WO2004013344A1

WO2004013344A1 - ２−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸の製造方法

Info

Publication number: WO2004013344A1
Application number: PCT/JP2003/008600
Authority: WO
Inventors: Kazuhisa Mukai; Keiji Tsusaki; Michio Kubota; Shigeharu Fukuda; Toshio Miyake
Original assignee: Kabushiki Kaisha Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo
Priority date: 2002-08-06
Filing date: 2003-07-07
Publication date: 2004-02-12
Also published as: EP1553186A1; KR20060006888A; KR101013195B1; EP1553186A4; JP2004065098A; JP4043312B2; US20060216792A1; TWI329673B; US8759030B2; TW200404812A

Abstract

本発明の課題は、5-O-α-D-グルコピラノシル-L-アスコルビン酸及び6-O-α-D-グルコピラノシル-L-アスコルビン酸を生成しないか若しくはそれらの生成が検出できないほど少ない2-O-α-D-グルコピラノシル-L-アスコルビン酸反応方法を提供するとともに本反応方法を用いた2-O-α-D-グルコピラノシル-L-アスコルビン酸の製造方法を提供することであり、L-アスコルビン酸とα-グルコシル糖化合物とを含有する溶液にα-イソマルトシルグルコ糖質生成酵素またはα-イソマルトシルグルコ糖質生成酵素とシクロマルトデキストリン・グルカノトランスフェラーゼ(EC2.4.1.19)とを作用させ、2-O-α-D-グルコピラノシル-L-アスコルビン酸を生成せしめ、これを採取することを特徴とする2-O-α-D-グルコピラノシル-L-アスコルビン酸の製造方法を提供することで前記課題を解決する。

Description

明細書

2 -0- ο:— D—ダルコピラノシル— Lーァスコルビン酸の製造方法技術分野

本発明は、 2— 0— ひ一 D—ダルコピラノシル _ Lーァスコルビン酸の製造方法に関し、更に詳細には、 α—イソマルトシルダルコ糖質生成酵素を用いて、又は、 α—イソマルトシルダルコ糖質生成酵素とシクロマルトデキストリン ' ダルカノトランスフヱラ一ゼとを併用して糖転移反応せしめ、得られる糖転移物を含有する溶液からの 2—Ο— a _D— ダルコビラノシル— L—ァスコルビン酸の製造方法に関する。背景技術

2 _ O— ひ — D—ダルコピラノシル _ Lーァスコルビン酸は、特開平 3 - 1 3 5 9 9 2号公報、特開平 ·3 - 1 3 9 2 8 8号公報などに開示されているように、化学式 1で示される化学構造を有しており、直接還元性を示さず、安定性に優れ、しかも生体内で容易に加水分解され、 L一ァスコルビン酸本来の生理活性を発揮する Lーァスコルビン酸の糖誘導体である。

化学式 1 ：

CH₂OH

その工業的製造方法としては、特開平 3— 1 8 3 4 9 2号公報に開示されているように、例えば、 L—ァスコルビン酸と α _ダルコシル糖化合物とを含有する溶液に糖転移酵素または糖転移酵素とダルコアミラ一ゼ（E C 3. 2. 1. 3 ) とを作用させて得られる 2 — O— a—D— ダルコビラノシルー L—ァスコルビン酸とともにそれ以外の夾雑物を含有する溶液を原料溶液として、強酸性カチオン交換樹脂を用いるカラムクロマトグラフィーを行ない、この溶出液の 2—〇一 α— D—ダルコピラノシルー L—ァスコルビン酸高含有画分を採取することにより、 2 - 0- α— D—ダルコビラノシル— L—ァスコルビン酸高含有液を製造する方法、更に、これを濃縮して過飽和とし、結晶 2 — 0— ひ — D—ダルコピラノシル— Lーァスコルビン酸を製造する方法が開示されている。しかしながら、糖転移酵素または糖転移酵素とダルコアミラーゼとを作用させて得られる Lーァスコルビン酸糖誘導体は、例えば、糖転移酵素がシクロマルトデキストリン'グルカノトランスフェラ一ゼ（E C 2. 4. 1. 1 9 ) (以下、本明細書では、 C GT a s eと略することもある。）の場合には、 2 - 0- _D _ダルコピラノシル _ L—ァスコルビン酸以外に、副生成物として、その結合異性体である 5 — 0— ひ—D—ダルコピラノシル— L—ァスコルビン酸 (化学式 2 ) 及び 6 -0- a -D - ダルコピラノシルー Lーァスコルビン酸 (化学式 3 ) が生成し、また、糖転移酵素が ο;—ダルコシダ一ゼの場合には、 2 — O— a— D—ダルコピラノシル— Lーァスコルビン酸以外に、 6 —〇— a— D—ダルコピラノシル _ L—ァスコルビン酸が生成することが知られている。強酸性力チオン交換樹脂を用いるカラムクロマトグラフィーの際、原料溶液に含まれる Lーァスコルビン酸やグルコースは 2 一〇一 α— D—ダルコピラノシル— Lーァスコルビン酸と分子量が異なるために 2 —〇ー α— D— ダルコビラノシルー L—ァスコルビン酸と分離が比較的に容易であるが、一方、副生成物として生成した 5 - 0 - ひ — D—ダルコピラノシルー L ーァスコルビン酸及び 6—0— a;— D—ダルコピラノシル— L一ァスコルビン酸は 2 — 0— ひ一 D—ダルコピラノシル—Lーァスコルビン酸と分子量が同一であるために 2—〇一 α— D—ダルコピラノシル— Lーァスコルビン酸と分離が困難であり、 2—0— «— D—ダルコピラノシル一 Lーァスコルビン酸高含有画分の純度向上を妨げ、更に、過飽和溶液からの結晶 2—〇一ひ一 D—ダルコピラノシルー L—ァスコルビン酸の析出をも阻害する。

化学式 2 ：

化学式 3

更に、これら結合異性体である 5—〇— ο; — D—ダルコピラノシルー L—ァスコルピン酸及び 6 一 O— α'— D—グルコピラノシル一 Lーァス ,

4

コルビン酸は、結晶 2— 0— 一 D—ダルコピラノシルー Lーァスコルビン酸を分離除去した母液中に残存し、こ.の母液からの更なる結晶 2— 0 _ α— D—ダルコピラノシルー Lーァスコルビン酸の析出を阻害し、 2番晶、 3番晶の回収量を著しく低下させる。

5— Ο— ひ一 D—ダルコピラノシル—L—ァスコルビン酸及び 6― 0 一 α— D—ダルコピラノシル一 Lーァスコルビン酸の除去方法としては、特開平 5 - 1 1 7 2 9 0号公報に開示されているように、これら結合異性体が直接還元性を有するため酸化されやすいという特性を利用して、 2 - 0 - α - D -グルコピラノシル一 L—ァスコルビン酸とともにこれら結合異性体とを含有する溶液を酸化処理して、直接還元性を示す結合異性体だけを酸化せしめ、次いで、強酸性カチオン交換樹脂を用いる力ラムクロマトグラフィーを行なうことにより、 2 - O - —D—ダルコピラノシル— Lーァスコルビン酸と L—ァスコルビン酸糖誘導体の酸化物（以下、単に Lーァスコルビン酸糖誘導体酸化物と略称する。）とを分離し、 2—0— α—D—ダルコピラノシルー L—ァスコルビン酸高含有物を製造する方法が開示されている。

しかしながら、上記のようにして、 2— O— a— D—ダルコピラノシルー Lーァスコルビン酸とともにこれら直接還元性を示す結合異性体を含有する溶液を酸化処理するには、できるだけ、 2— Ο— α— D—ダルコピラノシルー L—ァスコルビン酸に作用することなく、直接還元性を示す結合異性体を優先的に酸化する条件が必要で、例えば、通気攪拌などの好気的条件にさらす方法が採用され、この際、 ρ Ηを弱酸性乃至ァルカリ性にしたり、銅塩、鉄塩などの金属塩、水蒸気炭、塩化亜鉛炭などの活性炭など酸化促進剤を共存させたり、過酸化水素、過マンガン酸カリウムなどの酸化剤を添加するなど操作が煩雑で、また、酸化反応が不十分であれば、直接還元性を示す結合異性体が残存し、酸化反応が過度であれば、 2— O— ο;— D —ダルコビラノシル _ Lーァスコルビン酸にまで作用が及び、結果として得られる 2—0— ひ一 D —ダルコピラノシル—L —ァスコルビン酸高含有物の収率が低下することとなるため、酸化反応の工程にはその適正な反応進行を維持するための正確な制御が必要で、それに掛かる経済的労力には多大なものがあった。

本発明は、上記のような従来の 2 - 0 - α— D _ダルコピラノシルー Lーァスコルビン酸の製造方法の欠点を解消するために為されたもので、結合異性体を分離する必要がなく、効率良く 2—〇一ひ—D —ダルコピラノシル— L—ァスコルビン酸を製造することができる 2 - 0 - a - D —ダルコピラノシル—L —ァスコルビン酸の製造方法を提供するものである。発明の開示

本発明者等は、 2—〇—《一 D _ダルコピラノシル— L 一ァスコルビン酸の製造において、その'初発工程である Lーァスコルビン酸と α —グルコシル糖化合物とを含有する溶液に糖転移酵素または糖転移酵素とグルコアミラーゼとを作用させる工程で得られる 2— Ο— α — D —ダルコピラノシル _ L —ァスコルビン酸を含有する溶液中に夾雑物である 5― 0 - α— D—ダルコピラノシルー Lーァスコルピン酸及び 6— 0—《— D _ダルコピラノシル _ L —ァスコルビン酸を生成しないか、若しくは検出されないほど生成量が少なくすることができれば、これら直接還元性を示す Lーァスコルビン酸糖誘導体を酸化処理するなどの除去工程を必要とすることなく、高純度の 2—〇一《— D —ダルコピラノシルー L ーァスコルビン酸高含有物を工業的規模で高収率に製造できるのではないかと考え、 5 —〇一 a—D _ダルコピラノシル _ Lーァスコルビン酸及び 6— Ο—《— D —ダルコピラノシル _ Lーァスコルビン酸を生成しないか若しくはそれらの生成が検出できないほど少ない 2— 0— α— D 一ダルコピラノシル— L —ァスコルビン酸生成反応の確立を目指して、研究を続けてきた。

