WO2004018513A1 - 糖タンパク質若しくは細胞の識別、血清若しくは細胞診断、或いは糖タンパク質若しくは細胞分画のためのレクチンライブラリの使用 - Google Patents

Abstract

細胞等の微妙な違いを反映する細胞表面の炭水化物、例えば糖鎖や、細胞表面糖タンパク質の違いを認識し、それにより各種の細胞等を識別、同定或いは分画するのに役立つレクチンおよび当該レクチンにより構成されるレクチンライブラリーを提供する。

Description

明 細 糖タ ンパク 質若 し く は細胞の識別、 血清若 し く は細胞診断、 或 いは糖タンノ ク質若 し く は細胞分画のための レク チンライ プラ リ の使用 技術分野

本発明は、 複数の種類の レク チンか ら所定の解析能を有する レク チンを選別する方法およびその方法で選別されたレク チン に関する。 背景技術

近年の糖鎖工学の進歩は 目 ざま し く 、 細胞の安定化に寄与す る植物細胞の細胞壁のプロテオグ リ カ ン、 細胞の分化、 増殖、 接着、 移動等に影響を与える糖脂質、 および、 細胞間相互作用 や細胞認識に関与 している糖タ ンパク 質等の高分子の糖鎖が、 互いに機能を代行、 補助、 増幅、 調節、 あ るいは、 阻害 し合い なが ら高度で精密な生体反応を制御する機構が明 らかに されよ う と している。 また、 細胞表面の糖鎖や、 糖鎖— レセプター間 の相互作用異常によ る疾病の発生、 あ るいは、 エイ ズ等の ウイ ルス感染における糖鎖の役割等に関 して盛んに研究されている。

特に、 正常細胞と癌細胞、 あるいは分化段階の異なる細胞等、 ある細胞を他の細胞 と分別 し同定するために、 細胞がその表面 に持つ糖鎖を利用でき る。 例えば、 糖鎖は、 癌細胞については 悪性度に応 じて、 幹細胞についてはそ の分化段階に応 じて変化 する と いつた報告が数多く な されている。 従って、 糖鎖の解析 (例えば、 分別や同定） は、 細胞の識別 · 同定や分画において も極めて重要なもの と 考え られている。

こ の よ う な糖鎖に代表 される細胞表面等の炭水化物解析の手 段において、 特異的糖鎖 （炭水化物） 結合活性を有する レク チ ンの利用は、 大変有効である と考え られる。 し力 しなが ら、 天 然に存在する レク チ ンの種類は限られてお り 、 特に、 上記のよ う な糖鎖解析に十分な種類の レク チンが利用でき ないのが現状 である。 即ち、 糖鎖解析を含む炭水化物解析では糖鎖等の微妙 な違いの判別が極めて重要と な り 、 それを判別 し得る様々 な特 異性を示すレク チンが十分且つ系統的に準備される得る こ とが 当該解析の鍵を握る課題と なる。 発明の開示

本発明は、 細胞等の微妙な違いを反映する細胞表面の炭水化 物、 例えば糖鎖や、 細胞表面糖タ ンパク質の違いを認識 し、 そ れによ り 各種の細胞等を識別、 同定或いは分画する のに役立つ レク チ ンお よ び当該レク チ ンに よ り 構成される レク チンラ イ ブ ラ リ ーを提供する。

特に、 本発明では、 複数の種類の レク チンから、 指標と なる 特定の細胞等に対するバニ ングまたはその他の方法で所望の解 析能を有する レク チンを選別する。 こ の よ う に して選別 された 1 またはそれ以上の レク チンを用いて、 細胞等の解析を行 う こ と ができ る。 更に、 選別 されたレク チンは、 診断薬または診断 キ ッ ト と と して利用する こ と ができ る。 また、 その よ う に して 選別された レク チンの中には、 その他の手段では分離できない よ う な特定の細胞等に対 して、 極めて強固且つ特異的に結合す る ものが存在する こ とが明 らカゝと なっ た。 本発明は、 かかる レ ク チンによ る細胞等の分画、 ひいてはそのよ う な レクチンを利 用 したプラ ズマフ エ レシス の方法も提供する。

従って、 本発明の第一の局面は ；

複数の種類のレク チンから、 指標と なる細胞若 し く は擬細胞 体または糖タ ンパク質若 し く は糖鎖に対する親和性に基づいて 選別 した少な く と も 1種類以上の レク チンを含む、 糖タ ンパク 質若 し く は細胞の識別、 血清若 し く は細胞診断、 或いは糖タ ン パク質若し く は細胞分画用 レク チンライブラ リ である。

指標 と なる細胞等は、 必ず しも識別 · 診断 · 分画の対象 と な る細胞自体等である必要がないこ と が知見された。 すなわち、 識別対象の細胞 と 同一の細胞に対する親和性に基づいて特定の レク チンを選別する のではな く 、 識別対象と何らかの特性にお いて関連付け られる細胞等に対する親和性に基づいたと しても 本発明における レク チンの選別が所与の 目 的を達成 し得る。 こ れは、 本発明のライ ブラ リ の作製において、 必ずしも識別対象 の糖鎖 （炭水化物） 情報に関する完全な知見が必要ない こ と を 意味する。

例えば、 I g Aや骨芽細胞の識別に使用する レク チンライ プ ラ リ は、 赤血球やグライ コ ブ イ リ ンを指標に用いて、 それらに 対する親和性に基づき構築する こ と ができ る。 そ して、 この方 法は、 I g Aや骨芽細胞等の上に存在する 0—結合型糖鎖を認 識するための レク チンの選別に有用である。 特に、 その よ う に して選別されたレク チンから構成される ライ ブラ リ は、 I g A グライ コ フ ォ ー ム識別、 骨芽細胞亜集団識別に好適に用い得る こ と が示された。 また、 他のレク チンライ ブラ リ も、 間葉系幹 細胞由来の細胞亜集団識別または癌細胞転移性識別に好適に使 用でき る こ と が判明 した。

次なる、本発明の局面は ；

レク チン と被検体と の相互作用の表示が、 被検体に対する他 の親和性物質によ り 行われる方法に関する。

すなわち、 上記の よ う に して作製された レク チンライ ブラ リ によ る細胞等の識別において、 その識別結果を表示する方法と して、 例えば、 追加的な抗原一抗体反応の よ う な、 細胞等の他 の特異性を利用でき る。

更に、 本発明のも う一つの局面は ；

上記の レク チンライ ブラ リ を含む診断キ ッ ト の提供にある。 つま り 、 本発明の レクチンライ ブラ リ は、 任意の形態のキッ ト と して利用でき、 その非限定的例 と しては、 診断試薬、 レク チ ンチップおよび各種のセンサーを挙げる こ と ができ る。

更に、 本発明の最後の局面では ；

少な く と も 1 種以上の レク チンを含む本発明の レクチンライ プラ リ を、 細胞の分画/分取の手段と して用いる方法が提供さ れる。

驚く べき こ と に、 本発明の レクチンライ プラ リ の作製におい て、 特定の細胞に対 して非常に高い特異性と親和性を有する レ ク チンが存在する こ と が見出 された。 そ して、 これによ り 、 当 該細胞の該レク チンによ る分画/分取或いは除去が効率的に達 成 し得る こ と が判明 した。 これによ り 、 本発明の レクチンライ ブラ リ は、 プラズマフ エ レシス等への応用が可能である こ と も 示されたの である。 図面の簡単な説明

図 1 Aは、 M A Hモデノレの立体構造を示すものである。

図 1 Bは、 MAH の立体構造を模式的に示 したものである。 図 中、 ループ C と Dは、 その間に糖鎖を挟み込み、 所定の糖鎖に 結合性を示すこ と によ り 、 糖鎖の異同を認識する と 考え られる。

図 1 Cは、 糖鎖と M A Hの結合の様子を示 している。

図 2 は、 M A Hを コー ド した c D N Aの塩基配列 と予想され るア ミ ノ酸配列を示 した図である。 図 2 の M A Hのア ミ ノ 酸の 配列表で、 ループ D の位置が、 3番目 （一番下） の下線によつ て示されているが、 その中でも、 糖鎖 と の結合性に大きな影響 を及ぼすと思われる 5 つのア ミ ノ酸が四角で囲われている。 尚、 図中①は、 X h o I ( c t c g a g ) 制限酵素部位を、 ②は、 B g 1 I l ( a g a t c t )制限酵素部位を、③は、 S p e I ( a c t a g t ) 制限酵素部位を、 示 している。

図 3 は、 野生型ィ ヌェ ンジユマメ レク チ ン （M A H ) の認識 する糖鎖構造である。

図 4 は、 I g A l 糖鎖構造のバラエティ を図解する図である。 図 5 は、 M A H のループ C のア ミ ノ 酸配列を示 し、 改変によ る ア ミ ノ酸の挿入位置を示 した図である。

図 6 は、 フ ァ ージディ ス プ レー型 レク チ ンラ イ ブ ラ リ の概略 である。

図 7 は、 パニングによ る人エレク チンの回収手順である。 図 8 は、 細胞表面に発現 している糖鎖を模式的に示 した図で ある。 細胞 4 0 の細胞膜 4 2 には、 膜貫通タ ンパク 質がはま り 込んでお り 、 細胞の外側に出ている。 この出た先に O —結合型 糖鎖 5 2や N —結合型糖鎖 5 4 が葉のよ う に結合 している。 赤 血球膜上に発現 している糖タ ンパク質であ る ダ リ コ フ ォ リ ンも よ く 似た構造を持つ。

図 9 は、 糖鎖グライ コ フ ォーム の異なる I g Aの識別および 間葉系幹細胞由来の細胞の亜集団識別に用いた レ ク チンライ ブ ラ リ に含まれる レク チンのア ミ ノ酸配列を示す図である。

図 1 0 は、 ヒ ト赤血球によ るバニングによ り 得られたク ロー ンの糖鎖特異性を示す図である。

図 1 1 は、 レクチンチ ッ プの一例およびその使用方法 （ I g Aについて） を示す図である。

図 1 2 は、 糖鎖グライ コ フォー ム の異なる I g A の レク チン ライ ブラ リ に対する結合パター ンを示す図である。

図 1 3 は、 レクチンチ ップの一例およびその使用方法 （骨芽 細胞の分化度プロ フ アイ リ ン グについて） を示す図である。

図 1 4 は、 間葉系幹細胞由来細胞の亜集団の レ ク チ ンライ ブ ラ リ における結合パターンを示す図である。

図 1 5 は、 M A H のループ D のア ミ ノ酸配列を示 し、 改変に よ る ア ミ ノ酸の挿入位置を示 した図である。

図 1 6 は、 転移性の異なる癌細胞の レク チンライ ブラ リ に対 する結合パターンを示す図である。

図 1 7 は、 K U M 5細胞 （間葉系幹細胞由来細胞の亜集団） の レク チンライ ブラ リ における結合パタ一ンを示す図 (図 1 7 A ) と ライ ブラ リ 内の Y — 9 レクチンの他の亜集団 （ K U S A - A l お よび 9 一 1 5 C ) に対する 結合性の比較 （図 1 7 B ) を 示す。 発明 の詳細な説明

