WO2004013625A1 - Vorrichtung und messverfahren - Google Patents

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WO2004013625A1
WO2004013625A1 PCT/EP2003/050350 EP0350350W WO2004013625A1 WO 2004013625 A1 WO2004013625 A1 WO 2004013625A1 EP 0350350 W EP0350350 W EP 0350350W WO 2004013625 A1 WO2004013625 A1 WO 2004013625A1
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WO
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substances
separation
separation medium
fluorescence
separated
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PCT/EP2003/050350
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French (fr)
Inventor
Dario Anselmetti
Jan Sebastian RÖGENER
Marc-Oliver Schierenberg
Franka Kalman
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Solvias Ag
Universität Bielefeld
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Priority to EP03766413A priority patent/EP1535056A1/de
Priority to US10/522,830 priority patent/US20050259256A1/en
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
    • G01N27/416—Systems
    • G01N27/447—Systems using electrophoresis
    • G01N27/44704—Details; Accessories
    • G01N27/44717—Arrangements for investigating the separated zones, e.g. localising zones
    • G01N27/44721—Arrangements for investigating the separated zones, e.g. localising zones by optical means

Definitions

  • the present invention relates to a device with a UV radiation source, optical elements for guiding UV excitation radiation, a separating medium for flatbed electrophoresis on which there are unstained, separate spots of electrophoretically separable substances, optical elements for guiding UV fluorescent radiation, and a UV -Detector.
  • the device is used for direct measurement and detection of electrophoretically separable substances by means of natural fluorescence radiation in the UV range.
  • electrophoresis and especially gel electrophoresis have long been retained.
  • the method is used for the qualitative and quantitative analysis of active pharmaceutical ingredients and pesticides and their metabolites, for the separation and analysis of amino acids, oligo- and polypeptides (proteins), DNA, RNA, monomeric, oligomeric and polymeric saccharides, and other biological substances in Cells and body fluids used.
  • gel electrophoresis in particular has increased in importance when examining cells (proteomics).
  • capillary gel electrophoresis for the separation of microns and flatbed electrophoresis with various flat separation media on inorganic or organic separation media Basis (silica gels, metal oxides, paper, celluloses, agarose gels, dextran gels, polymer gels, membranes and especially polyacrylamide gels) in horizontal or vertical electrophoresis apparatuses.
  • the electrophoretic separation can be carried out in accordance with various separation mechanisms, for example according to the ratio of size to charge, the diversity of the isoelectric points (isoelectric focusing) or according to the size, for which gradient gels or charged SDS complexes are used.
  • a combination of isoelectric focusing and SDS-PAGE electrophoresis is known as 2-D gel electrophoresis, which has become particularly popular in cell examinations (proteomics). If the separation on flat supports is carried out in only one dimension, one speaks of 1 -D flatbed electrophoresis
  • the substances to be analyzed are advantageously detected with the aid of spectroscopic methods such as absorption or fluorescence, the absorption spectrum and the measurement at characteristic wavelengths of luminescence radiation usually being carried out in capillary electrophoresis [see for example UB Soetebeer et al. In Journal of Chromatography B, 745 (2000), pages 271 to 278] or liquid chromatography (HPLC) is used.
  • the gels used in capillary gel electrophoresis are liquid (replacement gels), and measurements of natural fluorescence are no problem here, as in liquid chromatography, since hardly any disturbances are observed with regard to absorption and background radiation of the liquids.
  • Substance-specific staining methods are therefore mostly used to make the areas of the substances (spots, lanes) visible directly or via digital imaging methods on the surfaces after separation and, if necessary, to use them for quantification.
  • An overview of the different staining methods is provided by L. R Williams in "Training nucleics acids and proteins in electrophoresis gels", Biotech. Histochem. (2001) 76 (3), pages 127-132].
  • Even before one specific for a substance Staining generally involves fixing the samples to the gel with a fixative to avoid "bleeding" during the staining reaction in the staining and staining solutions, which can already cause undesirable changes.
  • a method that is sufficiently sensitive in protein analysis is the separation and binding of silver ions to proteins [BR Oakly et al., Anal. Biochem. 105, pages 361-363 (1980)], (Silverstaining), but with the low dynamic range and disturbances of the others Investigations are particularly important.
  • Another disadvantage of this staining method is that there is a discrimination between different proteins during staining, i.e. some proteins stain strongly and other proteins stain less strongly. It is not possible to estimate the relative amount or frequency of the various proteins in unknown protein samples, but this is one of the basic requirements in the research area of cell studies (proteomics).
  • D. Kazmin et al. propose in a recent publication [Analytical Biochemistry 301, pages 91 to 96 (2002)] to treat tryptophan-containing proteins under UV light with trichloroacetic acid or chloroform, and the regions of the separated proteins in a polyacrylamide gel by means of the excited to make visible fluorescent radiation (natural fluorescence of the modified tryptophan) visible.
  • the spectrum of native fluorescence is thus shifted from the UV range to the visible range.
  • Another known method is staining with fluorescent dyes in the visible range after electrophoretic separation.
  • One advantage is the high linearity of the dependence of the measured intensity on the quantity (dynamic range).
  • the treatment with chemicals can lead to washing out of low molecular weight substances which are not detected.
  • the change of substances when exposed to chemicals cannot be ruled out and therefore a quantitative reaction of all substances in a sample cannot be guaranteed.
  • a first subject of the invention is a device with the components: a) a UV source (1) for excitation light in the wavelength range from 140 to 320 nm; b) a separation medium (2) from a flat-bed electrophoretic separation of electrically charged substances, or a separation medium (2) from a flat-bed chromatographic separation of electrically charged or neutral substances; c) in the separation medium (2), areas of substances to be separated and separated as well as unlabelled substances which, when excited with said UV source (1), emit UV fluorescence in the wavelength range from 150 to 400 nm; d) a UV detector (3) for the UV fluorescent radiation; and e) optical or optoelectronic components for filtering, guiding and / or amplifying the excitation and fluorescent radiation.
  • the UV source (1) can be lasers or UV lamps, for example mercury vapor lamps, KrF lamps, Xe flash lamps, excimer gas emission lamps (e-lamp, TuiLaser) or lasers for or multi-photon excitation.
  • the desired wavelength can be set by connecting optical filters, gratings or other optical elements and focused with lenses to generate a sufficient energy density.
  • the lasers can be continuous or pulsed lasers with pulse lengths in the range from femto to milliseconds. UV lasers are often frequency multiplied lasers that generate radiation in the visible range.
  • the radiation can be directed onto the gel directly, in a focused manner or as an expanded beam or by multiple exposure.
  • the power and energy density is chosen so that a measurable fluorescence signal is generated without significantly damaging the substances.
  • the energy density can be, for example, 0.1 to 3500, preferably 1 to 500, and particularly preferably 1 to 50 mJ / cm 2 in one second. Particularly suitable for measuring proteins around 35 mW / cm 2 in one second.
  • Such UV light sources are commercially available.
  • a laser from Spectra Physics (model Tsunami) has proven to be particularly suitable, which operates at a wavelength of 280 nm (frequency of 840 nm), 80 MHz and 100 femtoseconds pulse length, and has an output power of 150 mW.
  • a frequency-quadrupled Nd; YAG laser system (266 nm wavelength, 500 ps pulse length, 4 mW output power) from JDS Uniphase has also proven to be particularly suitable.
  • the wavelength of the UV excitation light is preferably 140 to 320 and particularly preferably 220 to 300 nm.
  • the separation medium (2) can consist of different sheet-like materials. They must not be soluble in the solvent used and they must be dielectric. They can be inorganic materials, for example metal oxides and salts such as silicates. Some examples are aluminum oxide, titanium oxide, silica gel and diatomaceous earth. Other suitable materials are paper and cellulose. Particularly suitable materials are optionally crosslinked, gel-forming polymers, such as, for example, polyacrylamide gels, agarose gels and dextran gels.
  • the separation medium can be applied to a dielectric or electrically conductive support for the separation and / or for subsequent measurement, for glass, quartz or plastics, metal oxides and metals. Materials that reflect UV radiation, for example polished metal plates or plastic plates coated with metals, are particularly suitable for this.
  • Separation media for electrophoretic separation are widely known, described in the literature and commercially available. They are therefore not described in more detail here. However, it should be mentioned that gels based on polyacrylamides are mainly used for the important field of protein separation.
  • the separation media advantageously have low UV absorption and UV fluorescence in order to be able to achieve a high measurement sensitivity.
  • the electrophoretic separation medium can also be replaced by separation media for flat-bed or thin-layer chromatography, these separation media likewise advantageously having low UV absorption and UV fluorescence.
