CN101518674B - 可视化光刺激系统和可视化光刺激方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种可视化光刺激系统和可视化光刺激方法,所述可视化光刺激系统包括第一激光通路、第二激光通路、荧光信号通路;所述第一激光通路用于产生第一激光以照射导入了光敏感基因的细胞群;所述第二激光通路用于产生第二激光以逐点扫描细胞群;所述荧光信号通路用于接收由第二激光激发的荧光信号,并将荧光信号转换为图像数据。所述可视化光刺激系统可以直接观察到作用细胞的变化情况。
Description
技术领域
本发明涉及一种可视化光刺激系统和可视化光刺激方法。
背景技术
目前对生物体内细胞进行物理刺激的方法有:深部脑核团电刺激(Deep brainstimulation,DBS)和经颅重复性低频磁刺激(Transcranial Magnetic Stimulation,TMS)。深部脑核团电刺激是利用脑立体定向手术在脑内某一特殊位置植入电极,通过刺激发生器产生脉冲,对脑深部神经核团进行慢性电刺激。经颅重复性低频磁刺激是一种无创伤的在大脑外部对神经细胞进行刺激的电生理技术。经颅重复性低频磁刺激的作用原理是以一个快速电流脉冲产生瞬间磁场,该磁场穿过颅骨,引起邻近神经组织产生继发电流,神经细胞去极化,从而产生刺激或阻断脑组织的电活动。
但是,上述物理刺激方法都不能直接观察到作用细胞的变化情况。
发明内容
有鉴于此,有必要针对上述物理刺激方法不能直接观察到作用细胞的变化情况的问题,提供一种可以直接观察到作用细胞的变化情况的可视化光刺激系统。
一种可视化光刺激系统,包括第一激光通路、第二激光通路、荧光信号通路;所述第一激光通路用于产生第一激光以照射导入了光敏感基因的细胞群,所述光敏感基因为使细胞膜发生去极化而兴奋的兴奋型通道蛋白基因或使细胞膜复极化而抑制细胞活性的抑制型通道蛋白基因;所述第二激光通路用于产生第二激光以逐点扫描细胞群;所述荧光信号通路用于接收由第二激光激发的荧光信号,传输荧光信号,提取荧光信号,对荧光信号进行扫描,将第二激光和荧光信号分离,对分离后的荧光信号过滤、聚焦、滤波和检测处理,并将处理后的荧光信号转换为图像数据。
优选的,还包括电信号通路,所述电信号通路用于采集细胞的电信号,并将电信号转换为图像数据。
优选的,还包括生理信号检测装置,所述生理信号检测装置用于检测生理信号。
优选的,所述生理信号检测装置包括PH值检测装置、离子浓度检测装置、腺体分泌物活性检测装置,所述PH值检测装置用于检测组织外液的PH值,所述离子浓度检测装置用于检测组织外液各种离子的浓度变化,所述腺体分泌物活性检测装置用于检测细胞分泌的各种神经递质、消化液的浓度和活性变化。
优选的,还包括药物注射装置和清除成像干扰装置,所述药物注射装置用于微量注射药物,所述清除成像干扰装置用于清除第二激光扫描点处的血液。
优选的,所述第一激光通路的第一光纤、第二激光通路的光学头、电信号通路的微电极、PH值检测装置的PH值检测头、离子浓度检测装置的离子浓度检测头、腺体分泌物活性检测装置的腺体分泌物活性检测头、药物注射装置的药物注射头、清除成像干扰装置的微吹风机是整合在一个探测头中。
优选的,所述第一激光通过第一光纤传输,所述第二激光和荧光信号通过光纤束中的一根第二光纤传输。
优选的,还包括连接阀,所述连接阀连接第一光纤和光纤束。
优选的,所述第一激光通路包括信号源、第一光源和第一光纤,所述第一光源用于发射第一激光,所述信号源用于调节第一光源的激光发射参数,所述第一光纤用于传输第一激光。
优选的,所述第一光纤的直径范围是200μm-400μm。
优选的,所述第一激光是蓝光或黄光。
优选的,所述蓝光的波长是473nm,所述黄光的波长是593nm。
还提供一种可视化光刺激方法。
一种可视化光刺激方法,包括:产生第一激光以照射导入了光敏感基因的细胞群,所述光敏感基因为使细胞膜发生去极化而兴奋的兴奋型通道蛋白基因或使细胞膜复极化而抑制细胞活性的抑制型通道蛋白基因;产生第二激光以逐点扫描所述细胞群;接收由第二激光激发的荧光信号,传输荧光信号,提取荧光信号,对荧光信号进行扫描,将第二激光和荧光信号分离,对分离后的荧光信号过滤、聚焦、滤波和检测处理,并将处理后的荧光信号转换为图像数据。
