WO2003087385A1 - Procede de production d'acide gras conjugue et aliment /boisson obtenus grace a ce procede - Google Patents

Procede de production d'acide gras conjugue et aliment /boisson obtenus grace a ce procede Download PDF

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WO2003087385A1
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lactobacillus
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Naomi Mizusawa
Masashi Sakai
Satoshi Kudo
Yukio Shirasawa
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Kabushiki Kaisha Yakult Honsha
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Definitions

  • the present invention particularly relates to a specific conjugate utilizing one or more bacteria selected from Lactobacillus oris, Lactobacillus POD tis, Lactobacillus panis, Bifidobacterium breve, Bifidobacteria ⁇ bifida ⁇ , Bifidobacteria ⁇ infant is, ytBifidobacteriwn pseudocatenulataa.
  • the present invention relates to a method for efficiently producing a fatty acid and a food or drink containing a conjugated fatty acid obtained by the method.
  • Conjugated fatty acids are fatty acids in which adjacent carbons have a double bond across a single bond, but conjugated linoleic acid, which has one conjugated diene in a fatty acid molecule having 18 carbon atoms, has various physiological activities. Has been revealed.
  • an alkali conjugation method is known in which a fat or oil containing linoleic acid or free linoleic acid is conjugated in an organic solvent such as ethylene glycol.
  • the unsaturated fatty acid and excess alkali are usually heated to 150 or more in an organic solvent.
  • the obtained conjugated fatty acid is in the form of a mixture in which the bonding positions and arrangements of the double bonds are different.
  • linoleic acid is used as a raw material
  • cis-9, trans-11 type or t Conjugated linoleic acid of rans- 9, ci sl l-type, trans-10, ci s-12 type was obtained, and also contained several regio or geometric isomers.
  • the physiological action of the conjugated fatty acid is an action as a mixture of the conjugated fatty acids, and if a specific conjugated fatty acid can be produced, the application value is high both academically and industrially.
  • cyclization and other side reactions also occur in the alkali conjugation method, and problems such as a decrease in the yield of conjugated fatty acids and difficulty in purification have been pointed out.
  • microorganisms or their enzymes produce conjugated fatty acids.
  • rumen bacteria produce conjugated fatty acids from polyunsaturated fatty acids (Shorland FB, et al., Nature, vol. 175, p. 1129, 1955).
  • microorganisms can be expected to provide a product having a high cis-9, trans-11 conjugated linoleic acid content, which is expected to have anticancer activity.
  • no microorganism has been found that produces low amounts of by-products and produces a sufficient amount of conjugated linoleic acid.
  • lactic acid bacteria and ⁇ / 7 / flAac / er / ffiff genus bacteria which are a kind of intestinal bacteria, are also known as microorganisms having high use value in foods.
  • Bifidobacterium species are obligately anaerobic and can easily die in the presence of oxygen or at low pH.Therefore, research using Bifidobacterium species requires an appropriate working environment and skilled operations. You. For these reasons, little research has been conducted on material production using c / er M bacteria, including the production of synergistic linoleic acid.
  • the alkali conjugation method has problems such that side reactions easily occur due to the reaction at a high temperature, it is difficult to obtain a specific conjugated fatty acid, and the subsequent purification step is complicated.
  • all-trans conjugated linoleic acid was also produced at the same time, and the production amount of the entire conjugated linoleic acid could not always be satisfied.
  • lactic acid bacteria producing conjugated linoleic acid include ctobaciUns acidophilus, L actobacillus caseL Bifidobacteria ⁇ longnm.Bifidobacterium adolescentis, Bifidobacterium breve, and Bifidobacteriaia infant is disclosed.
  • the strain is not produced if the strains are different, and further, such a suggestion was found in the process leading to the present invention.
  • the amount of production some bacterial strains produced 5 or more with respect to the substrate linoleic acid 100, but no bacterial strains produced 10 or more.
  • An object of the present invention is to conjugate unsaturated fatty acids having at least two double bonds to solve these problems. It is an object of the present invention to obtain a method for efficiently obtaining only 11-type conjugated linoleic acid at a high content. Furthermore, it is necessary to obtain a bacterium capable of efficiently producing cis-9, trans-11 conjugated linoleic acid having a high physiological effect at a high content from linoleic acid, and a food or drink containing conjugated fatty acids. Aim. Disclosure of the invention
  • the present inventors have conducted intensive studies to find a method for producing conjugated linoleic acid using bacteria.As a result, the ability to conjugate Lactobacillus bacteria and Z or /// The ability to move the position of the double bond in the saturated fatty acid molecule and to isomerize the double bond into a state where they are conjugated to each other.
  • the method for producing a conjugated fatty acid according to the present invention comprises a method of producing a viable cell, a dead cell, a cell extract of the bacterium belonging to the genus Zac zo las Z or BU i dobacter ergo having conjugating ability, or the bacterium Using the obtained enzyme, unsaturated fatty acids having at least two double bonds The conjugation solves the above-mentioned problem.
  • bacterium having a conjugation treatment ability examples include Zac / ac illas oris, Lactobacillus pout is, Lactobacillus panis, Bifidobacterium breve, Bifidobacteriaa bifidaa, Bifidobacteriaa infant is, X ⁇ Bifidobacte // raff / Using live cells, dead cells, cell extract, or an enzyme obtained from one or more of the bacteria selected from weffioca / e / iff / a / iM, or enzymes obtained from the bacteria, a cell having at least two double bonds. Conjugates saturated fatty acids.
  • a live bacterium, a killed bacterium, a bacterial cell extract of a bacterium belonging to the genus Lactobacillus and a bacterium belonging to the genus Z or WfMo6acter 7Mf, or an enzyme obtained from the bacterium having at least two double bonds is used.
  • Manufactures conjugated fatty acids typified by cis-9, trans-11 conjugated linoleic acid, which is considered to have high physiological activity because of conjugating saturated fatty acids, in high yields and selectively. can do.
  • Zac oris used in the method for producing a conjugated fatty acid according to the present invention is a bacterium isolated from human saliva (Farrow J.A.E. et al., Int. J. Syst. Bacterio 1. vol. 38, pll6, 1988).
  • Examples of the strain include Lactobacillus oris NCDO 2160 (ATCC 49062), NCDO 2162, NCDO 2163, NCDO 2164, and the like, with CDO 2160 (ATCC 49062) being particularly preferred.
  • Lactobacillus pont is a bacterium isolated from rye bread seeds (Vogel.RF, et al., Int. J. Syst. Bacteriol., Vol.44, p223-229, 1994).
  • Lactobacillus pont is ATCC 51518, ATCC 51519 and the like can be mentioned, and it is particularly preferable to use ATCC 51518.
  • Lactobacillus panis is a bacterium isolated from rye bread seeds (St rohmar, W., Diekiann, H., Z. Lebensm. Unters. Forsch, vol. 194, p536-540, 1992).
  • Lactobacillus panis JCM11053 and the like can be mentioned, and it is particularly preferable to use JCM11053.
  • Bacterial strains include, for example, 2? / 0 bacterittn breve ATCC 15698, ATCC 15701, YIT 10001, etc., and particularly, Bifidobacterium breve YIT 10001 has high cis-9, trans-11 type conjugated linoleic acid. It is an excellent strain that can be efficiently produced with its content.
  • Bifidobacterium breve YIT 10001 was deposited as FER ⁇ -18459 with the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Organism Depositary on August 14, 2001, as of FER I-18459. Transfer to the International Deposit as FERM BP-8205 has been completed on October 11, 2010.
  • This Bifidobacteriwa breve ⁇ 10001 strain was pre-cultured for at least 24 hours in GAM broth (manufactured by Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) containing a linoleic acid-BSA-complex, and / er / w bacterium was inoculated in a milk medium containing linoleic acid-BSA-complex at 3.8 wt% and shake-cultured for 144 hours to obtain at least 0.5 mg / 5 ml of conjugated linoleic acid in the medium. It is preferable because it is a strain having an extremely high ability to produce conjugated linoleic acid, which is capable of producing conjugated linoleic acid.
  • the fermented food eg, fermented milk
  • a physiological effect When a strain having such excellent production ability is used to ferment a food material containing linoleic acid (eg, dairy material), the fermented food (eg, fermented milk) after fermentation has a physiological effect.
  • linoleic acid eg, dairy material
  • fermented food eg, fermented milk
  • This is particularly suitable in terms of workability in food production, because it can produce conjugated linoleic acid to an extent that can be expected.
  • Bifidobacteria infantis is a strain isolated from infant feces.
  • Bacterial strains include, for example, Bifidobacteriiui infaniis KC 15702.
  • Bifidobacterium bitidnm is a strain isolated from feces and vagina of adults, infants, and nursing cattle. Examples of the strain include Bifidobacteria ! bifidua Xn 4007 (FERM BP-791).
  • Bifidobacterima pseudocatenulataa is a strain isolated from sewage, infant stool, and mammalian stool. Examples of the strain include Bifidobacteriwa ps eudocatenalatuia ATCC 27919.
  • the unsaturated fatty acid having at least two double bonds used as a raw material is not particularly limited, and examples thereof include linoleic acid, linolenic acid, arachidonic acid, eicosapentaenoic acid, and docosahexaenoic acid. It can be suitably used.
  • linoleic acid when linoleic acid is used as a raw material to produce conjugated linoleic acid, specific isomers with reported bioactivity are generated specifically and efficiently, and the amount of other isomers (by-products) is minimal. Therefore, it is preferable.
  • the unsaturated fatty acid may form a salt or ester, etc.
  • examples thereof include alkali metal salts such as sodium salts and potassium salts, alkaline earth metal salts such as calcium salts and magnesium salts, and ammonium salts.
  • examples of esters include methyl esters, ethyl esters, and other fatty acids containing the above fatty acids. It is also possible to use fatty acids (phosphorus umami, glycolipids, etc.), monodaliseride, diglyceride, triglyceride and the like.
  • Natural oils and fats can also be used as raw materials.
  • those containing a large amount of linoleic acid in the molecule include safflower oil, cottonseed oil, soybean oil, castor seed oil, corn oil, peanut oil, rice bran oil, and amaji oil.