  • the chromatographic separation medium can consist of different sheet-like materials which are able to separate molecules with their own fluorescence in the UV range when excited with UV radiation, for example by different absorption and / or by different sizes. They must not be soluble in the eluent used and may be applied as a separating layer on a carrier. It can be finely divided inorganic materials, for example metal oxides and salts such as silicates. Some examples are aluminum oxide, titanium oxide, silica gel and diatomaceous earth. Other suitable materials are paper and cellulose.
  • Particularly suitable materials are, if appropriate, crosslinked, gel-forming polymers, such as, for example, polyacrylamide gels, agarose gels and dextran gels, which also form a layer on a layer as finely divided materials Can form carriers.
  • Crosslinked, gel-forming polymers such as, for example, polyacrylamide gels, agarose gels and dextran gels, which also form a layer on a layer as finely divided materials Can form carriers.
  • Flatbed chromatography can be used for both electrically charged and uncharged substances.
  • the separating media can be provided with a cover in order to achieve as flat a surface as possible and to protect them from drying out and aging, which is optically transparent for both the excitation light and the fluorescent light, since the radiation is directed onto the gel and the measurement of the fluorescent radiation is advantageous through the Cover is made.
  • Materials that are transparent to UV radiation are known. It can be plastics that are expediently designed as foils. Quartz glass is also very suitable.
  • the substances can be distributed in one or two dimensions in the separation medium.
  • the substances are not chemically modified for detection. They must be able to be excited to emit UV light.
  • Such substances contain, for example, aromatic or heteroaromatic radicals and / or optionally conjugated unsaturated carbon or carbon-heteroatom double bonds or nitrogen multiple bonds.
  • the heteroatoms can be selected from the group O, N, S and P.
  • the substances contain electrically charged groups, for example acidic groups (for example carboxyl, phosphorus or phosphonic acid, boron or boronic acid, and / or sulfur or Sulfonic acid groups) and / or basic onium groups (for example ammonium groups).
  • the separation media can be measured immediately after a separation operation or it can be stored samples. Before storage, substance areas are fixed in the separation media in a manner known per se, in the case of gels for protein separation, for example by treatment with alcohols such as methanol or ethanol.
  • the wavelength of the fluorescent radiation is preferably from 150 to 400 and particularly preferably from 230 to 400 nm.
  • Proteins can contain the amino acids phenylalanine, tryptophan and / or tyrosine, at which the emission maximum is at wavelengths of 282 nm, 303 nm or 348 nm.
  • the extinction coefficient is high in the wavelength range from 200 to 320 nm and proteins are therefore particularly suitable for the measuring principle according to the invention.
  • Many organic substances Zen with the structural elements mentioned above have similar properties and are accessible for measurement using the device according to the invention, such as, for example, also genetic material (DNA or RNA) which can be separated electrophoretically.
  • the UV detector (3) can be photodetectors for measuring the fluorescence intensity, many of which are commercially available. Suitable detectors are, for example, photomultipliers, photodiodes (semiconductor diodes or semiconductor diode arrangements or arrays) and UV-sensitive CCD cameras. CCD cameras (electronic cameras with digital image recording and playback) are preferred. UV-sensitive CCD cameras are offered, for example, by Andor (USA).
  • Component (d) can be optical filters for masking unwanted background and / or stray radiation, which are arranged in the beam path between the plate (3) and the UV detector. Optical filters can also be used to adjust the wavelength of the excitation light and to block out unwanted radiation from the UV light source.
  • the components can also be mirrors, prisms or diffractive elements for deflecting or collecting excitation light. Furthermore, lens or lens systems with which radiation is guided or focused are expedient. Spherical lenses can be used to expand a laser beam. Light amplifiers (residual light amplifiers) can also be used to increase the sensitivity. Dimming elements can also be arranged between the UV light source and the plate (3), which allow irradiation at defined time intervals.
  • FIG. 1 shows an embodiment of a device according to the invention.
  • the laser beam (4) of a UV laser (1) is expanded by a convex lens (5) and directed onto a cover (6) of the separation medium (2).
  • the cover protects a layer of acrylamide gel (7), which is applied to a rustproof and polished steel plate (8).
  • acrylamide gel there are areas of separate substances distributed over the surface that generate UV fluorescence (9) when irradiated.
  • the fluorescent radiation (9) is guided to a UV detector (3), for example a UV, via spherical lenses (10) and (11), between which a bandpass filter (12) is arranged, for example for the wavelength range 300-375 nm -sensitive CCD camera.
  • the arrangement according to the invention is outstandingly suitable for the direct measurement of substances in the separation medium (for example a gel) of a plate for 1-D or 2D gel electrophoresis or separation media for flat-bed chromatography, without the substances having to be marked before or after the separation ,
  • the non-separated or separated substances can even be transferred in a simple manner by means of blotting (action of an electric field perpendicular to the plane of the separation medium) directly onto an applied membrane and measured with the arrangement according to the invention directly using unlabeled antibodies.
  • the method offers considerable advantages over the standard methods used:
  • Another object of the invention is a method for the determination of substances separated by means of 1-D or 2D flat bed electrophoresis, in which non-separated and separated substances in the separation medium for electrophoretic separations are irradiated with a light source, and emitted fluorescent light is measured with a detector which characterized in that (a) upon exposure to UV light in the UV range, fluorescence-emitting substances (b) in the separation medium directly with UV light of a wavelength irradiated from 140 to 320 nm and (c) measures the UV fluorescence at wavelengths from 150 to 400 nm with a UV-sensitive detector.
  • the method can also be used for separation media in flatbed chromatography, in which the separation of electrically charged or uncharged substances is possible.
  • the digital image of the sample can be generated in different ways:
  • a section can be of any size (limited by the laser focus of approx. 200 nm) or of any size (as in 1).
  • a section can again be an image (e.g. contain several spots) or just a point of the later image (principle of the scanner). The smaller the section is selected, the more effectively the fluorescent light can be collected. Increased collection efficiency shortens the measuring time, reduces potential UV damage to the measured substances and improves the sensitivity of the device.
  • the a) sample itself can be moved, b) the detector can be moved, c) the excitation source can be moved, d) the excitation and emission light can be redirected, or combinations of a) - d) be used. If only a point or a line is excited, the background fluorescence (e.g. of the cover and / or sample holder) can be greatly reduced by confocal detection.
  • the background fluorescence e.g. of the cover and / or sample holder
  • the sample or sections of the sample can be measured several times in order to obtain a better detection limit.
  • UV lasers are advantageously used, which are commercially available on the principle of frequency multiplication for different wavelengths. They can be continuous or pulsed lasers. Pulsed lasers are particularly suitable, lasers with different pulse lengths being known, which can be in the range from microseconds to femtoseconds. Short pulse lengths in the femtosecond range are particularly advantageous since the excited fluorescence radiation has a service life that lies essentially between the individual pulses, so that only a little or no excitation radiation falls on the UV detector.
  • the excitation radiation is advantageously irradiated at an angle of less than 90 ° to the vertical of the plate (3).
  • the measurement can be carried out in different variants.
  • the excitation light can be expanded so that the entire separation medium is exposed, which is possible, for example, if the edge length is not too great.
  • the plate can be exposed once or several times in order to achieve sufficient fluorescent radiation for the measurement.
  • the process is very variable.
  • the conditions can be set so that photosensitive substances are spared and decomposition can be largely suppressed.
  • the process is also suitable for automation and standardization, which is particularly valuable for industrial use.
  • the substance ranges can also be determined spectrometrically, for example over a wavelength range from 180 to 400 nm. In this way, specific substances can also be identified on the basis of characteristic wavelengths of the fluorescent radiation directly on the separation medium, or after determining the separated substance areas with UV detectors.
  • the substances are colorless, therefore invisible, and cannot be seen with the naked eye.
  • One possibility for removal is to produce a transparent negative film on, for example, plastic films, which can be placed on the surface of the separation medium (gel) to indicate the substance areas.
  • Another possibility is the automated removal using a suitable computer program that evaluates digital recordings and controls a mechanical device for taking samples.
  • Another possibility is, for example, to display the substance areas with a visible laser (laser pointer) for manual removal.
  • the method according to the invention can be used in all areas in which separations and investigations of substances are carried out by means of gel electophoresis or flat bed chromatography.
  • An important area is biochemical research for the investigation of body fluids, or corresponding extracts and contacts. trates.
  • the study of proteins plays a particularly important role here (proteomics).
  • the method can be used for diagnostic examinations in which the presence of specific substances suggests certain diseases.
  • the distribution and degradation (metabolism) of active pharmaceutical ingredients and pesticides in body fluids of plants and animals, including warm-blooded animals, can be investigated using the method according to the invention.
  • the method can also be used to characterize and / or determine the effect of active substances (binding of active substances to separate proteins or nucleotide sequences) and for quality control of active substances.
  • the method can also be used for further analysis of proteins on separation media, in particular for the analysis of western emblots or similar methods in which separate substance areas are transferred from the separation medium to membranes and then determined by adding antibodies labeled with fluorescent dyes.