优选的,所述产生第一激光以照射导入了光敏感基因的细胞群包括:调制第一激光的发射参数;发射第一激光;通过第一光纤传输。
优选的,还包括:采集电信号,并将电信号转换为图像数据。
优选的,还包括:采集生理信号,并对生理信号进行处理。
优选的,所述生理信号包括PH值、离子浓度、腺体分泌物活性。
上述可视化光刺激系统通过第一激光对细胞进行光刺激,通过第二激光和荧光信号对细胞进行成像,因此可以直接观察到作用细胞的变化情况。
附图说明
图1是可视化光刺激系统的第一实施方式的结构示意图。
图2是可视化光刺激系统的第一实施方式的工作流程图。
图3是可视化光刺激系统的第二实施方式的结构示意图。
图4是可视化光刺激系统的第二实施方式的工作流程图。
图5是可视化光刺激系统的第三实施方式的探测头的示意图。
具体实施方式
请同时参阅图1和图2,图1是可视化光刺激系统的第一实施方式的结构示意图,图2是可视化光刺激系统的第一实施方式的工作流程图。第一实施方式的可视化光刺激系统包括四个通路(在图2中分别用不同形状的箭头标示),即第一激光通路、第二激光通路、荧光信号通路、电信号通路。下面对这四个通路进行详细说明。
第一激光通路涉及一种基因治疗技术,首先用病毒载体将光敏感基因导入靶细胞中表达,再利用光控制特定细胞水平的离子通道的开关,从而在神经回路水平上发挥治疗效果。这项技术具有空间上的细胞特异性(应用特定启动子诱导相应基因在特定细胞群中表达)和时间上毫秒水平上的精确性。
光敏感基因可以是兴奋型通道蛋白基因(Channelrhodopsin-2,ChR2)或抑制型通道蛋白基因(Helorhodopsin,NpHR)。其中ChR2对蓝光敏感,蓝光可使Na+、Ca2+等阳离子进入细胞,使细胞膜发生去极化而兴奋。NphR对黄光敏感,可使Cl-进入细胞膜复极化而抑制细胞活性。交替利用蓝光或黄光就可以在特定的细胞水平控制离子通道的开关。
第一激光通路包括信号源1、第一光源2、第一光纤3。第一激光通路的工作流程包括:调制第一激光的发射参数;发射第一激光;通过第一光纤传输。第一激光通路由实现。
第一光源2是可以产生对转有光敏感基因的细胞有刺激作用的激光光源。对于转入ChR2的细胞,第一光源2是蓝光光源(例如波长为473nm)。对于转入NpHR的细胞,第一光源2是黄光光源(例如波长为593nm)。信号源1可以通过TTL或模拟调制信号调节第一光源2的激光发射参数,例如波宽为20ms、频率为10Hz的方波。调节好的第一激光通过直径为200μm-400μm的第一光纤3对转有光敏感基因的细胞群16进行照射,例如出射光强为380mWmm-2的蓝光可以引起1mm厚度下的细胞产生反应。第一光纤3通过立体定位以与水平面成一定角度接触或植入细胞群16。
第一激光通路可以快速、准确、高效的刺激及抑制特定的仅仅具有治疗效果的细胞群,具有空间上的细胞特异性和时间上的毫秒精确性。
第二激光通路包括第二光源4、整型部件5、分离部件6、扫描部件7、光纤注入部件8、光纤束9、光学头10。第二激光通路的工作流程包括:发射第二激光;对第二激光进行整形;将第二激光和荧光信号分离;对第二激光进行扫描;将第二激光注入第二光纤;通过第二光纤传输;对第二激光进行聚焦。
光纤束9由大量(几千到几万根)柔性第二光纤组成,例如30000根直径为2μm、间距为3.3μm的第二光纤。在实际应用中,可使用光纤束9的整组光纤或者这些光纤的选定的子组(例如居中的选定子组)。光纤束9的外径在300μm到1mm之间,它的植入对机体来说是微创的。
第二光源4是在某一激发波长(红外线)上发光的激光器,该波长可激发大范围的荧光信号体。第二光源4是纵向单模型激光器。第二光源4以连续形式或脉冲形式发光,并且以稳定的方式发光(最小可能噪声<1%),可获得的输出功率的量级为20-100mW。第二光源4可使用量子阱激光器(VCSEL)、二极管泵浦的固态激光器、激光二极管或气体激光器(氮离子激光器)。
整型部件5设置在第二光源4的出口。整型部件5由放大倍数不为1的远焦光学系统组成。