レ ク チ ン

本発明において、 複数の種類の レク チン は、 天然の レ ク チン お よび Zま たは人工の レ ク チンか ら構成 さ れる。

本発明の天然の レ ク チ ンには、 動物性の レク チ ンお よ び植物 性の レ ク チ ン並びにその他の レク チンが含まれる 。 好ま しい天 然 レク チンの非限定的な例 と して、 植物性の レク チ ン、 特に、 マ メ 科の レ ク チンを挙げ る こ と ができ 、 いっそ う 好ま しいマメ 科の レ ク チ ン と して 、 M a a c k a a m u r e n s i s h e m a g g l u t i n i n ( M A H ) 由 来の レク チン を挙げ る こ と ができ る

人工の レ ク チ ンには、 例 えば、 既知の化学的な手法に よ り 合 成 した レク チン も含み得 る が、 生命工学的手法に よ り 作製 した レク チ ンが好ま しい。 特に、 遺伝子工学を利用 して、 天然の レ ク チ ン を遺伝子的に改変 して得 られる レク チンが好適に利用で き る 。 特に好ま しい遺伝子改変は、 レク チン遺伝子内の特定の 領域の D N Aを操作する こ と によ り 達成され得るが、 これに限 定されない。

D N A操作を行 う 特定の領域と しては、 天然レク チンの糖鎖 結合 （認識） 部位をコー ドする領域が挙げ られ、 当該 D N A操 作は、 レク チ ンの糖鎖結合部位のア ミ ノ酸配列に対 して、 当該 部位の糖鎖結合活性を完全に損ねない範囲において、 欠失、 置 換および/または付加を導入する も のであ り 得る。

そのよ う な D N A操作は、 レク チンの立体構造解析カゝ ら も設 計する こ と ができ る。 図 1 Aおよび図 1 B は、 M A H レ ク チ ン の立体構造模式的に示すも のであ り 、 図 1 C は、 更に、 当該レ ク チンと糖鎖と の結合の様子を示 しているが、 これらの図から、 図中のループ C と Dは、 その間に糖鎖を挟み込むこ とで、 糖鎖 認識および結合部位を形成する こ と が判る。 従って、 当該糖鎖 認識部位であるループ Cおよび D をコー ドする D N Aが操作の 対象と な り 得る。 同 じく M A H レク チンにはループ Aと Bが存 在し （図示せず） 、 これ ら のループを コー ドする D N A領域も D N A操作の対象と して好適であ り 得る。

よ り 詳細には、 例えば、 図 2 に示される M A H レ ク チ ンの塩 基配列およびア ミ ノ 酸配列において、 塩基配列 4 6 6 〜 4 9 8 (ア ミ ノ酸配列 1 2 7 〜 1 3 7 ) が、 ループ Cに、 塩基配列 7 2 1 - 7 8 0 (ア ミ ノ酸配列 2 1 2 〜 2 3 1 ) が、 ループ Dに 対応する。 従って、 これらの領域が改変の対象領域と して含ま れて よい。 ループ Cの非限定的な改変例は、 図 5 に示すよ う な、 位置 1 2 7 〜 1 3 7 のア ミ ノ酸配列に対する ア ミ ノ 酸の挿入や 図 6 に示すよ う な、 所定のア ミ ノ 酸を固定 しての、 残り のア ミ ノ 酸のラ ンダム改変が挙げられる。 また、 ループ Dでは、 図 1 5 に示すよ う な、 ア ミ ノ 酸配列 2 1 9 〜 2 2 4 に対する挿入や 置換が例示でき る。 尚、 本明細書においては、 塩基配列は、 開 始コ ドンカゝ ら数え、 ア ミ ノ酸配列は、 N末端ア ミ ノ （M e t ) 酸残基から数える。

M A H以外のマメ 科の レク チンにも 、 同様に、 ループ A とル ープ Bおよびループ C とループ Dが存在し、 それらが糖鎖認識 一結合に関与 している と されてお り 、 従っ て、 それらの レク チ ンにおいても 当該ループが改変の対象と な り 得る。

レ ク チ ンの選別

本発明では、 複数種類のレク チンか ら、 目的 とする糖鎖解析 に有用 なレク チンを少な く と も 1 種以上選別 し、 それら によ り レク チンライ プラ リ を形成する。 そ して、 形成されたレク チ ン ライ プラ リ を用いて糖鎖に代表される炭水化物自 体或いは糖鎖 (炭水化物） を持つ細胞および糖蛋白の同定を行 う こ と ができ る。

上記レク チンの選別は、 任意の手法によ る こ と もでき るが、 特定の糖鎖を有する、 細胞若 しく は擬細胞体、 糖タ ンパク質或 いは当該糖鎖自 体またはその任意の構成単位を利用 したパニン グを利用する こ と が有利である。 該パユングは、 複数の種類の レク チンの各々 に対 して個別に行っても よ く 、 また複数種類の レク チンを含む レク チン混合物全体に対 して行って も よい。 パ ニングに用いる細胞ゃ擬細胞、 糖鎖 （単糖を含む） 等は、 本発 明のレク チンライ ブラ リ が、 識別、 診断または分画すべき対象 である血清、 細胞、 および糖タ ンパク 質の鍵と なる特性を反映 しえる ものであ り 得る。

すなわち、 特定の細胞の分化状態識別を 目 的 とするライ ブラ リ の作製においては、 特定の分化状態を反映し得る細胞をパニ ングに用い る こ と ができ、 その際、 当該細胞の糖鎖に関する詳 細な知見は必ずしも必要でない。

更には、 例えば、 ヒ ト骨髄細胞か ら特定細胞への分化能を有 する細胞の亜集団同定、 プロ フアイ リ ングまたはその性質の予 測において用い得る レク チンライ プラ リ を作製する 目的で、 複 数の レク チンを、 ヒ ト赤血球に対 してバニ ング して も よ いので め る。

ヒ ト骨髄細胞から心筋細胞への分化能を有する細胞は、 C D 3 4 と呼ばれる幹細胞関連抗原を有してお り 、 該 C D 3 4 は、 ムチン （後に詳述する） と よ ばれる糖タ ンパク 質のひと つ と し て知 られている。 ヒ ト C D 3 4 には、 N末端を含む細胞の外側 の 2 6 0 ア ミ ノ 酸残基が存在し、 当該領域に O —結合型糖鎖が 付加される。 当該糖鎖が付加され得る ア ミ ノ酸であ るス レオニ ン （ T ) と セ リ ン （ S ) は、 前記 N末端か ら 1 4 4番目 までに 特に集中 している。 すなわち、 ヒ ト C D 3 4 は、 当該領域にお いて、 T T T 、 S T S等の連続する T Z S 反復配列をも ち、 こ れはムチン様糖タ ンパク 質に特徴的な構造と される （図 8 ) 。

こ のヒ ト C D 3 4 の糖鎖に関する構造は、 ヒ ト赤血球のそれ と類似 してお り 、 従って、 当該 C D 3 4 を発現 し ヒ ト骨髄細胞 から心筋細胞への分化能を有する細胞、 例えば、 9 一 1 5 C細 胞と、 骨髄細胞への分化能を有する細胞である K U S A / A 1 細胞を識別する レク チンライ プラ リ を作製するためには、 その 構成レクチンを選別するパユングにおいて、 ヒ ト赤血球を使用 して も よい。

同様に、 I g A 1 分子 は、 そ の ヒ ンジ部ア ミ ノ 酸配列にス レ ォニ ン （ T ) と セ リ ン （ S ) を持っ てお り 、 O —結合型糖鎖を 付加 した構造 と な っ てい る （図 4 ) 。 また、 質量分析計等に よ つ て解析を行 う と 、 I g A腎症患者の I g A l 分子に付加 さ れ てい る 糖鎖は、 健常人 と 比較 して シアル酸、 ガラ ク ト ース が欠 如 した糖鎖不全 I g A 1 分子であ る こ と が報告 さ れてい る 。 一 方、 ヒ ト赤血球上に はグ ラ イ コ フ ォ リ ン と よ ばれる シアル酸を 含む 0 —結合型糖鎖が ク ラ ス タ ー状にぺプチ ドに付加 してい る 糖タ ンパク 質が存在 して お り 、 I g A l ヒ ンジ部に近い糖鎖一 ペプチ ド複合体 と しての構造を も つ。 それ故、 レク チンの集合 体か ら ヒ ト 赤血球でバニ ング して選別 した レ ク チ ン によ り 、 I g _A グライ コ フ ォ ーム識別のための レク チ ン ラ イ ブ ラ リ を作製 し得る。

尚、 前記の よ う に、 選別には、 パニ ング以外の種々 の方法を と る こ と ができ る。 ま た、 選別 と は、 単一の レク チ ン集合体内 か ら選別する のみな らず、 1 または所定の数の種類の レ ク チン 群を適宜組み合わせ る こ と に よ り 、 レク チ ン ラ イ ブラ リ を形成 する こ と も含む。 例 えば、 遺伝子改変 レク チ ンにおいて、 所定 P 画 003/010461

15 の位置 （例えば、 M A H レ ク チ ン のループ D ) に 1 のア ミ ノ 酸 ( 1 種類） を挿入する こ と によ り 、 1 の種類の遗伝子改変レ ク チンを生成 し、 ス ト ッ ク しておく 。 同様に他の種類のア ミ ノ酸 を同 じ位置に挿入する こ と によ り 別の種類のレ ク チ ンの ス ト ッ ク ができ る。 更に、 挿入する位置を変更する こ と に よ り 、 更に 多 く の種類のレク チ ンをその種類ごと に分別 してス ト ツ クする こ と ができ る。 これ らの レク チンは、 その特性が類似 している と 思われるが、 種々 の試験によ り その違いも明 らかにする こ と ができ る。 このよ う に して、 種類別に機能を特定 したレク チン ス ト ツ ク を適当にブ レ ン ドする こ と によ り 、 同様に細胞等の識 別に適切な レクチンライ ブラ リ を作成する こ とができ る。 なお、 本発明の レクチンライ ブラ リ には、 その構成レク チン内に、 識 別 しよ う とする 1 またはそれ以上の細胞等に対 して検出可能な 親和性または結合性を示すも のが少な く と も 1 つ存在する こ と が必要であ り 、 また、 識別 しょ う とする細胞等が 2 以上の場合 は、 少な く と も 2 以上の細胞等のいずれも に対 して親和性また は結合性が高いものが更に含まれている こ と がよ り 好ま しい。 また、 識別 しよ う とする 2 またはそれ以上の細胞等に対 して共 に親和性または結合性が低いものが更に含まれている こ と が更 によ り 好ま しい。 これら を比較する こ と に よ り 、 細胞等の識別 が的確に行われる こ と と なる力、らであ る。 このよ う に して、 必 要な種類おょぴ数の レク チンを含んだレク チンライ ブラ リ は、 本発明において好適に使用 され得る。