  • a particular advantage of the method is the detection of unlabeled antibodies by excitation and measurement of their own fluorescence in the UV range according to the method of the invention (in this case the membrane corresponds to the separation medium).
  • the method is very sensitive and allows the measurement of quantities up to 1 to 5 nanograms. It is therefore particularly suitable for examining the smallest amounts of substances.
  • diagnostic examinations the procedure is suitably automated and standardized with regard to sample preparation, separation and measurement conditions and evaluation after separation so that the determination of one or less disease-specific substances provides reliable information for subsequent medical treatment. Diagnostic examinations are carried out with samples taken from the human or animal body or plants, such as body fluids (blood, urine, blood plasma, gastric or intestinal juice, plant juices), or tissue samples, which may be processed before separation (cleaning and concentration, chemical pretreatment or production of cell lysates).
  • body fluids blood, urine, blood plasma, gastric or intestinal juice, plant juices
  • tissue samples which may be processed before separation (cleaning and concentration, chemical pretreatment or production of cell lysates).
  • the invention also relates to the use of the device according to the invention or the use of the method according to the invention for the separation and determination of disease-specific substances in samples taken from the human or animal body or plants.
  • Example 1 Separation of the proteins of a cell extract.
  • the experimental setup corresponds to the setup shown in Figure 1.
  • a UV laser from Spectra Physics is used as the UV light source (Tsunami ® , 840 nm, 80 MHz, 100 fs pulse length, frequency tripling to 280 nm excitation light, output power 150 mW).
  • the energy density on the surface of the separation medium (2) is 40 mW / cm 2 .
  • the exposure time is 1 second.
  • a commercially available UV-sensitive BCCD camera from LaVision Biotec Germany (QE> 65%) is used as the UV detector.
  • the separation medium (2) is applied as a 1 mm thick layer of a commercially available polyacrylamide gel on a stainless steel plate (8).
  • the polyacrylamide gel is covered with a 1 mm thick quartz plate (6).
  • the separation by means of 2-D gel electrophoresis is carried out according to Klose, J. Methods Mol Biol 1999, 112, 147-172 as a combination of isoelectric focusing (IEF) with carrier ampholytes (first dimension) and SDS-PAGE (second dimension).
  • IEF is carried out in gel-filled glass rods (diameter 0.9 mm, 7 M urea, 2 M thiourea, 3.5% acrylamide, 0.3% piperazine diacrylamide and a total of 4% carrier ampholyte pH 2-11).
  • the proteins come from cell lysates of cells EA.hy 926 [Edgell, C, JS Proc NatI Acad Sei USA 1983, 80, 3734-3737].
  • the proteins are fixed in the gel overnight (10% acetic acid, 50% ethyl alcohol and 40% triple distilled water). Before the measurement, a gel is washed for 45 min in 50 ml of triple distilled water (to reduce the background fluorescence), placed on the steel plate and covered with a quartz glass plate.
  • the camera takes a picture of the UV fluorescence; dark spots result from incorrect color representation in the image processing.
  • the illustration serves for a better comparison with the standard method "silver staining", in which the separated proteins are shown as black spots.
  • the image obtained is comparable to a separation made visible by means of silver ions.
  • Example 1 The arrangement according to Example 1 is used.
  • 1 D gel plates from Invitrogen (Karlsruhe, Germany, NOVEX 12% Tris-Glycine Gel 12 or 10 well 1 mm thickness No.EC60052 or EC6005) loaded with proteins of different molecular weights and separated (Lysozyme, (14, 6 kDa, chicken), bovine anhydrase (29 kDa), GAPDH (rabbit, 36 kDa), BSA (cattle, 66 kDa) and phosphorylase (rabbit, 97.4 kDa)
  • the proteins are mixed in equal amounts and in SDS buffer (NOVEX Tris-Glycine SDS denaturing samples buffer LC2676) diluted so that 500, 250, 100, 50, 25, 10, 5 and 1 ng per band (per protein) are present after application to the gel, according to [Laemmli UK, 1970, Nature 227: 680-685] eluent buffer: NOVEX Tris
  • the separated areas are made visible and compared according to the procedure in Example 1, as well as by the methods of silver marking and staining with Comassie Blue.
  • the sensitivity according to the procedure according to Example 1 is 1 to 5 ng detection limit, comparable to the method of silver labeling.
  • the detection limit for the Comassie Blue method is 10 to 50 ng.
  • the experimental setup corresponds to the setup shown in FIG. 1 and described in Example 1.
  • a UV laser system from JDS Uniphase (frequency-quadrupled Nd: YAG, 266 nm wavelength, 500 ps pulse length, 4 mW output power) is used as the UV light source.
  • the gels according to Example 2 are used as the separation system. It is shown that the use of the considerably less expensive laser system does not make any difference qualitatively and quantitatively to the results described in Examples 1 and 2. However, due to the lower output, exposure must be correspondingly longer (30 times).
  • Example 4 Blotting method with nitrocellulose membrane

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Abstract

Mittels 1 D- oder 2D-Flachbettelektrophorese oder -chromatographie nicht getrennte und getrennte Substanzen können direkt und ohne vorherige Markierung bestimmt werden, wenn man deren Eigenfluoreszenz im UV-Bereich mit einem UV-Detektor misst, die durch Bestrahlung mit UV-Licht im Wellenlängenbereich 140 bis 320 nm angeregt wird.

Description

Vorrichtung und Messverfahren
Die vorliegende Erfindung betrifft eine Vorrichtung mit einer UV-Strahlungsquelle, optischen Elementen zur Führung von UV-Anregungsstrahlung, ein Trennmedium einer Flachbettelektrophorese, auf dem sich ungefärbte, getrennte Flecken elektrophoretisch trennbarer Substanzen befinden, optischen Elementen zur Führung von UV-Fluoreszenzstrahlung, und einem UV-Detektor. Die Vorrichtung wird zur direkten Messung und zum Nachweis elektrophoretisch trennbarer Substanzen mittels natürlicher Fluoreszenzstrahlung im UV-Bereich verwendet.
Zur Trennung elektrisch geladener Moleküle nach Masse und/oder elektrischer Ladung hat sich die Elektrophorese und besonders die Gelelektrophorese seit langem bewahrt. Die Methode wird zur qualitativen und quantitativen Analyse von pharmazeutischen Wirkstoffen und Pestiziden sowie deren Metaboliten, zur Trennung und Untersuchung von Aminosäuren, Oli- go- und Polypeptiden (Proteine), DNA, RNA, monomeren, oligomeren und polymeren Sachariden, und anderen biologischen Substanzen in Zellen und Korperflussigkeiten eingesetzt. In letzter Zeit hat besonders die Gelelektrophorese bei der Untersuchung von Zellen (Proteomics) an Bedeutung zugenommen Neben der Gelelektrophorese in Kolonnen (Tis- sehusapparatur) für einen praparativen Masstab ist die Kapillargelelektrophorese zur Trennung von Mikromengen und die Flachbettelektrophorese mit verschiedenen flächenförmigen Trennmedien auf anorganischer oder organischer Basis (Silicagele, Metalloxide, Papier, Zellulosen, Agarosegele, Dextrangele, Polymergele, Membranen und besonders Polyacryl- amidgele) in horizontalen oder vertikalen Elektrophoreseapparaturen bekannt. Die elektro- phoretische Trennung kann ensprechend verschiedener Trennmechanismen durchgeführt werden, zum Beispiel entsprechend des Verhatnisses von Grosse zu Ladung, der Verschiedenheit der isoelektrischen Punkte (isoelektrische Fokusierung) oder entsprechend der Grosse, wozu Gradientgele oder geladene SDS-Komplexe verwendet werden. Eine Kombination der isoelektrischen Fokusierung und der SDS-PAGE Elektrophorese wird als 2-D Gelelektrophorese bezeichnet, die sich besonders bei Zelluntersuchungen (Proteomics) durchgesetzt hat. Wird die Trennung auf flachen Trägern nur in einer Dimension ausgeführt, spricht man von 1 -D Flachbettelektrophorese Die Detektion von zu analysierenden Substanzen erfolgt vorteilhaft mit Hilfe spektroskopischer Methoden wie zum Beispiel Absorption oder Fluoreszenz, wobei die Aufnahme des Absoptionsspektrums und das Messen bei charakteristischen Wellenlängen einer Lumineszenzstrahlung üblicherweise in der Kapillarelektrophorese [siehe zum Beispiel U. B. Soe- tebeer et al. In Journal of Chromatography B, 745 (2000), Seiten 271 bis 278] oder der Flüssigkeitchromatographie (HPLC) angewendet wird. Die in der Kapillargelelektrophorese verwendeten Gele sind flüssig (Austauschgele), und Messungen einer natürlichen Fluoreszenz sind hier wie in der Flüssigkeitschromatographie kein Problem, da bezüglich Absorption und Hintergrundstrahlung der Flüssigkeiten kaum Störungen beobachtet werden.