分离部件6的作用是分离第二激光和荧光信号。分离部件6可以是发散波长的透过率为98-99%的分色滤光器,并且,该分色滤光器将其它波长光线基本上反射。因而,沿与第二激光相同光路(共焦特征)返回的荧光信号几乎全部传输到荧光信号通路。
扫描部件7用于在与光纤束9的入射截面对应的XY平面内的行和列内进行快速扫描。扫描部件7包括两个反射镜M1、M2和两个远焦系统AF1、AF2。反射镜M1用于水平地折射第二激光,并由此实现图像的行;反射镜M2用于垂直地折射第二激光,并由此实现图像的列。两个远焦系统AF1、AF2具有单一放大率(unitary magnification)。远焦系统AF1位于两个反射镜M1、M2之间,远焦系统AF2位于反射镜M2之后,这些远焦系统用于使这两个反射镜M1、M2的转动面与一根第二光纤的注入面共轭。扫描部件7以与实时获得图像相对应的速度移动激发光束。例如对于640*640像素的显示方式,每秒要有至少12帧图像显示在屏幕上,因而,对于像素较少的显示方式,每秒所获得的图像数要大于12帧。
光纤注入部件8用于将第二激光注入到光纤束9中的一根第二光纤内。光纤注入部件8由两个光学单元E1和E2组成。光学单元E1用于校正扫描部件7的光场边缘的部分像差,由此优化整个光场(中心以及边缘)上的注入。光学单元E2用来进行实际注入。依据一个可获得消色差标准的实施例,光学单元E1和E2分别由一个双合消色差透镜构成,光学单元E2之后有一个靠近光纤束9设置的透镜。光纤注入部件8也可由任何其它类型的标准光学元件(例如两个三片透镜)、折射率渐变透镜或显微透镜构成。
光学头10设置在光纤束9的出口处,用于将第二激光聚焦到细胞群16的某一点上,该点定义为扫描点。该扫描点相对细胞群16的表面具有一定的深度,该深度范围在几十μm到几百μm之间,该扫描点可以是第一光纤3照射下的转有光感基因的细胞,也可以是其下游细胞。光学头10与细胞群16的表面相接触,调节光学头10的焦距,可在不移动光学头10的情况下,在上述深度范围里进行不同层次成像。例如,该深度可为40μm或200μm。光学头10还用于收集从细胞群16返回的荧光信号。光学头10的放大倍数为2.4,细胞群16上的数值孔径为0.5,选取这两个参数,是为了使返回的荧光信号只存在于光纤束9的一根第二光纤内,不存在于邻近的第二光纤内,并由此保持利用一根第二光纤的共焦滤波。利用这些放大倍数和数值孔径值,轴向分辨率的量级是10μm,横向分辨率的量级是1.4μm。
荧光信号通路包括分离部件6、扫描部件7、光纤注入部件8、光纤束9、光学头10、抑制滤光器11、检测透镜12、空间滤波部件13、检测部件14、荧光信号处理模块19、显示模块25。其中,分离部件6、扫描部件7、光纤注入部件8、光纤束9和光学头10是与第二激光通路共用的。
荧光信号通路的工作流程包括:收集荧光信号;通过第二光纤传输;从第二光纤提取荧光信号;对荧光信号进行扫描;将第二激光和荧光信号分离;对荧光信号进行过滤;对荧光信号进行聚焦;对荧光信号进行滤波;对荧光信号进行检测;将荧光信号转换为图像数据。
荧光信号可来自外来化合物(一般为注入的标记物,如Fura-2)或者生物组织的自生化合物(存在于细胞内,如转基因的GFP或YFP蛋白)。
抑制滤光器11用于完全消除向荧光信号通路传播的第二激光的干扰反射。从抑制滤光器11输出的荧光信号随后由检测透镜12聚焦到空间滤波部件13的滤波孔内。计算滤波孔的尺寸,以使光纤的图像完全适合该滤波孔。此外,为了优化通过滤波孔的光子数量和由此产生的检测流量,扫描部件7、光纤注入部件8、光学头10、抑制滤光器11、检测透镜12和空间滤波部件13按照检测荧光信号体作了调整:上述部件被选择为充分地消像差,以便在最宽的荧光信号体发射带上收集光子。检测部件14在被调查的荧光信号波长处的灵敏度最大。例如,可使用雪崩光电二极管(APD)或光电倍增管(PMT)。
荧光信号处理模块19用于收集荧光信号,对荧光信号进行计算处理(包括三维重构)得到图像数据,并向显示模块25传输图像数据。
