WO2003091430A1 - GLUCOSE DEHYDROGENASE β-SUBUNIT AND DNA ENCODING THE SAME - Google Patents

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WO2003091430A1
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Koji Sode
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Koji Sode
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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)

Definitions

  • the present invention relates to a cytochrome ⁇ 3 constituting the] 3 subunit of glucose dehydrogenase, DNA encoding the same, and uses thereof.
  • Glucose dehydrogenase is useful for glucose sensors and the like using enzyme electrodes. Background art
  • Biosensors using enzymes that specifically react with specific substrates are being actively developed regardless of the industrial field.
  • glucose sensors which are one of the biosensors, have been actively developed in the medical field mainly for measuring methods and devices using the measuring methods.
  • a glucose sensor was reported in 1962 by C 1 ark and Lyons as a biosensor that combined glucose oxidase and an oxygen electrode (L. c Clark, J. and Lyonas, C. "Elec rode system tems”).
  • 105: 20-45 which has been around forty years since the first publication of the book, "Ann, ny Acad. Sci. 105: 20-45".
  • glucose oxidase has been used as an enzyme in the Darcos sensor for a long time.
  • glucose oxidase has high substrate specificity for glucose, is excellent in thermostability, enables mass production of enzymes, and is inexpensive to produce compared to other enzymes. .
  • the high substrate specificity leads to the advantage that the enzyme does not react with sugars other than glucose, so that accurate measurements can be performed without errors in the measured values.
  • the fact that the thermostability is excellent can prevent the problem that the enzyme is denatured by heat and the enzyme activity is deactivated, leading to the advantage that accurate measurement can be performed for a long period of time.
  • glucose oxidase has the above advantages, but also has a problem that it is affected by, for example, dissolved oxygen, which affects measurement results.
  • glucose sensor using glucose dehydrogenase hereinafter also referred to as “glucose dehydrogenase” or “GDH”.
  • GDH glucose dehydrogenase
  • the development of sa has been carried out.
  • enzymes have also been found in microorganisms. For example, glucose dehydrogenase derived from the genus Bacillus (EC1.1.1.47) and glucose dehydrogenase derived from the genus Cryptococcus (EC1.1.1.119) are known.
  • glucose dehydrogenase (EC1.1.1.47) is an enzyme that catalyzes the reaction of i3-D-glucose + NAD (P) + ⁇ D- ⁇ -darconolactone + NAD (P) H + H +
  • Glucose dehydrogenase (EC1.1, 1.119) is an enzyme that catalyzes the reaction of D-glucose + NADP + ⁇ D_ (5-darconolactone + NADPH + H +), as described above.
  • the microorganism-derived glucose dehydrogenase is already commercially available.
  • glucose dehydrogenases have the advantage that they are not affected by the dissolved oxygen in the measurement sample. This means that even when measuring in an environment where the oxygen partial pressure is low, or when measuring a high-concentration sample that requires a large amount of oxygen, accurate measurements can be made without causing errors in the measurement results. Leads to the advantage of being able to.
  • This enzyme is a hetero-oligomeric enzyme composed of a catalytic subunit ( ⁇ subunit), an electron transfer subunit () 3 subunit) and an asubunit of unknown function with high heat resistance. And at 75 ° C.
  • the ⁇ and ⁇ ⁇ subunit genes have been cloned, and the microorganism belongs to Burkholderia cepacia, and) the 3 subunit N
  • the terminal amino acid sequence has also been clarified (Ken Inose, Master's Thesis, Tokyo University of Agriculture and Technology (2001)).
  • the structure of the 3) subunit gene has not yet been reported.
  • the present inventor further proceeded with research on the G dish of the Burkholderia cepacia KS1 strain, succeeded in isolating DNA encoding the GDHjS subunit, and completed the present invention. '
  • the present invention is as follows.
  • (4) further includes a base sequence consisting of base numbers 121-187 of SEQ ID NO: 15 DNA according to (3).
  • a method for producing a glucose dehydrogenase complex comprising culturing the transformant according to (10) to produce a glucose dehydrogenase complex as an expression product of the DNA, and collecting the resultant.
  • the present inventors searched for and isolated DNA encoding a subunit of the Burkholderia 'sephasia KS1 strain.
  • the strain was commissioned on September 25, 2000 to the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST), Patent Organism Depositary Center (1-1, Tsukuba East, Ibaraki, Japan 305-8566, Japan) Deposited under the number FERM BP-7306.
  • AIST National Institute of Advanced Industrial Science and Technology
  • Patent Organism Depositary Center (1-1, Tsukuba East, Ibaraki, Japan 305-8566, Japan
  • the DNA encoding the GDHjS subunit may be referred to as the DNA of the present invention, “jS subunit structural gene” or simply “] 3 subunit gene”.
  • GDH produced by the strain Burkholderia 'sephasia KS1 is a multimeric protein containing an ⁇ subunit, a 0 subunit, and an ⁇ subunit.
  • the protein of the present invention is a jS subunit among these subunits.
  • GDH spectrophotometric analysis shows that the absorption wavelength of oxidized GDH is The absorption wavelengths are similar to the absorption wavelengths of alcohol dehydrogenase and aldehyde dehydrogenase made of the dehydrogenase zetocytochrome complex of Novacta sp. And Acetopa sp., And this absorption is lost by heat treatment. This, and the difference in the optimal reaction temperature of GDH between the presence and absence of [3] subunit shown below, suggested that the [beta] -subunit is composed of cytochrome C.
  • the ⁇ subunit alone exhibits the following physicochemical properties.
  • the i3 subunit can be obtained together with other subunits by purifying the GDH complex from a culture of the strain Burkholderia cepacia KS1 using GDH activity as an index.
  • GDH activity can be measured by a method similar to the known method for measuring GDH activity. Specifically, for example, it can be measured as follows. Enzyme samples were prepared in lOmM potassium phosphate buffer (pH 7.0) containing 594 M 1-methoxyphenazine methosulfate (mPMS) and 5.94 M 2,6-dichlorophenol phenol indophenol (DCIP). Add glucose as substrate and incubate at 37. Using a spectrophotometer, follow the change in the absorbance of DCIP at 600 nm. The rate of decrease in absorbance is defined as the enzyme reaction rate.
  • nucleotide sequence of the gene encoding the j8 subunit (SEQ ID NO: 15) has been elucidated by the present invention, a DNA having this nucleotide sequence or the same amino acid sequence as the amino acid sequence encoded by the DNA is encoded.
  • the j3 subunit can also be produced by expressing the desired DNA in an appropriate host.
  • the amino acid sequence that can be encoded by the open reading frame (0RF) of SEQ ID NO: 15 is shown in SEQ ID NO: 16.
  • the N-terminal amino acid sequence of the 3 subunit was consistent with amino acids 23-38 of SEQ ID NO: 16. Therefore, amino acid numbers 1-22 are presumed to be signal peptides.
  • the first amino acid residue is described as Val, but it is highly likely that it is Met, and may be missing after translation.
  • the iS subunit of the present invention has an amino acid sequence consisting of amino acid numbers 23 to 425 of SEQ ID NO: 16 in an amino acid sequence of 23 to 425, and preferably 1 to 1 as long as it can function as the / 3 subunit of GDH. It may be a protein having an amino acid sequence in which 0, more preferably 1 to 5 amino acid residues have been substituted, deleted, inserted, or added.
  • the function as the / 3 subunit of GDH means that it functions as cytochrome C without impairing the enzyme activity of GDH.
  • the DNA of the present invention is a DNA encoding the above-mentioned 3) subunits, and can be obtained, for example, from the strain BK1 strain KS1.
  • the DNA of the present invention was isolated from the chromosomal DNA of the strain Burkholderia cepacia KS1.
  • the DNA of the present invention can be obtained, for example, by PCR using primers having the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOS: 13 and 14 and using the chromosomal DNA of the strain Burkholderia * sepacia KS1 as type III. it can. Further, since the nucleotide sequence and the amino acid sequence encoded by the nucleotide sequence have been clarified by the present invention, it can also be obtained by chemical synthesis based on these sequences.
  • the DNA of the present invention encodes a protein having an amino acid sequence consisting of amino acids 23 to 425 of SEQ ID NO: 16, and in this amino acid sequence, 1 to 20, preferably 1 to 10, more preferably May have an amino acid sequence in which 1 to 5 amino acid residues are substituted, deleted, inserted, or added, and may encode a protein that functions as a GDH / 3 sanit.
  • DNA of the present invention examples include a DNA containing a base sequence consisting of base numbers 187 to 1398 of SEQ ID NO: 15.
  • the DNA of the present invention may be a DNA that hybridizes with SEQ ID NO: 15 or a probe prepared from this sequence under stringent conditions and encodes a protein capable of functioning as a J3 subunit. Good.
  • Stringent conditions include conditions in which DNAs having homology of 70%, preferably 80%, and more preferably 90% or more are hybridized, specifically, 1 XSSC, 0.1% SDS, 60 are listed.
  • a GDHjS subunit can be manufactured.