その結果、意外にも、 Lーァスコルビン酸と —ダルコシル糖化合物とを含有する溶液に、糖転移酵素として、先に発明した国際公開番号 W 0 0 2 / 1 0 3 6 1号明細書で開示した a —イソマルトシルダルコ糖質生成酵素を作用させることによって、 2— Ο— a— D—ダルコピラノシル— L —ァスコルビン酸が著量生成し、しかも、夾雑物である 5— Ο— a—D _ダルコビラノシル—L—ァスコルビン酸及び 6— 0— a— D— ダルコピラノシル _ L—ァスコルピン酸を生成しないか若しくはそれらの生成が検出できないほど少ないことを見いだした。

更に、糖転移反応する際、該 α —イソマルトシルダルコ糖質生成酵素と C G T a s eとを併用し糖転移反応を起こさせるか、又は、これら酵素の併用による糖転移反応を起こさせ、次いで、ダルコアミラーゼを作用させることによって、得られる 2—O—ひ一 D —ダルコピラノシル一 L—ァスコルビン酸の生成量は、糖転移酵素として 0；—イソマルトシルダルコ糖質生成酵素を単独で使用する場合よりも増加し、しかも、その時の 5—〇一一 D _ダルコピラノシル一 L—ァスコルビン酸及び 6― 0— a — D —ダルコピラノシル _ L—ァスコルビン酸等の結合異性体は、糖転移酵素として α —イソマルトシルダルコ糖質生成酵素を単独で使用する場合と同様に生成しないか若しくはそれらの生成が検出できないほど少ないことも判明した。

上記のような糖転移反応によって得られる 2— O— α;— D —ダルコピラノシルー Lーァスコルビン酸を含有する糖転移反応生成物は、強酸性カチオン交換樹脂を用いるカラムクロマトグラフィーでは分離が困難であった 5 _〇一 α— D —ダルコピラノシルー L —ァスコルビン酸及び 6 一 O— α— D—ダルコピラノシルー L一ァスコルビン酸等の結合異性体を含有していないか、若しくは含有していてもその量が極めて少ないため、該クロマトグラフィ一によって目的とする 2— 0— α— D—ダルコビラノシル _ L—ァスコルビン酸が容易に、且つ高収率で分離 ·精製でき、高純度の 2—O— a—D—ダルコピラノシルー L—ァスコルビン酸高含有物を工業的規模で高収率に製造できるものである。

また、このようにして得られる高純度の 2— O— CK— D—ダルコピラノシルー Lーァスコルビン酸高含有物の過飽和溶液は、結晶の析出が容易で収率も高く、結晶 2— 0— α— D—ダルコピラノシルー L一ァスコルビン酸の工業的製造方法としてきわめて有利であることが判明した。本明細書でいう生成しないか若しくはそれらの生成が検出できないほど少ないとは、反応液固形物当り 0 . l w/w % (以下、本明細書では、特にことわらない限り、％は wZw %を意味する。）未満の生成量を意味する。また、本明細書でいう直接還元性を示すとは、 Lーァスコルビン酸の場合と同様に、そのままで、 2 , 6—ジクロルフエノールインドフェノールを還元脱色することを意味する。

また、本明細書でいう L—ァスコルビン酸とは、 Lーァスコルビン酸のみならず、 L—ァスコルビン酸のアル力リ金属塩若しくはアル力リ土類金属塩などの L—ァスコルビン酸塩、または、それらの混合物を意味する。

また、同様に、本明細書でいう 2— O— a—D—ダルコピラノシル— L—ァスコルビン酸、 5— 0—《— D—ダルコピラノシルー L一ァスコルビン酸、 6—〇一 a— D—ダルコビラノシル一 Lーァスコルビン酸、 α—ダリコシル一 Lーァスコルビン酸などについても、特に不都合が生じない限り、遊離の酸のみならず、それらの塩を意味する。

以下、本発明の α —イソマル卜シルダルコ糖質生成酵素による糖転移反応方法、または、 α —イソマルトシルダルコ糖質生成酵素と C G T a s eとの併用による糖転移方法について、より具体的に説明する。図面の簡単な説明

図 1は、ァルスロバクタ一 · グロビホルミス A 1 9由来の α —イソマル卜シルダルコ糖質生成酵素の 2— Ο— ひ一 D —ダルコピラノシル— L ーァスコルビン酸生成活性に及ぼす温度の影響を示す図である。

図 2は、ァルスロバクタ一 · グロビホルミス A 1 9由来の α —イソマルトシルダルコ糖質生成酵素の 2 - 0 - α — D _ダルコピラノシル _ L ーァスコルピン酸生成活性に及ぼす ρ Ηの影響を示す図である。発明を実施するための最良の形態

本発明で用いる α —ダルコシル糖化合物は、 α —グルコースを有する化合物であり、 α —イソマルトシルダルコ糖質生成酵素単独、または、 α —イソマルトシルダルコ糖質生成酵素と C G T a s eとの併用によつて、 L—ァスコルビン酸から 2 - 0 - a—D —ダルコピラノシルー L 一ァスコルビン酸又は Z及び 2— O 1—グリコシル— L—ァスコルビン酸を生成できるものであればよく、例えば、マルトース、マルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペン夕オース、マルトへキサオース、マルトヘプ夕オース、マルトォク夕オースなどのマルトオリゴ糖、マルトデキストリン、シクロデキストリン、アミロース、アミ口べクチン、溶性澱粉、液化澱粉、糊化澱粉、グリコーゲンなどが適宜選択できる。反応時の Lーァスコルビン酸の濃度は、通常、 1 %以上、望ましくは、約 2乃至 3 0 % ( w/ v ) であればよく、 «—ダルコシル糖化合物は、 Lーァスコルビン酸 1重量部に対して、通常、約 0 . 5乃至 3 0重量部の範囲が好適である。本発明に用いる α—ィソマルトシルダルコ糖質生成酵素は、例えば、国際公開番号 W O 0 2 / 1 0 3 6 1号明細書に記載の如く、非還元性末端の結合様式として α— 1 , ダルコシル結合を有するグルコース重合度が 2以上の糖質に対して、該糖質から、還元力を実質的に増加することなく α—ダルコシル転移することによって、非還元性末端の結合様式としてひ一 1， 6ダルコシル結合を有し、この非還元末端以外の結合様式として α— 1 ， 4ダルコシル結合を有するグルコース重合度が 3以上の糖質を生成する酵素活性を有しており、具体例としては、下記の理化学的性質を有する酵素がある。尚、前記非還元性末端の結合様式としてひ一 1 , 4ダルコシル結合を有するグルコース重合度が 2以上の糖質としては、マルトオリゴ糖、マルトデキストリン、アミロデキストリン、アミロース、アミ口べクチン、溶性澱粉、液化澱粉、糊化澱粉及びダリコ一ゲンから選ばれる 1種又は 2種以上の糖質を例示できる。

( 1 ) 作用

非還元性末端の結合様式として α— 1， 4ダルコシル結合を有するグルコース重合度が 2以上の糖.質から、還元力を実質的に増加することなく -ダルコシル転移することによって、非還元性末端の結合様式として α— 1， 6ダルコシル結合を有し、この非還元末端以外の結合様式として α— 1 , 4ダルコシル結合を有するグルコース重合度が 3以上の糖質を生成する。

( 2 ) 分子量

S D S —ゲル電気泳動法により、約 7 4， 0 0 0乃至 1 6 0 , 0 0 0 ダルトンの範囲内で分子量を有する。

( 3 ) 等電点

アンフォライン含有電気泳動法により、 p i約 3 . 8乃至 7 . 8の範囲内に等電点を有する。 ( 4 ) 至適温度

p H 6. 0、 60分間反応で、約 40乃至 5 0 °Cの範囲内で至適温度を有する。

p H 6. 0、 60分間反応で、 1 mMC a ²⁺存在下、約 45乃至 5 5 °C の範囲内に至適温度を有する。

pH 8. 4、 60分間反応で、約 6 0 °Cに至適温度を有する。または、 p H 8. 4、 60分間反応で ImM C a ² +存在下、約 6 5 °Cに至適温度を有する。

( 5) 至適 pH

3 5 °C, 60分間反応で、 pH約 6. 0乃至 8. 4の範囲内に至適 p Hを有する。

( 6 ) 温度安定性

PH 6. 0、 6 0分間保持する条件で、約 45 °C以下に温度安定域を有する。

p H 6. 0、 6 0分間保持する条件で、 1 mMC a ²⁺存在下、約 5 0 °C 以下に温度安定域を有する。

PH 8. 0、 60分間保持する条件で、約 5 5°C以下に温度安定域を有する。または、

P H 8. 0、 6 0分間保持する条件で、 1 mMC a ²⁺存在下、約 6 0 °C 以下に温度安定域を有する。

(7) pH安定性

4°C, 24時間保持する条件で、 pH約 4. 5乃至 1 0. 0の範囲内に安定 P H域を有する。

(8) N末端アミノ酸配列

チロシン一バリン一セリン一セリン一ロイシン一グリシン一ァスパラギン一口イシンーィソロイシン（配列表における配列番号 1 )、ヒスチジン一バリン―セリンーァラニン一ロイシン一グリシン一ァスパラギン一口イシン一口イシン（配列表における配列番号 2)、または、ァラニンープ口リン一口イシン一グリシン一パリン—ダル夕ミン—アルギニンーァラニン一グルタミン一フエ二ルァラニン一グルタミン一セリン一グリシン (配列表における配列番号 3) を有する場合がある。

本発明に用いる α—イソマル卜シルダルコ糖質生成酵素は、糖転移反応の供与体として、非還元性末端の結合様式が α— 1 , 4ダルコシル結合であるグルコース重合度が 2以上の糖質を用いると、 L一ァスコルビン酸に糖転移し 2— Ο— α— D—ダルコピラノシルー L—ァスコルビン酸、及び、更にこの 2— 0_ α— D—ダルコピラノシルー L—ァスコルビン酸のダルコピラノシル基に一ダルコピラノシル残基が 1個または 2個以上転移した 2— O— ひ一ダリコシルー L—ァスコルビン酸を生成する。

