WO2004033670A1 - 共重合ポリエステルの組成をコントロールする培養方法 - Google Patents

共重合ポリエステルの組成をコントロールする培養方法 Download PDF

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WO2004033670A1
WO2004033670A1 PCT/JP2003/013022 JP0313022W WO2004033670A1 WO 2004033670 A1 WO2004033670 A1 WO 2004033670A1 JP 0313022 W JP0313022 W JP 0313022W WO 2004033670 A1 WO2004033670 A1 WO 2004033670A1
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oil
culture
fat
polyester
specific substrate
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PCT/JP2003/013022
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Inventor
Toshimitsu Nakashima
Osamu Odawara
Satoru Yokomizo
Original Assignee
Kaneka Corporation
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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/62—Carboxylic acid esters
    • C12P7/625—Polyesters of hydroxy carboxylic acids

Definitions

  • the present invention relates to a culture method for controlling the composition of a copolyester produced from a microorganism.
  • P (3HB) poly-3-hydroxybutyric acid
  • P (3HB) is a thermoplastic polymer that is biologically degraded in the natural environment and is attracting attention as an environmentally friendly green plastic.
  • P (3HB) has high crystallinity and is hard and brittle, which limits its practical application. For this reason, research aimed at improving this property has been made.
  • a hydroxy acid other than 3HB and 3HV for example, 3-hydroxypropionic acid (hereinafter abbreviated as 3HP) , 3-hydroxyhexanoic acid (hereinafter abbreviated as 3HH), 3-hydroxyoctanoic acid (hereinafter abbreviated as 3HO), 3-hydroxynonanoic acid (hereinafter abbreviated as 3HN), 3-hydroxydecanoic acid (hereinafter abbreviated as 3HN)
  • 3HD 3-hydroxydodecanoic acid
  • 3HDD 3-hydroxydodecanoic acid
  • P (3HB-co-3HH) can be produced from fatty acids as a carbon source using a recombinant strain introduced into Ralstonia 'R. eutropha', which has a high polyhydroxybutyric acid (PHB) accumulation ability.
  • P (3HB-cG-3HH) having a 3HH content of 10 to 20 mol% can be produced by using sodium otatanate as a carbon source. Furthermore, recently, a method of using a plurality of carbon sources when producing a polyester using the above-mentioned recombinant strain has been disclosed, and the number of carbon atoms of fats and oils and fatty acids used as the carbon source is P (3HB-c D-3HH) was found to affect the 3 HH content (Japanese Patent Application Laid-Open No. 2001-340078).
  • copolyesters such as ⁇ (3 ⁇ -co-3 ⁇ )
  • ⁇ 3 ⁇ -co-3 ⁇
  • Another barrier to commercialization is the problem of production costs.
  • expensive specific fatty acids had to be added to the medium in order to copolymerize monomer units other than 3HB or to increase the content thereof.
  • the present invention has been made in view of the above circumstances, and provides a production method capable of controlling the composition of a biodegradable copolymerized polyester and realizing high productivity at low cost.
  • the present inventors have conducted various studies, and particularly with respect to fermentation raw materials, as a result of examining the price, supply stability, quality stability, yield of bacterial cells or polymers, and the like. Cultivation using a medium using inexpensive oils and fats as a carbon source, while maintaining high productivity, and the monomer composition within an arbitrary range without using particularly expensive fatty acids etc. as a carbon source Succeeded in controlling well.
  • the gist of the present invention is that when producing a copolymerized polyester using a microorganism, the specific substrate supply rate of the fat or oil used as a carbon source is controlled to a constant value throughout the culture, or the culture period is controlled.
  • the present invention relates to a culture method in which the food is divided into two phases, a cell growth phase and a polyester accumulation phase, and each phase is controlled to a constant value.
  • the present invention relates to a culturing method for arbitrarily controlling the composition of the produced copolymerized polyester by selecting the type of fat or oil and / or the control value of the specific substrate supply rate of fat or oil.
  • the culturing method for controlling the composition of the copolymerized polyester of the present invention is characterized in that, in the production of a copolymerized polyester by a microorganism, the specific substrate supply rate of an oil or fat used as a carbon source is controlled to a constant value throughout the culturing.
  • the culturing method is characterized in that the culturing method is changed between the bacterial cell growth period and the polyester accumulation period, and is controlled to a constant value during each period.
  • the culturing method is applied when producing a biodegradable copolymerized polyester using a microorganism.
  • the copolymerized polyester to which the culture method of the present invention can be applied is not particularly limited, and is a copolymerized polyester obtained by polymerizing at least two kinds of monomer cuts.
  • Specific examples of the copolymerized polyester include a copolymerized polyester p (3HB-c0-3HH) composed of 3HB and 3HH, a copolymer composed of 3 components of 3HB, 3HH and 3HV, and other pseudomonas.
  • Copolymers containing many components, such as 3HB, 3HH, 3HO, 3HD, and 3HDD, produced by bacteria of the genus (Pseu dmo nas) can be cited as typical examples. (I. KP Tan, KS Kumar, M.
  • 3HH is one of the monomer units in that the composition ratio of the monomer unit of the copolymerized polyester, particularly the content of 3HH, changes very widely and the properties of the polyester change. Is preferred, and P (3HB-co-3HH) is more preferred.
  • the microorganism to be used is not particularly limited, and a microorganism isolated from nature, a microorganism deposited at a strain depository (eg, IFO, ATCC, etc.), and the like can be used.
  • a microorganism isolated from nature e.g, IFO, ATCC, etc.
  • a microorganism deposited at a strain depository eg, IFO, ATCC, etc.
  • bacteria of the genus Alcaligenes A 1 ca 1 igenes
  • the genus Lanorestonia Ra 1 stonia
  • the genus Aeromonas A eromonas
  • Pseudomonas the genus Escherichia, etc.
  • Kinds can be used.
  • a gene encoding a polymerase enzyme of the target copolymer polyester is introduced into the microorganism.
  • the transformed microorganism obtained by the transformation can be used.
  • a general method such as using a recombinant vector containing a polyester synthase gene can be used.
  • the vector is a plasmid capable of autonomously growing in the cells. Vectors can be used.
  • the polyester synthase gene may be directly integrated into the host chromosome.
  • Good hosts include the genus Alcaligenes, the genus Ralstonia, the genus Aeromonas, the genus Pseud omonas, and the genus Escherichia. Bacteria can be used.
  • the polyester synthase gene used in the production of the copolymerized polyester of the present invention is not particularly limited, but is preferably a gene isolated from Aeromonas cinerea (Aeromo nascaviae), for example, JP-A-10-108682. Gene fragments described in the gazette can be used.
  • a recombinant vector can be introduced into a microorganism by a known method.
  • a joining method e.g., a joining method, a calcium method, an electoral opening method, or the like can be used.
  • Ra1stoniaeutropha As an example of the microorganism used in the present invention, Ralstonia eutropha (Ra1stoniaeutropha), into which a polyester synthase gene derived from Aeromonas caviae has been introduced, Ra1stoniaeutropha PHB—4 / p J RDEE 32 dl 3 Strain (T. Fukui, ⁇ . D ⁇ i, A ⁇ 1. Microbiol. Biotech ⁇ 1., 49, 333-336, 1998) can be preferably used.
  • the strain Ralstoniaeutropha PHB-4 / p J RDE E 32 d13 was named Alcaligeneseutrophus AC32 under the accession number of FERM BP-6038 on August 7, 1997, in Ibaraki, Japan. It has been deposited internationally at the Patent Organism Depositary at the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST) at Tsukuba East 1-chome 1-1 Chuo No. 6 based on the Pust Treaty.
  • inexpensive oils and fats are used as a main carbon source in terms of price, supply stability, quality stability, yield of cells or polyester as a fermentation raw material.
  • “major” means that it accounts for more than 50% of the total carbon source.
  • sugars such as glucose, fructose, sucrose, ratatose and the like can be used.
  • Nutrient sources other than carbon sources include nitrogen sources, inorganic salts, vitamins, and other general sources.
  • a medium containing an effective organic nutrient can be used.
  • the nitrogen source include inorganic nitrogen sources such as ammonia, ammonium chloride, ammonium sulfate, ammonium phosphate and the like; and organic nitrogen sources such as peptone, meat extract and yeast extract.
  • the inorganic salts include potassium (I) phosphate, potassium (II) phosphate, magnesium phosphate, magnesium sulfate, and sodium chloride.
  • the vitamins include vitamin B1, vitamin B12, and vitamin C.
  • Other organic nutrients include, for example, amino acids such as glycine, alanine, serine, threonine, and proline.
  • organic nitrogen sources such as peptone, meat extract, and yeast extract; amino acids such as glycine, alanine, serine, threonine, and proline; vitamin B1, vitamin B12
  • vitamins such as vitamin C is preferably minimized.
  • expensive organic nitrogen sources such as peptone, yeast extract, and meat extract is preferably minimized.
  • the production of polyester by microorganisms is preferably achieved under conditions where the nutrients required for growth, such as nitrogen and phosphorus, are restricted to some extent.
  • the nutrients required for growth such as nitrogen and phosphorus
  • such nutrient restriction can be performed.
  • it is more preferable to restrict nitrogen or phosphorus and it is more preferable to restrict phosphorus without restricting nitrogen.
  • limiting phosphorus does not mean that the medium does not contain any phosphorus atoms, but that it contains at least phosphorus as a nutrient required for growth. It refers to the condition in which the amount of growth of the body is defined by phosphorus, and does not exclude small amounts of inorganic salts contained in the medium.
  • the fats and oils used as a carbon source in the present invention include natural fats and oils which are relatively stably supplied such as soybean oil, corn oil, cottonseed oil, palm oil, palm kernel oil, coconut oil, peanut oil and the like; Fractions obtained by separating fats and oils (for example, palm W olein (low melting point fraction obtained by separating palm oil twice without solvent)), palm kernel oil olein (low melting point fraction obtained by once separating palm kernel oil without solvent) Fractions, etc.); synthetic oils obtained by chemically or biochemically treating these natural fats and oils and fractions thereof; and mixed oils obtained by mixing them.
  • natural fats and oils which are relatively stably supplied such as soybean oil, corn oil, cottonseed oil, palm oil, palm kernel oil, coconut oil, peanut oil and the like
  • Fractions obtained by separating fats and oils for example, palm W olein (low melting point fraction obtained by separating palm oil twice without solvent)
  • palm kernel oil olein low melting point fraction obtained by once separating palm kernel oil
  • natural fats and oils and fractionated fats and oils are preferred, and from the viewpoint of cost, natural fats and oils and inexpensive fractionated fats and oils are more preferable.
  • the type of fat or oil to be used the type of monomer unit constituting the copolymerized polyester and the composition ratio thereof can be controlled.
  • an oil or fat containing lauric acid as a constituent fatty acid of the oil or fat it is called an oil or fat containing lauric acid as a constituent fatty acid of the oil or fat, and is commonly called a lauric oil or fat.
  • fats and oils containing lauric acid as a constituent fatty acid include natural fats and oils such as palm kernel oil and coconut oil, fractionated fats and oils such as palm kernel oil olein, and mixed oils containing these lauric fats.
  • P (3HB-C G-3HH) when a lauric fat is used, P (3HB-C G-H) has a relatively high 3HH content of 4 to 2 Omo 1%. 3HH) can be obtained.
  • soybean oil, corn oil, cottonseed oil, palm oil, peanut oil, or their fractionated fats and oils are used, the relatively low 3HH content of P ( 3HB—co—3HH) is obtained.
  • the 3 HH content of P (3HB-co-3HH) can be arbitrarily controlled. it can.
  • the fat or oil used as a carbon source is a fat or oil containing lauric acid as a constituent fatty acid, and that the culture is performed under phosphorus limitation.
  • the inventors of the present invention have studied the optimal method of adding fats and oils as a carbon source, and as a result of devising the feeding method, not only avoiding operational problems such as foaming, but also producing a copolymerized polyester. It has been found that the composition of the steel can also be controlled.
  • the method of feeding fats and oils performed by the culture method of the present invention will be specifically described.
  • the specific substrate supply rate of the fat or oil as the carbon source is substantially constant throughout the cultivation period or during each of the cell growth phase and the polyester accumulation phase of the cultivation. It is fed to be a value.
