KR101655848B1 - 공액리놀레산을 생산하는 비피도박테리움 비피덤 cbg-c12 균주 및 이의 용도 - Google Patents

공액리놀레산을 생산하는 비피도박테리움 비피덤 cbg-c12 균주 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 공액리놀레산(Conjugated Linoleic acid; CLA)을 생산하는 비피도박테리움 비피덤 CBG-C12 균주, 상기 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 공액리놀레산 생산용 미생물 제제, 캡슐제, 기능성 식품, 자양 강장제, 동물 사료용 조성물과 약학 조성물, 및 상기 균주를 배양하는 단계를 포함하는 공액리놀레산을 생산하는 방법을 제공한다.

Description

공액리놀레산을 생산하는 비피도박테리움 비피덤 CBG-C12 균주 및 이의 용도{Bifidobaterium bifidum CBG-C12 strain producing conjugated linoleic acid and uses thereof}
본 발명은 공액리놀레산을 생산하는 비피도박테리움 비피덤(Bifidobaterium bifidum) CBG-C12 균주 및 이의 용도에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 공액리놀레산(Conjugated Linoleic acid; CLA)을 생산하는 비피도박테리움 비피덤 CBG-C12 균주, 상기 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 공액리놀레산 생산용 미생물 제제, 캡슐제, 기능성 식품, 자양 강장제, 동물 사료용 조성물과 약학 조성물, 및 상기 균주를 배양하는 단계를 포함하는 공액리놀레산을 생산하는 방법에 관한 것이다.
CLA(conjugated linoleic acid)는 필수지방산인 리놀레산(linoleic acid, 이하 'LA'라 한다)의 공액화 이성체로, 반추동물의 젖이나 근육에서 미량으로 발견되는 천연 지방산 성분이다. CLA는 사슬 내부의 시스(cis)-9 및 트랜스(trans)-11 또는 트랜스-10 및 시스-12 위치에 사슬 내부의 트랜스(trans) 배열에 공액화 이중결합을 가지는데, 특히 시스-9 및 트랜스-11 부위의 공액화 이중결합으로 인해 인체에 유용한 생리활성을 나타낸다. CLA는 동맥경화증의 발생저하, 면역기능 향상, 항암작용, 성장촉진 및 당뇨병 등의 질환에 대해 우수한 치료 효과를 나타내며, 체지방감소를 통해 비만을 억제한다고도 알려져 있다. 이러한 특성으로 인해 CLA는 기능성 식품 및 의약품의 유효성분으로 유용하게 이용될 수 있다. CLA는 주로 동물성 식품에 함유되어 있으며, 특히 반추동물에 많이 존재하는 것으로 알려져 있다. 쇠고기의 CLA 함량은 2.9~4.3㎎ CLA/fat이며, 어린양에서는 5.6㎎ CLA/fat이고, 해산물에서는 0.3~0.6㎎ CLA/fat이 존재하는 것으로 확인되었다. 인간의 일일 CLA 섭취량은 채식 위주인 동양인의 경우에는 0.1g/day이고, 육식을 많이 하는 서양인의 경우는 0.4g/day로 예상되고 있다.
현재까지 CLA의 대량 생산을 위해 여러 가지 방법이 개발되어 왔다. 기존의 방법은 요소부가법, 분자증류법, HPLC 방법 등 CLA를 LA로부터 화학적으로 합성하는 방법들이 있으며, LA를 CLA로 전환시킬 수 있는 활성을 지닌 미생물이 다수 분리된 바 있다. 그러나 화학적 합성법들은 고가의 장비를 필요로 하거나, 공정에 너무 많은 시간이 소요되는 등의 문제가 많다. 또한 이들 방법은 단일 종류의 CLA 뿐 아니라 다양한 종류의 이성체들을 함께 생성하기 때문에, 기존의 화학적 방법으로 기능성이 인정된 종류의 CLA 이성체만을 생산하는 것은 매우 어려운 공정이다.
현재, CLA를 효율적으로 생산할 수 있는 방법은 CLA를 생성할 수 있는 미생물로부터 CLA를 생산, 분리하는 것이다. CLA를 생성하는 것으로 알려진 대표적인 미생물은 비피도박테리움(Bifidobactrium), 락토바실러스(Lactobacillus), 프로피오니박테리움(Propionibacterium), 부티리비브리오 피브리솔벤스(Butyrivibrio fibrisolvens) 등의 장내 미생물이며, 이 미생물은 많은 국가에서 가축에게 투여하는 생균제(probiotics), 사료 등의 기능성 식품 또는 의약품의 유효성분으로 유용하게 사용되고 있다.