本発明に用いるひ一イソマルトシルダルコ糖質生成酵素としては、例えば、ァルスロパクター属及びバチルス属などに属する細菌由来の酵素があり、例えば、アルスロバクタ一 · グロビホルミス (A r t h r o b a c t e r g l o b i f o rm i s ) A 1 9株（F E RM B P - 7 5 9 0 )、バチルス ·グロビスポルス（B a c i l l u s g l o b i s p o r u s ) C 9株（F E RM B P— 7 1 4 3)、バチルス ·グロビスポルス（B a c i 1 1 u s g l o b i s p o r u s ) C 1 1株 ( F E RM B P— 7 1 44)、バチルス ·グロビスポルス（B a c i l l u s g l o b i s p o r u s ) N 7 5株（F E RM B P— 7 5 9 0) などを挙げることができる。勿論、 NTGなどの化学変異誘発剤または紫外線や照射線などを用いた人為的変異を施したり、突然変異株を分離して、一イソマルトシルダルコ糖質生成酵素高生産株などを取得し、その変異株由来の酵素も有利に利用できる。また、 α;—イソマルトシルダルコ糖質生成酵素のポリべプチドをコ一ドする遺伝子 DNAを化学合成したり、本来、該遺伝子 DNAを保有する細胞からクロ一ニングしたりして該遺伝子 DNAを得た後、該遺伝子 DN Aをそのまま、若しくは 1個または 2個以上の DNAを他の DNA に置換したり、 1個または 2個以上の DNAを欠失または付加、挿入して、同種または異種の細胞に導入し発現させた、所謂、セルフクロー二ング体及び組換え体の由来の酵素であってもよい。

本発明に用いる C GT a s eは、例えば、バチルス（B a c i 1 1 u s ) 属、クレブシ一ラ（K l e b s i e 1 1 a) 属、サーモアナエロパクタ一（Th e r mo a n a e r o b a c t e r) 属、ブレビパクテリゥム（B r e v i b a c t e r i um) 属、サーモコッカス（T h e r mo c o c c u s ) 属などに属する細菌由来の酵素が適宜選択される。また、 α—イソマルトシルダルコ糖質生成酵素の場合と同様に、 CGT a s eのポリぺプチドをコードする遺伝子 D N Aを化学合成したり、本来、該遺伝子 DNAを保有する細胞からクローニングしたりして該遺伝子 DNAを得た後、該遺伝子 DNAをそのまま、若しくは 1個または 2 個以上の DN Aを他の DN Aに置換したり、 1個または 2個以上の DN Aを欠失または付加、挿入して、同種または異種の細胞に導入し発現させた、所謂、セルフクローニング体及び組換え体の由来の酵素であってもよい。

これら糖転移酵素は、必ずしも精製して使用する必要はなく、通常は、粗酵素で本発明の目的を達成することができる。必要ならば、公知の各種方法で精製して使用してもよい。

また、使用酵素量と反応時間とは、密接な関係があり、通常は、経済性の点から約 3乃至 8 0時間で反応を終了するように酵素量が選ばれる。また、ひ一イソマルトシルダルコ糖質生成酵素と C GT a s eとを併用して使用する場合、 C GT a s eの使用量が過剰であると、 CGT a s eの糖転移反応による副生成物である 5— 0— ひ — D—ダルコピラノシルー Lーァスコルビン酸及び 6— 0 _ «— D—ダルコピラノシル _ L ーァスコルピン酸の生成量が著しく増加し、本発明の効果が発揮できなくなる。したがって、本発明に用いる CGT a s eの量は、望ましくは、基質の ο;—ダルコシル糖化合物 1グラム当り約 0. 0 1乃至 50単位の範囲から選択される。なお、ここでいう C GT a s eの酵素活性を示す単位は、 2 0mMの酢酸緩衝液（pH 5. 5) 及び 2 mMの塩化カルシゥムを含む 0. 3 % (w/v) の澱粉溶液に C GT a s eを添加し、 4 0°C, 1 0分間反応することで測定し、その酵素活性 1単位は、 1 5m gの溶液状澱粉のヨウ素呈色を完全に消失させる酵素量とする。

また、 0；—ィソマルトシルダルコ糖質生成酵素と C GT a s e とを別々の担体に固定化し、または、両酵素を同一の担体に固定化し、得られる固定化された糖転移酵素をバッチ式で繰り返し、または連続式で反応に利用することも有利に実施できる。

本発明の糖転移方法は、通常、前述の Lーァスコルビン酸と α—ダルコシル糖化合物とを含有する溶液に a—ィソマルトシルダルコ糖質生成酵素、または、ひ —イソマルトシルダルコ糖質生成酵素と C GT a s e とを加え、該両酵素が充分作用する条件、望ましくは、 11約3乃至1 0、温度 3 0乃至 7 0°Cの範囲から選ばれる反応条件にして行う。

また、反応中に L—ァスコルビン酸が酸化分解を受け易いので、できるだけ嫌気または還元状態で遮光下に維持するのが望ましく、必要ならば、チォ尿素、硫化水素などを共存させて反応させることも有利に実施できる。

本発明のひ —イソマルトシルダルコ糖質生成酵素単独、または、 a— イソマルトシルダルコ糖質生成酵素と CGT a s eとを併用して、 L一ァスコルビン酸に糖転移させると、 2 - 0 - _ D _ダルコピラノシル一 L—ァスコルビン酸が生成するとともに、 α— D —ダルコピラノシル残基が更に 1個又は 2個以上付加した 2— 0— ひ—グリコシルー Lーァスコルビン酸も混在して生成する。

以上述べたように、本発明の α —イソマルトシルダルコ糖質生成酵素単独、または、 α —イソマルトシルダルコ糖質生成酵素と C G T a s e との併用による糖転移反応を採用すると、 L —ァスコルビン酸と α—グルコシル糖化合物とから、 2— Ο— a— D—ダルコピラノシル— L—ァスコルビン酸が生成するとともに、 α— D—ダルコピラノシル残基が更に 1個又は 2個以上付加した 2—Ο— α —グリコシル— L 一ァスコルビン酸も混在して生成するものの、工業的カラムクロマトグラフィーなどで分離困難な夾雑物である 5— Ο— a—D—ダルコピラノシル— Lーァスコルビン酸など Lーァスコルビン酸の 5位水酸基への糖転移物や 6 - 0— α— D _グルコピラノシルー L —ァスコルビン酸など L—ァスコルビン酸の 6位水酸基への糖転移物の副生成は無いか検出できないほど少ない。

本発明の α—イソマルトシルダルコ糖質生成酵素単独、または、 α _ ィソマルトシルダルコ糖質生成酵素と C G T a s eとの併用による糖転移反応によって得られる生成物にダルコアミラーゼを作用させると、 2 — O— ひ — D _ダルコビラノシル _ L—ァスコルビン酸より高分子の 2 一 0— a —グリコシル— L—ァスコルビン酸のダリコシル部分の - 1 , 4結合又は α— 1 , 6結合を加水分解し、 2 —〇— α — D—ダルコビラノシルー Lーァスコルビン酸を蓄積生成させることができる。

ダルコアミラーゼの作用条件は、 2—〇一 α - D -ダルコピラノシル一 L —ァスコルビン酸より高分子の 2 — Ο— α—グリコシルー L —ァスコルビン酸を加水分解し、 2 - 0 - α — D —ダルコピラノシル一 L —ァスコルビン酸を蓄積生成させることができる条件であればよく、反応 p H、反応温度、作用量、作用時間など適当な条件で実施すればよい。また、担体結合法、架橋法、又は包括法などで固定化されたグルコアミラーゼを用いて連続式に、またはバッチ式にダルコアミラーゼ反応することも、反応後に膜分離などして、反応液とダルコアミラーゼとを別々に回収し、ダルコアミラーゼを再利用することも有利に実施できる。

通常、反応溶液は加熱するなどして酵素を失活させた後、またはそのまま、活性炭で脱色し、濾過して不溶物を除き、必要であれば濃縮する。得られる 2— O— a—D—ダルコピラノシル— L—ァスコルビン酸含有溶液は、目的とする 2—0— α— D—ダルコビラノシルー L—ァスコルビン酸とともに、夾雑物として未反応の L—ァスコルビン酸、 D—ダルコースなど中性糖質を含有している。グルコースなどの中性糖質を、公知の方法、例えば、電気透析法、ァニオン交換樹脂を用いるカラムクロマトグラフィ一法などで分離、除去、又は低減させてもよい。このようにして得られる 2— O— a— D—グルコピラノシルー L—ァスコルビン酸含有溶液を原料として、強酸性カチオン交換樹脂を用いるカラムクロマトグラフィ一を行い、 2—〇— a— D—ダルコピラノシルー L—ァスコルビン酸高含有画分を得る。

強酸性カチオン樹脂は、公知の、例えば、スルホン酸基を結合したスチレン—ジビニルベンゼン架橋共重合体樹脂の N a +型、 K +型などのァルカリ金属塩型、または、 C a ^{+ +}型、 M g ^{+ +}型などのアルカリ土類金属塩型、または H +型などが適宜使用され、市販品としては、例えば、ダゥケミカル社製造の商品名『ダウエックス 5 0 W X 8』、ローム &ハ一ス社製造の商品名『アンバーライト C G— 6 0 0 0』、東京有機化学工業株式会社製造の商品名『X T— 1 0 2 2 Ε』、三菱化学株式会社製造の商品名『ダイヤイオン S K 1 0 4』などがある。原料溶液として、例えば、目的とする 2 — 0— ひ一 D—ダルコピラノシル一 Lーァスコルビン酸とともに、 L—ァスコルビン酸、 D—ダルコースなどの夾雑物を含有する溶液を用いる場合には、強酸性カチオン交換樹脂を充填したカラムに原料溶液を流し、次いで、水で溶出し、 2— O— α— D—ダルコピラノシルー Lーァスコルビン酸高含有画分、 2 _ Ο— —D—ダルコピラノシル一 L—ァスコルビン酸 · L—ァスコルビン酸 · D—グルコース高含有画分、 Lーァスコルビン酸 · D—ダルコ一ス高含有画分などの順に複数の画分に分画して、この 2— O— Q; _ D— ダルコピラノシルー L—ァスコルビン酸高含有画分を採取することにより、容易に 2—O—ひ—D—ダルコピラノシルー Lーァスコルビン酸高含有物が製造される。