  • the DNA encoding the GDHjS subunit of the present invention further contains an ⁇ subunit.
  • the GDH complex can be produced by expressing the DNA together with the DNA encoding the unit or, further, with the DNA encoding the subunit.
  • the DNII fragment that continuously encodes the subunit and the ⁇ -subunit can be obtained by PCR using a primer having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NOS: 18 and 19.
  • microorganisms that produce GDH jS subunits or GDH complexes include intestinal bacteria such as Escherichia coli, Gram-negative bacteria such as Pseudomonas sp. And Darconobacter sp., And Bacillus bacteria such as Bacillus subtilis.
  • intestinal bacteria such as Escherichia coli
  • Gram-negative bacteria such as Pseudomonas sp.
  • Darconobacter sp. And Bacillus bacteria such as Bacillus subtilis.
  • Bacillus bacteria such as Bacillus subtilis.
  • Examples include positive bacteria, yeasts such as Saccharomyces cerevisiae, and filamentous fungi such as Aspergillus niger, but are not limited thereto, and any host microorganism suitable for producing a heterologous protein can be used.
  • a vector constructed for gene recombination from a plasmid or phage capable of autonomous growth in a host microorganism is suitable.
  • the vector for Escherichia coli include PBR322, PUC18, pUC118, pUC19, pUC119, pTrc99A, pBluescript or the cosmid SuperCos I.
  • the transfer from the vector once used for cloning of the DNA of the present invention to another recombinant vector suitable for expression or the like is performed by using a restriction enzyme or PCR method from the recombinant vector holding the DNA of the present invention. Can be easily performed by recovering and combining with other vector fragments.
  • the transformation of microorganisms by these vectors is carried out by, for example, the combi- gent cell method by calcium treatment for bacteria belonging to the genus Escherichia, the protoplast method for bacteria belonging to the genus Bacillus, the KU and KUR methods for yeast, and micromanipulation for filamentous fungi.
  • This can be done by a method such as the law.
  • an electro-boration method can also be widely used.
  • the selection as to whether or not the target recombinant vector has been transferred to the host microorganism may be made using a drug resistance marker or the like of a vector holding the target DNA as an indicator. For example, a microorganism that grows on a selective medium based on a drug resistance marker and that produces GDH may be selected.
  • the culture form of the transformant may be selected in consideration of the nutritional and physiological properties of the host, and in most cases, liquid culture is used. Industrially, aeration and agitation culture is recommended. It is profitable.
  • the carbon source may be any assimilable carbon compound, for example, glucose, sucrose, lactose, maltose, lactose, molasses, pyruvic acid and the like.
  • the nitrogen source may be any nitrogen compound that can be used, for example, peptone, meat extract, yeast extract, casein hydrolyzate, alkali extract of soybean meal, and the like.
  • phosphates, carbonates, sulfates, salts such as magnesium, potassium, iron, manganese, and zinc, specific amino acids, and specific vitamins are used as needed.
  • the culture temperature can be appropriately changed within a range in which the bacteria grow and produce the protein of the present invention, but is preferably about 20 to 42.
  • the cultivation time varies somewhat depending on the conditions, but the cultivation may be completed at an appropriate time in consideration of the time when GDH reaches the maximum yield, and is usually about 12 to 72 hours.
  • the pH of the medium can be appropriately changed within a range in which the bacteria grow and produce the protein of the present invention, but is preferably in the range of about pH 6.0 to 9.0.
  • the culture solution containing the cells producing the protein of the present invention in the culture can be directly collected and used, but generally, when the protein of the present invention is present in the culture solution, filtration is performed according to a conventional method. It is used after separating the solution containing the protein of the present invention from the microbial cells by centrifugation or the like.
  • the cells are collected from the obtained culture by means such as filtration or centrifugation, and then the cells are subjected to a mechanical method or an enzymatic method such as lysozyme.
  • the protein of the present invention is solubilized by adding a chelating agent such as EDTA and a surfactant, if necessary, and separated and collected as an aqueous solution.
  • the protein-containing solution obtained as described above is concentrated by, for example, concentration under reduced pressure, membrane concentration, salting-out treatment with ammonium sulfate, sodium sulfate, or the like, or by fractional precipitation using a hydrophilic organic solvent such as methanol, ethanol, acetone, or the like. You only have to settle.
  • Heat treatment and isoelectric point treatment are also effective purification means. Thereafter, purification by appropriately combining gel filtration with an adsorbent or a gel filtration agent, adsorption chromatography, ion exchange chromatography, and affinity chromatography is performed, whereby the purified invention of the present invention is obtained. Get protein be able to.
  • the purified enzyme preparation is preferably purified to the extent that it shows a single band on electrophoresis (SDS-PAGE), but may contain ⁇ -subunit or asubunit.
  • the purified enzyme obtained as described above can be distributed as a powder by, for example, freeze-drying, vacuum drying, spray drying, or the like.
  • the 3-subunit and ⁇ -subunit of the present invention can be used as an enzyme electrode of a Darcos sensor.
  • a carbon electrode, a gold electrode, a platinum electrode, or the like is used, and the GDH of the present invention is immobilized on the electrode.
  • the immobilization method include a method using a crosslinking reagent, a method of enclosing in a polymer matrix, a method of coating with a dialysis membrane, a photocrosslinkable polymer, a conductive polymer, and a redox polymer.
  • An electronic media such as a derivative may be immobilized in a polymer together with the sun or adsorbed and immobilized on an electrode, or may be used in combination.
  • the glucose dehydrogenase of the present invention is immobilized on a carbon electrode using dartartaldehyde, and then treated with a reagent having an amine group to block dartartaldehyde.
  • the measurement of the glucose concentration can be performed as follows. Put the buffer solution in the thermostat cell and add the media to keep the temperature constant. As the media one day, a ferricyanide rim, phenazine methosulfate and the like can be used. An electrode on which the enzyme of the present invention is immobilized is used as a working electrode, and a counter electrode (for example, a platinum electrode) and a reference electrode (for example, an Ag / AgC1 electrode) are used. After applying a constant voltage to the carbon electrode and the current becomes steady, add a sample containing glucose and measure the increase in current. The concentration of glucose in the sample can be calculated according to the calibration pressure generated by the standard concentration glucose solution.
  • the GDH complex containing the three subunits of the present invention can be a component of a saccharide assay kit such as glucose.
  • the kit will contain the GDH complex plus the required buffer for the assay, mediator, and calibration Includes standard solutions such as glucose for making tubes, as well as guidelines for use.
  • the enzyme according to the invention can be provided in various forms, for example as a lyophilized reagent or as a solution in a suitable storage solution.
  • a chromosomal gene was prepared from Burkholderia cepacia KS1 strain according to a conventional method. That is, the same strain was prepared using TL liquid medium (10 g of polypeptone, 1 g of yeast extract, 5 g of NaCl, 2 g of KH2PO4, 5 g of glucose; 1 L, pH 7.2) at 34 ° C. Shake. The grown cells were collected by a centrifuge. The cells were suspended in a solution containing 10 mM NaCl, 20 mM TrisHCl (pH 8.0), ImM EDTA, 0.5% SDS, 100 g / ml proteinase K, and treated at 50 for 6 hours. did.
  • GDH purified in the same manner as in Example 2 was concentrated by freeze-drying, and developed by SDS-electrophoresis using 12.5% polyacrylamide to separate ⁇ -subunit.
  • the ⁇ -subunit thus obtained was transferred to a polyvinylidene fluoride membrane, and the ⁇ -terminal amino acid sequence was determined using an amino acid sequencer (manufactured by Shimadzu Corporation, PPSQ-10).
  • an amino acid sequencer manufactured by Shimadzu Corporation, PPSQ-10
  • Transformants were selected from LB agar medium containing 10 g / ml neomycin and 25 g / ml ampicillin according to the antibiotic resistance on SuperCos I, neomycin resistance and ampicillin resistance.
  • the obtained transformant was cultured in LB liquid medium. After harvesting these transformed cells, they were suspended in a reagent for measuring GDH activity, and clones were selected based on the dehydrogenase activity against glucose as an index. As a result, a clone showing glucose dehydrogenase activity of one strain was obtained.
  • the nucleotide sequence of the inserted DNA fragment of pKS1 was determined according to restriction enzyme analysis and a conventional method. As a result, a DNA sequence encoding the N-terminal amino acid sequence of the ⁇ subunit identified in 2> was confirmed in the input DNA fragment, and an open reading frame containing this sequence was found. Was.
  • the determined nucleotide sequence and the nucleotide sequence The resulting amino acid sequence is as shown in SEQ ID NOs: 1 and 3.
  • SEQ ID NOs: 1 As will be described later, of the base sequence of SEQ ID NO: 1, the base sequence of base number 238 and after codes the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4, and encodes the] 3-subunit. It was estimated that Reference Example 2 Production of GDH ⁇ subunit by recombinant Escherichia coli
  • a vector was prepared using the structural gene of the ⁇ -subunit, and a transformant was produced using the vector.
  • a gene to be inserted into a vector was prepared as follows.