  • Plant-derived natural oils and fats such as cocoa butter, and those containing a large amount of linolenic acid in their molecules include animal-derived natural oils and fats such as sardine oil, disin oil, and cod oil. Decomposed products can be used as raw materials.
  • a medium containing unsaturated fatty acids having at least two double bonds is inoculated with the aforementioned bacteria of the genus Zac / oAac / '/// ff and bacteria of the genus Z or Wf ⁇ odacteriim and cultured.
  • a milk medium is preferable to use as the medium for this purpose.
  • Zac / // bacteria and / or Bifidobacteriau bacteria especially Lactobacillus oris, Lactobacillas pontis, La ctobacillos panis, Bifidobacteria ⁇ breve, Bifidobacteriaa bifidua, Bifid bacterioua infant is, K ⁇ ⁇ tBifidobacteriBB
  • the treatment for conjugating unsaturated fatty acids using one or more kinds of bacteria selected from pseadocatenalataa includes a method of directly producing conjugated fatty acids by culturing the bacteria in a growth medium containing unsaturated fatty acids as a raw material.
  • any method such as a method of producing conjugated fatty acids by culturing bacteria by any method and collecting and washing the washed cells (washed cells) to a solution containing unsaturated fatty acids as a raw material and reacting them is used. It is also possible to use. Furthermore, in a solution containing unsaturated fatty acids, it is possible to perform the reaction using not only live bacterial cells but also dead bacterial cells, bacterial cell extracts, enzymes extracted from the bacterial cells, and the like. .
  • Lactobacillus bacteria such as Lactobacillas oris, Lactobacillus pontis, Lactobacillus panis, Bifidobacteriaa breve, Bifidobacterium biiidnm, BifidobacteriUE infantis, or Bifidobacteriaa pseadocatenalataa and 7 or 7 ⁇
  • a medium for culturing the genus Bacteria a medium commonly used for the growth of Lactobacillus and Zy Bifjdobacterima bacterium or a milk medium containing milk can be used. It is preferred to treat fatty acids.
  • milk refers to raw milk of animal milk such as cow milk and goat milk, skim milk powder, whole milk powder, fresh cream, or various milk proteins of vegetable milk such as soy milk, almond milk, and coconut milk. Refers to inclusions.
  • conjugated linoleic acid by the genus bacteria, Biiidobac / erraf genus bacteria, at least one selected from linoleic acid, BSA, lipid-binding protein and surfactant It is preferable to sell the whole medium in a medium to which a complex with the material has been added. This is because the production amount of conjugated linoleic acid in the main culture can be effectively increased.
  • the pre-culture time is preferably at least 12 hours, particularly preferably 20 hours or more.
  • Lactobacillus oris Lactobacillus pontis, Lactobacillus panis, Bifidobacteriaa breve, Bifidobacteriaa bifidau, Bifidobacterium infant is, ⁇ Bifidobacterium pseodocatenulataa and the like (Lactobacillus bacteria and or or
  • the washed cells can be obtained by washing the cultured cells with a physiological saline solution or a buffer solution, and the cell powder can be obtained by a drying technique such as freeze drying or spray drying.
  • Methods for obtaining dead cells include, in addition to the method involving the action of cell wall lysing enzymes, a method involving low osmotic pressure, a method involving freeze-thawing, a method involving high pressure, a method involving crushing, and a method involving heat treatment.
  • the method of heat-treating the cells by self-thawing is preferable in that a large amount of cells can be treated without increasing the cost.
  • the cell extract can be obtained as a centrifuged supernatant after adding an appropriate solvent to the washed cells, cell powder, dead cells, and the like obtained as described above.
  • Lactobacillus pout is, Lactobacillus panis, Bifidobacterium breve, Bifidobacteria ⁇ bifidua, Bifidobacte Tium infant is, MB ifidobacteriim psendocatenulatim which has conjugation ability More specifically, examples of the conjugation treatment method for producing a fatty acid include the following (a) to (e).
  • the basic operation may be performed by a commonly used technique. It is preferable to use the following as the starter.
  • an unsaturated fatty acid such as linoleic acid is grown on lactic acid bacteria growth medium such as MRS (LACTOBACILL I MRS BROTH, DIFCO) medium or GAM medium (GAM broth). th, manufactured by Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.). This concentration is between 0 and 0.2%, especially between 0.05 and 0.1%.
  • the culture at this time is preferably stopped at a pH of 3.5 to 5.5, particularly preferably at a pH of 4.5 to 5.5. When the culture is performed to pH 3.5 or less, the conjugation ability may decrease due to bacterial overgrowth, and when the pH is 5.5 or more, a sufficient amount of cells for conjugation cannot be obtained.
  • the culture solution cultivated as described above is a starter, and the amount of the starter to be inoculated is preferably 0.5 to 8%, more preferably about 1 to 4% of the fermented milk preparation medium.
  • the raw material is preferably about 0.02 to 0.8% in the medium, and particularly preferably 0.1 to 0.2%.
  • the culture temperature is about 20-4 Ot: about, preferably 28-37T.
  • the culture is preferably stopped at pH 3.5 to 5.5, and particularly preferably at pH 4.5 to 5.5.
  • the desired conjugated fatty acid can be obtained by neutralization culture.
  • the cells cultured under the same culture conditions as in the preparation of the starter in the treatment method (a) were washed with physiological saline, recovered, and suspended in a buffer.
  • the buffer for suspending the cells and the washing cell reaction are carried out using an aqueous solution under conditions that can maintain an appropriate pH.
  • 0.1 to 0 M phosphate buffer is preferable.
  • ? 1 is between 5.0 and 7.5, preferably between 6.0 and 7.0.
  • the cell concentration of the cell suspension is 0.025 to 0.25% by wet weight, preferably 0.025 to 0.1%.
  • the raw material at the time of addition is a mixed solution with bovine serum albumin (BSA), and the raw material concentration is preferably added to the reaction solution at about 0.1 to 4.0%, particularly preferably 0.3 to 1.0%.
  • BSA bovine serum albumin
  • the mixing ratio of BSA is preferably about 1/5 of the raw material.
  • the temperature for the conversion reaction by the washed cells is 20 to 52, preferably 32 to 37.
  • a suitable time for conversion generation is 1 to 96 hours, preferably 24 to 72 hours. It should be noted that cells cultured while neutralizing the pH can also be used.
  • Bacterial bacterial powder can be obtained, for example, by pulverizing bacterial cells obtained by the same method as the culture conditions at the time of preparation of the star in process (a) by drying. Freeze drying, spray drying and the like can be used as the drying treatment method.
  • the conversion reaction after preparation of the bacterial powder may be performed in the same manner as the reaction conditions for the washed cell reaction in the treatment method (b).
  • (d) Method for conjugating unsaturated fatty acids using the killed bacterial cells The bacterial cells were obtained, for example, in the same manner as in the culture conditions at the time of preparation of the star in process (a). It can be obtained by destroying the cell wall of the bacterial cell.
  • Cell wall destruction can be achieved by treatment with cell wall disrupting enzymes, suspension of cells in a solvent at a low osmotic pressure, freeze-thawing, high-pressure treatment, crushing, heat treatment, etc. And so on.
  • the conversion reaction after preparation of the cell wall disruption solution may be performed in the same manner as the reaction conditions for the washed cell reaction in the treatment method (b).
  • the bacterial cell extract for example, the bacterial washed cells, cell powder, dead cells, etc. obtained by the same method as in the treatment methods (b) to (d) are extracted with an appropriate solvent, and centrifuged. It can be obtained by removing the residue by a method such as separation.
  • the reaction after preparation of the bacterial cell extract may be carried out under the same conditions as in the washing cell reaction in the treatment method (b).
  • the fatty acid composition of the reaction solution or culture solution obtained by the bacterium described in (a) to (d) above is calculated from the ratio of the area value between the internal standard substance and each fatty acid by gas chromatography analysis. it can.
  • gas chromatography may be performed under the conditions shown in Table 1.
  • Colum DB-23 (ID 0.25 SUB X 30m)
  • the conjugated fatty acids obtained according to the present invention can be administered in the form of pharmaceuticals, foods, cosmetics and the like.
  • oral administration as solid preparations such as capsules, granules, tablets, powders, etc., or liquid preparations such as syrups can do.
  • parenteral administration such as injections, external preparations for the skin, and rectum, is also possible.
  • excipients such as lactose, starch, crystalline cellulose, calcium lactate, magnesium aluminate metasilicate, and silicic anhydride
  • binders such as sucrose, hydroxypropylcellulose, polyvinylpyrrolidone, carboxymethylcellulose
  • Disintegrators such as calcium carboxymethylcellulose
  • lubricants such as magnesium stearate, talc, monoglyceride, and sucrose fatty acid ester, and other components acceptable and acceptable as pharmaceuticals and foods may be appropriately used.
  • the conjugated fatty acid may be used in the form of fats and oils when the conjugated fatty acid is used in a general food form (form of “clear food”) in expectation of a similar physiological effect. It may be added to foods and drinks such as tablet confections, fermented milk, candy, seasonings, sprinkles, etc., and manufactured using a conventional method.
  • a fermented food it can be produced by adding a fatty acid having two or more double bonds in a fermentation raw material and fermenting (culturing) with a fermenting bacterium.
  • fermented milk obtained by fermenting milk containing linoleic acid is preferable because it is easy to specifically and in large amounts contain cis-9, trans-11-type conjugated linoleic acid as described above.
  • the present invention in particular, Lactobacillus oris ATCC 49062, Lactobacillus pontis ATCC 51518, Lactobacillus pontis ATCC 51519, Lactobacillus pan is JCM1 1053, Bifidobacterium breve YIT 10001, Bifidobacteriaa breve ATCC 15698, Bifeve B. , Bifidob acteriu infant is ATCC 15702 ⁇ OSBifidobacteriwa pseudocatenulattm KKi 27919 to obtain a composition in which most of the conjugated linoleic acid is cis-9, trans-1 conjugated linoleic acid Can be.