대한민국 식품의약품안전처(KFDA)가 기능성 원료로서의 CLA 규격을 시스-9 및 트랜스-11(c-9, t-11)과 트랜스-10 및 시스-12(t-10, c-12), 시스-9 및 시스-11(c-9, c-11), 트랜스-9 및 트랜스-11(t-9, t-11)의 합으로 규정하고 있고(660~850 mg/g), 각 성분의 비율은 시스-9 및 트랜스-11과 트랜스-10 및 시스-12의 함량의 합이 CLA 함량 중 90% 이상이어야 하고, 트랜스-9 및 트랜스-11의 함량은 3% 이하이어야 한다고 규정하고 있다. 현재까지 알려진 바에 의하면, 장내 미생물에 의해 합성된 CLA는 시스-9 및 트랜스-11과 트랜스-10 및 시스-12의 비율이 약 50%씩 생성되는 화학적인 합성법과는 달리, 시스-9 및 트랜스-11과 트랜스-10 및 시스-12가 약 6:4의 비율로 생성되지만, 그 비율은 종마다 다른 것으로 알려져 있다. 반추동물 유래의 육유에서는 소량의 시스-9 및 트랜스-11이 확인되지만, 탈지유를 이용한 발효 유제품에서는 매우 낮은 시스-9 및 트랜스-11이 검출될 뿐이며, 특히 각종 유산균을 이용한 발효 김치에서도 시스-9 및 트랜스-11이 존재하지 않는 것으로 알려지고 있다.
한국공개특허 제2001-0047292호에서는 락토바실러스 속 미생물을 이용하여 미생물에 의해 합성된 순수한 시스-9 및 트랜스-11형의 CLA를 식품에 첨가시키는 방법을 개시한 바 있으나, 실제 식품에서는 극미량의 CLA 함량이 확인되었을 뿐이다. 또한 CLA 생성 미생물이 식품 또는 의약품의 유효성분으로 사용될 수 있기 위해서는, 제조된 제품의 유통기간 내내 미생물이 제품 제조시와 비슷하게 높은 비율로 잔존해야 하며, 사람 등 동물의 체내로 섭취된 후에는 장(腸) 내에서 높은 생존율과 활성을 지녀야 한다. 또한 슈퍼박테리아(superbacteria)를 비롯한 장내의 유해한 균과 경쟁하여 우위를 점하기 위해서는 항생물질에 대해 우수한 내성을 갖추어야 하며, 유해세균의 장 점착저해 효능 또한 우수해야 한다.
그러나 현재 시판중인 제품의 유효성분으로 사용되는 미생물 중 많은 균주들은 저장 중의 제품 뿐 아니라 섭취 후 위를 통과하는 과정에서조차 잔존하지 못하며, 항생물질에 대한 내성도 미약하며, 또한, 유해세균의 장 점착저해 효능 또한 미약하다. 따라서 우수한 CLA 생산 능력과 함께, 동물의 체내에서 높은 생존력과 활성을 나타내며, 균체 자체를 식품 및 의약품의 유효성분으로 직접 첨가할 수 있는 균주에 대한 개발은 여전히 과제로 남아 있다.
한국공개특허 제2014-0006509호에서는 '공액리놀레산을 생산하는 비피도박테리움 롱검 균주 및 그 용도'가 개시되어 있고, 한국등록특허 제0928890호에서는 '공액 지방산의 제조방법 및 그 방법에 의해 얻어진 음식품'이 개시되어 있으나, 본 발명에서와 같이, 공액리놀레산을 생산하는 비피도박테리움 비피덤 CBG-C12 균주 및 이의 용도에 대해서는 밝혀진 바가 전혀 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명에서는 기존에 알려진 균주보다 리놀레산(LA)을 공액리놀레산(CLA)으로 전환하는 전환률이 훨씬 높은 신규한 비피도박테리움 비피덤 CBG-C12을 분리하였다(표 1 참고). 또한, 상기 균주는 내산성(pH 3~6에서 생육), 내담즙성(담즙 1000㎍/㎖에서 생육) 및 항생제 내성이 우수하고, 유해세균(살모넬라 타이피뮤리움)에 대한 장 점착 저해 효능이 우수하여 균체 자체를 식품 및 의약품에 첨가할 때 CLA를 간접적으로 생성할 수 있는 신규한 균주를 제공할 수 있는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 리놀레산(linoleic acid, LA)을 공액리놀레산(conjugated linoleic acid, CLA)으로 전환시킬 수 있는 공액리놀레산 생산능을 가지는 비피도박테리움 비피덤(Bifidobaterium bifidum) CBG-C12 균주(수탁번호 KACC91979P)를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 공액리놀레산(conjugated linoleic acid, CLA) 생산용 미생물 제제를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 균주를 유효성분으로 함유하며, 수용성 다당류를 피복물질로 함유하는 캡슐제를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 함유하는 기능성 식품을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 동물 사료용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 자양강장제를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 암, 동맥경화, 당뇨병 또는 비만의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 균주를 배양하는 단계를 포함하는 공액리놀레산을 생산하는 방법을 제공한다.