  • amplification was carried out by a PCR reaction so as to include a desired restriction enzyme site.
  • the following set of oligonucleotide primers was used for the PCR reaction.
  • Escherichia coli DH5aMCR strain was transformed with the above plasmid pFLAG-CTS / ⁇ , and colonies generated on an LB agar medium containing 50 g / ml of ampicillin were collected.
  • the pKS1 inserted fragment was searched for an open reading frame upstream of the ⁇ -subunit and found to encode a polypeptide composed of 168 amino acid residues newly described in SEQ ID NO: 2.
  • a structural gene consisting of 507 bases (base numbers 258 to 761 in SEQ ID NO: 1) was found. This structural gene was thought to encode an assabunit. Since the existence of the region encoding the asubunit was found upstream of the ⁇ -subunit coding region, a recombinant vector containing a polycistronic gene in which the asubunit and the ⁇ -subunit were continuous was prepared, and the vector was constructed. A transformant into which one was introduced was constructed.
  • a gene to be inserted into a vector was prepared as follows.
  • Amplification was carried out by PCR using a genomic fragment derived from the ⁇ S1 strain as a template, in which the structural gene of the subunit and the structural gene of the a subunit were continuous, so as to include the desired restriction enzyme site.
  • the following set of oligonucleotide primers was used in the PCR reaction.
  • Ncol / is the cloning site of the vector pTrc99A (Pharmacia). Inserted into Hindlll. The resulting plasmid was named pTrc99A / r + ⁇ .
  • Escherichia coli DH5otMCR strain was transformed with the plasmid pTrc99A / ⁇ + ⁇ , and colonies generated on an LB agar medium containing 50 50g / ml of ampicillin were collected.
  • ⁇ -subunits were produced using the Escherichia coli DH5aMCR strain transformed with the respective plasmids of pKSl pFLAG-CTS / and pTrc99A / r + ⁇ .
  • Each transformant was inoculated into 3 ml of LB medium containing 50 g / ml of ampicillin, cultured at 37 for 12 hours, and cells were collected by centrifugation. After crushing the cells with a French press (1500 kgf), the membrane fraction (10 mM potassium phosphate buffer PH6.0) was separated by ultracentrifugation (4, 160 x 400 g for 90 minutes).
  • Reference Example 3 Confirmation of GDH activity
  • Transformant culture membrane fraction with pFLAG-CTS / ⁇ incorporating only sperm subunit has the lowest GDH activity and efficiently constructed vector
  • the transformant culture membrane fraction with pTrc99A / r + Q! showed the highest GDH activity.
  • ⁇ -subunit is expressed even in a transformant using a vector consisting only of the ⁇ -subunit structural gene, efficient use of a vector combining the asubunit structural gene with the ⁇ -subunit structural gene allows for efficient use. ⁇ -subunit was obtained.
  • Glucose was synthesized using the glucose dehydrogenase of the present invention.
  • the enzyme activity of the glucose dehydrogenase ( ⁇ -subunit) of the present invention was measured at various concentrations of glucose.
  • GDH activity was measured using lOmM potassium phosphate buffer (PH7.0) containing 594 / ⁇ methylphenazine methosulfate (mPMS) and 5.94 M 2,6-dichlorophenol indophenol (DCIP). Went inside.
  • the obtained base sequence contained 0RF considered to be the C-terminal of GDH and 0RF considered to be a cytochrome c structural gene consisting of 1275 bp (SEQ ID NO: 11).
  • the amino acid sequence encoded by the same 0RF is shown in SEQ ID NO: 12.
  • the nucleotide sequence of the obtained 12315 strain was compared with the already cloned KS1 strain a subunit base sequence. Downstream contained high nucleotide sequence homology to a nucleotide sequence encoding a signal base peptide of J2315 strain cytochrome c.
  • the third 0RF (from base number 2386 of SEQ ID NO: 1) in the cloning fragment of the strain Burkholderia cepacia KS1 obtained in Reference Example 1 was ⁇ It was presumed to encode one subunit.
  • the amino acid sequence at the N-terminus of the purified / 3-subunit and the five amino acid residues translated by the nucleotide sequence of nucleotides 2452 to 2466 in SEQ ID NO: 1 were also identical. 0RF was considered to code for the J3 Subunit.
  • the KS1 strain was shake-cultured at 37 with 5 ml of a complete medium (0.5% polypepton, 0.3% yeast extract, 0.5% NaCl).
  • a genome was extracted from the obtained cells using GennomicPrep TM Cells and Tissue DNA Isolation Kit (Amersham Pharmacia Biotech). The method followed the attached manual.
  • GennomicPrep TM Cells and Tissue DNA Isolation Kit (Amersham Pharmacia Biotech). The method followed the attached manual.
  • the obtained genome was subjected to phenol / cloth-form treatment, precipitated with ethanol, and then dissolved in purified water.
  • the genome extracted from the KS1 strain was digested with BamHI, EcoRI, HindllL Smal, Sacl and Xhol, and the genomic fragment was recovered by ethanol precipitation.
  • the genomic Ig digested with the restriction enzyme was subjected to a ligation reaction at 16, using a DNA ligation kit (Takara Shuzo Co., Ltd.).
  • Forward primer (EF1 SEQ ID NO: 13) 50 pmol
  • reverse primer (ER1 SEQ ID NO: 14) 50 pmol (all primers were commissioned by Invitrogen) designed from the nucleotide sequence of the N-terminal signal sequence region of KS1 strain GDHi3 subunit ), LATa q (Takara Bio Inc.) 0.5 ml, dNTP solution 8 ⁇ 1, 10X PCR buffer, add purified water to a total volume of 501, and perform PCR using Program Temp Control System PC-801 (ASTEC). went.
  • the PCR reaction was performed under the following conditions. 94: 5 minutes, 98V 20 seconds, 30 seconds, 30 cycles, 726 minutes, 72 10 minutes.
  • the obtained plasmid was treated with RNase, 0.6 volumes of 20% PEG6000 / 2.5M NaCl was added thereto, and left on ice for 1 hour. Thereafter, the mixture was centrifuged at 15000 rpm at 4 for 15 minutes to obtain pellets. This was washed with 70% ethanol, and the pellet was dried under vacuum. This was dissolved in purified water.
  • the nucleotide sequence of the inserted fragment of the plasmid obtained in (2) was analyzed using ABI PRISM TM 310 Genetic Analyzer (PERKIN-ELMER Applised Biosystems). The partial sequence of the inserted fragment was determined from the multiple cloning site of the vector using the M13 primer, and as a result, a base sequence containing the 3-subunit N-terminus was confirmed. Using this sequence as a clue, primers were sequentially prepared and used to determine the nucleotide sequence of the inserted fragment. The result is shown in SEQ ID NO: 15. The amino acid sequence encoded by 0RF contained in this nucleotide sequence is shown in SEQ ID NO: 16. .
  • 3 subunits are composed of a total of 425 amino acid residues. Compared to the N-terminal amino acid sequence already obtained, 22 of them are considered to be signal peptides. The molecular weight calculated from the amino acid sequence was 45,276 Da. . ; 3-subunit amino In the acid sequence, three binding motifs to heme (SEQ ID NO: 18) were confirmed in cytochrome c. This 0RF was located immediately downstream of 0RF of the ⁇ -subunit structural gene, and a sequence considered to be an SD sequence was present upstream of the start codon.
  • the GDHjS subunit structural gene of the KS1 strain has 92.0% homology at the nucleotide sequence level and 92.2% at the amino acid level with the GDHjS subunit structural gene of the 12315 strain.
  • the present invention provides a GDH / 3 subunit of a microorganism belonging to the genus Burkholderia and a DNA encoding the same.