Bei der 1 D- und 2D-Flachbettelektrophorese, bei der feste Trennmedien eingesetzt werden, ist die Bestimmung von nicht sichtbaren Substanzen durch Absorption mit der notwendigen Empfindlichkeit bisher nicht möglich, da der Hintergrund der Trennmedien (Träger und Puffersystem) im niedrigen UV-Bereich (190 bis 280 nm) zu hoch ist. Auch mit sehr dünnen, UV-transparenten Gelen konnte dieses Problem nicht beseitigt werden.
Es werden daher meist substanzspezifische Färbeverfahren verwendet, um nach der Trennung die Bereiche der Substanzen (Spots, Lanes) direkt oder über digitale Abbildungsverfahren auf den Flächen sichtbar zu machen und gegebenenfalls zur Quantifizierung heranzuziehen. Einen Überblick zu den verschiedenen Färbemethoden gibt L. R Williams in „Stai- ning nucleics acids and proteins in electrophoresis gels", Biotech. Histochem. (2001) 76(3), Seiten 127-132]. Schon vor einer für eine Substanz spezifischen Anfärbung müssen die Proben im allgemeinen mit einem Fixiermittel am Gel fixiert werden, um ein "Ausbluten" während der Anfärbreaktion in den Lösungen zum Anfärben und Entfärben zu vermeiden, was bereits unerwünschte Veränderungen hervorrufen kann.
Bekannte Methoden zum Sichtbarmachen von Proteinen sind das Färben mit Amido black [C. M. Wilson, Anal. Biochem. 6, Seiten 263 bis 278 (1979)] oder mit Comassie Blue Farbstoff [S. Fazekas de St. Groth et al., Biochim. Biophys. Acta 1 , Seiten 377-391 (1963)], bei denen aber die geringe Empfindlichkeit als besonderer Nachteil empfunden wird. Ein Vorteil ist aber die quantitative Reaktion der verschiedenen Polypeptide mit Farbstoffen.
Eine in der Proteinanalyse genügend empfindliche Methode ist das Abscheiden und Binden von Silberionen an Proteine [B. R. Oakly et al., Anal. Biochem. 105, Seiten 361-363 (1980)], (Silverstaining), bei der jedoch der geringe dynamische Bereich und Störungen der weiteren Untersuchungen besonders ins Gewicht fallen. Ein weiterer Nachteil dieser Anfärbemethode ist, dass bei der Färbung eine Diskriminierung zwischen verschiedenen Proteinen erfolgt, also einige Proteine stark und andere Proteine weniger stark anfärben. In unbekannten Proteinproben ist ein Abschätzen der relativen Menge beziehungsweise Häufigkeit der verschiedenen Proteine nicht möglich, was aber im Forschungsgebiet von Zelluntersuchungen (Proteomics) eine der Grundvoraussetzungen ist.
D. Kazmin et al. schlagen in einer neueren Publikation vor [Analytical Biochemistry 301, Seiten 91 bis 96 (2002)], Tryptophan enthaltende Proteine unter UV-Licht mit Trichloressigsäu- re oder Chloroform zu behandeln, und die Regionen der getrennten Proteine in einem Poly- acrylamidgel mittels der angeregten sichtbaren Fluoreszenzstrahlung (natürliche Fluores- zens des modifizierten Tryptophans) sichtbar zu machen. Das Spektrum der nativen Fluoreszenz wird somit vom UV-Bereich in den sichtbaren Bereich verschoben.
Eine weitere bekannte Methode ist das Anfärben mit im sichtbaren Bereich fluoreszierenden Farbstoffen nach der elektrophoretischen Trennung. Ein Vorteil ist die hohe Linearität der Abhängigkeit der gemessenen Intensität von der Menge (dynamischer Bereich). Besonders nachteilig ist aber, dass die Behandlung mit Chemikalien zum Auswaschen niedermolekularer Substanzen führen kann, die nicht erfasst werden. Ferner kann die Veränderung von Substanzen bei der Einwirkung der Chemikalien nicht ausgeschlossen und daher eine quantitative Reaktion aller Substanzen einer Probe nicht gewährleistet werden.
Ähnliche oder gleiche Nachteile bestehen, wenn die Substanzen vor der Trennung mit Fluoreszenzfarbstoffen angefärbt werden, wobei der Farbstoff kovalent gebunden wird. Dies ist ein gängiges Verfahren für die Analyse von Proteinen, da eine hochempfindliche, quantitative Detektion gewährleistet wird. Der grosse Nachteil dieser Technik ist aber, das die Substanzen in den Analyseproben chemisch verändert werden (auch Masse sowie isoelektrischer Punkt) und nur für spezifische Farbstoffe entwickelte spezielle Systeme zur Detektion verwendet werden können. Das Verfahren ist daher unwirtschaftlich. Ferner kann die Anwesenheit fluoreszierender Farbstoffe weitere Untersuchungen stören, zum Beispiel massen- spektrometrische Messungen.
Färbemittel werden im allgemeinen vor einer massenspektrometrischen Messung, vor einer enzymatischen Verdauung oder vor dem Blotten wieder entfernt, was wiederum Veränderungen der getrennten Substanzen verursachen kann. Glykolisierte Proteine sind in diesem Zusammenhang besonders empfindlich und können oft nicht erfasst werden. Die zusätzlichen Arbeitsschritte sind zudem zeitaufwendig und verursachen Chemikalienabfall, der entsorgt werden muss. Um so bedingte Unsicherheiten bei einer Messung zu umgehen, werden häufig zwei bis 4 Gelplatten, je 2 als Mess- und Referenzplatte verwendet, um aus den Referenzplatten die Substanzen für weitere Messungen zu isolieren. Dieser hohe Materialverbrauch wird als besonderer Nachteil empfunden.
H. Yamamoto et al. beschreiben in Analytical Biochemistry 191 , Seiten 58-64 (1990) ein densitometrisches Verfahren zur bildhaften Darstellung nicht markierter, getrennter Substanzen bei der 2-D Gelelektrophorese, bei dem die Absorptionsspektren der Substanzbereiche im UV-Bereich bis in den sichtbaren Bereich durch Selektion geeigneter Wellenlängen aufgenommen werden. Die Methode ist nicht ausreichend empfindlich und eignet sich besonders nicht für die in neuerer Zeit entstandenen Anforderungen an die Untersuchung von Proteinen (Proteomics).
Bislang ist noch kein Verfahren zur direkten Bestimmung von elektrophoretisch trennbaren Substanzen mittels 1D- oder 2 D-Flach bettelektrophorese (abgekürzt als PAGE bei Verwendung von Polyacrylamidgelen) ohne Vorbehandlung und Modifikation der Substanzen bekannt geworden, insbesondere bei der Bestimmung und dem Sichtbarmachen von Proteinen in Acrylamidgelen oder anderen Festgelen (die meist quervernetzt sind). Ein solches Verfahren ist äusserst wünschenswert, um die genannten Nachteile, zum Beispiel geringe Empfindlichkeit, Fixieren, Entfärben, Markieren, unterschiedliche Stärke der Färbung für verschiedene Substanzen (Proteine), Verändern der Substanzen (Proteine) durch kovalent gebundenen Farbstoff, zu vermeiden.
Es wurde nun überraschend gefunden, dass die direkte Messung und/oder bildhafte Darstellung bei der 1D- oder 2D-Flachbettelektrophorese und der Flachbettchromatographie (Dünnschichtchromatographie) dann möglich ist, wenn man die Eigenfluoreszenz im UV-Bereich von elektrophoretisch trennbaren Substanzen mit UV-Strahlung anregt und misst. Der dynamische Bereich ist unerwartet hoch und es können auch glykolisierte Proteine mit der Messung direkt erfasst werden. Ferner ist die Messempfindlichkeit überraschend hoch, so dass sogar ein Nachweis im Bereich von 1 bis 5 Nanogramm pro Bande ermöglicht wird. Die direkte Messung eignet sich daher besonders für die Detektion geringer Substanzmengen, zum Beispiel Zelllysate. Ein erster Gegenstand der Erfindung ist eine Vorrichtung mit den Komponenten: a) einer UV-Quelle (1) für Anregungslicht im Wellenlängenbereich von 140 bis 320 nm; b) einem Trennmedium (2) von einer flachbettelektrophoretischen Trennung elektrisch geladener Substanzen, oder einem Trennmedium (2) einer flachbettchromatographischen Trennung elektrisch geladener oder neutraler Substanzen; c) im Trennmedium (2) verteilten Bereichen von zu trennenden und getrennten sowie nicht markierten Substanzen, die bei Anregung mit besagter UV-Quelle (1) UV-Fluoreszenz im Wellenlängenbereich von 150 bis 400 nm emittieren; d) einem UV-Detektor (3) für die UV-Fluoreszenzstrahlung; und e) optischen oder optoelektronischen Komponenten für das Filtern, die Führung und/oder Verstärkung der Anregungs- und Fluoreszenzstrahlung.