ライ ブラ リ の使用

上記のよ う に して作製 された レク チンライ ブラ リ は、 糖タ ン パク 質若し く は細胞の識別、 血清若 し く は細胞診断、 或いは糖 タ ンパク質若し く は細胞分画において使用する こ と ができ、 特 に病態における糖鎖の差異を識別するために有利に使用でき る。 例えば、 ムチンは、 気管、 胃腸等の消化管、 生殖腺等の内腔 を覆 う 粘液の主要な糖タ ンパク質である。 ムチンは、 o — ダ リ コ シ ド結合を介 してポリ ペプチ ド （コ アタ ンパク質、 アポムチ ン） に結合 した多数の o —結合型糖糖鎖を持つ。 ほ と んどのム チンが多く の反復配列 ドメ イ ンを持っている。 これ らの反復配 列 ドメ イ ンはセ リ ン、 ス レオニ ンに富み、 完成されたム チンで は、 ほと んどに o —結合型糖鎖が付加 している。

M U C 1 ムチン上に発現する糖鎖と癌の進行に伴 う悪性挙動 との関連も示唆されてお り 、 これを識別し得る レクチンライ プラ リ は有効である と考えられる。 例えば、 大腸癌において M U C 1 ムチン上に発現している糖鎖であるシァ リ ノレルイ ス X抗原の発現 が多いほど癌細胞の浸潤等が起こ り 、 悪性度が高く 、 シァ リルル イス X抗原の発現量は 5年生存率と逆相関 しているこ とが報告さ れており （ C a n c e r R e s e a r c h 5 3 , 3 6 3 2 - 3 6 3 7 , A u g u s t 1 , 1 9 9 3 ) 、 本発明の レク チ ンライ プラ リ は、 当該悪性度の識別に有効であ り 得る。

更に、 ムチンを含む細胞表層の糖質の変化が、 細胞の癌化の 特徴と して認め られている。 これらの変化が、 細胞の接着性の 変化、 あるいは転移のよ う な癌細胞の異常な挙動、 免疫によ る 防御力 らの回避に関与してレヽる と考え られている。 こ の こ と 力 ら、 例えば糖タ ンパク質である ムチンの糖鎖修飾度合いを本発 明のライ ブラ リ で測定する こ と ができれば、 特定の癌細胞の悪 性度を識別 · 予測でき る と 考え られる。

と り わけ、 癌の転移においては上述ムチン構造の う ち、 シァ ル酸の役割が大きい と報告されてお り 、 シアル酸を含む O—結 合型糖鎖構造を認識する M A H と そ の遺伝子改変レ ク チ ンを レ ク チンライ ブラ リ と して用いる こ と で、 癌の転移についての血 清或いは細胞診断が達成され得る。

一方で、 ムチンに対する抗体で癌の悪性度を判別 しよ う と い う試みも ある。 しカゝ しなが ら、 モノ ク ローナル抗体は特定のム チン抗原に高い特異性を持つものの、 その抗原と なる糖鎖の発 現は、 各組織の分化の各段階で時間的 · 空間的に厳密に制御 さ れてお り 、 従って、 モノ ク ローナル抗体によ る手法は、 ある時 点における糖鎖情報にすぎない。 糖鎖の種類と特異性の強弱を 識別でき る レク チンライ ブラ リ に よ り 糖鎖の時間的、 質的、 量 的な変化を見る こ と で、 病態そのも のの診断だけでなく 、 効率 的な早期診断 · 予後診断 · 治療が達成され得る。

感染、 炎症、 癌、 神経障害、 アルツハイ マー等の病態に伴い 変化する糖鎖は、 上述のよ う なムチンに限られない。 N _結合 型糖鎖の変化を伴 う 疾患、 その他の糖タ ンパク質または糖脂質 の糖鎖の変化を伴 う 疾患も報告されてお り 、 糖鎖の種類と特異 性の強弱を識別でき る レク チンライ ブラ リ は、 そのいずれに対 しても糖鎖の時間的、 質的、 量的な変化を見るために有用 と 考 え られる。

加えて、 本発明のライ ブラ リ は、 特定の糖タ ンパク質や細胞 を分画する 目 的においても有用である。 その 目的においては、 ただ 1 種類の レク チンからなる ライ プラ リ ーでも十分であ り 得 る。 特に、 遗伝子改変によ り 作製 した レク チ ンの中から選択さ れたレクチンにおいて、 特定の細胞に対して極めて高い親和性 を有する も のが見出 され、 そのよ う な レク チンを単独、 或いは 組み合わせて、 特定の糖タ ンパク質や細胞を効率的に分画し得 る。 更には、 当該分画をプラズマ ' フ ェ レシスにも応用する こ と が可能である。

以上の と お り 、 本発.明の レクチンライ ブラ リ は、 各種の細胞 等の識別、 診断および分画に有用であ るが、 特に、 該ライ ブラ リ は、 I g Aグライ コ フ ォーム、 転移性の異なる癌細胞、 間葉 系幹細胞由来の細胞集団を識別するために適用 し得る こ と が示 されてお り 、 それら は、 本発明の レク チンライ ブラ リ の好適な 使用例を構成する。

キ ッ トおよび装置

本発明の レク チンライ ブラ リ を適用 して、 各種の診断キッ ト および装置を作製でき る。 例えば、 本発明の レク チンライ ブラ リ 内の各レク チンを、 基材上の所定の位置に、 適当な順列で配 列 して固定 し、 細胞識別等のための装置を作製する こ と ができ る。 こ こ で、 レク チンを固定する部分は、 ゥエルのよ う なよ う なものであってよ く 、 単なるスポッ ト であっても よい。 また、 基材は、 チ ップ、 プレー ト、 ビーズ等、 いかなる材質や形状を 有 して も よ く 、 それが レク チンを固定でき る ものであればかま わない。

好ま しく は、 基材上に複数の レクチン固定する際、 当該レ ク チンを、 明瞭な識別パターンが表示さ る よ う に配列 して固定す る。 例えば、 細胞表面の糖鎖に対 して異な る親和性によ り 結合 する複数の レク チンを特定の配置で固定する こ と で、 その配列 パターンから容易に識別結果が判定でき る よ う にする。

このよ う な配列は、 チ ップまたは各種のセンサー と して診断 キッ ト或いは装置を形成する際に特に有効であ り 、 その製造は、 公知の D N Aチッ プ作製手順等を適宜変更 して成 し得る。

なお、 上記のよ う なチ ップにおいては、 目 的の細胞若 し く は 疾病診断に最適と なる よ う に、 個々 の レク チンを固定する位置 を適切に変化させる こ と が好ま しいこ と は言 う までもない。 更 に、 上記材質の基材は、 合成樹脂 （プラスチッ ク を含む） 、 金 属 （白金、 銀、 銅、 金、 シリ コ ン等を含む） 、 雲母、 および、 これらの混合物を含んでよい。

一方で、 キッ ト は、 本発明の レクチンライ ブライ を含む試薬 の形と して供給され得、 そのよ う な試薬の調製方法も、 当業者 に と つて標準的な手法に よ り 達成 し得る。 なお、 レクチンと被 検体の結合、 例えば、 レ ク チン と特定の細胞の結合を検出する ためには、 レクチンまたは該細胞を予め標識 し、 レクチン一細 胞複合体内の標識を測定する こ と でも達成でき るが、 両者を特 に標識せずに、 例えば、 該細胞の有する他のェピ ト一プを認識 する抗体を用いて、 それに よ り レク チン一細胞複合体の存在或 いはその量を決定しても よい。

或いは、 よ り 複雑な態様においては、 固体支持体に固定する ための抗被検体抗体 と本発明の レク チンライ ブラ リ および標識 抗レク チン抗体から本発明のキッ ト を構成 し得る。 そのキッ ト では、 まず抗被検体抗体を ゥエル内等に固定し、 次に、 被検体 を当該抗体と接触させて抗体一被検体複合体を形成 し、 次いで、 本発明のレクチンを添加 して被検体に結合させ、 最後に結合 し た レク チンを標識抗レク チ ン抗体で検出する。

その他の様々 なバ リ エーショ ンも実施可能であ り 、 それらの バ リ エーシ ョ ンも また当業者に と って容易に理解される であろ

従って、 本発明のキッ ト には、 レク チンライ ブラ リ 以外の追 加の試薬が含まれ得、 当該追加の試薬は、 好ま し く は レク チン と被検体の相互作用以外の親和性、 例えば抗原一抗体反応に基 づく 親和性を有する物質であ り 得る。

また、 試薬以外の特定の形態のキッ ト と して本発明のライ プ ラ リ を用いる場合においても、 検出は、 被検体そ の も の の染色 を通 して、 または被検体を標識 した蛍光によ り行っ てよ く 、 ま たは分子間相互作用の質量変化若 し く は電流と して検出 しても よい。 分子間相互作用の質量変化は水晶発振子天枰でも表面プ ラスモン共鳴法であって も よい。 または、 糖タ ンパ ク 質の糖鎖 を レク チンライ ブラ リ で解析 したのち、 2 次抗体に よって糖タ ンパク 質の蛋白 を蛍光標識 しても よ く 、 糖タ ンパク 質の蛋白 を パルス レーザの照射によ つてィ オン化 した蛋白質を質量分析計 によ って検出 しても よい。 勿論、 これ らを組み合わせも可能で ある。

例えば、 チップの例と しては、 本発明における レクチンライ ブラ リ の個々 の種類のレク チンを所定の位置に固定 して、 異な る種類の レク チンを含む レク チン固定部を作り 、 その上に、 例 えば、 血淸サ ンプルを流 して、 該サ ンプルを レク チンに接触さ せる。 サンプル中の、 前記レク チンに結合 しない、 若し く は実 質的な結合力を有さ ない血清糖蛋白 を洗い流した後に、 結合 し て固定された血清糖'蛋白 について、 その糖以外の構造に結合性 のマーカーを結合させる。 余分なマーカーを洗い流 した後に、 発色等によ り マーカー判読でき る よ う に して、 血清の識別を行 う こ と ができ る。

