチドをプライマーと して PCRを行い、 ェ ンドグルカナーゼをコー ドする D NA断片を調製した。 その後は、 上記 （ 1 ) と同様の方法でエンドダルカナーゼのァミ ノ末端に Val が付加したエンドグルカナーゼを発現するプラスミ ドを調製した。 配列番号 8 ； 5 CATGCCATGG CTTTCGCAGT AGAAAATACA ACATATCAAA CACCGA- 3，
(4) プラス ミ ド pNUR2L6- D- EGの構築
上記と同一の鑤型を使用し、 配列番号 9 (順方向） および配列番 号 6の合成オリ ゴヌク レオチ ドをプライマーと して PCRを行い、 ェ ンドダルカナーゼをコ一ドする D N A断片を調製した。 その後は、 上記 （ 1 ) と同様の方法でエン ドグルカナーゼのァミ ノ末端に A s Pが付加したェン ドグルカナーゼを発現するプラスミ ドを調製した 酉己歹 ij番号 9 ； 5，- CATGCCATGG CTTTCGCAGA TGAAAATACA ACATATCAAA CACCGA - 3'
(5) プラス ミ ド pNUR2L6- T- EGの構築
上記と同一の鐯型を使用し、 配列番号 10 (順方向） および配列番 号 6の合成オリ ゴヌク レオチ ドをプライマーと して PCRを行い、 ェ ンドダルカナーゼをコー ドする DNA断片を調製した。 その後は、 上 記 （ 1 ) と同様の方法でェン ドグルカナーゼのァミ ノ末端に Thrが 付加したェン ドグルカナーゼを発現するプラスミ ドを調製した。 配列番号 10 ； 5 '-CATGCCATGG CTTTCGCAAC TGAAAATACA ACATATCAAA CACCGA - 3'
(6) プラスミ 賺2し6^ の構築
上記と同一の铸型を使用し、 配列番号 11 (順方向） および配列番 号 6の合成オリ ゴヌク レオチ ドをプライマーと して PCRを行い、 ェ ンドダルカナーゼをコー ドする DNA断片を調製した。 その後は、 上 記 （ 1 ) と同様の方法でエン ドダルカナーゼのァミ ノ末端に Asp - Pr 0が付加したェン ドグルカナーゼを発現するプラスミ ドを調製した 配列番号 11 ； 5 '-CATGCCATGG CTTTCGCAGA TCCAGAAAAT ACAACATATC AAACACCGA-3' (7) プラスミ ド pNUR2L6-AEDP- EGの構築
上記铸型を使用し、 配列番号 12および配列番号 6のオリ ゴヌ タ レ ォチドをプライマーと して PCRを行い、 ェンドグルカナーゼをコ一 ドする DNA断片を調製した。 得られた断片を BamHI- Xbalによつて消 化し、 プラスミ ド pNUR2L6を BamHI- Xbalにて消化して得られる約 4.3 kbp の断片と連結し、 プラスミ ド pNUR2L6cEGを得た。
得られたプラスミ ド pNUR2L6cEGを Ncol- BamHIによつて消化して得 られる約 5.6kbp の DNA断片に、 互いに相補的なオリ ゴヌ ク レオチ ド IP1 (配列番号 13) および IP2 (配列番号 14) 同士をァニールさせる ことによって調製した 2本鎖 DNA断片を結合し、 分泌されるェン ドグルカナーゼの N末端に Ala- Glu Asp-Proの配列 （配列番号 ： 28 ) が付加されるように、 エンドダルカナーゼ発現プラスミ ド （pNUR 2L6-AEDP-EG) を調製した。 塩基配列の確認も行った。
配列番号 12； 5'-CGGGATCCGG AAAATACAAC ATATCAAACA CCGA-3' 配列番号 13； 5 '-CATGGCTTTC GCAGCAGAA-3'
配歹 |J番号 14； 5'-GATCTTCTGC TGCGAAAGC-3'
(8) プラスミ ド pNUR2L6-AEEAADP— EGの構築
プラスミ ド pNUR2L6cEGを Ncol- BamHIにて消化して得られる約 5.6k bの DNA断片に、 互いに相補的なオリ ゴヌク レオチド IP5 (配列番号 1 5) および IP6 (配列番号 16) 同士をァニールさせた 2本鎖 DNA断片 を結合し、 分泌されるェンドグルカナーゼの N末端に Ala-Glu- Glu- Ala- Ala- Asp-Proの配列 （配列番号 ： 29) が付加されるように、 ェ ンドダルカナーゼ発現プラスミ ドを調製した。 塩基配列の確認も行 つた。
配列番号 15； 5，- CATGGCTTTC GCAGCAGAAG AAGCAGCA-3'