Bei der UV-Quelle (1) kann es sich um Laser oder UV-Lampen, zum Beispiel Quecksilberdampflampen, KrF-Lampen, Xe-Blitzlichtlampen, Excimer-Gas-Emission-Lampen (e-lamp, Firma TuiLaser) oder Laser zur Ein- oder Mehrphotonenanregung handeln. Bei der Verwendung von Lampen kann die gewünschte Wellenänge durch Vorschalten von optischen Filtern, Gittern oder anderen optischen Elementen eingestellt und zur Erzeugung einer ausreichenden Energiedichte mit Linsen fokussiert werden. Bei den Lasern kann es sich um kontinierliche oder gepulste Laser mit Pulslängen im Bereich von Femto- bis Millisekunden handeln. UV-Laser sind häufig Frequenz vervielfachte Laser, die Strahlung im sichtbaren Bereich generieren. Die Strahlung kann direkt, fokussiert oder als aufgeweiteter Strahl sowie durch Mehrfachbelichtung auf das Gel gerichtet werden. Die Leistungs- und Energiedichte wird so gewählt, dass ein messbares Fluoreszenzsignal erzeugt wird, ohne dabei die Substanzen nennenswert zu schädigen. Die Energiedichte kann zum Beispiel 0,1 bis 3500, bevorzugt 1 bis 500, und besonders bevorzugt 1 bis 50 mJ/cm2 in einer Sekunde betragen. Besonders geeignet sind bei der Messung von Proteinen um 35 mW/cm2 in einer Sekunde. Solche UV-Lichtquellen sind kommerziell erhältlich. Als besonders geeignet hat sich ein Laser der Firma Spectra Physics (Modell Tsunami) erwiesen, der bei einer Wellenlänge von 280 nm (Frequenz von 840 nm), 80 MHz und 100 Femtosekunden Pulslänge arbeitet, und eine Ausgangsleistung von 150 mW hat. Ebenfalls als besonders geeignet hat sich ein fre- quenzvervierfachtes Nd;YAG Lasersystem (266 nm Wellenlänge, 500 ps Pulslänge, 4 mW Ausgangsleistung) von JDS Uniphase erwiesen.
Die Wellenlänge des UV-Anregungslichts beträgt bevorzugt 140 bis 320 und besonders bevorzugt 220 bis 300 nm. Das Trennmedium (2) kann aus unterschiedlichen flächenförmigen Materialien bestehen. Sie dürfen im verwendeten Laufmittel nicht löslich und sie müssen dielektrisch sein. Es kann sich um anorganische Materialien handeln, zum Beispiel Metalloxide und Salze wie Silikate. Einige Beispiele sind Aluminiumoxid, Titanoxid, Silicagele und Kieselgur. Weitere geignete Materialien sind Papiere und Cellulosen. Besonders geeignete Materialien sind gegebenenfalls vernetzte, gelbildende Polymere, wie zum Beispiel Polyacrylamidgele, Agarosegele und Dextrangele.
Das Trennmedium kann für die Trennung und/oder zur anschliessenden Messung auf einem dielektrischen oder elektrisch leitenden Träger aufgebracht sein, zum Glas, Quarz oder Kunststoffen, Metalloxiden und Metallen. Besonders geeignet sind hierfür Materialien, die UV-Strahlung reflektieren, zum Beispiel polierte Metallplatten oder mit Metallen beschichtete Kunststoffplatten.
Trennmedien für die elektrophoretische Trennung sind vielfach bekannt, in der Literatur beschrieben und kommerziell erhältlich. Sie werden daher hier nicht näher beschrieben. Es sei aber erwähnt, dass für das wichtige Gebiet der Trennung von Proteinen hauptsächlich Gele auf Basis von Polyacrylamiden eingesetzt werden. Die Trennmedien weisen vorteilhaft eine geringe UV-Absorption und UV-Fluoreszenz auf, um eine hohe Messempfindlichkeit erzielen zu können.
Das elektrophoretische Trennmedium kann in der erfindungsgemässen Anordnung auch durch Trennmedien für die Flachbett- beziehungsweise DUnnschichtchromatographie ersetzt werden, wobei diese Trennmedien ebenfalls vorteilhaft eine geringe UV-Absorption und UV- Fluoreszenz aufweisen. Das chromatographische Trennmedium kann aus unterschiedlichen flächenförmigen Materialien bestehen, die Moleküle mit Eigenfluoreszenz im UV-Bereich bei Anregung mit UV-Strahlung zum Beispiel durch unterschiedliche Absorption und/oder nach unterschiedlicher Grosse zu trennen vermögen. Sie dürfen im verwendeten Laufmittel nicht löslich sein und sind gegebenenfalls als Trennschicht auf einem Träger aufgebracht. Es kann sich um feinteilige anorganische Materialien handeln, zum Beispiel Metalloxide und Salze wie Silikate. Einige Beispiele sind Aluminiumoxid, Titanoxid, Silicagele und Kieselgur. Weitere geignete Materialien sind Papiere und Cellulosen. Besonders geeignete Materialien sind gegebenenfalls vernetzte, gelbildende Polymere, wie zum Beispiel Polyacrylamidgele, Agarosegele und Dextrangele, die auch als feinteilige Materialien eine Schicht auf einem Träger bilden können. Die Flachbettchromatographie kann sowohl für elektrisch geladene als auch ungeladene Substanzen eingesetzt werden.
Die Trennmedien können zur Erzielung möglichst planer Oberflächen und zum Schutz vor Austrocknung und Alterung mit einer Abdeckung versehen werden, die sowohl für das Anregungslicht als auch das Fluoreszenzlicht optisch transparent ist, da die Bestrahlung auf das Gel gerichtet wird und die Messung der Fluoreszenzstrahlung vorteilhaft durch die Abdeckung vorgenommen wird. Für UV-Strahlung durchlässige Materialien sind bekannt. Es kann sich um Kunststoffe handeln, die zweckmässig als Folien ausgebildet sind. Sehr gut eignet sich auch Quarzglas.
Die Substanzen können im Trennmedium in ein- oder zweidimensionaler Richtung verteilt sein. Die Substanzen sind nicht chemisch für eine Detektion modifiziert. Sie müssen zur Emission von UV-Licht anregbar sein. Solche Substanzen enthalten zum Beispiel aromatische oder heteroaromatische Reste und/oder gegebenenfalls konjugierte ungesättigte Kohlenstoff- oder Kohlenstoff-Heteroatom-Doppelbindungen oder Stickstoffmehrfachbindungen. Die Heteroatome können ausgewählt sein aus der Gruppe O, N, S und P. Ferner enthalten die Substanzen elektrisch geladene Gruppen, zum Beispiel saure Gruppen (zum Beispiel Carboxyl-, Phosphor- oder Phosphonsäure-, Bor- oder Boronsäure-, und/oder Schwefeloder Sulfonsäuregruppen) und/oder basische Oniumgruppen (zum Beispiel Ammoniumgruppen).
Die Trennmedien können unmittelbar nach einer Trennoperation vermessen werden oder es kann sich um gelagerte Proben handeln. Vor einer Lagerung werden Substanzbereiche in den Trennmedien in an sich bekannter Weise fixiert, bei Gelen zur Proteintrennung zum Beispiel durch Behandeln mit Alkoholen wie Methanol oder Ethanol.
Die Wellenlänge der Fluoreszenzstrahlung beträgt bevorzugt von 150 bis 400 und besonders bevorzugt von 230 bis 400 nm.
Das Messprinzip wird mit Proteinen als Substanz erläutert. Proteine können die Aminosäuren Phenylalanin, Tryptophan und/oder Tyrosin enthalten, bei denen das Emissionsmaximum bei Wellenlängen von 282 nm, 303 nm, beziehungsweise 348 nm liegt. Der Extink- tionskoeffezient ist im Wellenlängenbereich von 200 bis 320 nm hoch und Proteine eignen sich daher besonders für das erfindungsgemässe Messprinzip. Viele organische Substan- zen mit den zuvor erwähnten Strukturelementen weisen ähnliche Eigenschaften auf und sind einer Messung mit der erfindungsgemässen Vorrichtung zugänglich, wie zum Beispiel auch Genmaterial (DNA oder RNA), die elektrophoretisch trennbar sind.
Bei dem UV-Detektor (3) kann es sich um Photodetektoren zur Messung der Fluoreszenzintensität handeln, die vielfach kommerziell erhältlich sind. Geeignete Detektoren sind zum Beispiel Photomuliplier, Photodioden (Halbleiterdioden oder Halbleiterdiodenanordnungen beziehungsweise -arrays) und UV-empfindliche CCD-Kameras. CCD-Kameras (elektronische Kameras mit digitaler Bildaufzeichnung und Wiedergabe) sind bevorzugt. UV-empfindliche CCD-Kameras werden zum Beispiel von der Firma Andor (USA) angeboten.