また、 血清糖蛋白 の糖鎖以外の構造に結合性を有する抗体を 固定 しておき、 その上に、 血清サ ンプル等を流 して抗体に接触 させ、 当該抗体の抗原 （例えば血清糖蛋白） を固定 し、 前記抗 体に対 して結合しない、 若 し く は実質的な結合力を有さ ない抗 原 （血清糖蛋白） を洗い流 した後に、 結合 して固定された血清 糖蛋白の糖鎖構造を識別するための種々 の レクチンを結合させ - 余分な レク チンを洗い流 した後に、 発色等によ り 判読でき る よ う に して、 血清の識別を行 う こ と ができる。

逆に、 検体を固定 した場合は、 レク チンライ ブラ リ を含む識 別剤をその上に流 し、 各レク チン固有のマーカー (例えば、 タ グを遺伝子工学的につけて、 そのタ グの発色等、 または、 タ グ 特有の結合性マーカーを用いる） によ り 、 結合 した レク チ ンの 種類を特定し、 検体の識別や診断を行 う こ と ができ る。

以下、 本発明を具体的な例を上げ、 図を参照 しつつ、 よ り詳し く 説明するが、 本発明はこれらの実施例に限られる も のではない ₍ 実施例 0461

24 概要

シアル酸を含む糖鎖に特異的なマメ 科レクチンである M a a c k i a a m u r e n s i s h e m a g g l u t i n i n ( M A H ) の糖結合部位に関連する と 思われる部分の少なく と も一部を遺伝子工学的手法でラ ンダムに改変 し、 ラ ンダムに改 変 した レク チンから複数の種類の異なる糖鎖のバ リ エ ーシ ョ ン を見分け られる複数の人工のレク チンを作製した。 また、 得ら れた人エ レ ク チ ンの集合体を利用 して、 所定の細胞等を使用 し て種類の異なる細胞への結合パターンから細胞の種類の違いを 見分ける こ と ができ る レク チンを選別 し、 1 つの レク チンライ ブラ リ を作成 した。 そ して、 こ の レク チンライ ブラ リ によ り 、 生物学的に重要な糖鎖に特異的なレク チンを選別するための、 ス ク リ ーニ ング系を確立する こ と ができた。 こ こで、 哺乳類の 細胞には、 わずかな構造上の差異を有する多様な複合糖質が存 在 している こ と が知 られている。 また、 こ のよ う に多様な構造 を識別でき る レクチンを生成する こ と は非常に有用である と考え られる。 このレクチンライブラ リ は、 糖鎖がシアル酸残基、 g卩ち、 N e u 5 A c a 2 - 3 G a 1 1 - 3 ( N e u 5 A c a 2 - 6 ) G a 1 N A c ( 4 ) か ら な る炭化水素配列を認識する こ と が で き る 。 ま た、 別のイ ソ レ ク チ ンエ ン ジ ニ ア リ ン グで あ る M a a c k i a a m u r e n s i s 1 e u k o a g g l u t i n i n (M A L ) は、 N e u 5 A c a 2 — 3 G a 1 β 1 - 4 G 1 c N A c ( 5 ) 配列を特異的に認識する こ と ができ 、 こ の両者の レク チ ンは、 マメ 科植物 （ l e g u m e ) や他の レク チンの間でも独 特なものである。 M A Hは、 相対分子量 （ r e 1 a t i v e m o l e c u l a r m a s s ) 2 9 , 0 0 0 であ り 、 サプュ ニッ ト のダイマーカ らなる。 MA Hにエンコー ドされた c D N A のヌ ク レオチ ド配列およびそれから導き出 されたァ ミ ノ 酸配列 では、 M A Hは 2 8 7'のア ミ ノ 酸力 らな り 、 3 0 のア ミ ノ 酸シ ングルぺプチ ドを含んでいる こ と を示 している。 推定されてい る M A Hの糖鎖認識 ドメ イ ンは、 そのア ミ ノ 酸シーケンス を他 のマメ 科植物 （ l e g u m e ) の レ ク チン （ 7 ) のア ミ ノ 酸シ 一ケンスと比較すること、 および、 M A Hにその結合特性を賦与す るこれらのアミ ノ酸によ り定義されるこの ドメ イ ンの遺伝的変異の 古く からの研究によ り同定されている。 また、 N e u 5 A c a 2 — 3 G a 1 /3 1 - 3 ( N e u 5 A c a 2 - 6 ) G a I N A c ( 8 ) を含む M A Hの 3 次元構造のコ ン ピューターモデルから、 これ らの観察が確認された。 <実施例 1 >

[ループ C 改変 レ ク チンの赤血球バニ ング法に よ る レク チン ラ ィ ブラ リ の取得]

M A H レク チンのループ C におけ る ラ ンダムな改変を行った， M A H のループ C の糖鎖認識部位に相 当す る ァ ミ ノ 酸配列の う ち、 糖鎖の認識お よ びレ ク チンの構造保持のために必要 と 考え られる A s p l 2 7、 H i s 3 2、 A s p l 3 5 は保存 して変 異を加えなかっ た。

[ループ C改変 M A Hの作製]

MAHレク チンはファージ上に発現 し、 赤血球を凝集する こ と を確 認したのちに MAHのループ C糖鎖認識部位は、 A m p 1 i T a q G o l d D N Aポ リ メ ラ ーゼ （ A m p l i T a q G o l d D N A p o l y m e r a s e ( P E B i o s y s t e m s 社製） ) に よ っ て、 パーキ ン · エルマ一 2 4 0 0 熱サイ ク ル装 置 （ P e r k i n — E l m e r 2 4 0 0 t h e r m a l e y e 1 e r ) でラ ンダムに改変された。 この と き用いたプライマ 一および リ / ース ' プライマー ( r e v e r s e p r i m e r ) を表 1 に示す。 プライマー

プライマー ： E c o R I サイ ト を含む

5 '- C C G G A A T T C G A C A C T T A C N N K N N K C

A T N N K N N K G A T N N K N N K G A C C C A A A C T A

C A G A C A T A T C 3 '

リ パースプライマー H a H I サイ ト を含む

5 '— C A C A A A C G A A T G G G G A T C C A C — 3

P C R生成物を得るために次のよ う なプロ ト ルが用い ら れた。 まず、 9 5 °Cで 9 分間、 （ 9 4 °Cで 1 分間、 5 4 °Cで 分間、 7 2 °C 1 分間） のサイ クルを

3 0 回であ る。 生成物は、 過剰量の制限酵素 c o R I および

B a m ¥L I によって処理 した。

生成物は、 制限酵素 ^ c o R I / B a mU I 処理野生型 MA H p C o m b 3 ( li c o R l / B a m H l — d i g e s t e d w . t . M A H— p C o m b 3 フ ァ ージミ ド （ p C o m b 3 p h a g e m i d v e c t o r h a v i n g w . t . MAH c D N A ) ) にライ ゲー ト された。 [ フ ァ ージの準備]

M A H レク チン一 p C o m b 3 は、 大腸菌 （ £, c o l

S U R E 2細胞 （ S t r a t a g e n e社製、 L J o 1 1 a

C A ) に組み込まれた の細胞を 5 0 μ m 1 力ノレべ二 シ リ ン （ c a b e n 1 1 n ) を含む H E Mプレー ト k 2 4 g / L t r v p t o n e 、 4 8 g / L y e a s t e x t a c t 0 g L M O P S , p H 7 . 0 ) 上で、

3 7 。Cで 8時間培養した。 細胞は、 プ レー ト を 1 0 m 1 H E M に浸して、 はが し、 回収 した。 細胞を含む H E M培地を、 1 0 0 m l H E M ( p H 6 . 9 、 s u p p l e m e n t e d w i t h 1 m M C a C l ₂および I m M M n C 1 ₂ ) c a r b e n i c i l l i n ) 2 時間培養 した。 A 6 0 を約 0 . 3 になる よ う に調製し、 培養細胞を V S C M 1 3

e l p e r p h a g e (fc) 1 0 ^{1 2} p f u ; S t r a t a g e n 社製、 L a J o 1 1 a 、 C A ) に感染させた。 感染したフ ァ ジは、 3 0 °Cで 1 2時間振盪して培養 し、 ポ リ エチレン . グ リ コール 8 0 0 0 およびと N a C 1 沈殿に よ って一晚かけ 4 °C で、 培養物から単離 した。 遠心分離した後、 フ ァ ージ · ペレツ ト は、 ト リ ス緩衝生理食塩水 （ T r i s - b u f f e r d s a l i n e ( T B S : 5 0 m M T r i s — H C 1 , H 7 . 5 c o n t a i n i n g 1 5 0 m M N a C 1 ) - 1 % b o v i n e s e r u m a l b u m i n ( B S A ) ) に懸 濁 した。

[ ヒ ト赤血球細胞によ るノ ニ ング]

パユングには、 ヒ ト赤血球細胞を用いた。 各パニングにおい て、 約 1 0 ^{1 2} p f u のフ ァージを、 1 % B S Aを含む

6 0 0 μ 1 の T B S に 5 1 の ヒ ト赤血球細胞を懸濁した液に 加え、 4 °Cで 5 時間の回転式培養 した。 細胞をペ レ ッ ト と して 回収 し、 1 m l の T B S で 4 °Cで 2 回洗浄した。 フ ァ ージを含 む最終細胞ペ レッ ト に、 2 m l の （ O D ₆ 。 。 l ) S u r e c e 1 1 s を加えて培養 した。 3 7 °Cで 1 5 分間培養した後、 大腸菌細胞を、 m U 1 t i p 1 e H E M ( p H 7 . 0 ) Z c a r b e n i c i 1 1 i n p l a t e s 上に移し、 3 7 °C で 8 時間培養 した。 大腸菌細胞培養上澄みから フ ァ ージ懸濁液 を調製し、 こ の操作を 3 回繰り 返した。

[改変レク チンの D N A配列決定と フ ラ グ . ぺプチ ド導入] 1 回 目 のパユングによ り 得られたク ローンは 2 . 7 4 X 1 0 ⁷ 個、 3 回 目 のバニングののちに得られたク ロ ーンは 1 X 1 0 ⁹ であった。 ラ ンダムに選んだ 2 8 8 ク ロー ン のア ミ ノ酸配列を 決定したと ころ、 そのう ちの 1 0 ク ローン （図 9、 1 〜 ¥ 1 0 ) が野生型 M A H と 異なるァ ミ ノ 酸配列を持っていた。