  • the specific substrate supply rate is a culture variable defined as the amount of oil supplied per unit weight of the cell per unit time, that is, the acceleration of the oil flow per unit cell weight.
  • the net cell weight is the cell weight (dry cell weight) obtained by subtracting the contained polyester weight from the total cell weight. That is, the specific substrate supply rate is a value obtained from the following equation (1).
  • Total cell weight (g)-Polyester content (g) In the present invention, in order to set the specific substrate supply rate and control it to a constant value, it is necessary to predict the change in the net cell weight. is there.
  • the present inventors have conducted intensive studies on the change in the net bacterial cell weight, and as a result, have succeeded in estimating the growth curve of a practically usable net bacterial cell through preliminary experiments, and have completed the present invention.
  • the hold-up of the fats and oils present in the culture solution (the total (The volume ratio of fat to oil) is as small as 10% or less, and there is no significant change in the droplet diameter of fat or oil determined by the stirring and aeration conditions. Therefore, there is no large difference in the uptake rate of the substrate, which is governed by the droplet boundary area, and as a result, if the type of oil and fat and other culture conditions are the same, the net change in bacterial cell weight is It is considered that almost one growth curve can be approximated in the range of oil and fat flow acceleration where stable operation is possible.
  • the flow acceleration of the fat and oil is calculated based on the above formula (1) so that the specific substrate supply rate becomes a set constant value during the entire cultivation or during the specific phase described above. According to the calculation result, the flow rate of the fat or oil may be changed continuously (stepwise) or intermittently. .
  • the oxygen and carbon dioxide concentrations in the vented exhaust gas are measured, the net bacterial mass is estimated from the oxygen consumption rate or the carbon dioxide generation rate, and the specific substrate supply rate is calculated in real time. It can also be controlled. According to the study results of the present inventors, the above-mentioned respiratory characteristics greatly changed during the cell growth phase in which nitrogen or phosphorus was not withered and in the polyester accumulation phase after withering. Therefore, it is preferable to study the respiratory characteristics in the growth phase and the production phase in detail in advance.
  • a method of controlling the specific substrate supply rate of fats and oils to a certain value throughout the entire culture period It is divided into two phases of the accumulation period, and the value of the specific substrate supply rate is set differently in each phase, and the control is performed such that the set specific substrate supply rate is set within each phase.
  • the control is performed such that the set specific substrate supply rate is set within each phase.
  • the flow rate of the fat or oil In order to control the specific substrate feed rate of the fat or oil to a constant value during the entire period of the culture or during a specific phase of the culture, the flow rate of the fat or oil must be adjusted so as to satisfy the set specific substrate supply rate. Needs to be changed continuously (stepwise) or intermittently.
  • a computer can be used to control the flow acceleration.
  • it can be controlled automatically, but it is simple in that the flow acceleration can be operated manually.
  • the preset specific substrate supply speed value is not always completely satisfied, but the average specific substrate supply speed value set above must be satisfied. It should just be.
  • the culturing method of the present invention in which the specific substrate supply rate of the fat or oil is controlled to be a set constant value during the entire cultivation or within a specific phase of the culturing, Or a fixed amount of fat or oil during the culture period.
  • Conventional cultivation methods such as fed-batch cultivation in a large volume or empirically changing the amount of fats and oils added based on the specific substrate feed rate, were insufficient.Improved copolyester productivity and monomer unit composition Control of the ratio is achieved for the first time.
  • the entire culture period refers to the entire period from the start of culture to the end of culture in the main culture for polyester production.
  • the specific substrate supply rate is controlled so as to be constant throughout the entire culture period, that is, by selecting the same constant specific substrate supply rate during both the cell growth period and the polyester accumulation period. That is, the flow acceleration of the fats and oils is controlled so as to become the value.
  • the cell growth phase and the polyester accumulation phase of the culture are defined as the two phases in which the culture period is divided into two phases, where a sufficient amount of nitrogen or phosphorus is present in the medium, and the cell growth occurs.
  • the polyester accumulation rate is not so high
  • the first half of the phase (cell growth phase), the concentration of nitrogen or phosphorus in the medium decreases, the cell growth is restricted, and the polyester accumulation rate increases.
  • Different values of the specific substrate supply rate are set for each culturing phase, and during the period of each phase, the specific substrate supply rate is controlled to the set constant value to perform cultivation, thereby improving the productivity of the copolymerized polyester. The improvement and the control of the composition ratio of the monomer cut can be performed more efficiently.
  • the specific substrate supply rate range of the fats and oils applied in the method of the present invention depends on the kind of the fats and oils used and the cultivation phase, but is generally about 0.05 to 0.20 (g; fats) X (g; Net dry cell weight) (h; time) — preferably 0.06-0.15 (g; fat) X (g; net dry cell weight) d (h; time) — more preferably 0.07 ⁇ 0.12 (g; fat) X (g; net dry cell weight) (h; time) -1 .
  • the specific substrate supply rate is lowered (for example, 0.06 to 0.08 (g; fat) X (g; Net dry cell weight) haze (h; time) — culture can be set and the specific substrate supply rate can be changed depending on the cultivation phase.
  • Feed speed value (For example, 0.09 to 0.13 (g; fat) X (g; net dry cell weight) 1 ⁇ (h; time) — and the specific substrate supply rate in the polyester accumulation phase in the latter half of the culture.
  • the culture temperature may be any temperature at which the bacterium can grow, but is preferably 20 to 40 ° C, more preferably 25 to 35 ° C.
  • the culturing time is not particularly limited, but may be about 1 to 7 days, preferably 40 to 70 hours.
  • the control of the specific substrate supply rate, the selection of the type of fats and oils, and the restriction of nitrogen or phosphorus during the production of polyester described above are performed in the main culture in a polyester production medium.
  • the cells are usually pre-cultured in a seed medium or preculture medium in order to allow the cells to grow to some extent.
  • the same nutrients as those described above can be used for the seed medium and the pre-culture medium, and the culture temperature in these mediums is the same as that in the main culture in the polyester production medium.
  • the cultivation time is preferably 1-2 days, respectively.
  • an antibiotic such as kanamycin, ampicillin, or tetracycline corresponding to the resistance gene present in the vector may be added during culturing in the preculture medium.
  • the method for recovering the copolymerized polyester from the microbial cells is not particularly limited, and a known solvent extraction method, a physical crushing method, a chemical treatment, or the like can be employed.
  • the following method is used. it can.
  • the cells are separated from the culture solution using a centrifuge or the like, and the cells are washed with distilled water and methanol, and then dried.
  • Polyester is removed from the dried cells using an organic solvent such as black-mouthed form. Extract the file.
  • Cell components are removed from the organic solvent solution containing the polyester by filtration or the like, and a poor solvent such as methanol or hexane is added to the filtrate to precipitate polyester. The supernatant is removed by filtration or centrifugation and dried to recover the polyester.
  • FIG. 4 is a view showing a growth curve of a net dry cell weight per unit culture solution amount obtained from the curve.
  • Figure 2 is 0.
  • P (3HB-co-3HH) was produced as a copolymerized polyester.
  • the present invention does not limit the technical scope to these Examples, and is not limited to the production of P (3HB-co-3HH).
  • Ralstoniaeutropha PHB-4 / p J RDEE 32 dl 3 strains (T. Fukui, Y. Doi, Ap pl. Microbiol. Biotechnol., 49, 333-336, 1998) (hereinafter referred to as Re dl 3 strains) ) was cultured as follows.
  • the Red 13 strain was named Alcaligeneseutrophus AC32 under the accession number of FERM BP-6038, and was registered on August 7, 1997, at 1-1, Higashi 1-1, Tsukuba City, Ibaraki Prefecture, Japan. It has been deposited internationally under the Pudaest Convention at a National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Organism Depositary.
  • the seed medium contained 1 w / V% Meat-extract, 1 w / v% Bacto-Tryton ⁇ 0.2 w / v% Yeast-extract, 0.9 w / v% Na 2 P0 4 ⁇ 1 2H 2 0 , 0. 15 w / v% KH 2 P0 4, and the (pH6. 8).
  • composition of the preculture medium 1. lw / v% Na 2 P0 4 ⁇ 1 2H 2 0, 0. 19 w / v% KH 2 P0 4, 1. 29 w / v% (NH 4) 2 S0 4, 0. 1 w / v% M g S 0 4 ⁇ 7 H 2 0 N 2. 5 v% palm W Orein oil, 1. 0.
  • composition of the polyester production medium 0. 385 w / v% Na 2 P0 4 ⁇ 1 2H 2 0, 0. -067 w / v% KH 2 P0 4, 0. 291 w / v% (NH 4) 2 S ⁇ 4, 0. 1 w / v% Mg SO 4 '7H 2 0, 0. 5 v / v% trace metal salt solution (0, 1 ⁇ to 1. 6w / v 0 / o F e C l 3' 6H 2 0, 1 w / v % C a C 1 2 ⁇ 2 H 2 O, 0. 02 w / v% C o C 1 2 ⁇ 6H 2 O, 0.
  • the carbon source was palm kernel oil, a low-melting fraction obtained by separating palm kernel oil, and the specific substrate supply rate was 0.08, 0.09, 0.10 (g; fat) X (g; net dry cell weight) (h; time) -1 was fed.
  • the flow acceleration was measured while observing the thickness of the oil layer in the culture supernatant using palm kernel oil olein. It was determined using the adjusted and cultured results. In other words, based on the data on the change in the dry cell weight per unit culture volume in the preliminary experiment, linear growth was performed until the 36th hour of cultivation as shown in Fig. 1, and thereafter, the net weight per unit culture volume was determined. The weight of the dried cells was constant.
  • the specific substrate supply rate was 0.09 (g; fat) X (g; net dry cell weight) using the growth curve of the net dry cell weight obtained in FIG. - E (h; between time) in the case of setting to one 1, the flow acceleration of the theoretical value per unit volume of the culture broth palm kernel oil Orein (dotted line), actually fed in the following examples were fat The gradual change pattern (solid line) of the flow acceleration per unit culture volume is shown.
  • L indicates per liter of culture medium (total volume of medium, bacterial cells, and oils), and h indicates time.
  • 1.0 V / V% of the precultured seed was inoculated into a 10 L jar armamenter (MDL-1000, manufactured by Marubishi Biohenge) containing 6 L of a production medium.
  • the operating conditions were a culture temperature of 28 ° C., a stirring speed of 400 rpm, an aeration rate of 3.6 L / min, and a pH of 6.7 to 6.8.
  • a 14% aqueous ammonium hydroxide solution was used for pH control.
  • Culture was performed for 60 hours, and sampling was performed every 4 hours after the 16th hour of culture, the cells were collected by centrifugation, washed with methanol, lyophilized, and the weight of the dried cells was measured.
  • the gas chromatograph used was GC-17A manufactured by Shimadzu Corporation, and the one-shot ram was NEUTRA BOND-1 manufactured by GL Sciences (column length 25 m, column inner diameter 0.25 mm, liquid film thickness 0.4 ⁇ m). .
  • the temperature conditions were as follows: the initial temperature was raised from 100 to 200 ° C at a rate of 8 ° CZ, and The temperature was raised from 200 to 290 ° C at a rate of 30 ° C / min.
  • Table 2 shows the effect of controlling the specific substrate supply rate on the composition ratio and productivity of the copolyester.
  • Example 3 the setting value of the specific substrate supply rate was the lowest, 0.08 (g; fat) X (g; net dry cell weight) '' X (h; time) -1 It was well controlled when controlled. (Example 3)
  • the results shown in 5 to 7 were obtained. Tables 5 to 7 summarize the effects of the specific substrate supply rate on the productivity and 3HH content of the polyester for each mixed fat and oil.
  • the specific substrate supply rate was 0.09 (g; fat) X (g; net dry cell weight) — X (h ; Time) — 1 and control after the 36th hour of culture, which is the polyester accumulation phase, after 0.08 (g; fat) X (g; net dry cell weight) — i X (h; time) — 1 Culture was performed in the same manner as in Example 1 except for the above.
  • the biodegradability is improved.
  • foaming due to excessive supply of fats and oils can be suppressed well, and the culture can be stabilized.