  • the high cis-9, trans-1 type 1 conjugated linoleic acid composition is defined as various conjugated linoleic acid isomers excluding cis-9, trans-1 type 1 conjugated linoleic acid. At least all conjugated renos A conjugated linoleic acid composition that does not exceed 10% with respect to lactic acid.Such a composition can be expected to have anti-cancer and other physiological effects with a small amount when used in foods, etc. It is also excellent in terms of flavor and workability.
  • the composition is preferably such that the ratio of various conjugated linoleic acid isomers other than cis-9, trans-11 type 1 conjugated linoleic acid does not exceed 4%.
  • the present invention further provides a food or beverage containing a conjugated fatty acid obtained by the above-described method according to the present invention.
  • Fermented milk refers to fermented milk specified by a ministerial ordinance such as milk, beverages containing live bacteria such as dairy lactic acid bacteria beverages, and milky beverages containing sterilized fermented milk. Kefir, etc.
  • other bacteria such as Zac / oAacillns casei, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus gasser Lactobaci lias zeae, L & ctobacillus johnsoiiii, Lactobacillus delbraec iiiss.
  • Bacteria such as Streptococcus tbemophilns, Lactococcus lactisi ss * JacUs), Lactococcas lac ⁇ is (ss.creaoris), Lactococcas plantaraa ⁇ Lact ococcns raffinolactis, etc. Enterococcns bacteria such as Eatero coccus faeciam can be used.
  • Bacteria belonging to the genus i'ioAac / er / flffl such as Bifidobacteriua breve, Bifidobacterina bifidwn, Bifidobacterium loDgam, and Bifidobacterium aniaalis, yeasts, and other microorganisms may also be used. These can be used alone or in combination of two or more.
  • sugars such as sucrose, catabolic sugar, glucose, fructose, palatinose, trehalose, lactose, xylose, etc., sorbitol, xylitol, erythritol, lactitol, palatinit, reduced sugar syrup, reduced maltose syrup, etc.
  • Emulsifiers such as sucrose fatty acid ester, glycerin fatty acid ester, lecithin, and thickening of carrageenan, guar gum, xanthan gum, pectin, lipstick cast bean gum, etc. C) agent, and the like.
  • various vitamins such as vitamin A and vitamin B, and minerals such as calcium, iron, manganese, and zinc may be blended.
  • the conjugated fatty acids obtained by the method of the present invention can be appropriately blended.
  • Figure 1 is a gas chromatogram chart of the isomers of conjugated linoleic acid produced by Zac / ac /// ffj oris.
  • Figure a is a linoleic acid standard
  • b is a conjugated linoleic acid standard
  • c The figure shows the chart of the reaction solution by Zac ⁇ //.
  • Peak ⁇ in the figure is the internal standard (17: 0), peak B is linoleic acid, peak C is cis-9, tran-11 type conjugated linoleic acid, and peak D is ans-10, cis-12 type conjugate Linoleic acid and peak E indicate all cis conjugated linoleic acids, peak F indicates all trans conjugated linoleic acids, and peak C + D + E + F indicates conjugated linoleic acid.
  • Example 1 Screening for Z /// w bacteria that produce conjugated fatty acids
  • the culture was centrifuged to collect the cells, and the cells were washed twice with physiological saline to obtain washed cells.
  • To the washed cells add 100 mL of linoleic acid-BSA-complex solution and 0.9 mL of lOOmM phosphate buffer solution (PH6.5), and add oxygen and carbon dioxide (Anaero Pack, Mitsubishi Gas Chemical Co., Ltd.). 37) in an oxygen-impermeable plastic bag kept anaerobic by At 120 rpm for 24 hours.
  • the peak of conjugated linoleic acid was judged based on the retention time of a standard product (CLA80, manufactured by Linol Oils and Fats), and the relative value was calculated when linoleic acid added as a substrate was set at 100. As a result, as shown in Table 2, production of conjugated linoleic acid was observed at c / o ⁇ /. This ⁇ / NCD02160 is registered as ATCC 49062 with the American Type Culture Collection (ATCC). Table 2
  • Example 2 Screening for // i / ac / e / flffl bacteria producing conjugated fatty acids
  • B. adolescent is 4011 ATCC 15703 3.6 1.08 0.00 0.00 0.00 0.08 1.32 0.56
  • B. infant is 4018 ATCC 15697 6.0 4.28 0.00 0.00 0.00 0.00 0.89
  • B.1 act is 4121 DSM 10140 4.3 3.81 0.00 0.00 0.00 0.05 0.07 0.61
  • Example 1 isomers of conjugated linoleic acid produced by Zac / oris were examined.
  • Figure 1 is a gas chromatogram chart of isomers of conjugated linoleic acid produced by Z ⁇ /// ffi oris.
  • all of the conjugated linoleic acids produced by ZaWoAac /// j / is were cis-9, trans-11 conjugated linoleic acids. From the above results, It became clear that i produced cis-9, trans-11 type conjugated linoleic acid efficiently at a selective and high content.
  • Example 4 Production of conjugated fatty acids by Zac / o bacteria in fermented milk
  • lOmg of linoleic acid and 1 mg of BSA were dissolved in 1 mL of O OmM phosphate buffer (pH 6.5) to prepare a linoleic acid-BSA-complex solution in advance.
  • O OmM phosphate buffer pH 6.5
  • MRS LACTOBACILLI MRS BROTH, DIFC0
  • Example 1 10% skim milk (grease) dispensed 5mL into a 5mL test tube (with cap) (Lucose 1%, soybean peptide 0.1% added) 100 L of linoleic acid-BSA-complex solution and 200 / L of the culture solution of each strain prepared above were added to the medium, and the cap was closed. This medium was cultured at 28 "C and 120 rpm for 48 hours to prepare a fermented milk of PH4.6, and fatty acid analysis was performed in the same manner as in Example 1.
  • Omg of linoleic acid and Omg of BSAl were dissolved in 1 mL of 10 OmM phosphate buffer (pH 6.5) to prepare a linoleic acid-BSA-complex solution in advance.
  • This linoleic acid (1) Add 20 BSA-complex solution to 15 mL of MRS (LACTOBACILLI MRS BROTH, DIFCO) medium, inoculate Lactobacillus oris, incubate for 28, 120 rpm, and shake for 20 hours. A culture solution was prepared.
  • MRS LACTOBACILLI MRS BROTH, DIFCO
  • lysozyme solution (10 mg / mL in 25 mM Trisaminomethane, pH 8.0, manufactured by Seikagaku Corporation) and N-Acetyl ylmuramidase aqueous solution (lmg / mL, manufactured by Seikagaku Corporation) ) 0.15 mL was added, and the mixture was reacted at 120 rpm at 37 for 30 minutes.
  • the reaction solution was transferred to Centriprep 10 (manufactured by Amicon) and concentrated to obtain about 0.6 mL of a suspension of dead Zac / ori cells.
  • Linoleic acid 5 Omg and BSAl Omg were dissolved in 1 mL of 10 OmM phosphate buffer (pH 6.5) to prepare a linoleic acid_BSA-complex solution in advance.
  • a linoleic acid_BSA-complex solution was prepared in advance.
  • Lactobacillus pout was inoculated, and at 28, 120 rpm, 48 hours By culturing with shaking, a culture solution of pH 4.9 was prepared.
  • Example 1 After sterilizing 10% skim milk medium, 5mL dispensed into a 5mL test tube (with cap), 100 / zL of linoleic acid-BSA-complex solution and 400l of the previously prepared culture of each strain was added and the cap was closed. This medium was cultured at 28 and 120 rpm for 48 hours, and a fermented milk of PH5.5 was prepared, and fatty acid analysis was performed in the same manner as in Example 1.
  • Example 8 Bifidobacterium breve YIT 10001 (FERM BP-8205) containing 10% conjugated lino skim milk, 1% glucose, and 0.1% soy peptide in a medium containing 0.1% linoleic acid or After adding 1.0% and performing homogenization treatment of 150 kg / cm 2 , sterilization treatment was performed in an autoclave at 115 for 10 minutes to prepare a fermented food preparation medium.
  • FERM BP-8205 Bifidobacterium breve YIT 10001 (FERM BP-8205) containing 10% conjugated lino skim milk, 1% glucose, and 0.1% soy peptide in a medium containing 0.1% linoleic acid or After adding 1.0% and performing homogenization treatment of 150 kg / cm 2 , sterilization treatment was performed in an autoclave at 115 for 10 minutes to prepare a fermented food preparation medium.
  • GAM brotM manufactured by Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.
  • 1 Bifidobacieriam breve YIT 10001 (FERM BP-8205) was inoculated, and cultured with shaking at 120 rpm for 48 hours at 35 to prepare a Bifidobacteritm bacterium culture solution. 6 mL of this culture solution was inoculated into 50 mL of the fermented food preparation medium previously prepared, and the gas phase was replaced with nitrogen gas.Then, the fermented food was anaerobically incubated at 35 t: 120 rpm for 72 hours. Was prepared.