各改変 M A H c D N A - p C o m b 3 は、 セ ン ス · プライ マー ( s e n s e p r i m e r ) N — F 1 a g — X A o I ： 5 ' - C C A G G T G A A A C T G C T C G A G T C A G A T G - 3 ' を用い、 また、 アンチセ ンス ' プライマー （ a n t i s e n s e p r i m e r ) N — F l a g — H 7 1 1 ： 5 - T C C A C C G C C A G A T C T C T A T G C A G T G T A A C G - 3 ' を用いて、 P C R された。 得られた P C R生成物 は、 P C R回収キッ ト （ P C R p u r i f i c a t i n K i t

( Q I A G E N社製） ） を用いて回収 し、 制限酵素 X li o I お よび 7 I I によって処理した。 処理されたものは、 X h o 1 / ^ ^ 7 1 1 消ィ匕した 1 & _§ —八丁 3 ( S i g m a社製） にラ ィゲー ト した。 得られた各プラス ミ ドは、 大腸菌 （ E . c o 1 i ) J M 1 0 9 に組み込んた。

[ ブ ラ グ融合プロティ ン の発現]

既知の発現プラスミ ドを含む大腸菌 （E . C o l i ) J M 1 0 9 を、 3 7 。Cで 3時間、 1 πι M C a C 1 2， M n C 1 2 , 2 0 m M M g C 1 ₂を含む H E M培地において培養した。 i s o p r o p y 1 β - D - t h i o g a l a c t o s i d e ( I P T G : f i n. a 1 c o n c e n t r a t i o n 1 m M ) をカ卩えてフ ラグ融合プ 口 ティ ンの発現を誘起したのち、 さ らに 3 7 °Cで 3 時間培養 し た。 培養 した大腸菌を、 9 6 0 0 r p mで遠心分離 してペ レ ツ ト と し、 T B S ( T r i s B u f f e r e d S a l i n e ) に懸濁 した.。 こ の懸濁液を液体窒素と 3 7 °Cの ウォーターパス を用いて、 凍結と解凍を 5 回繰り 返した。 得られた懸濁液は、 4 °C、 3 0 分間 1 5 0 0 0 r p mで遠心分離 した。 フラ グ融合 プロテイ ンが含まれている上澄みを取り 、 B C Aプロテイ ン . ァ ッセづ ' キッ ト 、 B C A p r o t e i n a s s a y k i t ( P I E R C E社製） ） によって蛋白質成分を定量した。

<実施例 2 〉

[ I g Aグライ コ フ ォームの識別]

上述の レク チンライ ブラ リ を I g Aグライ コ フ ォ ーム識別法 に適用する場合の 1 例を以下に順序をおつて説明する。

1 ) M A H レク チ ン （ィ ヌ ェ ンジユ マ メ レク チ ン） 糖認識部 位のアミ ノ 酸配列を改変 した遺伝子改変レク チンライブラ リ一 を作成する。

2 ) I g A腎症患者 I g Aに親和性の高い レク チンをパニン グ法によ り 選択 し、 レク チンサプライ ブラ リ ーを作製する。

3 ) 上記の 2 ) で得られたレク チンサプライ ブラ リ ーの中力 ら必要に応 じ I g A腎症患者と健常人の I g Aの違いを よ く 反 映する レク チンを選び、 マイ ク ロ タイ タープレー ト に固定した レ ク チ ンプ レー ト を作製する。

4 ) I g A のグライ コ フ ォ ー ム の レク チンライ ブラ リ 一によ る識別 I g A腎症患者と健常人の血清 I g A の レク チンプ レー トへの結合パター ンの比較 . 解析を行 う。

5 ) 血清診断ア ツセィ条件の検討市販健常人 I g Aに糖鎖を 酵素的 · 化学的に付加 し、 人工 I g Aを作製する。 健常人血清 に人工 I g Aを混合 し、 レクチンプレー ト を用いたパターン解 析を行 う 。 血清中に存在する他の血清蛋白質の影響を検討し、 アツセィ条件の最適化を行う。

本方法のメ カニズムをよ り 詳し く 説明すれば、 I g A 腎症 患者で O (ォゥ） 一結合型糖鎖の糖鎖異常が見 られる I g A ヒ ンジ部分のア ミ ノ 酸配列の う ち、 O (ォゥ） —結合型糖鎖を付 加でき るのはセ リ ンまたはス レオニ ン残基のある 5 箇所であ り 、 〇 （ォ ゥ） 一結合型糖鎖のパターンは 6 種類あるので、 ヒ ンジ 部分 O (ォゥ） 一結合型糖鎖の位置と糖鎖構造は理論上 6 ⁵通 り . つま り 7 ， 7 7 6 通 り ある こ と になる。 ひとつひと つの可能性 を従来から行われている煩雑な糖鎖解析によ って調べる こ と は 困難であるが、 O (ォゥ） —結合型糖鎖を認識する レク チンへ の O Nノ O F F によ ってパター ン解析を行 う こ と ができ る と 考 える。 ひと つの レク チンに対する O N Z O F Fでは 2通 り の糖 鎖結合様式を調べる こ と ができ、 n個の レク チンでは 2 ⁿ通 り の パターン認識が行えるはずである。 したがって、 計算上は ヒ ン ジ部分の糖鎖異常 7 ， 7 7 6 通 り を解析するために必要な レク チン数は 1 3 個である。 実際には糖鎖構造および糖鎖の位置情 報を顕著に示すこ と のでき る レク チンがあっての理論上の数字 ではあ るが、 基質にプロ ッ トでき る数百個の レク チンか らの情 報で I g A ヒ ンジ部分の糖鎖構造と位置を解析でき る可能性が 高い。 有用な レ ク チンライ プラ リ ーを得る ために、 患者血清 I g A と健常人血清 I g Aの違いをも っ と も大き く 反映する レ クチン群をク ラス ター解析によ って取得する こ と ができ、 有効 なレク チンライ プラ リ ーを構築する こ と ができ る。 その レク チ ンライ ブラ リ ーを用いて、 I g A腎症患者と健常人血清 I g A のグライ コフォームの違いをパターンによ り解析する （図 1 1 ) 。 こ の図において、 試験管 6 2 に入った血清 I g Aを含む液 6 2 を ピぺッ ト 6 4 で取 り 、 レク チンチッ プ 7 0 の上に固定させて いる レクチンライ ブラ リ の各種レクチン 7 2 の上に滴下 し、 洗 浄後抗 I g Aによ り 発色 させ、 発色 したスポッ ト 7 4 と しない スポッ ト 7 2 によ り 1 つのノ ターンを作る こ と ができ る。 これ を表 8 0 にま と めれば、 検査結果が定性および定量的に判断で き得る。 こ の図では、 複数の O— ダ リ カ ンを含む糖タ ンパク質 である I g A l のプロ フ アイ リ ングを簡単に行 う よ うすが示 し てある。 慢性腎不全状態になっている よ う な重症患者と の違い のほか、 I g A腎症と診断されていない軽症患者予備軍の早期 診断への応用可能性もある。

以上のこ と を確認するために、 以下の実験を表 2 に示す材料 で行った。 表 2 . 実験に用いた材料

H u m a n - I g A l , P l a s m a ( C A L B I O C H E

M # 4 0 0 1 0 5 ) 丁 8 3 ( 11 7 . 5 ) で 5 / 111 1 に希釈 シアル酸切断処理 H u m a n — I g A l 、 P l a s m a ( C A L B I O C H E M # 4 0 0 1 0 5 ) ： T B S ( p H 7 . 5 ) で 5 μ g / m 1 に希釈

• 人エ レク チン ( Y 1 〜 Y 8 、 Y 1 0 ) お よ び野生型 レ ク チ ン を含むライセー ト ( l m g m l )

- レク チンを含まない p F L A G — A T S の ラ イ セー ト （ l m g / m 1 ) ： コ ン ト ロ ーノレ用

• m o u s e a n t i — L A G 2 m o n o c 1 o n a l 抗体 （ S I G M A # F — 3 1 6 5 ) ： 原液を 1 % B S A Z 丁 8 3 丁で 1 0 0 0倍に希釈

• H R P — g o a t a n t i — m o u s e I g G ( H + L ) 抗体 （ Z y m e d # 6 2 — 6 5 2 0 ) ： 原液を 1 % B S A Z T B S Tで 1 0 0 0 倍に希釈

- A B T S / H 2 O 2 A B T S 0 . 2 7 4 g 、 C i t r i c a s i d 1 0 . 5 g を M i 1 1 i 一 Q 5 0 0 m l に溶力、 し、 N a O Hで p H 4 . 2 に合わせ、 使用直前に H ₂ 0 ₂を l / l 0 0 0量加える。

• 9 6 w e l l - E L I S A p l a t e ( S U M I L O N # M S — 8 9 9 6 F ) 9 6 w e 1 1 — E L I S A プ レー ト に H u m a n — I g A を 5 0 /z l ( 0 . S S /i g Z w e l l ) ずつ入れ、 4 °Cで一 晚静置 して抗体を ゥ エルに固定 した。 ゥ ヱルを T B S で 3 回洗 い B S A / T B S 2 0 0 μ 1 をカ卩 え、 室温でプ ロ ツ キ ング した。 3 時間後、 ゥ エルを T B S で 3 回洗い、 各 ゥ エルに 人エ レ ク チ ンを含む ラ イ セー ト を 5 0 /i 1 ( 5 0 μ g / w e 1

1 ) ずつ入れた で用 いた レク チンラ イ ブラ リ のぺプチ ド 配列を図 9 に示す。 こ では、 N末力 ら数えた 1 2 7 番 目 のァ ノ 酸のか ら 1 3 7 番 目 のア ミ ノ 酸の配列が記載 されてい る が 残 り は天然の M A H レク チ ンのア ミ ノ 酸配列 と 同 じであ る 力 ら わカ る よ う の レ ク チンラ イ ブラ リ に は、 ク 口 ン か ら 1 0 ( Y 1〜Y 1 0 ) までの種類の人エ レ ク チ ンが含まれ ていた。 室温で 2 時間おいて ライ セー ト 中 の レ ク チ ンを結合 さ せたの ち、 ゥ エルを T B S T ( 0 . l % T w e e n / T B S ) で 3 回洗い、 ； m o u s e a n t i — F L A G M 2 m o n o c l o n a l 抗体 （ S I G M A # F — 3 1 6 5 ) を 5 0 μ 1 ずつ入れた。 室温で 3 0 分反応 さ せてか ら 、 ゥ ヱルを T B S T で 3 回洗い， H R P - g o a t a n t i - m o u s e I g G ( H + L ) 抗体 （ Z y m e d # 6 2 — 6 5 2 0 ) を 5 0 μ 1 ずつ入れた。 室温で 3 0 分反応させたのち、 ゥヱルを T B S T で 3 回洗い、 各ゥエル A B T S / H ₂ 0 ₂ を 5 0 μ 1 ずつ力 [Iえて 発色させ、 プレー ト リ ーダーで吸光度 （ 4 0 5 、 4 9 0 n ) を測定 した。 I g A 1 お よび糖鎖が切断された I g A 1 につい て、 各人エ レク チンへの結合が測定され、 以下の よ う な結果が 出た (図 1 0 、 1 2 ) 。 こ の こ と 力、ら、 レク チンライ ブラ リ が I g Aグライ コ フォーム の検出に有用である こ と が確認された。 また、 このこ と から、 本発明の レク チンライ ブラ リ が、 いわゆ るプラ ズマ ' フ ェ レシス においても有効である こ と が示された。