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Abstract

　本発明の目的は、低コストで高生産性を確保しつつ、生分解性共重合ポリエステルの組成を任意に制御できる技術を開発することである。　本発明は、微生物による共重合ポリエステルの生産において、炭素源として使用する油脂の比基質供給速度を、培養の全期間を通じて一定値に制御するか、又は、培養の菌体増殖期とポリエステル蓄積期とで変化させ、それぞれ期間中は一定値に制御することを特徴とする培養方法である。また、本発明は、油脂の種類及び／又は油脂の比基質供給速度の制御値を選択することによって、生産される共重合ポリエステルの組成をコントロールする培養方法である。

Description

明細書
共重合ポリエステルの組成をコント口ールする培養方法 技術分野
本発明は、 微生物より生産される共重合ポリエステルの ,袓成をコントロールす る培養方法に関する。 背景技術
現在までに数多くの微生物において、 エネルギー貯蔵物質としてポリエステル を菌体内に蓄積することが知られている。 その代表例がポリ一 3—ヒドロキシ酪 酸 （以下、 P (3HB) と略す） である。 P (3HB) は熱可塑性高分子であり、 自然環境中で生物的に分解されることから、 環境にやさしいグリーンプラスチッ クとして注目されている。 しかし、 P (3HB) は結晶性が高いため、 硬くて脆 い性質を持っていることから実用的には応用範囲が限られる。 この為、 この性質 の改良を目的とした研究がなされてきた。
その中で、 3—ヒドロキシ酪酸 （以下、 3HBと略す） と 3—ヒドロキシ吉草 酸 （以下、 3HVと略す） からなる共重合体 P (3HB— c o— 3HV) の製造 方法が開発された （特開昭 57— 150393号公報；特開昭 59— 22019 2号公報；特表平 1 1— 500008号公報） 。 この P (3HB- C o - 3 HV ) は P (3HB) に比べると柔軟性に富むため、 幅広い用途に応用できると考え られた。 これらの特許文献における共重合体の製造方法は、 従来の P (3HB) の製造方法と同様に、 前段で菌体を増殖させ、 後段で窒素又はリンを制限して微 生物を培養し、 共重合体を製造するものである。 また P (3HB- c G-3HV ) については、 3 HVの含有率が増えるにつれて柔軟性が変化することから、 3 HVの組成比を制御する研究もなされてきた。 例えば、 特開昭 57- 1 5039 3号公報や特開昭 63— 269989号公報ではプロピオン酸を使用し、 また、 特公平 7— 79705号公報ではプロパン一 1—オールを使用し、 それらの培地 中への添加量を変えることにより 3 HVの含有率を変化させており、 3HV含有 率が 10〜9 Omo 1 %の P (3HB-c o-3HV) が製造されている。 しか しながら、 実際のところ P (3HB-c o-3HV) は 3HV含有率を増加させ ても、 それに伴う物性の変化が乏しく、 特にフィルム等に使用するのに要求され る程には柔軟性が向上しないため、 シャンプーポトルや使い捨て剃刀の取っ手等、 硬質成型体の分野にしか利用されなかった。
このような状況下、 上述の 3 HBと 3 HVの共重合体の欠点をカバーすること を目的とし、 3HBと 3HV以外のヒドロキシ酸、 例えば、 3—ヒドロキシプロ ピオン酸 （以下、 3HPと略す） 、 3—ヒドロキシへキサン酸 （以下、 3HHと 略す） 、 3—ヒドロキシオクタン酸 （以下、 3HOと略す） 、 3—ヒドロキシノ ナン酸 （以下、 3HNと略す） 、 3—ヒドロキシデカン酸 （以下、 3HDと略す ) 、 3—ヒドロキシドデカン酸 （以下、 3HDDと略す） 等を構成要素として含 む共重合ポリエステルが精力的に研究されている （P o i r i e r Y. ， Na wr a t h C. , S ome r v i l l e C， B I O/T E C HN O L O G Y, 1 3， 142— 150， 1 995年） 。 その中でも、 注目すべきものとして、 3 HBと 3 HHを含む共重合ポリエステル、 特に 3HBと 3 HHのみからなる共重 合体 P (3HB—c o— 3HH) と、 その製造方法についての研究がある （特開 平 5— 93049号公報；特開平 7— 265065号公報） 。 これらの特許文献 の P (3HB-c o-3HH) の製造方法は、 土壌より単離されたァエロモナス 'キヤビエ (Ae r omo n a s c a v i a e ) を用いて、 ォレイン酸等の脂 肪酸ゃォリーブオイル等の油脂から発酵生産するものである。 また、 P (3HB — c o— 3HH) の性質に関する研究もなされている （Y. D o i , S. K i t a mu r a , H. Ab e, Ma c r omo l e c u l e s 28， 4822— 4 823, 1 995年） 。 この報告では炭素数が 12個以上の脂肪酸を唯一の炭素 源としてァエロモナス 'キヤビエ (A. c a V i a e) を培養し、 3 HH含有率 が 1 1〜19mo 1 %の （3HB— c o— 3HH) を発酵生産している。 その 結果、 この P (3HB- C o-3HH) は、 3 HH含有率が増加するにしたがつ て、 P (3HB) の硬くて脆い性質から次第に柔軟な性質を示すようになり、 P (3 HB- c o— 3HV) を上回る柔軟性を示すことが明らかにされた。
また、 ァエロモナス■キヤビエ (A. c a V i a e ) のポリヒドロキシァノレ力 ン酸 （PHA) シンターゼ遺伝子をクローユングし、 この遺伝子を 90%以上の 高ポリヒドロキシ酪酸 （PHB) 蓄積能を有するラルストニア 'ユートロファ （ R. e u t r o p h a) に導入した組換え株を用いて、 脂肪酸を炭素源として P (3HB-c o-3HH) を生産するとの報告がなされた （T. F u k u i , Y. d o i , J . B a c t e r i o l . ， v o l . 1 79, No. 15， 4821— 4830， 1997年；特開平 10— 108682号公報） 。 このなかで、 オタ タン酸ナトリゥムを炭素源とすることで、 3HH含有率が 10〜20mo 1 %の P (3HB- c G-3HH) が生産できると報告している。 さらに、 最近になつ て、 上記組み換え株を用いてポリエステルを生産する際に、 複数種の炭素源を用 いる方法が開示され、 炭素源として用いる油脂や脂肪酸の炭素数が、 P (3HB - c D-3HH) の 3 HH含有率に影響を与えることが明らかとなった （特開 2 001 -340078号公報） 。
今後、 P (3HB-c o-3HH) 等の共重合ポリエステルのモノマーュニッ トの 成比、 特に 3 ΗΗ含有率を広い任意の範囲でコントロールして共重合体を 製造することができれば、 硬い共重合体から柔らかい共重合体まで発酵生産可能 となり、 テレビの筐体等のように硬さを要求されるものから、 糸やフィルム等の ような柔軟性を要求されるものまで、 幅広い分野への応用が期待できると考えら れている。
上述のように、 Ρ (3ΗΒ— c o— 3ΗΗ) 等の共重合ポリエステルについて は、 その組成比を任意に制御できる技術を確立することが実用化、 商業化を実現 する上で、 また消費者の要求を満足する上で、 この上なく重要となる。 もうひと つ実用化の障壁となっているのは生産コストの問題である。 それに対し、 従来の 共重合ポリエステルの製造方法においては、 3 HB以外のモノマーュニットを共 重合させるために、 あるいはその含有率を高めるために、 高価な特定の脂肪酸を 培地中に添加する必要があった （特表平 1 1一 500008号公報；特開 200 1 - 340078号公報） 。 さらに、 P (3HB— c o - 3 HH) の場合は、 既 に開示されているいずれの方法においても菌体の生産性が低く、 また 3 HH含有 率を向上させようとすると高価な炭素源が必要となるばかりでなくさらに生産性 が低下する傾向があり、 従来の方法は本ポリマーの実用化に向けた生産方法とし ては適用できない。 上述したように、 共重合ポリエステルについてはそのモノマ ーュニットの組成比を制御することが幅広い分野へ応用するために必要不可欠で ある。 そこで低コストで高い菌体生産性とポリマー含量を実現し、 かつ共重合ポ リエステルの組成を任意に制御することができる生産方法の開発が待望されてい た。 発明の要約
本発明は、 上記現状に鑑み、 生分解性共重合ポリエステルの組成を制御でき、 かつ低コストで、 高い生産性を実現する生産方法を提供するものである。
本発明者らは様々な検討を行い、 特に発酵原料に関しては、 価格、 供給安定性、 品質の安定性、 菌体あるいはポリマーの収率等を検討した結果、 共重合ポリエス テルを蓄積する微生物を、 安価な油脂を炭素源とする培地を使用して培養し、 高 い生産性を保持しつつ、 かつ、 炭素源として特に高価な脂肪酸等を使用しなくて もモノマー組成を任意の範囲内に良好に制御することに成功した。
すなわち、 本発明の要旨は、 微生物を用いて共重合ポリエステルを生産する際 に、 炭素源として使用する油脂の比基質供給速度を、 培養の全期間を通じて一定 値に制御する、 又は、 培養期間を菌体増殖期とポリエステル蓄積期の 2つのフ ーズに分けてそれぞれのフェーズで一定値に制御する培養方法に関する。 さらに、 油脂の種類及び 又は油脂の比基質供給速度の制御値を選択することによって、 生産される共重合ポリエステルの組成を任意にコントロールする培養方法に関す る。 発明の詳細な開示
以下に、 本発明を詳細に説明する。