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Description

明細書 グルコース脱水素酵素) 3サブユニット及びそれをコードする D N A 技術分野
本発明は、 グルコース脱水素酵素の ]3サブュニットを構成するチ卜クロ一ム<3、 それをコードする D N A、 及びそれらの利用に関する。 グルコース脱水素酵素は、 酵素電極を用いたグルコースセンサ等に有用である。 背景技術
特定の基質に対して特異的に反応する酵素を用いたバイオセンサの開発は、 産 業の分野を問わず盛んに行われている。 その中でも特にバイオセンサの 1つであ るグルコースセンサは、 主に医療分野で測定方法やその方法を利用した装置の開 発が盛んに行われている。 例えばグルコースセンサは、 1962年に C 1 a r kと L y o n sによってグルコースォキシダーゼと酸素電極を組み合わせたバイオセン サ一の報告 (L. c Cl ark, J. and Lyonas, C. " El ec t rode sys tems for cont inuous m oni t or ing in cardi ovascul ar surgery. " Ann, n. y. Acad. Sc i . 105 : 20-45) が最初 にされて以来、 約 40年ほどの歴史を有している。
このように、 ダルコ一スセンサに、 酵素としてグルコースォキシダ一ゼが採用 されてからの歴史は長い。 なぜならグルコースォキシダーゼは、 グルコースに対 する基質特異性が高く、 熱安定性に優れており、 更に酵素の量産化が可能であり、 生産コストが他の酵素と比べて安価である、 からである。 基質特異性が高いとい うことは、 酵素がグルコース以外の糖とは反応しないため、 測定値に誤差を生じ ることなく、 正確な測定が行なえるという利点に通じる。 また、 熱安定性に優れ ているということは、 酵素が熱により変性し酵素活性が失活するという問題を防 止することができ、 長期間正確な測定が行えるという利点に通じる。
しかし、 グルコースォキシダーゼは、 上記の様なメリットを有している反面、 例えば溶存酸素の影響を受け、 測定結果に影響があるという問題も有している。 一方、 グルコースォキシダーゼ以外には、 グルコース脱水素酵素 （以下、 「グ ルコースデヒドロゲナーゼ」 又は 「GDH」 ともいう） を利用したグルコースセン サの開発も行われてきた。 そして、 酵素も、 微生物から発見されている。 例えば、 バチルス （Bacillus) 属由来のグルコースデヒドロゲナ一ゼ （EC1.1.1.47) 及び クリプトコッカス （Cryptococcus) 属由来グルコースデヒドロゲナーゼ （EC1.1. 1.119) が知られている。
前者のグルコースデヒドロゲナ一ゼ （EC1.1.1.47) は、 i3— D—グルコース + NAD (P) + →D- δ—ダルコノラクトン + NAD(P)H + H+の反応を触媒する酵素であ り、 後者のグルコースデヒドロゲナ一ゼ （EC1.1, 1.119) は、 D—グルコース +N ADP+ →D_ (5—ダルコノラクトン + NADPH+H+の反応を触媒する酵素であり、 前 述した微生物由来のグルコースデヒドロゲナーゼは、 既に市販もされている。
これらグルコースデヒドロゲナーゼは、 測定サンプルの溶存酸素の影響を受け ないという利点を有する。 このことは、 酸素分圧が低い環境下で測定を行ったり、 酸素量が多く要求される高濃度サンプルを測定する場合であっても、 測定結果に 誤差を及ぼさずに正確に測定することができるという利点に通じる。
しかし、 従来に見られるグルコースデヒドロゲナ一ゼは、 溶存酸素の影響を受 けない一方、 熱安定性が悪く、 基質特異性がグルコースォキシダ一ゼよりも劣る という問題点を有しており、 センサに採用される酵素として、 グルコースォキシ ダーゼやグルコースデヒドロゲナーゼの両欠点を補う酵素の提供が望まれていた。 尚、 本発明者は Sode， K.， Tsugawa, W.， Yamazaki,T.， Watanabe, M. , Ogasawara, N. , andTanaka, M. , (1996) Enzyme Microb. Technol.19， 82- 85.や、 Yamazaki, T. , T suga a,W..and Sode,K. , (1999)Appli Biochemi and Biotec.77— 79/0325や、 Yama zakl,T.,Tsugawa,W. ,and Sode,K. , (1999)Biotec Let t.21, 199— 202において、 温 泉近くの土壌より採取した試料を用い、 GDHについての研究結果を報告している。 この試料中の微生物が産出する GDHは補酵素結合型であり、 すでに至適反応温度、 熱安定性、 基質特異性などの酵素学的性質が明らかとなっている （前記文献） 。 本酵素は高い耐熱性を持つ触媒サブユニット （αサブユニット） 、 電子伝達サブ ユニット （)3サブユニット） 、 機能不明のアサブユニットから構成されているへ テロオリゴマー酵素であり、 活性のピークを 45でと 7 5 °Cに持つ。 また、 ァ、 ひサブュニット遺伝子はクローニングされており、 上記微生物がブルクホルデリ ァ 'セパシァ （Burkholderia cepacia) に属すること、 及び )3サブユニットの N 末端アミノ酸配列も明らかにされている （猪瀬 健、 東京農工大学修士論文 （20 01年） ） 。 しかし、 ）3サブユニット遺伝子の構造は未だ報告されていない。 発明の開示 本発明は、 ブルクホルデリァ属微生物の GDH サブュニットをコ一ドする DN A、 及びその利用法を提供することを課題とする。
本発明者は、 ブルクホルデリア ·セパシァ KS1株の G皿に関する研究をさらに 進め、 GDHjSサブユニットをコードする DNAを単離することに成功し、 本発明 を完成するに至った。 '
すなわち、 本発明は以下のとおりである。
(1) 以下の （A) または （B) に示すタンパク質。
(A) 配列番号 1 6のアミノ酸番号 23〜425からなるアミノ酸配列を少な くとも有するタンパク質。
(B) 配列番号 1 6のアミノ酸番号 23〜425からなるアミノ酸配列におい て、 1〜20個のアミノ酸残基が置換、 欠失、 挿入、 又は付加されたアミノ酸配 列を有し、 グルコース脱水素酵素 ]3サブュニットとして機能し得るタンパク質。
(2) 以下の （A) 又は （B) のタンパク質をコードする DNA。
(A) 配列番号 1 6のアミノ酸番号 23〜425からなるアミノ酸配列を少な くとも有するタンパク質。
(B) 配列番号 1 6のアミノ酸番号 23〜425からなるアミノ酸配列におい て、 1〜20個のアミノ酸残基が置換、 欠失、 挿入、 又は付加されたアミノ酸配 列を有し、 グルコース脱水素酵素) 3サブュニットとして機能し得るタンパク質。
(3) 以下の （a) 又は （b) に示す DNAである（2)に記載の DNA。
(a) 配列番号 1 5の塩基番号 187〜1 398からなる塩基配列を含む DN
A。
(b) 配列番号 1 5の塩基番号 187〜1 398からなる塩基配列とストリン ジェン卜な条件下でハイブリダィズし得る D N A。
(4) さらに配列番号 1 5の塩基番号 1 2 1〜 1 8 7からなる塩基配列を含む (3)に記載の DNA。
(5) (2)〜（4)のいずれかに記載の DNAを含有する組換えべクタ一。
(6) (2)〜（4)のいずれかに記載の DN A又は（5)の組換えべクタ一で形質転換 された形質転換体。 -
(7) (6)に記載の形質転換体を培養して、 前記 DNAの発現産物としてダルコ ース脱水素酵素 /3サブュニットを産生させ、 これを採取するグルコース脱水素酵 素 /3サブュニッ卜の製造方法。
(8) さらにブルクホルデリア ·セパシァのグルコース脱水素酵素 αサブュニッ ト及びアサブュニットをコ一ドする塩基配列を含む（3)又は（4)に記載の DNA。
(9) (8)に記載の DNAを含有する組換えべクタ一。
(10) (8)に記載の DNA又は（9)に記載の組換えベクターで形質転換された形 質転換体。 '
( 1 1) (10)に記載の形質転換体を培養して、 前記 DNAの発現産物としてダル コース脱水素酵素複合体を産生させ、 これを採取するグルコース脱水素酵素複合 体の製造方法。 発明を実施するための最良の形態
以下、 本発明を詳細に説明する。
本発明者らは、 ブルクホルデリア 'セパシァ KS1株の サブュニットをコ一 ドする DNAを検索し、 単離した。 同菌株は、 2000年 9月 25日に、 独立行 政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センタ一 （〒305- 8566 日本国茨城県つ くば巿東 1丁目 1番地 1 中央第 6) に受託番号第 FERM BP-7306として寄託され ている。 本明細書において、 GDHjSサブユニットをコードする DNAを、 本発明 の DNA、 「jSサブユニット構造遺伝子」 又は単に 「]3サブユニット遺伝子」 と いうことがある。