由此可见,第二激光通路和荧光信号通路是一种共焦成像技术。该共焦成像技术包括逐点扫描细胞群16,每个扫描点对应一个激发信号,该激发信号由第二光源4发射,依次偏转并注入到光纤束9的一根第二光纤内,随后在光纤束9的出口处聚焦到扫描点,该扫描点转而发射荧光信号,该荧光信号由同一根光纤收集,随后进行检测和数字化处理,以形成像素。
共焦特性可通过以下方法获得:使用相同的光路(特别是使用用于空间滤波的同一根光纤)传输激发信号和响应激发信号而发射的荧光信号,并使用一个适合使扫描点与该同一根光纤共扼的光学系统。
电信号通路包括微电极20、导线21、信号放大器22、电生理记录系统23、电信号处理模块24、显示模块25。电信号通路的工作流程包括:对电信号进行记录;对电信号进行放大;采集电信号;将电信号转换为图像数据。
微电极20是由铂铱合金构成的,尖端为1-3μm,通过导线21连接到外置的信号放大器22,微电极20的尖端位置与光学头10的聚焦位置保持同步,记录到的电信号经过信号放大器22放大后由电生理记录系统23采集,并传输至电信号处理模块24。电信号处理模块24对电信号进行计算处理得到图像数据,并将图像数据传输至显示模块25。显示模块25用于显示图像。
图3是可视化光刺激系统的第二实施方式的结构示意图,图4是可视化光刺激系统的第二实施方式的工作流程图。第二实施方式的可视化光刺激系统与第一实施方式的可视化光刺激系统的结构基本相同,二者的区别是:第二实施方式的可视化光刺激系统没有电信号通路,在光纤束9和第一光纤3之间加上连接阀26,使得两束光纤在同一平面上可以任意调节角度,轴向上可以相对滑动以调节深度。
图5是可视化光刺激系统的第三实施方式的探测头的示意图。第三实施方式的可视化光刺激系统与第一实施方式的可视化光刺激系统的结构基本相同,二者的区别是:第三实施方式的可视化光刺激系统还包括PH值检测装置、离子浓度检测装置、腺体分泌物活性检测装置、药物注射装置和清除成像干扰装置。PH值检测装置用于检测组织外液的PH值。离子浓度检测装置用于检测组织外液各种离子(如钠离子、钙离子等)的浓度变化。腺体分泌物活性检测装置用于检测细胞分泌的各种神经递质、消化液等的浓度和活性变化。药物注射装置用于向局部组织外或组织内进行各种药物的微量注射。清除成像干扰装置用于将组织间的血液清除,便于成像观察。
PH值检测装置包括PH值检测器和PH值检测头31,离子浓度检测装置包括离子浓度检测器和离子浓度检测头32,腺体分泌物活性检测装置包括腺体分泌物活性检测器和腺体分泌物活性检测头33,药物注射装置包括药物注射器和药物注射头34,清除成像干扰装置包括电源和微吹风机35。实际使用时,PH值检测器、离子浓度检测器、腺体分泌物活性检测器、药物注射器和电源可以整合在一个模块中,光学头10、第一光纤3、微电极20、PH值检测头31、离子浓度检测头32、腺体分泌物活性检测头33、药物注射头34、微吹风机35整合在一个探测头30中。
上述可视化光刺激系统可以针对动物在体的特定细胞类型的细胞群进行实时光刺激、电刺激、给药,并实时提取图像信息(原位观察细胞及其胞内信号变化)、电信号、pH值、离子浓度、腺体分泌物活性,以观察刺激后靶点或其下游作用细胞的信号改变,达到实时的、从网络层面上研究作用机制的目的。
上述可视化光刺激系统应用在大脑(尤其是大脑深部组织)、各种内脏(如肺、肝脏、肾脏、心脏等)、角膜、肠系膜、淋巴、膀胱、肌肉等器官或组织上,可以对其进行以下几方面的分析:基因表达量分析;干细胞的发育、移行、成熟;药物通过血脑屏障的动力学特征分析;药物检测(药物对局部细胞形态学、pH值、离子浓度的影响);血管生成及其生理状态的分析;腺体分泌的检测、调控。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式,其描述较为具体和详细,但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是,对于本领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明构思的前提下,还可以做出若干变形和改进,这些都属于本发明的保护范围。因此,本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (17)