本発明の共重合ポリエステルの組成をコントロールする培養方法は、 微生物に よる共重合ポリエステルの生産において、 炭素源として使用する油脂の比基質供 給速度を、 培養の全期間を通じて一定値に制御する、 又は、 培養の菌体増殖期と ポリエステル蓄積期とで変化させ、 それぞれ期間中は一定値に制御することを特 徴とする培養方法である。 このように、 当該培養方法は、 微生物を用いて生分解 性の共重合ポリエステルを生産する際に適用される。 本発明の培養方法が適用できる共重合ポリエステルとしては、 特に限定されず、 少なくとも 2種のモノマーュ-ットを重合して得られる共重合ポリエステルであ る。 当該共重合ポリエステルとしては、 具体的には、 3HBと 3HHからなる共 重合ポリエステル p (3HB- c 0 - 3HH) や、 3 H Bと 3 HHと 3 H Vの 3 成分からなる共重合体、 その他シユードモナス (P s e u dmo n a s ) 属細菌 によって生産される 3 HB、 3HH、 3 HO, 3HD、 3HDD等の多くの成分 をその構成要素として含む共重合体を、 その代表的なものとして挙げる事ができ る （I . K. P. Ta n, K. S. Kuma r, M. T h e a nm a 1 a r , S. N. G a n, B. Go r d o n I I I， Ap 1. M i c r o b i o l . B i o t e c hn o l . , 47, 207— 21 1， 1997 ; R. D. A s h b y , T. A. F o g l i a , A p 1. M i c r o b i o l . B i o t e c hn o l . ， 49， 431 -437, 1 998 ) 。 この中でも、 共重合ポリエステルのモノ マーユニットの組成比、 特に 3 HHの含有率が変化することにより、 非常に幅広 くポリエステルの特性が変化するという点で、 そのモノマーュニットの一つとし て 3 HHを含む共重合体が好ましく、 P (3HB- c o- 3HH) がより好まし い。
本発明の培養方法において、 使用する微生物としては特に制限はなく、 天然か ら単離された微生物や、 菌株の寄託機関 （例えば I FO、 ATCC等） に寄託さ れている微生物等を使用できる。 具体的には、 アルカリゲネス (A 1 c a 1 i g e n e s ) 属、 ラノレストニア (R a 1 s t o n i a ) 属、 ァエロモナス (A e r o m o n a s ) fe、 シユードモナス 、P s e u d omo n a s ) 属、 ェシエリキ ァ (E s c h e r i c h i a) 属等の細菌類を使用することができる。
また、 上記微生物が、 野生型の状態では目的とする共重合体を生産できない、 もしくはその生産量が低い場合には、 上記微生物に、 目的とする共重合ポリエス テルの重合酵素遺伝子を導入して形質転換し、 得られた形質転換微生物を用いる ことができる。 形質転換微生物を作製する場合、 ポリエステル重合酵素遺伝子を 含む組換えベクターを利用する等の一般的な方法を用いることができ、 該べクタ 一には、 その菌体内で自律的に増殖しうるプラスミドベクターを用いることがで きる。 また、 該ポリエステル重合酵素遺伝子を直接宿主の染色体に組み込んでも 良く、 宿主としては、 アルカリゲネス (A l c a l i g e n e s) 属、 ラルスト ニァ (R a 1 s t o n i a ) 属、 ァエロモナス (Ae r omo n a s) 属、 シュ ードモナス (P s e u d omo n a s ) 属、 ェシエリキア (E s c h e r i c h i a) 属等の細菌類を用いることができる。
本発明の共重合ポリエステルの生産において使用されるポリエステル重合酵素 遺伝子としては、 特に限定されないが、 ァエロモナス 'キヤビエ (Ae r omo n a s c a v i a e) より単離された遺伝子が好ましく、 例えば、 特開平 10 - 108682号公報に記載されている遺伝子断片を用いることができる。
また、 微生物に組換えベクターを導入するには、 公知の方法により行うことが できる。 例えば、 接合法、 カルシウム法やエレクト口ポレーシヨン法等を用いる ことができる。
本発明に用いられる微生物の一例として、 ラルストニア 'ユートロファ (R a 1 s t o n i a e u t r o p h a) に、 ァエロモナス ■キヤビエ (A e r o m o n a s c a v i a e) 由来のポリエステル重合酵素遺伝子を導入した、 Ra l s t o n i a e u t r o p h a PHB— 4/p J RDEE 32 d l 3株 （ T. Fu k u i , Υ. D ο i , A ρ 1. Mi c r o b i o l . B i o t e c h η ο 1. ， 49, 333-336, 1998) を好ましく用いることができる。 なお、 当該 R a l s t o n i a e u t r o p h a PHB- 4/p J RDE E 32 d 13株は、 A l c a l i g e n e s e u t r o p h u s AC 32の 名称で、 FERM B P— 6038の受託番号にて、 平成 9年 8月 7日付で、 日 本国茨城県つくば巿東 1丁目 1番地 1中央第 6にある独立行政法人産業技術総合 研究所特許生物寄託センターに、 プダぺスト条約に基づいて国際寄託されている。 本発明の培養方法において、 共重合ポリエステルの生産には、 発酵原料として、 価格、 供給安定性、 品質の安定性、 菌体あるいはポリエステルの収率等の点から、 安価な油脂を主要な炭素源として使用する。 ここで 「主要な」 とは、 炭素源全体 の 50%以上を占めることを意味する。 油脂以外の炭素源としては、 例えば、 グ ルコース、 フラクトース、 スクロース、 ラタトース等の糖類を用いることができ る。
炭素源以外の栄養源としては、 窒素源、 無機塩類、 ビタミン類、 その他の一般 的な有機栄養源を含む培地が使用できる。 窒素源としては、 例えば、 アンモニア、 塩化アンモニゥム、 硫酸アンモユウム、 リン酸アンモニゥム等のアンモニゥム塩 等の無機窒素源；ペプトン、 肉エキス、 酵母エキス等の有機窒素源が挙げられる。 無機塩類としては、 例えば、 リン酸第一カリウム、 リン酸第二カリウム、 リン酸 マグネシウム、 硫酸マグネシウム、 塩化ナトリウム等が挙げられる。 ビタミン類 としては、 例えば、 ビタミン B 1、 ビタミン B 1 2、 ビタミン C等が挙げられる。 その他の有機栄養源としては、 例えば、 グリシン、 ァラニン、 セリン、 スレオニ ン、 プロリン等のアミノ酸等が挙げられる。 し力 しながら、 生産コスト抑制の観 点からは、 ペプトン、 肉エキス、 酵母エキス等の有機窒素源；グリシン、 ァラニ ン、 セリン、 スレオニン、 プロリン等のァミノ酸； ビタミン B 1、 ビタミン B 1 2、 ビタミン C等のビタミン類の使用は最少量とする方が好ましい。 特に、 高価 な有機窒素源であるペプトン、 酵母エキス、 肉エキス等の使用は最少量に留める 方が好ましい。
一般に、 微生物によるポリエステルの生産は、 窒素やリン等の、 増殖に必要な 栄養素をある程度制限した条件下で好ましく達成される。 本発明においても、 そ のような栄養制限を行うことができ、 そのなかでも、 窒素又はリンを制限するの がより好ましく、 窒素は制限せずにリンを制限するのがさらに好ましい。 なお、 リンを制限するというのは、 培地中にリン原子を全く含まないということではな く、 増殖に必要とされる栄養源としてのリンが最低限含まれているということで あり、 すなわち菌体の増殖量がリンによって規定されている状態をいうのであつ て、 培地中に無機塩として少量含まれるものを排除するものではない。
本発明において炭素源として使用する油脂としては、 大豆油、 コーン油、 綿実 油、 パーム油、 パーム核油、 ヤシ油、 落花生油等の比較的安定的に供給される天 然油脂；これらの油脂を分別して得られる各画分 （例えば、 パーム Wォレイン油 (パーム油を 2回無溶媒分別した低融点画分） 、 パーム核油ォレイン （パーム核 油を 1回無溶媒分別した低融点画分） 等） である分別油脂；これら天然油脂やそ の画分を化学的あるいは生物化学的に処理した合成油； さらにはこれらを混合し た混合油等が使用できる。 このなかでも、 天然油脂、 分別油脂が好ましく、 コス トの点からは天然油脂や安価な分別油脂を使用するのがより好ましい。 ここで、 使用する油脂の種類を適宜選択することによって、 共重合ポリエステ ルを構成するモノマーュニットの種類やその組成比を制御することができる。 例 えば、 3 HHを含む共重合ポリエステルの生産において、 3 HH含有率の高い共 重合ポリエステルを得たい場合には、 油脂の構成脂肪酸としてラウリン酸を含有 する油脂、 俗にラウリン油脂と称される油脂を使用することが好ましい。 構成脂 肪酸としてラウリン酸を含有する油脂としては、 パーム核油やヤシ油等の天然油 脂、 パーム核油ォレイン等の分別油脂や、 それらラウリン油脂を含む混合油等が 挙げられる。
さらに具体的に P (3HB- C G-3HH) の場合を説明すると、 ラウリン系 の油脂を用いた場合、 4〜2 Omo 1 %の比較的高い 3HH含有率を有する P ( 3HB- C G-3HH) を得ることができ、 大豆油、 コーン油、 綿実油、 パーム 油、 落花生油あるいはこれらの分別油脂等を用いた場合は 1〜1 Omo 1 %の比 較的低い 3 HH含有率の P (3HB— c o— 3HH) が得られる。 さらにこれら の油脂を 2種類あるいはそれ以上混合した油脂を用い、 その混合割合を任意に変 化させることで、 P (3 HB- c o - 3 HH) の 3 HH含有率を任意にコント口 ールできる。