本発明者らは、 ブルクホルデリア 'セパシァ KS1株が産生する GDHは、 αサブ ユニット、 0サブユニット、 及ぴァサブユニットを含む多量体タンパク質である ことを確認している。 本発明のタンパク質は、 これらのサブユニットのうち、 jS サブユニットである。 GDHの分光光度解析により、 酸化型 GDHの吸収波長はダルコ ノバクタ一 S p. 、 ァセトパクター s p. のデヒドロゲナ一ゼチトクローム複合 体でできているアルコールデヒドロゲナ一ゼおよびアルデヒドデヒドロゲナーゼ の吸収波長と類似しており、 熱処理によりこの吸収は失われる。 このことと、 下 記に示す ]3サブュニットの有無による GDHの至適反応温度の相違から、 βサブュ ニットはチトクローム Cからなつていることが示唆された。
以下に、 上記 GDHの理化学的性質を示す。
①作用：
グルコースの脱水素反応を触媒する。
②還元条件下での S D S—ポリアクリルアミドゲル電気泳動において、 分子量約 60 kD aと分子量約 43 k Daを示すサブュニットからなる。
③ TSK g e l G 3000 SW (東ソ一 （株） 製） を用いたゲル濾過クロマ トグラフィ一において、 分子量約 380 kDaを示す。
④至適反応温度：
45で付近 （T r i s _HC 1緩衝液、 pH 8. 0) 。
また、 αサブユニット単独では、 以下の理化学的性質を示す。
① 'グルコース脱水素酵素活性を有する。
② '還元条件下での SD S—ポリアクリルアミドゲル電気泳動において、 分子量 約 60 kD aを示す。
③ '至適反応温度：
75で付近 （T r i s— HC 1緩衝液、 pH8. 0) 。 i3サブユニットは、 ブルクホルデリア ·セパシァ KS1株の培養物から、 GDH活性 を指標として GDH複合体を精製することにより、 他のサブュニットとともに取得 することができる。 GDH活性は、 公知の GDHの活性測定と同様の方法で測定するこ とができる。 具体的には、 例えば次のようにして測定することができる。 594 M の 1ーメトキシフエナジンメトサルフエ一ト（mPMS)および 5.94 Mの 2, 6-ジクロ 口フエノールインドフエノール（DCIP)を含む lOmMリン酸カリゥム緩衝液（pH7.0) に、 酵素試料および基質としてグルコースを基質として加え、 37 でインキュべ —トする。 分光光度計を用いて DCIPの 600nmにおける吸光度変化を追跡し、 当該 吸光度の減少速度を酵素反応速度とする。
また、 本発明により j8サブユニットをコードする遺伝子の塩基配列 （配列番号 1 5) が明らかにされたので、 この塩基配列を有する DNA又は同 DNAがコ一 ドするアミノ酸配列と同じアミノ酸配列をコードする DN Aを適当な宿主で発現 させることによつても j3サブュニットを製造することができる。 配列番号 1 5の オープンリーディングフレーム （0RF) がコードし得るアミノ酸配列を、 配列番 号 1 6に、 示す。 タンパク質から決定した )3サブユニットの N末端アミノ酸配列 は、 配列番号 1 6のアミノ酸番号 2 3〜38と一致していた。 したがって、 アミ ノ酸番号 1〜2 2はシグナルペプチドであると推定される。 尚、 配列番号 1 5及 び 1 6において、 第 1番目のアミノ酸残基は Valと記載されているが、 Metである 可能性が高く、 また、 翻訳後に脱落している可能性がある。
上記アミノ酸配列について BLASTによるホモロジ一検索を行ったところ、 ラル ストニア *ソアナセアルム （Ralstonia solanacearum) 由来のォキシドレダク夕 ーゼ脱水素酵素のシトクロム cサブュニットと 65¾、 ダルコノバクタ一 ·ォキシ ダンス （Gluconobacter oxydans) 由来のソルビトール脱水素酵素のシトクロム cサブユニットと 48¾、 エルビニァ 'シプリぺデイイ （Eriwinia cypripedii) 由 来のダルコン酸脱水素酵素のシトクロ一ム cサブュニットと 44%、 パントエア · シトレア （Pantoea citrea) 由来 2—ケト—ダルコン酸脱水素酵素のシトクロ一 ム cサブユニットと塩基配列レベルで 5 5. Ί %、 アミノ酸レベルで 46. 4 % と、 全体にわたって高い相同性を示していた。 またこれらのシトクロ一ム cのァ ミノ酸配列中には、 ヘム結合モチーフ （配列番号 1 8) 配列が保存されていた。 これらのことから、 本発明の /3サブュニットがチトクローム Cであることが示さ れた。
本発明の iSサブユニットは、 GDHの /3サブユニットとして機能し得る限り、 配 列番号 1 6のアミノ酸番号 2 3〜42 5からなるアミノ酸配列において、 1〜2 0個、 好ましくは 1〜 1 0個、 より好ましくは 1〜5個のアミノ酸残基が置換、 欠失、 挿入、 又は付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質であってもよい。 尚、 GDHの /3サブユニットとして機能するとは、 GDHの酵素活性を損なわずに チトクローム Cとして機能することをいう。 本発明の DNAは、 上記) 3サブユニットをコードする DNAであり、 例えばブ ルクホルデリア ·セパシァ KS1株から取得することができる。 本発明の DNAは、 本発明を完成する過程においては、 ブルクホルデリア ·セパシァ KS1株の染色体 DNAから単離された。 本発明の DNAは、 例えば、 配列番号 1 3及び 14に示 す塩基配列を有するプライマ一を用い、 ブルクホルデリア *セパシァ KS1株の染 色体 DNAを铸型とする PCRによって、 取得することができる。 また、 本発明に よりその塩基配列及び同塩基配列によってコードされるアミノ酸配列が明らかと なったので、 これらの配列に基づいて化学合成することによつても取得すること ができる。 また、 前記配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプローブと するハイプリダイゼーシヨンによって、 ブルクホルデリア 'セパシァ KS1株の染 色体 DNAから取得することもできる。 また、 ブルクホルデリア，セパシァの他 の菌株からも、 同様にしてバリアントを取得することができる。
本発明の DN Aは、 配列番号 16のアミノ酸番号 23〜 425からなるァミノ 酸配列を有するタンパク質をコードするものの他、 このアミノ酸配列において、 1〜20個、 好ましくは 1〜 1 0個、 より好ましくは 1〜5個のアミノ酸残基が 置換、 欠失、 挿入、 又は付加されたアミノ酸配列を有し、 かつ、 GDH/3サュニッ トとして機能するタンパク質をコ一ドするものであってもよい。
本発明の DN Aとしては、 具体的には、 配列番号 1 5の塩基番号 187〜13 98からなる塩基配列を含む DNAが挙げられる。 また本発明の DNAは、 配列 番号 1 5又はこの配列から調製され得るプロ一ブとストリンジェントな条件下で ハイプリダイズし、 かつ、 J3サブユニットとして機能し得るタンパク質をコード する DNAであってもよい。 ストリンジェントな条件としては、 70%、 好まし くは 80 %、 より好ましくは 90 %以上の相同性を有する DNA同士がハイプリ ダイズする条件、 具体的には、 1 X S S C、 0. 1 %SDS、 60 が挙げられ る。
本発明の DN A又は同 DN Aを含む組換えベクターを保持する形質転換体を培 養して、 同 DNAの発現産物として GDHiSサブユニットを産生させ、 これを菌体 又は培養液から採取することにより、 GDHjSサブュニットを製造することができ る。 その際、 本発明の GDHjSサブユニットをコードする DNAは、 さらに αサブ ュニットをコードする D N A、 又はさらにアサブュニットをコードする D N Aと ともに発現させることによって、 GDH複合体を製造することができる。 アサブュ ニット及び αサブュニットを連続してコードする D N Α断片は、 配列番号 1 8及 び 1 9に示す塩基配列を有するプライマ一を用いた PCRによって、 取得すること ができる。
GDH jSサブュニット又は GDH複合体を産生させる微生物としては、 大腸菌をはじ めとする腸内細菌群、 シユードモナス属ゃダルコノバクタ一属などのグラム陰性 細菌、 バチルス ·サブチリス等のバチルス属細菌をはじめとするグラム陽性細菌、 サッカロマイセス ·セレピシェ等の酵母、 ァスペルギルス ·二ガー等の糸状菌が 挙げられるが、 これらに限られず、 異種タンパク質生産に適した宿主微生物であ れば用いることができる。
本発明の D N Aのクローニング又は発現に使用するべクタ一としては、 宿主微 生物内で自律的に増殖し得るプラスミド又はファージから遺伝子組換え用として 構築されたものが適している。 ェシエリヒア ·コリ用のベクターとしては、 PBR3 22、 PUC18, pUC1 1 8, pUC19, pUC1 19, pTrc99A, pBl uescr iptあるいはコスミドで ある SuperCos Iなどが例示される。 一旦本発明の D N Aのクローニングに使用し たベクターより、 発現等に適した他の組換えベクターへの移入は、 本発明の D N Aを保持する組換えべクタ一から制限酵素や PCR法により同 D N Aを回収し、 他 のべクタ一断片と結合させることにより容易に実施できる。 また、 これらのべク 夕一による微生物の形質転換は、 例えばェシエリヒア属細菌ではカルシウム処理 によるコンビテントセル法、 バチルス属細菌ではプロトプラスト法、 酵母では K U法や K U R法、 糸状菌ではマイクロマニュピレーシヨン法等の方法によって行 うことができる。 また、 エレクトロボレ一シヨン法も広く用いることができる。 宿主微生物への目的組換えベクターの移入の有無についての選択は、 目的とす る DNAを保持するべクタ一の薬剤耐性マーカー等を指標とすればよい。 例えば、 薬剤耐性マーカ一に基づく選択培地で生育し、 かつ GDHを生成する微生物を選択 すればよい。