I g A 1 のシアル酸切断処理は以下表 3 に示す材料で以下の よ う に行った。 表 3 . シアル酸切断処理に用いた材料

H u m a n - I g A l , P l a s m a ( C A L B I O C H

E M # 4 0 0 1 0 5 ) ： 1 m g / m 1

ノ イ ラ ミ ニダーゼ （ N a k a l a i T e s q u e # 2 4

2 2 9 - 6 1 ) ： 2 . 0 u n i t / m 1

酢酸ナ ト リ ウム緩衝液 [ 0 . 2 M酢酸ナ ト リ ウム （ p H 5 . 5 ) 、 0 . 4 M N a C 1 ]

H u m a n— I g A 1 に等量の酢酸ナ ト リ ゥム緩衝液をカ卩え、 溶液の p Hを、 ノ ィ ラ ミ ニダーゼを 0 . 5 μ 1 ( 1 u n i t ) 加える。 3 7 °Cの水浴でー晚反応させ、 I g A 1 の シアル酸を 切断する。 T B S を加え、 溶液の p Hを中性に戻す。 シアル酸 切断確認は ビォチ ン標識精製 P N A ( ピーナッ ツ レ ク チ ン ； 生 化学工業 # 3 0 0 4 3 0 ) および M A L II (ィ ヌ ェ ンジユ レ ク チン ； V E C T O R # B — 1 6 2 5 ) への結合によ っ て確 認された。

<実施例 3 >

[間葉系幹細胞由来骨芽細胞亜集団の識別]

上述の レク チンライブラ リ を骨芽細胞の識別や分化ス テージ の異なる亜集団を検出する方法に適用する場合の 1 例を以下に 順序をおつ て説明する。

1 ) M A H レク チ ン (ィ ヌ ェ ンジユ マメ レ ク チン） 糖認識部 位のァ ミ ノ 酸配列を改変 した遺伝子改変レク チンライ ブラ リ一 を作成する。

2 ) レ ク チ ンライブラ リ 一の作製骨芽細胞に親和性の高い レ ク チンをパユング法によ り 選択 し、 レク チンサブライ ブラ リ ー を作製する。

3 ) 上記の 2 ) で得られた レク チンサプライ ブラ リ ーの中力 ら必要に応 じ分化のステージをよ く 反映する レク チンを選び、 マイ ク ロ タ イ タ 一プ レー ト に固定化 した レク チンプ レー ト を作 製する。

4 ) 骨芽細胞の分化誘導と レク チンライ プラ リ ーによ る識另 培養 した間葉系幹細胞を培養 · 分離する。 よ り 具体的には、 間 葉系幹細胞を培養後、 骨芽細胞に分化させ、 分化開始か ら 5 Θ 目、 1 0 日 目 、 1 5 日 目、 2 0 日 目 の細胞を分離する。

5 ) 分化過程の各時点で分離 した細胞を レク チンプレー ト に て分析 し、 細胞表面糖鎖構造と骨形成能と の相関を検討する。 骨形性能の測定には骨型アル力 リ フォ ス フ ァ ターゼ活性の測定 およびォステオカルシン含有量の測定を行 う （標準の作成） 。 即ち、 分離 した細胞を骨芽細胞を足場となる b — T C P プロ ッ ク と の複合体の形でラ ッ ト背部皮下に移植 し、 移植後 4= 週、 8 週において摘出後、 （ i ) ォステオカルシン含有量と、 （ i i ) 骨型アル力 リ フ ァ スファ ターゼ活性を測定する。

6 ) 分化過程が不明の細胞を レク チンプレー トで分析 し、 標 準と比較する。 図 1 3 では、 骨芽細胞の分化度のプロ フ ァイ リ ングを簡単に行 う よ う すが示してある。

注射器 9 0 によ り 採取 した自 己の骨髄細胞をぺ ト リ 皿等 9 2 にと り 、 分化誘導前に上述のレクチンチップ 7 0上に滴下する。 洗浄後細胞を染色 して発色部 7 8 と 非発色部 7 6 か ら 1 つ のパ ターンを作る こ と ができ る。 この結果を踏ま えて、 分化誘導後、 骨芽細胞を骨再生のために注射器 1 0 0 で移植する こ と ができ る。 即ち、 得られたパター ン 9 6 のプロ フ アイ リ ングか ら、 骨 再生の基準を達成 している こ と を確認する こ とができ る。

以下のよ う な例を示すこ とができ る。

表 4 に示す材料を用いて、 C 3 H Z H e マ ウス骨髄細胞か ら 分化誘導を行 う こ と によ って得られた細胞の う ち、 心筋細胞へ の分化能をもつ 9一 1 5 C細胞 （M a k i n o e t a 1 ： T h e J o u r n a l o f C l i n i c a l I n v e s t i g a t i o n 、 M a r c h 1 9 9 9 、 V o l u m e 1 0 3 、 N o 5 ) と骨芽細胞への分化能をもつ K U S A Z A l 細胞 ( K o h y a m a e t a l .- D i f f e r e n t i a t i o n 、 2 0 0 1 、 6 8 ： 2 3 5 - 2 4 4 ) に対する レク チ ンライ ブラ リ の結合活性を R e v e r s e C e l l E L I S A法によ り 測定 した 表 4 . 実験に用いた材料

人エレク チン （ Y 1 〜 Y 8 、 Υ 1 0 ) および野生型 レク チン を含むライセー ト （ I m g Zm l )

レク チン を含まない： F L A G — A T S の ライ セー ト （ 1 g / m 1 ) ： コ ン ト ロ ーノレ用

細胞 （ K U S A Z A 1 および 9 一 1 5 C ) ： 1 % B S A / P

B Sで 7 . 5 X 1 0 ⁵ c e l l s / m l に調整

(細胞は慶応義塾大学医学部病理学教室 · 梅澤博士よ り ） m o u s e a n t F L A G M 2 m o n o c l o n a l 抗体 （ S I G M A # F — 3 1 6 5 ) : T B S ( p H 7 . 5 ) で 5 μ g / m 1 に希釈

0 % ク リ ス タルバイ オ レ ッ ト ( 2 5 %メ タ ノ ール）

9 6 w e 1 1 - E L I S A 1 a t e ( S U M I L O N

# M S — 8 9 9 6 F )

R e v e r s e C e l l E L I S A法は以下のよ う に行 つた。 9 6 w e 1 1 — E L I S Aプレー ト に抗 F L A G抗体を 5 0 /z 1 ( 0 . 2 5 At g / w e 1 1 ) ずつ入れ、 4 °Cでー晚静 置 して抗体を ゥ エルに固定した。 ゥエルを T B S で 3 回洗い、

3 % B S A / T B S 2 0 0 μ 1 を力 Dえ、 室温で 3 時間プロ ッ キング した。 ウ エノレを T B Sで 3 回洗い、 各人エ レ ク チ ンを含 むライセー ト を 5 0 μ 1 ( 5 0 g / w e 1 1 ) ずつ入れ、 温で 2 時間おいてライセー ト 中のレク チンを結合させた。 ゥェ ルを T B S T ( 0 T w e e n / T B S ) で 3 回洗い 各 ゥエルに細胞浮遊液を 1 0 0 1 ( 7 . 5 X 0 c e l l s w e 1 1 ) 力 Bえた 0 0 0 r p mで 5 分、 室温でプレー ト 遠心 し、 細胞を ゥエルの底へ沈める。 室温で 2 時間静置 し、 細 胞と レクチンを結合させる。 ゥエルを P B S で 2 , 3 回洗 う バッファーが細胞に直接当たらないよ うにする。 ゥエルに 0 . 2 5 グルタルアルデヒ ド Z P B S を Ι Ό Ο μ 1 カ卩え、 レク チンに結 合した細胞を 3 0 分間固定する

ゥエルを T B S で 3 回洗い、 0 . 2 %ク リ ス タ ルノ ィ ォレ ツ ト ( 2 5 %メ タ ノ ール） を適量 （細胞が浸る程度） 加えたのち

5 〜 1 0分室温で放置 し、 細胞を染色する。 プレー ト を水洗い し、 ゥエルを風乾 して力、 らア ツセィ用ァノレ コ ー ノレ ( 1 0 %メ タ ノ ール、 4 0 %エタ ノ ール、 5 0 %水） を 2 0 0 1 カ卩え る。 3 7 °Cで 1 0分イ ンキ ュベー ト したのち にプ レー ト リ ーダー で吸光度 （ 5 5 0 n m ) を測定 した。 結果は図 1 4 に示す。 改 変を行っていないワ イ ル ドタイ プ （ w t ) と の相対値を示 した。

こ のこ と から、 レクチンライ プラ リ が間葉系幹細胞由来の細 胞亜集団の分別同定に有用である こ と がわかった。

[他の間葉系幹細胞由来の細胞亜集団の識別/分画]

他の間葉系幹細胞由来の細胞亜集団 と して、 K U M 5 細胞の 識別を確認した。 KUM 5細胞は、 K U S A— A 1 および 9 一 1 5 C 細胞同様、 不死化遺伝子を含むマ ウ ス間葉系幹細胞で、 分化誘 導をかける と軟骨細胞に分化する。 人エレクチン （Y 1 〜Y 1 0 ) および野生型レク チンを含むライセー ト （ l m g Z m l ) を用 いて上記間葉系幹細胞由来骨芽細胞亜集団の識別と 同様に行つ た、 R e v e r s e C e l l E L I S Aの結果を図 1 7 に 示した。 図 1 7 B力 ら、 Y— 9 は、 K U S A— A 1および 9 一 1 5 C 細胞を認識せず、 これら に殆ど結合 しないのに対 し、 K U M 5 細胞に強く 結合する こ と が示-された。 従って、 当該 Y — 9 また は Y — 9 を含むレク チンライ ブラ リ によ り 、 K U M 5 細胞のよ う な軟骨細胞への分化を示す間葉系幹細胞を識別する のみな ら ず、 これを分画でき る こ と が示された。 特に、 K U M 5 細胞は、 軟骨細胞に特異的に結合するので、 E S細胞など幹細胞を分化 させる と き の n e g a t i v e s e l e c t i o n に使 う こ と が可能である こ と が理解される。 また、 今までの と こ ろ、 軟 骨に特異的なマーカーは存在せず、 抗体もつく られていないこ と から、 本発明の レクチンライ ブラ リ 一が当該目的に極めて有 効である こ と が示された。

