CN102879367B - 高等植物活体原位电活动的光电同步记录系统及方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及农业信息检测技术领域，公开了一种高等植物活体原位电活动的光电同步记录系统及方法，该系统包括荧光激发装置、荧光图像采集装置以及PC机，所述荧光激发装置用于向用电压敏感染料侵染的、待测的高等植物活体样本发出荧光，所述荧光图像采集装置用于对所述高等植物活体样本漫反射出的荧光进行图像采集，并将采集的图像发送给PC机，所述PC机用于从所述图像中提取电信号。本发明可全面客观地实现以多个高等植物细胞活体原位在不同环境条件下细胞间电信号传导规律的研究及应用。

Description

高等植物活体原位电活动的光电同步记录系统及方法

技术领域

本发明涉及农业信息检测技术领域，特别涉及一种高等植物活体原位电活动的光电同步记录系统及方法。

背景技术

植物电信号是植物体对外界刺激的最初反应，植物受到刺激后也会出现动作电位（称之为锋电位）或动作电位的发放序列。只有对其进行定量分析才能很好地解释高等植物电信号的产生机理、调控机制。如同“脑电”、“心电”能够预示人体器官的生理状态一样，植物电信号可以反映高等植物的生长发育及营养状况，并希望最终将其应用在交互式温室环境调控、植物生长发育及营养健康状况的诊断和调节、节水灌溉的智能化控制等方面。植物电信号所呈现的是一个复杂的非线性动态过程，植物细胞之间电信号传输模式及信息处理的机理，以及植物细胞网络电信号仿真中数据表达和并行处理方法等仍是值得继续深入研究的科学问题。解决这些问题需要具有时空分辨率并能同时记录多个植物细胞电活动的技术手段。

现有技术中，传统的胞外记录技术能记录多个细胞的叠加的电活动，但不具备空间分辨率，不区分细胞的电活动。微电极胞内记录技术只能记录一个细胞的电活动，记录两个以上时基本无法实现，而且植物有细胞壁，电极连接固定和耦合是一个大问题，当接触不良，则完全不能获得真实信号，且无法获得植物电信号多个细胞同步传导的信息。

发明内容

（一）要解决的技术问题

本发明要解决的技术问题是：如何实现高等植物活体原位电活动的非接触式、高分辨率光学记录，并提出光记录信号的校准方法。

（二）技术方案

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种利用高等植物活体原位电活动的光电同步记录系统对高等植物活体原位电活动进行光电同步记录的方法，所述系统包括：荧光激发装置、荧光图像采集装置以及PC机，所述荧光激发装置用于向用电压敏感染料侵染的、待测的高等植物活体样本发出荧光，所述荧光图像采集装置用于对所述高等植物活体样本漫反射出的荧光进行图像采集，并将采集的图像发送给PC机，所述PC机用于从所述图像中提取电信号；

所述荧光激发装置包括泵灯和第一滤光片，所述荧光图像采集装置位于所述荧光激发装置与高等植物活体样本之间，有两套，第一套包括第一电荷耦合元件和第二滤光片，第二套包括第二电荷耦合元件和第三滤光片；在两套荧光图像采集装置之间设有可移动的分束镜，在所述分束镜与高等植物活体样本之间设有透镜组；

所述系统还包括微电极、高阻抗放大器和数据采集器，所述微电极用于在所述荧光图像采集装置采集图像的同时，通过刺入高等植物活体样本来获取所述高等植物活体样本在所述荧光激发装置发出的荧光照射下产生的电信号，所述高阻抗放大器用于指示所述微电极是否已刺入高等植物活体样本中，所述数据采集器用于在高阻抗放大器指示所述微电极已刺入高等植物活体样本中之后，采集所述高等植物活体样本在所述荧光激发装置发出的荧光照射下产生的电信号，并发送给所述PC机，所述PC机还用于对来自所述数据采集器的电信号进行校正；

所述方法包括以下步骤：

S1、用电压敏感燃料侵染待测的高等植物活体样本，利用所述荧光激发装置发出的荧光照射高等植物活体样本；

S2、利用任一套所述荧光图像采集装置获取高等植物活体样本漫反射出的荧光的图像以及高等植物活体样本无荧光照射区域的图像，读取漫反射出的荧光的图像中的荧光光强值和无荧光照射区域的图像中的光强值，若两者之比大于预设阈值，则两套所述荧光图像采集装置获取的漫反射出的荧光的图像分别发送给PC机，否则将所述可移动的分束镜移开，第二套荧光图像采集装置接收的漫反射出的荧光的图像发送给PC机，PC机对获取的图像进行校正后得到电信号变化趋势曲线；