形質転換体の培養形態は、 宿主の栄養生理的性質を考慮して培養条件を選択す ればよく、 多くの場合は液体培養で行う。 工業的には通気攪拌培養を行うのが有 利である。
培地の栄養源としては、 微生物の培養に通常用いられるものが広く使用され得 る。 炭素源としては資化可能な炭素化合物であればよく、 例えば、 グルコース、 シユークロース、 ラクト一ス、 マルトース、 ラクトース、 糖蜜、 ピルビン酸など が使用される。 また、 窒素源としては利用可能な窒素化合物であればよく、 例え ば、 ペプトン、 肉エキス、 酵母エキス、 カゼイン加水分解物、 大豆粕アルカリ抽 出物などが使用される。 その他、 リン酸塩、 炭酸塩、 硫酸塩、 マグネシウム、 力 ルシゥム、 カリウム、 鉄、 マンガン、 亜鉛などの塩類、 特定のアミノ酸、 特定の ビタミンなどが必要に応じて使用される。
培養温度は菌が生育し、 本発明のタンパク質を生産する範囲で適宜変更し得る が、 好ましくは 20〜42で程度である。 培養時間は条件によって多少異なるが、 GD Hが最高収量に達する時期を見計らって適当時期に培養を完了すればよく、 通常 は 12〜72時間程度である。 培地の pHは菌が発育し、 本発明のタンパク質を生産す る範囲で適宜変更し得るが、 好ましくは pH6. 0〜9. 0程度の範囲である。
培養物中の本発明のタンパク質を生産する菌体を含む培養液をそのまま採取し、 利用することもできるが、 一般には、 常法に従って、 本発明のタンパク質が培養 液中に存在する場合はろ過、 遠心分離などにより、 本発明のタンパク質を含有す る溶液と微生物菌体と分離した後に利用される。 本発明のタンパク質が菌体内に 存在する場合には、 得られた培養物からろ過または遠心分離などの手段により菌 体を採取し、 次いで、 この菌体を機械的方法またはリゾチームなどの酵素的方法 で破壊し、 また、 必要に応じて、 EDTA等のキレート剤及び界面活性剤を添加して 本発明のタンパク質を可溶化し、 水溶液として分離採取する。
上記のようにして得られたタンパク質含有溶液を、 例えば減圧濃縮、 膜濃縮、 さらに硫酸アンモニゥム、 硫酸ナトリウムなどの塩析処理、 あるいは親水性有機 溶媒、 例えばメタノール、 エタノール、 アセトンなどによる分別沈殿法により沈 殿せしめればよい。 また、 加熱処理や等電点処理も有効な精製手段である。 その 後、 吸着剤あるはゲルろ過剤などによるゲルろ過、 吸着クロマトグラフィー、 ィ オン交換クロマ卜グラフィ一、 ァフィ二ティクロマトグラフィーを適宜組み合わ せることによって精製を行うことにより、 精製された本発明のタンパク質を得る ことができる。
カラムクロマイトグラフィ一により分離、 精製し、 精製酵素標品を得ることが できる。 該精製酵素標品は、 電気泳動 （SDS-PAGE) 的に単一のバンドを示す程度 に純化されていることが好ましいが、 αサブュニット又はアサブュニットが含ま れていてもよい。
上記のようにして得られた精製酵素を、 例えば凍結乾燥、 真空乾燥やスプレー ドライなどにより粉末化して流通させることが可能である。
本発明の ]3サブュニット及び αサブュニット、 もしくは必要に応じてさらにァ サブユニットからなる GDH複合体、 又はそれを保持する形質転換体は、 ダルコ一 スセンサの酵素電極として用いることができる。 電極としては、 カーボン電極、 金電極、 白金電極などを用い、 この電極上に本発明の GDHを固定化する。 固定化 方法としては、 架橋試薬を用いる方法、 高分子マトリックス中に封入する方法、 透析膜で被覆する方法、 光架橋性ポリマー、 導電性ポリマー、 酸化還元ポリマー などがあり、 あるいはフエ口センあるいはその誘導体に代表される電子メデイエ —夕一とともにポリマ一中に固定あるいは電極上に吸着固定してもよく、 またこ れらを組み合わせて用いてもよい。 典型的には、 ダルタルアルデヒドを用いて本 発明のグルコース脱水素酵素をカーボン電極上に固定化した後、 アミン基を有す る試薬で処理してダルタルアルデヒドをブロッキングする。
グルコースの濃度の測定は、 以下のようにして行うことができる。 恒温セルに 緩衝液を入れ、 メディエー夕一を加えて一定温度に維持する。 メデイエ一夕一と しては、 フェリシアン化力リゥム、 フエナジンメトサルフェートなどを用いるこ とができる。 作用電極として本発明の酵素を固定化した電極を用い、 対極 （例え ば白金電極） および参照電極 （例えば A g / A g C 1電極） を用いる。 カーボン 電極に一定の電圧を印加して、 電流が定常になった後、 グルコースを含む試料を 加えて電流の増加を測定する。 標準濃度のグルコース溶液により作製したキヤリ プレーシヨン力一ブに従い、 試料中のグルコースの濃度を計算することができる。 また、 本発明の) 3サブユニットを含む GDH複合体は、 グルコース等の糖類アツ セィキットの構成要素とすることができる。 典型的には、 キットは、 GDH複合体 に加えて、 アツセィに必要な緩衝液、 メディエー夕一、 キャリブレーションカー ブ作成のためのグルコースなどの標準溶液、 ならびに使用の指針を含む。 本発明 に従う酵素は種々の形態で、 例えば、 凍結乾燥された試薬として、 または適切な 保存溶液中の溶液として提供することができる。 実施例
以下、 本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。
. ブルクホルデリア ·セパシァ KS1株 GDH αサブユニットをコードする 遺伝子の単離
ぐ 1 >ブルクホルデリア *セパシァ KS1株からの染色体 DNAの調製
ブルクホルデリア ·セパシァ KS1株より染色体遺伝子を常法に従って調製した。 すなわち、 同菌株を TL液体倍地（ポリペプトン 1 0 g、 酵母抽出液 l g、 NaCl 5 g、 KH2 PO 4 2 g、 グルコース 5 g ; 1 L、 pH 7. 2)を用いて、 34 でー晚振盪した。 増殖した菌体を遠心分離機により回収した。 この菌体を 10mM NaCl、 20mM Tr i s-H C l (pH8. 0)、 ImM EDTA、 0. 5% SDS、 100 g/mlのプロティナ一ゼ Kを含む溶液に懸 濁し、 5 0 で 6時間処理した。 ここに等量のフエノ一ルークロロホルムを加え て室温で 1 0分間撹拌した後、 遠心分離機により上清を回収した。 これに終濃度 0. 3Mになるように酢酸ナトリゥムを加え、 2倍量のエタノ一ルを重層して中間層 に染色体 DNAを析出させた。 これをガラス棒を用いてすくいとり、 70%エタノール で洗浄した後、 適当量の TEバッファ一に溶解させ、 染色体 DNA溶液とした。
< 2 >GDH αサブユニットの N末端アミノ酸配列の決定
実施例 2と同様にして精製した GDHを凍結乾燥によつて濃縮後、 1 2. 5%ポリアク リルアミドを用いた SDS-電気泳動法を用いて展開し、 αサブュニットを分離した。 こうして得られた αサブュニットをポリビニリデンフルオリ ド膜に転写した後、 アミノ酸シークェンサ一 （島津製作所製、 PPSQ- 10) により Ν末端アミノ酸配列の 決定を行った。 その結果、 本酵素には配列番号 3のアミノ酸配列においてァミノ 酸番号 2〜1 2からなる 1 1残基から構成されるペプチド配列を含むことが明ら かとなつた。 く 3〉 αサブュニットをコ一ドする遺伝子のクロ一ニング
< 1 >で調製した DNA 1 n gを制限酵素 Sau3AIで限定分解した。 これを C IAP (仔ゥシ小腸由来アルカリホスファターゼ） 処理した。 一方、 コスミドである Su perCos I (ストラジーン社から入手） を BamHI処理し、 T4 DNAリガーゼにより、 Su perCos Iに α -15株由来の染色体 DNA断片を Sau3AIで限定分解して得られた DNA断片 を組み込んだ。 得られた組換え]) NAでェシエリヒア ·コリ XL- 1 Bl ue MR (ストラ ジーン社から入手） を形質転換した。 形質転換体は SuperCos I上の抗生物質耐性 であるネオマイシン耐性およびアンピシリン耐性にしたがって 10 g/mlのネオマ ィシンおよび 25 g/mlのアンピシリンを含む LB寒天培地から選抜した。 得られた 形質転換体を LB液体培地で培養した。 これらの形質転換菌体を集菌後、 GDH活性 測定試薬に懸濁し、 グルコースに対する脱水素酵素活性を指標にクローンを選抜 した。 その結果、 1株のグルコース脱水素酵素活性を示すクローンが得られた。
< 4 >サブクローニング