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Description

明 細 書
共役脂肪酸の製造方法及び該方法により得られた飲食品 技術分野
本発明は、 特に、 Lactobacillus oris, Lactobacillus POD t is, Lactobacillu s panis, Bifidobacterium breve, Bifidobacteria^ bifida^, Bifidobacteria^ infant is, y tBifidobacteriwn pseudocatenulataaから選ばれる 1種以上の細 菌を利用して特定の共役脂肪酸を効率よく製造する方法及びこの方法により得ら れた共役脂肪酸を含有する飲食品に関するものである。 背景技術
共役脂肪酸は隣り合う炭素が単結合を挟んで二重結合を持つ脂肪酸であるが、 とりわけ炭素数 1 8の脂肪酸分子内に共役ジェンを 1個持つ共役リノール酸は、 様々な生理活性を持つことが明らかにされている。
共役リノール酸を工業的に製造する方法としては、 例えばリノール酸を含む油 脂、 あるいは遊離型のリノール酸をエチレングリコールなどの有機溶媒下で共役 化するアルカリ共役化法が知られている。
アルカリ共役化法では、 通常、 不飽和脂肪酸と過剰のアルカリとを有機溶媒中 で 1 5 0で以上に加熱する。 この時、 得られる共役脂肪酸は、 二重結合の結合位 置や配置が異なる混合物の形であり、 例えば原料にリノール酸を用いた場合には 、 c i s-9, t rans- 11型あるいは t rans- 9, c i s-l l型、 t rans- 10, c i s-12型の共役リ ノ一ル酸が得られ、 この他にも幾つかの位置あるいは幾何異性体を含んでいる。 従って、 上記共役脂肪酸の生理作用は、 共役脂肪酸の混合物としての作用であ り、 特定の共役脂肪酸が製造できれば学術的にも産業的にも応用価値は高い。 ま た、 アルカリ共役化法では、 環化およびその他の副反応も起こり、 共役脂肪酸の 収率が低下すること、 精製が困難になることなどの問題点も指摘されている。 一方、 微生物あるいはその酵素が共役脂肪酸を作ることが報告されている。 例 えば、 ル一メン細菌が多価不飽和脂肪酸から共役脂肪酸を産生すること （Shor l a nd F. B. , et al .， Nature, vol . 175, p. 1129, 1955) をはじめとして、 トレポネ —マ (Treponema) (Yokoyama, et al. , J. Bacteriology , vol.107, p519 - 527， 19 71) 、 Butyrivibrio f ibrisolvens (Kepler C. R. , et al. , J. Biol. Chem. , v ol.242, p5686-92, 1967) 、 Propionibacterium f reudenreichi i (Jiang J. , Do ctoral thesis, Swedish Uni. Uppsala, 1998 ) 、 種々の肺の病原菌の一割強 ( Jack C. I.A., et al., Clinica Chlimica Acts., vol224， pl39-4, 1994 ) など がリノール酸異性化活性を持ち、 また、 これらの微生物によって産生される共役 リノール酸は cis-9、 trans-11型異性体が主体であることも報告されている。 一方、 反芻動物は自らの体内で cis_9， trans-11型共役リノール酸を産生してい ることから、 乳製品ゃ畜肉には cis - 9， trans-11型共役リノール酸が多く含有され ており、 従って、 cis- 9, trans- 11型共役リノール酸は通常の食生活でヒトが摂取 する機会の多い共役リノール酸であると考えられる。 それゆえ、 本異性体の生理 効果については多くの研究が行われ、 種々の癌に対する防御作用があることが明 らかとなつてきた （Ha, Y.L.， et al., Cancer Research vol.50, pl097-1101, 1990, Ip ， et al., Cancer Research vol.51, p6118-6124 ) 。
以上のように、 微生物を用いれば、 抗癌作用の期待される cis-9, trans-11型 共役リノール酸含量の高い生成物が得られることが期待できる。 しかしながら、 副産物が少なく、 十分な量の共役リノール酸を産生する微生物は未だ見出されて いない。
一方、 腸内細菌の一種である乳酸菌や^ /7/flAac/er/ffiff 属細菌も食品への利用 価値の高い微生物として知られている。 W/ ^^c/eWw?属細菌は、 ヒト大腸へ 定着し、 便性改善、 腸内腐敗抑制など、 様々な有益な作用を示すことから近年で は発酵乳などにも利用されるようになってきている。
しかしながら、 Bifidobacterium属細菌は偏性嫌気性であり酸素の存在下や低 pH下では死滅しやすいため、 Bifidobacterium属細菌を用いた研究を行うには 、 適切な作業環境や熟練した操作が必要とされる。 このような理由もあって、 共 役リノール酸製造も含め c/er M属細菌を用いた物質生産に関する研究 はほとんど行われていなかった。
そのような中で、 乳酸菌を利用して共役リノ一ル酸を 0.001〜 5重量％を含有す る発酵乳組成物とその製法が提案されている （韓国特許公開番号；特 2001- 00898 58号（KR2001- 0089858)公開日 2001. 10. 12) 。
前述の通り、 アルカリ共役化法は、 高温における反応のため副反応が起こりや すく特定の共役脂肪酸を得ることが困難であり、 その後の精製工程が煩雑である などの問題点があった。 また、 微生物による変換反応では、 al l trans型共役リ ノール酸も同時に副産されてしまい、 共役リノール酸全体の産生量も必ずしも満 足し得るものではなかった。
また、 前記韓国公報において乳酸菌の利用により得られる発酵乳組成物につい て、 共役リノール酸を生成する乳酸菌としては、 ctobaciUns acidophilus, L actobacillus caseL Bifidobacteria^ longnm. Bifidobacterium adolescentis 、 Bifidobacterium breve, Bifidobacteriaia infant isが開示されているが、 同 一の種であっても菌株が相違すると生成しないことが示され、 更に、 本発明に至 る過程でもそのような示唆はあった。 また、 生成量についても、 基質のリノール 酸 1 0 0に対して、 5以上を生成する菌種は幾つかあつたが、 1 0以上を生成す る菌種は得られることはなかった。
本発明は、 こうした問題点を解決すべく、 二重結合を少なくとも二つ以上有す る不飽和脂肪酸を共役化することを目的とし、 特に、 リノール酸から生理効果の 高い cis- 9, trans-11型共役リノール酸のみを選択的かつ高い含有率で効率よく得 る方法を得ることを目的とする。 更に、 リノール酸から生理効果の高い ci s- 9, tr ans-11型共役リノール酸を高い含有率で効率良く産生する能力を有する細菌、 及 び、 共役脂肪酸を含んだ飲食品を得ることを目的とする。 発明の開示
本発明者らは、 細菌を用いた共役リノール酸の製造方法を見出すべく鋭意研究 を進めた結果、 ある籩の Lactobacillus属細菌及び Z又は /// 属細 菌に共役化処理能、 即ち、 不飽和脂肪酸分子内の二重結合の位置を移動させ二重 結合同士が互いに共役する状態に異性化する能力、 があることを見出した。
即ち、 本発明に係る共役脂肪酸の製造法は、 共役化処理能を有する Zac c ゾ las Z又は BU i dobac t er i醐属細菌の生菌、 死菌体、 菌体抽出液又は該細 菌より得た酵素を用いて、 二重結合を少なくとも二つ以上有する不飽和脂肪酸を 共役化することにより、 上述の課題を解決するものである。
具体的な共役化処理能を有する細菌としては、 共役化処理能を有する Zac/ ac illas oris, Lactobacillus pout is, Lactobacillus panis, Bifidobacterium b reve, Bifidobacteriaa bifidaa, Bifidobacteriaa infant is, X^Bifidobacte //raff /weffioca/e/iff/a/iMから選ばれる 1種以上の細菌の生菌、 死菌体、 菌体抽出 液又は該細菌より得た酵素を用いて、 二重結合を少なくとも二つ以上有する不飽 和脂肪酸を共役化する。
本発明による方法においては、 Lactobacillus属細菌及び Z又は WfMo6acter 7Mf 属細菌の生菌、 死菌体、 菌体抽出液又は該細菌より得た酵素を用いて二重結 合を少なくとも二つ以上有する不飽和脂肪酸を共役化するものであるため、 生理 活性が高いとされている cis- 9, trans-11型共役リノール酸に代表される共役脂肪 酸を選択的かつ高い含有率で高収率で製造することができる。
本発明による共役脂肪酸の製造方法で用いられる Zac oris は人の唾 液から分離された細菌である (Farrow J.A.E. et al., Int. J. Syst. Bacterio 1. vol.38, pll6, 1988) 。 菌株としては、 例えば、 Lactobacillus oris NCDO 21 60 (ATCC 49062), NCDO 2162, NCDO 2163, NCDO 2164等が挙げられ、 特に、 CDO 2160 (ATCC 49062)が好ましい。
また、 Lactobacillus pont is 、 ライ麦パン種から分離された細菌であり （V ogel.R.F. , et al., Int. J. Syst. Bacteriol., vol.44, p223-229, 1994) 、 菌 株としては、 例えば、 Lactobacillus pontis ATCC 51518, ATCC 51519等が挙げら れ、 特に ATCC 51518を用いることが好ましい。
また、 Lactobacillus panis は、 ライ麦パン種から分離された細菌であり （St rohmar, W. , Diekiann,H. , Z.Lebensm. Unters. Forsch, vol.194, p536-540, 19 92) 、 菌株としては、 例えば、 Lactobacillus panis J CM 11053等が挙げられ、 特 に JCM 11053を用いることが好ましい。