본 발명의 균주는 리놀레산(LA)으로부터 공액리놀레산(CLA)을 우수한 효율로 생성할 수 있을 뿐 아니라, 위산과 담즙산, 그리고 항생물질에 대해 뛰어난 내성을 지닌다. 본 발명의 균주는 CLA를 생성한 후 균체 내에 축적할 수 있기 때문에, CLA가 간접적으로 생성되도록 하는 효과가 있다.
또한, 본 발명의 균주는 균체 고정화 등의 생물학적 방법에 의해 CLA 외에도 CLA의 이성체들을 대량으로 생합성하는데 효율적으로 이용될 수 있으며, 단일균주 또는 복합균주로서 장기능개선 및 배변활동을 향상시키는 조성물로서 이용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 균주가 리놀레산(LA)이 첨가된 배지에서 생성하는 지방산의 조성을 확인하기 위한 GC 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 리놀레산(LA)이 첨가된 배지에서 본 발명의 균주가 제공하는 생장상태, CLA 생성정도 및 배양액의 pH 변화를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 균주를 포도당(glucose), 과당(fructose), 젖당(Lactose) 및 설탕(sucrose)이 각각 탄소원으로 첨가된 배지에서 배양하여 생장정도와 CLA 생성량을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 리놀레산(linoleic acid, LA)을 공액리놀레산(conjugated linoleic acid, CLA)으로 전환시킬 수 있는 공액리놀레산 생산능을 가지는 비피도박테리움 비피덤(Bifidobaterium bifidum) CBG-C12 균주(수탁번호 KACC91979P)를 제공한다.
상기 균주는 한국인 건강한 성인의 분변으로부터 균주를 분리하여, 300개 정도의 균집락(colony)들을 임의로 채취하여 기질인 LA가 첨가된 배지에서 배양한 후, 상기 배양액을 헥산(hexane)으로 추출한 후 흡광도를 측정하여 CLA 생성 증력이 우수한 균주들을 선발하였다. 상기 과정에 의해 선발된 균주들에 대해, 각 균주들이 생성하는 지방산을 가스 크로마토그래피(Gas Chromatograph; 이하 GC라고 한다)법으로 분석하여, LA로부터 CLA를 생성할 수 있는지를 재차 확인하였고, 이렇게 하여 선발된 본 발명의 균주는 비피도박테리움 비피덤 CBG-12 (Bifidobacterium bifidum CBG-C12)로 명명되었으며, 2014년 9월 30일 국립농업과학원 농업유전자원센터(KACC)에 KACC91979P로 기탁되었다.
상기 균주는 내산성, 내담즙성, 항생제 내성 및 항균 활성이 있는 것을 특징으로 한다. 상기 항생제는 바람직하게는 앰피실린, 테트라사이클린, 스트렙토마이신, 리파마이신 또는 카나마이신이나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 항균 활성은 살모넬라 타이피뮤리움의 장세포 침투에 대한 저지 활성을 의미한다.
본 발명의 미생물로부터 생산되는 CLA는 주로 시스-9 및 트랜스-11과 트랜스-10 및 시스-12의 입체구조를 포함하는데, 이들은 기존에 공지된 바와 같이 다양한 생리활성을 가지는 이성체이므로, 이들 구조물을 포함하는 지방산과 아실글리세롤은 각종 동물성 유래의 유제품, 식물 유래의 원료물질에 의한 유제품, 발효식품 및 건강 기능성식품과 미생물제재(probiotics) 등의 개발을 위해 광범위하게 이용될 수 있다. 따라서 본 발명의 균주들은 균체 고정화 등의 생물학적 방법에 의해 CLA의 이성체들을 대량으로 생합성하는데 효율적으로 이용될 수 있다.
