CN108474736A - 用于光遗传学成像的系统和方法 - Google Patents

Abstract

本文提供了使用显微镜系统同时进行成像和刺激的系统和方法。与普通显微镜系统相比，所述显微镜系统可以具有相对较小的大小。所述显微镜可以部分包括成像光源和刺激光源。来自所述成像光源和所述刺激光源的光可以是在光谱上分离的，以减少所述刺激光与所述成像光之间的串扰。

Description

用于光遗传学成像的系统和方法

交叉引用

本申请要求于2015年11月5日提交的美国临时申请号

62/251,501和于2016年9月2日提交的美国临时申请号62/383,122的权益，其公开内容在此通过引用整体并入。

背景技术

生物样品可以由光能刺激。刺激可以启动、增强和/或抑制由光能刺激的一部分生物样品执行的一种或多种活性。在一些情况下，神经细胞可以通过光能激活或去活化。一个或多个神经细胞群体可以基于光能激活来传递信号。生物样品可以具有较小的空间尺度，使得它们可以包含人眼不可见的一个或多个特征，诸如细胞。可以使用显微镜使生物样品较小的特征可视化。

发明内容

本文提供了用于同时对放大的样品进行成像并对样品的至少一部分进行刺激的系统和方法。所述成像和所述刺激可以用显微镜系统进行。所述显微镜系统可以包括总体积小于1立方英寸的小型显微镜。所述显微镜可以包括刺激光源和成像光源。所述刺激光源可以入射在比所述成像光入射的区域更小的区域上。所述显微镜系统能够以与刺激光相比相对较低的强度递送成像光。可以调制所述成像光和所述刺激光的波性质(例如，波长、频率、强度和功率)以减少所述成像光与所述刺激光之间的串扰。

因此，在一方面，提供了用于同时成像和刺激的显微镜系统。所述系统包括：成像光引导布置，其将来自成像光源的成像光引导到所述显微镜系统的视场中的样品；刺激光引导布置，其在所述样品由来自所述成像引导布置的所述成像光照射的同时将来自刺激光源的刺激光引导到所述样品的至少一部分用于刺激所述样品的部分；将所述成像光和所述刺激光引导到所述样品的光学路径，其中所述成像光和所述刺激光透射穿过所述光学路径中的至少一个共享的光学元件，并且其中所述刺激光在所述样品处与所述成像光重叠；以及图像传感器，其在将刺激光引导到所述样品的部分用于刺激所述样品的部分的同时接收来自所述样品的发射光以生成所述样品的图像。

在一些实施方式中，所述刺激光源包括(1)由空间光调制器图案化的单个刺激光源，或者(2)多个刺激光源。在一些实施方式中，(1)在空间上或时间上调制图案化的刺激光，或者(2)其中当所述刺激光引导布置将刺激光引导到所述样品的部分时打开所述多个刺激光源中的至少一部分。在一些实施方式中，(1)基于将刺激光引导到所述样品的指定部分的命令来在空间上或时间上调制所述图案化的刺激光，或者(2)其中打开的所述多个刺激光源中的一部分基于将刺激光引导到所述样品的指定部分的命令。在一些实施方式中，所述图案化的刺激光或所述多个刺激光源由对所述图像传感器生成的图像执行图像分析的计算机系统控制。在一些实施方式中，图像分析确定所述样品中一个或多个感兴趣的物体的位置。在一些实施方式中，通过相同的光学路径将所述成像光和所述刺激光递送到所述样品。在一些实施方式中，将所述成像光和所述刺激光引导到所述样品的相同的光学路径包括光学探针，其(1)促进将所述成像光和所述刺激光递送到所述样品，并且(2)促进将所述样品的图像传送到所述图像传感器。在一些实施方式中，所述计算机系统基于对由所述图像传感器生成的所述图像的所述图像分析借助于一个或多个处理器来控制所述刺激光源的照射图案。在一些实施方式中，所述显微镜具有约1立方英寸的体积。在一些实施方式中，所述显微镜安装在自由移动的生物体上。在一些实施方式中，所述样品包含脑组织。在一些实施方式中，所述刺激光的功率密度是所述成像光的功率密度的至少10X。在一些实施方式中，所述刺激光的波长范围与所述成像光的波长范围在光谱上分离至少10nm。在一些实施方式中，接收来自所述样品的发射光的所述图像传感器以至少50μm或更好的空间分辨率来生成所述样品的图像。在一些实施方式中，所述成像光引导布置与所述显微镜系统板外的光源光学通信。在一些实施方式中，所述刺激光导向布置与所述显微镜系统板外的光源光学通信。

在另一方面，提供了用显微镜对样品同时进行成像和刺激的方法。所述方法包括：借助于将来自成像光源的成像光引导到所述显微镜的视场中的所述样品的至少一部分的成像光引导布置引导成像光，其中所述成像光具有在紫外波长谱、可见波长谱或近红外波长谱内的波长；借助于接收来自所述样品的发射光以生成所述样品的图像的所述显微镜的图像传感器生成所述样品的图像；以及在所述样品由来自所述成像引导布置的所述成像光照亮的同时，借助于将来自刺激光源的刺激光引导到所述样品的部分用于刺激所述样品的部分的刺激光引导布置引导刺激光。

在一些实施方式中，所述刺激光源包括由空间光调制器图案化的单个光源，或者其中所述刺激光源包括多个空间上不同的刺激光源。在一些实施方式中，所述方法还包括(1)在时间上或空间上调制所述图案化的刺激光源，或者(2)打开所述多个刺激光源的至少一部分以将所述刺激光引导到所述样品的部分。在一些实施方式中，基于将刺激光引导到所述样品的指定部分的命令来在空间上或时间上调制所述图案化的刺激光源，或者其中所述打开的多个刺激光源的一部分基于将刺激光引导到所述样品的指定部分的命令。在一些实施方式中，所述方法还包括通过计算机系统的一个或多个处理器分析所述样品的图像以及基于对所述样品的图像的分析控制所述图案化的刺激光源或所述多个刺激光源。在一些实施方式中，所述图像分析包括确定所述样品中一个或多个感兴趣的物体的位置。在一些实施方式中，通过相同的光学路径将所述成像光和所述刺激光递送到所述样品。在一些实施方式中，将所述成像光和所述刺激光同时引导到所述样品的所述相同的光学路径包括光学探针，其(1)促进将所述成像光和所述刺激光递送到所述样品，并且(2)促进将所述物体的图像传送到所述图像传感器。在一些实施方式中，所述显微镜具有约1立方英寸的体积。在一些实施方式中，所述显微镜安装在自由移动的生物体上。在一些实施方式中，所述样品包含脑组织。在一些实施方式中，所述刺激光的功率密度是所述成像光的功率密度的至少10X。在一些实施方式中，所述刺激光的波长范围与所述成像光的波长范围在光谱上分离至少10nm。在一些实施方式中，接收来自所述样品的发射光的所述图像传感器以至少20μm的空间分辨率来生成所述样品的图像。

在另一方面，提供了用于同时成像和刺激的显微镜系统。所述系统包括：成像光引导布置，其将来自成像光源的成像光引导到所述显微镜系统的视场中的样品；刺激光引导布置，其在所述样品由来自所述成像引导布置的成像光照射的同时将来自刺激光源的刺激光引导到所述视场外的所述样品的不同部分用于刺激所述样品的不同部分；以及图像传感器，其在将刺激光引导到所述样品的不同部分用于刺激所述样品的不同部分的同时接收来自所述样品的发射光以生成所述样品的图像。

在一些实施方式中，所述刺激光源包括(1)由空间光调制器图案化的单个刺激光源，或者(2)多个刺激光源。在一些实施方式中，(1)在空间上或时间上调制所述图案化的刺激光，或者(2)其中当所述刺激光引导布置将刺激光引导到所述样品的不同部分时打开所述多个刺激光源的至少一部分。在一些实施方式中，(1)基于将刺激光引导到所述样品的指定部分的命令来在空间上或时间上调制所述图案化的刺激光，或者(2)其中所述打开的多个刺激光源的一部分基于将刺激光引导到所述样品的指定部分的命令。在一些实施方式中，所述图案化的刺激光或所述多个刺激光源由对所述图像传感器生成的图像执行图像分析的计算机系统控制。在一些实施方式中，图像分析确定所述样品中一个或多个感兴趣的物体的位置。在一些实施方式中，通过不同的光学路径将所述成像光和所述刺激光递送到所述样品。在一些实施方式中，所述光学路径中的至少一个包括光学探针，其(1)促进将所述成像光或者所述刺激光递送到所述样品，并且(2)促进将所述样品的图像传送到所述图像传感器。在一些实施方式中，所述计算机系统基于对由所述图像传感器生成的所述图像的图像分析借助于一个或多个处理器来控制所述刺激光源的照射图案。在一些实施方式中，所述显微镜具有约1立方英寸的体积。在一些实施方式中，所述显微镜安装在自由移动的生物体上。在一些实施方案中，所述样品包含脑组织。在一些实施方式中，所述刺激光的功率密度是所述成像光的功率密度的至少10X。在一些实施方式中，所述刺激光的波长范围与所述成像光的波长范围在光谱上分离至少10nm。在一些实施方式中，其中接收来自所述样品的发射光的所述图像传感器以至少50μm或更好的空间分辨率来生成所述样品的图像。在一些实施方式中，所述成像光引导布置与所述显微镜系统板外的光源光学通信。在一些实施方式中，所述刺激光导向布置与所述显微镜系统板外的光源光学通信。在一些实施方式中，所述视场是成像视场。在一些实施方式中，所述刺激光在所述样品处不与所述成像光重叠。

本文公开了用于对受试者体内的组织同时进行成像和刺激的光学系统，所述系统包括：a)光学组件，其包括：i)成像光源，其包括一个或多个发光元件并且被配置用于将成像光引导到指定视场内的组织；ii)刺激光源，其包括一个或多个发光元件并且被配置用于将刺激光引导到所述视场的至少一部分内的组织；iii)将所述成像光和所述刺激光引导到所述组织的光学路径，其中所述成像光和所述刺激光通过至少一个共享的可变形透镜透射到所述组织；和iv)图像传感器，其被配置用于接收由所述组织反射、散射或发射的光以生成所述视场内的所述组织的图像；以及b)基板，其中所述基板被配置成以固定位置安装在所述受试者上并且接收所述光学组件，从而使所述光学组件在附接到所述基板时相对于所述受试者的所述组织对准，并且其中所述光学组件是可从所述基板移除的。

在一些实施方式中，所述视场约为1mm x 1mm。在一些实施方式中，所述图像的焦平面在约300μm的范围上是可调节的而不损失空间分辨率。在一些实施方式中，所述光学组件能够在约1mm x1mm x 300μm的组织体积上生成图像。在一些实施方式中，所述光学组件能够在所述视场的中心处生成具有优于2μm的空间分辨率的图像。在一些实施方式中，所述光学组件还包括一个或多个校正光学元件，并且能够在所述整个视场上生成具有优于2μm的空间分辨率的图像。在一些实施方式中，所述光学组件还包括至少第二可变形透镜。在一些实施方式中，所述图像的焦平面与由所述刺激光源生成的刺激光的焦平面相同。在一些实施方式中，所述图像的焦平面不同于由所述刺激光源生成的刺激光的焦平面。在一些实施方式中，所述至少一个可变形透镜选自液体透镜、液晶透镜和压电致动可调透镜或其任何组合。在一些实施方式中，所述至少一个共享的可变形透镜被定位成十分靠近梯度折射率(Gradient Index，GRIN)物镜。在一些实施方式中，所述至少一个共享的可变形透镜被定位成十分靠近离所述组织最远的所述梯度折射率(GRIN)物镜的端部。在一些实施方式中，所述光学组件还包括可以部分植入所述组织中的探针。在一些实施方式中，组织到图像传感器路径长度约小于5cm。在一些实施方式中，组织到成像光源路径长度约小于5cm。在一些实施方式中，所述成像光源包括两个或更多个发光元件，并且被配置用于将两个或更多个不同波长的成像光引导到所述指定视场的所述组织。在一些实施方式中，所述刺激光源包括两个或更多个发光元件，并且被配置用于将两个或更多个不同波长的刺激光引导到所述视场的至少一部分内的所述组织。在一些实施方式中，所述刺激光源被配置用于以用户定义的空间图案将刺激光引导到所述组织。在一些实施方式中，所述用户定义的空间图案在所述焦平面处具有优于5μm的空间分辨率。在一些实施方式中，所述光学系统还包括处理器和存储器设备，其中所述处理器被配置用于执行存储在所述存储器设备中的一系列软件编码的指令。在一些实施方式中，所述软件编码的指令包括用于以下操作的指令：(i)以时间依赖性或空间依赖性方式调制成像光强度，(ii)以时间依赖性方式调制刺激光强度，(iii)以时间依赖性方式改变焦深，以及(iv)以指定时间在所述指定视场内捕获所述组织的一个或多个图像，或其任何组合。在一些实施方式中，所述组织是脑组织，并且所述软件编码的指令包括用于以时间依赖性或空间依赖性方式调制所述刺激光以在所述脑组织中诱导神经反应的指令。在一些实施方式中，所述系统的总体积约小于5cm³。在一些实施方式中，所述系统的总重量约小于4克。在一些实施方式中，所述系统包括可以安装在同一基板上的至少第二光学组件。在一些实施方式中，所述成像光源或所述刺激光源的所述一个或多个发光元件包括耦合到一个或多个外部光源的光纤。在一些实施方式中，所述系统通过所述基板安装在自由移动的受试者上。在一些实施方案中，受试者选自小鼠、大鼠、猫、狗、猪、牛、马、猴、黑猩猩、红毛猩猩、大猩猩和人类。在一些实施方式中，所述系统用于临床前研究。在一些实施方式中，所述系统用于临床研究。在一些实施方式中，所述系统用于确定临床诊断测试结果。在一些实施方式中，系统用于以产生治疗效果的时间调制或空间调制的方式将刺激光引导到所述组织。

本文公开了用于对受试者体内的组织同时进行成像和刺激的光学系统，所述系统包括：光学成像探针，其包括成像光源和图像传感器，并且被配置用于接收由所述组织反射、散射或发射的光以生成指定视场内的所述组织的图像；光学刺激探针，其包括一个或多个发光元件并且被配置用于将刺激光引导到所述视场内的组织，所述视场外的组织或其任何组合；以及基板，其中所述基板被配置成以固定位置安装在所述受试者上并且接收所述光学成像探针和所述刺激探针，从而使所述光学成像探针和所述光学刺激探针在附接到所述基板时相对于所述受试者的所述组织对准，并且其中所述光学成像探针和所述光学刺激探针是可从所述基板移除的。

在一些实施方式中，所述光学系统还包括附接到所述相同基板的至少第二光学成像探针、至少第二光学刺激探针或其任何组合，并且其中所述基板的配置确定了所述光学成像探针与光学刺激探针之间的横向距离。在一些实施方式中，所述光学成像探针和所述光学刺激探针各自包括至少一个可变形透镜，所述至少一个可变形透镜允许在约300μm的范围上调节焦平面而不损失空间分辨率。在一些实施方式中，所述光学成像探针的所述视场约为1mm x 1mm。在一些实施方式中，所述光学成像探针能够在约1mm x 1mm x 300μm的组织体积上生成图像。在一些实施方式中，所述光学成像探针能够在所述视场的中心处生成具有优于2μm的空间分辨率的图像。在一些实施方式中，所述光学成像探针还包括一个或多个校正光学元件，并且能够在所述整个视场上生成具有优于2μm的空间分辨率的图像。在一些实施方式中，所述图像的焦平面与由所述光刺激探针生成的刺激光的焦平面相同。在一些实施方式中，所述图像的焦平面不同于由所述光学刺激探针生成的刺激光的焦平面。在一些实施方式中，所述至少一个可变形透镜选自液体透镜、液晶透镜和压电致动可调透镜或其任何组合。在一些实施方式中，所述光学成像探针的所述至少一个可变形透镜被定位成十分靠近梯度折射率(GRIN)物镜。在一些实施方式中，所述至少一个可变形透镜被定位成十分靠近离所述组织最远的所述梯度折射率(GRIN)物镜的端部。在一些实施方式中，所述光学成像探针可以部分植入所述组织中。在一些实施方式中，所述光学刺激探针可以部分植入所述组织中。在一些实施方式中，所述光学成像探针的组织到图像传感器路径长度约小于5cm。在一些实施方式中，所述光学刺激探针的组织到成像光源路径长度约小于5cm。在一些实施方式中，所述成像光源包括两个或更多个发光元件，并且被配置用于将两个或更多个不同波长的成像光引导到所述指定视场的所述组织。在一些实施方式中，所述光学刺激探针包括两个或更多个发光元件，其被配置用于将两个或更多个不同波长的刺激光引导到所述视场内的所述组织、到所述视场外的组织，或到其任何组合。在一些实施方式中，所述光学刺激探针被配置用于以用户定义的空间图案将刺激光引导到所述组织。在一些实施方式中，所述用户定义的空间图案在所述焦平面处具有优于5μm的空间分辨率。在一些实施方式中，所述光学系统还包括处理器和存储器设备，其中所述处理器被配置用于执行存储在所述存储器设备中的一系列软件编码的指令。在一些实施方式中，所述软件编码的指令包括用于以下操作的指令：(i)以时间依赖性或空间依赖性方式调制成像光强度，(ii)以时间依赖性方式调制刺激光强度，(iii)以时间依赖性方式改变焦深，以及(iv)以指定时间在所述指定视场内捕获所述组织的一个或多个图像，或其任何组合。在一些实施方式中，所述组织是脑组织，并且所述软件编码的指令包括用于以时间依赖性或空间依赖性方式调制所述刺激光以在所述脑组织中诱导神经反应的指令。在一些实施方式中，所述系统的总体积约小于5cm³。在一些实施方式中，所述系统的总重量约小于4克。在一些实施方式中，所述成像光源或所述光学刺激探针的一个或多个发光元件包括耦合到一个或多个外部光源的光纤。在一些实施方式中，所述系统通过所述基板安装在自由移动的受试者上。在一些实施方式中，所述受试者选自由小鼠、大鼠、猫、狗、猪、牛、马、猴子、黑猩猩、红毛猩猩、大猩猩和人类。在一些实施方式中，所述系统用于临床前研究。在一些实施方式中，所述系统用于临床研究。在一些实施方式中，所述系统用于确定临床诊断测试结果。在一些实施方式中，所述系统用于以产生治疗效果的时间调制或空间调制的方式将刺激光引导到所述组织。