本発明による共役脂肪酸の製造方法で用いられる 7/ίΛ>Λ M/ breveは乳 児 '哺乳牛の糞便、 膣から分離された菌株である。 菌株としては、 例えば 2?// 0 bacterittn breve ATCC 15698、 ATCC 15701、 YIT 10001などが挙げられるが、 特に 、 Bifidobacterium breve YIT 10001は cis - 9， trans- 11型共役リノール酸を高い 含有率で効率良く製造することができる優れた株である。 尚、 Bifidobacterium breve YIT 10001は、 平成 1 3 ( 2 0 0 1 ) 年 8月 1 4日付けで独立行政法人産業 技術総合研究所特許生物寄託センタ一に FER Ρ- 18459として寄託され、 平成 1 4 ( 2 0 0 2 ) 年 1 0月 1 1日付けで FERM BP- 8205として、 国際寄託への移管が済 んでいる。 この Bifidobacteriwa breve ΉΊ 10001株は、 リノール酸— B S A—複 合体を含む G AM broth (日水製薬（株)社製） にて少なくとも 24時間、 前培養さ れた後、 この培養された // c/er/w 属細菌をリノール酸— B S A—複合体 を含む乳培地に 3. 8wt %接種し、 144時間振盪培養することにより、 培地中に少な くとも 0. 5mg/5mlの共役リノール酸を産生する能力を有する、 共役リノール酸産 生能の極めて高い株であるため好ましい。 このように優れた産生能を有する株は 、 これを用いてリノール酸を含む食品素材 （例えば、 乳原料） を発酵した場合に 、 発酵後の発酵食品 （例えば、 発酵乳） 中に、 生理効果を期待できる程度の共役 リノール酸を産生させることができるので、 食品製造の作業性等において特に適 したものである。
また、 Bifidobacteria infantis は、 乳児の糞便から分離された菌株である。 菌株としては、 例えは Bifidobacteriiui infaniis KC 1 5702 が挙げられる。 また、 Bifidobacterium bitidnmは、 成人 ·乳児 ·哺乳牛の糞便、 膣から分離 された菌株であり、 菌株としては、 讽えば Bifidobacteria!! bifidua Xn 4007 (F ERM BP-791)などが挙げられる。
また、 Bifidobacterima pseudocatenulataaは、 下水、 乳児の糞便、 哺乳仔ゥ シの糞便より分離された菌株であり、 菌株としては、 枫えば Bifidobacteriwa ps eudocatenalatuia ATCC 27919などが挙げられる。
本発明において、 原料として用いられる、 二重結合を少なくとも二つ以上有す る不飽和脂肪酸は特に限定されず、 例えばリノール酸、 リノレン酸、 ァラキドン 酸、 エイコサペンタエン酸、 ドコサへキサェン酸などいずれも好適に使用し得る 。 特に、 リノール酸を原料として共役リノール酸を生成させた場合、 生理活性の 報告されている特定の異性体が特異的かつ効率よく生成し、 他の異性体 （副産物 ) の量は極微量となるため好ましい。
また、 上記不飽和脂肪酸は、 塩またはエステルなどを形成していても良く、 塩 としては、 ナトリウム塩、 カリウム塩などのアルカリ金属塩、 カルシウム塩、 マ グネシゥム塩などのアルカリ土類金属塩、 アンモニゥム塩等が挙げられ、 エステ ルとしてはメチルエステル、 ェチルエステルのほか上記脂肪酸を含むその他の脂 質類 （リン旨質、 糖脂質等） 、 モノダリセライド、 ジグリセライド、 トリグリセ ライドなどを用いることも可能である。
また、 天然油脂も原料として用いることができ、 例えばリノール酸を分子内に 多く含むものとしてはサフラワー油、 綿実油、 大豆油、 ヒマヮリ種子油、 トウモ ロコシ油、 落花生油、 米ぬか油、 アマ二油、 カカオ脂などの植物由来の天然油脂 などが、 リノレン酸を分子内に多く含むものとしてはイワシ油、 二シン油、 タラ 油などの動物由来の天然油脂などが挙げられ、 さらにこれらのリパ一ゼ分解物な ども原料として用いることが可能である。
本発明においては、 二重結合を少なくとも二つ以上有する不飽和脂肪酸を含有 する培地に、 前述の Zac/oAac/'//ff 属細菌及び Z又は Wf^odacteriim属細菌を 接種し、 培養することが好ましい。 このための培地として、 乳培地を用いること が好適である。
本発明において共役脂肪酸を製造するために Zac/ // 属細菌及び/又は Bifidobacteriau属細 ¾、 特に Lactobacillus oris, Lactobacillas pontis, La ctobacillos panis, Bifidobacteria^ breve, Bifidobacteriaa bifidua, Bifid obacteriua infant is, K ~ \tBifidobacteriBB pseadocatenalataaから選ばれる 1 種以上の細菌を用いて不飽和脂肪酸を共役化する処理としては、 原料の不飽和脂 肪酸を含有する増殖培地中で細菌を培養して直接共役脂肪酸を生成させる方法、 あるいは何らかの方法で細菌を培養して集菌し洗浄した菌体 （洗浄菌体） を原料 の不飽和脂肪酸を含有する溶液に加えて反応させることにより共役脂肪酸を生成 させる方法など何れの方法を用いることも可能である。 更に、 不飽和脂肪酸を含 有する溶液中では、 細菌の生菌体のみならず、 死菌体、 菌体抽出液、 菌体から抽 出した酵素などを利用して反応を行うことも可能である。
Lactobacillas oris, Lactobacillus pontis, Lactobacillus panis, Bifidob acteriaa breve, Bifidobacterium biiidnm, BifidobacteriUE infantis, 又は B ifidobacteriaa pseadocatenalataa等の Lactobacillus属細菌及びノ又は 7 < 属細菌を培養するための培地としては、 Lactobacillus属細菌及び Z y Bifjdobacterima属細菌の増殖用に通常用いられる培地や乳を含む乳培地を 用いることができ、 特に乳を用いた培地中で不飽和脂肪酸を処理することが好ま しい。
通常用いられている増殖培地、 例えば M R S培地や G AM broth等を用いると 、 リノール酸等の原料油類が培地に分散せず処理効率も悪くなるため、 B S A ( 牛血清アルブミン） 等の脂質結合タンパク質や界面活性剤の添加や、 厳しい条件 での均質化処理が必要となる。 しかしながら、 乳培地を用いた場合には、 B S A の添加をしなくても、 原料油類の均質化が比較的容易となり、 作業性、 処理効率 が向上し、 B S A等の添加によるコスト上昇を抑制できる。 また、 B S A等の脂 質結合タンパク質や界面活性剤は、 風味への影響を与えてしまうため、 特に共役 脂肪酸を含む食品製造において本発明を用いる場合には、 B S Aを含まなくても 効率よく反応を行なえる乳培地を用い、 発酵乳を製造することが好ましい。
乳培地において、 このような優れた分散性が得られる理由としては、 乳中に含 まれる蛋白成分などの影響が考えられるが定かではない。 なお、 本明細書中にお いて乳とは、 牛乳 ·山羊乳などの獣乳の生乳、 脱脂粉乳、 全脂粉乳、 生クリーム 、 あるいは豆乳 ·アーモンド乳 ·ココナッツミルク等の植物乳の各種乳蛋白含有 物を指す。
また、 前記コスト面等の問題はあるものの、 属細菌、 Biiidoba c/er raf 属細菌による共役リノール酸の製造にあたり、 リノール酸と、 B S A、 脂質結合蛋白質および界面活性剤から選ばれる少なくとも 1種の素材との複合体 を添加した培地で全売用を行うことが好ましい。 本培養における共役リノール酸 の産生量を効果的に増加させられるためである。 尚、 前培養の時間は少なくとも 1 2時間とすることが好ましく、 特に 2 0時間以上とすることが好ましい。
また、 Lactobacillus oris, Lactobacillus pontis, Lactobacillus panis, B ifidobacteriaa breve, Bifidobacteriaa bifidau, Bifidobacterium infant is, ^Bifidobacterium pseodocatenulataa等 ( Lactobacillus属細菌及び 又は
c/er/mff 属細菌の洗浄菌体あるいは菌体末、 死菌体、 菌体抽出液などを 利用して反応を行う場合、 洗浄菌体ゃ菌体末、 死菌体、 菌体抽出液の調製は定法 に従えば良い。 例えば、 洗净菌体は、 生理食塩水や緩衝液などで培養菌体を洗浄 して得ることができ、 菌体末は凍結乾燥や噴霧乾燥などの乾燥技術により得るこ とができる。
死菌体を得る方法としては、 細胞壁溶解酵素を作用させる方法の他に、 低浸透 圧で処理する方法、 凍結融解する方法、 高圧処理する方法、 破砕処理する方法、 加熱処理する方法などが挙げられる。 中でも、 菌体を加熱処理し自己融解させる 方法は、 コストをかけずに大量の菌体を処理できる点で好ましい。 菌体抽出液は 、 上記のようにして得た洗浄菌体、 菌体末、 死菌体などに適切な溶媒を添加した 後、 遠心分離上清として得ることができる。
共役ィ匕処理能を有する ZacfoAac/ゾゾ oris, Lactobacillus pout is, Lactobac illus panis, Bifidobacterium breve, Bifidobacteria^ bifidua, Bifidobacte Tium infant is, MB ifidobacteriim psendocatenulatim力 ら選【まれる 1種以上 の細菌を用いて共役脂肪酸を製造するための共役化処理法としてより具体的には 、 例えば以下の（a) 〜（e) を挙げることができる。
(a) 前記細菌を増殖培地や乳培地 （発酵乳） 中で培養して発酵生産の形で不飽和 脂肪酸を共役化する方法
(b) 不飽和脂肪酸を前記細菌の洗浄菌体で共役化する方法
(c) 前記細菌菌末を用いて不飽和脂肪酸を共役化する方法
(d) 前記細菌死菌体を用いて不飽和脂肪酸を共役化する方法
(e) 前記細菌菌体抽出液を用いて不飽和脂肪酸を共役化する方法
以下、 処理法 (a) 〜（e) について詳述する。
(a) 前記細菌を増殖培地や発酵乳中で培養して発酵生産の形で不飽和脂肪酸を共 役化する方法：
増殖培地あるいは発酵乳中で共役化を行う際は、 基本操作は一般的に行われて いる手法で行えば良い。 ス夕一ターとしては以下のものを用いるのが好ましい。 まず菌体調製において変換能を効率的に誘導するため、 リノール酸などの不飽 和脂肪酸を M R S (LACTOBACILL I MRS BROTH, DIFCO社製）培地などの乳酸菌用増殖 培地や G AM培地 （G AM bro th, 日水製薬 (株)社製） 等の嫌気性菌用増殖培地 に添加した。 この濃度は 0 ~0. 2 %で、 特に0. 05〜0. 1 %が好ましぃ。 この際の培養は、 pH3.5〜5.5で停止することが好ましく、 特に、 4.5〜5.5で 停止することが好ましい。 PH3.5 以下まで培養すると菌の過増殖により共役化 能が低下してしまう場合もあり、 PH5.5 以上では共役化を行うのに充分な菌体 量が得られないためである。