また、 炭素源として使用する油脂が、 その構成脂肪酸としてラウリン酸を含む 油脂であり、 かつリン制限下で培養することが特に好ましい。
一般に、 微生物の培養において油脂を添加する場合、 その添加方法としては、 —度に大量に添加する、 分割して添加する、 連続的にあるいは間欠的に流加する 等の方法が考えられるが、 本発明者の検討結果によれば、 一度に多量添加すると 生成する脂肪酸により細胞毒性が現れたり、 脂肪酸に起因する発泡が激しくなり、 実際のオペレーションが困難な状況に陥ることがあることが判つた。 したがつて、 本発明においては、 炭素源である油脂を、 ポンプ等を使用して連続流加あるいは 間欠流加する方法を採択する。 本発明者らが炭素源である油脂の最適な添加方法 を検討した結果、 その流加方法を工夫することにより、 発泡等の操作上の問題を 回避するばかりではなく、 生産される共重合ポリエステルの組成をも制御できる ことを見いだした。 以下、 本発明の培養方法で実施される油脂の流加方法につい て具体的に記述する。 本発明の培養方法において、 炭素源である油脂は、 その比基質供給速度が、 培 養の全期間を通じて、 又は、 培養の菌体増殖期とポリエステル蓄積期のそれぞれ のフェーズ期間内で、 ほぼ一定値となるよう流加される。
ここで、 比基質供給速度とは、 単位時間に正味の菌体重量あたり供給される油 脂の量、 つまり、 正味の菌体重量あたりの油脂流加速度として定義される培養変 数である。 また、 正味の菌体重量とは、 全菌体重量から含有するポリエステル重 量を差し引いた菌体重量 （乾燥菌体重量） である。 すなわち、 比基質供給速度は 以下の式 （1 ) より求められる値である。
比基質供給速度 =油脂流加速度 ( g / h ) ノ正味の菌体重量 （g )
=単位時間あたりの油脂の供給量 （g Z h ) /
(全菌体重量 （g ) —ポリエステル含有量 （g ) ) 本発明において、 比基質供給速度を設定し、 それを一定値に制御するためには 正味の菌体重量の変化を予測する必要がある。 本発明者らは正味の菌体重量の変 化について鋭意検討した結果、 実用に耐えうる正味の菌体の増殖曲線を予備実験 を通じて推定することに成功し、 本発明を完成するに至った。
本発明者らの検討結果によれば、 発泡を抑制し、 安定した培養を実現できる油 脂の流加速度範囲では、 培養液中に存在する油脂のホールドアップ （全培養液量 (培地 +菌体 +油脂） に占める油脂の容積割合） は 1 0 %以下と小さく、 攪拌条 件と通気条件によって決定される油脂の液滴径には大きな変化は見られない。 し たがって、 液滴界面積に支配される基質の取り込み速度にも大きな差がなく、 結 果的に油脂の種類及び他の培養条件が同じであれば、 正味の菌体重量の変化は、 安定運転可能な油脂の流加速度範囲では、 ほぼひとつの増殖曲線で近似して差し 支えないと考えられる。
また、 生分解性ポリエステルの生産は、 後述するように窒素あるいはリンを制 限した培養条件下で行われるので、 窒素あるいはリンが枯渴した後は、 正味の菌 体量はほとんど変化せず、 一定となる。 したがって、 油脂の種類と培養条件が決 まれば、 その条件下で油脂の流加速度を、 油脂供給が不十分とならず、 また過剰 供給にならない範囲内で適当に変化させ （実操作では培養上清中の油脂層の厚さ を観察しながら流加速度を調整する） 、 正味の菌体量の変化のデータを採取すれ ば良い。 このようにして正味の菌体の増殖曲線を得ることができる。 それを基本 に、 比基質供給速度が培養の全期間、 又は、 上記特定のフェーズ期間内では設定 されたある一定値となるように、 上記式 （1 ) に基づいて油脂の流加速度を計算 し、 その計算結果にしたがって、 油脂の流加速度を連続的 （段階的） あるいは間 欠的に変化させて流加すればよい。 .
また、 間接的な方法としては、 通気排ガス中の酸素濃度、 二酸化炭素濃度を測 定して、 酸素消費速度あるいは二酸化炭素発生速度から正味の菌体量を推定して リアルタイムで比基質供給速度を制御することもできる。 し力、しな力 Sら、 本発明 者らの検討結果によれば、 窒素あるいはリンが枯渴していない菌体増殖期と枯渴 後のポリエステル蓄積期では上述の呼吸特性に大きな変化が認められるため、 予 め増殖期及ぴ生産期の呼吸特性を詳細に調べておくことが好ましい。
本発明において、 油脂の比基質供給速度を一定値に制御する場合、 培養の全期 間を通じて油脂の比基質供給速度をある一定値に制御する方法と、 培養全期間を 菌体増殖期とポリエステル蓄積期の 2つのフェーズに分け、 それぞれのフエ一ズ において異なる比基質供給速度の値を設定し、 それぞれのフェーズ期間内では設 定された一定の比基質供給速度となるように制御する方法の 2通りがあり、 どち らの方法を用いても構わない。 油脂の比基質供給速度を、 培養の全期間中あるい は培養の特定のフェーズ期間内、 一定値に制御するためには、 設定された比基質 供給速度の値を満たすように油脂の流加速度を連続的 （段階的） にあるいは間欠 的に変化させる必要がある。
油脂の流加速度を連続的 （段階的） に変化させるには、 例えばコンピューター を利用して流加速度を制御することができる。 また、 間欠的あるいは段階的に変 化させる場合は、 自動で制御することもできるが、 手動でも流加速度の操作が可 能である点で、 簡便である。 間欠的あるいは段階的に変化させる場合、 厳密には 予め設定された比基質供給速度の値を常に完全に満たすわけではないが、 その平 均値として上記設定された比基質供給速度の値を満たしていればよい。
このように、 油脂の比基質供給速度を、 培養の全期間、 又は、 培養の特定のフ エーズ期間内で、 設定されたある一定値となるように制御する本発明の培養方法 により、 培養初期に所定量の油脂を全量添加したり、 培養期間中一定の油脂流加 量で流加培養したり、 比基質供給速度に基づかず経験的に油脂の添加量を変化さ せるといった従来の培養方法では不十分であった、 共重合ポリエステルの生産性 の向上とモノマーュニットの組成比の制御が初めて達成される。
本明細書において、 培養全期間というのは、 ポリエステル生産のための本培養 における培養開始から培養終了時までの全期間のことである。 また、 比基質供給 速度が培養全期間を通じて一定値となるように制御するというのほ、 すなわち菌 体増殖期とポリエステル蓄積期の両方の期間で同じ一定値の比基質供給速度を選 択してその値となるように油脂の流加速度を制御するということである。 ここで いう、 培養の菌体増殖期やポリエステル蓄積期というのは、 培養期間を大きく 2 つのフェーズに分けた場合の、 それぞれ、 培地中に窒素あるいはリンが十分量存 在し、 菌体増殖が活発に行われ、 ポリエステルの蓄積速度がそれほど大きくない 前半のフェーズ （菌体増殖期） と、 培地中の窒素あるいはリンの濃度が低下し、 菌体増殖が制限され、 ポリエステルの蓄積速度が大きくなつた後半のフェーズ （ ポリエステル蓄積期） である。 それぞれの培養フェーズによって異なる比基質供 給速度の値を設定し、 各フェーズの期間内では比基質供給速度をその設定された 一定値に制御して培養することによって、 共重合ポリエステルの生産性の向上と、 モノマーュ-ットの組成比の制御をより効率的に行うことができる。
本発明の方法で適用される油脂の比基質供給速度の範囲は、 使用する油脂の種 類や培養のフェーズにもよるが、 おおむね 0. 05〜0. 20 (g ;油脂） X ( g ；正味乾燥菌体重量） (h ；時間） — 好ましくは 0. 06〜0. 1 5 (g ；油脂） X (g ；正味乾燥菌体重量） ェ (h ；時間） — より好ましく は 0. 07〜0. 1 2 (g ；油脂） X (g ；正味乾燥菌体重量） (h ；時 間） —1である。
本発明において、 比基質供給速度が小さいほど P (3HB- c 0 - 3HH) の 3 HH含有率が上昇することが初めて見いだされた。 従って、 3 HH含有率の高 い P (3HB- C G-3HH) を得たい場合には、 比基質供給速度を低く （例え ば 0. 06〜0. 08 (g ；油脂） X (g ；正味乾燥菌体重量） ェ ズ (h ；時 間） — 設定して培養すればよい。 また、 培養のフェーズによって比基質供給 速度を変化させる場合には、 培養前半の菌体増殖期における比基質供給速度の値 を高め （例えば 0. 0 9~0. 1 3 (g ；油脂） X (g ；正味乾燥菌体重量） 一 τ (h ；時間） — に、 培養後半のポリエステル蓄積期における比基質供給速 度の値を低め （例えば 0. 06〜0. 08 (g ；油脂） X (g ；正味乾燥菌体重 量） — X (h ；時間） — ^ に設定することで、 共重合ポリエステルの生産性を 低下させることなく、 より効率的に 3 HH含有率を向上させることができる。 また、 上述したように、 油脂の種類を適宜選択することでも、 生産される共重 合ポリエステルの組成を制御することが可能である。 従って、 油脂の種類、 ある いは油脂の比基質供給速度の制御値を変えることにより、 さらには両者の適切な 組み合わせを選択することにより、 生産される共重合ポリエステルの組成、 例え ば P (3HB- c 0 - 3HH) の 3 HH含有率等を、 所望の組成やその割合に制 御することが可能となる。
培養温度は、 その菌の生育可能な温度であればよいが、 20〜40°Cが好まし く、 より好ましくは 2 5〜 3 5 °Cである。 培養時間としては、 特に制限はないが、 1〜 7日程度で良く、 好ましくは 40〜 70時間である。
以上説明したポリエステル生産の際の、 比基質供給速度の制御、 油脂の種類の 選択や、 窒素又はリンの制限等は、 ポリエステル生産培地での本培養で行うもの である。 なお、 ポリエステル生産培地での本培養の前に、 菌体をある程度まで増 殖させておくために、 通常、 種培地や前培養培地であらかじめ培養する。 その場 合には、 種培地や前培養培地で用いる栄養源等は上述と同様のものを用いること ができ、 これら培地での培養温度はそれぞれ上記ポリエステル生産培地での本培 養と同程度でよく、 培養時間はそれぞれ好ましくは 1〜2日である。