本文公开了用于对受试者体内的组织同时进行成像和刺激的光学系统，所述系统包括：光学组件，其包括：光学成像探针，其包括成像光源和图像传感器，并且被配置用于接收由所述组织反射、散射或发射的光以生成指定视场内的所述组织的图像；和光学刺激探针，其包括一个或多个发光元件并且被配置用于将刺激光引导到所述视场内的组织，所述视场外的组织或其任何组合；以及基板，其中所述基板被配置成以固定位置安装在所述受试者上并且接收所述光学组件，从而在附接到所述基板时相对于所述受试者的所述组织对准所述光学组件，并且其中所述光学组件具有约小于5cm³的总体积且是可从所述基板移除的。

本文还公开了用于对受试者体内的组织同时进行成像和刺激的光学系统，所述系统包括：光学组件，其包括：光学成像探针，其包括成像光源，可变形透镜和图像传感器，并且被配置用于接收由组织反射、散射或发射的光，以在约300μm的深度上在约1mm x 1mm的视场内生成所述组织的一系列断层图像；和光学刺激探针，其包括一个或多个发光元件并且被配置用于将刺激光引导到所述视场内的组织，所述视场外的组织或其任何组合；以及基板，其中所述基板被配置成以固定位置安装在所述受试者上并且接收所述光学组件，从而在附接到所述基板时相对于所述受试者的所述组织对准所述光学组件，并且其中所述光学组件具有约小于5cm³的总体积且是可从所述基板移除的。

在一些实施方式中，由所述成像光源产生的成像光和刺激光透射穿过至少一个共享的可变形透镜到所述组织，所述至少一个共享的可变形透镜允许在约300μm的范围上调节所述焦平面而不损失空间分辨率。在一些实施方式中，所述光学成像探针的视场约为1mmx1mm。在一些实施方式中，所述光学成像探针能够在约1mm x 1mm x 300μm的组织体积上生成图像。在一些实施方式中，光学成像探针能够在视场的中心处生成具有优于2μm的空间分辨率的图像。在一些实施方式中，所述光学成像探针还包括一个或多个校正光学元件，并且能够在整个视场上生成具有优于2μm的空间分辨率的图像。在一些实施方式中，所述图像的焦平面与由所述光刺激探针生成的刺激光的焦平面相同。在一些实施方式中，所述图像的焦平面不同于由所述光学刺激探针生成的刺激光的焦平面。在一些实施方式中，所述至少一个可变形透镜选自液体透镜、液晶透镜和压电致动可调透镜或其任何组合。在一些实施方式中，所述光学成像探针的所述至少一个可变形透镜被定位成十分靠近梯度折射率(GRIN)物镜。在一些实施方式中，所述至少一个可变形透镜被定位成十分靠近离所述组织最远的所述梯度折射率(GRIN)物镜的端部。在一些实施方式中，所述光学成像探针可以部分植入所述组织中。在一些实施方式中，所述光学刺激探针可以部分植入所述组织中。在一些实施方式中，所述光学成像探针的组织到图像传感器路径长度约小于5cm。在一些实施方式中，所述光学刺激探针的组织到成像光源路径长度约小于5cm。在一些实施方式中，成像光源包括两个或更多个发光元件，并且被配置用于将两个或更多个不同峰值波长的成像光引导到所述指定视场的所述组织。在一些实施方式中，所述光学刺激探针包括两个或更多个发光元件，其被配置用于将两个或更多个不同峰值波长的刺激光引导到所述视场内的组织，到所述视场外的组织，或到其任何组合。在一些实施方式中，所述光学刺激探针被配置用于以用户定义的空间图案将刺激光引导到所述组织。在一些实施方式中，所述用户定义的空间图案在所述焦平面处具有优于5μm的空间分辨率。在一些实施方式中，所述光学系统还包括处理器和存储器设备，其中所述处理器被配置用于执行存储在所述存储器设备中的一系列软件编码的指令。在一些实施方式中，软件编码的指令包括用于以下操作的指令：(i)以时间依赖性或空间依赖性方式调制成像光强度，(ii)以时间依赖性方式调制刺激光强度，(iii)以时间依赖性方式改变焦深，以及(iv)以指定时间在所述指定视场内捕获所述组织的一个或多个图像，或其任何组合。在一些实施方式中，所述组织是脑组织，并且其中所述软件编码的指令包括用于以时间依赖性或空间依赖性方式调制所述刺激光以在所述脑组织中诱导神经反应的指令。在一些实施方式中，所述系统的总体积约小于5cm³。在一些实施方式中，所述系统的总重量约小于4克。在一些实施方式中，所述成像光源或所述光学刺激探针的一个或多个发光元件包括耦合到一个或多个外部光源的光纤。在一些实施方式中，所述系统通过所述基板安装在自由移动的受试者上。在一些实施方式中，所述受试者选自小鼠、大鼠、猫、狗、猪、牛、马、猴子、黑猩猩、红毛猩猩、大猩猩和人类。在一些实施方式中，所述系统用于临床前研究。在一些实施方式中，所述系统用于临床研究。在一些实施方式中，所述系统用于确定临床诊断测试结果。在一些实施方式中，所述系统用于以产生治疗效果的时间调制或空间调制的方式将刺激光引导到所述组织。

本文公开了用于对受试者体内的组织同时进行成像和刺激的光学系统，所述系统包括：光学组件，其包括：照射光学路径，其包括一个或多个发光元件并且被配置用于将成像光引导到指定视场内的组织；刺激光学路径，其包括一个或多个发光元件并且被配置用于将刺激光引导到所述视场内的组织、到所述视场外的组织或到其任何组合；成像光学路径，其包括一个或多个图像传感器并且被配置用于接收由所述组织反射、散射或发射的光以在所述视场内生成所述组织的图像；以及基板，其中所述基板被配置成以固定位置安装在所述受试者上并且接收所述光学组件，从而使所述光学组件在附接到所述基板时相对于所述受试者的所述组织对准，并且其中所述光学组件是可从所述基板移除的。

本文公开了用于对受试者体内的组织同时进行成像和刺激的光学系统，所述系统包括：a)光学组件，其包括：照射光学路径，其包括一个或多个发光元件并且被配置用于将成像光引导到指定视场内的组织；刺激光学路径，其包括一个或多个发光元件并且被配置用于将刺激光引导到所述视场内的组织、到所述视场外的组织或到其任何组合；成像光学路径，其包括一个或多个图像传感器并且被配置用于接收由所述组织反射、散射或发射的光以在所述视场内生成所述组织的图像；被配置用于在所述光学组件与外部控制器之间提供无线信息通信的无线适配器；以及被配置用于包围所述光学组件和所述无线适配器的壳体，其中所述壳体是气密密封的并且包括生物相容性外表面；其中所述光学系统是部分或完全可植入所述受试者的所述组织内的。

在一些实施方式中，所述指定视场约为1mm x 1mm。在一些实施方式中，所述光学组件被配置用于获取在所述视场的中心处的具有优于约2μm的空间分辨率的图像。在一些实施方式中，所述光学组件被配置用于通过将一个或多个校正光学元件添加到所述光学组件获取在所述整个视场上具有约2μm的空间分辨率的图像。在一些实施方式中，所述光学组件还包括一个或多个可变形透镜，所述一个或多个可变形透镜被配置用于调节所述成像光学路径、所述刺激光学路径或者两者的焦深。在一些实施方式中，所述一个或多个可变形透镜被配置用于在约300μm的范围上调节所述成像光学路径、所述刺激光学路径或者两者的焦深，而不损失空间分辨率。在一些实施方式中，所述一个或多个可变形透镜选自液体透镜、液晶透镜和压电致动可调透镜或其任何组合。在一些实施方式中，所述一个或多个可变形透镜被配置成使得所述成像光学路径和所述刺激光学路径将光引导到相同的焦平面。在一些实施方式中，所述光学组件被配置用于在约1mm x 1mm x 300μm的组织体积上获取图像。在一些实施方式中，所述刺激光学路径还被配置用于以所述用户定义的空间图案将所述刺激光引导到所述组织。在一些实施方式中，所述用户定义的空间图案在所述焦平面处具有优于约5μm的空间分辨率。在一些实施方式中，所述光学系统还包括第一处理器和存储设备，其中所述处理器被配置用于执行存储在所述存储设备中的一系列软件编码的指令。在一些实施方式中，所述软件编码的指令包括用于以下操作的指令：(i)以时间依赖性或空间依赖性方式调制成像光强度，(ii)以时间依赖性方式调制刺激光强度，(iii)以时间依赖性方式改变所述焦深，以及(iv)以指定时间在所述指定视场内捕获所述组织的一个或多个图像，或其任何组合。在一些实施方式中，所述组织是脑组织，并且所述软件编码的指令包括用于以时间依赖性或空间依赖性方式调制所述刺激光以在所述脑组织中诱导神经反应的指令。在一些实施方式中，所述系统的总体积约小于5cm³。在一些实施方式中，所述系统的总重量约小于4克。在一些实施方式中，所述系统包括至少第二照射光学路径、至少第二刺激光学路径、至少第二成像光学路径或其任何组合。在一些实施方式中，所述照射光学路径或所述刺激光学路径的所述一个或多个发光元件包括耦合到一个或多个外部光源的光纤。在一些实施方式中，所述基板被配置用于允许附接两个或更多个光学组件。在一些实施方式中，所述无线适配器被配置用于经由射频或光学链路提供无线通信。在一些实施方式中，所述无线适配器被配置用于分别地或同时地支持无线读取和写入操作。在一些实施方式中，所述系统安装在自由移动的受试者上、部分植入或完全植入自由移动的受试者体内。在一些实施方式中，所述受试者选自小鼠、大鼠、猫、狗、猪、牛、马、猴子、黑猩猩、红毛猩猩、大猩猩和人类。在一些实施方式中，所述系统用于临床前研究。在一些实施方式中，所述系统用于临床研究。在一些实施方式中，所述系统用于确定临床诊断测试结果。在一些实施方式中，所述系统用于以产生治疗效果的时间调制或空间调制的方式将刺激光引导到所述组织。

本文公开了用于对受试者体内的组织同时进行刺激和成像的方法，所述方法包括：提供根据本文公开的任何一个实施方式的光学系统；提供包含待刺激和成像的所述组织的受试者；将步骤(a)的所述光学系统安装在所述受试者上或者植入其体内；以及在以时间调制或空间调制的方式将刺激光引导到所述受试者的所述组织之前、期间或之后，生成所述组织的一个或多个图像。

在一些实施方式中，所述受试者选自小鼠、大鼠、猫、狗、猪、牛、马、猴子、黑猩猩、红毛猩猩、大猩猩和人类。在一些实施方式中，所述方法作为临床前研究的一部分执行。在一些实施方式中，所述方法作为临床研究的一部分执行。在一些实施方式中，所述方法还包括确定临床诊断测试结果。在一些实施方式中，所述还包括以产生治疗效果的时间调制或空间调制的方式将刺激光引导到所述组织。

本文公开了用于对受试者体内的组织同时进行成像和刺激的显微镜系统，所述显微镜系统包括：光学组件，其包括：照射光学路径，其包括一个或多个发光元件并且被配置用于将成像光引导到指定视场内的组织；刺激光学路径，其包括一个或多个发光元件并且被配置用于将刺激光引导到所述视场内的组织、到所述视场外的组织或者到部分地位于所述视场内的组织；成像光学路径，其包括一个或多个图像传感器并且被配置用于接收由所述组织反射、散射或发射的光以生成所述视场内的所述组织的图像；基板，其中所述基板被配置成以固定位置安装在所述受试者上并且接收所述光学组件，从而使所述光学组件在附接到所述基板时相对于所述受试者的所述组织对准，并且其中所述光学组件是可从所述基板移除的。

在一些实施方式中，所述指定视场约为1mm x 1mm。在一些实施方式中，所述指定视场约为2mm x 2mm。在一些实施方式中，所述指定视场约为4mm x 4mm。在一些实施方式中，所述成像光是荧光激发光。在一些实施方式中，所述荧光激发光在400nm至500nm的波长范围内提供，并且所述刺激光在500nm至800nm的波长范围内提供。在一些实施方式中，所述荧光激发光在500nm至650nm的波长范围内提供，并且所述刺激光在350nm至560nm的波长范围内提供。在一些实施方式中，所述光学组件被配置用于获取在所述视场的中心处的具有优于约2μm的空间分辨率的图像。在一些实施方式中，所述光学组件被配置用于通过将一个或多个校正光学元件添加到所述光学组件而获取在所述整个视场上具有约2μm的空间分辨率的图像。在一些实施方式中，所述光学组件还包括一个或多个可变形透镜，所述一个或多个可变形透镜被配置用于调节所述成像光学路径、所述刺激光学路径或者两者的焦深。在一些实施方式中，所述照射光学路径、所述刺激光学路径和所述成像光学路径共享至少一个可变形透镜。在一些实施方式中，所述一个或多个可变形透镜被配置用于在约300μm的范围上调节所述成像光学路径、所述刺激光学路径或者两者的焦深，而不损失空间分辨率。在一些实施方式中，所述一个或多个可变形透镜选自液体透镜、液晶透镜和压电致动可调透镜或其任何组合。在一些实施方式中，所述一个或多个可变形透镜被配置成使得所述成像光学路径和所述刺激光学路径将光引导到相同的焦平面。在一些实施方式中，所述光学组件被配置用于在约1mm x 1mm x 300μm的组织体积上获取图像。在一些实施方式中，所述刺激光学路径还被配置用于以所述用户定义的空间图案将所述刺激光引导到所述组织。在一些实施方式中，所述用户定义的空间图案在所述焦平面处具有优于约5μm的空间分辨率。在一些实施方式中，所述显微镜系统还包括第一处理器和存储设备，其中所述处理器被配置用于执行存储在所述存储设备中的一系列软件编码的指令。在一些实施方式中，所述软件编码的指令包括用于以下操作的指令：(i)以时间依赖性或空间依赖性方式调制成像光强度，(ii)以时间依赖性方式调制刺激光强度，(iii)以时间依赖性方式改变焦深，以及(iv)以指定时间在所述指定视场内捕获所述组织的一个或多个图像，或其任何组合。在一些实施方式中，所述组织是脑组织，并且其中所述软件编码的指令包括用于以时间依赖性或空间依赖性方式调制所述刺激光以在所述脑组织中诱导神经反应的指令。在一些实施方式中，所述系统的总体积约小于5cm³。在一些实施方式中，所述系统的总重量约小于4克。在一些实施方式中，将所述照射光学路径和所述成像光学路径包装在第一壳体中作为光学成像探针。在一些实施方式中，所述刺激光学路径被包装在第二壳体中作为光学刺激探针。在一些实施方式中，所述系统包括附接到所述基板的至少第二光学成像探针、至少第二光学刺激探针或其任何组合。在一些实施方式中，所述照射光学路径或所述刺激光学路径的所述一个或多个发光元件包括耦合到一个或多个外部光源的光纤。在一些实施方式中，所述系统安装在自由移动的受试者上或者部分植入其体内。在一些实施方式中，所述照射光学路径、所述刺激光学路径和所述成像光学路径还包括部分植入所述受试者的组织中的共享内窥镜探针。在一些实施方式中，所述受试者选自小鼠、大鼠、猫、狗、猪、牛、马、猴子、黑猩猩、红毛猩猩、大猩猩和人类。在一些实施方式中，所述系统用于临床前研究。在一些实施方式中，所述系统用于临床研究。在一些实施方式中，所述系统用于确定临床诊断测试结果。在一些实施方式中，所述系统用于中枢神经系统、外周神经系统或者两者的神经元组织的光刺激。在一些实施方式中，所述系统用于以产生治疗效果的时间调制或空间调制的方式将刺激光引导到所述组织。

本文公开了用于受试者体内的组织同时进行刺激和成像的方法，所述方法包括：a)提供根据权利要求34所述的显微镜系统；b)提供包含待刺激和成像的所述组织的受试者；c)将步骤(a)的所述显微镜系统安装在所述受试者上或者植入其体内；以及在以时间调制或空间调制的方式将刺激光引导到所述受试者的组织之前、期间或之后，生成所述组织的一个或多个图像。

在一些实施方式中，所述受试者选自小鼠、大鼠、猫、狗、猪、牛、马、猴子、黑猩猩、红毛猩猩、大猩猩和人类。在一些实施方式中，所述方法作为临床前研究的一部分执行。在一些实施方式中，所述方法作为临床研究的一部分执行。在一些实施方式中，所述方法还包括确定临床诊断测试结果。在一些实施方式中，方法还包括以产生治疗效果的时间调制或空间调制的方式将刺激光引导到所述组织。

根据下文的详细描述，本公开内容的其他方面和优点对于本领域技术人员来说将会容易变得显而易见，其中仅示出和描述了本公开内容的说明性实施方式。如将会认识到，本公开内容能够具有其他且不同的实施方式，并且在各个明显方面能够对其若干细节进行修改，所有这些修改都不脱离本公开内容。因此，附图和描述实际上要视为是说明性的，而非限制性的。

援引并入

本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请均通过引用整体并入本文，程度如同具体地和单独地指出通过引用整体并入每个单独的出版物、专利或专利申请。在本文术语与并入引用中的术语冲突的情况下，以本文术语为准。