また、原料溶液をカラムに流して分画するに際し、既に得られている 2— O—ひ— D—ダルコピラノシル一 L一ァスコルビン酸 · L—ァスコルビン酸 · D―グルコース高含有画分などの 2— 0— ひ一 D—ダルコピラノシル— Lーァスコルビン酸含有画分を原料溶液の前後に、または、原料溶液とともに流すことにより、分画に要する水の使用量を減少させ、原料溶液から 2 - 0 - - Ό -グルコピラノシル— L—ァスコルビン酸高含有物を高濃度、高収率で採取することも有利に実施できる。本発明で使用される分画方式は固定床方式、移動床方式、擬似移動床方式のいずれであってもよい。

このようにして得られる本発明の 2 —〇— ひ一 D—ダルコピラノシル一 L—ァスコルビン酸高含有物、望ましくは、純度 7 0 %以上の高含有物は、溶液状であっても、また濃縮してシラップ状であっても、安定であり、その取り扱いは容易である。通常、更に濃縮して、過飽和溶液とし、結晶化して、さらに安定化した結晶 2—〇ー α— D—ダルコピラノシル— Lーァスコルビン酸を製造する。本発明で使用する晶出用 2—〇一 —D—ダルコピラノシルー Lーァスコルビン酸高含有物は、結晶 2 一〇一 α— D—ダルコピラノシルー L—ァスコルビン酸の析出を阻害する直接還元性を示す結合異性体を、初発の糖転移反応段階で実質的に含有していないので、その結晶の析出は、きわめて容易であり、結晶収率も高い。晶出方法は、通常、 2 0乃至 6 0 °Cの過飽和 2—ひ— α— D— ダルコピラノシル— L—ァスコルビン酸溶液を助晶缶【ことり、これに種結晶を望ましくは、 0 . 1乃至 2 %共存せしめて、ゆっくり攪拌しつつ徐冷し、晶出を促してマスキットにすればよい。

このように、本発明の結晶 2 - 0 - a — D—ダルコピラノシル一 L— ァスコルビン酸は、過飽和 2— Ο—《— D —ダルコピラノシルー L—ァスコルビン酸溶液に結晶 2—〇一 a— D—ダルコピラノシルー L—ァスコルビン酸を種晶として加えることにより容易に晶出させることができる。 ·

晶出したマスキットから結晶 2— 0— α — D —ダルコピラノシルー L ーァスコルビン酸粉末を製造する方法としては、結晶 2— Ο _ θί— D— ダルコピラノシルー L—ァスコルビン酸粉末を採取できる方法を適宜選択すればよく、例えば、分蜜方法、ブロック粉碎方法、流動造粒方法、噴霧乾燥方法などが挙げられる。

このようにして得られる結晶 2 - 0 - a—D —ダルコビラノシルー L —ァスコルビン酸は、その純度、晶出率によって多少変動するものの、実質的に非吸湿性または、難吸湿性であり、その結晶粉末は流動性であり、固着の懸'念もなく、その優れた特長は、次の通りである。

( 1 ) 直接還元性を示さず、きわめて安定である。

Lーァスコルビン酸とは違って、メイラード反応を起こしにくい。従つて、アミノ酸、ペプチド、蛋白質、脂質、糖質、生理活性物質などが共存しても無用の反応を起こさず、むしろ、これらの物質を安定化する。 (2) 加水分解を受けて L—ァスコルビン酸を生成し、 L—ァスコルビン酸と同様の還元作用、抗酸化作用を示す。

(3) 体内の酵素により、 Lーァスコルビン酸と D—グルコースとに容易に加水分解され、 Lーァスコルビン酸本来の生理活性を示す。

また、ビタミン E、ビタミン Pなどとの併用により、その生理活性を増強することができる。

(4) L—ァスコルビン酸と α—ダルコシル糖化合物とを経口摂取することにより、生体内で生成され、代謝される物質であることから、その安全性は極めて高い。

(5) 実質的に、非吸湿性、難吸湿性であるにもかかわらず、水に対して大きな溶解速度、溶解度を有しており、粉末、顆粒、錠剤などのビ夕ミン剤、サンドクリーム、チョコレート、チューィンガム、即席ジユース、即席調味料などの飲食物のビタミン C強化剤、呈味改善剤、酸味剤、安定剤などとして有利に利用できる。

(6) 実質的に非吸湿性または難吸湿性であり、固結しないことからその粉末は流動性であり、その取り扱いは容易で非晶質の場合と比較して、その包装、輸送、貯蔵に要する物的、人的経費が大幅に削減できる。次に実験により本発明の Lーァスコルビン酸への糖転移方法をさらに具体的に説明する。

< α—イソマル卜シルダルコ糖質生成酵素の生産 >

澱粉部分分解物『パインデックス # 4』 4. 0 % (wZv)、酵母抽出物『アサヒミースト』 1. 8 % (wZ v)、リン酸ニ力リウム 0. 1 % (w / v)、リン酸ーナトリウム ' 1 2水塩 0. 0 6 % (w/ v), 硫酸マグネシゥム · 7水塩 0. 0 5 % (w/v)、及び水からなる液体培地を、 5 00m l容三角フラスコに 1 00m lずつ入れ、オートクレーブで 1 2 1 °C, 20分間滅菌し、冷却して、ァルスロパクター · グロビホルミス A 1 9株（F ERM B P— 7 5 90) を接種し、 2 Ί。じ、 2 30 r p m で 48時間回転振盪培養したものを種培養とした。容量 3 0 Lのファ一メン夕一に種培養の場合と同組成の培地を約 2 0 L入れて、加熱滅菌、冷却して温度 2 7°Cとした後、種培養液 1 % ( v/v) を接種し、温度 27°C、 pH 6. 0乃至 9. 0に保ちつつ、 48時間通気攪拌培養した。培養後、培養物中の酵素活性を測定したところ、ひ—イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性は約 1. 1単位/ m lであった。この培養物を遠心分離（ 1 0， 0 0 0 r pm、 30分間）して回収した上清約 1 8 Lの酵素活性を測定したところ、 Q!—イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性は約 1. 0 6単位/ m 1 (総活性約 1 9， 1 0 0単位）であった。尚、 ο;—イソマルトシルダルコ糖質生成酵素の活性測定は、次のようにして測定する。マルトトリオースを濃度 2 w/v%となるよう 1 0 0 mMグリシン— N a〇H緩衝液（pH 8. 4) に溶解させ基質液とし、そ'の基質液 0. 5m 1に酵素液 0. 5m l加えて、 40°Cで 60分間酵素反応し、その反応液を 1 0分間煮沸して反応を停止させた後、その反応液中のマルトース含量を高速液体クロマトグラフィー（HPL C) 法で定量することによって行った。 α—イソマルトシルダルコ糖質生成酵素の活性 1単位は、上記の条件下で 1分間に 1 モルのマルトースを生成する酵素量と定義した。尚、 HP L Cは、『S h o d e x KS— 80 1カラム』（昭和電工株式会社製造）を用い、カラム温度 60°C、溶離液として水の流速 0. 5m 1 /m i n水の条件で行い、検出は示差屈折計『R I— 8 0 1 2』（東ソ一株式会社製造）を用いて行なった。実験 2 く α—イソマルトシルダルコ糖質生成酵素の精製 >

実験 1の方法で得た培養上清約 1 8 Lを 8 0 %飽和硫安液で塩祈して 4°C、 24時間放置した後、その塩析沈殿物を遠心分離（ 1 0, 0 0 0 r pm、 3 0分間）して回収し 1 0 mMトリス ·塩酸緩衝液（ p H 7. 5) に溶解後、同緩衝液に対して透析して粗酵素液約 8 5 0 m lを得た。 'この粗酵素液は、 a—イソマルトシルダルコ糖質生成酵素活性を約 8 , 2 1 0単位含んでいた。この粗酵素液を『D E AE _トヨパール（T o y o p e a r 1 ) 6 5 0 S』ゲル（東ソ一株式会社製造）を用いたィォン交換クロマトグラフィー（ゲル量 3 8 0 m l ) に供した。酵素活性成分は、『D E AE—トヨパール（T o y o p e a r 1 ) 6 5 0 S』ゲルには吸着し、 N a C 1濃度 0Mから 1 Mのリニアグラジェントで溶出させたところ、 α—イソマルトシルダルコ糖質生成酵素活性成分は、 N a C 1のリニアグラジェン卜でその濃度が約 0. 2 M付近で溶出した。そこで、 a—イソマルトシルダルコ糖質生成酵素活性画分を回収し、 α—ィソマルトシルダルコ糖質生成酵素活性を有する部分精製酵素標品を回収した。

得られた α—イソマルトシルダルコ糖質生成酵素活性を有する部分精製酵素標品を 1 Μ硫安を含む 1 0 mMリン酸緩衝液（ρ Η 7. 0) に対して透析し、この透析液を遠心分離して不溶物を除き、『セファクリル (S e p h a c r y l ) HR S— 2 0 0』ゲル（アマシャム ' フアルマシア ·バイォテク社製造) を用いたァフィ二ティーク口マトグラフィ一（ゲル量 5 0 0 m l ) に供した。酵素活性成分は、『セフアクリル（S e p h a c r y 1 HR S— 2 0 0』ゲルに吸着し、硫安 1 Mから 0 M に濃度低下するリ二アグラジェントで溶出させたところ、ひ—イソマルトシルダルコ糖質生成酵素活性は、硫安のリニアグラジェント濃度が約 0. 2 M付近の画分に検出された。そこで、本酵素活性画分を回収し、精製酵素標品とした。この精製の各ステップにおける α · ィソマルトシルダルコ糖質生成酵素活性を有する酵素標品の酵素活性: ；、比活性、収率を表 1に示す。

表 1 ：

精製した α—イソマルトシルダルコ糖質生成酵素標品を 7. 5 % (w / v) 濃度ポリアクリルアミドを含むゲル電気泳動により酵素標品の純度を検定したところ、蛋白バンドは単一で純度の高い酵素標品であった。実験 3

ぐ α—イソマルトシルダルコ糖質生成酵素の諸性質 >

実験 3— 1

<分子量 >

実験 2の方法で精製して得た a—イソマルトシルダルコ糖質生成酵素標品を、 SD S—ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ゲル濃度 7. 5 w/v%) に供し、同時に泳動した分子量マーカ一（日本バイオ ' ラッド · ラボラトリーズ株式会社製造）と比較して当該酵素の分子量を測定した。当該酵素の分子量は約 94， 0 0 0 ± 2 0， 0 0 0ダルトンであつた。実験 3— 2