配列番号 16； 5' - GATCTGCTGC TTCTTCTGCT GCGAAAGC - 3'
(9) プラス ミ ド PNUR2L6- AAAEEDP- EGの構築 プラスミ ド pNUR2L6cEGを Nco l- BamHIにて消化して得られる約 5. 6k bの DNA断片に、 互いに相補的なオリ ゴヌク レオチ ド IP7 (配列番号 1 7) および IP8 (配列番号 18) 同士をァニールさせた 2本鎖 DNA断片 を結合し、 分泌されるェンドグルカナーゼの N末端に Ala- Ala- Ala - Glu-Glu- Asp-Proの配列 （配列番号 ： 30) が付加されるように、 ェ ンドグルカナーゼ発現プラスミ ドを調製した。 塩基配列の確認も行 つた
配列番号 17； 5 ' -CATGGCTTTC GCAGCAGCAG CTGAAGAA-3 '
配列番号 18 ; 5 ' - GATCTTCTTC AGCTGCTGCT GCGAAAGC-3 '
( 10) プラスミ ド pNUR2L6-AEAAADP - EGの構築
プラスミ ド pNUR2L6cEGを Nco l - BamHIにて消ィ匕して得られる約 5. 6k bの DNA断片に、 互いに相補的なオリ ゴヌクレオチド IP9 (配列番号 1 9) および IP10 (配列番号 20) 同士をァニールさせた 2本鎖 DNA断片 を結合し、 分泌されるェンドグルカナーゼの N末端に Ala-Glu-Ala - Ala Ala- Asp- Proの配列 （配列番号 ： 31) が付加されるように、 ェ ンドダルカナーゼ発現プラスミ ドを調製した。 塩基配列も確認した 配列番号 19； 5 CATGGCTTTC GCAGCAGAAG CAGCAGCA-3 '
配列番号 20； 5 ' - GATCTGCTGC TGCTTCTGCT GCGAAAGC-3 '
( 11) プラスミ ド PNUR2L6- NSDSEDP-EGの構築 ' プラスミ ド pNUR2L6cEGを Nco l- BamHIにて消化して得られる約 5. 6k bの DNA断片に、 互いに相補的なオリ ゴヌク レオチ ド IP11 (配列番号 21) および IP12 (配列番号 22) 同士をァニールさせた 2本鎖 DNA断 片を結合し、 分泌されるェンドダルカナーゼの N末端に Asn-Ser- As p-Ser- Glu-Asp- Proの配列 （配列番号 ： 32) が付加されるよ うに、 エンドダルカナーゼ発現プラスミ ドを調製した。 塩基配列も確認し た。 配列番号 21 ； 5 CATGGCTTTC GCAAACAGTG ATAGTGAA-3 ' 酉己列番号 22； 5 '— GATCTTCACT ATCACTGTTT GCGAAAGC-3 '
( 12) プラスミ ド pNUR2L6 - AEEAATTTDP-EGの構築
プラスミ ド pNUR2L6cEGを Nc o I -BamHIにて消化して得られる約 5. 6k bの DNA断片に、 互いに相補的なオリ ゴヌクレオチド IP13 (配列番号 23) および IP14 (配列番号 24) 同士をァニールさせた 2本鎖 DNA断 片を結合し、 分泌されるエンドダルカナーゼの N末端に Ala- Glu - G1 u- Ala- Ala- Thr - Thr- Thr- Asp - Pr o (配列番号 ： 33) の配列が付加さ れるように、 ェンドグルカナーゼ発現プラスミ ドを調製した。 塩基 配列も確認した。
配列番号 23； 5 CATGGCTTTC GCAGCAGAAG AAGCAGCAAC TACTACA-3 ' 配歹 [j番号 24； 5 GATCTGTAGT AGTTGCTGCT TCTTCTGCTG CGAAAGC-3 '
( 13) プラスミ ド pNUR2L6 - AEEAATTTAPKDP_EGtの構築
上記 （1) の pET- EGPhを铸型に使用し、 配列番号 12および配列番 号 27のォリ ゴヌク レオチドをプライマーと して PCRを行い、 エン ド ダルカナーゼをコ一ドする DNA断片を調製した。 得られた断片を Bam HI - Xba lによって消化し、 プラスミ ド pNUR2L6を BamHI -Xba lにて消化 して得られる約 4. 3kbp の断片と連結し、 プラスミ ド pNUR2L6cEGtを 得た。