また、 形質転換微生物を使用する際は、 例えば前培養培地で培養中に、 ベクタ 一に存在する耐性遺伝子に対応するカナマイシン、 アンピシリン、 テトラサイク リン等の抗生物質を添加しても良い。
本発明において、 共重合ポリエステルを微生物菌体から回収する方法としては 特に限定されず、 公知の溶媒抽出法、 物理的破砕法、 化学的処理等が採用でき、 例えば、 次のような方法が使用できる。 培養終了後、 遠心分離器等を用いて、 培 養液から菌体を分離し、 その菌体を蒸留水及ぴメタノール等により洗浄した後、 乾燥させる。 この乾燥菌体から、 クロ口ホルム等の有機溶剤を用いてポリエステ ルを抽出する。 このポリエステルを含んだ有機溶剤溶液から、 濾過等によって菌 体成分を除去し、 そのろ液にメタノールやへキサン等の貧溶媒を加えてポリエス テルを沈殿させる。 濾過や遠心分離によって上澄み液を除去し、 乾燥させてポリ エステルを回収する。
得られたポリエステルのモノマーユニットの分析は、 例えば、 ガスクロマトグ ラフ法ゃ核磁気共鳴法等により行う。 図面の簡単な説明
図 1は、 パーム核油ォレインを用いた 2回の予備実験における、 単位培養液量 あたりの正味の乾燥菌体重量 （g/L) の実測値 （図中の▲、 ♦) の変化と、 そ れより求められる単位培養液量あたりの正味の乾燥菌体重量の増殖曲線を示す図 である。
図 2は、 比基質供給速度を 0. 09 (g ；油脂） X (g ；正味乾燥菌体重量） -1 X (h ；時間） —1に設定した場合の、 パーム核油ォレインの単位培養液量あ たりの流加速度 （ （g— o i 1 /h) L) の理論値 （点線） と、 実際に実施例で 流加した油脂の単位培養液量あたりの流加速度の段階的な変化パターン （実線） を示す図である。 発明を実施するための最良の形態
以下、 実施例により本発明をさらに具体的に説明する。 以下の実施例において は、 いずれも共重合ポリエステルとして、 P (3HB- c o - 3HH) を生産し た。 もちろん本発明はこれら実施例にその技術範囲を限定するものではなく、 P (3 HB- c o— 3HH) の生産に限られるものではない。
例えば、 用いる微生物やポリエステル重合酵素遺伝子の種類を変えたり、 炭素 源として他の油脂を用いたり、 特定の脂肪酸を添加することによって、 P (3H B- c o - 3HH) 以外の他の共重合体を生産することが可能である。
なお、 下記の各表において、 比基質供給速度の単位は、 特に断りのない限り、 (g ；油脂） X (g ；正味乾燥菌体重量） 一 X (h ；時間） 一1とする。 (実施例 1 )
R a l s t o n i a e u t r o p h a PHB-4/p J RDEE 32 d l 3株 （T. Fu ku i , Y. D o i， Ap p l . Mi c r o b i o l . B i o t e c h n o l . ， 49， 333 -336, 1998) (以下、 Re d l 3株と略 す） を次のように培養した。 なお、 R e d 13株は、 A l c a l i g e n e s e u t r o p h u s AC 32の名称で、 FERM B P— 6038の受託番号 にて、 平成 9年 8月 7日付で、 日本国茨城県つくば市東 1丁目 1番地 1中央第 6 にある独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに、 プダぺスト条 約に基づいて国際寄託されている。
種培地の糸且成は、 1 w/ V % Me a t— e x t r a c t、 1 w/ v% B a c t o— T r y t o n^ 0. 2 w/ v%Ye a s t— e x t r a c t、 0. 9 w/v%N a 2P04■ 1 2H20, 0. 15 w/v%KH2P04, (pH6. 8 ) とした。
前培養培地の組成は、 1. lw/v% Na 2P04■ 1 2H20、 0. 19 w /v% KH2P04、 1. 29 w/v% (NH4) 2S04、 0. 1 w/v% M g S 04 · 7 H20N 2. 5 v %パーム Wォレイン油、 0. 5 v / v % 微 量金属塩溶液 （0. 11^塩酸に1. 6 w/v % F e C l 3 ' 6H20、 1 w/ v % C a C 12 · 2H2O 0. 02 w/v % C o C 12■ 6 H20, 0. 0 1 6 w/v% Cu SO4 ' 5H2〇、 0. 0 1 2 w/v % N i C 12 · 6 H2 Oを溶かしたもの) 、 5 X 1 0"6w/ v % カナマイシンとした。
ポリエステル生産培地の組成は、 0. 385 w/v% Na 2P04■ 1 2H2 0、 0. -067 w/v% KH2P04、 0. 291 w/v% (NH4) 2S〇4、 0. 1 w/v% Mg SO4 ' 7H20、 0. 5 v / v % 微量金属塩溶液 （ 0 , 1赚酸に1. 6w/v0/o F e C l 3 ' 6H20、 1 w/ v % C a C 12 · 2 H2O、 0. 02 w/v% C o C 12■ 6H2O、 0. 016 w/ v % C u S 04 · 5H2O、 0. 0 1 2 w/v% N i C 12 · 6H20を溶かしたもの） 、 0. 05 w/ v%B I OSPUREX200K (消泡剤： コグニスジャパン社製 ) とした。 炭素源は、 パーム核油を分別した低融点画分であるパーム核油ォレイ ンを用い、 培養全期間を通じ、 比基質供給速度がそれぞれ、 0. 08、 0. 09、 0 . 1 0 ( g ；油脂） X ( g ；正味乾燥菌体重量） ( h ；時間） — 1となる ように流加した。
比基質供給速度の制御の基本となる正味の乾燥菌体重量の増殖曲線については、 予備実験として、 パーム核油ォレインを用いて培養上清中の油脂層の厚さを観察 しながら流加速度を調整して培養した結果を用いて求めた。 すなわち、 予備実験 における単位培養液量あたりの正味の乾燥菌体重量の変化のデータから、 図 1の ように培養 3 6時間目までを直線増殖とし、 それ以降は単位培養液量あたりの正 味の乾燥菌体重量は一定としたものを採用した。
図 2及び表 1には、 図 1で求めた正味の乾燥菌体重量の増殖曲線を用い、 比基 質供給速度を 0 . 0 9 ( g ；油脂） X ( g ；正味乾燥菌体重量） —ェ ( h ；時 間） 一 1に設定した場合の、 パーム核油ォレインの単位培養液量あたりの流加速 度の理論値 （点線） と、 実際に以下の実施例で流加した油脂の単位培養液量あた りの流加速度の段階的な変化パターン （実線） を示した。
なお、 図 1， 2及び下記表 1〜8において、 Lは、 培養液量 （培地、 菌体、 油 脂の合計容量） 1 リ ッ トルあたりを示し、 hは時間を示すものである。
表 1
培養時間 油脂流加速度 流加速度の段階的変化
(h) ((g - oil/h) /し） ((g-oil/h)/L)
0 0.00 0.58
14 1 .1 6 1.24
1 6 1.32 1 .49
20 1 .65 1.82
24 1.98 2.1 4
28 2.31 2.48
32 2.64 2.81
36 2.97 2.97
40 2.97 2.97
44 2.97 2.97
48 2.97 2.97
52 2.97 2.97
56 2.97 2.97
60 2.97 2.97 R e d 13株のグリセ口一ルストツク （ 50 /i 1 ) を種培地 （10ml) に接 種して 24時間培養した後、 3 Lの前培養培地を入れた 5 Lジャーフアーメンタ 一 （丸菱バイォェンジ社製 MD L— 500型） に 0. 2 v/v %接種した。 運転 条件は、 培養温度 30 °C、 攪拌速度 500 r p m、 通気量 1. 8 L/m i nとし、 pHは 6. 7~6. 8の間でコントロールしながら 28時間培養した。 pHコン ト口一ルには 7 %水酸化ァンモニゥム水溶液を使用した。
ポリエステル生産培養は、 6 Lの生産培地を入れた 10 Lジャーフアーメンタ 一 （丸菱バイオェンジ社製 MDL— 1000型） に前培養種母を 1. 0 V / V % 接種した。 運転条件は、 培養温度 28°C、 攪拌速度 400 r pm、 通気量 3. 6 L/m i nとし、 pHは 6. 7力 ら 6. 8の間でコントロールした。 pHコント ロールには 14%水酸化アンモニゥム水溶液を使用した。 培養は 60時間行い、 培養 16時間目以降 4時間おきにサンプリングし、 遠心分離によって菌体を回収 し、 メタノールで洗浄後、 凍結乾燥し、 乾燥菌体重量を測定した。
得られた乾燥菌体約 l gに 100mlのクロロホルムを加え、 室温で一昼夜攪 拌して、 菌体内のポリエステルを抽出した。 菌体残渣をろ別後、 エバポレーター で総容量が約 3 Omlになるまで濃縮後、 約 9 Omlのへキサンを徐々に加え、 ゆっくり攪拌しながら、 1時間放置した。 析出したポリエステルをろ別後、 50 °Cで 3時間真空乾燥した。 乾燥ポリエステルの重量を測定し、 菌体内のポリエス テル含量を算出した。