<等電点 >

実験 2の方法で精製して得たひ一イソマルトシルダルコ糖質生成酵素標品を、 2 wZv%アンフオライン (アマシャム · フアルマシア · バイォテク社製造）含有等電点ポリアクリルアミドゲル電気泳動法に供し、電気泳動後の蛋白バンド及びゲルの p Hを測定して当該酵素ポリべプチドの等電点を求めた。その結果、当該酵素の等電点は P I約 4. 3 ± 0. 5であった。実験 3— 3

<作用温度及び ρΗ>

一イソマルトシルダルコ糖質生成酵素活性に及ぼす温度と Ρ Ηの影響について、各種温度、 ρΗ条件下、実験 1に記載の α—イソマルトシルダルコ糖質生成酵素の活性測定法に準じて調べた。その結果、至適温度は、 ρΗ 8. 4、 6 0分間反応で、約 6 0°C (C a^{2 +}非存在）又は約

6 5 °C ( 1 mMC a ²⁺存在）で、その至適 pHは、 3 5°C、 6 0分間反応で約 8. 4であった。実験 3— 4

く安定性 >

—イソマルトシルダルコ糖質生成酵素の温度安定性は、当該酵素含有溶液（ 2 0 mMグリシン— N a OH緩衝液、 pH 8. 0) を C a ²⁺非存在下または I mMC a ²⁺存在下で各温度に 6 0分間保持し、水冷した後、残存するひ一イソマルトシルダルコ糖質生成酵素活性を測定することにより求めた。又、 pH安定性は、 α—イソマルトシルダルコ糖質生成酵素を各 Ρ Ηの 5 OmM緩衝液中で 4°C、 24時間保持した後、 p H を 8 . 0に調整し、残存する酵素活性を測定することにより求めた。その結果、温度安定性は約 5 5 °Cまで（C a ^{2 +}非存在）又は約 6 0 °Cまで ( 1 mM C a ^{2 +}存在）で、 p H安定性は約 5 . 0乃至 9 . 0であった。実験 3 - 5

< N末端アミノ酸配列 >

実験 2の方法で精製して得た a—イソマルトシルダルコ糖質生成酵素について、その N末端アミノ酸配列を、『プロテインシーケンサーモデル 4 7 3 AJ (アプライドバイオシステムズ社製造）を用いて分析したところ、 α—イソマルトシルダルコ糖質生成酵素は配列表に於ける配列番号 3に示すアミノ酸配列を有することが判明した。

以上、ァルスロパクター · グロビホルミス A 1 9株由来の《—イソマルトシルダルコ糖質生成酵素の調製方法及びその性質を示したが、本発明においては、他の菌株由来の α—イソマルトシルダルコ糖質生成酵素であっても用いることができる。実験 4

< Lーァスコルビン酸への糖転移試験 >

以下に示す各種糖質が、ひ一イソマルトシルダルコ糖質生成酵素を用いる糖転移反応における糖供与体となり、 Lーァスコルビン酸へ糖転移するかどうかを試験した。すなわち、グルコース、マルトース、マルトトリオ一ス、マルトテトラオース、マルトペン夕オース、マルトへキサオース、マルトヘプ夕オース、イソマルトース、イソマルトトリオース、イソパノ一ス、トレハロース、コージビオース、ニゲロース、ネオトレハロース、セ口ビオース、ゲンチビオース、マルチトール、マルトトリィトール、ラクト一ス、スクロース、エルロース、セラギノース、マルトシルダルコシド、イソマルトシルダルコシド、 α—シクロデキストリン、 β―シクロデキストリン、 r—シクロデキストリン、アミロース、アミ口べクチン、グリコーゲン、プルラン、デキストランを含む溶液を調製した。それぞれ溶液に L—ァスコルビン酸を加えて、糖質濃度及び Lーァスコルビン酸濃度を 2 w/v%に調整した。これらの溶液に、実験 2の方法で得た精製ひ一イソマルトシルダルコ糖質生成酵素標品を糖質固形物 1グラム当たりそれぞれ 3単位ずつ加え、基質濃度を 1. 6w / V %になるように調整し、これらを 40°C、 p H 6. 0で 2 0時間作用させた。酵素反応後の 2— O— a— D—ダルコピラノシル— Lーァスコルビン酸の生成を調べるため、シリカゲル薄層クロマトグラフィ一（以下、 TL Cと略す。）を行なった。展開溶媒として n—ブ夕ノール、ピリ ' ジン、水混液（容量比 6 : 4 : 1 )、薄層プレー卜としてメルク社製造『キーゼルゲル 6 0 F 2 5 4』（アルミプレート、 2 0 X 2 0 cm) を用い 1 回展開した後、紫外線を薄層プレートに照射してァスコルビン酸及び 2 一〇一 a—D—ダルコピラノシル一 L—ァスコルビン酸検出し、 2—〇一 a— D—ダルコビラノシルー L—ァスコルビン酸生成の有無を確認した。結果を表 2に示す。

表 2

表 2の結果から明らかなように、 α—イソマルトシルダルコ糖質生成酵素は、試験した各種糖質の内、グルコース重合度が 3以上で、非還元末端にマルト一ス構造を有する糖質を糖供与体として、 L—ァスコルビン酸に糖転移し、 2— Ο— α— D—ダルコピラノシル— L一ァスコルビン酸を生成することが判明した。又、グルコース重合度が 2の糖質では、マルトース、コ一ジビオース、ニゲロース、ネオトレハロース、マルトトリイトール、エルロースにも作用し 2— Ο— ひ一 D—ダルコピラノシルー L—ァスコルビン酸を生成することが判明した。実験 5

< Lーァスコルビン酸への糖転移生成物 >

L—ァスコルビン酸を濃度 5 w/ v %、マルトペン夕オースを濃度 5 w/ v %、及び 1 mMの塩化カルシウムを含む水溶液を p H 5 . 0に調整し、これに実験 2の方法で調製した精製 α—イソマルトシルダルコ糖質生成酵素をマルトペン夕オース 1 g当たり 1 0単位になるように加えで 50°Cで 24時間反応させ、その反応液を 1 0分間煮沸して反応を停止させた後、その反応液の一部分を採り、それにダルコアミラーゼ（生化学工業株式会社製造）をマルトペンタオース 1 g当たり 40単位加え、 40°Cで 1 6時間作用させた後、 1 0分間煮沸して反応を停止させた。これら反応液中の Lーァスコルビン酸への糖転移生成物及び残存する L ーァスコルビン酸を、以下の高速液体クロマトグラフィー（HP L C) 法で分離し測定した。『Wa k o p a k WB— T— 3 30カラム』（和光純薬工業株式会社製造）を用い、カラム温度 2 5°C、溶離液として 7 0 p pm硝酸水溶液の流速 0. 5m 1 /m i nの条件で行い、検出は、ァスコルビン酸及びァスコルビン酸への糖転移物を分光光度計『UV_ 8 020』（東ソ一株式会社製造）を用いて波長 2 3 8 nm吸収で測定するとともに、ァスコルビン酸及びァスコルビン酸への糖転移物を含めた全組成を示差屈折計『R I — 8 0 20』（東ソ一株式会社製造）を用いて測定することで行ない、ァスコルビン酸及びァスコルビン酸への糖転移物の反応液固形物当りの生成量（以下、本明細書では、特に断らない限り、生成量は反応液固形物当りの生成量を意味する。）を求めた。それらの結果を表 3に示す。

表 3 ：

*： 2— Ο— a—D— ルコビラノシル一Lーァスコルビン酸に or—D- グルコビラノシル残基が更に 1個又は 2個以上付加したものを意味する _c 表 3の結果から明らかなように、 α; —イソマルトシルダルコ糖質生成酵素による Lーァスコルピン酸への糖転移生成物として、 2— 0— α— D—ダルコピラノシルー L —ァスコルビン酸が約 1 8 . 7 %生成するとともに、 2— 0— α—ρ—ダルコピラノシルー Lーァスコルビン酸とは異なる転移生成物が約 0 . 4 %生成することがわかった。また、この反応液にダルコアミラ一ゼを作用させると、 2— Ο— ひ一 D—ダルコピラノシル— Lーァスコルビン酸とは異なる転移生成物は消失し、その消失とともに 2—0— 一 D —ダルコピラノシル一 L—ァスコルビン酸量が増加し、 Lーァスコルピン酸への糖転移生成物として、 2— O— ひ — D 一ダルコピラノシルー L —ァスコルビン酸のみが生成することが判明した。ダルコアミラ一ゼの作用特性を考慮すると、 2— O— α— D —グルコピラノシルー L —ァスコルビン酸とは異なる転移生成物は、 2— Ο— a - D -グルコピラノシル— L —ァスコルビン酸に α— D—ダルコピラノシル残基が更に 1個又は 2個以上付加した 2— Ο— α—グリコシル— L —ァスコルピン酸であり、ダルコアミラーゼ作用の結果、この 2— Ο - α —グリコシル _ Lーァスコルビン酸の 1個又は 2個以上付加した — D —ダルコピラノシル残基が加水分解され、 2—〇一 α—グリコシル一 Lーァスコルビン酸が 2— 0— 一 D—ダルコピラノシル—Lーァスコルビン酸に変換されたと判断される。実験 6

く 2— O— ひ一 D—ダルコピラノシル一 Lーァスコルビン酸生成の作用温度及び p H >

α —イソマルトシルダルコ糖質生成酵素の 2—〇_ α — D—ダルコピラノシル— Lーァスコルビン酸生成活性に及ぼす温度と Ρ Ηの影響について、各種温度、 ρ Η条件下で調べた。 2 _〇ー en— D —ダルコピラノシルー Lーァスコルビン酸生成活性測定は、次のようにして測定した。

( 1 )温度の影響については、 Lーァスコルビン酸を濃度 0. 5 wZ V %、マルトペン夕オースを濃度 0. 5 w/v %、及び塩化カルシウムを濃度 1 mMとなるように 1 0 O mM酢酸緩衝液（p H 5. 0 ) に溶解させ基質液とし、その基質液 2 m 1に酵素液 0. 2 m 1加えて、 3 0乃至 6 5 °C で 3 0分間酵素反応し、その反応液を 1 0分間煮沸して反応を停止させた。その反応液中に生成した 2 - 0- α— D—ダルコピラノシル一 L一ァスコルビン酸量は、実験 5に記載の HP L C法により分離し測定することによって行った。