附图说明

本发明的新颖特征在所附权利要求中具体阐述。通过参考对在其中利用到本发明原理的说明性实施方式加以阐述的以下详细描述和附图(本文也为“示图”和“图”)，将会获得对本发明的特征和优点的更好的理解，在附图中：

图1示出了小型光遗传学显微镜系统的示意图。

图2A示出了包括多个光源的刺激光源的示意图。

图2B示出了由显微镜系统成像的视场的示意图，所述视场包括刺激光入射到其上的多个感兴趣的物体。

图3示出了可以提供给用户以显示由显微镜系统成像的视场的显示器。

图4示出了与计算机控制系统通信的小型光遗传学显微镜系统的示意图。

图5示出了被配置用于控制显微镜系统的计算机系统。

图6示出了作为成像光源和刺激光源的波长的函数的可能的发射光谱。

图7示出了紧凑型光遗传学显微镜系统的一个实施方式的示意图。

图8A-图8B图示了紧凑型光遗传学显微镜的配置的两个非限制性示例。图8A：455nm激发LED，590nm激活LED。图8B：560nm激发LED，455nm激活LED。

图9A-图9C图示了紧凑型光遗传学显微镜系统的不同成像应用的非限制性示例。

图10A-图10D示出了使用兴奋性视蛋白进行生物串扰的体外表征数据的示例。

图11A-图11B示出了使用抑制性视蛋白进行生物串扰的体外表征数据的示例。

图12A-图12B示出了生物串扰的体内表征数据的示例。

图13A-图13B示出了光学串扰的体内表征数据的示例。

图14示出了与所公开的紧凑型光遗传学显微镜系统一起使用的合适的视蛋白/指示剂组合的非限制性示例。

图15图示了使用所公开的紧凑型光遗传学显微镜系统建立和执行光遗传学学研究中所采取的步骤的一个非限制性示例。

具体实施方式

虽然本文已经示出和描述了本发明的各个实施方式，但对于本领域技术人员显而易见的是，这样的实施方式只是以示例的方式提供的。本领域技术人员可以在不偏离本发明的情况下想到许多变形、改变和替代。应当理解，可以采用本文所描述的本发明实施方式的各种替代方案。

本文提供了用于操作显微镜系统的系统和方法，该显微镜系统在本文中也称为光学系统和/或光遗传学显微镜系统。显微镜系统可以被配置用于提供样品的并行操作和观察。样品可以是生物样品。样品的至少一部分可以包含一个或多个感兴趣的物体，例如细胞。在一些情况下，样品可以包含神经元群体。包含一个或多个感兴趣的物体的样品的至少一部分可以通过来自显微镜系统的光刺激来激活或去活化。刺激光可以刺激细胞膜中光激活的离子通道(例如，视蛋白)(该过程也可以称为“光遗传学刺激”或“光遗传学调制”)。视蛋白可以自然发生在细胞膜中。在一些情况下，视蛋白可以通过导致细胞膜结合视蛋白的细胞遗传修饰而装载到细胞膜中。可以通过病毒介导的转染将生成视蛋白的基因导入细胞。显微镜系统可以在向样品提供刺激光的同时对样品成像(例如，使用荧光)。同时成像和刺激可以允许用户观察由刺激光刺激的样品的一个或多个部分(例如，细胞、神经元或神经元群体)。样品可以使用单个集成光遗传学显微镜系统同时由刺激光刺激并由成像光成像。例如，通过采集由样品散射、反射或透射的成像光，或者通过使用激发成像光源激发样品中的荧光并收集发射的荧光以形成图像，可以对样品进行光学成像。样品可以通过直接提供给样品的光成像。在入射到样品上之前，样品可以通过不透射通过一个或多个边界(诸如皮肤或骨骼)的光进行成像。在一些实施方式中，所公开的光遗传学显微镜系统还包括基板，该基板可以安装在或植入自由移动受试者上的固定位置。基板可以被配置用于接收光遗传学显微镜，从而在将显微镜附接到基板时使显微镜相对于受试者的组织对准，并且还允许随后移除或更换显微镜。

光遗传学显微镜可以是任何显微镜，该任何显微镜被配置用于将来自第一光源的光递送到样品以产生样品的图像并且交替地或同时地将来自第二光源的光递送到样品以刺激至少一部分样品。样品的刺激可以包括引发来自样品的电化学信号。图1示出了被配置用于将成像光和刺激光递送到样品的光遗传学显微镜系统100的示图。显微镜系统100可以同时将成像光和刺激光递送到样品。显微镜系统可以在不同的时间段将成像光和刺激光递送到样品。

本文公开的紧凑型光遗传学显微镜是光学系统的一个非限制性实例。如本文所使用的，光学设备或光学系统可以是任何设备或系统，该任何设备或系统包括以一种方式布置的一个或多个光学部件，例如透镜、反射镜、光学滤光片、棱镜、衍射光栅、单色器等等，使得该设备或系统执行光学功能，诸如将光传递到指定的视场、从指定的视场收集光并在指定的焦平面形成图像、提供指定视场的放大图像等等。光学设备或光学系统中的光学部件的布置因此构成用于将光从空间中的一个位置传输到另一个位置的“光学路径”。因此，可以提及，例如，用于将成像光递送到限定视场内的样品或组织的“照射光学路径”，或者用于将刺激光递送到限定视场内的样品或组织“刺激光学路径”，或者用于将从限定视场内的样品或组织收集的光递送到图像传感器的“成像光学路径”。

如本文所使用的，“光学组件”可以指包括光学设备或系统的光学部件的全部或一部分的一个或多个光学部件的分组，并且通常还可以包括电子部件(例如，光源或光检测器)以及机械部件(例如，底座或固定器)，该机械部件保持各个光学部件相对于彼此处于固定或可调节的定向以及/或者相对于彼此处于固定或可调节的距离。在一些情况下，光学设备或系统可以包括多于一个光学组件(或光学子系统)。在一些情况下，光学设备或系统可以包括两个或更多个光学组件，其中两个或更多个不同的光学组件被配置用于执行相同或不同的功能。例如，光学组件(例如，照射光学组件，或者“光学照射探针”)可以包括将成像光递送到限定视场内的样品所需的光学部件和电子部件。或者，光学组件(例如，刺激光学组件，或“光学刺激探针”)可以包括将光刺激光递送到限定视场内的样品所需的光学部件。

在另一情况下，光学组件(例如，成像光学组件，或“光学成像探针”)可以包括将成像光递送到限定视场内的样品，以及收集由样品反射、散射或发射的光以捕获限定视场的样品的图像两者所需的光学部件和电子部件。因此，在一些实施方式中，诸如本文公开的光遗传学显微镜系统等光学系统可以包括一个或多个任意组合的光学组件或光学探针以提供各种照射、光刺激和成像功能。在一些实施方式中，所公开的光遗传学显微镜系统还可以包括附加机械部件，例如，壳体、基板或位置调节机构、机电部件(例如，手动或机动平移台或其他微定位设备)，或者电子部件(例如，光源、光检测器、图像传感器、光源、温度传感器、温度控制元件、温度控制器、模数转换器、数模转换器、放大器、处理器、存储器设备等等)。

显微镜系统可以包括成像导光布置103和刺激导光布置102。成像导光布置和刺激导光布置可以包含在壳体中，该壳体包含显微镜系统的一个或多个光学部件的至少一部分。导光布置可以与环境光是光学上隔离的。成像导光布置可以包括成像光源。成像光源可以在显微镜板上的。成像光源可以生成成像光。成像导光布置可以与导光布置板外的成像光源光学通信。成像光源可以是在显微镜板外的。成像光源可以包含或可以不包含在壳体中。成像导光布置可以通过光学透射元件(例如光纤元件)与成像光源光学通信。刺激导光布置可以与在导光布置板外的刺激光源光学通信。刺激光源可以生成刺激光。刺激光源可以是在显微镜板上的。刺激光源可以是在显微镜板外的。刺激光源可以包含或可以不包含在壳体中。刺激导光布置可以通过光学透射元件(例如光纤元件)与刺激光源光学通信。

光遗传学显微镜可对来自样品的不同波长(例如，颜色)的光成像，使得用户可以研究不同的细胞组分和/或相互作用。在一些情况下，不同的细胞群体可以通过对不同颜色的荧光标签进行成像来识别。显微镜可以被配置用于放大样品的一个或多个特征，使得用户能够研究可由用户眼睛检测的大小范围之外的组分和/或相互作用。从样品成像的不同波长的光可以对应于可以在多色显微镜成像过程中成像的不同颜色。显微镜系统可以被配置用于同时检测多种颜色的光。

光遗传学显微镜可以被配置用于执行单色或多色成像。光遗传学显微镜可以在刺激样品的同时对来自样品的两种或更多种不同颜色(例如，波长)发射(例如，荧光)成像。在一些情况下，两种或更多种不同的颜色可以来自添加到样品中的两种以上不同的染料。染料可以是荧光染料。具有不同蛋白质和/或不同遗传标记和/或不同神经功能的细胞可以用不同染料来识别。双色成像可以帮助识别感兴趣的物体(例如细胞群体)以用于靶向来自光遗传学显微镜的刺激光。

同时成像多种颜色可以允许用户对不同的样品成像，例如，不同的细胞群体和不同细胞群体之间的相互作用。不同的细胞群体可以用能够通过显微镜系统检测到的颜色标记进行染色。或者，不同的细胞群体可以自然地发射能够通过显微镜系统检测到的不同颜色标记。在一些情况下，可以通过检测蛋白质或遗传标记用多色显微镜识别群体内的亚群。可以通过多色成像刺激光的刺激来研究和/或研究亚群中的差异。在一些情况下，可以研究来自一个细胞群体的成像动态和血液动力学，以识别代谢和/或血脑屏障现象(例如，药物递送)。

在一些情况下，光遗传学显微镜可以被配置用于执行单色成像。光遗传学显微镜可以在对来自样品的单一颜色(例如，波长或波长带)发射(例如，荧光)成像的同时对样品进行刺激。光遗传学显微镜可以包括在可见波长范围内检测来自样品的光的单色图像传感器。光遗传学显微镜可以包括在可见波长范围外检测来自样品的光的单色图像传感器。光遗传学显微镜可以包括在可见波长范围之外以及之内检测来自样品的光的单色图像传感器。在一些实施方式中，光遗传学显微镜可以包括多于一个图像传感器，例如，两个、三个、四个或更多个图像传感器。

本文提供的显微镜系统可被配置用于提供对活体样品的一个或多个部分的实时同时成像和刺激。活体样品的每个部分可以包含一个或多个感兴趣的物体，诸如细胞或细胞群。活体样品可以经受各种刺激，同时对活体样品的一个或多个感兴趣的物体(例如，细胞)进行成像和刺激。活体样品可以在显微镜系统进行同时成像和刺激之前或期间经受药物的作用。在一些情况下，活体样品可以是生物体中的器官和/或组织。生物体可以经受各种刺激，同时对生物体的一个或多个感兴趣的物体(例如，细胞)进行成像和刺激。在一些情况下，可以选择刺激以引起生物体的压力、镇定、激动和/或另一预定的生物反应。

在一些情况下，本文所述的显微镜系统可以允许观察样品中第一组细胞与第二组细胞之间的相互作用。第一组细胞和第二组细胞中的至少一个可以是神经元群体。在一个示例中，用户可以通过使用显微镜系统的成像功能将成像光引导到样品来检测样品中的第一组细胞和第二组细胞。继而用户可以使用显微镜系统的刺激功能将刺激光提供给第一组细胞和第二组细胞中的至少一个。刺激光和成像光可以同时提供给样品，使得用户可以在第一组细胞和第二组细胞中的至少一个受到刺激时继续观察第一组细胞和第二组细胞。当第一组细胞和第二组细胞中的至少一个受到刺激时，用户可以观察在第一组细胞和第二组细胞之间发生的活动模式。

成像光源可以包括一个或多个LED或其他类型的发光元件。成像光源可以是发光二极管(LED)或有机发光二极管(OLED)。可以通过包括一个或多个光学元件的光学布置将来自成像光源104的光引导到样品106。成像光源可以提供基本上单色的光。或者，成像光源可以提供多个波长的成像光。在一个示例中，成像光源可以包括以两种或更多种不同颜色(例如，波长或波长范围)发射光的两个或更多个LED(或其他发光元件)。成像光源可以提供用于单色或多色成像的光，该用于单色或多色成像的光由照射光学路径引导到所公开的光遗传学显微镜或光学探针的视场内的全部或部分样品或组织。在一些实施方式中，成像光源的一个或多个发光元件可以包括光学地和/或机械地耦合到一个或多个外部光源的光纤。

成像光可以是激发光源，使得当来自成像光的光入射在样品上时，样品发射来自样品中包含的一个或多个荧光团的荧光。荧光团可以自然存在于样品中，或者它们可以是添加到样品的。在一些实施方式中，可以检测任何类型的发光用于样品的成像，包括但不限于光致发光(例如荧光、磷光)、化学发光、生物发光或电致发光。由于反射、发光、散射或其他光相互作用可以检测到多种颜色。在一些情况下，来自成像光源的光可以入射到样品上，并且至少一部分光可以由样品反射。可以检测反射光以生成样品的图像。

在一些情况下，成像光能够以约至多1000μW/mm²、900μW/mm²、800μW/mm²、700μW/mm²、600μW/mm²、500μW/mm²、550μW/mm²、500μW/mm²、450μW/mm²、400μW/mm²、350μW/mm²、300μW/mm²、250μW/mm²、200μW/mm²、150μW/mm²、100μW/mm²、75μW/mm²、50μW/mm²、25μW/mm²、15μW/mm²、10μW/mm²、5μW/mm²、1

μW/mm²、0.5μW/mm²或0.1μW/mm²的功率密度向样品提供成像光。在一些情况下，功率密度可以大于1000μW/mm²。由成像光提供的功率密度可以落在所列出的任何值之间。或者，成像光的较高水平可以指成像光入射在将成像光引导到样品的光学路径中的光学元件的表面上的功率密度。成像光的最高水平还可以指成像光源消耗的功率。

显微镜设备可以附加包括刺激光源。刺激光源可以是单个光源或多个(例如两个或更多个)光源。刺激光源可以包括mXn光源矩阵中布置成行和/或列的多个光源，其中m可以是1到1000的整数，并且n可以是1到1000的整数。刺激光源中的多个光源可以布置成一列或多列。刺激光源中的多个光源可以排列成一行或多行。刺激光源中的多个光源可以布置成不规则的图案。刺激光源中的多个光源可以布置成阵列。光源可以是发光二极管(LED)。光源可以是有机发光二极管(OLED)。光源可以是微型LED。光源可以是高功率LED。光源可以是激光二极管。光源可以是垂直腔面发射激光器(VCSEL)。光源可以是任何其他发光元件。在一些情况下，刺激光源可以包括以两种不同颜色(例如，波长或波长范围)发射光的两个或更多个发光元件。在一些情况下，高功率LED能够以约至少0.1W、0.25W、0.5W、0.75W、1W、2W、3W、4W、5W、10W、15W、20W或25W的功率发射光。高功率LED能够以比成像光源发射的光更大的功率发射光。

该刺激光源可以生成刺激光108。可以通过光学布置将刺激光引导到样品106。将刺激光引导到样品的光学布置可以包括与将成像光引导到样品的光学布置相同的光学元件中的至少一些。将成像光引导到样品的光学布置的一个或多个光学元件可以与光学设备共享以便将刺激光引导到样品。刺激光和成像光可以同时透射穿过共享的光学元件。在一些情况下，一个或多个光学元件可以是滤光片元件。滤光片可以是被配置用于透射预定波长范围的光的光谱滤光片。可以为成像光和刺激光提供相同的滤光片和/或不同的滤光片。不同的滤光片可以被配置用于透射不同的离散波长和/或波长范围。不同的滤光片可以被配置用于透射相同的离散波长和/或波长范围。

在一些情况下，刺激光可以相对于成像光以更高的功率密度提供给样品。低水平功率密度的成像光可以降低成像光不经意地刺激样品的一部分的可能性。刺激光的功率密度可以约为至少1.5X、2X、3X、4X、5X、6X、7X、8X、9X、10X、20X、30X、40X、50X、60X、70X、80X、90X或100X的成像光的功率密度。

可以引导来自刺激导光布置的刺激光和来自成像导光布置的成像光通过二向色镜136。在二向色镜处与成像光一起被引导之前刺激光可以透射穿过聚光透镜110。聚光透镜可以靠近刺激光源放置。聚光透镜几乎可以触及刺激光源。聚光透镜可以接触刺激光源。聚光透镜与刺激光源之间的距离可以约为至多0.001mm、0.005mm、0.01mm、0.05mm、0.1mm、0.5mm、1mm、5mm、10mm、20mm、30mm、40mm或50mm。聚光透镜可将来自刺激光源的光聚集成具有平坦强度分布(例如，空间均匀强度)的光束。聚光透镜可以校准刺激光。聚光透镜可将来自刺激光源的光聚集成在光束区域内强度变化很小或没有变化的光束。在一些情况下，透射穿过聚光器后的刺激光的光束区域内的强度变化可以约为至多50％。在一些情况下，透射穿过聚光器后的刺激光的光束区域内的强度变化可以约为至多25％。在一些情况下，透射穿过聚光器后的刺激光的光束区域内的强度变化可以约为至多10％。在一些情况下，透射穿过聚光器后的刺激光的光束区域内的强度变化可以约为至多5％。在一些情况下，透射穿过聚光器后的刺激光的光束区域内的强度变化可以约为至多1％。提供均匀的刺激光束对于生成对样品的均匀刺激可能是重要的。