EGtは配列番号 3に示すェンドグルカナーゼ遺伝子からコードさ れるポリペプチ ド （シグナルペプチドを除く、 第 1アミノ酸残基か ら第 430アミ ノ酸残基まで） であり、 EGは EGtよ りカルボキシ末端か ら 42アミ ノ酸残基少ないポリペプチド。
得られたプラスミ ド pNUR2L6cEGtを Nc o l - BamHIによって消化して 得られる約 5. 6kbの DNA断片に、 互いに相補的なォリ ゴヌクレオチ ド IP15 (配列番号 25) および IP16 (配列番号 26) 同士をァニールさせ た 2本鎖 DNA断片を結合し、 分泌されるェンドグルカナーゼの N末 端に Ala_Glu - Glu- Ala_Ala-Thr-Thr- Thr - Ala-Pro_Lys_Asp - Pro (配 列番号 ： 34) の配列が付加されるように、 エン ドダルカナーゼ発現 プラスミ ドを調製した。
本プラスミ ド中のェンドグルカナーゼ遺伝子およびその近傍の塩 基配列は ABI prism 310 DNAシークェンサ一を用いてプロモーター 領域からエンドダルカナーゼ遺伝子の下流領域までの約 1.5kbp の 塩基配列が正しいことを確認した。
配列番号 25； 5 CATGGCTTTC GCAGCAGAAG AAGCAGCAAC TACTACAGCT CCAAAG-3'
配列番号 26； 5' - GATCCTTTGG AGCTGTAGTA GTTGCTGCTT CTTCTGCTGC GAAAGC-3'
配列番号 27； 5' - GCTCTAGACT ACCTGGGAGC CCTTCTTAAG-3 '
(14) プラス ミ ド PNU212- EGの構築
上記 （1) の pET- EGPhを鐃型として、 配列番号 5および配列番号 6の合成ォリ ゴヌ ク レオチドをプライマーとした PCRを実施し、 ェ ンドグルカナーゼをコ一ドする DNA断片を調製した。 得られた断片 を Ncol-Xbalにて消化し、 プラスミ ド pNU212を Ncol- Xbalにて消化し て得られる断片約 4.3kbの断片と連結することによって、 分泌され るェンドグルカナーゼの末端には何も付加されない、 エンドグルカ ナーゼ発現プラスミ ド （PNU212- EG) を調製した。 また、 本発現プ ラスミ ドは、 改良配列ではなく原配列のシグナルペプチドを有する 。 塩基配列も確認した。
(15) プラスミ ド pNU212- A-EGの構成
上記 （1) の pET- EGPhを铸型と して、 配列番号 7および配列番号 6の合成オリ ゴヌク レオチドをプライマーに用いて PCRを行い、 ェ ンドグルカナーゼをコ一ドする DNA断片を調製した。 得られた断片 を Pstl- Xbalによって消化し、 プラスミ ド PNU212を Pstl- Xbalで消化 してえられる約 4. 3kbの断片と連結することによって、 分泌される エンドダルカナーゼの N末端に Alaが付加されるように、 発現ブラ スミ ド （PNU212- A- EG) を調製した。 塩基配列も確認した。
( 16) プラスミ ド PNU212- A-EGtの構築
上記 （1) の pET- EGPhを铸型として、 配列番号 7および配列番号 2 7の合成オリ ゴヌク レオチドをプライマーと して PCRを行い、 エンド グルカナーゼをコ一ドする DNA断片を調整した。 この後のプラスミ ド調製過程は上記 （15) の場合と全く同様であるが、 得られた発現 プラスミ ドは pNU212-A-EGtであった。 塩基配列も確認した。
( 17) プラスミ ド PNH326- A- EGの構築
上記 （1) の pET_EGPhを铸型と して、 EG3 (配列番号 7 ) および EG 2 (配列番号 6 ) をプライマーと した PCRを実施し、 エンドダルカナ 一ゼをコ一ドする DNA断片を調製した。 得られた断片を Pst l- Xbalに よって消化し、 プラスミ ド pNH326を Ps t l- Xbalにて消化して得られ る約 3. 9kbp の断片と連結することによって、 分泌されるエンドグ ルカナーゼの N末端に Alaが付加されるよ うに、 ェンドグルカナー ゼ発現プラスミ ドを調製した。 本プラスミ ド中のエンドダルカナー ゼ遺伝子およびその近傍の塩基配列は AB I pr ism 310 DNAシークェ ンサーを用いてプロモーター領域からエンドグルカナーゼ遺伝子の 下流領域までの約 1. 5kbp の塩基配列が正しいことを確認した。
( 18) プラスミ ド PNH326- A- EGtの構築