1.一种可视化光刺激系统,其特征在于:包括第一激光通路、第二激光通路、荧光信号通路;所述第一激光通路用于产生第一激光以照射导入了光敏感基因的细胞群,所述光敏感基因为使细胞膜发生去极化而兴奋的兴奋型通道蛋白基因或使细胞膜复极化而抑制细胞活性的抑制型通道蛋白基因;所述第二激光通路用于产生第二激光以逐点扫描细胞群;所述荧光信号通路用于接收由第二激光激发的荧光信号,传输荧光信号,提取荧光信号,对荧光信号进行扫描,将第二激光和荧光信号分离,对分离后的荧光信号过滤、聚焦、滤波和检测处理,并将处理后的荧光信号转换为图像数据。
2.根据权利要求1所述的可视化光刺激系统,其特征在于:还包括电信号通路,所述电信号通路用于采集细胞的电信号,并将电信号转换为图像数据。
3.根据权利要求2所述的可视化光刺激系统,其特征在于:还包括生理信号检测装置,所述生理信号检测装置用于检测生理信号。
4.根据权利要求3所述的可视化光刺激系统,其特征在于:所述生理信号检测装置包括PH值检测装置、离子浓度检测装置、腺体分泌物活性检测装置,所述PH值检测装置用于检测组织外液的PH值,所述离子浓度检测装置用于检测组织外液各种离子的浓度变化,所述腺体分泌物活性检测装置用于检测细胞分泌的各种神经递质、消化液的浓度和活性变化。
5.根据权利要求4所述的可视化光刺激系统,其特征在于:还包括药物注射装置和清除成像干扰装置,所述药物注射装置用于微量注射药物,所述清除成像干扰装置用于清除第二激光扫描点处的血液。
6.根据权利要求5所述的可视化光刺激系统,其特征在于:所述第一激光通路的第一光纤、第二激光通路的光学头、电信号通路的微电极、PH值检测装置的PH值检测头、离子浓度检测装置的离子浓度检测头、腺体分泌物活性检测装置的腺体分泌物活性检测头、药物注射装置的药物注射头、清除成像干扰装置的微吹风机是整合在一个探测头中。
7.根据权利要求1所述的可视化光刺激系统,其特征在于:所述第一激光通过第一光纤传输,所述第二激光和荧光信号通过光纤束中的一根第二光纤传输。
8.根据权利要求7所述的可视化光刺激系统,其特征在于:还包括连接阀,所述连接阀连接第一光纤和光纤束。
9.根据权利要求1所述的可视化光刺激系统,其特征在于:所述第一激光通路包括信号源、第一光源和第一光纤,所述第一光源用于发射第一激光,所述信号源用于调节第一光源的激光发射参数,所述第一光纤用于传输第一激光。
10.根据权利要求9所述的可视化光刺激系统,其特征在于:所述第一光纤的直径范围是200μm-400μm。
11.根据权利要求9所述的可视化光刺激系统,其特征在于:所述第一激光是蓝光或黄光。
12.根据权利要求11所述的可视化光刺激系统,其特征在于:所述蓝光的波长是473nm,所述黄光的波长是593nm。
13.一种可视化光刺激方法,其特征在于:包括:产生第一激光以照射导入了光敏感基因的细胞群,所述光敏感基因为使细胞膜发生去极化而兴奋的兴奋型通道蛋白基因或使细胞膜复极化而抑制细胞活性的抑制型通道蛋白基因;产生第二激光以逐点扫描所述细胞群;接收由第二激光激发的荧光信号,传输荧光信号,提取荧光信号,对荧光信号进行扫描,将第二激光和荧光信号分离,对分离后的荧光信号过滤、聚焦、滤波和检测处理,并将处理后的荧光信号转换为图像数据。
14.根据权利要求13所述的可视化光刺激方法,其特征在于:所述产生第一激光以照射导入了光敏感基因的细胞群包括:调制第一激光的发射参数;发射第一激光;通过第一光纤传输。
15.根据权利要求13所述的可视化光刺激方法,其特征在于:还包括:采集电信号,并将电信号转换为图像数据。
16.根据权利要求13所述的可视化光刺激方法,其特征在于:还包括:采集生理信号,并对生理信号进行处理。
17.根据权利要求16所述的可视化光刺激方法,其特征在于:所述生理信号包括PH值、离子浓度、腺体分泌物活性。
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PB01 | Publication | ||
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GR01 | Patent grant |