( 2 ) p Hの影響については、 Lーァスコルビン酸を濃度 0. 5 w/v %、マルトペン夕オースを濃度 0. 5 w/v %、及び塩化カルシウムを濃度 1 mMとなるように 1 0 0 mMの各種緩衝液に溶解させ基質液とした。緩衝液の種類は、 p H 4. 1乃至 6. 4の範囲では酢酸緩衝液を用い、 p H 6. 7乃至 7. 5の範囲ではリン酸緩衝液を用い、 p H 7. 6乃至 8. 5の範囲ではトリス ·塩酸緩衝液を用いた。その基質液 2 m 1 に酵素液 0. 2 m l加えて、 4 0 °Cで 3 0分間酵素反応し、その反応液を 1 0分間煮沸して反応を停止させた後、その反応液中に生成した 2 — O— ひ— D—ダルコピラノシルー Lーァスコルビン酸量を HP L C法で定量することによって行った。それらの結果を図 1 (温度の影響）及び図 2 (p Hの影響）に示した。

図 1から明らかなように、 α—イソマルトシルダルコ糖質生成酵素の 2 - - 一 D—ダルコピラノシル—Lーァスコルビン酸生成活性の至適温度は、 P H 5. 0、 3 0分間反応で、約 5 5乃至 6 0 °Cであった。また、図 2から明らかなように、その至適 p Hは、 4 0 ° (：、 3 0分間反応で約 5. 5であった。実験 7

く 2—〇一 α— D—ダルコピラノシルー Lーァスコルビン酸生成 >

L—ァスコルビン酸を 5 %、澱粉部分分解物（商品名『パインデックス # 1』、松谷化学株式会社製造）を 5 %及び 1 mMの塩化カルシウムを含む水溶液を p H 5 . 0に調整し、これに実験 2の方法で調製した精製ひ一イソマルトシルダルコ糖質生成酵素を澱粉部分分解物 1 g当たり 5 乃至 2 0単位になるように加えて 5 0 °Cで 4 8時間反応させた。これら反応液を約 1 0 0 °Cで 1 0分間加熱し、酵素を失活させた後、 4 0 に冷却し、ダルコアミラーゼ（生化学工業株式会社製造）を澱粉部分分解物 1 g当たり 4 0単位加え、 4 0 °Cで 1 6時間作用させた。これら反応液を実験 5に記載の H P L C法に供し、標準品として、市販の 2—〇_ ひ—D—ダルコピラノシル— L—ァスコルビン酸 (株式会社林原生物化学研究所製造）、特許第 3 1 3 4 2 3 5号明細書に記載の方法で調製した 5 _〇— α— D _ダルコピラノシル— L—ァスコルビン酸及び 6 - 0 - 一 D—ダルコピラノシルー L—ァスコルビン酸を用いて、 2— 0— Q! 一 D—ダルコピラノシルー Lーァスコルビン酸、及び 5— O— α— D— グルコピラノシル一 Lーァスコルビン酸、 6 - O - a - D -グルコピラノシルー Lーァスコルビン酸を分離し、それぞれの生成量を測定し、基質固形物当りの生成率を求めた。対照として、 _α—イソマルトシルダルコ糖質生成酵素の代わりに、バチルス 'ステア口サ一モフィルス由来の C G T a s e (株式会社林原生物化学研究所製造）を澱粉部分分解物 1 g当り 3 0 0単位用いた以外、同じ操作を行い、同様に、 2—〇一 a— D一ダルコピラノシル一 L—ァスコルビン酸、及び 5 一〇一 α— D—グルコピラノシルー Lーァスコルビン酸、 6—〇一 α— D—ダルコピラノシル— Lーァスコルビン酸の生成量を調べた。それらの結果を表 4に示す。表 4

表 4の結果から明らかなように、 α—イソマル卜シルダルコ糖質生成酵素は、ァスコルビン酸への転移物として 2 —〇ーひ一 D—ダルコピラノシルー L—ァスコルビン酸のみを生成し、他の 5 — Ο— α— D—グルコピラノシル— Lーァスコルビン酸及び 6 —0— a— D—ダルコピラノシルー L—ァスコルビン酸の生成されなかった。一方、対照の C G T a s eは、 α—イソマル卜シルダルコ糖質生成酵素とほぼ同じの 2— O— — D _ダルコピラノシルー Lーァスコルビン酸生成量であつたが、 5 — 0— α—D—ダルコピラノシル— L—ァスコルビン酸及び 6 — O— ひ一 D—ダルコピラノシルー L—ァスコルビン酸の生成量は、それぞれ、 0 . 8 %、 0 . 3 %であった。

以上の結果から、 C G T a s eのァスコルビン酸への糖転移は、ァスコルビン酸の 2位水酸基だけでなく、 5位及び 6位水酸基にも転移し、 2 —〇一 a— D—ダルコピラノシル— L—ァスコルビン酸を生成するとともに、副生成物として 5—〇一 α;— D—ダルコピラノシル一 Lーァスコルビン酸及び 6 一〇一 a—D—ダルコビラノシル _ Lーァスコルビン酸を生成するのに対して、本発明の a—イソマルトシルダルコ糖質生成酵素のァスコルビン酸への糖転移は、ァスコルビン酸の 2位水酸基のみに反応し、特異的に 2 -0- α— D—ダルコピラノシルー Lーァスコルビン酸を生成することが判明した。実験 8

<C GT a s eとの併用試験〉

L—ァスコルビン酸を 9 %、澱粉部分分解物（商品名『パインデックス # 1 0 0』、松谷化学株式会社製造）を 2 1 %及び ImMの塩化カルシゥムを含む水溶液を PH 5. 0に調整し、これに実験 2の方法で調製した精製 α—イソマルトシルダルコ糖質生成酵素を澱粉部分分解物 1 g当たり 1 0単位、 CGT a s e (株式会社林原生物化学研究所製造）を.1 乃至 1 0 0単位になるように加えて 5 0 °Cで 24時間反応させた。これら反応液を約 1 0 0°Cで 1 0分間加熱し、酵素を失活させた後、 40°C に冷却し、ダルコアミラーゼ (生化学工業株式会社製造) を澱粉部分分解物 1 g当たり 40単位加え、 40 °Cで 1 6時間作用させた。これら反応液を実験 5に記載の H P L C法に供し、 2— O— a— D—ダルコピラノシル _ L—ァスコルビン酸、及び 5—〇一 en—D—ダルコピラノシル一 L—ァスコルビン酸、 6— O— a— D—ダルコピラノシル— Lーァスコルビン酸の生成量を測定し、基質固形物当りの生成量を求めた。併せて、精製 α—イソマルトシルダルコ糖質生成酵素単独及び対照として、 C GT a s e単独で転移反応を行い同様に操作した。それらの結果を表 5に示す。表 5 ：

表 5の結果から明らかなように、 α—イソマルトシルダルコ糖質生成酵素単独の場合は、上記の実験 7の結果と同様に、ァスコルビン酸への転移物として 2 - 0- 一 D—ダルコピラノシル一 L—ァスコルビン酸のみを約 2 5 %生成量で生成し、他の 5 — O— « _D—ダルコピラノシル一 L—ァスコルピン酸及び 6 - 0- « -D -ダルコピラノシル— L― ァスコルピン酸の生成は検出されなかった。一イソマルトシルダルコ糖質生成酵素と C GT a s eとを併用した場合は、 2—0— a— D—グルコピラノシル一 Lーァスコルビン酸の生成が増加し、約 2 9乃至 3 1 %の生成量で、併用する C GT a s eの使用量が 1乃至 2単位 Zgでは 5 _〇一 α— D—ダルコピラノシル— Lーァスコルビン酸及び 6— Ο 一《— D—ダルコピラノシルー L—ァスコルビン酸の生成は検出されず，併用する C GT a s eの使用量が 5乃至 1 0単位/ gでは 5 —〇 _ α _ D _ダルコピラノシル— L—ァスコルビン酸の生成が約 0 - 1 %の生成量で検出され、併用する C GT a s eの使用量が 1 0 0単位 Zgでは 5 一〇— a—D—ダルコピラノシルー L—ァスコルビン酸及び 6—〇一 ο; 一 D—ダルコピラノシル— L—ァスコルビン酸の生成が、それぞれ 0 . 8 %及び0 . 1 %の生成量で検出された。対照の C G T a s e単独の場合、その使用量が 1乃至 2単位 Z gでは、 5— 0— α — D —ダルコピラノシルー Lーァスコルビン酸及び 6—〇一 a— D —ダルコビラノシルー L—ァスコルビン酸の生成は検出されないものの、 2 —0— a _ D—グルコピラノシルー Lーァスコルビン酸の生成量は約 4乃至 5 %と少量で、また、 C G T a s e単独の使用量が 5単位/ g以上の場合では、その使用量の増加とともに 2— O— ひ一 D —ダルコピラノシル一 L—ァスコルビン酸の生成量が約 8 %から約 3 0 %に上昇するものの、 5 _ 0— α— D—ダルコピラノシル— Lーァスコルビン酸及び Ζ又は 6 — 0— a - D —ダルコビラノシル— L —ァスコルビン酸が生成することがわかった。以上の結果から、 5 — Ο— α — D—ダルコピラノシルー L —ァスコルビン酸及び Ζ又は 6— Ο— ο;— D —ダルコピラノシル— L 一ァスコルビン酸の生成が無いか若しくは検出できない使用量の C G T a s eを、 α —イソマルトシルダルコ糖質生成酵素と併用することによって、 2 —〇一 — D —ダルコピラノシル— L —ァスコルビン酸の生成率を a; —イソマルトシルダルコ糖質生成酵素単独使用の場合より増加させ、且つ、ひ一イソマルトシルダルコ糖質生成酵素単独使用の場合と同様に、 5 — O 一 CK — D —ダルコピラノシル— Lーァスコルビン酸及び/又は 6 一 O— ο;— D—ダルコピラノシルー L —ァスコルビン酸の生成が無いか若しくは検出できないほどの極微量であることが判明した。

以下、本発明の 2—0— α — D —ダルコピラノシルー L 一ァスコルビン酸高含有物の製造'方法についての実施例を述べる。実施例 1

デキストリン（D E約 6 ) 9重量部を水 2 8重量部に加熱溶解し、還元下に保って、 Lーァスコルビン酸 3重量部を加え、 pH 5. 0、 5 0°C に維持しつつ、これに実験 2の方法で調製した α—イソマルトシルダルコ糖質生成酵素活性を有する部分精製酵素標品をデキストリン 1グラム当り 8単位加えて 42時間反応させた。次に、反応液を加熱して酵素を失活させた後、 5 5°Cに調整し、これにダルコアミラ一ゼをデキストリン 1 g当り 5 0単位加えて、 1 6時間反応させた。