S3、将所述微电极用KCl和罗丹明染料进行灌冲后将微电极尖端刺入高等植物活体样本中，当高阻抗放大器指示电压下降一定值时，利用数据采集器采集高等植物活体样本在所述荧光激发装置发出的荧光照射下产生的电信号，并发送给所述PC机；

S4、所述PC机利用来自数据采集器的电信号建立回归模型，并利用回归模型对来自数据采集器的电信号进行自校正。

优选地，步骤S2中，对于两套所述荧光图像采集装置获取的漫反射出的荧光的图像和

PC机校正因光漂白引起的光衰减的公式为：

其中j=1，2，i为图像序号，k、α为常数，得到电信号变化趋势曲线

对于第二套荧光图像采集装置获取的漫反射出的荧光的图像S^λ(i)，PC机校正因光漂白引起的光衰减的公式为：S^λ(i)=k×So^λ(i)×e^-αi，其中i为图像序号，k、α为常数，得到电信号变化趋势曲线 ${\mathrm{So}}^{\mathrm{\λ}}\left(i\right)=\frac{S^{\mathrm{\λ}}\left(i\right)}{k\×e^{-\mathrm{\αi}}}.$

优选地，所述预设阈值为20。

优选地，所述微电极是由1mm玻璃电极拉制而成的尖端为不大于1微米的电极。

（三）有益效果

上述技术方案具有如下优点：本发明中，通过电压敏感染料穿过植物细胞壁与细胞膜结合，当激发光照射产生荧光，不同的电位水平荧光强度不同，且在一定范围呈线性相关，当细胞膜电位变化时，荧光强度发生改变，可以通过对荧光强度来检测细胞膜电位改变。细胞膜电位变化是植物电活动的基础，采用荧光图像获得多个细胞同时发生的电信号变化，可以用于研究电信号的传导细节和用于发现传导规律，也可以用于研究植物抗逆品种电活动特性；且用于实现该方法的系统中微电极与荧光图像采集装置记录同步，并用电压敏感染料作为微电极定位细胞的指示，操作方便。

附图说明

图1为本发明的一种高等植物活体原位电活动的光电同步记录方法的流程图；

图2为实现本发明实施例的一种高等植物活体原位电活动的光电同步记录方法的装置结构示意图；

图3a～图3b分别为降温刺激下第1、2波长原始荧光图像序列；图3c～图3e为以双波长实施图1所示实施例的方法得到荧光图像序列和电信号变化趋势曲线；

图4a～图4b为以单波长波长实施图1所示实施例的方法得到的得到荧光图像序列和电信号变化趋势曲线；

图5用光记录方法得到的植物电信号传导图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

如图2所示，本发明提供一种高等植物活体原位电活动的光电同步记录系统，包括荧光激发装置、荧光图像采集装置以及PC机1，所述荧光激发装置用于向用电压敏感染料侵染的、待测的高等植物活体样本发出荧光，所述荧光图像采集装置用于对所述高等植物活体样本漫反射出的荧光进行图像采集，并将采集的图像发送给PC机1，所述PC机1用于用信号提取方法从所述图像中提取电信号。

所述荧光激发装置包括100W泵灯101和第一滤光片102，所述荧光图像采集装置位于所述荧光激发装置1与高等植物活体样本1之间，有两套，第一套包括第一电荷耦合元件201和第二滤光片202，第二套包括第二电荷耦合元件301和第三滤光片302。高等植物活体样本1则放置于测试平板上。