在透射穿过二向色镜136之后，刺激光和成像光可以透射穿过第二聚光透镜112和激发滤光片114。第二聚光透镜可以增大来自刺激光源和/或成像光源的光到样品的衰减。第二聚光透镜可以收集来自不同角度的光并将该光重新引导至校准光束中以递送到样品。在没有聚光透镜的情况，以这些不同角度中的一些行进的光可能不会保持在光学路径中以递送到样品。在没有聚光透镜的情况下，可能需要增加成像光源的辐照度以向样品提供足够的光用于成像。增加成像光的辐照度可能增加用成像光不期望地刺激样品的可能性。

第二二色元件134可以将刺激光和/或成像光引导到样品。

可以引导来自样品的光，例如来自样品的荧光发射和/或反射光穿过光学路径到达图像传感器126，以生成样品图像的数字表示。当来自样品的光在两个或更多个不同的波长范围(例如，颜色)内发射和/或反射时，可以在样品和图像传感器之间的光学路径中提供色差校正元件128。色差校正元件可以调节一个或多个不同波长范围内的光的焦距，使得焦点基本相同。色差校正元件可以调节一个或多个不同波长范围内的焦距，使得不同波长范围中的每一个中的光聚焦到图像传感器中的光检测器上。

从样品到图像传感器的光学路径还可以包括发射滤光片130和/或镜筒透镜132。发射滤光片可以防止一个或多个波长范围内的光透射到图像传感器。发射滤光片可以选择一个或多个波长范围内的光以透射到图像传感器。镜筒透镜可以将来自样品的光聚焦到图像传感器上。镜筒透镜可以校正球面像差和色差。

可以对显微镜系统的大小和形状设定，使得活的生物体可以在显微镜系统正在对生物体的一个或多个组织或器官的至少一部分进行成像和刺激时佩戴显微镜系统。可以对显微镜系统的大小和形状设定，使得当显微镜系统由生物体佩戴或附着于生物体时，活的生物体的典型运动和/或活动不受显微镜系统的阻碍和/或改变。例如，当显微镜系统正在对活的生物体的组织进行成像和刺激时，活的生物体可以自由移动。当显微镜系统正在对诸如脑组织等生物体的组织进行成像和/或刺激时，活的生物体可以四处走动。

在一些情况下，所公开的显微镜和光学系统(例如，光学探针)可以是相对较小的。显微镜或系统可以具有约小于5英寸、4英寸、3英寸、2英寸、1英寸或0.5英寸的最大尺寸。显微镜或系统可以具有约小于12.7cm、10.2cm、7.6cm、5.1cm、2.5cm或1.3cm的最大尺寸。显微镜或系统的最大尺寸可以是大于显微镜的其他尺寸的显微镜或系统的任何尺寸(例如，长度、宽度、高度、直径)。显微镜或系统可以具有约小于或等于10立方英寸、7立方英寸、6立方英寸、5立方英寸、4立方英寸、3立方英寸、2.5立方英寸、2立方英寸、

1.5立方英寸、1立方英寸、0.7立方英寸、0.5立方英寸、0.3立方英寸，0.1立方英寸、0.05立方英寸、0.01立方英寸、0.005立方英寸或0.001立方英寸的体积。显微镜或系统可具有约小于或等于170cm³、115cm³、100cm³、82cm³、66cm³、50cm³、40cm³、33cm³、25cm³、16cm³、11cm³、8cm³、5cm³、1.6cm³、0.8cm³、0.2cm³或0.02cm³的体积。显微镜或系统可以具有约小于或等于5平方英寸、4平方英寸、3平方英寸、2平方英寸、1.5平方英寸、1.2平方英寸、1平方英寸、0.9平方英寸、0.8平方英寸、0.7平方英寸、0.6平方英寸、0.5平方英寸、0.3平方英寸、0.1平方英寸、0.05平方英寸、0.01平方英寸、0.005平方英寸或0.001平方英寸的横向截面(例如，占位面积)。显微镜或系统可具有约小于或等于10克、7克、5克、4克、3.5克、3克、2.5克、2克、1.5克、1克、0.5克或0.1的质量。小尺寸可能对于受试者可能较小的应用是有用的，以减少显微镜对受试者活动的干扰。当受试者较小和/或可以安装显微镜或系统的空间或区域有限时，小的横向截面是有用的。小的横向截面可以允许将许多显微镜或光学探针安装在有限的区域内。如本文所述，小型显微镜或光学系统可以能够同时进行刺激和成像。如本文别处所述，小型显微镜或光学系统可以有利地被配置用于在有限尺寸内提供同时刺激和成像。

如图1中所示，显微镜系统100可包括尺寸120和尺寸122内的多个部件(例如，光学元件)。未示出的是垂直于尺寸120和122延伸的进一步尺寸。虽然不一定限于此，但是这些尺寸中的每一个可以小于一英寸。在一些情况下，尺寸120可以约为至多0.001英寸、0.01英寸、0.05英寸、0.1英寸、0.2英寸、0.3英寸、0.4英寸、0.5英寸、0.6英寸、0.7英寸、0.8英寸、0.9英寸、1英寸或5英寸。在一些情况下，尺寸122可以约为至多0.001英寸、0.01英寸、0.05英寸、0.1英寸、0.2英寸、0.3英寸、0.4英寸、0.5英寸、0.6英寸、0.7英寸、0.8英寸、0.9英寸、1英寸或5英寸。在一些情况下，垂直于尺寸120和122延伸的尺寸可以约为至多0.001英寸、0.01英寸、0.05英寸、0.1英寸、0.2英寸、0.3英寸、0.4英寸、0.5英寸、0.6英寸、0.7英寸、0.8英寸、0.9英寸、1英寸或5英寸。

显微镜可以被配置用于放大样品的一个或多个部分，使得用户可以研究在用户眼睛可发觉的大小范围之外的该样品的一个或多个部分。显微镜系统可以被配置用于放大包含用户可以使用刺激光来刺激的一个或多个感兴趣的物体的样品的一部分。在一些情况下，显微镜可以是相对较小的显微镜。显微镜可以安装到活生物体或非活生物体上。在一些情况下，显微镜可以安装到生物体的外部(例如，在生物体的皮肤上)。显微镜可以用于对生物体上或内的样品进行成像。例如，显微镜可以安装到受试者的头部并用于对生物体的脑组织进行成像。显微镜可以安装到受试者并用于对受试者身上或体内的任何其他组织进行成像。样品的示例可以包括任何生物样品或组织，例如神经组织(例如，脑组织)、肌肉组织、结缔组织、癌组织、器官组织、心脏组织、血管组织或上皮组织。受试者可以是人类受试者或动物受试者。在一些实施方案中，动物受试者可以包括啮齿类动物(例如小鼠、大鼠、兔、豚鼠、沙鼠、仓鼠)、类人猿(例如，猴子、黑猩猩、红毛猩猩、大猩猩和人类)、马科动物(例如马),牛科动物(例如，奶牛)、犬科动物(例如，家犬)、猫科动物(例如，家猫)、禽类、昆虫或任何其他类型的动物。在一些情况下，受试者的重量可以约小于50kg、40kg、30kg、20kg、15kg、10kg、5kg、3kg、2kg、1kg、750克、500克、400克、300克、200克、100克、75克、50克、40克、30克、25克、20克、15克、10克、5克、3克或1克。在一些实施方式中，显微镜可以安装在活的生物体或非活生物上或者插入活的生物体或非活生物体内，并用于临床前研究或临床研究。在一些实施方式中，显微镜可以用于临床诊断，例如确定临床诊断测试结果，或者用于治疗应用，例如用于神经元组织的光刺激。在一些实施方式中，所公开的显微镜或相关光学系统可以用于中枢神经系统的神经元组织的成像和/或光刺激。在一些实施方式中，所公开的显微镜或相关光学系统可以用于外周神经系统的神经元组织的成像和/或光刺激。在一些实施方式中，所公开的显微镜或相关光学系统可以用于中枢神经系统和外周神经系统的神经元组织的成像和/或光刺激。

显微镜(或其光学组件)可以光学地和/或机械地耦合到插入生物体内的探针。探针可以接触或可以不接触生物体的组织。探针可以部分植入生物体的组织中。探针可以同时将成像光和刺激光递送到样品。探针可以将成像光和刺激光直接递送到样品。探针可以将成像光和刺激光递送到样品而不透射成像光和/或刺激光穿过诸如皮肤或骨头等生物屏障。探针可以包括物镜。或者，探针可以不包含物镜。

显微镜可以体内或体外使用。在一些情况下，对于有意识的受试者，显微镜可以体内使用。对于未经麻醉的受试者，显微镜可以体内使用。对于可以自由移动或可动的受试者，显微镜可以体内使用。当显微镜连接到受试者(例如，安装在受试者身上、插入受试者体内)时，受试者可以能够围绕环境自由行走。在显微镜正在对受试者的样品进行成像时，受试者可以能够围绕环境自由行走。诸如具有如本文别处描述的大小的那些显微镜等小型显微镜可能有利的是对受试者的活动提供的干扰较少，或者可以用于较小的受试者，诸如具有本文描述的特性的那些受试者。

将成像光和/或刺激光引导到样品的光学元件(例如，聚光透镜、二向色镜和滤光片元件)的至少一部分可以在将来自样品的光发射引导到图像传感器的光学路径之外。在样品与图像传感器之间的光学路径外放置将成像光和/或刺激光引导到样品的光学元件的至少一部分可以提高从样品到图像传感器的光传输的效率。提供从样品到图像传感器的高效率光传输可以允许将相对低功率密度水平的成像光递送到样品。

本文描述的显微镜系统可以同时对样品的至少一部分进行成像和刺激，而在成像光和刺激光之间没有串扰。当成像光意外刺激样品的至少一部分使得刺激不完全仅由刺激光控制时可能发生串扰。类似地，当刺激光反射离开样品和/或引起样品出现荧光并且引起杂散光被递送到图像传感器时可能发生串扰。

通过优化样品与图像传感器之间的光收集路径的效率可以使生成样品图像所需的每单位面积递送到样品的光子的数量最小化或减少。降低引导到样品的成像光的功率密度可以降低用成像光意外刺激目标物体的可能性。相对于刺激光的低水平的成像光可以使成像光与刺激光之间的串扰最小化。当成像光无意中刺激样品的一个或多个部分时可能发生串扰。如果成像光的功率密度超过预定阈值，那么由刺激光刺激的样品部分(例如，视蛋白)可以类似地由成像光刺激。该预定阈值保持可以由多种因素决定，包括视蛋白的类型，视蛋白在细胞膜中的浓度以及成像光的波长。用户可能想要减少在有意地向样品的一个或多个部分提供刺激光的同时由成像光无意中刺激样品的一个或多个部分的可能性。本文描述的系统和方法提供了在样品和图像传感器之间具有少量光学元件的有效光学路径，该有效光学路径允许使用低水平(例如，功率密度)的成像光。本文描述的系统中使用的成像光的水平可以低于刺激样品的一个或多个部分的水平。

在一些情况下，能够以基本上相同的功率提供刺激光源和成像光。通过刺激光源和成像光源的光谱分离可以减少刺激光源与基本上处于相同功率的成像光源之间的串扰。备选地或附加地，可以用滤光片阵列减少成像光源与刺激光源之间的串扰。备选地或附加地，可以用被配置用于将光从光源物理分离的挡板来减少成像光源与刺激光源之间的串扰。

可以通过图像传感器的一个或多个光检测器(例如，像素)收集来自样品的发射，以生成样品图像的电子表示。在一些情况下，发射可以是由成像光刺激的荧光发射。刺激光可以反射离开样品和/或引起可以在成像期间导致成像光与刺激光之间的串扰的荧光发射。通过在成像光与刺激光之间提供光谱分离，可以减少或消除来自刺激光的反射和/或荧光的串扰。在一些情况下，可以通过提供第一波长的成像光和显著高于或低于第一波长的第二波长的刺激光而在光谱上分离入射在样品上的成像光和刺激光。在一些情况下，成像光的离散波长或波长范围以及刺激光的离散波长或波长范围可以在光谱上分离约至少5nm、10nm、20nm、30nm、40nm、50nm、60nm、70nm、80nm、90nm、100nm、200nm、300nm、400nm、500nm、600nm、700nm、800nm、900nm、1000nm。在一些情况下，成像光与刺激光之间的光谱分离可以小于5nm。成像光与刺激光之间的光谱分离可以落在本文列出的任何值之间。

响应于成像光由样品发射的发射(例如，荧光)的波长可以是入射成像光的已知波长的函数，使得可以使用滤光片在光由图像传感器检测之前分离不在预期波长范围内的光。在一些情况下，超出预期范围的光可以是由刺激光引起的来自样品的不需要的发射。不同的滤光片可以用于不同的样品或不同类型的成像研究，使得成像光和/或刺激光的离散波长或波长范围可以是变化的。在一些情况下，成像光(例如，荧光激发光)能够以约100nm、200nm、300nm、400nm、500nm、600nm、700nm、800nm、900nm、1000nm、1100nm、1200nm、1300nm、1400nm、1500nm、1600nm、1700nm、1800nm、1900nm或2000nm的波长提供。成像光能够以大于所列的值、小于所列的值，或者以在所列的任何值之间的值的波长提供。在一些情况下，刺激光(例如，光遗传学刺激光)能够以约100nm、200nm、300nm、400nm、500nm、600nm、700nm、800nm、900nm、1000nm、1100nm、1200nm、1300nm、1400nm、1500nm、1600nm、1700nm、1800nm、1900nm或2000nm的波长提供。刺激光能够以大于所列的值，小于所列的值、或者以在所列的任何值之间的值的波长提供。成像光可以在一定范围的波长上提供。刺激光可以在一定范围的波长上提供。与刺激光的波长范围相比，成像光的波长范围可以更大。或者，与刺激光的波长范围相比，成像光的波长范围可以更小。在一些情况下，成像光的波长范围和刺激光的波长范围可以具有至少一部分的重叠范围。图6示出了在光谱上分离的成像光和刺激光的图形示例。曲线图600和曲线图606各自示出了作为波长的函数的强度。在曲线图600中，成像光601发射比刺激光602更短的波长范围的光。例如，成像光可以在第一波长范围603内发射。刺激光可以在第二波长范围604内发射。可以在第一波长范围603与第二波长范围604之间提供间隙605。在曲线图606中，成像光607发射波长比刺激光608更长的光。例如，成像光可以在第一波长范围610内发射。刺激光可以在第二波长范围611内发射。可以在第一波长范围610与第二波长范围611之间提供间隙609。

在一些情况下，成像所需的成像光的功率密度可以通过在成像(例如，激发)光的光源与样品之间提供紧密靠近而进一步减小。对于落射荧光成像，成像光于样品之间的相互作用导致从样品生成荧光发射。成像光可针对目标物体并且可具有被配置成被荧光团、荧光标志物或荧光探针吸收的特定波长。荧光团继而发射不同(例如，较长)波长的光。不同的荧光团可以发射不同波长(即颜色)的光。吸收光的量可以与递送到目标物体的成像光的功率密度相关。以这种方式，生成的荧光的量与成像光的功率密度关联。虽然各种光递送机构可以帮助减少光在其行进穿过介质时的衰减，但是随着行进穿过介质的距离的增加，光的衰减将会增加。而且，当使用空气和其他介质时，介质的组成和其他分散属性可以在光的递送和/或衰减中起重要作用。在一些情况下，可以将显微镜系统设计成允许将成像光十分靠近样品布置，从而促进使用相对低功率的成像光源。在一些情况下，成像光的光源与目标对象之间的直线距离(例如，组织到成像光源路径长度)可以约为至多5cm、2cm、1cm、5mm、1mm、0.1mm、0.01mm、0.001mm、0.0005mm或0.0001mm。

类似地，图像分辨率可以取决于从样品传输到图像传感器的光的量。在一些情况下，样品与图像传感器之间的直线距离(例如组织到图像传感器路径长度)可以约为至多5cm、2cm、1cm、5mm、1mm、0.1mm、0.01mm、0.001mm、0.0005mm或0.0001mm。聚焦从样品发射的光的物镜与图像传感器之间的直线距离可以约为至多5cm、2cm、1cm、5mm、1mm、0.1mm、0.01mm、0.001mm、0.0005mm或0.0001mm。物镜焦平面与图像传感器之间的直线距离可以约为至多5cm、2cm、1cm、5mm、1mm、0.1mm、0.01mm、0.001mm、0.0005mm或0.0001mm。

可以使用与本文讨论的一个或多个实施方式一致的各种荧光源。提及特定荧光源不一定排除使用其他荧光源(例如，诸如GFP、GCaMP、mCherry及其变体等遗传编码的荧光蛋白)。

本公开内容的实施方式涉及一种针对相对较大的视场捕获图像数据的显微镜设备和系统，该图像数据提供样品的高分辨率。视场可以约为至少0.1mm²、0.2mm²、0.3mm²、0.4mm²、0.5mm²、1mm²或5mm²。整个视场可以一次成像。刺激光可以指向视场的任何部分或整个视场。整个视场可以一次成像，而不需要将视场分割成子集并单独扫描每个子集以对整个视场进行成像。可以同时以高分辨率捕获整个视场。整个视场可以同时以约至少0.1μm、0.5μm、1μm、2μm、3μm、4μm、5μm、10μm、20μm、30μm、40μm或50μm的分辨率捕获。分辨率可以足以识别由显微镜系统捕获的图像中的一个或多个细胞。分辨率可以足以识别由显微镜系统捕获的图像中的一个或多个细胞结构。分辨率可以足以识别由显微镜系统捕获的图像中的一个或多个树突。分辨率可以足以识别由显微镜系统捕获的图像中的一个或多个神经细胞轴突。相对较大的视场可以允许用户刺激同一视场中的两个或更多个细胞或细胞群体以观察受到刺激的细胞或细胞群体的相互作用。