以上のようにして培養した培養液をスターターとして用いるのが好ましく、 ス ター夕一接種量は発酵乳調整用培地の 0.5~ 8 %が好ましく、 特に 1〜 4 %程度が 好ましい。 原料は培地中に 0.02〜0.8%程度が好ましく、 特に 0.1〜0.2%が好まし い。 培養温度は 20〜4 Ot:程度、 好ましくは 28〜3 7Tである。
より効率良く目的とする共役脂肪酸を得るためには培養は pH3.5〜5.5で停止 することが好ましく、 特に pH4.5~5.5で停止することが好ましい。 また、 中和 培養でも同様に目的とする共役脂肪酸を得ることが出来る。
(b) 不飽和脂肪酸を前記細菌の洗浄菌体で共役化する方法：
処理法（a) のスターター調製時と同様の培養条件によって培養した菌体を生理 食塩水にて洗浄したものを回収し、 緩衝液に懸濁させた。 この菌体を懸濁させる 緩衝液および洗浄菌体反応は適度な pHを維持できる条件の水溶液を用いて行う 。 例えば 0.1〜し 0Mのリン酸緩衝液が好ましく、 。？1は5.0〜7,5でぁるが、 好ま しくは 6.0〜7.0である。 菌体懸濁液の菌体濃度は、 湿重で 0.025~0.25%であり、 好ましくは0.025〜0.1%でぁる。 原料は、 添加時の原料を牛血清アルブミン （B S A) との混合液としており原料濃度は反応溶液中に 0.1〜4.0%程度添加するこ とが好ましく、 特に 0.3〜1.0%が好ましい。
また、 BS Aの混合比率は原料に対して 5分の 1程度が好ましい。 洗浄菌体に よる変換反応の際の温度は 20〜52でだが、 好ましくは 32〜 3 7でである。 変換生成の適正な時間は 1〜96時間であり、 好ましくは 24〜 72時間である 。 なお、 pHを中和しながら培養した菌体も同様に用いることが出来る。
(c) 前記細菌菌末を用いて不飽和脂肪酸を共役化する方法：
細菌菌末は、 例えば処理法 (a) のスター夕一調製時の培養条件と同様の方法に て得た細菌菌体を乾燥処理により粉末化することにより得ることが出来る。 乾燥 処理方法としては凍結乾燥、 噴霧乾燥などを利用することができる。 なお、 菌末 調製後の変換反応は、 処理法 (b) の洗浄菌体反応の反応条件と同様に行えば良い (d) 前記細菌死菌体を用いて不飽和脂肪酸を共役化する方法： 前記細菌菌体は、 例えば処理法 (a) のスター夕一調製時の培養条件と同様の方 法にて得た前記細菌菌体の細胞壁を破壊することにより得ることが出来る。 細胞 壁破壊は、 細胞壁破壊酵素で処理する方法や、 菌体を溶媒に懸濁させて低浸透圧 で処理する方法、 凍結融解する方法、 高圧処理する方法、 破砕処理する方法、 加 熱処理する方法などを利用することができる。 細胞壁破壊液調整後の変換反応は 、 処理法（b) の洗浄菌体反応の反応条件と同様に行えばよい。
(e) 前記細菌菌体抽出液を用いて不飽和脂肪酸を共役化する方法：
前記細菌菌体抽出液としては、 例えば処理法 (b) 〜（d) と同様の方法にて得た 前記細菌洗浄菌体、 菌体末、 死菌体などを適切な溶媒で抽出し、 遠心分離などの 方法により残漬を除去して得ることが出来る。 なお、 菌体抽出液調製後の反応は 、 処理法（b) の洗浄菌体反応の反応条件と同様に行えばよい。
上記 (a) 〜(d) 等、 前記細菌により得られる反応液または培養液の脂肪酸組成 は、 ガスクロマトグラフィー分析により内部標準物質と各脂肪酸の面積値の比率 をもとに各脂肪酸量を算出できる。 なお、 例えば、 共役リノール酸を対象とする 場合には、 ガスクロマ卜グラフィ一は表 1に示す条件で行えばよい。
GC分析条件
GC system ジ一エルサイエンス社製 GC- 353B
GC14A (島津製作所製）
Colum DB-23(ID 0.25讓 X 30m)
Oven 160で→220で (at 2Τ/ηιΐη)
Inj Temp 250
Det Temp 250Ό
Carrier Gas N2(50mL/min)
Detector FID
Sam le Size 1 L in hexane
Sprit 1/100 本発明により得られる共役脂肪酸は、 医薬品、 食品、 化粧品等の形態で投与す ることができる。 例えば共役リノールの生理効果を訴求する医薬品や栄養補助食 品等の形態で用いる場合であれば、 カプセル剤、 顆粒剤、 錠剤、 散剤等の固形製 剤、 或いはシロップ剤等の液状製剤として経口投与することができる。 また、 経 口投与剤でなくとも、 注射剤、 皮膚外用剤、 直腸投与剤等非経口形態で投与する ことも可能である。
各製剤の製造時には、 乳糖、 澱粉、 結晶セルロース、 乳酸カルシウム、 メタケ ィ酸アルミン酸マグネシウム、 無水ケィ酸等の賦形剤、 白糖、 ヒドロキシプロピ ルセルロース、 ポリビニルピロリドン等の結合剤、 カルポキシメチルセルロース 、 カルボキシメチルセルロースカルシウム等の崩壊剤、 ステアリン酸マグネシゥ ム、 タルク、 モノグリセリド、 蔗糖脂肪酸エステル等の滑沢剤や、 その他、 医薬 •食品等として許容され待る成分を適宜使用すればよい。
また、 同様の生理効果を期待して一般食品形態 （ 「明らか食品」 の形態） で用 いる場合には、 本発明の方法により得られた共役脂肪酸をそのまま或いは適宜精 製処理したものを油脂、 錠菓、 発酵乳、 飴、 調味料、 ふりかけ等の飲食品に添加 し、 常法を用いて製造すればよい。 発酵食品として用いる場合には、 発酵原料中 の二重結合を二つ以上有する脂肪酸を添加し、 発酵菌により発酵 （培養） させ、 製造することができる。 特にリノール酸を含む乳を発酵した発酵乳とすれば、 前 記のとおり c i s- 9, t rans- 1 1型共役リノール酸を特異的かつ多量に含有させること が容易であるため好ましい。
本発明は、 特に、 Lactobacillus oris ATCC 49062, Lactobacillus pontis AT CC 51518, Lactobacillus pontis ATCC 51519, Lactobacillus pan is J CM 1 1053 ， Bifidobacterium breve YIT 10001 , Bifidobacteriaa breve ATCC 15698, Bif idobacteriutt breve ATCC 15701 , Bifidobacteriuai bifidasi YIT 4007, Bifidob acteriu infant is ATCC 15702 ^OSBifidobacteriwa pseudocatenulattm KKi 27919から選ばれる 1種以上を用いることにより、 共役リノール酸の殆どが c i s-9 ， t rans-1 1型共役リノール酸である組成物を得ることができる。 尚、 本発明におい て、 高含有 c i s-9, t rans-1 1型共役リノール酸組成物とは、 c i s- 9, t rans-1 1型共役 リノール酸を除く各種共役リノール酸異性体の比率が少なくとも全ての共役リノ ール酸に対して、 1 0 %を越えない共役リノール酸組成物を指し、 このような組 成物は食品等への利用に際し、 低い添加量で制癌作用等の生理作用を期待でき、 風味面、 作業性からも優れたものである。 特に、 c i s-9, t rans - 1 1型共役リノール 酸を除く各種共役リノール酸異性体の比率が 4 %を超えない組成であることが好 ましい。
本発明は更に、 上述の本発明による方法によって得られた共役脂肪酸を含有す る飲食品も提供する。
なお、 発酵乳とは、 乳等省令により定められている発酵乳、 乳製品乳酸菌飲料 等の生菌含有タイプの飲料や殺菌処理の施された発酵乳を含有する乳性飲料、 更 には、 ケフィァ等のことである。 発酵に際しては、 その他の菌、 例えば Zac/oAac illns casei、 Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus gasser Lactobaci lias zeae, L&ctobacillus johnsoiiii、 Lactobacillus delbraec iiiss. balgari ens) , Lactobacillus delbmecki iiss, delbruecki i)等の Lactobaci I Ins属細菌や Streptococcus tbemophilns等の Streptococcus属細菌、 Lactococcus lactisi ss* JacUs)、 Lactococcas lac ί is (ss. creaoris) , Lactococcas plantaraa^ Lact ococcns raffinolactis等の Lactococcus属細菌、 Leaconostoc ttesenteroides^ Leuconostoc lact is Leaconostoc属細菌、 Enterococcas feacalis^ Eatero coccus faeciam等の Enterococcns属細菌等を使用できる。
また、 Bifidobacteriua breve, Bifidobacterina bifidwn、 Bifidobacterium loDgam, Bifidobacterium aniaalis等の i'i oAac/er/flffl属細菌や酵母その他 の微生物を使用しても良い。 これらは、 1種または 2種以上を組み合わせて使用 することができる。
また、 これらの食品には、 その他の食品素材、 すなわち、 各種糖質や乳化剤、 増粘剤、 甘味料、 酸味料、 果汁等を適宜配合してもよい。 具体的には、 蔗糖、 異 性化糖、 グルコース、 フラクトース、 パラチノース、 卜レハロース、 ラクトース 、 キシロース等の糖類、 ソルピトール、 キシリトール、 エリスリトール、 ラクチ トール、 パラチニット、 還元水飴、 還元麦芽糖水飴等の糖アルコール、 ショ糖脂 肪酸エステル、 グリセリン脂肪酸エステル、 レシチン等の乳化剤、 カラギーナン 、 グァ一ガム、 キサンタンガム、 ぺクチン、 口一カストビーンガム等の増粘 （安 定） 剤、 が挙げられる。 この他にも、 ビタミン A、 ビタミン B類等の各種ビ夕ミ ン類ゃカルシウム、 鉄、 マンガン、 亜鉛等のミネラル類を配合してもよい。 これら医薬品、 食品等の形態での使用に際しては、 本発明の方法により得られ た共役脂肪酸を適宜配合することができる。 また、 共役脂肪酸の生理効果を訴求 する場合であれば、 その効果を得られかつ過剰摂取等の問題が生じない程度の量 、 10mg〜1000mg/日程度の摂取が見込まれる量を適宜配合しておけば良い。 図面の簡単な説明
図 1は Zac/ ac///ffj oris によって産生された共役リノール酸の異性体のガス クロマトグラムのチャートであり、 a図はリノール酸標準品、 b図は共役リノ一 ル酸標準品、 c図は Zac ^^ // による反応液のチャートを示す。 尚、 図 中のピーク Αは内部標準物質（17:0)、 ピーク Bはリノール酸、 ピーク Cは cis - 9， tran- 11型共役リノール酸、 ピーク Dは ans-10，cis- 12型共役リノール酸、 ピー ク Eは全 cis型共役リノール酸、 ピーク Fは全 trans型共役リノール酸、 ピーク C + D + E + Fは共役リノール酸を示す。 発明を実施するための最良の形態