본 발명은 또한, 본 발명의 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 공액리놀레산 생산용 미생물 제제를 제공한다. 상기 균주는 바람직하게는 비피도박테리움 비피덤이며, 더욱 바람직하게는 비피도박테리움 비피덤(Bifidobaterium bifidum) CBG-C12 균주(수탁번호 KACC91979P)이다.
본 발명은 또한, 본 발명의 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 기능성 식품을 제공한다. 상기 균주는 바람직하게는 비피도박테리움 비피덤이며, 더욱 바람직하게는 비피도박테리움 비피덤 CBG-C12 균주(수탁번호 KACC91979P)이다. 본 발명의 기능성 식품은 액상요구르트, 호상요구르트, 치즈, 김치류, 장류 등일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 기능성 식품은 상기 유효성분 외에도 필요에 따라 다양한 보조성분을 추가로 함유할 수 있다. 본 발명의 기능성 식품의 경우, 비타민 A, 비타민 B1, 비타민 B2, 비타민 B3, 비타민 B6, 비타민 B12, 엽산(folic acid), 비타민 C, 비타민 D3, 비타민 E 등의 비타민류와, 구리, 칼슘, 철, 마그네슘, 칼륨, 아연 등의 미네랄 또는 유산균 등을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 기능성 식품 중, 건강음료는 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 포함할 수 있다. 향미제로는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파탐과 같은 합성 감미제 등을 들 수 있다. 천연 탄수화물로는 포도당, 과당 등의 단당류, 말토스, 수크로오스 등의 이당류, 덱스트린, 사이클로덱스트린 등의 다당류, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알코올류 등을 들 수 있다.
본 발명은 또한, 본 발명의 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 동물 사료용 조성물을 제공한다. 상기 균주는 바람직하게는 비피도박테리움 비피덤이며, 더욱 바람직하게는 비피도박테리움 비피덤 CBG-C12 균주(수탁번호 KACC91979P)이다.
본 발명의 사료용 조성물은 기초사료에 일정 비율로 첨가하는 것이다. 상기 기초사료는 주성분이 옥수수, 대두박, 유청, 어분, 당밀, 소금, 비타민 프리믹스 및 미네랄 프리믹스 등으로 이루어질 수 있다. 비타민 프리믹스는 비타민 A, 비타민 D, 비타민 E, 리보프라빈 및 나이아신으로 구성될 수 있으며, 미네랄 프리믹스는 망간, 철 아연, 칼슘, 구리, 코발트 및 셀레니늄 등으로 구성될 수 있다.
본 발명은 또한, 본 발명의 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 자양강장제를 제공한다. 상기 균주는 바람직하게는 비피도박테리움 비피덤(Bifidobaterium bifidum) CBG-C12 균주(수탁번호 KACC91979P)이다.
본 발명은 또한, 본 발명의 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 암, 동맥경화, 당뇨병 또는 비만의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다. 상기 약학 조성물은 공액리놀레산을 함유하고 있으므로 공액리놀레산에 의해 조절되는 질환을 예방 또는 치료할 수 있다. 본 발명의 균주는 CLA를 생산하며, 생산된 CLA는 동맥경화증의 발생저하(Artery. 1997. 22:266-277), 면역기능향상(J. Nut. 1999. 129:32-38), 항암작용(Anticancer research. 1997. 17:969-973), 당뇨병 등의 질환에 대해 우수한 치료 효과를 나타내며, 체지방감소(AM. J. Physiol. 1998. 275: R667-R672)를 통해 비만을 억제한다고도 알려져 있으므로, 본 발명의 균주 또는 이의 배양액은 암, 동맥경화, 당뇨병 또는 비만의 예방 또는 치료용 약학 조성물로 이용될 수 있는 것이다. 상기 균주는 바람직하게는 비피도박테리움 비피덤(Bifidobaterium bifidum) CBG-C12 균주(수탁번호 KACC91979P)이다.
본 발명의 약학 조성물의 투여량 또는 섭취량은 60∼130 uM(Cancer Epidemiol. Biol. Prev. 2000. 9:689-696), 그리고 기능성 식품의 투여량 또는 섭취량은 3.4∼6 g/day(J. Nutr. 2000. 130:2943-2948)인 것이 바람직하나, 필요에 따라 가감할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 섭취량에 관계없이 체내에 안전하게 흡수된다. 투여량 또는 섭취량은 약학 조성물에 함유된 유효성분 및 다른 성분의 종류 및 함량, 제형의 종류 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 인체에 투약하는 경우, 화학적으로 합성된 CLA 함유 식품 및 의약품에 비해 부작용의 우려가 없다.