Bei der Komponente (d) kann es sich um optische Filter zur Ausblendung unerwünschter Hintergrund- und/oder Streustrahlung handeln, die im Strahlengang zwischen der Platte (3) und dem UV-Detektor angeordnet werden. Optische Filter können auch verwendet werden, um die Wellenlänge des Anregungslichts einzustellen und von der UV-Lichtquelle ausgehende unerwünschte Strahlung auszublenden. Bei den Komponenten kann es auch um Spiegel, Prismen oder diffraktive Elemente zur Ablenkung oder dem Sammeln von Anregungslicht handeln. Ferner sind Linsen- oder Linsensysteme zweckmässig, mit denen Strahlung geführt oder fokussiert wird. Sphärische Linsen können zur Aufweitung eines Laserstrahles eingesetzt werden. Zur Erhöhung der Empfindlichkeit können auch Lichtverstärker (Restlichtverstärker) eingesetzt werden. Zwischen UV-Lichtquelle und der Platte (3) können auch Abblendelemente angeordnet sein, die eine Bestrahlung in definierten Zeitintervallen erlauben.
Figur 1 zeigt eine Ausführungsform einer erfindungsgemässen Vorrichtung. Der Laserstrahl (4) eines UV-Lasers (1) wird durch eine Konvexlinse (5) aufgeweitet und auf eine Abdeckung (6) des Trennmediums (2) gerichtet. Die Abdeckung schützt eine Schicht Acrylamidgel (7), die auf einer rostfreien und polierten Stahlplatte (8) aufgebracht ist. Im Acrylamidgel befinden sich über die Fläche verteilte Bereiche getrennter Substanzen, die bei Bestrahlung UV-Fluoreszenz (9) erzeugen. Die Fluoreszenzstrahlung (9) wird über sphärische Linsen (10) und (11), zwischen denen ein Bandpassfilter (12) zum Beispiel für den Wellenlängenbereich 300-375 nm angeordnet ist, zu einem UV-Detektor (3) geführt, zum Beispiel einer UV-empfindlichen CCD Kamera. Die erfindungsgemässe Anordnung eignet sich hervorragend zur direkten Messung von Substanzen im Trennmedium (zum Beispiel ein Gel) einer Platte für die 1 D- oder 2D-Gel- elektrophorese oder Trennmedien für die Flachbettchromatographie, ohne dass die Substanzen vor oder nach der Trennung markiert werden müssen. Die nicht getrennten oder getrennten Substanzen (Analyten) können sogar in einfacher Weise mittels Blotten (Einwirkung eines elektrischen Feldes senkrecht zur Ebene des Trennmediums) direkt auf eine aufgelegte Membran transferiert und mit der erfindungsgemässen Anordnung direkt unter Verwendung unmarkierter Antikörper gemessen werden. Die Methode bietet gegenüber benutzten Standardverfahren erhebliche Vorteile:
a) die Verwendung von Chemikalien zur Messung/Sichtbarmachung wird vollständig vermieden; b) der Zeitaufwand für die Messung wird erheblich reduziert; c) die Veränderung von Substanzen durch die Modifikation mit Chemikalien und ein Auswaschen von Substanzen durch das Modifikationsverfahren wird vollständig vermieden; d) die chemische Nachbehandlung für weitere Untersuchungen, zum Beispiel mittels Massenspektroskopie, wird vermieden; e) Vermeidung einer präparativen Trennung gegenüber Standardverfahren, bei denen eine analytische und parallel eine präparative Trennung durchgeführt werden, um unmodifizierte Substanzen für weitere Untersuchungen bereitzustellen; f) Erfassung aller Substanzen einer zu trennenden Mischung, bei Proteinmischungen zum Beispiel auch Glykoproteine; g) sehr hohe Empfindlichkeit, vergleichbar mit der Silbermarkierung, und zusätzlich ein hoher dynamischer Bereich wie beim Markieren mit Farbstoffen und Fluorophoren; h) Messung von nicht mit Farbstoffen/Fluorophoren modifizierbaren Substanzen; i) keine signifikante Zersetzung von Proteinen durch UV-Bestrahlung bis mindestens 35 mJ/cm2, was mittels Massenspektroskopie von bekannten Proteinen nachweisbar ist; j) keine zusätzliche Verwendung von Trennmedien als Referenzmaterial.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Bestimmung von mittels 1 D- oder 2D-Flachbettektrophorese getrennten Substanzen, bei dem nicht getrennte und getrennte Substanzen im Trennmedium für elektrophoretische Trennungen mit einer Lichtquelle bestrahlt werden, und emittiertes Fluoreszenzlicht mit einem Detektor gemessen wird, das dadurch gekennzeichnet ist, dass man (a) bei Einwirkung von UV-Licht im UV-Bereich Fluoreszenz emittierende Substanzen (b) im Trennmedium direkt mit UV-Licht einer Wellenlänge von 140 bis 320 nm bestrahlt und (c) die UV- Fluoreszenz bei Wellenlängen von 150 bis 400 nm mit einem UV-empfindlichen Detektor misst. Das Verfahren kann auch für Trennmedien der Flachbettchromatographie eingesetzt werden, bei der die Trennung elektrisch geladener oder ungeladener Substanzen möglich ist.
Für das Verfahren gelten die zuvor für die Vorrichtung beschriebenen Ausführungsformen und Bevorzugungen.
Die Erzeugung des digitalen Bildes von der Probe kann auf verschieden Arten erfolgen:
1) Die gesamte Fläche wird gleichzeitig zur Fluoreszenz angeregt und eine digitale Kamera nimmt ein Bild vom gesamten Trennmedium auf.
2) Die Probe wird Abschnittsweise vermessen und die einzelnen Elemente werden im Computer zu einem Gesamtbild zusammengesetzt. Dabei kann ein Abschnitt beliebig klein sein (begrenzt durch den Laserfokus von ca. 200 nm) oder beliebig groß (wie 1). Ein Abschnitt kann wieder ein Bild sein (z.B. mehrere Spots enthalten) oder nur ein Punkt des späteren Bildes (Prinzip des Scanners). Je kleiner der Abschnitt gewählt wird desto effektiver lässt sich das Fluoreszenzlicht sammeln. Erhöhte Sammeleffizienz verkürzt die Messzeit, verringert potentielle UV-Schäden an den gemessenen Substanzen und verbessert die Empfindlichkeit der Aparatur. Um die gesamte Probe nach den Scannerprinzip zu vermessen kann die a) Probe selbst bewegt werden, b) der Detektor bewegt werden, c) die Anregungsquelle bewegt werden, d) das Anregungs- und Emissionslicht umgelenkt werden, oder Kombinationen von a) - d) verwendet werden. Wird nur ein Punkt oder eine Linie angeregt, kann durch konfokale Detektion die Untergrundfluoreszenz (z.B. der Abdeckung und/oder Probenhalterung) stark reduziert werden.
Die Probe oder Abschnitte der Probe können mehrfach vermessen werden, um eine bessere Nachweisgrenze zu erhalten.
Für das erfindungsgemässe Verfahren werden vorteilhaft UV-Laser verwendet, die über das Prinzip einer Frequenzvervielfachung für verschiedene Wellenlängen kommerziell erhältlich sind. Es kann sich um kontinuierliche oder gepulste Laser handeln. Gepulste Laser sind besonders geeignet, wobei Laser mit unterschiedlichen Pulslängen bekannt sind, die im Bereich von Mikro- bis Femtosekunden liegen können. Kurze Pulslängen im Femtosekunden- bereich sind besonders vorteilhaft, da die angeregte Fluoreszenzstrahlung eine Lebensdauer hat, die im wesentlichen zwischen den einzelnen Pulsen liegt, so dass nur wenig oder keine Anregungsstrahlung auf den UV-Detektor fällt. Die Anregungsstrahlung wird vorteilhaft in einem Winkel von kleiner als 90° zur Senkrechten der Platte (3) eingestrahlt.
Die Messung kann in verschiedenen Varianten vorgenommen werden. Grundsätzlich kann das Anregungslicht so aufgeweitet werden, dass das gesamte Trennmedium belichtet wird, was zum Beispiel bei nicht zu grosser Kantenlänge möglich ist. Die Platte kann einmal oder mehrmals belichtet werden, um eine ausreichende Fluoreszenzstrahlung für die Messung zu erzielen.
Das Verfahren ist sehr variabel. Insbesondere können die Bedingungen so eingestellt werden, dass photoempfindliche Substanzen geschont und eine Zersetzung weitgehend unterdrückt werden kann. Das Verfahren eignet sich auch für eine Automatisierung und Standardisierung, was für eine industrielle Anwendung besonders wertvoll ist.