以下、 実施例により本発明を具体的に説明するが、 本発明はこれら実施例にな んら制約されるものではない。
実施例 1 ：共役脂肪酸を産生する Z / /// w属細菌のスクリーニング
10 OmMリン酸緩衝液 （pH6.5) 1 mL中にリノール酸 5 Omgと BSA 1 Omgを 溶解し、 あらかじめリノール酸— BSA—複合体溶液を調製した。
15 mLの 0.07%リノール酸含有 MRS (LACTOBACILLI MRS BROTH, DIFC0社製） 培 地に Zac /ひ 属細菌を接種し、 28t：、 120 r pm、 20時間振盪培養 した。 得られた培養液は pH 4.7であった。
この培養液を遠心分離して菌体を回収し生理食塩水で 2回洗浄して洗浄菌体を 得た。 この洗浄菌体にリノール酸一 BSA—複合体溶液を 100iiL、 lOOmMリン酸緩 衝液 （PH6.5) を 0.9mL添加し、 酸素吸収 ·炭酸ガス発生剤 （Anaero Pack, 三 菱ガス化学 (株)社製） にて嫌気状態に保った酸素不透過性のビニール袋内で 37 で、 1 20 r pmで 24時間反応した。
得られた反応液に内部標準物質 （HEPTADECANOIC ACID) を lmg添加後 Bl igh- Dye r 法にて抽出し、 メチルエステル化 （4%塩酸メタノール溶液で 30分間室温静 置） 後、 ガスクロマトグラフィーの分析に供し脂肪酸分析を行った。
共役リノール酸のピークは標準品 （リノール油脂製 CLA80) のリテンション タイムを基準に判断し、 基質として添加したリノール酸を 1 00とした時の相対 値を算出した。 その結果、 表 2に示したように c/o σ/ で共役リノ一 ル酸の産生が認められた。 この σ/ NCD02160は、 ATCC 49062とし てアメリカン ·タイプ ·カルチヤ一 ·コレクション (ATCC)に登録されている。 表 2
Figure imgf000016_0001
実施例 2：共役脂肪酸を産生する // i/ ac/e /flffl属細菌のスクリーニング
l O OmMリン酸緩衝液 （pH 6.5) 1 mL中にリノール酸 5 Omgと BSA 1 Omgを 溶解し、 あらかじめリノール酸一 BSA—複合体溶液を調製した。 このリノール酸 - BSA—複合体溶液 200 zLを GAM broth (日水製薬 (株）社製） 1 5mLに添加後、 Bifidobacteriuia 1 5菌株をそれぞれ接種し 3 5で、 120rpm、 48時間振盪培養 し、 Bifidobacteri a属細菌培養液を調製した。
1 5mL容試験管 （キャップ付き） に 5mL分注した 1 0%スキムミルク （グ ルコース 1 %、 大豆ペプチド 0.1%添加） 培地に、 リノール酸一 BS A—複合体 溶液を 1 00 X L (リノール酸含量 5mg) および先に調製した /// i¾Aac/ey /ω?属細菌培養液を 200 添加し、 キャップを閉めた。 この培地を 3 5で、 120 111で144時間振盪培養し発酵乳を調製した。 得られた発酵乳に内部標準物 質 (HEPTADECANOIC ACID) を 1 m g添加後 Bl igh-Dyer法にて抽出し、 メチルエス テル化 （4%塩酸メタノール溶液で 30分間室温静置） 後、 ガスクロマトグラフ ィ一の分析に供し脂肪酸分析を行つた。 結果を次の表 3に示す。
表 3
144時間培養発酵乳 (誘導：リノール酸） 単位 (mg/5mL)
YIT 外部登録 培 リノ-ル共役リノ一 -ル酸 ヒドロキシ酸 後 c9- tio- all oth菌株名 No. 機関 No. 酸 H0A1 H0A2
PH tll cl2 トランス ers
B. adolescent is 4011 ATCC 15703 3.6 1.08 0.00 0.00 0.00 0.08 1.32 0.56
B. adolescent is 4087 J CM 7042 3.6 1.04 0.00 0.01 0.00 0.10 1.57 0.33
B. bifidm 4007 FERM BP - 791 3.5 3.84 0.02 0.00 0.00 0.07 0.18 0.69
B. bifidm 4013 5.2 1.41 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.85
B. breve 4064 3.6 3.11 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.76
B. breve 4065 3.6 1.93 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.46
B. breve 10001 FERM BP- 8205 3.5 0.61 0.57 0.00 0.02 0.00 0.00 0.31
B. cat enala turn 4016 ATCC 27539 3.3 2.99 0.00 0.00 0.00 0.06 0.49 0.66
B. cateDalatw 4118 J CM 7130 4.4 3.99 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.73
B. infant is 4018 ATCC 15697 6.0 4.28 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.89
B. infantis 4019 ATCC 15702 4.7 0.87 0.05 0.00 0.00 0.00 0.00 0.52
B.1 act is 4121 DSM 10140 4.3 3.81 0.00 0.00 0.00 0.05 0.07 0.61
B. lottgtm 4021 ATCC 15707 3.8 2.81 0.00 0.00 0.00 0.06 0.56 0.70
B. longtm 4037 ATCC 15708 3.6 0.99 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.27
B.
4072 ATCC 27919 3.7 4.02 0.02 0.00 0.00 0.00 0.00 0.99 pseadoca tenula tm 共役リノール酸のピークは標準品 （リノール油脂製 CLA80) のリテンシ ヨンタイムを基準に判断し、 解析を行った。 その結果、 Bifidobacterima breve YIT 10001 (FERM BP— 8205) 、 Bifidobacterium infantis ATCC 15702, Bifidobac teriua bifiduB FERM BP- 791、 Bifidobacterium pseadocateaalatam ATCC 27919 で共役リノール酸の産生が認められた。
特に、 BifidobacteriOM breve YIT 10001 (FERM BP - 8205)は添加したリノール酸 (5mg) のうち 11.4% (=0.57mg/5mgX 100)が共役リノール酸に変換されており 、 これら産生された共役リノール酸のほとんどが （96 %以上（0.57/0.59X 100) ) cis- 9, trans-11型共役リノール酸であった。 しかしながら、 じ Bifidobacter iuB breveでも Bifidobacteriwn breve YIT 4 や Bifidobacteriasi breve YIT 4 065 には共役リノール酸産生活性は認められず、 共役リノール酸産生活性は '// dobacterium breveの中でも特別な菌株に限定されることが確認された。 実施例 3： Lactobacillus属細菌の共役脂肪酸の異性体の同定
実施例 1で Zac / oris によって産生された共役リノール酸の異性体を 調べた。 図 1は Z ^^ /// ffi orisによって産生された共役リノール酸の異性体 のガスクロマトグラムのチャートである。 図 1に示したように ZaWoAac///な j or isによって産生された共役リノール酸の全てが cis- 9， trans-11型共役リノール酸 であった。 以上の結果から、 数あ
Figure imgf000018_0001
iが選択的、 且つ高い含有率で効率的に cis-9, trans-11型共役リノール酸を産生することが明 らかとなつた。 実施例 4：発酵乳中での Zac/o 属細菌の共役脂肪酸の産生
l O OmMリン酸緩衝液 （pH6.5) 1 mL中にリノール酸 5 Omgと BSA 1 Omgを 溶解し、 あらかじめリノール酸一 BSA —複合体溶液を調製した。 このリノール酸 一 BSA—複合体溶液 2 0 O juLを MRS (LACTOBACILLI MRS BROTH, DIFC0社製） 培地 1 5mL に添加後、 Lactobacillus oris を接種し 28で、 1 20 r pm, 20時 間振盪培養し、 PH4. 7の培養液を調製した。
1 5mL 容試験管 （キャップ付き） に 5mL 分注した 1 0%スキムミルク （グ ルコース 1 %、 大豆ペプチド 0.1%添加） 培地に、 リノール酸— BSA—複合体溶液 を 1 0 0 L、 先に調製した各菌株の培養液を 200 / L添加し、 キャップを閉め た。 この培地を 28 "C、 1 2 0 r pmで 48時間培養し PH4.6 の発酵乳を調製 し、 実施例 1と同様に脂肪酸分析を行った。
その結果、 添加したリノール酸の 2. 0%が共役リノール酸に変換されていた 。 産生された共役リノ一ル酸の全てが cis-9、 trans-11型共役リノール酸であり、 実施例 3と同様の結果が得られた。 以上の結果から、 発酵乳中でも Zac/ ac/ゾ/な s orisが選択的、 且つ効率的に cis- 9， trans-11型共役リノール酸を産生すること が明らかとなった。 実施例 5 ： BiiidobacteriOM属細菌の洗浄菌体反応における共役脂肪酸の産生
1 0 OmMリン酸緩衝液 （pH 6.5) lmL中にリノール酸 5 Omgと BSA1 Omgを溶解し、 あらかじめリノール酸— B SA—複合体溶液を調製した。
このリノール酸— B SA—複合体溶液を 1 5mLの GAM broth (日水製薬（株)社 製）に 0.07%の割合で添加した後 //ゾ i aWei breve YIT 10001 (FERM BP-820 5) をそれぞれ接種し、 3 5で、 120rpm, 48時間振盪培養した。 この培養液を遠 心分離して菌体を回収し生理食塩水で 2回洗浄して洗浄菌体を得た。
この洗浄菌体にリノール酸一 B S A—複合体溶液を 1 0 O L、 1 0 OmMリ ン酸緩衝液 (pH 6.5) を 0.9mL添加し、 窒素ガスにて気相を置換後密栓をし試 験管内を嫌気状態に保ち 37で、 120rpmで 7 2時間反応した。
得られた反応液に内部標準物質 (HEPTADECANOIC ACID)を 1 m g添加後 Bl igh- Dy er法にて抽出し、 メチルエステル化 （4%塩酸メタノール溶液で 3 0分間室温静 置） 後、 ガスクロマトグラフィーの分析に供し脂肪酸分析を行った。