反応液を HP L Cで分析したところ、 2 - O -ひ — D—ダルコピラノシル— L—ァスコルビン酸を固形物当り約 2 4. 9 %含有しており、 5. 一 O— α—D—ダルコピラノシル— Lーァスコルビン酸及び 6 -0- a 一 D_ダルコピラノシル— L—ァスコルビン酸は検出されなかった。さらに、本反応液を加熱して酵素を失活させ、活性炭で脱色濾過し、濾液をカチオン交換樹脂 (H +型）のカラムにかけ脱ミネラルし、次いで、ァニオン交換樹脂（OH—型）のカラムにかけァニオンを樹脂に吸着させ、水洗して D—グルコースなどを除去後、 0. 5規定一塩酸溶液で溶出、濃縮した。

濃縮液を HP L Cで分析したところ、 2— O— ひ一 D—ダルコピラノシル— L—ァスコルビン酸を固形物当り約 5 2. 5 %、 L—ァスコルビン酸を固形物当り約 3 9 %含有しており、 5— 0— α— D—ダルコピラノシル— L—ァスコルビン酸及び 6— Ο— α— D _ダルコピラノシルー L—ァスコルビン酸は 0. 1 %未満であった。本濃縮液を原料溶液として、強酸性カチオン交換樹脂（ローム &ハース社製造、商品名『アンバ一ライト C G— 6 0 0 0』、 Η +型）を充填したカラムクロマトグラフィ一を行い、この溶出液の 2—〇一 a—D—ダルコピラノシルー Lーァスコルビン酸高含有画分を採取した。

本画分を H P L Cで分析したところ、 2—〇一 α— D—ダルコピラノシル— Lーァスコルビン酸を固形物当り約 9 3. 6 %含有しており、 5 一 O— Q; _D—ダルコピラノシルー Lーァスコルビン酸及び 6 -0- 一 D—ダルコピラノシルー Lーァスコルピン酸は 0 . 1 %未満であった。本画分を減圧濃縮して濃度約 7 7 %とし、これを助晶缶にとり、結晶 2 -0 - -Ό -ダルコビラノシルー Lーァスコルビン酸を種晶として 2 %加えて 4 0 °Cとし、ゆっくり攪拌しつつ、徐冷して 2日間を要して 2 0 °Cまで下げ、更にバスケット型遠心分離機にかけ、結晶一 0— ひ一 D一ダルコピラノシルー Lーァスコルビン酸を原料の L—ァスコルビン酸に対して収率約 46 %で得た。また、母液として、 2— O— ひ一 D— ダルコピラノシル— L—ァスコルビン酸を固形物当り約 8 2. 3 %含有する溶液を原料の L—ァスコルビン酸に対して固形物収率約 2 8 %で回収した。

本結晶 2 - 0 - α—D—ダルコピラノシル— Lーァスコルビン酸品は、直接還元性をしめさず、安定性、生理活性も充分で、ビタミン C強化剤としてばかりでなく、呈味改善剤、酸味剤、安定剤、品質改良剤、抗酸化剤、生理活性剤、紫外線吸収剤、医薬原料、化学品などとして、飲食物、抗感受性疾患剤、化粧品などに有利に利用できる。実施例 2

実施例 1の方法で回収した母液を濃縮後、実施例 2の方法に準じて、強酸性カチオン交換樹脂を用いるカラムクロマトグラフィーを行い、この溶出液の 2 - O- a - D -ダルコピラノシルー L—ァスコルビン酸高含有画分を採取した。本画分を H P L Cで分析したところ、 2 — O— Q; 一 D—ダルコピラノシルー Lーァスコルビン酸を固形物当り約 9 3 .

0 %含有しており、 5 -〇一 α— D -ダルコピラノシルー Lーァスコルビン酸及び 6—〇— α—D—ダルコビラノシル—L—ァスコルビン酸は

0 . 1 %未満であった。さらに、本画分を、実施例 1の方法に準じて、濃縮、晶出、分蜜し、結晶 2— O— a—D—ダルコピラノシルー L—ァスコルビン酸を母液固形物当り収率約 6 3 %で得た。

本品は、実施例 1の場合と同様に、飲食物、抗感受性疾患剤、化粧品などに有利に利用できる。実施例 3

ァルスロバクタ一 · グロビホルミス A 1 9株（F ERM B P— 7 5 9 0) を常法に従って、変異剤としてニトロソグァ二ジンを用いて変異させ、 α;—イソマルトシルダルコ糖質生成酵素高生産且つ 0；—イソマルトシル転移酵素非生産株を取得した。この変異株を、実験 1の方法に準じて、澱粉部分分解物『パインデックス # 4』 4. 0 % (wZv)、酵母抽出物『アサヒミースト』 1. 8 % (wZv)、リン酸ニ力リウム 0. 1 % (w/v)、リン酸ーナトリウム · 1 2水塩 0. 06 % (wZv)、硫酸マグネシウム · 7水塩 0. 0 5 % (wZv)、及び水からなる液体培地で 7 2時間通気攪拌培養した。培養後、培養液中の酵素活性を測定したところ、 α—イソマルトシルダルコ糖質生成酵素活性は約 1 4単位 Zm 1 で、 a; -イソマルトシル転移酵素活性は検出されなかった。得られた培養液を、常法に従って、 S F膜で除菌し、 UF膜で濃縮し、 α _イソマルトシルダルコ糖質生成酵素活性を有する濃縮液を得た。得られた濃縮液の酵素活性を測定したところ、 α—イソマルトシルダルコ糖質生成酵素活性は約 3 5 0単位 Zm 1であった。

とうもろこし澱粉を濃度約 2 0 %の澱粉乳とし、これに炭酸カルシゥム 0. 1 %加え、 pH 6. 5に調整し、 α—アミラーゼ（商品名『ターマミ一ル 6 0 L』、ノポ社製造）を澱粉グラム当たり 0. 3 %加え、 9 5°C で 1 5分間反応させ、次いで 1 2 0°Cに 2 0分間オートクレープし、更に約 5 3 °Cに急冷して D E約 4の液化溶液を得、この液化溶液 8 8重量部に L —ァスコルビン酸 1 2重量部を加え、 p H 5 . 0、 5 3 °Cに維持しつつ、これに上記のひ一イソマルトシルダルコ糖質生成酵素活性を有する濃縮液をデキストリン 1グラム当り 1 0単位と C G T a s e (株式会社林原生物化学研究所製造）をデキストリン 1グラム当り 1単位加えて 3 6時間反応させた。

反応液を加熱して酵素を失活させた後、 5 5 °Cに調整し、これにダルコアミラーゼをデキストリン l g当り 5 0単位加えて、 1 6時間反応させた。反応液を H P L Cで分析したところ、 2— O— α — D —ダルコピラノシルー L —ァスコルビン酸を固形物当り約 3 3 . 5 %含有しており、 5— 0— — D _ダルコピラノシル— L—ァスコルビン酸及び 6 — O— α— D —ダルコピラノシルー Lーァスコルピン酸は検出されなかった。本反応液を加熱して酵素を失活させ、活性炭で脱色濾過し、濾液を力チオン交換樹脂（Η +型）のカラムにかけ脱ミネラルし、次いで、ァニオン交換樹脂（O H—型）のカラムにかけァニオンを樹脂に吸着させ、水洗して D—グルコースなどを除去後、 0 . 5規定一塩酸溶液で溶出、濃縮し、 2— 0— en— D —ダルコピラノシル— L —ァスコルビン酸を固形物当り約 5 6 . 1 %含有する濃縮液を得た。

本濃縮液を原料溶液として、実施例 1の方法に準じて強酸性カチオン交換樹脂を用いたカラムクロマトグラフィ一を行い、この溶出液の 2— 〇— α—D—ダルコピラノシル—L—ァスコルビン酸高含有画分を採取し、 2一〇— α — D —ダルコピラノシルー L —ァスコルビン酸を固形物当り約 9 6 . 4 %含有する 2 _〇— α — D—ダルコピラノシルー L —ァスコルビン酸高含有画分を得た。

本画分を減圧濃縮して濃度約 7 7 %とし、これを助晶缶にとり、結晶 2 —〇一ひ—D —ダルコビラノシルー Lーァスコルビン酸を種晶として 1 %加えて 4 0 °Cとし、ゆっくり攪拌しつつ、徐冷して 2日間を要して 2 0 まで下げ、更にバスケット型遠心分離機にかけ、 1番晶結晶として 2— 0— α — D —ダルコピラノシルー Lーァスコルビン酸を原料の L ーァスコルビン酸に対して固形物収率約 4 8 %で得た。また、母液として、 2 -〇— α— D _ダルコピラノシル— L—ァスコルビン酸を固形物当り約 8 6 . 7 %含有する溶液を原料の Lーァスコルビン酸に対して固形物収率約 2 6 %で回収した。

得られた母液を、活性炭で脱色濾過し、濃縮して、実施例 2の方法に準じて、強酸性カチオン交換樹脂を用いるカラムクロマトグラフィーを行い、この溶出液の 2 - O - a - D -ダルコピラノシル— Lーァスコルビン酸高含有画分を採取した。

本画分を H P L Cで分析したところ、 2 — 0 _ a — D—ダルコピラノシル— Lーァスコルビン酸を固形物当り約 9 6 . 3 %含有しており、 5 — Ο— α— D —ダルコピラノシル _ L —ァスコルビン酸及び 6 - 0 - α 一 D—ダルコピラノシル _ L —ァスコルビン酸は 0 . 1 %未満であった。本画分を、実施例 1の方法に準じて、濃縮、晶出、分蜜し、 2番晶結晶として 2 — Ο— - Ώ -ダルコピラノシル一 L —ァスコルピン酸を母液固形物当り収率約 6 5 %で得た。

上記の方法で得られた 1番晶及び 2番晶の結晶 2 — O— a—D —ダルコピラノシル— Lーァスコルビン酸をそれぞれ乾燥し、混合して粉碎して、純度 9 9 %以上の結晶 2 —〇_ α— D—ダルコビラノシル— L —ァスコルビン酸粉末を原料の L —ァスコルビン酸に対して固形物収率約 6 0 %で得た。