<実施例 4 >

c o 1 o n 3 8細胞は、 C 5 7 B L Z 6マウスに i n v i v o で化学発癌によって作られ、 マ ウス個体で継代されて確立され た癌細胞株である （ C o r b e t t e t a 1 ： C a n c e r R e s 3 5 、 2 4 3 4 — 2 4 3 9 、 1 9 7 5 ) 。

c o 1 o n 3 8 細胞をマ ウス脾臓に注射 したのちに肝転移を おこ した細胞を i n v i t r o で培養と い う i n v i v o と i n v i t r o のサイ クルを 4 回繰り 返すこ と によ り 、 同 所移植の系でも高頻度の肝転移形成が見られる非常に転移性の 高い細胞株 S L 4 が得られた。

転移性能の異なる 2つの細胞株と人エ レクチン と の結合性を 解析 した。 以下に方法を示す。 [ループ D における延長]

癌細胞の転移性を判別するために以下の手順でレクチンライ ブラ リ を準備 した。 M A H のループ D の中央部 6 箇所 （ァ ミ ノ 酸配列 2 1 9〜 2 2 4の前） に 1 アミ ノ酸を挿入する こ とによ り 、 糖鎖認識特異性の異なる多様なレクチンを含むライブラ リ一を作 製した。 ベク ターに N末に F L A Gタ グを付加する p F L A G — A T S を用いたが、 マルチク ローニングサイ ト には M A Hを/祖 み込むのに都合の良い制限酵素部位が無かったので、 S i t e 一 D i r e c t e d M u t a g e n e s i s のフ ロ ト コ一ノレ に従い、 B g l I I s i t e を S p e I s i t e に作 り 変えた。 まず、 改変したい部位を含むプライマーを s e n s e 側、 a n t i 側でまった く 相捕的になる よ う に設計 した。 次 に P C Rを行い、 D p n I 1 1 をカ卩え、 3 7 °Cで 1 時間 イ ンキュベー ト した。 こ の D N A溶液をそのまま用いて X L 1 一 B l u e に ト ラ ンス フ ォ ーメ ーシ ョ ン した。 再度に、 得られ た コ ロ ニーをシ ョ ー ト 力ノレチヤ一 してプラ ス ミ ドを回収 し、

B 1 g D y e T e r m i n a t o r C y c l e S e q u e n c i n g によ り その D N A配列を読んで、 改 p F L A G — A T S を同定した。 （表 5 参照） 表 5 ベタ ターの作成

P C R反応液の組成 （ t e m 1 a t e ( p F L A G - A T S ) ; 1 1 、 p r i m e r ( p F L A G — S e I ― s e n s e 1 0 0 n g / μ 1 , p F L A G - S p e I — a n

1 0 0 n g β 1 ) ； 各 2 5 μ 1 、 1 0 X P C R b u f e 5 μ 1 d N T P μ 1 M 1 1 Q 4 0

5 μ I p f u t u r b o ; 1 /i l )

P C R の反応条件 （ 9 5 °C 3 0 s e c 、 1 2 サイ クノレ [ 9 5 °C

3 0 s e c 、 5 5 °C l m i n 、 6 8 °C 1 0 m i n ] ) プライマーの配列

p F L A G — S p e I — s e n s e ： 5 ' — c c g g g t a c c t g c a c t a g t a g a t a g a t g a g c t c

F L A G — S p e I — a n t i ： 5 ' — g a g c t c a t c t a t c t a c t a g t g c a g g t a c c c g g

[ベタ ターの移しかえ]

野生型 M A H c D N A と M A H由来の人工の c D N Aを p

F L A G — C T S から P C Rで増幅 して制限消化 （ X h o I c o n e と S p e c o n e (ロ ッ シュ社製） ) し 改 p F L A G — A T S に組み込んだ。 これを J M 1 0 9 に ト ラ ンス フ ォーメ ーシ ョ ン し 、 得 られた ク ロ ー ンを B i g D y e f e r m i n a t o r し v c l e e q u e n c i n g に よ り 同定 した。 （表 6参照） 表 6 . ベク ターの移 しかえ

P C R反応液の糸且成 （ t e m 1 a t e 5 μ 1

in e r ( N - F 1 a g - X h o I 0 0 n g / μ 1 M A H

- S p e a n t 0 0 n g / μ 1 ) ； 各 0 . 5 μ 1 d N T P 4 μ 1 0 X P C R b u e r 5 ^ 1 T a q G o 1 d l 、 M i l l i Q 3 8 . 5 μ 1 )

P C R の反応条件は一般的なも の （ 9 6 °C 5 m i η , 3 0 サ ィ ク ル [ 9 6 °C l m i n 、 5 5 °C m i n 、 7 2 。C 2 m n ] 、 7 2 °C 5 m i n )

プライ マーの配列

p F L A G — X h o I : 5 ' — c c a g g t g a a a c t g c t c g a g t c a g a t g

M A H — S p e I — a n t i ： 5 ' — t g g g c a a c t a g t t g c a g t g t a a c g t g c g

シーケンス に用いたプライマーの配列

N — 2 6 ： 5 ' ― c a t c a t a a c g g t t c t g g c a a a t a t t c

し o o p u — s e q : 5 — g t t a a t a g c a t c t c t a g t t t a c c c

[ループ D の伸張]

制限酵素と して（ X h o I . c o n eおよび B g l I I . c o n e ) を用いて上記と 同様にク ロ ー ンを作成 し、 単離 · 同 定した。 ラ ンダムにア ミ ノ 酸を揷入するプライマ ーを用いた改 変では、 単離できなかったク ローンについては、 個別にプライ マ ーを設計 して同 じよ う に単離 · 同定 した。 （表 7 参照）

[改変 M A H c D N Aを持つク ローンの単離 · 同定] マノレチク ロ一ユングサイ トの B g 1 I I s i t e を S p e I s i t e に変換する こ と ができた。 目 的の部分以外には変 異は存在 しなかった。 理論上予測される 1 2 0種類の改変 M A Hを単離 · 同定する こ と ができた。

表 7 . ラ ンダムに改変する時に用いたプライ マ ー N — F 1 a g — X h o I ： 5 ^f — c c a g g t g a a a c t g c t c g a g t c a g a t g

L L D 3 ： 5 ^T — c t a c a a g a t c t a a c a t c g t g g g t t t c a a c t g c m n n t t t a g g a g c a c c c g t g g c a g c a g a

L L D 4 ： 5 ' — c t a c a a g a t c t a a c a t c g t g g g t t t c a a c t g c t t t m n n a g g a g c a c c c g t g g c a g c a g a

L L D 5 : 5 ^T — c t a c a a g a t c t a a c a t c g t g g g t t t c a a c t g c t t t a g g m n n a g c a c c c g t g g c a g c a g a

L L D 6 ： 5 ' — c t a c a a g a t c t a a c a t c g g t g g g t t t c a a c t g c t t t a g g a g c m n n a c c g t g g c a g c a g a

個別に設計したプライマ ー

M A H 1 o o p D — l P h e ： 5 ^T — c t a c a a g a t c t a a c a t c g t g g g t t t c a a a a a c t g c t t t a g g a g c a c c c g t g g c a g c a g a

M A H 1 o o p D — 2 A s p ： 5 ^T — c t a c a a g a t c t a a c a t c g t g g g t t t c a a c a t c t g c t t t a g g a g c a c c c g t g g c a g c a g a

M A H l o o p D — 3 C y s ： 5 ― c t a c a a g a t c t a a c a t c g t g g g t t t c a a c t g c a c a t t t a g g a g c a c c c g t g g c a g c a g a

M A H l o o p D — 4 A s p ： 5 — c t a c a a g a t c t a a c a t c g t g g g t t t c a a c t g c t t t a t c a g g a g c a c c c g t g g c a g c a g a

M A H 1 o o p D — 6 P h e ： 5 ― c t a c a a g a t c t a a c a t c g t g g g t t t c a a c t g c t t t a g g a g c a a a a c c c g t g g c a g c a g a

[ B i g D y e T e r m i n a t i o r C y c l e S e q u e n c i ri g プロ ト コ一ノレ の変更]

今回のシーケンスでは、 既知のプロ ト コ一ノレを変更 して行つ ているので、 その変更点を箇条書き に して表 8 に示す 1

51 表 8 . プロ ト コールの変更点

P C R応液の組成 ：

5 X S q u e n c i n g B u f f e r 2 μ I → 1 O X P G R B u f f e r 2 μ 1

エタ ノール沈殿よ り調整後のシーケンスサンプルを溶かす溶媒 H i — D i F o r m a m i d e 2 0 ^ 1 → M i 1 1 i Q 2 0 M 1 -

[大腸菌溶解物 （ライセー ト の作製） ]

カルべニ シ リ ンを入れた H E M ( H i g h 1 v E n r i c h e d M e d i u m ) で単離 してある大腸菌をー晚短期培養 ( s m a l l — c u l t u r e ( o v e r n i g h t ) ) し た。 翌 日 、 H E M 2 0 m l 、 C a C l ₂ ( l M ) 2 0 μ 1 、

Μ η C 1 2 ( 1 Μ) 2 0 /x l 、 M g C l ₂ ( 4 . 9 M) 8 β 1 か らなる培地に短期培養 （ s m a 1 1 - c u 1 t u r e ) した大腸菌を 2 0 0 _μ 1 力！]えて、 3 時間予備的培養 （ p r e — c u l t u r e ) した。 こ こへ、 l O O m M I P T Gを 2 0 0 μ 1 加えて、 3時間培養し誘導をかけた。 次に 9 , 5 0 0 r p m で 1 0 分間遠心 して大腸菌を回収 し、 T B S 2 0 0 _M 1 に懸 濁 して一 8 0 °Cに保存した。 後 日 、 大腸菌を凍結 （液体窒素） と融解 （ 3 7 °C湯浴） を 5 回繰り 返 し、 1 5 ， 0 0 0 r p m で 2 0 分間遠心 して上清をライセ一ト と して回収 した。 こ のラ イ セー ト は、 タ ンパク定量を行った後に一 8 0 °Cに保存 し、 こ れを使用する準備が整ってからタ ンパク濃度 l rn g Zm 1 に希 釈 して 4 °C保存 した。