整个视场可以通过处理来自导向图像传感器的样品的光来成像。图像传感器可以包括被提供用于对视场进行成像的传感器元件或像素的阵列。传感器元件针对视场的不同部分检测来自样品的光发射。传感器元件可以是单色光检测器。传感器元件可以检测在一个或多个预定波长范围内的光。传感器元件可以被配置成具有足够的灵敏度并且靠近样品以促进至少一部分样品的图像捕获和生成。

在一些情况下，本文所述的显微镜系统的操作可以在显微镜系统内生成热量。来自一个或多个电子电路元件和/或一个或多个光源的内部电阻可以生成热量，导致一个或多个光学元件、显微镜壳体或与显微镜系统热连通的其他部件的表面温度升高。在一些情况下，显微镜系统可以在活体组织上或附近。这种生成的热量可以限制显微镜可以使用的持续时间。生成的热量可以传递到活体组织，可以导致活体组织加热。可以将活体组织加热到高于组织死亡、灼伤、分解、氧化或以其他方式降解的温度。在一些情况下，生成的热量可以影响细胞活性并导致混淆光遗传学实验的结果的观察结果。一些细胞在升高的温度下可能更活跃，使得升高的温度导致由生成的热而不是刺激光引起的观察到的细胞活性。在一些情况下，可以在显微镜上放置一个或多个冷却片、散热片或热导管以通过辐射、传导和/或对流来去除所生成的热量。冷却片、热导管或散热片可以防止和/或减少从显微镜系统到活体组织的热量传递。

在一些情况下，对于一个或多个大小较小的样品，显微镜能够以对视场的高分辨率成像的相对较低的光学放大倍数进行操作。放大倍数可以约为至多1000X、500X、100X或50X、10X、8X、5X、4X、3X、2X、1.5X或1X。如本文他处所述，低水平的放大倍数可以使显微镜获得视场的高分辨率。使用较低的放大倍数的显微镜系统可以获得高分辨率。通过仔细设计和应用与本文讨论的各个方面一致的显微镜设备和系统，可以减少特定水平的成像所需的光学放大倍数的最大放大能力。

本文描述的显微镜系统允许使用与本文讨论的方面一致的显微镜设备和/或系统对样品的一个或多个部分的实时同时成像和刺激。显微镜系统可以促进对目标物体的体内或体外实时同时成像和刺激。例如，活体受试者的体内成像和刺激对于将外部刺激和其他因素与捕获的图像关联可能特别有用。这一关联可以通过将捕获的图像的性质与外部刺激相关联来用作例如诊断/研究工具。在高帧率下的实时成像可以进一步提供这样的相关性作为时间的函数。

显微镜系统可以允许用户将成像光引导到样品以对样品进行成像并且检测用户想要刺激的样品的一个或多个部分。继而用户可以向用成像光检测到的样品的一个或多个部分提供刺激光。用户可以在刺激光实时传送到样品的一个或多个部分的同时继续观察样品。在一个示例中，用户可以用显微镜系统观察样品中的神经回路。用户可以将刺激光引导到神经回路的一部分并实时观察神经回路的一个或多个其他部分的响应。在一些情况下，使用者可以提供刺激光以抑制样品的一个或多个部分中的活性。用户可以使用显微镜系统的成像光观察活动。当用户观察到活动时，用户可以向至少一部分样品提供刺激光以抑制活动。在一个示例中，用户可以观察指示发作前活动/发作早期活动的两个或更多个神经元群体之间的活动。用户可以向一个或多个神经元群体提供刺激光以预防或减轻发作。

显微镜设备和/或系统可以具有模块化设计，该模块化设计促进了拆卸和重新附接显微镜设备的各个部件。拆卸和重新附接可以用于将模块化组件用新的和/或不同的模块化组件替换。例如，光源可以用具有相同或不同光学和/或电气性质的新光源替换。刺激光源和成像光源中的任一个或两者可以是可替换的。也可以移除和替换光学传感器阵列和/或光学引导元件(例如，反射镜、滤光片和透镜)阵列。如果期望，也可以移除和替换光学传感器。

显微镜系统可以包括用于接到外部光数据处理(记录和/或配置)系统的同步电路。同步电路包括被配置和布置用于传送帧基准/活动信号的逻辑电路(例如，可编程或半可编程芯片(微控制器或ASIC))。同步电路可以包括现场可编程门阵列(FPGA，Field-Programmable Gate Array)。同步电路可以包括基于ARM(Advanced RISC Machines)的微控制器。在典型的应用中，帧活动信号将会为显微镜系统与外部系统之间传送的数据或者与其一起例如提供如IEEE通信标准中所定义的同步信息。这样的光学数据记录/配置系统可以用于安装软件，为实验和程序配置设置参数，在这样的实验和程序期间提供视觉反馈，以及记录光学数据以供操纵和进一步研究。外部光学数据处理(记录和/或配置)系统可以被配置用于控制如本文他处描述的刺激光源。

在又进一步的实施方式中，即时公开内容针对使用本文描述的图像设备的方法。某些公开的设备和系统可以包括基板，该基板充当提供支撑/稳定性并且还允许显微镜或光学探针(重新)对准的基础结构。这些方法包括将显微镜或光学探针附接和重新附接到基板以便允许显微镜或光学探针精确对准的步骤。例如，在慢性实验期间，这样的精度应该足以用于对共同成像位置的重复成像。可以将基板附接到活的生物体。基板可以附接到活的生物体的头部。基板可以附接到活的生物体的头骨。在一些情况下，当从基板上移除显微镜时，基板可以保持附接到活的生物体。可以使用头盔、皮带和/或安全带将基板附接到生物体。

在一些情况下，显微镜可被配置用于同时刺激样品的一部分和对样品的一部分进行成像(例如观察)。样品的部分可以包括感兴趣的物体。感兴趣的物体可以是可以由光能刺激和/或去活化的物体。感兴趣的物体可以是一个或多个细胞。感兴趣的物体可以是一个或多个神经细胞(例如，神经元)。通过将光激活的通道(例如，视蛋白)遗传加载到所选择的一个或多个细胞的细胞膜中，可以刺激或去活化所选择的一个或多个细胞。在一些情况下，光激活的通道可以由指定波长和/或强度的光激活。可以调制刺激光源的波长以激活不同的光激活的通道。

刺激光源可以是单个光源。或者，刺激光源200可以包括如图2A中所示的光源阵列201。刺激光源200可以具有约至少1平方微米、5平方微米、10平方微米、50平方微米、100平方微米、0.001平方毫米、0.01平方毫米、0.1平方毫米、1平方毫米、5平方毫米、10平方毫米或50平方毫米的面积。刺激光源200可以包括1×n个光源201的阵列，其中n可以是从1到1000的整数。在一些情况下，刺激光源可以包括m×n个光源的矩阵，其中m可以是从1到1000的整数并且n可以是从1到1000的整数。在一些情况下，光源矩阵可以允许刺激单独的细胞，样品的一部分或者物体。光源矩阵可以允许刺激单独的神经元或单独的神经元群体。光源可以是发光二极管(LED，Light Emitting Diode)。光源可以是有机发光二极管(OLED,Organic Light-Emitting Diode)。光源可以是微型LED。光源可以是高功率LED。可以引导光源穿过空间光调制器。光源可以包括通过耦合光纤束而图案化的光。光源可以包括激光二极管的图案。在一些情况下，高功率LED能够以约至少0.1W、0.25W、0.5W、0.75W、1W、2W、3W、4W、5W、10W、15W、20W或25W的功率发射光。

刺激光源可以与控制器通信。刺激光源可以通过有线或无线连接与控制器通信。控制器可以在显微镜板上或者在显微镜板外。控制器可以包括被编程用于控制刺激光源的一个或多个处理器。矩阵或阵列中的一个或多个刺激光源可以由控制器打开以向目标物体上的指定位置提供刺激光，以便将刺激光递送到感兴趣的物体(例如，细胞)。图2A示出了具有多个打开的光源202和多个关闭的光源203的刺激光源200。可以在刺激光源中打开任何数量的光源。例如，可以在刺激光源200中打开零个、一个、两个、三个、四个、五个或更多个光源。可以在刺激光源中关闭任何数量的光源。例如，可以在刺激光源200中关闭零个、一个、两个、三个、四个、五个或更多个光源。能够以图案打开刺激光源以便将刺激光递送到目标物体，例如一个或多个感兴趣的物体，的指定区域。一个或多个处理器可以被编程用于确定应当以其打开和关闭一个或多个光源的图案，以便将刺激光递送到目标物体的指定区域。当确定图案时，一个或多个处理器可以从显微镜接收目标对象的图像作为输入。在一个示例中，样品可以包含多个神经细胞。用户可以通过仅将刺激光递送到样品的一部分来刺激样品中的单个神经细胞，而不刺激相邻的神经细胞。用户可以观察其他未受到刺激的神经细胞对一个受到刺激的神经细胞的反应。

图2B示出了包括可以由显微镜系统成像的样品的视场204。视场204可以包括一个或多个感兴趣的物体205。感兴趣的物体205可以是响应于刺激光源的物体。感兴趣的物体可以是细胞。感兴趣的物体可以是神经细胞。刺激光206可以入射到感兴趣的物体205上。刺激光可以同时入射到两个或更多个感兴趣的物体205上。刺激光可以入射到视场204的至少一部分上。刺激光可以入射到至少视场204中包含的样品的约1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％或70％上或者样品的一部分上。可以在将刺激光提供给一个或多个感兴趣的物体205的同时将成像光提供给视场204，使得可以对一个或多个感兴趣的物体205对刺激光的反应成像。虽然刺激光206被示出为小于图2B中正受到刺激的物体205(例如，细胞)，应当理解刺激光可以比感兴趣的物体更小或更大。

备选地或附加地，刺激光207可以入射到视场外的样品的部分上。例如，刺激光可以相比成像光入射在样品的不同部分上。例如，可以在刺激光入射到未展示的样品的不同部分上时(例如，在显示器上)展示视场(例如，成像视场)以供观看者观察。在一些情况下，刺激光可以刺激大脑(例如，小鼠大脑)的右侧，同时包含感兴趣的物体的视场204示出大脑的左侧，反之亦然。在一些情况下，刺激光可以与成像光完全或部分重叠(例如，在样品处)。在一些情况下，刺激光可以不与成像光重叠。例如，刺激光可以刺激大脑(例如，小鼠大脑)的右侧，同时成像光入射在大脑的左侧，反之亦然。在一些情况下，成像光和刺激光可以共享相同光学路径的至少一部分。在一些情况下，刺激光和成像光的光学路径可以是独立的。在一些情况下，刺激光和成像光的光学路径可以是不同的。如前所述，可以在时间上调制刺激光和成像光。例如，刺激光可以刺激样品的一部分，同时样品的一部分(例如，不同部分)正由成像光照射。

刺激光源能够以被配置用于向由显微镜系统生成的图像中示出的一个或多个感兴趣的物体递送刺激光的图案打开。图案可以是预定的图案。在一些情况下，图案可以由用户选择并且被提供为被配置用于控制刺激光源的计算机系统的输入。计算机系统可以生成图案。计算机系统或用户可以分析视场的图像并且响应于分析生成图案或对现有图案的修改。图案可能会随着时间或响应成像的样品而改变。反馈可以经由对早期刺激图案的响应的图像来提供，该图像可以用于制定随后的刺激图案。本文将详细描述计算机系统。图案可以是恒定的图案。或者，图案可以随时间而改变。图案能够以预定的频率改变。当视场改变到不同样品或当前样品的不同区域时，图案可以改变。

刺激光能够以预定图案提供给包含一个或多个感兴趣的物体的样品的至少一部分。图案可以包括以时间顺序点亮矩阵或阵列中的一个或多个光源。图案可以包括以特定频率、强度、功率、持续时间和/或波长分布(例如，离散波长或波长范围)点亮矩阵或阵列中的一个或多个光源。

刺激光源和/或照射光源可以由计算机系统控制。模拟光源和/或照射光源可以通过无线或有线连接与计算机系统通信。计算机系统可以包括被配置用于执行程序的一个或多个处理器，该程序通过刺激光源生成对目标物体的图案化刺激。程序可以使用算法生成图案化刺激。算法可以在构建刺激图案时将系统的一个或多个光学性质作为输入。光学性质输入可以包括显微镜中的光学部件、穿过光学部件的一个或多个光源的焦距，和/或一个或多个光学部件的光透射(例如，透射、反射和/或吸收作为波长、频率和/或强度的函数)。算法可以使用通过检测成像光生成的图像作为输入来识别视场中的目标物体的一个或多个位置以供刺激光的刺激。算法可以执行图像分析以检测一个或多个感兴趣的物体用于递送刺激光。算法可以确定应当照射刺激光源的阵列和/或矩阵中的哪些刺激光源，以便将刺激光引导到图像中检测到的一个或多个感兴趣的物体。算法可以确定刺激图像中检测到的一个或多个感兴趣的物体所需的刺激光的功率密度。

备选地或附加于算法之外，用户可以直接指令计算机系统控制刺激光源。用户可以是显微镜系统的操作员。用户可以在显示设备上观看由显微镜系统生成的视场的图像。图3示出了可以在显示设备302上提供给用户的视场301的示意性示例。视场301可以包括一个或多个感兴趣的物体303。用户可以基于显示设备302上示出的感兴趣的物体的位置来选择将由刺激光源遵循的特定刺激图案。在一些情况下，用户可以基于一个或多个感兴趣的物体对刺激光的响应来更改刺激光源图案。备选地或附加地，计算机系统的一个或多个处理器可以执行视场的图像分析以自动检测一个或多个感兴趣的物体303并且建议或启动将由刺激光源遵循的图案以将刺激光递送到一个或多个感兴趣的物体303。

用户可以指定新的刺激图案，或者用户可以选择存储在计算机系统上的存储器存储设备中的先前使用的或通用的刺激图案。用户可以指定刺激图案随时间改变。用户可以指定图案及时改变的频率。用户可以指定刺激图案随着显微镜捕获的每个图像而改变。用户可以在对样品成像时改变刺激图案。在一些情况下，用户可以基于实时在样品的图像中检测到的一个或多个特点来改变刺激图案以针对样品中的特定物体或区域。例如，用户可以检测样品图像中的神经元群体并选择刺激光图案以向神经元群体提供刺激光。

图4示出了与计算机系统400通信的显微镜系统100。显微镜系统100可以通过有线或无线连接与计算机系统400通信。计算机系统可以包括一个或多个处理器401。一个或多个处理器可以被配置用于执行一个或多个程序来控制显微镜系统。处理器可以执行一个或多个程序来控制显微镜系统的刺激光源和/或成像光源。一个或多个程序的指令可以存储在一个或多个存储器存储设备402上。一个或多个存储设备可以与一个或多个处理器通信。至少一部分的存储器存储设备可以是与计算机系统通信的服务器的一部分。

用户可以通过用户界面与计算机系统交互。用户界面可以在显示设备403上的显示器中提供。显示设备可以是与计算机系统400通信的监视器、屏幕和/或电子设备。显示设备403可以通过无线或有线连接与计算机系统400通信。用户界面可以提供在显示设备的屏幕上。屏幕可以是液晶显示器(LCD,Liquid Crystal Display)屏幕或触摸屏。显示设备可以包括计算机监视器。显示设备可以包括电子设备。显示设备可以是手持式电子设备，例如，智能手机或平板电脑。

显微镜系统可以被配置用于执行目标物体的实时同时成像和刺激。目标物体可以是活的生物体。目标物体在显微镜系统运行时可以是清醒的。显微镜可以安装到活生物体或非活生物体上。在一些情况下，显微镜可以安装到生物体的外部(例如，在生物体的皮肤上)。显微镜可以用于对生物体上或内的样品进行成像。例如，显微镜可以安装到受试者的头部并用于对生物体的脑组织进行成像。显微镜可以安装到受试者并用于对受试者身上或体内的任何其他组织进行成像。

本文详细描述的被配置用于同时提供成像光和刺激光的光遗传学显微镜可以用于各种应用。例如，光遗传学显微镜可用于绘制生物体大脑的区域。可以用光遗传学显微镜识别不同神经细胞之间的联系。生物体可以是活的生物体。在另一示例中，光遗传学显微镜可以用于执行心房颤动。光遗传学显微镜可用于刺激活的生物体的心脏组织。

在另一示例中，光遗传学显微镜可以用于刺激光敏蛋白。在由来自光遗传学显微镜的光刺激时，光敏蛋白可以打开或关闭离子通道，或者主动抽运离子。

包括可调节透镜的紧凑型光遗传学显微镜系统

图7图示了包括用于调节显微镜系统的有效焦距和景深或者用于校正色差的可调节透镜703的紧凑型光遗传学显微镜系统700的一个实施方式。成像光和刺激光可以由光源708和光源709提供，并且通过包括二向色镜707、透镜706、光学(激发)滤光片705、二向色镜704、可调节透镜703、可选校正光学元件702和/或梯度折射率(Gradient Index，GRIN)透镜701的光学路径引导到样品或受试者。由样品或受试者反射或散射的成像光由GRIN透镜701收集，并且通过光学路径透射到图像传感器712，该光学路径包括可选校正光学元件702、可调节透镜703、二向色反射器704、光学(发射)滤光片710和透镜711。类似地，由刺激光在样品或受试者中激发的荧光由GRIN透镜701收集，并通过公共光学路径透射到图像传感器712，该公共光学路径包括可选校正光学元件702、可调节透镜703、二向色反射器704、光学(发射)滤光片710和透镜711。与光学滤光片705和光学滤光片710的透射性质相组合，二向色镜707和二向色镜704的透射和反射性质确定了成像光和刺激光的光学带宽以及到达图像传感器712的反射的或散射的成像光和荧光的光学带宽。