在两套荧光图像采集装置之间设有可移动的分束镜2，在所述分束镜2与高等植物活体样本3之间设有透镜组4。

所述系统还包括微电极5、高阻抗放大器6（阻抗大于2¹³Ω）和数据采集器7，所述微电极5用于在所述荧光图像采集装置采集图像的同时，通过刺入高等植物活体样本3来获取所述高等植物活体样本3在所述荧光激发装置发出的荧光照射下产生的电信号，所述高阻抗放大器6用于指示所述微电极5是否已刺入高等植物活体样本3中，所述数据采集器7用于在高阻抗放大器6指示所述微电极5已刺入高等植物活体样本3中之后，采集所述高等植物活体样本3在所述荧光激发装置发出的荧光照射下产生的电信号，并发送给所述PC机，所述PC机1还用于对来自所述数据采集器7的电信号进行校正。所述微电极是由1mm玻璃电极拉制而成的尖端为不大于1微米的电极。

所述第一滤光片的波长为488nm，第二滤光片的波长为540nm，带宽为40nm，第三滤光片的波长为600nm，带宽为40nm。

如图1所示，本发明还提供了一种利用所述的系统对高等植物活体原位电活动进行光电同步记录的方法，包括以下步骤：

S1、用电压敏感燃料侵染待测的高等植物活体样本，利用所述荧光激发装置发出的荧光照射高等植物活体样本；具体地，用浓度为1-2μmol的Di-4-ANEPPS染料溶液作为培养液，用1M的NaOH溶液调整所述培养液pH值至6.5后，侵染植物的茎或叶片10-20分钟，所述培养液中含2.5mM Hepes、10mM蔗糖、0.5mM CaCl₂和1.0mMKCl，溶剂为蒸馏水。

S2、利用任一套所述荧光图像采集装置获取高等植物活体样本漫反射出的荧光的图像以及高等植物活体样本无荧光照射区域的图像，读取漫反射出的荧光的图像中的荧光光强值和无荧光照射区域的图像中的光强值，若两者之比大于20，则两套所述荧光图像采集装置获取的漫反射出的荧光的图像分别发送给PC机，否则将所述可移动的分束镜移开，第二套荧光图像采集装置接收的漫反射出的荧光的图像发送给PC机，然后进行校正，校正后得到电信号变化趋势曲线；

对每个波长下的图像选择感兴趣的区域，并从所记录的图像序列中里连续获得该区域的荧光强度值得到时间序列数据，作为原始信号

i为图像序号，j=1,2，表示两个荧光的两个波长；λ_j=540nm、600nm。

对于两套所述荧光图像采集装置获取的漫反射出的荧光的图像，PC机校正因光漂白引起的光衰减，即S^540nm(i)=k×So^540nm(i)×e^-αi，S^600nm(i)=k×So^600nm(i)×e^-αi，其中k，α是常数，于是采用

（i=1，2，…400，共400个荧光数据）作为可得到的植物电信号变化趋势，如图3a～图3e所示；

对于将所述可移动的分束镜移开后，第二套荧光图像采集装置接收的漫反射出的荧光的图像，在温度刺激下获得80个荧光数据（本步骤中使用3mm*3mm*3mm冰块刺激植物）S^600nm(i)，i=1,2,...80，为了获得So^600nm(i)，计算光淬灭引起的光衰减项，需要从获得曲线上取无信号变化的20个点获得变化趋势曲线上区无信号变化的20个点，k=9407.637,α=-0.021,

如图4a～图4b所示，反映植物电信号变化趋势，其中，k，α采用单纯性法拟合获得；

S_d(i)、So^600nm(i)以结构体类型数据存储，结构体包括三维坐标下X、Y、Z轴数据，X、Y轴数据表示荧光图像像素点位置，Z轴数据表示S_d(i)或So^600nm(i)，也就是电信号的变化情况。

S3、将所述微电极用3M KCl和罗丹明染料进行灌冲后将微电极尖端刺入高等植物活体样本中，当高阻抗放大器指示电压下降60mV-70mV时，利用数据采集器采集高等植物活体样本在所述荧光激发装置发出的荧光照射下产生的电信号，并发送给所述PC机；

S4、所述PC机利用来自数据采集器的电信号建立回归模型，并利用回归模型对来自数据采集器的电信号进行自校正。数据采集器采集的数据为S_e(i)，在[tm,tn]时间段内（tm、tn表示时刻，n>m）取不少于10点的数据，获得S_d(i)或So^λ(i)，建立回归模型S_e(i)=a1×S_d(i)+b1或S_e(i)=a2×So^λ(i)+b2，a1,b1或a2,b2用最小二乘法拟合得到。