본 발명의 식품 또는 약학 조성물은 상기 유효성분 이외에도 약제학적 또는 식품에서 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 제제화할 수 있다. 약제학적 또는 식품에서 허용 가능한 담체는 식염수, 멸균수, 링거액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 더 나아가 당 분야의 적정한 방법으로, 또는 Remington's Pharmaceutical Science(최근판), Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라, 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물의 제제 형태는 과립제, 산제, 과립제, 피복정, 정제, 캡슐제, 탕제, 엑기스제, 좌제, 시럽, 즙, 현탁제, 유제 및 활성 화합물의 서방출형 제제 등이 될 수 있다.
본 발명의 캡슐제는 피복물질(coating material)과, 피복되는 내부의 핵물질(core material)로 이루어진다. 본 발명의 캡슐제에서 핵물질은 본 발명의 균주와 리놀레산을 함께 포함하는 것이 바람직하다. 본 발명의 캡슐제에서 핵물질을 둘러싸는 피복물질은 흡수성, 분산성, 점착성이 우수한 수용성 다당류를 사용한다.
본 발명에서 사용가능한 수용성 다당류는 전분, 한천, 카라기난, 알긴산, 알긴산나트륨(sodium alginate), 폴리메틸메타크릴레이트(polymethylmetacrylate), 소맥단백, 대두단백을 비롯하여, 메틸셀룰로오스(methylcellulose), 하이드록시프로필셀룰로오스(hydroxylpropylcellulose), 하이드록시프로필메틸셀룰로오스 (hydroxyl-propylmethylcellulose) 등의 셀룰로오스 유도체, 잔탄검(xanthan gum), 아라비아검(arabic gum), 로커스트콩검(locust bean gum), 구아검(guar gum), 타마린드검(tamarind gum), 타라검(Tara gum), 카라야검(karaya gum), 트라가칸검(tragacanth gum), 가티검(ghatti gum) 등의 검류, 그리고 젤란(gellan), 잔탄(xanthan), 펙틴(LM, HM type), 덱스트란(dextran), 글루칸(glucan), 글루코만난(glucomannan), 아라비노갈락탄(arabino galactan), 퍼셀레란(furcelleran), 풀루란(pullulan), 글루코사민(glucosamine), 젤라틴(gelatin), 카제인(casein) 중 선택된 하나 이상이 될 수 있다.
본 발명의 캡슐제 제조시 코팅물질의 양은 용도 및 목적에 따라 그 양을 적절하게 가감할 수 있으며, 핵을 기준으로 하여 일반적으로 사용되는 범위인 1~80 중량% 범위의 양으로 사용하는 것이 바람직하다. 또한 본 발명의 캡슐제는 필요에 따라 유화제, 보호제 및 가소제를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 캡슐제의 제조 방법은 통상적으로 사용되는 캡슐화 방법 중 적절한 방법을 택하여 사용할 수 있다. 본 발명의 캡슐제를 포함하는 조성물은 구체적으로 유제품(우유, 두유, 가공우유), 발효유(액상 요구르트, 호상 요구르트), 발효성식품(김치류, 장류), 가축용 사료, 건강보조식품 등이 될 수 있다.
본 발명은 또한, 본 발명의 균주를 배양하는 단계를 포함하는 공액리놀레산을 생산하는 방법을 제공한다. 상기 균주는 바람직하게는 비피도박테리움 비피덤(Bifidobaterium bifidum) CBG-C12 균주(수탁번호 KACC91979P)이다. 본 발명의 균주를 배양하는 방법은 당업계에 통상적으로 이용되는 방법을 이용할 수 있다. 본 발명의 균주 배양시 적합한 탄소원으로는 포도당, 과당, 젖당 및 설탕 등을 이용할 수 있으나, 젖당 또는 포도당이 CLA를 최대로 생산하므로 바람직하다.