[ S D S — P A G Eおよびウェス タ ン · ブロ ッテイ ングによ る フ ラ グ融合プロティ ンの検出]

ライ セー ト 中に改変 F L A G — M A Hが存在してレ、る のか調 ベるために、 適当にサンプルを選んで S D S — P A G E、 およ ぴ、 ウ ェス ターン . プロ ッ ト を行った。 抗体染色では、 1 次抗 体と して、 a n t i — M A H r a b b i t p o l y c l o n a 1 抗体、 または、 a n t i — F L A G M 2 m o n o c 1 o n a 1 抗体を用い、 2 次抗体にはそれぞれ A P— g o a t a n t i 一 r a b b i t I g G t几体と、 A P — g o a t a n t i - m o u s e I g G抗体を用いて A B C キッ トで発 色させた。 フ ラ グ改変レ ク チンは、 フ ラ グ融合タ ンパク と して も M A H と しても発現が確認できた。 [ 2種の癌細胞の識別]

9 6 w e 1 l — E L I S A用プレー ト に p o 1 y - L - 1 y s i n e ( 1 /z g / w e 1 1 ) をひき （ 3 7 °Cで 3 0分間イ ン キュペー ト） 、 細胞溶液 （ 1 0 ⁵ c e 1 1 s / w e 1 1 ； C o 1 1 o n — 3 8 、 S L — 4 、 C a c o — 2 、 分ィ匕型 C a c o — 2 ) をカ卩え、 グノレタ ノレ ア ノレデヒ ド （ g 1 u t a r a 1 d e h y d e ( 2 5 % ) ) ； ( 1 μ g / w e 1 1 ) によ り これをプレー トへ 固定 （室温で 3 0 分間静置） した。 細胞を固定したプレー ト は T B S を入れて 4 °C保存 し、 更に、 3 % B S A / T B S でブロ ッ キング （室温で 3 時間振盪） して、 上で作製 した改変 M A H レク チンを含むライセ一 ト ( 5 0 μ g / w e 1 1 ) を力 I]えた （室 温で 2 時間振盪） 。 1 次抗体には、 a n t i — F L A G M 2 m o n o c 1 o n a 1抗体 （ 1 0 0 0倍希釈を 5 0 μ 1 / w e 1 1 ) 、 2次抗体には、 H R P— g o a t a n t i — m o u s e I g G 抗体 （ 1 0 0 0倍希釈を 5 0 / l Z w e l 1 ) を用いた （共に 室温で 3 0分間振盪） 。 A B T S /H 2 0 2 ( 5 0 1 / w e 1 1 ) で発色させ、 O D ₄ 。 ₅ / _{4 9} 。 を測定した。

図 1 6 は、 1 2 0種類の改変レク チンと C o 1 o n — 3 8 ま たは S L — 4 と の結合性を示す。 こ こ で、 C o l o n 3 8 、 S L 4 は同 じ起源であるが、 転移性の異なる 2 つの癌細胞セルラ イ ンである。 図'中、 1 Q と は、 囪 1 5 において、 1 の位置にグ ルタ ミ ンが入る こ と を意味 し、 2 C と は、 2 の位置にシスティ ン （ C y s t e i n e ) が入る こ と を意味 し、 3 D と は、 3 の 位置にァスノ ラ ギン酸 （ A s p a r t i c a c i d ) が入る こ と を意味 し、 3 S と は、 3 の位置にセ リ ン （ S e r i n e ) が 入 る こ と を意味 し 、 4 N と は 、 4 の位置 に ァ ス ノ ラ ギ ン ( A s p a r a g i n e ) が入る こ と を意味する。 即ち、 一般 には、 " n X " と は、 図 5 の " n " の位置に " X " と い う ア ミ ノ酸が挿入されたこ と を意味する。 上述の よ う に性質の異なる 細胞 と の結合性が異なる のは、 細胞表面の糖鎖の違いによ る も の と 考えられ、 従って、 これらの レク チン群を用いれば、 糖鎖 若しく は細胞の特徴を判別できる こ とになる。 特に、 C o l o n 3 8 と S L _ 4 のよ う に起源が同 じ細胞等においても、 それぞ れ結合性が異なる レクチンが存在 し、 その差異を明確にする こ と ができ癌細胞の転移性能の識別可能なライ ブラ リ が作製され 得る こ と が示された。 産業上の利用可能性

本発明によ り 、 レ ク チ ンライ プラ リ が血清診断 ·細胞の種類 · 分化ステージ等の違いを反映し、 診断方法と して有用である こ とがわかった。

そ して、 こ の新 しい方法で細胞表面の糖鎖や炭水化物を分析 する こ と に よ り 、 遺伝子発現だけに依存していた細胞の同定が 正確に行える こ と を意味 し、 細胞移植や細胞治療の開発に役立 つと考える。 また、 本研究では人エ レクチンライ ブラ リ をフ ァ ージミ ド系フ ァージの表面に発現させる こ と に成功 した。 改変 レクチンライ ブラ リ から特異性の異なる も のを選別する方法が 確立 したので、 こ の系を用いて既存の レク チンやモノ ク ローナ ル抗体にはない、 新規な糖鎖特異性を有する も のを得る こ と が でき る と期待される。

更に、 本発明の レク チンライ ブラ リ を用いる と I g Aのダラ ィ コフォームの検出や骨芽細胞亜集団の分別 · 同定する ツール を提供する こ と ができ る。 即ち、 I g Aを含む各種血清蛋白質 のグライ コ フ ォ ーム の解析を簡便 · 迅速に診断する対外診断薬 を提供する こ と も可能であ り 、 再生医療や細胞医療を実用化段 階に移行させるために必要な細胞の品質保証を行 う 規格設計ッ ールを提供する こ と も可能である。 例えば、 リ ウマチや自 己免 疫疾患時の免疫グロ プリ ンのグライ コ シ レーシ ョ ン、 癌患者の ある特定のホルモ ン （卵巣癌における絨毛性性腺刺激ホルモ ン の糖鎖変化） や蛋白質のグライ コシ レ一シ ヨ ン （肝炎から肝癌 に至る際のアル フ ァ一フ ヱ トプロテイ ンの糖鎖変化） 等、 疾病 の早期発見、 病態の正確な把握、 治療薬 · 予防薬への適用でき る。

種差に由来 して産生されるのが抗体の特徴である ので、 線維 芽細胞に対する特異的抗体を作製する こ と が困難なため、 骨髄 由来の線維芽細胞にはいわゆる細胞表面マーカーが存在せず、 骨芽細胞を直接ア ツセィする方法はな く 、 現在のと こ ろ動物を 用いたバイ オア ツセィ も し く は骨芽細胞の活性度を反映する間 接的なア ツセィ 法が主と して用い られている分野においても、 本発明の レク チンライ プラ リ を用いた レク チンチッ プで、 骨芽 細胞の識別 '同定、 と く に分化ス テージの異なる亜集団を識別 · 同定する こ と ができ る と.考え られる。 同様のアプローチで骨髄 由来樹状細胞おょぴ骨髄由来血管內皮細胞へ応用でき る可能性 がきわめて高 く 、 再生医療で用いる細胞の品質確保のスタ ンダ ー ドツールと な り える。 現在の癌遠隔診断ネ ッ ト ワーク においては病理診断が主体で あるが、 遺伝子発現情報を追加する こ と が検討されてお り 、 O (ォゥ） 一結合型糖鎖が細胞間相互作用、 細胞の浸潤、 接着等 に深く 関与 している知見も鑑み、 糖鎖情報を追加する こ と によ つて、 よ り 詳細な癌遠隔診断についての検討が可能となる。

Claims

請 求 の 範 囲

1 . 複数の種類の レク チンから、 指標と なる細胞若し く は擬 細胞体または糖タ ンパク 質若 し く は糖鎖に対する親和性に基づ いて選別 した少なく と も 1 種類以上の レク チンを含む、 糖タ ン パク 質若し く は細胞の識別、 血清若 し く は細胞診断、 或いは糖 タ ンパク 質若 しく は細胞分画用 レク チンライ ブラ リ 。

2 . O —結合型糖鎖を認識する レ ク チンを少なく と も 1 種類 以上含む請求の範囲第 1 項に記載の レクチンライ ブラ リ 。

3 . 前記指標と なる細胞または擬細胞体が赤血球またはグラ ィ コ ブイ リ ンである、 請求の範囲第 1 または 2項に記載の レク チンライ ブラ リ 。

4 . I g Aグライ コフ ォーム識別のための、 請求の範囲第 1 乃至 3 項のいずれかに記載の レクチンライ プラ リ 。

5 . 前記細胞識別が、 骨芽細胞亜集団識別、 間葉系幹細胞由 来の細胞亜集団識別または癌細胞転移性識別のいずれかである こ と を特徴とする請求の範囲第 1 乃至 3項のいずれかに記載の レ ク チ ン ラ イ プラ リ 。

6 . 請求の範囲第 1乃至 4 のいずれかに記載のレクチンライ ブラ リ を用いた糖タ ンパク 質若し く は細胞の識別、 血清若し く は細胞診断、 或いは糖タ ンパク 質若 し く は細胞分画方法。

7 . レク チン と被検体と の相互作用の表示が、 被検体に対す る他の親和性物質によ り 行われる請求の範囲第 6項に記載の方 法。

8 . 前記被検体に対する他の親和性物質が被検体に対する抗 体である、 請求の範囲第 6 または 7項に記載の方法。

9 . 前記血清診断が、 I g Aグライ コ フ ォーム識別であ る請求 の範囲第 6 乃至 8項のいずれかに記載の方法。

1 0 . 前記細胞識別が、 骨芽細胞亜集団識別、 間葉系幹細胞 由来の細胞亜集団識別ま たは癌細胞転移性識別のいずれかであ る こ と を特徴とする請求の範囲第 6 または 8 項に記載の方法。

1 1 . 請求の範囲第 1 乃至 5 項のいずれかに記載のレク チン ライ ブラ リ を含む診断キ ッ ト。

1 2 . 試薬の形態である請求の範囲第 1 1 項に記載のキッ ト。

1 3 . 被検体に対する他の親和性物質を更に含む、 請求の範 囲第 1 2項に記載のキッ ト。

1 4 . レ ク チンチ ッ プまたは レク チ ンセ ンサ一の形態であ る 請求の範囲第 1 1 項に記載のキ ッ ト。

1 5 . 請求の範囲第 1 乃至 5 項のいずれかに記載の レ ク チン ラ イ ブ ラ リ を含む糖タ ンパク 質若 し く は細胞分画、 分取または 除去装置。

1 6 . プラ ズマ · フ ェ レシス に用い る請求の範囲第 1 5 項に 記載の装置。