在一些实施方式中，GRIN透镜701和可选校正光学元件702包括显微镜系统的“物”镜并且可操作地耦合到其他透镜元件。在一些实施方式中，GRIN透镜701和可选校正光学元件702是附接到或光学耦合到显微镜系统的其他元件的内窥镜探针的部件，其中内窥镜探针被设计成与样品或受试者接触或者插入(例如，部分植入)样品或受试者中。可选地，校正光学元件702可以与GRIN透镜701集成。在一些实施方式中，内窥镜探针可以进一步包括插管，例如玻璃插管，该插管植入样品或对象中，并且内窥镜探针插入该插管中。在一些实施方式中，内窥镜探针可以是照射光学路径、刺激光学路径，和成像光学路径或其任何组合的共享光学部件。在一些实施方式中，可以使用多于一个内窥镜探针，其中不同的内窥镜探针由照射光学路径、刺激光学路径、成像光学路径或其任何组合利用。在一些实施方式中，校正光学元件702补偿GRIN透镜701或包括GRIN透镜701的内窥镜探针的光学性质，以跨显微镜的视场提供具有改善的空间分辨率的环形物场。在使用可选校正光学元件702的那些实施方式中，尽管其他放置是可能的，但优选接触或非常靠近远离样品或对象的GRIN透镜701的端部放置。

在一些实施方式中，紧凑型光遗传学显微镜系统可以包括附加的孔径、透镜、光学滤光片、二向色镜、棱镜、反射镜、分束器、偏振器等，以进一步改善递送到样品或受试者的成像光束和刺激光束的光学性质(例如，波长、偏振或强度)或物理尺寸。类似地，紧凑型光遗传学显微镜系统可以包括附加的孔径、透镜、光学滤光片、二向色镜、棱镜、反射镜、分束器、偏振器等，以进一步改善递送到图像传感器的成像光束和荧光光束的光学性质或物理尺寸。

在图7中描绘的部件中的每一个都可以包含在如在他处例如关于图1基本上所描述的单个壳体内。在一些实施方式中，图7中描绘的部件能够以这样的方式被配置使得它们包含在两个或更多个单独的壳体中。或者，图7中描绘的一些部件可以包含在单个壳体或者两个或更多个壳体内，而其他元件位于单个壳体或者两个或更多个壳体之外。例如，GRIN透镜701和可选校正光学元件702可以位于单个壳体之外，而其他部件位于单个壳体之内。GRIN透镜701和/或可选光学校正元件702可以与或可以不与诸如可调节透镜703等其他光学元件直接接触。如图7中所图示，在一些实施方式中，将GRIN透镜701和/或可选校正光学元件702直接接触或非常靠近可调节透镜703放置，例如非常靠近最远离样品或受试者(或其组织)的GRIN透镜701(或可选校正光学元件702)的端部。在一些实施方式中，包括成像光递送光学路径和刺激光递送光学路径的光学部件可以与包括反射的或散射的成像光和荧光光收集光学路径的光学部件分离，并且可以包装在单独的壳体中(例如，作为光学照射、刺激和成像探针)。在一些实施方式中，包括成像光递送光学路径的光学部件和包括光收集光学路径的那些光学部件可以与刺激光递送路径分离开地包装(例如，作为光学成像探针的替代形式)。在一些实施方式中，光遗传学显微镜和光学探针壳体可以被配置成可移除地附接到公共基板以安装在受试者上，使得两个或更多个完整的显微镜、光学照射探针、光学刺激探针或光学成像探针，或者其任意组合可以在固定或可调节的相对位置处可移除地附接到公共基板，并且其中两个或更多个显微镜、光学照射探针、光学刺激探针或光学成像探针的光轴彼此基本上平行。在一些实施方式中，公共基板可以被配置成使得用于两个或更多个显微镜、光学照射探针、光学刺激探针或光学成像探针的光轴不彼此基本上平行。在一些实施方式中，可以将至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个或更多个显微镜或光学探针附接到公共基板。在一些实施方式中，公共基板的配置确定一个或多个显微镜、光学成像探针和光学刺激探针之间的横向距离。在许多实施方式中，基板被设计成以固定位置安装在受试者上，并且因此相对于受试者的组织向附接的光学组件(例如显微镜、光学照射探针、光学刺激探针或光学成像探针)提供可复制的对准。在单独的光学刺激探针和光学成像探针附接到公共基板的实施方式中，由光学刺激探针照射的样品或受试者的区域可以部分、完全或完全不与反射或散射的成像光和荧光从其收集并成像到光学成像探针或显微镜的图像传感器上的样品或受试者的区域重叠(例如，视场(FOV,Field of Vision))。

如贯穿本申请所公开的，成像光源(图7，708或709)可以包括一个或多个LED，或者其他类型的发光元件。成像光源可以提供基本上单色的光。或者，成像光源可以提供多个波长的成像光。在一个非限制性示例中，成像光源可以包括发射不同颜色(例如，不同波长范围)的光的两个或更多个LED或者其他发光元件。成像光源可以为单色或多色成像提供光。在一些实施方式中，成像光源可以包括被配置用于以用户定义的空间图案和/或用户定义的时间图案发射光的两个或更多个发光元件，例如，LED。在这些实施方式中，用户定义的空间图案可以在焦平面处具有至少0.1μm、至少0.5μm、至少1μm、至少5μm、或至少10μm、至少15μm、至少20μm的空间分辨率。在一些实施方式中，紧凑型光遗传学显微镜系统还包括处理器和存储器设备，其中处理器被配置用于执行存储在存储器设备中的一系列软件编码的指令。在一些实施方式中，软件编码的指令包括用于以下操作的指令：(i)以时间依赖性或空间依赖性方式调制成像光强度，(ii)以时间依赖性或空间依赖性方式调制刺激光强度(iii)以时间依赖性方式改变焦深，以及(iv)以指定时间在指定视场内捕获组织的一个或多个图像，或者其任何组合。在一些实施方式中，例如其中组织是脑组织，软件编码的指令可以包括用于以时间依赖性或空间依赖性方式调制刺激光以在所述脑组织中诱导神经反应，例如治疗效果，的指令。

在许多实施方式中，成像光源与被配置用于将成像光和/或刺激光递送到样品并被包装在相同壳体内的光学元件集成。在一些实施方式中，成像光源可以位于壳体的外部，该壳体包围将成像光和/或刺激光递送到样品并且通过例如光纤、液体光导或任何其他合适的导光手段光学地耦合到样品的光学元件。成像光源被配置用于通过包括光递送光学路径的光学元件将成像光递送到样品或受试者，或递送到受试者体内的指定视场内的组织。

如贯穿本申请所公开的，刺激光源(图7，709或708)还可以包括一个或多个LED或其他类型的发光元件。刺激光源可以提供基本上单色的光。或者，刺激光源可以提供多个波长的刺激光。在一个非限制性示例中，刺激光源可以包括发射不同颜色(例如，不同波长范围)的光的两个或更多个高强度LED或其他发光元件。刺激光源可以提供用于单色或多色刺激(激发)的光。在一些实施方式中，刺激光源可以包括被配置用于以用户定义的空间图案和/或用户定义的时间图案发射光两个或更多个发光元件，例如高强度LED。在许多实施方式中，刺激光源与被配置用于将成像和/或刺激光传递到样品并被包装在相同壳体内的光学元件集成。在一些实施方式中，刺激光源可以位于壳体的外部，该壳体包围将成像和/或刺激光递送到样品并且通过例如光纤、液体光导或任何其他合适的导光手段光学地耦合到样品的光学元件。刺激光源被配置用于通过包括光递送光学路径的光学元件将刺激光递送到样品或受试者，或递送到受试者体内的指定照射区域或视场内的组织。

如贯穿本申请所公开的，图像传感器712可以包括单色图像传感器或彩色图像传感器。在一些实施方式中，紧凑型光遗传学显微镜系统可以包括两个或更多个图像传感器。合适的图像传感器的示例包括但不限于CCD(电耦合器件，Charge Coupled Device)传感器芯片和CMOS(互补金属氧化物半导体，Complementary Metal-Oxide-Semiconductor)图像传感器。在一些实施方式中，图像传感器捕获单个图像或可以是灰度或RGB(红绿蓝，Red、Green、Blue)图像的一系列图像。可以在使用预定义或用户可调节的曝光时间将刺激光递送到样品或对象之前、期间或之后捕获单个图像或一系列图像。在一些实施方式中，由图像传感器进行的图像捕获的时间可以与空间和/或时间调制刺激光向受试者或样品的递送的时间同步。在一些实施方式中，由图像传感器进行的图像捕获的时间可以与空间和/或时间调制刺激光向受试者或样品的递送的时间偏移(异相)。通过包括光收集光学路径的光学元件将由样品或受试者或受试者体内的组织(例如，在受到刺激光激发时)反射、散射或发射的光收集并递送到图像传感器。

图7中的可调节透镜703可以包括可变形透镜。备选地或附加地，可调节透镜可以包括可移动部件，例如可移动光学元件。可调节透镜可以通过电光装置、机械装置、机电装置、热光装置和/或声学机械装置来调节。例如，通过向透镜和/或与可调节透镜相关联的部件施加电压，可以调节透镜的焦距。例如，可以通过向透镜和/或与可调节透镜相关联的部件施加电压来倾斜透镜。可由任何电相关装置调节的可调节透镜在本文也可以称为电子透镜或“e透镜”。在许多实施方式中，至少一个可调节或可变形的透镜可以构成光学元件，该光学元件由成像光和刺激光通过其透射到样品的光学路径共享。在这些实施方式中，至少一个共享的可调节或可变形的透镜可以被定位成非常靠近最远离样品或组织的GRIN透镜(或可选校正光学元件)的端部。在一些实施方式中，紧凑型光遗传学显微镜系统可以包括两个或更多个可调节透镜，该两个或更多个可调节透镜例如被配置用于分别调节刺激和图像收集光学路径的有效焦距，从而确保刺激光聚焦在图像收集光学器件用作视场的相同的焦平面上。在一些实施方式中，可以调节刺激和图像收集光学路径的有效焦距以确保刺激光聚焦在与图像收集光学器件用作视场的焦平面不同的焦平面上。在一些实施方式中，有效焦距是可调节的，使得刺激光的焦平面和/或图像收集光学器件的焦平面在约50μm、约100μm、约200μm、约300μm、约400μm或约500μm的范围上是可调节的，而不会损失空间分辨率。

在一些情况下，可调节透镜可以包括压电部件或机械部件。例如，可以将透镜流体泵入或泵出透镜外壳，该透镜外壳扩张或缩回透镜膜以实现改变的焦距和/或变焦。例如，致动器可以推动或释放可变形的壁以改变腔室中的液体的体积从而调节透镜，例如液体镜头，的曲率。在一些情况下，施加到压电部件的电压可以使薄膜(例如与涂覆在基底上的液体或聚合物层接触的薄玻璃膜)变形，从而使液体或聚合物层变形并改变其光学性质。作为非限制性示例，可调节透镜可以包括液体透镜、液晶透镜和/或压电可调透镜，或其任何组合。

可调节透镜可以包括适合于与全文所述的小型显微镜系统相集成的大小。在一些情况下，可调节透镜可以形成约等于或小于1mm、2mm、3mm、4mm、5mm、6mm、7mm、8mm、9mm、10mm、12mm、14mm、16mm、18mm或20mm的半径。可选地，可调节透镜可以形成可变半径。在一些情况下，可调节透镜可以形成约等于或小于1mm、2mm、3mm、4mm、5mm、6mm、7mm、8mm、9mm、10mm、12mm、14mm、16mm、18mm或20mm的厚度或高度。可选地，可调节透镜可以形成可变高度。

可调节透镜可以包括可调节光学参数。例如，可调节透镜可以包括可变焦距。作为另一示例，可调节透镜可以包括可变光学轴。在一些情况下，可调节透镜可以是倾斜的和/或抖动的。可调节透镜关于其光学轴可以是或者可以不是倾斜的。在一些情况下，可调节透镜的光学轴可以是倾斜的或调节了的。可调节透镜可以用于，例如，将图像带入焦点、改变有效焦深以支持容积成像，和/或用于校正色差。

在一些实施方式中，可调节透镜可以包括约等于或大于10mm、15mm、20mm、25mm、30mm、40mm、50mm、60mm、70mm、80mm、90mm或100mm的焦距，或者此范围内的任何焦距。在一些实施方式中，可以调节可调节透镜以在任何给定时间点具有任何先前提及的焦距。

在一些实施方式中，可调节透镜可以包括负焦距或无穷远焦距。在一些实施方式中，可调节透镜可以提供约-100至约+100屈光度的屈光力，其中屈光度被定义为以米为单位的焦距的倒数。在一些实施方式中，可调节透镜可以提供至少-100屈光度、至少-90屈光度、至少-80屈光度、至少-70屈光度、至少-60屈光度、至少-50屈光度、至少-40屈光度、至少-30屈光度、至少-20屈光度、至少-10屈光度、至少0屈光度、至少+10屈光度、至少+20屈光度、至少+30屈光度、至少+40屈光度、至少+50屈光度、至少+60屈光度、至少+70屈光度、至少+80屈光度、至少+90屈光度或至少+100屈光度的屈光力。在一些实施方式中，可调节透镜可以提供至多+100屈光度、至多+90屈光度、至多+80屈光度、至多+70屈光度、至多+60屈光度、至多+50屈光度、至多+40屈光度、至多+30屈光度、至多+20屈光度、至多+10屈光度、至多+0屈光度、至多-10屈光度、至多-20屈光度、至多-30屈光度、至多-40屈光度、至多-50屈光度、至多-60屈光度、至多-70屈光度、至多-80屈光度、至多-90屈光度或至多-100屈光度的屈光力。本段中描述的任何下限值和上限值可以组合以形成本公开内容内包括的范围，诸如可调节透镜可以提供范围从约+20屈光度到约+70屈光度的屈光力。本领域技术人员将认识到，可调节透镜可以提供具有该范围内的任何值(例如，约+25屈光度)的屈光力。

如本文所提及的使可调节透镜倾斜可以是指使可调节透镜本身倾斜。备选地或附加地，使可调节透镜倾斜可以是指调节可调节透镜(例如，使透镜变形、调节液体透镜的曲率)，使得可调节透镜的光轴倾斜或改变。倾斜角度可以是或者可以不是围绕可调节透镜的光学轴的。可选地，可调节透镜可以被配置成倾斜约等于或大于0.1°、0.2°、0.3°、0.4°、0.6°、0.8°、1°、1.2°、1.5°、2°、2.5°、3°、4°或5°的倾斜角度。

在一些实施方式中，所公开的光遗传学显微镜或部件光学探针可以包括至少一个可调节或可变形透镜、至少两个可调节或可变形透镜、至少三个可调节或可变形透镜、至少四个可调节或可变形透镜，或者更多。在利用一个或多个可调节或可变形透镜的那些实施方式中，如上所提及，紧凑型光遗传学显微镜系统或光学成像探针的有效焦深可以是变化的以支持容积成像。在这样的实施方案中，光遗传学显微镜或光学成像探针可以能够在约1mm x 1mm x 50μm深，或约1mm x1mm x 100μm深，或约1mm x 1mm x 200μm深，或者约1mm x1mm x 300μm深，或者约1mm x 1mm x 400μm深，或者约1mm x 1mm x 300μm深的样品或组织体积上收集光并生成图像。

在一些实施方式中，显微镜系统或光学探针的照射区域、刺激区域和/或视场(FOV)可以在从约100μm x 100μm到约5mm x 5mm的范围内。在一些实施方式中，FOV为至少100μm x 100μm、至少200μm x 200μm、至少300μm x 300μm、至少400μm x 400μm、至少500μmx500μm、至少600μm x 600μm、至少700μm x 700μm、至少800μm x 800μm、至少900μm x 900μm、至少1mm x 1mm、至少1.1mm x 1.1mm、至少1.2mm x 1.2mm、至少1.3mm x 1.3mm、至少1.4mm x 1.4mm、至少1.5mm x 1.5mm、至少1.6mm x 1.6mm、至少1.7mm x 1.7mm、至少1.8mmx 1.8mm、至少1.9mm x 1.9mm、至少2mm x 2mm、至少2.5mm x 2.5mm、至少3mm x 3mm、至少3.5mm x 3.5mm、至少4mm x 4mm、在至少4.5mm x 4.5mm或至少5mm x 5mm。在一些实施方式中，FOV为至多5mm x 5mm、至多4.5mm x 4.5mm、至多4mm x 4mm、至多3.5mm x 3.5mm、至多3mm x 3mm、至多2.5mm x 2.5mm、至多2mm x 2mm、至多1.9mm x 1.9mm、至多1.8mm x1.8mm、至多1.7mm x 1.7mm、至多1.6mm x 1.6mm、至多1.5mm x 1.5mm、至多1.4mm x1.4mm、至多1.3mm x 1.3mm、至多1.2mm x 1.2mm、至多1.1mm x 1.1mm、至多1mm x 1mm、至多900μm x 900mm、至多800μm x 800μm、至多700μm x 700μm、至多600μm x 600μm、至多500μm x 500μm、至多400μm x 400μm、至多300μm x 300μm、至多200μm x 200μm，或至多100μmx 100μm。本段中描述的任何下限值和上限值可以组合以形成本公开内容内包括的范围，诸如照射/刺激区域以及FOV可以在从约800μm×800μm至约1.2mm x 1.2mm的范围内。本领域技术人员将认识到照射/刺激和FOV可以具有在该范围内的任何值，例如约1.15mm x1.15mm。

在一些实施方式中，显微镜系统的有效焦深可以在约10μm至约1mm的范围内。在一些实施方式中，有效焦深可以为至少10μm、至少25μm、至少50μm、至少75μm、至少100μm、至少200μm、至少300μm、至少400μm、至少500μm、至少600μm、至少700μm、至少800μm、至少900μm或至少1mm。在一些实施方式中，有效焦深可以为至多1mm、至多900μm、至多800μm、至多700μm、至多600μm、至多500μm、至多400μm、至多300μm、至多200μm、至多100μm、至多75μm、至多50μm、至多25μm或至多10μm。本段中描述的任何下限值和上限值可以组合以形成本公开内容内包括的范围，诸如有效焦深可以在从约200μm至约500μm的范围内。本领域技术人员将认识到，有效焦深可以具有在该范围内的任何值，例如，约275μm。在一些实施方式中，显微镜系统的有效焦深随着在每个有效焦深设置处捕获一系列一个或多个图像而变化。