また、 得られた乾燥ポリエステル約 20 m gに 2 m 1の硫酸一メタノ一ル混液 (15 : 85) と 2m 1のクロ口ホルムを添加して密栓し、 100°Cで 140分 間加熱することでポリエステル分解物のメチルエステルを得た。 冷却後、 これに 1. 5 gの炭酸水素ナトリウムを少しずつ加えて中和し、 炭酸ガスの発生が止ま るまで放置した。 4 m 1のジイソプロピルエーテルを添加してよく混合した後、 遠心して、 上清中のポリエステル分解物のモノマーユニットの組成をキヤビラリ 一ガスクロマトグラフィーにより分析した。 ガスクロマトグラフは島津製作所社 製 GC—17A、 キヤビラリ一力ラムは GLサイエンス社製 NEUTRA BO ND— 1 (カラム長 25 m、 カラム内径 0. 25 mm、 液膜厚 0. 4 μ m) を用 いた。 温度条件は、 初発温度 100〜200°Cまで 8°CZ分の速度で昇温、 さら に 2 0 0〜 2 9 0 °Cまで 3 0 °C /分の速度で昇温した。
比基質供給速度の制御が共重合ポリエステルの組成比及び生産性に与える影響 を表 2に示した。
表 2
P(3HB— co— 3HH)生産量（g L) 比基質供給速度 培養 24 - h 培養 36 - h 培養 48 - h 培養 60 - h
0.08 ~ 1 ~ 15 40 " 63 "-" ~~
0.09 3 18 43 66
0.10 3 21 46 68
3HH含有率（mol%) 比基質供給速度 Ι 24 - h 培養 36— h 培養 48 - h 培養 60 - h
0.08 18.2 15.1 12.4 1 1.1
0.09 15.8 12.2 10.3 8.9
0.10 13.2 10.2 8.5 7.5
この結果から、 比基質供給速度を低く制御するほど生産性は少し低下するが、 共重合ポリエステル中の 3 HH含有率が向上する事がわかった。 また培養中の発 泡は比基質供給速度の設定値が低いほど良好に抑制される様子が観察された。
(実施例 2 )
パーム核油ォレインのかわりに大豆油を用いた以外は、 実施例 1と同様の培地 •条件で培養を行い、 表 3に示す結果を得た。 表 3
P(3HB— co—3HH)生産量（g L) 比基質供給速度培養 24- h培養 36 - h培養 48- -h培養 60— h
0.08 2 33 55 62
0.09 4 39 60 64
0.10 3 41 60 68
3HH含有率（mol%) 比基質供給速度培養24- h培養36- h培養48- h培養 60 - h
0.08 13.2 6.7 5.3 4.1
0.09 12.9 5.8 4.2 3.4
0.10 13.8 4.9 3.3 3.2
表 3に示されているように、 大豆油でもパーム核油ォレインと同様に比基質供 給速度を低く制御する事によって、 ポリエステル中の 3 HH含有率が向上する事 がわかった。 しかしながら、 同じ比基質供給速度条件下での 3 HH含有率を大豆 油と実施例 1のパーム核油ォレインで比較すると、 大豆油の方が明らかに低く、 基質として使用する油脂の違いによって、 同じように比基質供給速度を同じ値に 制御しても得られる 3 HH含有率に差があることがわかった。
発泡については、 実施例 1と同様に比基質供給速度の設定値が最も低い 0. 0 8 ( g ；油脂） X (g ；正味乾燥菌体重量） '' X (h ；時間） —1に制御した時 に良好に抑制された。 (実施例 3 )
基質としてパーム核油ォレインのかわりに、 コーン油、 綿実油、 パーム Wォレ イン油、 パーム核油、 ヤシ油、 落花生油を用い、 比基質供給速度をそれぞれの油 脂について、 0. 0 6 (g ；油脂） X (g ；正味乾燥菌体重量） (h ；時 間） — 1及び 0. 1 2 (g ；油脂） X (g ；正味乾燥菌体重量） (h ；時間 ) 一1に制御した以外は、 実施例 1と同様の培地 ·条件で培養を行い、 表 4に示 す結果を得た。 表 4には、 比基質供給速度がポリエステルの生産性及び 3 HH含 有率に与える影響をそれぞれの油脂についてまとめた （培養 6 0時間目の結果の み比較した） 。
Figure imgf000020_0001
表 4に示されているように、 いずれの油脂においても比基質供給速度を低く制 御する事によって、 生産性は少し低下するが共重合ポリエステル中の 3 HH含有 率が向上する事がわかった。 また培養 60時間目で到達する 3 HH組成について は、 基質として使用する油脂の違いによって、 比基質供給速度を同じ値に制御し ても明らかな差が認められ、 ラウリン系の油脂であるヤシ油、 パーム核油では、 約 7〜14mo 1 %の比較的高い 3 HH含有率を有する P (3HB- c o- 3H H) が得られ、 コーン油、 綿実油、 パーム Wォレイン油、 落花生油では、 約 3〜 6mo 1 %の比較的低い 3HH含有率を有する P (3HB- c o- 3HH) が得 られることがわかった。 表 4の結果は、 油脂の種類あるいは比基質供給速度の設 定値を選択し、 両者を適切に組み合わせることにより、 高い生産性を確保しなが ら、 所望の 3 HH含有率を有する共重合ポリエステルを得ることが可能となるこ とを示している。
(実施例 4)
基質としてパーム核油ォレインと大豆油の混合油 3種類、 つまり、 混合油 A ( パーム核油ォレインノ大豆油 = 75Z 25 (v/v) ) 、 混合油 B (パーム核油 ォレイン Z大豆油 =50/50 (v/v) ) 、 混合油 C (パーム核油ォレインノ 大豆油 =25/75 (v/v) ) を用いた以外は、 実施例 1と同様の培地，条件 で培養を行い、 表 5〜 7に示す結果を得た。 表 5〜7には比基質供給速度がポリ エステルの生産性及ぴ 3 HH含有率に与える影響をそれぞれの混合油脂について まとめた。
表 5
混合油 A (パーム核油ォレイン/大豆油 = 75Z25 (v/v) )
P(3HB— co— 3HH)生産量 (g/L) 比基質供給速度培養 24 - h 培養 36- h培養 48 - h培養 60- h
0.08 3 16 39 64
0.09 2 20 44 66
0.10 3 23 48 69
3HH含有率 (mol%) 比基質供給速度培養 24 - h ―培養36- 培養48 培養《0 - h
0.08 16.9 13.8 11.1 10.3
0.09 14.1 10.8 8.6 7.5
0.10 11 8.6 7.5 7
表 6
混合油 B (パーム核油ォレイン 大豆油 = 50ノ 50 (v/v) )
P(3HB— co— 3HH)生産量 (g L〉 比基質供給速度 培養24 -h 培養36 -h培養48 - h培養 60 - h
0.08 2 15 37 65
0.09 3 21 42 66
0.10 2 22 48 70
3HH含有率（mol<½) 比基質供給速度 培養 24 - h 培養36 - h培養48 - h培養 60 - h
0.08 15.9 12.6 10.2 8.1
0.09 13.6 9.8 7.9 6.8
0.10 9.9 7.4 6.8 6.3 表 7
混合油 C (パーム核油ォレイン/大豆油 = 25/75 (v/v) )
P(3HB - co— 3HH 生産量 (g L)
比基質供給速度培養 24 - h ~培養36— h培養 48 - h培養 60 - h
0.08 3 12 36 66
0.09 3 23 43 66
0.10 4 23 47 68
3HH含有毕（mol%)
0.08 12.1 9.2 7.2 6.3
0.09 11.6 8.3 6.2 5.7
0.10 8.7 6.8 5.8 5.2
表 5〜 7に示されているように、 いずれの混合油脂においても比基質供給速度 を低く制御する事によって、 生産性は少し低下するがポリエステル中の 3 HH含 有率が向上する事がわかった。 また、 3 HH含有率については、 混合油中のパー ム核油ォレインの割合が多いほど高くなることがわかった。 これは、 表 5〜7、 及び、 パーム核油ォレイン、 大豆油がそれぞれ 1 0 0 %の場合 （実施例 1の表 2、 実施例 2の表 3 ) を合わせた結果からも言えることである。 表 5〜 7に示された 結果は、 実施例 3で示された油脂の種類と比基質供給速度制御値を組み合わせる ことに加え、 複数の油脂を混合する、 さらにはその混合割合を調整することによ り、 高い生産性を確保しながら、 所望の 3 HH含有率を有するポリエステルを得 ることが可能となることを示している。
(実施例 5 )
パーム核油ォレインを炭素源とし、 菌体増殖期である培養 3 6時間目までは比 基質供給速度を 0 . 0 9 ( g ；油脂） X ( g ；正味乾燥菌体重量） — X ( h ； 時間） — 1に、 その後のポリエステル蓄積期である培養 36時間目以降は 0. 0 8 (g ；油脂） X (g ；正味乾燥菌体重量） — i X (h ；時間） —1に制御した以 外は、 実施例 1と同様にして培養を行った。
表 8
培養 24 - h 培養 36-h培養 48-h培養 60 - h P(3HB— co-3HH)生産量 (g X) 3 17 42 65
3HH含有率 (mol%) 16.0 13.0 12.5 12.3
表 8に示された結果を、 実施例 1の表 2に示された結果と比較するとわかるよ うに、 ポリエステル蓄積期に比基質供給速度を少し下げて培養することにより、 培養全期間を通じて 0. 09 (g ；油脂） X (g ；正味乾燥菌体重量） "X X ( h ；時間） —1に制御した場合に比べて、 生産性を低下させることなく、 培養全 期間を通じて 0. 08 (g ;油脂） X (g ；正味乾燥菌体重量） (h ;時 間） 一1に制御した場合と同等以上の高 3HH含有率を得ることができた。 産業上の利用可能性
本発明の方法において、 炭素源として用いる油脂の比基質供給速度の制御値を 選択することによって、 さらには、 油脂の比基質供給速度の制御 と油脂の種類 を適切に組み合わせることによって、 生分解性ポリマーである共重合ポリエステ ルの物性を大きく変化させる同ポリエステルの組成を任意に制御できるようにな り、 かつ高い生産性を安定して得ることが可能となる。 したがって、 応用範囲の 広い共重合ポリエステルを、 低コストで工業的に生産、 提供できるようになる。 加えて、 比基質供給速度を制御することにより、 油脂の過剰供給に起因する発泡 を良好に抑制でき、 培養の安定化が図れる。