上記 （1) の pET- EGPhを铸型と して、 EG3 (配列番号 7 ) および EG 8 (配列番号 27) をプライマーとした PCRを実施し、 エンドダルカナ 一ゼをコ一ドする DNA断片を調製した。 得られた断片を Ps t l - Xba lに よって消化し、 プラスミ ド pNH326を Ps t l - Xbalにて消化して得られ る約 3. 9kbp の断片と連結することによって、 分泌されるエン ドグ ルカナーゼの N末端に Alaが付加されるよ うに、 エンドダルカナー ゼ発現プラスミ ドを調製した。 本プラスミ ド中のエンドダルカナー ゼ遺伝子およびその近傍の塩基配列は AB I pr i sm 310 DNAシークェ ンサーを用いてプロモーター領域からエンドグルカナーゼ遺伝子の 下流領域までの約 1. 5kbp の塩基配列が正しいことを確認した。
実施例 2 . 発現べクタ一を有するバチルス · ブレビスによるェ ンドグルカナーゼの分泌生産
実施例 1 の （1) 〜 （18) で構築した各種発現べクター · プラス ミ ドによってバチルス ' ブレビス HPD31株、 或いは 31- 0K株を形質転 換し、 得られた形質転換体を好気的に培養するこ とによって、 ェン ドダルカナーゼを培養液中に分泌生産させた。 生産はそれぞれの菌 を生産用培地 （ 3 %ポリペプ ト ン- S、 0. 8%酵母エキス、 3 %グル コース、 その他、 必要に応じて各種金属塩、 Tween-40、 エ リ ス ロマ イ シン、 ネオマイシン等を含有する） に接種し、 30°G、 振と う培養 で数日間培養することにより行った。 それらの培養液の上清中のェ ンドグルカナーゼ活性を測定した結果を表 1に示す。
分泌生産されたエンドグルカナーゼ量は、 カルボキシメチルセル ロース （CMC) を基質として活性を測定することにより測定した。 0 . 2mlの 1 % CMC水溶液と 0. 2mlの 0. 2M酢酸緩衝液 （pH5. 6) を混合し 、 これに 50mMト リ ス—塩酸緩衝液 （pH8. 0) に対して一晩透析した 培養液上清を加え、 85°Cにて反応させた。 0. 2mlの反応液と 0. 4mlの Somogi銅液を混合し、 沸騰浴中にて 20分間加熱した後、 0. 4mlの Ne l son試薬を混合した。
この溶液の、 500nmにおける吸光虔を測定し、 別にグルコースを 用いて作成した検量線よ り、 還元性末端量 （Main) を測定した。 ま た、 培養液の代わりに 50mMト リ ス—塩酸緩衝液 （pH5. 6) を用いた ブランク 1、 CMCの代わりに水を用いたブランク 2を同様に処理し 、 それぞれの還元性末端量を測定した。 Mainの値とブランク 1およ びブランク 2の差を算出することによ り、 反応によつて増加した還 元性末端量を求めた。 活性 1単位 （U) は CMCから 1分間に 1 mgダル コースに相当する還元力を生じる酵素量と定義した。 精製酵素の比 活性は 8· 5U/mgタンパク質であった。
表 1. ァミノ末端にアミノ酸を付加したエンドグルカナーゼのバチルス 'ブレビスによる生産。 発現■分泌べクタ一 シグナルぺプチド 付加したアミノ酸 エンドグルカナ-ーゼのタイプと生 タイプ ** 2曰百 4曰巨
PNUR2L6 改良配列 None EG 0.03 0.04
II // A II 0.50 0.75
II // V II 0.42 . 0.70
II ,/ τ II 0.18 0.20
// // D II 0.12 0.16
II // DP II 0.20 0.58
II 11 AEDP II 0.25 0.18
II 11 AEEAADP II 0.40 0.78
II II AAAEEDP II 0.24 0.23
II II AEAAADP II 0.26 0.26
〃 〃 NSDSEDP II 0.22 0.20
〃 II AEEAATTTDP II 0.37 0.47
II II AEEAATTTAPKDP EGt <0.01 0.21
PNU212 原配列 None EG <0.01 0.05
II II A II <0.01 0.05
// II A EGt 0.01 0.03
PNH326 改良配列 A EG 0.53 1.05
II 〃 A EGt 0.05 0.18
* ：培養液上澄 ml当りの酵素活性 unit数。 **： EGtについては実施例 1の （Ί3) にて説明。