在一些实施方式中，由紧凑型光遗传学显微镜系统提供的图像的空间分辨率在视场中心处可以在约0.1μm至约5μm的范围内。在一些实施方式中，在视场中心处的空间分辨率可以为至少0.1μm、至少0.25μm、至少0.5μm、至少0.75μm、至少1μm、至少1.5μm、至少2μm、至少3μm、至少4μm，或至少5μm。在一些实施方式中，在视场中心处的空间分辨率可以为至多5μm、至多4μm、至多3μm、至多2μm、至多1.5μm、至多1μm、至多0.75μm、至多0.5μm、至多0.25μm，或至多0.1μm。本段中描述的任何下限值和上限值可以组合以形成本公开内容内包括的范围，诸如在视场中心处的空间分辨率可以在从约0.75μm至约2μm的范围内。本领域技术人员将认识到，在视场中心处的空间分辨率可以具有在该范围内的任何值，例如，约1.6μm。

在一些实施方式中，由紧凑型光遗传学显微镜系统提供的图像的空间分辨率可以跨视场变化，并且可以在从约0.1μm至约30μm的范围内。在一些实施方式中，跨视场的最小空间分辨率可以为至少0.1μm、至少0.5μm、至少1μm、至少5μm、至少10μm、至少15μm、至少20μm、至少25μm，或至少30μm。在一些实施方式中，最小空间分辨率可以为至多30μm、至多25μm、至多20μm、至多15μm、至多10μm、至多5μm、至多1μm、至多0.5μm，或至多0.1μm。本段中描述的任何下限值和上限值可以组合以形成本公开内容内包括的范围，例如最小空间分辨率可以在从约1μm至约20μm的范围内。本领域技术人员将认识到，最小空间分辨率可以具有在该范围内的任何值，例如，约20μm。

在一些实施方式中，可以使用一个或多个校正光学元件(图7中的702)以改进由紧凑型光遗传学显微镜系统跨整个视场提供的图像的空间分辨率。在这些实施方式中，跨整个视场的最小空间分辨率可以在从约0.1μm至约5μm的范围内。在一些实施方式中，跨整个视场的最小空间分辨率可以为至少0.1μm、至少0.25μm、至少0.5μm、至少0.75μm、至少1μm、至少1.5μm、至少2μm、至少3μm、至少4μm、或至少5μm。在一些实施方式中，跨整个视场的最小空间分辨率可以为至多5μm、至多4μm、至多3μm、至多2μm、至多1.5μm、至多1μm、至多0.75μm、至多0.5μm、至多0.25μm，或至多0.1μm。本段中描述的任何下限值和上限值可以组合以形成本公开内容内包括的范围，诸如跨整个视场的最小空间分辨率可以在从约0.75μm至约2μm的范围内。本领域技术人员将认识到，最小空间分辨率可以具有该范围内的任何值，例如约1.6μm。

在一些实施方式中，可以使用一个或多个可调节透镜来主动校正色差。在一些情况下，可调节透镜可以用于轴向校正色差。例如，可以通过适当地改变可调节透镜的焦距来校正或减轻色差。例如，多色刺激或成像系统可能经历色差，因为诸如透镜等光学元件可能不同地聚焦不同颜色(例如不同波长)的光。相应地，对于不同波长的光(或不同的波长范围)，可能需要调节可调节透镜的焦距以便使图像成为焦点或将刺激光聚焦在与用于对样品或受试者成像的平面相同的样品平面上。在一些实施方式中，使用可调节透镜对有效焦距的调节可以与图像传感器对图像的捕获同步。

备选地或附加地，在一些实施方式中可以利用可调节透镜来校正横向平面中的色差。例如，可以通过使可调节透镜倾斜至适当的倾斜角度来校正或减轻横向平面中的色差。在一些情况下，在多个图像由图像传感器(例如，使用将图像捕获过程与可调节透镜的倾斜同步的图像捕获电路)捕获时能够以径向图案(即，其中透镜在一个方向上从0度的角度(与光轴对齐)倾斜到指定角度(例如，沿着x轴)倾斜))或圆形图案(即，其中将透镜倾斜到固定角度并且继而将透镜围绕光轴旋转完整360度)倾斜可调节透镜。随后，可以处理结合透镜的倾斜和/或旋转捕获的多个图像以提供已经校正了色差的图像。多个捕获的图像可以包括以不同的倾斜角度捕获的图像。不同的倾斜角度可以是指幅度不同的倾斜角度，或者关于光学轴的倾斜方向不同的倾斜角度。在一些情况下，可以在具有相同或相似幅度的倾斜角度下捕获多个图像。或者，可以在具有不同幅度的倾斜角度下捕获多个图像。在一些实施方式中，如果以足够高的频率完成抖动可以使用抖动可调节透镜的倾斜角度和方向(即，引起倾斜角度和方向上的随机变化)以校正单个图像内的色差，从而在捕获图像所需的曝光时间内提供整个视场的覆盖。在一些实施方式中，在以同步方式捕获多个图像时抖动可调节透镜的倾斜角度。

在一些实施方式中，还可以提供一个或多个处理器(例如，集成在显微镜壳体内，或者作为与紧凑型显微镜系统通信的外部控制器的一部分)来帮助校正图像的色差。例如，一个或多个处理器可以单独地或共同地利用多个捕获的图像来校正色差或者使色差最小化。多个图像可以是使用如上文所述的倾斜的可调节透镜(例如以圆形或径向图案倾斜)所捕获的图像。在一些情况下，例如，可以在对图像的后处理中，对所捕获的多个图像进行组合以制作处理过的图像。组合或处理利用可调节透镜的不同倾斜角度的多个捕获的图像可以减少或消除色差，例如在横向平面上减少或消除色差。不同的倾斜角度可以是指幅度不同或关于光轴的方向不同的倾斜角度。在一些情况下，用于校正色差的多个捕获的图像可以为约等于或多于5个图像、10个图像、15个图像、20个图像、25个图像、30个图像、40个图像、50个图像、60个图像、80个图像、100个图像、150个图像、200个图像、250个图像、300个图像、400个图像或500个图像。

如所述的，在一些实施方式中，图像传感器对图像的捕获可以与可调节透镜的倾斜或抖动同步。例如，可调节透镜可以根据图像传感器的图像捕获速率而倾斜或抖动。或者，可调节透镜可以以大于图像传感器的图像捕获速率的速率倾斜或抖动。或者，可调节透镜可以以小于传感器的图像捕获速率的速率抖动或倾斜。图像捕获电路可以以约等于或大于10fps、15fps、20fps、25fps、30fps、40fps、50fps、60fps、80fps、100fps、120fps、140fps、160fps、180fps、200fps、220fps、240fps、280fps、320fps、360fps、400fps或更大的速率捕获图像。可调节透镜可以以约等于或大于每秒10次调节、每秒15次调节、每秒20次调节、每秒25次调节、每秒30次调节、每秒40次调节、每秒50次调节、每秒60次调节、每秒80次调节、每秒100次调节、每秒120次调节、每秒140次调节、每秒160次调节、每秒180次调节、每秒200次调节、每秒220次调节、每秒240次调节、每秒280次调节、每秒320次调节、每秒360次调节、每秒400次调节或更大的速率进行调节(例如，倾斜、抖动等)。

在一些情况下，可调节透镜对于多色刺激或多色成像应用可能尤其有用。如本文先前所述，多色成像可能经受色差或者可能捕获焦点未对准的图像，原因在于不同颜色(例如波长)的光在穿过诸如透镜等光学元件聚焦时，可能具有不同的焦距。因此，对于不同的波长(例如不同的波长范围)，为了使图像聚焦清晰，利用不同的焦距可能是适当的或必要的。在一些情况下，可调节透镜可以被调节成使得焦距适合于对于不同波长的光均使图像聚焦清晰。可选地，可以提供一个或多个处理器来改变成像系统(例如，使用可调节透镜)的焦距，使得对于不同波长的光捕获的图像总是焦点对准的。

在一些情况下，发射不同波长范围的光的不同光学布置或光源可以在时间上进行复用。结合光学布置或光源的时间复用，可以调节可调节透镜使得刺激光聚焦在与包括将要进行成像的视场的样品或受试者平面相同的样品或受试者平面上。此外，结合光学布置或光源的时间复用，可调节透镜可以被调节成使得成像系统能够针对不同波长的光捕获焦点对准的图像。在一些情况下，对可调节透镜的焦距进行调节可以与光学布置或光源的时间复用基本上同时地进行调节，以便使捕获的图像聚焦清晰。或者，对可调节透镜的焦距进行调节可以与对光学布置或光源的时间复用基本上顺序地进行，以便使捕获的图像聚焦清晰。在一些情况下，可以提供一个或多个处理器以确保根据由光学布置或光源产生的光(例如激发光)适当地调节成像系统或可调节透镜的焦距，以使捕获的图像聚焦清晰。备选地或附加地，可以提供一个或多个处理器以确保根据由样品产生的光(例如发射光)适当地调节成像系统或可调节透镜的焦距，以使捕获的图像聚焦清晰。另外，如上文所提及，可以使可调节透镜倾斜和/或抖动以减轻或校正色差。

如上所讨论的，紧凑型光遗传学显微镜可以用于研究人类受试者或动物受试者。在包括一个或多个可调节透镜的那些实施方式中，可以使用可调节透镜，例如来将成像光和刺激光带入相同或不同的焦平面和/或视场中，或者例如用于校正视场内的色差。使用紧凑型光遗传学显微镜同时对受试者体内组织进行刺激和成像的方法的非限制性示例可以包括：a)提供根据本文公开的任何实施方式的光学系统；b)提供包含待刺激和成像的组织的受试者；c)将步骤(a)的光学系统安装在受试者上或者植入受试者体内；以及d)在以时间调制或空间调制的方式将刺激光引导到所述受试者的组织之前，期间或之后，生成组织的一个或多个图像。本文公开的紧凑型光遗传学显微镜可以在对突触后细胞进行成像、对相同细胞群体进行成像和调制，或者对相同视场内的不同群体进行成像和调制时用于，例如，调制神经组织的突触前输入。在一些实施方式中，动物受试者可以包括啮齿动物(例如，小鼠、大鼠、兔、豚鼠、沙鼠、仓鼠)、猿、犬科动物、猫科动物、禽类、昆虫或任何其他类型的动物。在一些实施方式中，显微镜可以安装在活体受试者(或非活受试者)上或插入其中，并用于临床前或临床研究。在一些实施方式中，显微镜可以用于临床诊断或治疗应用。在一些实施方式中，紧凑型光遗传学显微镜可以与光激活离子通道结合使用以递送光学刺激的空间-时间图案，该光刺激的空间-时间图案在被大脑的神经组织处理时触发受试者中的具体效应。通过递送光学刺激的空间-时间图案可以在受试者中触发的具体效应的示例包括但不限于食欲/摄食行为的变化、引发恐惧/回避行为、奖励寻求行为、普遍性增强或抑制运动活动，以及改变睡眠模式。

可植入显微镜系统

在本文公开的紧凑型光遗传学显微镜系统的一些实施方式中，系统可以被配置为部分或完全可植入的设备(即，其中设备不破坏皮肤屏障的设备)。在这些实施方式中，可以将显微镜系统或其部件(例如，一个或多个单独的光学照射探针、光学刺激探针、光学成像探针或其任何组合)封装在气密密封的生物相容性壳体中，例如，具有由生物相容性材料制成的外表面的壳体。用于制造生物相容性壳体(或其外表面)的合适材料的非限制性示例可以包括各种金属(例如，不锈钢、钴基合金、钛和钛基合金)、聚合物(例如，聚丙烯、高密度聚乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯和硅树脂)、陶瓷(例如，二氧化锆)、复合材料或其组合。

在这些可植入实施方式中，显微镜系统可以进一步包括与外部控制器通信并实现外部控制器与植入设备之间的无线数据和功率传输的无线发射器/接收器(或无线适配器，例如，射频或光学无线链路)。在一些实施方式中，无线发射器/接收器(分开地和/或同时地)提供数据读取和数据写入通信两者。这些实施方式中的无线数据传输速率可以在从约1Mbit/s至约7Gbit/s的范围内。在一些实施方式中，无线数据传输速率可以是约至少1Mbit/s、约至少5Mbit/s、约至少10Mbit/s、约至少50Mbit/s、约至少100Mbit/s、约至少200Mbit/s、约至少300Mbit/s、约至少400Mbit/s、约至少500Mbit/s、约至少600Mbit/s、约至少700Mbit/s、约至少800Mbit/s、约至少900Mbit/s、约至少1Gbit/s、约至少2Gbit/s、约至少3Gbit/s、约至少4Gbit/s、约至少5Gbit/s，约至少6Gbit/s或约至少7Gbit/s。

本文公开的可植入显微镜系统可以包括如本文公开的针对紧凑型光遗传学显微镜系统的其他实施方式所述的光学设计、光学性能特点和物理特征。可植入显微镜系统的应用包括对受试者中经遗传修饰的组织进行光刺激，其中该组织已经受到遗传修饰以并入光驱动离子通道和/或荧光钙指示剂或其他荧光离子指示剂，并且其中植入设备被配置用于将在空间上和/或在时间上调制的刺激光脉冲序列递送到设备的照射场和/或视场内的神经元，从而刺激由受试者处理的选定神经元或选定的一组神经元以引发治疗反应。在一些实施方式中，例如，其中受试者的组织已经受到遗传修饰以包括荧光钙指示剂或其他荧光离子指示剂的那些中，植入设备可以被配置用于递送在空间上和/或在时间上调制的刺激光脉冲序列，并且对在目标神经元(即，由刺激光脉冲刺激的神经元)中诱导的应答进行成像。在一些实施方式中，经由反馈回路使用目标神经元中，或者邻近或十分靠近目标神经元的神经元中的成像响应来修改刺激光脉冲的空间和/或时间图案。本公开内容的植入设备的潜在应用的示例包括测试受试者中心房颤动的光遗传学诱导、心脏病患者中心肌组织的光遗传学刺激、视力丧失患者中视网膜神经元的光遗传学刺激以及癫痫患者中迷走神经的光遗传学刺激。潜在应用的其他示例包括但不限于诱导睡眠、食欲、药物依赖、赌博或其他习惯行为改变的刺激、抑制帕金森病患者的震颤，以及在其他运动障碍中恢复正常运动。

控制系统

本公开内容提供了被编程用于实现本公开内容的方法的计算机控制系统。图5示出了被编程或以其他方式被配置用于控制入射在样品上的刺激光源的计算机系统501。计算机系统可以被配置用于识别包括一个或多个感兴趣的物体的样品的区域以供刺激光源刺激。计算机系统可以调节刺激光源的各个方面，诸如，例如在显微镜系统的视场中的样品上入射光的强度、位置，和/或样品由刺激光源照射的持续时间。

计算机系统包括中央处理单元(CPU，本文中也称为“处理器”和“计算机处理器”)505，其可以是单核或多核处理器或者用于并行处理的多个处理器。计算机系统还包括存储器或存储器位置510(例如，随机存取存储器、只读存储器、快闪存储器)，电子存储单元515(例如，硬盘)，用于与一个或多个其他系统进行通信的通信接口520(例如，网络适配器)，以及外围设备525(诸如高速缓存、其他存储器、数据储存器和/或电子显示适配器)。存储器、存储单元、接口和外围设备通过诸如主板等通信总线(实线)与CPU 505通信。存储单元可以是用于存储数据的数据存储单元(或数据存储库)。计算机系统501可以借助于通信接口520可操作地耦合至计算机网络(“网络”)530。网络可以是互联网、因特网和/或外联网，或者与互联网进行通信的内联网和/或外联网。网络在一些情况下是电信和/或数据网络。网络530可以包括一个或多个计算机服务器，所述计算机服务器可以支持诸如云计算等分布式计算。网络530在一些情况下借助于计算机系统501可以实现对等网络，对等网络可以使得耦合至计算机系统的设备能够充当客户端或服务器。

CPU 505可以执行可以在程序或软件中体现的机器可读指令序列。指令可以存储在诸如存储器510等存储器位置中。由CPU执行的操作的示例可以包括取、解码、执行和回写。

CPU可以是诸如集成电路等电路的一部分。可以将系统的一个或多个其他组件包括在该电路中。在一些情况下，电路是应用专用集成电路(ASIC，Application SpecificIntegrated Circuit)。

存储单元可以存储诸如驱动程序、库和保存的程序等文件。存储单元可以存储用户数据，例如用户偏好和用户程序。计算机系统在一些情况下可以包括一个或多个附加数据存储单元，所述一个或多个附加数据存储单元是在计算机系统外部的，诸如位于通过内联网或因特网与计算机系统进行通信的远程服务器上。

计算机系统可以通过网络530与一个或多个远程计算机系统通信。例如，计算机系统可以与用户(例如，操作者)的远程计算机系统通信。远程计算机系统的示例包括个人计算机(例如，便携式PC)、板或平板PC(例如，iPad、Galaxy Tab)、电话、智能电话(例如，iPhone、支持Android的设备、)或个人数字助理。用户可以经由网络访问计算机系统。

可以通过存储在计算机系统的电子存储位置上(举例而言，诸如存储器或电子存储单元上)的机器(例如，计算机处理器)可执行代码来实现如本文描述的方法。机器可执行代码或机器可读代码能够以软件的形式提供。在使用期间，代码可以由处理器505执行。在一些情况下，代码可以从存储单元中检索并且存储在存储器上以供处理器迅速存取。在一些情况下，可以不包括电子存储单元，并且将机器可执行指令存储在存储器上。