< 3 >で得られた αサブュニットをコードする遺伝子を含むコスミド SuperCos Iから、 目的遺伝子を含む DNA断片を調製した。 同コスミドから挿入遺伝子断片を 制限酵素 No t lにより切り出した。 この DNA断片を制限酵素 Xbalで処理し、 それら の断片を Xbalで消化したプラスミド PUC18に組み込んだ。 各挿入断片を含むブラ スミド pUC18でェシエリヒア · コリ DH5 a MCR株を形質転換し、 アンピシリン 50 S /mlを含む LB寒天培地で生じるコロニーを採取した。 得られた形質転換体を液体 の LB培地で培養し、 それぞれの細胞の GDH活性をく 3 >と同様に調べた。 その結 果、 一つの形質転換体に GDH活性を示す株が得られた。 この形質転換体からブラ スミドを抽出し、 その挿入 DNA断片を解析したところ、 約 8. 8kbpの揷入断片が確 認された。 本プラスミドを pKSlと命名した。
< 5 >塩基配列の決定
pKS lの挿入 DNA断片について、 制限酵素解析及び常法に従い塩基配列を決定し た。 その結果、 本揷入 DNA断片中に、 く 2 >で明かとなった αサブユニットの N末 端アミノ酸配列をコ一ドする DNA配列が確認され、 この配列を含むオープンリ一 ディングフレームが見つかった。 決定した塩基配列 よび同塩基配列がコードし 得るアミノ酸配列ほ、 配列番号 1および 3に示す通りである。 尚、 後述するよう に、 配列番号 1の塩基配列のうち、 塩基番号 2 3 8 6以降の塩基配列は、 配列番 号 4に示すアミノ酸配列をコードじており、 ]3—サブュニットをコードしている と推定された。 参考例 2 組換え大腸菌による GDH αサブユニットの生産
αサブュニットの塩基配列が決定されたことにより、 前記 αサブュニッ卜の構 造遺伝子を用いてベクタ一を作製し、 更に前記べクタ一により形質転換体の製造 行つた。
先ずベクターに挿入する遺伝子を以下のように調製した。
K S 1株由来のゲノム断片をテンプレートとして、 所望の制限酵素部位を含むよ うに、 PCR反応により増幅した。 PCR反応には次の 1組のオリゴヌクレオチドブラ イマ一を用いた。
(フォヮード）
5' -CCCAAGCTTGGGCCGATACCGATACGCA-3' (配列番号 5 )
(リバース) , '
5' -GAGAAGCTTTCCGCACGGTCAGACTTCC-3' (配列番号 6 )
PCRにより増幅された遺伝子を制限酵素 Hindl l lで消化した後、 発現べクタ一 pF LAG- CTS (S IGMA社）のクローニング部位である Hindl l l部位に挿入した。 得られた プラスミドを pFLAG- CTS/ aと命名した。
前記プラスミド pFLAG- CTS/ αでエッシェリヒァ ·コリ D H 5 a M C R株を形質 転換し、 アンピシリン 5 0 g /m 1を含む L B寒天培地で生じるコロニーを採 取した。
さらに p K S 1挿入断片について、 αサブュニッ卜の上流に関してオープンリ 一ディングフレームを検索したところ、 新たに配列番号 2に記載される 1 6 8ァ ミノ酸残基から構成されるポリペプチドをコードする 5 0 7塩基から構成される 構造遺伝子 （配列番号 1中塩基番号 2 5 8〜 7 6 1 ) が見出された。 この構造遺 伝子は、 アサブュニットをコードしていると考えられた。 αサブュニッ卜のコード領域の上流に、 アサブュニットをコードする領域の存 在が明らかになったことから、 ァサブュニットと αサブュニットが連続するポリ シストロン構造の遺伝子を含む組換えベクターを作製し、 同べクタ一を導入した 形質転換体を構築した。
先ずべクタ一に挿入する遺伝子を以下のように調製した。
アサブュニッ卜の構造遺伝子および aサブュニッ卜の構造遺伝子が連続する Κ S 1株由来のゲノム断片をテンプレートとして、 所望の制限酵素部位を含むよう に、 PCR反応により増幅した。 PCR反応には次の 1組のオリゴヌクレオチドプライ マーを用いた。
(フォワード）
5' -CATGCCATGGCACACAACGACAACACT-3' (配列番号 7 )
(リバース）
5' -CCCAAGCTTGGGTCAGACTTCCTTCTTCAGC-3' (配列番号 8 ) この PCRにより増幅された遺伝子の 5'末端を NcoI 3'末端を Hindlllで消化した 後、 ベクタ一 pTrc99A (Pharmacia社） のクローニング部位である、 Ncol/Hindlll に挿入した。 得られたプラスミドを pTrc99A/r + αと命名した。
前記プラスミド pTrc99A/ァ + αにより、 ェシエリヒア 'コリ DH 5 otMCR株 を形質転換し、 アンピシリン 50^g/mlを含む L B寒天培地で生じるコロニーを採 取した。
前記 pKSl pFLAG-CTS/ , pTrc99A/r + αのそれぞれのプラスミドによって形 質転換したェシェリヒア ·コリ DH5aMC R株を用いて αサブュニッ卜の生産 を行った。 各形質転換体をアンピシリン 50 g/mlを含む LB培地 3 m 1に植菌し、 3 7 で 1 2時間培養を行い、 遠心分離機により細胞を集菌した。 この細胞をフ レンチプレス (1500kgf) で破砕した後、.超遠心 （4で、 160 400X g 90分） に より膜画分 （10mMリン酸カリウム緩衝液 PH6.0) を分離した。 参考例 3 GDH活性の確認
先ず前記各膜分画を用いて GDH活性の確認を行った。 具体的には 594 iMのメ チルフエナジンメトサルフェート（mPMS)および 5.94 tMの 2， 6-ジクロロフエノー ルインドフエノール（DCIP)を含む 10mMリン酸カリゥム緩衝液（pH7.0)により、 目 視判定を行った。 結果は以下のとおりである。 +の数は、 青色から無色への変化 の程度を表す。 pFLAG-CTS/ αによる形質転換体培養膜分画 +
PKS1による形質転換体培養膜分画 + +
pTrc99A/r +ひによる形質転換体培養膜分画 + + + ひサブユニットのみを組みこんだ pFLAG- CTS/ αによる形質転換体培養膜分画の GDH活性が最も低く、 効率良くベクターを構築した pTrc99A/r + Q!による形質転換 体培養膜分画が最も高い GDH活性を示した。
αサブュニッ卜の構造遺伝子のみによるべクタ一を用いた形質転換体でも αサ ブュニットは発現されるが、 更にアサブュニットの構造遺伝子を αサブュニット の構造遺伝子と合わせたベクタ一を用いることにより、 効率良く αサブュニット を得ることができた。
本発明のグルコース脱水素酵素を用いてグルコースをアツセィした。 本発明の グルコース脱水素酵素（αサブュニッ卜）を、 各種濃度のグルコースで酵素活性を 測定した。 GDH活性の測定は 594 /Μのメチルフエナジンメトサルフエ一ト（mPMS) および 5.94 Mの 2， 6-ジクロロフエノールインドフエノール（DCIP)を含む lOmMリ ン酸カリウム緩衝液（PH7.0)の中で行った。 酵素試料および基質としてダルコ一 スを基質として加え 37ででィンキュベートした時の DCIPの 600nmの吸光度変化を 分光光度計を用いて追跡し、 その吸光度の減少速度を酵素反応速度とした。 本発 明の GDHを用いて、 0.01〜1.0mMの範囲でグルコースの定量を行うことができた。 実施例 1 ブルクホルデリア ·セパシァ KS1株 GDH ;3サブユニットをコードする 遺伝子の単離
<1 >ブルクホルデリア ·セパシァ KS1株 GDHJ3サブュニッ卜の検索
Sanger Centre のブルクホルデリア 'セパシァ J2315株ゲノムデ一夕べ一ス（ht tp:〃 w. Sanger, ac.uk/)を用いて、 KS1株由来 GDHの )3サブュニット遺伝子を検 索した。 すでに明らかにされている KS1株 GDHjSサブユニットの N末端配列 （配列 番号 9) を参考に、 ァセトバクタ一 S p. 、 ダルコノパクター S p. 由来のアル コール脱水素酵素 (Taiaki T. et al.， Biochim Biophys Acta 1088(2) :292-300
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上記アミノ酸配列を指標として、 前記ブルクホルデリア ·セパシァ J2315株の データーベースから BLASTを用いてホモロジ一の高いアミノ酸配列をコードして いる遺伝子配列を検索した。 つぎに、 得られた 5つの配列に対して、 KS1株 GDHa サブュニッ卜の C末端配列とのホモロジ一を検索した結果、 2つの遺伝子断片か ら翻訳されるアミノ酸配列が高いホモロジ一 （〉90 を示した。 各遺伝子断片 は 200〜500bpと短かったので、 これらの配列に対して相同性の高い配列を、 Bias tを用いてブルクホルデリァ ·セパシァ J2315株のゲノムデ一ターベースから検索 し、 各断片をつなぎ合わせた。 その結果、 3110bpの断片を得た。 得られた塩基配 列には GDHの C末端と思われる 0RFと 1275bpからなるシトクローム c構造遺伝子と 思われる 0RFが存在した （配列番号 1 1) 。 同 0RFがコードするアミノ酸配列を配 列番号 1 2に示す。 得られた 12315株の塩基配列と既にクローニングされている K S1株 aサブュニット塩基配列を比較した結果、 aサブュニット下流には J2315株 シトクローム cのシグナルべプチドをコードする塩基配列に相同性の高い塩基配 列が含まれていた。