Claims

請求の範囲
1, 微生物による共重合ポリエステルの生産において、 炭素源として使用する 油脂の比基質供給速度を、 培養の全期間を通じて一定値に制御することを特徴と する培養方法。
2. 微生物による共重合ポリエステルの生産において、 炭素源として使用する 油脂の比基質供給速度を、 培養の菌体増殖期とポリエステル蓄積期とで変化させ、 それぞれ期間中は一定値に制御することを特徴とする培養方法。
3 · 油脂の種類及びノ又は油脂の比基質供給速度の制御値を選択することによ つて、 生産される共重合ポリエステルの組成をコントロールすることを特徴とす る請求の範囲第 1又は 2項記載の培養方法。
4. 炭素源として使用する油脂が、 大豆油、 コーン油、 綿実油、 パーム油、 パ ーム核油、 ヤシ油、 落花生油、 及び、 これらの油脂を分別して得られる分別油脂 の中から選ばれる少なくとも 1種の油脂を含む油脂である請求の範囲第 1〜 3項 のいずれかに記載の培養方法。
5. 炭素源として使用する油脂が、 その構成脂肪酸としてラウリン酸を含む油 脂であり、 かつリン制限下で培養することを特徴とする請求の範囲第 1〜 4項の いずれかに記載の培養方法。
6. 微生物が、 ラルス トニア (R a 1 s t o n i a) 属、 シユードモナス （ s e u d omo n a s ) 属、 ァエロモナス (A e r o m o n a s ) 属、 ァノレカリ ゲネス (A l c a l i g e n e s) 属、 及び、 ェシエリキア (E s c h e r i c h i a) 属からなる群から選択される属に属する微生物である請求の範囲第 1〜 5項のいずれかに記載の培養方法。
7 . 微生物が、 ポリエステル重合酵素遺伝子を組み込まれた形質転換微生物で ある請求の範囲第 1〜 6項のいずれかに記載の培養方法。
8 . 共重合ポリエステルが、 3—ヒ ドロキシへキサン酸を含む共重合ポリエス テルである請求の範囲第 1〜 7項のいずれかに記載の培養方法。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1557470A1 (en) * 2002-10-10 2005-07-27 Kaneka Corporation Process for producing copolyester
JPWO2008010296A1 (ja) * 2006-07-21 2009-12-17 株式会社カネカ 遺伝子置換微生物およびそれを用いたポリエステルの製造方法
JP5696036B2 (ja) * 2009-03-31 2015-04-08 株式会社カネカ 微生物の培養方法、及び微生物による物質の製造方法

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
MX2008008292A (es) * 2008-06-23 2009-12-23 Ct Investig Y Estudios Del Ipn Metodos para la produccion de polihidroxialcanoatos (pha) de cadena media usando aceite vegetal como fuente de carbono.
MY155003A (en) * 2009-01-13 2015-08-28 Plainexus Res Lab Sdn Bhd A method for producing biodegradable resins

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS6427483A (en) * 1987-07-24 1989-01-30 Shoichi Shimizu Production of poly-beta-hydroxybutyric acid
JPH07155192A (ja) * 1993-12-10 1995-06-20 Mitsubishi Gas Chem Co Inc ポリ−３−ヒドロキシ酪酸の製造法
JPH08289797A (ja) * 1995-04-18 1996-11-05 Chikyu Kankyo Sangyo Gijutsu Kenkyu Kiko ３成分系共重合体の製造方法
JPH10108682A (ja) 1996-08-14 1998-04-28 Rikagaku Kenkyusho ポリエステル重合酵素遺伝子及びポリエステルの製造方法
JP2001340078A (ja) 2000-06-01 2001-12-11 Kanegafuchi Chem Ind Co Ltd ポリエステルの製造方法

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0052460B1 (en) * 1980-11-18 1985-02-06 Imperial Chemical Industries Plc Polymer blends
DE3875367T2 (de) * 1987-04-28 1993-03-25 Mitsubishi Gas Chemical Co Verfahren zur herstellung eines d-(-)-3-hydroxybutyrat- und d-(-)-3-hydroxyvalerat-einheiten enthaltenden zufallscopolymers.
JP2777757B2 (ja) * 1991-09-17 1998-07-23 鐘淵化学工業株式会社 共重合体およびその製造方法
GB9503174D0 (en) * 1995-02-17 1995-04-05 Zeneca Ltd Polymer production
TW200420726A (en) * 2002-10-10 2004-10-16 Kaneka Corp Process for producing copolyester

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS6427483A (en) * 1987-07-24 1989-01-30 Shoichi Shimizu Production of poly-beta-hydroxybutyric acid
JPH07155192A (ja) * 1993-12-10 1995-06-20 Mitsubishi Gas Chem Co Inc ポリ−３−ヒドロキシ酪酸の製造法
JPH08289797A (ja) * 1995-04-18 1996-11-05 Chikyu Kankyo Sangyo Gijutsu Kenkyu Kiko ３成分系共重合体の製造方法
JPH10108682A (ja) 1996-08-14 1998-04-28 Rikagaku Kenkyusho ポリエステル重合酵素遺伝子及びポリエステルの製造方法
JP2001340078A (ja) 2000-06-01 2001-12-11 Kanegafuchi Chem Ind Co Ltd ポリエステルの製造方法

Non-Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CHEN G.Q. ET AL.: "Industrial scale production of poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyhexanoate)", APPL. MICROBIOL. BIOTECHNOL., vol. 57, no. 1/2, 2001, pages 50 - 55, XP002976379 *
S.H. LEE; D.H. OH; W.S. AHN, BIOTECHNOL. BIOENG., vol. 67, no. 3, 2000, pages 240 - 244
See also references of EP1557460A4
SEUNG HWAN LEE ET AL.: "Production of poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyhexanoate) by high-cell-density cultivation of aeromonas hydrophilia", BIOTECHNOL. BIOENG., vol. 67, no. 2, 2000, pages 240 - 244, XP002976378 *
T. FUKUI; Y. DOI, APPL. MICROBIOL. BIOTECHNOL., vol. 49, no. 3, 1998, pages 333 - 336
T. FUKUI; Y. DOI, J. BACTERIOL., vol. 179, no. 15, 1997, pages 4821 - 4830
Y. DOI; S. KITAMURA; H. ABE, MACROMOLECULES, vol. 28, 1995, pages 4822 - 4823

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1557470A1 (en) * 2002-10-10 2005-07-27 Kaneka Corporation Process for producing copolyester
EP1557470A4 (en) * 2002-10-10 2010-06-02 Kaneka Corp PROCESS FOR PRODUCING COPOLYESTER
JPWO2008010296A1 (ja) * 2006-07-21 2009-12-17 株式会社カネカ 遺伝子置換微生物およびそれを用いたポリエステルの製造方法
JP5468779B2 (ja) * 2006-07-21 2014-04-09 株式会社カネカ 遺伝子置換微生物およびそれを用いたポリエステルの製造方法
JP5696036B2 (ja) * 2009-03-31 2015-04-08 株式会社カネカ 微生物の培養方法、及び微生物による物質の製造方法

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