Wenn als UV-Detektor ein UV-Spektrometer verwendet wird, können die Substanzbereiche auch spektrometrisch zum Beispiel über einen Wellenlängenbereich von 180 bis 400 nm bestimmt werden. Auf diesem Wege können auch spezifische Substanzen an Hand charakteristischer Wellenlängen der Fluoreszenzstrahlung direkt auf dem Trennmedium, oder nach Bestimmung der getrennten Substanzbereiche mit UV-Detektoren, identifiziert werden.
Für die Entnahme der Substanzbereiche zu weiteren Untersuchungen wie zum Beispiel Massenspektrometrie (MALDl-MS) und anderen Methoden muss beachtet werden, dass die Substanzen farblos, daher unsichtbar, und mit blossem Auge nicht erkennbar sind. Eine Möglichkeit zur Entnahme besteht in der Herstellung eines transparenten Negativfilmes auf zum Beispiel Kunststoffolien, den man zur Indizierung der Substanzbereiche auf der Oberfläche des Trennmediums (Gels) auflegen kann. Eine andere Möglichkeit besteht in der automatisierten Entnahme über ein geeignetes Rechenprogramm, das digitale Aufzeichnungen auswertet und eine mechanische Vorrichtung zur Probenentnahme steuert. Eine weitere Möglichkeit ist zum Beispiel die Substanzbereiche mit einem sichtbaren Laser (La- serpointer) für die manuelle Entnahme anzuzeigen.
Das erfmdungsgemässe Verfahren kann in allen Bereichen angewendet werden, in denen Trennungen und Untersuchungen von Substanzen mittels Gelelektophorese oder Flachbettchromatographie vorgenommen werden. Ein wichtiger Bereich ist die biochemische Forschung zur Untersuchung von Körperflüssigkeiten, oder entsprechenden Extrakten und Kon- zentraten. Die Untersuchung von Proteinen spielt hier eine besonders grosse Rolle (Proteomics). Das Verfahren kann für diagnostische Untersuchungen eingesetzt werden, bei denen das Vorhandensein von spezifischen Substanzen auf bestimmte Krankheiten schliessen lässt. Ferner kann die Verteilung und der Abbau (Metabolismus) von pharmazeutischen Wirkstoffen und Pestiziden in Körperflüssigkeiten von Pflanzen und Tieren einschliesslich Warmblütern mit dem erfindungsgemässen Verfahren untersucht werden. Das Verfahren kann auch zur Charakterisierung und/oder Bestimmung der Wirkung von Wirkstoffen (Bindung von Wirkstoffen an getrennte Proteine oder Nukleotidsequenzen) und zur Qualitätskontrolle von Wirkstoffen dienen. Das Verfahren kann ferner zur weiteren Untersuchung von Proteinen auf Trennmedien dienen, insbesondere zur Analytik von Westemblots oder ähnlichen Verfahren, bei denen getrennte Substanzbereiche vom Trennmedium auf Membranen übertragen und anschliessend mittels Zugabe von mit Fluoreszenzfarbstoffen markierten Antikörpern bestimmt werden. Ein besonderer Vorteil des Verfahrens besteht in der Detektion unmarkierter Antikörper durch Anregung und Messung deren Eigenfluoreszenz im UV- Bereich gemäss dem Verfahren der Erfindung (die Membran entspricht in diesem Fall dem Trennmedium).
Das Verfahren ist sehr empfindlich und erlaubt die Messung von Mengen selbst bis zu 1 bis 5 Nanogramm. Es ist daher besonders für die Untersuchung kleinster Substanzmengen geeignet.
Für diagnostische Untersuchungen wird das Verfahren zweckmässig automatisiert und bezüglich Probenaufbereitung, Trenn- und Messbedingungen und Auswertung nach der Trennung so standardisiert, dass die Bestimmung einer oder weniger krankheitsspezifischer Substanzen einen sicheren Hinweis für eine anschliessende ärtzliche Behandlung geben. Diagnostische Untersuchungen werden mit dem menschlichen oder tierischen Körper oder Pflanzen entnommenen Proben, wie zum Beispiel Körperflüssigkeiten (Blut, Urin, Blutplasma, Magen- oder Darmsaft, Pflanzensäfte), oder Gewebeproben durchgeführt, die vor der Trennung gegebenenfalls aufbereitet (Reinigung und Konzentrierung, chemische Vorbehandlung oder Herstellung von Zellysaten) werden.
Die Flachbettelektrophorese beziehungsweise -Chromatographie wird in breitem Umfang in der Analytik und ganz besonders in der Freigabeanalytik eingesetzt. Mit der erfindungsgemässen Vorrichtung beziehungsweise dem erfindungsgemässen Verfahren kann gerade in diesem Anwendungsbereich die Wirtschaftlichkeit auf Grund der Vereinfachung im Verfahrensablauf und der Vermeidung von Chemikalienabfällen besonders erhöht werden.
Gegenstand der Erfindung ist auch die Verwendung der erfindungsgemässen Vorrichtung oder die Anwendung des erfindungsgemässen Verfahrens zur Trennung und Bestimmung krankheitsspezifischer Substanzen in dem menschlichen oder tierischen Körper oder Pflanzen entnommenen Proben.
Die nachfolgenden Beispiele erläutern die Erfindung näher.
Beispiel 1 : Trennung der Proteine eines Zellextraktes.
Der experimentelle Aufbau entspricht dem in Figur 1 dargestellten Aufbau. Als UV-Lichtquelle wird ein UV-Laser der Firma Spectra Physics verwendet (Tsunami®, 840 nm, 80 MHz, 100 fs Pulslänge, Frequenzverdreifachung zu 280 nm Anregungslicht, Ausgangsleistung 150 mW). Zwischen Konvexlinse (5) und dem Trennmedium (2) befindet sich eine Blende, mit der eine quadratische Bestrahlungsfläche von 1 cm Kantenlänge eingestellt wird. Die Energiedichte an der Oberfläche des Trennmediums (2) beträgt 40 mW/cm2. Die Belichtungszeit beträgt 1 Sekunde. Als UV-Detektor wird eine käufliche UV-sensitive BCCD Kamera der Firma LaVision Biotec Deutschland (QE>65%) eingesetzt. Die 1 cm2 grosse Fläche wird über 2 UV-Linsen der Firma Nikon (105 mm, f = 4,5) abgebildet und im Computer zu einem Gesamtbild zusammengesetzt. Zwischen den beiden Linsen befindet sich ein UV- Bandpassfilter für den Wellenlängenbereich von 300 bis 375 nm. Für das gewählte Format von 8 x 7 cm (Mini-Gel, nach Aufquellen in dreifach destilliertem Wasser etwa 20% größer als bei der Trennung) werden insgesamt 56 Bilder aufgenommen. Hierzu wird das Trennmedium manuell in einem Raster mit Abstand 1 cm in einem Positionierungstisch bewegt.
Das Trennmedium (2) ist als 1 mm dicke Schicht eines käuflichen Polyacrylamidgels auf einer rostfreien Stahlplatte (8) aufgebracht, Das Polyacrylamidgel ist mit einer 1 mm dicken Quarzplatte (6) abgedeckt.
Die Trennung mittels 2-D Gelelektrophorese wird nach Klose, J. Methods Mol Biol 1999, 112, 147-172 als Kombination von isoelektrischer Fokussierung (IEF) mit Trägerampholyten (erste Dimension) und SDS-PAGE (zweite Dimension) durchgeführt. Die IEF wird in gelgefüllten Glasstangen durchgeführt (Durchmesser 0,9 mm, 7 M Harnstoff, 2 M Thioharnstoff, 3,5% Acrylamid, 0,3% Piperazindiacrylamide und eine Gesamtmenge von 4% Trägerampholyt pH 2-11). Die Proteine stammen von Zelllysaten der Zellen EA.hy 926 [ Edgell, C, J. S. Proc NatI Acad Sei USA 1983, 80, 3734-3737 ]. Es werden etwa 10 μg Protein an der anodischen Seite der IEF Gele von 7 Zentimeter Länge aufgebracht und unter Bedingungen einer nicht im Gleichgewicht pH Gradient Elektrophorese (non equilibrium pH gradient electrophoresis; NEPHGE) für Vh 1842 fokussiert. SDS-PAGE wird in 15% Acrylamid Gel mit den IEF Gelen als Stapelgel durchgeführt. Die Gelgröße beträgt 70x60x1 Millimeter.
Nach der Trennung werden die Proteine über Nacht im Gel fixiert (10% Essigsäure, 50% Ethylalkohol und 40% dreifach destilliertes Wasser). Vor der Messung wird ein Gel für 45 min in 50ml dreifach destilliertem Wasser gewaschen (zur Reduktion der Hintergrundfluoreszenz), auf die Stahlplatte gelegt und mit einem Quarzglasplatte abgedeckt.