또한, 본 발명의 균주는 생균체 뿐만 아니라 사균체 형태로도 식의약품 첨가가 가능한데, 이는 본 발명의 균주가 CLA를 배양액 혹은 반응액에 분비하면서, 동시에 상당량의 CLA를 균체 내 축적할 수 있는 특성을 지니기 때문이다. 따라서 본 발명의 균주는 LA 첨가 배지에서 배양한 균체 자체를 식품 및 의약품 등 다양한 조성물의 유효성분으로 첨가하여 CLA가 간접적으로 생성되도록 할 수 있으므로, CLA를 다량 함유한 기능성 제품의 개발을 촉진할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 본 발명의 균주 분리, 동정 및 특성 확인
1) 본 발명의 균주의 분리 및 동정
본 발명의 균주를 분리하기 위해, 한국인 성인의 분변 10종을 채취하였다. CLA를 생성하는 미생물을 분리하기 위해, L-시스테인이 0.05% 첨가된 MRS (Man Rogosa Sharpe) 액상배지에 접종하였다. 멸균 생리식염수 0.85%(w/v)로 30~150개 정도의 균락(colony)이 생기도록 희석하여 MRS 한천배지에 도말한 후, 혐기조에 가스 팩(Gas pack, MGC, Mitsubishi)과 함께 넣어 37℃에서 72시간 배양하였다. 이때 LA를 0.5%(w/v) 트윈 80(tween 80)에 잘 유화시켜 제면여과한 후 L-시스테인이 0.05% 첨가된 MRS 배지에 첨가하였다.
배양된 배지에서 300개 정도의 균 집락을 임의 선택하고, LA를 0.5%(w/v) 트윈 80(tween 80)에 잘 유화시켜 제면여과한 후 L-시스테인이 0.05% 첨가된 MRS 배지로 2회 계대배양한 후 LA 0.5% 및 L-시스테인 0.05%가 첨가된 MRS 배지를 함유한 20㎖ 시험관에 1% 접종하여 48시간 배양하였다. 배양세포를 포함한 배양액을 헥산(hexane)으로 추출한 후 234nm에서 흡광도를 측정하여 CLA 생성량을 계산하고, 이를 균체량, 즉 600nm에서의 흡광도 값으로 보정하여 상대적인 CLA 생성량을 비교하였다.
생균수 측정은 MRS 한천 배지를 이용하여 10배 희석법에 의해 평판 배양하고 이를 혐기조(Difco, USA)에 넣어 가스팩과 함께 72시간 경과 후 생성된 균 집락의 수를 세어 측정하였다. 이렇게 하여 CLA 생성 능력이 우수한 균주를 선발하고 CBG-C12로 명명하였다. 본 발명의 균주들에 대해 rRNA의 염기서열을 분석하여 그 속과 종을 동정하였다. 그 결과, CBG-C12는 비피도박테리움 비피덤(Bifidobacterium bifidum)인 것으로 판명되었다. 상기 CBG-C12 균주는 2014년 9월 30일 국립농업과학원 농업유전자원센터에 비피도박테리움 비피덤 CBG-12(KACC91979P)로 기탁되었다.
2) 본 발명의 균주가 생성하는 지방산의 조성 확인
본 발명의 균주가 생성하는 지방산의 조성을 확인하여, 본 발명의 균주가 CLA를 생성하는지 재차 확인하기 위해, 다음과 같이 GC를 수행하였다. 균체를 LA (500㎍/㎖)가 포함된 배지에서 42시간 동안 배양하였다. 균주에 의한 총 CLA 생성량을 분석하기 위해, 균체를 포함한 배양액에 2배 부피의 이소프로필 알콜(isopropyl alcohol)을 첨가하여 격렬히 혼합한 후, 여기에 1.5배 부피의 헥산을 가하여 3분 동안 흔들어 주면서 혼합하였다. 상기 혼합액을 상온에서 3000rpm으로 5분 동안 원심분리한 후, 234nm에서 상청액의 흡광도를 측정하였다. 추출한 지방산은 American Oil Chemists's Society(Official Method and Recommended Practoces pf AOCS, 4th. ed.(1989)) 방법에 따라 메틸 에스테르(methly ester)화하여 GC 분석에 필요한 시료를 준비하였다. GC 분석시 조건은 다음과 같다. 이때, FID가 부착된 GC DS-6200 (DONAM)을 사용하였고, 컬럼은 HP-FFAP 모세관 컬럼(30m 0.25㎜, 두께 0.25㎛)을 사용하였으며, 오븐 온도는 210℃, 인젝터(injector) 온도는 250℃, 디텍터(detector) 온도는 270℃이었다. 운반기체는 헬륨을 사용하였으며, 1㎖/min 유속으로 용출시켰고, 분해비(split ratio)는 50:1로 하였다. 각 피크의 면적은 기기에 연결된 적분계(model 3390A, Hewlett-packard, USA)를 이용하여 구하였다. CLA의 동정은 표준 물질의 머무름 시간과 비교하여 확인하였으며, CLA의 함량은 표준 물질의 면적과 CLA의 면적비에 의해 분석시료로 사용하였다. 도 1에 나타난 바와 같이, LA 및 CLA 피크가 관찰되는 것을 통해 본 발명의 균주들은 LA를 기질로하여 CLA를 생성할 수 있음을 알 수 있다.