代码可以被预编译并配置用于与具有适于执行代码的处理器的机器一起使用，或者可以在运行时间期间进行编译。代码能够采用可以选择以使得该代码能够以预编译或编译时的方式执行的编程语言来提供。

本文提供的系统和方法的各方面，诸如计算机系统，可以在编程方面体现。该技术的各个方面可被认为是以在某一类型的机器可读介质上携带或体现的典型的机器(或处理器)可执行代码和/或关联数据的形式的“产品”或“制品”。机器可执行代码可以存储在诸如存储器(例如，只读存储器、随机存取存储器、快闪存储器)或硬盘等电子存储单元上。“存储”类介质可以包括计算机、处理器等有形存储器，或其相关联的模块(诸如各种半导体存储器、磁带驱动器、磁盘驱动器等)中的任何或全部，其可以在任何时间为软件编程提供非暂时性存储。软件的全部或部分有时可以通过因特网或各种其他电信网络进行通信。这样的通信例如可以使得软件能够从一台计算机或处理器加载到另一台计算机或处理器中，例如，从管理服务器或主机计算机加载到应用服务器的计算机平台中。因此，可以承载软件元素的另一类介质包括诸如跨本地设备之间的物理接口、通过有线和光学陆上通信线网络以及通过各种空中链路所使用的光波、电波和电磁波。携带此类波的物理元件，诸如有线或无线链路、光学链路等，也可以视为是承载软件的介质。如本文所使用，除非限制于非暂时性有形“存储”介质，否则诸如计算机或机器“可读介质”等术语是指参与向处理器提供指令以供执行的任何介质。

因此，诸如计算机可执行代码等机器可读介质可以采取许多种形式，包括但不限于有形存储介质、载波介质或物理传输介质。非易失性存储介质例如包括光盘或磁盘，诸如任何(一个或多个)计算机中的任何存储设备等，如附图中所示的可以用于实现数据库的那些等。易失性存储介质包括动态存储器，诸如这样的计算机平台的主存储器。有形传输介质包括同轴电缆；铜线和光纤，包括构成计算机系统内的总线的导线。载波传输介质可以采取电信号或电磁信号或者声波或光波(诸如射频(RF，Radio Frequency)和红外(IR，InfraredRadiation)数据通信过程中产生的那些)的形式。因此，计算机可读介质的常见形式例如包括：软盘、柔性盘、硬盘、磁带、任何其他磁性介质、CD-ROM、DVD(高密度数字视频光盘，Digital Video Disc)或DVD-ROM、任何其他光学介质、穿孔纸带、具有孔洞图案的任何其他物理存储介质、RAM(随机存取存储器，Random Access Memory)、ROM(只读存储器，Read-Only Memory)、PROM(可编程只读存储器，Programmable Read-Only Memory)和EPROM(可擦可编程只读存储器，Erasable Programmable Read-Only Memory)、FLASH-EPROM、任何其他存储器芯片或盒式磁带、传送数据或指令的载波、传送这样的载波的电缆或链路，或者计算机可以从中读取编程代码和/或数据的任何其他介质。在将一个或多个指令的一个或多个序列载送到处理器以供执行的过程中可能涉及这些计算机可读介质形式中的许多形式。

计算机系统可以包括电子显示器或与其通信，电子显示器包括用于提供例如由显微镜系统捕获的图像的显示的用户接口(UI,User Interface)。图像可以有成像光生成。图像可以包括显微镜系统的当前视场。图像可以包括用于由刺激光源刺激的一个或多个感兴趣的物体。UI的示例包括但不限于图形用户接口(GUI,Graphical User Interface)和基于网络的用户接口。

示例——在自由行为的小鼠中同时进行钙成像和光遗传学操作

光遗传学通过提供工具来因果关联不同的神经电路活动行为，从而彻底改变了系统神经科学。此外，钙指示剂和成像技术的进步已经带来了关于各种内部和外部刺激如何驱动不同神经元群体的活动的重要发现。在此，我们描述了轻型集成显微镜的两个非限制性示例(图8A-图8B，其图示了具有不同荧光激发波长和光刺激波长的紧凑型光遗传学显微镜)，该轻型集成显微镜允许在同一视场内在自由行为的小鼠中同时且顺序地进行细胞分辨率成像和光学操作。

图9A-图9C图示了紧凑型光遗传学显微镜系统的不同成像应用的非限制性示例。这些集成的显微镜允许在同一视场内的几种不同的成像和光遗传学应用，包括在对突触后细胞进行成像时调制突触前输入(图9A)、对相同细胞群体进行成像和调制(图9B)，以及对同一视场内不同的群体进行成像和调制(图9C)。

图10A-图10D示出了使用兴奋性视蛋白进行生物串扰的体外表征数据的示例。为了确定激发LED光源(EX-LED)是否激活了兴奋性视蛋白，用MVS-Syn-ChrimsonR-tdTom(图10A，左上)或MVS-CamKIa-ChR2-eYFP(图10C，左上)注射到小鼠的皮层中。在注射超过4周后，我们在皮层脑切片中进行了全细胞膜片钳电生理学(图10A和10C，右上)。我们发现用nVista-OPTO 455EX激发滤光片过滤的蓝光显著激活了体细胞中的ChrimsonR(图10A，左下和右下)，但终端中ChrimsonR没有显著激活(图10B，左下和右下)我们发现使用nVista-OPTO 560EX激发滤光片过滤的绿光没有显著激活体细胞或终端中的ChR2(图10C，右下和10D，左下和右下)。

图11A-图11B示出了使用抑制性视蛋白进行生物串扰的体外表征数据的示例。为了确定EX-LED是否激活抑制性视蛋白，用MV5-CamKIIa-NpHR3.0-mCherry(图11A，左上)或MV5-CamKII-Jaws-KGC-GFP-ER2(图11B，左上)注射到小鼠的皮层中。在注射超过4周后，我们在皮层脑切片中进行了全细胞膜片钳电生理学。我们发现用nVista-OPTO 455EX激发滤光片过滤的蓝光导致NpHR3.0(图11A)和Jaws(图11B)的一些激活。然而，在用于成像的较低辐照度下，这种串扰最小。

图12A-图12B示出了生物串扰的体内表征数据的示例。我们确定了1)OG-LED是否提供足够的功率来引起预期的行为响应，以及2)EX-LED是否改变了行为。对于nVista-OPTO455EX，用

AAVS-syn-ChrimsonR-tdTom注射到小鼠的LHb中，并将6mm透镜插入RMTg上方(图12A，上部)。对于nVista-OPTO 560EX，用AAV5-CamKIIa-ChR2-eYFP注射到小鼠的eYFP中，并将7mm透镜植入BNST上方(图12B，上部)。在实时地点偏好测定中，小鼠对与暴露于来自nVista-OPTO 455EX的EX-LED搭配的腔室没有显示任何偏好或躲避。小鼠对与暴露于来自nVista-OPTO 455EX 60Hz的OG-LED搭配的腔室一侧显示出厌恶(图12A，下部)。在进食测定中，小鼠在暴露于来自nVisla-OPTO 560EX的EX-LED期间没有显示任何进食变化。在暴露于来自nVista-OPTO 560EX的20Hz OG-LED期间，小鼠显示出增加的进食(图12B，下部)。

图13A-图13B示出了机械串扰的体内表征数据的示例。为了确定OG-LED是否激发脑组织、内窥镜或显微镜中的自发荧光，幼稚小鼠(不表达视蛋白或指示剂)在海马体或背侧纹状体上方植入4mm透镜。成像期间由OG-LED关闭30秒、OG-LED开启30秒，重复3次组成。EX-LED一直处于关闭状态。nGista-OPTO 455EX OG-LED不会激活脑组织、内窥镜或显微镜中的任何自发荧光，如OG-LED开启与OG-LED关闭之间的荧光计数没有显著变化(图13A)所证明的。nVista-OPTO 560EX OG-LED显著地激活了显微镜、内窥镜和脑组织中的自发荧光，如OG-LED开启与OG-LED关闭之间显著更多的荧光计数所证明的(图13B)。

图14示出了与所公开的紧凑型光遗传学显微镜系统一起使用的合适的视蛋白/指示剂组合的非限制性示例。ChR2示出了最小的体外和体内串扰。RGECO和RCaMP目前正在体内验证。同时进行的GCaMP成像与体细胞红移视蛋白操作将需要进一步设计红移视蛋白，使得它们在体细胞内不受蓝光的激发。

图15图示了使用所公开的紧凑型光遗传学显微镜系统建立和执行光遗传学研究中所采取的步骤的一个非限制性示例。用AAVS-Syn-ChrimsonR-tdTom注射到小鼠的BLA中。4周后，用AAV1-CamKIIa-GCaMP6f注射到小鼠的NAc中。在同一手术中，在小鼠的NAc上方植入7mm中继透镜。三周后，向小鼠植入允许附接nVista-OPTO显微镜的基板。准许小鼠进入开放腔室20分钟。如果小鼠穿越进入刺激搭配的腔室侧，则其接受1s每秒20Hz的OG-LED。如果小鼠穿越进入没有刺激搭配的一侧，则其不会接受OG-LED刺激。在整个20分钟期间经由EX-LED进行成像。如预期的，我们发现小鼠在刺激搭配的腔室侧花费更多的时间，证明BLA-Io-NAc回路是有成效的。此外，我们观察到与OG-LED递送一致的钙活性增加。

我们已经开发了两种新的紧凑型光遗传学显微镜系统，其允许在相同的视场中对自由行为的动物进行成像和光遗传学操作。我们已经进行了体外和体内生物可行性研究，以确定哪些视蛋白/指示剂组合对于每个显微镜是可行的。最后，我们已经展示了对自由行为的小鼠同时进行光遗传学操作和钙成像。在集成轻量显微镜中将光遗传学和钙成像结合可以允许研究人员开始建立神经回路动力学与行为之间的因果关系。

虽然本文示出和描述了本发明的优选实施方式，但对于本领域技术人员显而易见的是，这样的实施方式仅以示例的方式提供。本发明不旨在通过说明书中提供的具体示例来限制。虽然已经参考前述说明书描述了本发明，但本文的实施方式的描述和图示不应以限制性的意义来解释。本领域技术人员现将在不偏离本发明的情况下想到众多变更、改变和替换。此外，应当理解，本发明的所有方面不限于本文阐述的具体描绘、配置或相对比例，而是取决于多种条件和变量。应当理解，在本发明的实践中可以采用本文描述的本发明的实施方式的各种备选方案。因此可以设想，本发明还应当覆盖任何这样的替代、修改、改变或等同物。以下权利要求旨在限定本发明的范围，并且旨在由此涵盖这些权利要求及其等同物的范围内的方法和结构。

Claims (40)

1.一种用于对受试者体内的组织同时进行成像和刺激的显微镜系统，所述显微镜系统包括：

a)光学组件，其包括：

i.照射光学路径，其包括一个或多个发光元件并且被配置用于将成像光引导到指定视场内的组织；

ii.刺激光学路径，其包括一个或多个发光元件并且被配置用于将刺激光引导到所述视场内的组织、到所述视场外的组织或者到部分地位于所述视场内的组织；

iii.成像光学路径，其包括一个或多个图像传感器并且被配置用于接收由所述组织反射、散射或发射的光以生成所述视场内的所述组织的图像；以及

b)基板，其中所述基板被配置成以固定位置安装在所述受试者上并且接收所述光学组件，从而使所述光学组件在附接到所述基板时相对于所述受试者的所述组织对准，并且其中所述光学组件是可从所述基板移除的。

2.根据权利要求1所述的显微镜系统，其中所述指定视场约为1mm x 1mm。

3.根据权利要求1或权利要求2所述的显微镜系统，其中所述指定视场约为2mm x 2mm。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的显微镜系统，其中所述指定视场约为4mm x 4mm。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的显微镜系统，其中所述成像光是荧光激发光。

6.根据权利要求5所述的显微镜系统，其中所述荧光激发光在400nm至500nm的波长范围内提供，并且所述刺激光在500nm至800nm的波长范围内提供。

7.根据权利要求5所述的显微镜系统，其中所述荧光激发光在500nm至650nm的波长范围内提供，并且所述刺激光在350nm至560nm的波长范围内提供。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的显微镜系统，其中所述光学组件被配置用于获取在所述视场的中心处具有优于约2μm的空间分辨率的图像。

9.根据权利要求1至8中任一项所述的显微镜系统，其中所述光学组件被配置用于通过将一个或多个校正光学元件添加到所述光学组件，获取在整个视场上具有优于约2μm的空间分辨率的图像。

10.根据权利要求1至9中任一项所述的显微镜系统，其中所述光学组件还包括一个或多个可变形透镜，所述一个或多个可变形透镜被配置用于调节所述成像光学路径、所述刺激光学路径或者两者的焦深。

11.根据权利要求10所述的显微镜系统，其中所述照射光学路径、所述刺激光学路径和所述成像光学路径共享至少一个可变形透镜。

12.根据权利要求10所述的显微镜系统，其中所述一个或多个可变形透镜被配置用于在约300μm的范围上调节所述成像光学路径、所述刺激光学路径或者两者的焦深，而不损失空间分辨率。

13.根据权利要求10所述的显微镜系统，其中所述一个或多个可变形透镜选自液体透镜、液晶透镜和压电致动可调透镜或其任何组合。

14.根据权利要求10所述的显微镜系统，其中所述一个或多个可变形透镜被配置成使得所述成像光学路径和所述刺激光学路径将光引导到相同的焦平面。

15.根据权利要求10所述的显微镜系统，其中所述光学组件被配置用于在约1mm x 1mmx 300μm的组织体积上获取图像。

16.根据权利要求1至15中任一项所述的显微镜系统，其中所述刺激光学路径还被配置用于以用户定义的空间图案将所述刺激光引导到所述组织。

17.根据权利要求16所述的显微镜系统，其中所述用户定义的空间图案在所述焦平面处具有优于约5μm的空间分辨率。

18.根据权利要求1至17中任一项所述的显微镜系统，还包括第一处理器和存储设备，其中所述处理器被配置用于执行存储在所述存储设备中的一系列软件编码的指令。

19.根据权利要求18所述的显微镜系统，其中所述软件编码的指令包括用于以下操作的指令：(i)以时间依赖性或空间依赖性方式调制成像光强度，(ii)以时间依赖性方式调制刺激光强度，(iii)以时间依赖性方式改变所述焦深，以及(iv)以指定时间在所述指定视场内捕获所述组织的一个或多个图像，或其任何组合。

20.根据权利要求19所述的显微镜系统，其中所述组织是脑组织，并且其中所述软件编码的指令包括用于以时间依赖性或空间依赖性方式调制所述刺激光以在所述脑组织中诱导神经反应的指令。

21.根据权利要求1至20中任一项所述的显微镜系统，其中所述系统的总体积约小于5cm³。

22.根据权利要求1至21中任一项所述的显微镜系统，其中所述系统的总重量约小于4克。

23.根据权利要求1至22中任一项所述的显微镜系统，其中所述照射光学路径和所述成像光学路径被包装在第一壳体中作为光学成像探针。

24.根据权利要求23所述的显微镜系统，其中所述刺激光学路径被包装在第二壳体中作为光学刺激探针。

25.根据权利要求23或权利要求24所述的显微镜系统，其中所述系统包括附接到所述基板的至少第二光学成像探针、至少第二光学刺激探针或其任何组合。

26.根据权利要求1至25中任一项所述的显微镜系统，其中所述照射光学路径或所述刺激光学路径的所述一个或多个发光元件包括耦合到一个或多个外部光源的光纤。

27.根据权利要求1至26中任一项所述的显微镜系统，其中所述系统安装在自由移动的受试者上或者部分植入其体内。

28.根据权利要求1至27中任一项所述的显微镜系统，其中所述照射光学路径、所述刺激光学路径和所述成像光学路径还包括部分植入所述受试者的组织中的共享内窥镜探针。

29.根据权利要求1至28中任一项所述的显微镜系统，其中所述受试者选自小鼠、大鼠、猫、狗、猪、牛、马、猴子、黑猩猩、红毛猩猩、大猩猩和人类。

30.根据权利要求1至29中任一项所述的显微镜系统，其中所述系统用于临床前研究。

31.根据权利要求1至30中任一项所述的显微镜系统，其中所述系统用于临床研究。

32.根据权利要求1至31中任一项所述的显微镜系统，其中所述系统用于确定临床诊断测试结果。

33.根据权利要求1至32中任一项所述的显微镜系统，其中所述系统用于中枢神经系统、外周神经系统或者两者的神经元组织的光刺激。

34.根据权利要求19所述的显微镜系统，其中所述系统用于以产生治疗效果的时间调制或空间调制的方式将刺激光引导到所述组织。

35.一种用于对受试者体内的组织同时进行刺激和成像的方法，所述方法包括：

a)提供根据权利要求34所述的显微镜系统；

b)提供包含待刺激和成像的所述组织的受试者；

c)将步骤(a)的所述显微镜系统安装在所述受试者上或者植入其体内；以及

d)在以时间调制或空间调制的方式将刺激光引导到所述受试者的组织之前、期间或之后，生成所述组织的一个或多个图像。

36.权利要求35所述的方法，其中所述受试者选自小鼠、大鼠、猫、狗、猪、牛、马、猴子、黑猩猩、红毛猩猩、大猩猩和人类。

37.根据权利要求35或权利要求36所述的方法，其中所述方法作为临床前研究的一部分来执行。

38.根据权利要求35至37中任一项所述的方法，其中所述方法作为临床研究的一部分来执行。

39.根据权利要求35至38中任一项所述的方法，其中所述方法还包括确定临床诊断测试结果。

40.根据权利要求35至39中任一项所述的方法，其中所述方法还包括以产生治疗效果的时间调制或空间调制的方式将刺激光引导到所述组织。