由以上实施例可以看出，本发明中，通过电压敏感染料穿过植物细胞壁与细胞膜结合，当激发光照射产生荧光，不同的电位水平荧光强度不同，且在一定范围呈线性相关，当细胞膜电位变化时，荧光强度发生改变，可以通过对荧光强度来检测细胞膜电位改变。细胞膜电位变化是植物电活动的基础，采用荧光图像获得多个细胞同时发生的电信号变化，可以用于研究电信号的传导细节和用于发现传导规律，也可以用于研究植物抗逆品种电活动特性；且用于实现该方法的系统中微电极与荧光图像采集装置记录同步，并用电压敏感染料作为微电极定位细胞的指示，操作方便。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和替换，这些改进和替换也应视为本发明的保护范围。

Claims (4)

1.一种利用高等植物活体原位电活动的光电同步记录系统对高等植物活体原位电活动进行光电同步记录的方法，其特征在于，所述系统包括：荧光激发装置、荧光图像采集装置以及PC机，所述荧光激发装置用于向用电压敏感染料侵染的、待测的高等植物活体样本发出荧光，所述荧光图像采集装置用于对所述高等植物活体样本漫反射出的荧光进行图像采集，并将采集的图像发送给PC机，所述PC机用于从所述图像中提取电信号；

所述荧光激发装置包括泵灯和第一滤光片，所述荧光图像采集装置位于所述荧光激发装置与高等植物活体样本之间，有两套，第一套包括第一电荷耦合元件和第二滤光片，第二套包括第二电荷耦合元件和第三滤光片；在两套荧光图像采集装置之间设有可移动的分束镜，在所述分束镜与高等植物活体样本之间设有透镜组；

所述系统还包括微电极、高阻抗放大器和数据采集器，所述微电极用于在所述荧光图像采集装置采集图像的同时，通过刺入高等植物活体样本来获取所述高等植物活体样本在所述荧光激发装置发出的荧光照射下产生的电信号，所述高阻抗放大器用于指示所述微电极是否已刺入高等植物活体样本中，所述数据采集器用于在高阻抗放大器指示所述微电极已刺入高等植物活体样本中之后，采集所述高等植物活体样本在所述荧光激发装置发出的荧光照射下产生的电信号，并发送给所述PC机，所述PC机还用于对来自所述数据采集器的电信号进行校正；

所述方法包括以下步骤：

S1、用电压敏感染料侵染待测的高等植物活体样本，利用所述荧光激发装置发出的荧光照射高等植物活体样本；

S2、利用任一套所述荧光图像采集装置获取高等植物活体样本漫反射出的荧光的图像以及高等植物活体样本无荧光照射区域的图像，读取漫反射出的荧光的图像中的荧光光强值和无荧光照射区域的图像中的光强值，若两者之比大于预设阈值，则两套所述荧光图像采集装置获取的漫反射出的荧光的图像分别发送给PC机，否则将所述可移动的分束镜移开，第二套荧光图像采集装置接收的漫反射出的荧光的图像发送给PC机，PC机对获取的图像进行校正后得到电信号变化趋势曲线；

S3、将所述微电极用KCl和罗丹明染料进行灌冲后将微电极尖端刺入高等植物活体样本中，当高阻抗放大器指示电压下降一定值时，利用数据采集器采集高等植物活体样本在所述荧光激发装置发出的荧光照射下产生的电信号，并发送给所述PC机；

S4、所述PC机利用来自数据采集器的电信号建立回归模型，并利用回归模型对来自数据采集器的电信号进行自校正。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S2中，对于两套所述荧光图像采集装置获取的漫反射出的荧光的图像

和，PC机校正因光漂白引起的光衰减的公式为：

其中j=1，2，i为图像序号，k、α为常数，得到电信号变化趋势曲线

对于第二套荧光图像采集装置获取的漫反射出的荧光的图像S^λ(i)，PC机校正因光漂白引起的光衰减的公式为：S^λ(i)=k×So^λ(i)×e^-αi，其中i为图像序号，k、α为常数，得到电信号变化趋势曲线 ${\mathrm{So}}^{\mathrm{\λ}}\left(i\right)=\frac{S^{\mathrm{\λ}}\left(i\right)}{k\×e^{-\mathrm{\αi}}}.$

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述预设阈值为20。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述微电极是由1mm玻璃电极拉制而成的尖端为不大于1微米的电极。

Images