3) 본 발명의 균주 배양시 CLA 생성 최적 조건 확인
본 발명의 균주에 대한 CLA 최적 생성조건을 확인하기 위해, 기질인 LA가 배지에 존재하는 경우와 존재하지 않는 경우의 두 조건에서 생육 특성을 관찰하였다. 우선, 전배양하여 활성화된 균주를 LA(500 ㎍/㎖)가 포함된 MRS 배지 2ℓ에 1%가 되도록 접종한 후, 시간 별로 배양액을 회수하여 균체 농도, CLA 생성량 및 배양액의 pH를 측정하여 그 결과를 도 2에 나타내었다. 도 2에 나타난 바와 같이, 비피도박테리움 비피덤은 대수기(log phase)에 접어들면서 CLA 생성량도 증가하였으며, 정지기(stationary phase)에 도달하기 직전에 CLA를 최대로 생성하였다. 배양액의 최초 pH는 6.7 정도였으나, 배양 시간이 지날수록 떨어져 약 24시간 발효 후에는 pH 4.2 정도를 나타냈다.
4) 본 발명의 균주가 생성하는 CLA의 양 확인 및 전환율 분석
본 발명의 균주 배양시, 각각의 균주가 생성하는 CLA의 양을 확인하기 위해, 다음과 같이 실험을 수행하였다. 전환율 비교를 위한 대조구로는 미생물자원센터(KCTC) 등록균주인 비피도박테리움 비피덤 KCTC3357 균주를 사용하였다. 우선, LA가 포함된 배양액에 균주를 접종한 후 24시간 동안 배양하면서 2시간 간격으로 CLA 생성 정도를 측정하였고, 균체와 배양액에 존재하는 총 CLA의 농도를 분석하여(시스-9 및 트랜스-11과 트랜스-10 및 시스-12의 합) 그 결과를 표 1에 나타냈다. CLA 전환률을 살펴보면, CLA 생성 우수 균주로 알려진 비피도박테리움 비피덤 KCTC3357 균주는 38.7%인 반면, 본 발명에서 선발한 비피도박테리움 비피덤 CBG-C12 균주는 45%로 더 높은 전환률을 나타내는 것을 확인하였다.
균주명 CLA (ug)/배양액(ml) CLA 전환률 (%)
KCTC3357 193.5 38.7
CBG-C12 225.1 45.0
5) 본 발명의 균주의 pH 내성, 담즙 내성 및 항생물질 내성 확인
본 발명에서 분리 동정한 균주를 발효 제품 또는 식품 첨가제로 사용하기 위해 pH 내성, 담즙 내성 및 항생물질 내성 등의 생육특성을 알아보았다.
(1) 산 내성
본 발명의 균주의 pH별 내성을 확인하기 위해, 24시간 정도 배양한 각각의 균주를 멸균한 0.5w/v% 염화나트륨 용액으로 희석하였다(105cfu/ml). 산에 대한 내성 비교를 위한 대조구로는 미생물자원센터(KCTC) 등록균주인 비피도박테리움 비피덤 KCTC3357 균주를 사용하였다. 산 내성 분석을 위한 인공위액은 빙초산, 염화나트륨 및 증류수와 pH 미터를 이용하여 pH2, 3, 4로 맞추었다. 배양 세포 희석액 0.2ml과 0.3ml의 0.5%(w/v) 멸균 염화나트륨 용액, 그리고 1ml의 인공위액을 2ml 멸균 에펜도르프 튜브에서 혼합하고, 3시간 동안 방치한 후 MRS 고체배지에 접종하여 출현한 유산균을 계수하고, 그 결과를 표 2에 나타냈다.
[단위: cfu/g]
균주명 pH 2 pH 3 pH 4 pH 5 pH 6
KCTC3357 - 3.0×103 1.1×105 4.4×105 5.3×105
CBG-C12 - 2.1×104 2.5×105 8.2×105 9.0×105
표 2에 의하면, 본 발명의 균주는 pH 3.0 ~ 6.0의 범위에서 모두 생육이 가능하였고, 대조구에 비해 우수한 pH 내성을 보였다. 따라서 본 발명의 균주는 약알칼리와 약산성에 걸치는 넓은 범위에서 모두 생육이 가능하며, 특히 위산이 분비되어 산성 환경이 조성되는 위에서 충분히 생존할 수 있음을 알 수 있다.