その結果、 Bifidobacterium breve YIT 10001 (FERM BP-8205)では、 添加した基 質中のリノール酸の 0.9%が cis-9， trans- 11型共役リノール酸に変換されていた。 実施例 6 ： Lactobacillus oris死菌体による共役脂肪酸の産生
1 0 OmMリン酸緩衝液 （pH6.5) 1 mL中にリノール酸 5 Omgと BSAl Omgを 溶解し、 あらかじめリノール酸一 BSA —複合体溶液を調製した。 このリノール酸 一 BSA—複合体溶液 2 0 O Lを MRS (LACTOBACILLI MRS BROTH, DIFCO社製) 培地 1 5mL に添加後、 Lactobacillus orisを接種し 28 , 1 20 r pm, 20時 間振盪培養し、 PH4.7 の培養液を調製した。
この培養液 0.5mLを、 0.3¾!glc加 I L S培地 15raLに接種し、 37で、 1 20 rpm で 1 8時間 （PH5.6まで） 培養し、 遠心分離して菌体を回収し 0.2Mグリシン緩 衝液 （pHlO.6) で 2回洗浄し、 洗浄後菌体を 6.7%蔗糖— 5 OmMトリスァミノ メタン— ImM EDTA溶液 2mLに溶解した。 この液に lysozyme溶液（10mg/mL in 25mM トリスァミノメタン ， pH8.0、 生化学工業 (株)社製） 0.8mLおよび N- Acet ylmuramidase水溶液 （lmg/mL 、 生化学工業（株)社製） 0.15mLを添加し、 37で 、 1 20 r pmで 3 0分反応した。 反応液をセントリプレップ 1 0 (amicon社製 ) に移し濃縮操作を行うことにより Zac/ ori 死菌体懸濁液を約 0.6m L 得た。
この死菌体懸濁液にリノール酸—BSA—複合体溶液を 1 00 L、 1 0 OmMリン 酸緩衝液 （PH6.5) を 0.9mL添加し、 酸素吸収 ·炭酸ガス発生剤 （Anaero Pack 、 三菱ガス化学 (株）（株)社製） にて嫌気状態に保った酸素不透過性のビニール袋 内で 37で、 1 20 r pmで 24時間反応した。
得られた反応液について実施例 1と同様に脂肪酸分析を行った結果、 添加した リノール酸の 1. 6%が共役リノール酸に変換されていた。 産生された共役リノ —ル酸の全てが cis-9， trans-11型共役リノール酸であり、 洗浄菌体および発酵乳 中と同様の結果が得られた。 以上の結果から、 細胞壁を破壊した死菌体でも Zac/ obacillus w 'iが選択的、 且つ効率的に cis- 9, trans- 11型共役リノール酸を産生 することが明らかとなった。 実施例 7 ： Lactobacillus pout isによる共役脂肪酸の産生
1 0 OmMリン酸緩衝液 （pH6.5) 1 mL中にリノール酸 5 Omgと BSAl Omgを 溶解し、 あらかじめリノール酸 _BSA —複合体溶液を調製した。 このリノール酸 — BSA -複合体溶液 2 00 を MRS (LACTOBACILLI MRS BROTH, DIFCO社製) 培地 1 5mL に添加後、 Lactobacillus pout is (ATCC 51518) を接種し 28で、 1 2 0 r pm、 48時間振盪培養し、 pH4.9 の培養液を調製した。 1 5mL 容試験管 （キャップ付き） に 5mL 分注した 1 0%スキムミルク培地 を滅菌後、 リノール酸— BSA —複合体溶液を 1 00 /zL 、 先きに調整した各菌株 の培養液を 400 l添加し、 キャップを閉めた。 この培地を 2 8 、 1 20 r pmで 48時間培養し、 PH5.5の発酵乳を調整し、 実施例 1と同様に脂肪酸分析 を行った。
その結果、 添加したリノール酸の 0. 5 %が共役リノール酸に変換されていた 。 産生された共役リノ一ル酸の全てが cis- 9， t rans- 11型共役リノール酸であった 。 以上の結果から、 Lactobacillus pont is繩糊、 且つ高い含有率で効率的に cis-9, trans- 11型共役リノール酸を産生することが明らかとなった。 実施例 8 ： Bifidobacterium breve YIT 10001 (FERM BP-8205)を用いた共役リノ一 脱脂粉乳を 1 0%、 グルコースを 1 %、 大豆ペプチドを 0.1%含む培地に、 基 質としてリノール酸を 0.1%または 1.0%添加して 1 50 k g/cm2 の均質化処 理を行った後、 オートクレーブで 1 1 5で、 1 0分間の滅菌処理を行い発酵食品 調製用培地を作製した。
GAM brotM日水製薬（株）社製） 1 こ Bifidobacieriam breve YIT 10001 (F ERM BP-8205)を接種し 3 5で、 120rpm、 48時間振盪培養し、 Bifidobacteritm 属細菌培養液を調製した。 この培養液 6 m Lを先に作製した発酵食品調製用培地 1 50mLに接種し、 気相を窒素ガスにて置換後、 嫌気的に 3 5t:、 120rpmで 7 2時間静置培養し発酵食品を調製した。
得られた反応液について実施例 2と同様に脂肪酸分析を行った結果、 添加した リノール酸の一部が、 共役リノール酸に変換されていることが判った。 産生され た共役リノ一ル酸の全てが c i s - 9， t rans-11型共役リノ一ル酸であつた。
また、 調製した発酵食品の官能評価を行ったところ、 リノール酸無添加のもの と同等のものが得られた。

Claims

請求の範囲
1 . Lactobacillus oris , Lactobacillus pontis , Lactobacillus panis , Bifidobacterina breve , Bifidobacterina infant is , Bifidobacterium bifid 又は Bifidobacteriim pseadocatenulatainの細菌種から選ばれる 1種以上の 共役化処理能を有する細菌の生菌、 死菌体、 菌体抽出液又は該細菌より得た酵素 を用いて、 二重結合を少なくとも二つ以上有する不飽和脂肪酸を共役化する工程 を含むことを特徴とする共役脂肪酸の製造法。
2 . 前記共役化処理能を有する細菌として、 Lactobacillus oris ATCC 49062, Lactobacillus pontis ATCC 51518, Lactobacillus pontis ATCC 51519, Lactob acillas panis J CM 1 1053, Bifidobacterina breve YIT 10001 (FERM BP- 8205)， Bifidobacterina breve ATCC 15698, Bifidobacterium breve ATCC 15701 , Bifi dobacterinm biiidnm YIT 4007 (FERM BP-791) , Bifidobacterina infantis ATCC
15702 Bindobacterittm pseudocatenulatim K X 27919から選ばれる 1種以 上を用いることを特徴とする請求項 1に記載の共役脂肪酸の製造法。
3 . 二重結合を少なくとも二つ以上有する不飽和脂肪酸として、 リノール酸を 用いることを特徴とする請求項 1に記載の共役脂肪酸の製造法。
4 . 前記共役化する工程が、 二重結合を少なくとも二つ以上有する不飽和脂肪 酸を含有する培地に、 前記共役化処理能を有する細菌を接種し、 培養する工程を 含むことを特徴とする請求項 1に記載の共役脂肪酸の製造法。
5 . 前記培地として乳培地を用いて、 共役脂肪酸含有発酵乳を得ることを特徴 とする請求項 4に記載の共役脂肪酸の製造法。
6 . 前記培地として脂質結合タンパク質及び界面活性剤を含まない乳培地を用 いて、 共役脂肪酸含有発酵乳を得ることを特徴とする請求項 4に記載の共役脂肪 酸の製造法。
7 . 前記共役化処理能を有する細菌として、
リノール酸を共役リノール酸に変換する能力を有し、
次の（a) 及び (b) 工程によって、 培地中に添加された基質のリノール酸を 1 0 0とした場合の共役リノール酸の値が 1 0を越える共役リノール酸を産生する能 力を有する細菌を用いることを特徴とする請求項 1に記載の共役脂肪酸の製造法
(a) リノール酸と、 B S A、 脂質結合蛋白質および界面活性剤から選ばれる少 なくとも 1種の素材との複合体を含む増殖培地にて少なくとも 1 2時間前培養す る工程、
(b) リノール酸を含む乳培地に、 工程（a) で得られた共役化処理能を有する細 菌を接種し予め定められた時間振盪培養する工程、
8 . 共役化処理能を有する細菌の生菌、 死菌体、 菌体抽出液又は該細菌より得 た酵素を用いて、 リノ一ル酸を共役化する共役リノ一ル酸を含む組成物を得る製 造法において、
前記細菌として、 Lactobacillus oris ATCC 49062, Lactobacillus pontis AT CC 51518, Lactobacillus pontis ATCC 51519, Lactobacillus pan is J CM 1 1053 , Bifidobacteriaa breve YIT 10001 (FERM BP-8205) , Bifidobacterium breve A TCC 15698, Bifidobacteriaa breve ATCC 15701 , Bifidobacteriaa biiidum YIT 4007 (FERM BP-791) , Bifidobacterium infant Js ATCC 15702 Biiidobacter ium pseadocatenalatttjs ATCC 27919から選ばれる 1種以上を用いることにより、 共役リノール酸の殆どが c i s_9, t rans-1 1型共役リノール酸である高含有 c i s- 9, t r ans- 1 1型共役リノール酸組成物を得ることを特徴とする高含有 c i s- 9， t rans- 1 1型 共役リノール酸組成物の製造法。
9 . 次の（a) 及び (b) 工程によって、 培地中に添加された基質のリノール酸を 1 0 0とした場合の共役リノール酸の値が 1 0を越える共役リノール酸を産生す る能力を有する細菌の共役化処理への使用。
(a) リノール酸と、 B S A、 脂質結合蛋白質および界面活性剤から選ばれる少 なくとも 1種の素材との複合体を含む増殖培地にて少なくとも 1 2時間前培養す る工程、
(b) リノール酸を含む乳培地に、 工程 (a) で得られた共役化処理能を有する細 菌を接種し予め定められた時間浸透培養する工程、
1 0 . 前記細菌が Zac/oAac〃/な j oris ATCC 49062又は breve YIT 10001 (FERM BP-8205)であることを特徴とする請求項 9に記載の細菌の共役 化処理への使用。
1 1 . 請求項 1に記載の方法により得られた共役脂肪酸を含有する飲食品。
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