Mit der Kamera wird ein Bild der UV-Floureszenz aufgenommen; dunkle Spots entstehen durch Fehlfarbendarstellung in der Bildverarbeitung. Die Darstellung dient dem besseren Vergleich mit der Standardmethode „Silberfärbung", bei der die getrennten Proteine als schwarze Flecken dargestellt werden. Das erhaltene Bild ist vergleichbar mit einer mittels Silberionen sichtbar gemachten Trennung.
Beispiel 2: Bestimmung der Empfindlichkeit
Es wird die Anordnung gemäss Beispiel 1 verwendet. Es werden 1 D-Gelplatten von Invitro- gen (Karlsruhe, Deutschland, NOVEX 12 % Tris-Glycin Gel 12 oder 10 well 1 mm Dicke Nr. EC60052 bzw. EC6005) (mit Proteinen unterschiedlichen Molekulargewichts beladen und getrennt (Lysozyme, (14,6 kDa, Huhn), Rinder Anhydrase (29 kDa ), GAPDH (Kaninchen, 36 kDa), BSA (Rinder, 66 kDa) und Phosphorylase (Kaninchen, 97,4 kDa). Die Proteine werden in gleichen Mengen gemischt und in SDS Puffer (NOVEX Tris-Glycine SDS denaturierender Proben Puffer LC2676) so verdünnt, dass nach Auftragen auf das Gel 500, 250, 100, 50, 25, 10, 5 und 1 ng je Bande (je Protein) vorliegen. Die Trennung erfolgt nach [Laemmli U.K., 1970, Nature 227:680-685] Laufmittel Puffer: NOVEX Tris-Glycine SDS Run- ning Buffer LC2675), Einwandern der Probe bei konstant 50 V für 10 Minuten, anschließend so lange (etwa 1 ,5 Stunden) laufen lassen (bei konst 145 V ), bis die Lauffront (Bromphenolblau, im Proben Puffer enthalten) das untere Ende der Gele erreicht hat. Nach der Trennung werden die Proteine im Gel wie in Beispiel 1 fixiert und vor der Messung wird ein Gel für 45 Minuten in 50ml dreifach destilliertem Wasser gewaschen, auf die Stahlplatte gelegt und mit einem Quarzglasplatte abgedeckt.
Nach der Trennung werden die getrennten Bereiche gemäss der Durchführung in Beispiel 1 , sowie nach den Verfahren der Silbermarkiemng und Anfärbung mit Comassie Blue sichtbar gemacht und verglichen. Die Empfindlichkeit gemäss Durchführung nach Beispiel 1 liegt bei 1 bis 5 ng Nachweisgrenze, vergleichbar mit dem Verfahren der Silbermarkierung. Bei dem Verfahren mit Comassie Blue liegt die Nachweisgrenze bei 10 bis 50 ng.
Beispiel 3: Verwendung eines 266nm Lasersystems
Der experimentelle Aufbau entspricht dem in Figur 1 dargestellten und in Beispiel 1 beschriebenen Aufbau. Als UV-Lichtquelle wird jedoch ein UV-Lasersystem der Firma JDS Uniphase (frequenzvervierfachter Nd:YAG, 266 nm Wellenlänge, 500 ps Pulslänge, 4 mW Ausgangsleistung) verwendet. Als Trennsystem werden die Gele gemäss Beispiel 2 verwendet. Es wird gezeigt, dass die Verwendung des erheblich kostengünstigeren Lasersystems qualitativ und quantitativ keinen Unterschied zu den in den Beispielen 1 und 2 beschriebenen Resultaten ergibt. Allerdings muss bedingt durch die geringere Leistung entsprechend länger (30 fach) belichtet werden.
Beispiel 4: Blottingverfahren mit Nitrozellulose Membran
Es wird gezeigt, dass mit dem in Figur 1 dargestellten und mit dem in Beispiel 3 beschriebenen Aufbau und Trennung auch die quantitative Detektion von Proteinen (polyclonales rab- bit-lgG-Antikörperfragment), von der Firma Sigma Aldrich, Produktnummer I-5006) nach dem Transfer auf eine Nitrocellulose-Membran und nach der Markierung mit unmarkierten Antikörperfragmenten (anti-rabbit-lgG-Antikörperfragmente, Firma Sigma Aldrich, Produktnummer R-9130) bei einem Spotdurchmesser von 500 Mikrometern, mit der Konzentration von 1 ng/Spot, und sogar mit noch geringeren Konzentrationen möglich ist. Dies erweitert die Anwendungsmöglichkeiten zum Beispiel in Blottingverfahren.

Claims

Patentansprüche:
1. Vorrichtung mit den Komponenten: a) einer UV-Quelle (1) für Anregungslicht im Welleπlängenbereich von 140 bis 320 nm; b) einem Trennmedium (2) von einer flachbettelektrophoretischen Trennung elektrisch geladener Substanzen, oder einem Trennmedium (2) einer flachbettchromatographischen Trennung elektrisch geladener oder neutraler Substanzen; c) im Trennmedium (2) verteilten Bereichen von nicht getrennten und getrennten sowie nicht markierten Substanzen, die bei Anregung mit besagter UV-Quelle (1) UV-Fluoreszenz im Wellenlängenbereich von 150 bis 400 nm emittieren; d) einem UV-Detektor (3) für die UV-Fluoreszenzstrahlung; und e) optischen oder optoelektronischen Komponenten zum Filtern, Führen und/oder Verstärken der Anregungs- und Fluoreszenzstrahlung.
2. Vorrichtung gemäss Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der UV- Quelle um einen Laser, UV-Lampen oder Laser zur Mehrphotonenanregung.
3. Vorrichtung gemäss Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die UV-Quelle eine Energiedichte von 0,1 bis 3500 mJ pro cm2 aufweist, gemessen an der Oberfläche des Trennmediums.
4. Vorrichtung gemäss Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die Wellenlänge des Anregungslichts 140 bis 320 nm beträgt.
5. Vorrichtung gemäss Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem Trennmedium um Metalloxide, Salze, Papiere, Cellulosen oder vernetzte, gelbildende Polymere handelt.
6. Vorrichtung gemäss Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den gelbildenden Polymeren um Polyacrylamide, Agarose oder Dextran handelt.
7. Vorrichtung gemäss Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass das Trennmedium (2) ein in der Flachbettchromatographie (Dünnschichtchromatographie) verwendetes Trennmedium ist.
8. Vorrichtung gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Trennmedium auf einem Träger aufgebracht und gegebenenfalls mit einer UV-durchlässigen Abdeckung versehen ist.
9. Vorrichtung gemäss Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die Substanzen der Komponente c) aromatische oder heteroaromatische Reste und/oder gegebenenfalls konjugierte ungesättigte Kohlenstoff- und/oder Kohlenstoff-Heteroatom-Doppelbindungen und/oder Stickstoffmehrfachbindungen und elektrisch geladene Gruppen enthalten.
10. Vorrichtung gemäss Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den Substanzen um Proteine handelt.
11. Vorrichtung gemäss Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die UV-Fluoreszenz 150 bis 400 nm beträgt.
12. Vorrichtung gemäss Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem UV- Detektor um eine CCD Kamera, einen Photomultiplier, eine Halbleiterdiode oder eine Halbleiterdiodenanordnung handelt.
13. Verfahren zur Bestimmung von mittels 1 D- oder 2D-Flachbettelektrophorese oder -Chromatographie getrennten Substanzen, bei dem nicht getrennte und getrennte Substanzen im Trennmedium für elektrophoretische oder chromatographische Trennungen mit einer Lichtquelle bestrahlt werden, und emittiertes Fluoreszenzlicht mit einem Detektor gemessen wird, dadurch gekennzeichnet, dass man (a) bei Einwirkung von UV-Licht im UV-Bereich Fluoreszenz emittierende Substanzen (b) im Trennmedium direkt mit UV-Licht einer Wellenlänge von 150 bis 320 nm bestrahlt und (c) die UV-Fluoreszenz bei Wellenlängen von 150 bis 400 nm mit einem UV-empfindlichen Detektor misst.
14. Verfahren gemäss Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass die getrennten Substanzen vom Trennmedium durch Anlegen eines elektrischen Feldes senkrecht zur Ebene des Trennmediums auf eine aufgelegte Membran transferiert werden.
15. Verfahren gemäss Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass die Membran aus Nitro- cellulose oder Polyvinylidenfluorid besteht, die in Westernblotverfahren eingesetzt werden.
16. Verfahren gemäss Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass die transferierten Substanzbereiche mit unmarkierten Antikörpern behandelt werden, und dann deren Eigenfluoreszenz im UV-Bereich nach Anregung mit UV-Strahlung gemessen wird.
17. Verwendung der Vorrichtung gemäss Ansprüchen 1 bis 12 oder Anwendung des Verfahrens gemäss Ansprüchen 13 bis 16 zur Trennung und Bestimmung krankheitsspezifischer Substanzen in dem menschlichen oder tierischen Körper oder Pflanzen entnommenen Proben.
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