以上のことから、 参考例 1で得られたブルクホルデリア ·セパシァ KS1株のク ローニング断片中の三番目の 0RF (配列番号 1の塩基番号 2386以降） は、 β 一サブユニットをコードしていると推定された。 また、 精製された /3—サブュニ ットの N末端におけるアミノ酸配列と、 配列番号' 1中の塩基番号 2452〜24 66の塩基配列によって翻訳される 5アミノ酸残基が一致したことからも、 前記 0RFは J3サブュニットをコードしていると考えられた。
< 2 >ィンバース PCR法を用いた βサブュニット構造遺伝子の増幅
(1) 菌体の培養及びゲノムの抽出
KS1株を 5mlの完全培地 （0.5% polypepton 、 0.3% yeast extract 、 0.5¾ NaC 1) を用いて 37ででー晚振とう培養した。 得られた菌体から GennomicPrepTM Cell s and Tissue DNA Isolation Kit (Amersham Pharmacia Biotech社） を用いてケ ノムを抽出した。 方法は付属のマニュアルに従った。 得られたゲノムに対してフ ェノール/クロ口ホルム処理を行い、 エタノール沈殿させた後、 精製水に溶解し た。
(2) ゲノム断片の環状化
KS1株より抽出したゲノムを、 BamHI、 EcoRI、 HindllL Smal、 Saclおよび Xhol で消化し、 エタノール沈殿によってゲノム断片を回収した。 制限酵素消化したゲ ノム l gを DNAライゲ一シヨンキット （宝酒造（株）） を用いて 16ででー晚ライゲ ーション反応を打った。
(3) PCR
KS1株 GDHi3サブュニッ卜の N末端シグナル配列領域の塩基配列からデザインし たフォワードプライマー （EF1配列番号 1 3) 50pmol, リバースプライマー （ER1 配列番号 14) 50pmol (プライマ一はいずれも Invi trogen社に依託合成） 、 LATa q (宝バイオ （株） ） 0.5ml、 dNTP溶液 8^1， 10XPCR buffer に精製水を 全量 50 1となるように加え、 プログラムテンプコントロールシステム PC - 801 (ASTEC) を用いて PCRを行った。 PCRの反応は、 以下の条件で行った。 94 : 5分、 98V 20秒、 30秒を 30サイクルの後、 72 6分、 72 10分。
Smalで制限酵素消化したゲノムをテンプレートとした場合において、 約 2. lkbp の大きさの断片がァガロース電気泳動で確認された。 く 3 >PCR増幅断片のシークェンシング
(1) TAクロ一ニング
前記のインパース P C R産物をァガロースゲル電気泳動後、 バンドを切り出し、 Gene clean II KIT (BiolOl inc.) を用いて精製した。 この断片を、 pGEMR- T a nd pGEMR-T EASY Vector Systems (Promega) を用いて、 pGEM- T Vectorにライ ゲ一シヨンした。 ライゲ一シヨンを行ったベクタ一でェシェリヒア ' コリ DH5Q! を形質転換し、 アンピシリン 50 g/ml、 X- Gal 40 /mK IPTG 0. lAtMを含む L 寒天培地を用いて一晩培養した。 出現したコロニーから白色のコロニーを選択し、 アンピシリン 50 g/mlを含む L培地で一晩培養して、 菌体からプラスドをアル力 リ法により抽出した。
(2) シークェンスサンプルの調製
得られたプラスミドを RNase処理し、 これに 0.6倍量の 20% PEG6000/2.5M NaCl を加え、 氷上に 1時間放置した。 その後 15000r.p.m、 4でで 15分間遠心分離し、 ぺ レットを得た。 これを 70%エタノールで洗浄し、 ペレットを真空乾燥させた。 こ れを精製水に溶解した。
(3) DN A塩基配列の解析
(2) で得られたプラスミドの挿入断片の塩基配列を、 ABI PRISM™310 Genet ic Analzer ( PERKIN- ELMER Applised Biosystems)を用いて解析した。 ベクター のマルチクローニングサイトから M13プライマ一を用いて挿入断片の一部の配列 を決定した結果、 これまでに解析されている) 3サブュニット N末端を含む塩基配 列が確認された。 この配列を手がかりにプライマーを順次作製して用い、 挿入断 片の塩基配列を決定した。 結果を配列番号 1 5に示す。 また、 この塩基配列に含 まれる 0RFがコードするアミノ酸配列を配列番号 1 6に示す。 .
)3サブユニットは、 全部で 425個のアミノ酸残基から構成されており、 すでに 得られている N末端アミノ酸配列と比較して、 そのうち 22残基はシグナルべプチ ドであると考えらる。 アミノ酸配列から計算される分子量は 45， 276Daであり、 シ ダナルぺプチドを除いた分子量 42，731Daは、 SDS- PAGEから求められた Κβΐ株 GDH3 サブュニッ卜の分子量 43kDaとほぼ同等の値であった。 ；3サブュニットのァミノ 酸配列中には、 シ卜クローム cにおいてヘムとの結合モチーフ （配列番号 18) が 3ケ所に確認された。 この 0RFは αサブュニット構造遺伝子の 0RFのすぐ下流に 位置し、 開始コドンの上流に SD配列と思われる配列が存在した。
得られたァミノ酸配列について BLASTによるホモ口ジ一検索を行つたところ、 ラルストニア ·ソアナセアルム （Ralstonia solanacearum) 由来のォキシドレダ クターゼ脱水素酵素のシトクロム cサブュニッ卜と 65 ダルコノパクタ一 ·ォ キシダンス （Gluconobacter oxydans) 由来のソルビトール脱水素酵素のシトク ロム cサブュニッ卜と 48¾、 エルビニァ · シプリぺデイイ （Eriwinia cypripedi i) 由来のダルコン酸脱水素酵素のシトクローム cサブユニットと 44%、 パントェ ァ · シ卜レア (Pantoea citrea) 由来 2—ケト—ダルコン酸脱水素酵素のシトク ローム cサブユニットとアミノ酸レベルて 46. 4%と、 全体にわたって高い相 同性を示していた。 またこれらのシトクローム cのアミノ酸配列中には、 ヘム結 合モチーフ （配列番号 18) 配列が保存されていた。
尚、 KS1株の GDHjSサブユニット構造遺伝子は、 12315株の GDHjSサブユニット構 造遺伝子と、 塩基配列レベルで 92. 0%、 アミノ酸レベルで 92. 2 %の相同 性を有している。 産業上の利用の可能性
本発明により、 ブルクホルデリア属微生物の GDH/3サブュニット及びそれをコ 一ドする DN Aが提供される。

Claims

請求の範囲
1. 以下の （A) または （B) に示すタンパク質。
(A) 配列番号 16のアミノ酸番号 23〜425からなるアミノ酸配列を少な くとも有するタンパク質。
(B) 配列番号 16のアミノ酸番号 23〜425からなるアミノ酸配列におい て、 1〜20個のアミノ酸残基が置換、 欠失、 挿入、 又は付加されたアミノ酸配 列を有し、 グルコース脱水素酵素 jSサブュニットとして機能し得るタンパク質。
2. 以下の （A) 又は （B) のタンパク質をコードする DNA。
(A) 配列番号 16のアミノ酸番号 23〜425からなるアミノ酸配列を少な くとも有するタンパク質。
(B) 配列番号 16のアミノ酸番号 23〜425からなるアミノ酸配列におい て、 1〜20個のアミノ酸残基が置換、 欠失、 挿入、 又は付加されたアミノ酸配 列を有し、 グルコース脱水素酵素 /3サブュニットとして機能し得るタンパク質。
3. 以下の （a) 又は （b) に示す DNAである請求項 2に記載の DNA。
(a) 配列番号 1 5の塩基番号 187〜1398からなる塩基配列を含む D N
A。
(b) 配列番号 1 5の塩基番号 1 87〜 1 398からなる塩基配列とストリン ジェン卜な条件下でハイプリダイズし得る DNA。
4. さらに配列番号 1 5の塩基番号 1 2 1〜 187からなる塩基配列を含む請 求項 3に記載の DNA。
5. 請求項 2〜4のいずれか一項に記載の DNAを含有する組換えベクター。
6. 請求項 2〜4のいずれか一項に記載の DN A又は請求項 5に記載の組換え. ベクタ一で形質転換された形質転換体。
7. 請求項 6に記載の形質転換体を培養して、 前記 DNAの発現産物としてグ ルコース脱水素酵素 ι8サブュニットを産生させ、 これを採取するグルコース脱水 素酵素 JSサブュニットの製造方法。
8. さらにブルクホルデリァ ·セパシァのグルコース脱水素酵素 αサブュニッ ト及びァサブュニットをコ一ドする塩基配列を含む請求項 3又は 4に記載の D Ν A。
9. 請求項 8に記載の DNAを含有する組換えベクター。 .
10. 請求項 8に記載の DN A又は請求項 9に記載の組換えべクタ一で形質転換 された形質転換体。 '
11. 請求項 10に記載の形質転換体を培養して、 前記 DNAの発現産物として グルコース脱水素酵素複合体を産生させ、 これを採取するグルコース脱水素酵素 複合体の製造方法。 ·
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