本品は、直接還元性をしめさず、安定性、生理活性も充分で、ビタミン C強化剤としてばかりでなく、呈味改善剤、酸味剤、安定剤、品質改良剤、抗酸化剤、生理活性剤、紫外線吸収剤、医薬原料、化学品などとして、飲食物、抗感受性疾患剤、化粧品などに有利に利用できる。実施例 4

国際公開番号 WO O 2 / 1 0 3 6 1号明細書に記載の方法に準じて、澱粉部分分解物『パインデックス # 4』 4. 0 % (w/v), 酵母抽出物『アサヒミースト』 1. 8 % (wZv)、リン酸二カリウム 0. 1 % (w /v)、リン酸一ナトリウム · 1 2水塩 0. 0 6 % (wZv)、硫酸マグネシゥム · 7水塩 0. 0 5 % (wZv)、及び水からなる液体培地を用いて、バチルス ·グロビスポルス C 1 1株（F E RM B P - 7 1 44) を 4 8時間通気攪拌培養し、遠心分離（1 0， 0 0 0 r pm、 3 0分間）して回収した培養上清を 8 0 %飽和硫安液で塩祈し、透析した後、『セファビーズ（S e p a b e a d s ) F P— DA 1 3』ゲル（三菱化学株式会社製造）を用いたイオン交換クロマトグラフィー、続いて、『セファクリル（S e p h a c r y l ) HR S— 2 0 0』ゲル（アマシャム ' フアルマシア ·バイオテク社製造を用いたァフィ二ティークロマ卜グラフィ一、更に『ブチル—トヨパール（B u t y l — T o y o p e a r l ) 6 5 0 M』ゲル（東ソ一株式会社製造）を用いた疎水クロマトグラフィ ―、再度『セフアクリル（S e p h a c r y l ) HR S— 2 0 0』ゲルを用いたァフィ二ティークロマトグラフィーを行い、 —イソマルトシルダルコ糖質生成酵素活性を約 2， 0 0 ひ単位有する精製酵素標品を得た。

デキストリン（DE約 6) 6重量部を水 3 0重量部に加熱溶解し、還元下に保って、 L—ァスコルビン酸 4重量部を加え、 pH 5. 0、 40°C に維持しつつ、これに上記の ο;—イソマルトシルダルコ糖質生成酵素活性を有する精製酵素標品をデキストリン 1グラム当り 1単位と C GT a s e (株式会社林原生物化学研究所製造）をデキストリン 1グラム当り 2単位加えて 2 4時間反応させた。反応液を加熱して酵素を失活させた後、 5 5 °Cに調整し、これにダルコアミラーゼをデキストリン 1 g当り 5 0単位加えて、 1 6時間反応させた。この反応液を加熱して酵素を失活させ、活性炭で脱色濾過し、濾液を得た

濾液を H P L Cで分析したところ、 2— O— 一 D—ダルコピラノシル—L—ァスコルビン酸を固形物当り約 1 0 . 2 %含有しており、 5― 0 - α—D —ダルコピラノシルー L—ァスコルビン酸及び 6 _ 0— α— D—ダルコピラノシル _ L—ァスコルビン酸は検出されなかった。濾液をカチオン交換樹脂（Η +型）のカラムにかけ脱ミネラルし、次いで、ァニオン交換樹脂（〇Η _型）のカラムにかけァニオンを樹脂に吸着させ、水洗して D—グルコースなどを除去後、 0 . 5規定一塩酸溶液で溶出、濃縮し、実施例 1の方法に準じて強酸性カチオン交換樹脂を用いたカラムクロマトグラフィ一を行い、 2— Ο _ α— D—ダルコビラノシル _ Lーァスコルビン酸高含有画分を採取し、減圧濃縮して濃度約 7 7 %とし、これを助晶缶にとり、結晶 2—O— a—D —ダルコピラノシルー L —ァスコルビン酸を種晶として 2 %加えて 4 0 °Cとし、ゆつくり攪拌しつつ、徐冷して 2日間を要して 2 0 °Cまで下げ、更にバスケット型遠心分離機にかけ、純度 9 8 %以上の結晶 2— 0— ο;— D—ダルコピラノシルー L —ァスコルビン酸を原料の L —ァスコルピン酸に対して固形物収率約 1 1 %で得た。 · 本品は、直接還元性をしめさず、安定性、生理活性も充分で、ビタミン C強化剤としてばかりでなく、呈味改善剤、酸味剤安定剤、品質改良剤、抗酸化剤、生理活性剤、紫外線吸収剤、医薬原料、化学品などとして、飲食物、抗感受性疾患剤、化粧品などに有利に利用できる。産業上の利用可能性

以上説明したように、本発明は、 2—〇一 a;— D—ダルコピラノシル —Lーァスコルビン酸の製造方法に関し、より詳細には、 α —イソマルトシルダルコ糖質生成酵素を用いて、又は、 α—イソマル卜シルダルコ糖質生成酵素とシクロマルトデキストリン · ダルカノトランスフェラーゼとを併用して、 L—ァスコルビン酸に糖転移反応させ、 2— Ο— a— D—ダルコピラノシル— Lーァスコルビン酸を生成せしめる反応を利用した 2— Ο— α—D—ダルコピラノシル一 L—ァスコルビン酸の製造方法に関する発明である。斯かる本発明によれば、糖転移物中には、 2— 0— ひ一 D—ダルコビラノシル一 L—ァスコルビン酸の結合異性体である 5— O— a - D -ダルコビラノシルー Lーァスコルビン酸及び 6— Ο 一 α— D—ダルコピラノシルー Lーァスコルビン酸が生成してないか若しくはそれらの生成が検出できないほど少なく、糖転移物から 2— Ο— a— D—ダルコビラノシルー L—ァスコルビン酸を採取する工程において、これら結合異性体の悪影響を受けることなく有利に 2— Ο— a— D 一ダルコビラノシル _ L—ァスコルビン酸を採取することができる。斯かる本発明によれば、斯界に於いて有用な 2 — 0 _ α— D—ダルコピラノシルー Lーァスコルビン酸を工業的に大量かつ安価に高収率で製造し得る。

Claims

請求の範囲

1. Lーァスコルビン酸と a—ダルコシル糖化合物とを含有する溶液に α—イソマルトシルダルコ糖質生成酵素または α—イソマルトシルグルコ糖質生成酵素とシクロマルトデキス卜リン ' ダルカノトランスフェラーゼ（E C 2. 4. 1. 1 9 ) とを作用させ、 2 -O- a -D -ダルコピラノシル— L—ァスコルビン酸を生成せしめ、これを採取することを特徵とする 2—〇一一D—ダルコピラノシル _ Lーァスコルビン酸の製造方法。

2. a—イソマルトシルダルコ糖質生成酵素又は α—イソマル卜シルグルコ糖質生成酵素とシクロマルトデキストリン ' ダル力ノトランスフエラ一ゼとを作用させた後に、ダルコアミラーゼ（E C 3. 2. 1. 3) を作用させることを特徴とする請求の範囲第 1項記載の 2— O— a— D -ダルコピラノシルー Lーァスコルビン酸の製造方法。

3 · 2—〇ー CK— D—ダルコピラノシル— L—ァスコルビン酸を生成せしめるに際し、 5— O— a -D-ダルコピラノシルー L—ァスコルビン酸及び 6—〇一 α— D _ダルコピラノシル一 L—ァスコルビン酸を生成しないか若しくはそれらの生成が検出できないほど少ないことを特徴とする請求の範囲第 1項又は第 2項記載の 2—〇— ひ一 D _ダルコピラノシル _ L—ァスコルビン酸の製造方法。

4. 一ダルコシル糖化合物が、マルトオリゴ糖、マルトデキス卜リン、シクロデキス卜リン、アミロース、アミ口べクチン、溶性澱粉、液化澱粉、糊化澱粉、及びグリコーゲンから選ばれる 1種又は 2種以上の糖質である請求の範囲第 1項、第 2項又は第 3項に記載の 2—〇一 α— D— ダルコピラノシルー Lーァスコルビン酸の製造方法。

5. 生成する 2 -0- α一 D—ダルコピラノシルー L—ァスコルビン酸が、反応液固形物当り 2—0— α— D _ダルコピラノシルー L 一ァスコルビン酸を 1 0 wZw %以上含有し、且つ、反応液固形物当り 5 — 0— a - D -ダルコピラノシルー Lーァスコルビン酸及び 6 一 Ο— α — D— ダルコビラノシル _ Lーァスコルビン酸を 0 . 1 w/w %未満含有することを特徴とする請求の範囲第 1項乃至第 4項のいずれかに記載の 2— 〇一 α — D—ダルコピラノシルー L'—ァスコルビン酸の製造方法。

6 . 2— Ο— α— D _ダルコピラノシルー L _ァスコルビン酸を採取する工程に於いて、強酸性カチオン交樹脂を用い、更に、必要に応じて、粉末化工程又は結晶化工程を含むことを特徴とする請求の範囲第 1項乃至第 5項のいずれかに記載の 2 — Ο— ひ—D—ダルコピラノシル— L 一ァスコルビン酸の製造方法。

7 . 2 - 0 - α _ D—ダルコピラノシルー L 一ァスコルビン酸を採取する工程に於いて、 2 - 0 - a — D —ダルコピラノシルー L —ァスコルビ ' ン酸をシラップ状、粉末状又は結晶状で採取することを特徴とする請求の範囲第 1項乃至第 6項のいずれかに記載の 2— 0 _ CK — D —ダルコピラノシルー L _ァスコルビン酸の製造方法。

8 . L —ァスコルビン酸と α —ダルコシル糖化合物とを含有する溶液に α —イソマルトシルダルコ糖質生成酵素または —イソマルトシルグルコ糖質生成酵素とシクロマルトデキストリン ' ダルカノトランスフェラ一ゼとを作用させ、 2—〇一 α— D—ダルコピラノシルー L—ァスコルビン酸を生成せしめる L—ァスコルビン酸への糖転移方法。

9 . a -ダルコシル糖化合物が、マルトオリゴ糖、マルトデキストリン、シクロデキストリン、アミロース、アミ口べクチン、溶性澱粉、液化澱粉、糊化澱粉、及びグリコーゲンから選ばれる 1種又は 2種以上の糖質である請求の範囲第 8項記載の Lーァスコルビン酸への糖転移方法。