表 1から、 エン ドダルカナーゼ生産量は、 そのアミノ末端に 1な いし数個のアミノ酸を付加した場合にァミ ノ酸を付加しない場合の 生産量の 5〜20数倍になり、 顕著に増加することが分かる。 また、 本酵素の生産量をその比活性で重量に換算すると、 効率よい場合は 1 リ ッ トル当たり lOOmg以上であり、 大腸菌による生産量の約 100倍 であった。
実施例 1の （2) 及び （13) の発現ベクターによって得られたェ ンドグルカナーゼを含有する培養液を遠心分離し、 菌体を除いた後 、 硫安塩析、 陰イオン交換クロマ トグラフィー、 疎水性相互作用ク 口マ トグラフィー、 ゲルろ過クロマ トグラフィー等によ り、 電気泳 動的に単一に精製した。 そのタンパク質の分子量、 酵素活性、 耐熱 性、 最適 pH、 基質特異性、 などは、 大腸菌で生産されたものと一致 した。 ァミノ末端のアミ ノ酸配列を決定したところ、 （2) 及び （1 3) のどちらの場合も A或いは AEEAATTTAPKDPの付力 Pしたェンドグル カナーゼが生産されていることが明らかになり、 それらの付加アミ ノ酸ゃぺプチドが酵素の性質に有意の影響を与えていないことが示 された。

Claims

1 . バチルス · ブレビス （Bacillus brevis) 由来のシグナルぺ プチド領域をコー ドする DNA配列の下流に、 超好熱性古細菌由来で ァミ ノ末端 （N—末端） に 1ないし 20個のアミ ノ酸を付加したェン ドグルカナーゼをコ一ドする核酸配列が接続された遺伝子発現べク 青
ターを有するバチルス （Bacillus) 属細菌を培養し、 エンドグルカ ナーゼを産生および分泌させることを特徴とする、 古細菌由来超耐 熱性ェンドグルカナーゼの製造方の法。
2. 前記シグナルペプチ ドがバチルス · ブレビス由来で細胞表層 タンパク質遺伝子のシグナルぺプチドを改囲変した下記のァミ ノ酸配 列 ：
酉 3列番号 1 ； Met Lys Lys (Arg)n Val Val Asn Ser Val Leu (Leu)m
1 5 10
Ala Ser Ala Leu Ala Leu The Val Ala XI X2 Ala Phe Ala
15 20 25
(ただし、 n， mはそれぞれ Argが 0〜 2個及び Leuが 3〜 5個連続 に配列することを示す。 また XIは Proまたは Ala， X2は Metまたは Asn である。 ）
を有するペプチドである請求項 1記載の方法。
3. 前記エンドグルカナーゼがピロコッカス （Pyrococcus) 属古 細菌由来のェンドグルカナーゼである請求項 1及び 2記載の方法。
4. 前記ェンドグルカナーゼが配列番号 4に示すァミ ノ酸配列を 有する、 請求項 1〜 3のいずれか 1項に記載の方法。
5. 前記エンドダルカナーゼが、 配列番号 4に記載のアミ ノ酸配 列において N—末端における 1〜50個のァミノ酸の欠失によ り、 あ るいは配列番号 4に記載のァミ ノ酸配列又はその C一末端の 1〜50 個のアミノ酸が欠失したアミ ノ酸配列において 1〜数個のアミノ酸 の置換、 欠失、 挿入および/または付加によ り修飾されたアミ ノ酸 配列を有する請求項 1〜 3に記載の方法。
6 . 前記エンドダルカナーゼの N —末端に付加されるアミ ノ酸の 数が 1〜15個である、 請求項 1〜 5·のいずれか 1項に記載の方法。
7 . 前記ェンドグルカナーゼの N —末端に付加されるアミ ノ酸が 、 次のアミノ酸またはアミノ酸配列 ： Ala、 Val、 Thr、 Asp , Asp-Pr o、 Ala - Glu - Asp - Pr o (配列番号 ： 28) 、 Ala - Glu - Glu - Ala - Ala- Asp - Pro (配列番号 ： 29) 、 Ala-Ala-Ala-Glu-Glu-Asp-Pro (配列番号 ： 30) 、 Ala-Glu-Ala-Ala-Ala-Asp-Pr o (配列番号 ： 31 ) 、 Asn-Ser-A sp - Ser - Glu - Asp - Pr o (配列番号 ： 32 )、 Ala - Glu- Glu_Ala - Ala - Thr-T hr-Thr-Asp-Pro (配列番号 ： 33) または Ala- Gul- Glu- Al a- Ala- Thr - Thr-Thr- Ala- Pro- Lys- Asp-Pro (配列番号 ： 34) を構成する、 請求 項 6に記載の方法。
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