(2) 담즙 내성
본 발명의 균주의 담즙 내성을 확인하기 위해, 담즙의 성분인 소듐 디옥시콜레이트(sodium deoxycholate)가 0, 100, 300, 500, 800, 1,000㎍/㎖으로 다양하게 첨가된 MRS 배지를 준비하였다. 각 배지에 균주를 접종하여 37℃에서 48시간 동안 배양하면서 생육 여부를 검토하였으며, 담즙 내성 비교를 위한 대조구로는 미생물자원센터(KCTC) 등록균주인 비피도박테리움 비피덤 KCTC3357 균주를 사용하였고, 그 결과를 표 3에 나타냈다.
[단위: cfu/g]
처리농도(㎍/㎖) KCTC3357 CBG-C12
0 2.5×109 2.5×109
100 9.8×108 2.5×109
300 1.1×108 2.2×109
500 1.0×108 1.1×109
800 3.1×107 2.6×108
1,000 2.3×107 2.5×108
표 3에 나타난 바와 같이, 본 발명의 균주는 담즙 1,000㎍/㎖까지도 우수하게 생육하는 것을 확인하였다. 따라서 본 발명의 균주는 담즙이 분비되는 위장관에서 안정적으로 생육할 수 있음을 알 수 있다.
(3) 항생물질 내성
본 발명의 균주의 항생물질 내성을 확인하기 위해, 20㎖ 시험관에 밤새 배양한 균주를 MRS 배지에 희석하여 고체 배지를 제조하였다. 대조구로는 미생물자원센터(KCTC) 등록균주인 비피도박테리움 비피덤 KCTC3357 균주를 사용하였다.
본 실험에 사용한 항생물질은 앰피실린(ampicillin), 테트라사이클린(tetracycline), 스트렙토마이신(streptomycin), 리파마이신(rifamycin) 및 카나마이신(kanamycin)으로, 1, 2, 4, 8, 16, 32㎍/㎖의 농도로 첨가된 배지를 준비하였다. 시험용 균주는 MRS 액체 배지에서 1x109cfu/ml 정도로 진탕배양하여 준비하였다.
상기와 같이 준비된 항생물질을 포함한 배지를 각각 15ml 시험관에 5ml씩 분주하고, 배양하여 준비한 시험용 균주를 1x105cfu/ml이 되도록 첨가하고, 37℃에서 15시간 동안 배양하면서 생육이 저해되는 최소농도를 측정하여 그 결과를 표 4에 나타내었다.
항생제 종류 최소저해농도(MIC, ㎍/㎖)
KCTC3357 CBG-C12
앰피실린 1 4
테트라사이클린 2 8
스트렙토마이신 8 8
리파마이신 1 2
카나마이신 16 16
표 4에 나타난 바와 같이, 본 발명의 균주는 스트렙토마이신과 카나마이신에 대해서는 대조구와 유사한 내성을 보였으나, 앰피실린, 테트라사이클린 및 리파마이신에 대해서는 대조구 대비 우수한 항생물질 내성을 나타내었다. 따라서 본 발명의 균주는 광범위한 종류와 농도 범위의 항생물질에 대해 내성을 지니고 있음을 알 수 있다.
6) 본 발명의 균주의 살모넬라 타이피뮤리움의 장세포 침투에 대한 저지 활성 측정
락테올 표준 동결건조물에 의한 살모넬라 타이피뮤리움(Salmonella enterica serovar Typhimurium)의 Caco-2 내부 침투 저해에 관한 약리활성 확인을 위한 시험으로, 검체 준비는 원심분리를 통해 유산균과 배양액을 분리하였다. 유산균은 인산완충식염수에 희석하여 처리하고, 배양액은 그대로 사용하였다. Caco-2 세포배양 준비물로는 플라스틱 배양 용기, DMEM (Dulbeco's Modified Eagle's Medium; 배지), 100배 농축 비필수 아미노산, 우태혈청을 준비하였다.
Caco-2 배양을 위한 배지는 DMEM에 100배 농축 비필수 아미노산 1%와 우태혈청 15%를 넣었다. 인산완충식염수 10배 농축액(PBS 10X)을 정제수로 10배로 희석하고 121℃, 15분의 고온, 고압으로 멸균하였다. 트립신-EDTA 용액 A: 트립신을 인산완충식염수에 0.25%로 섞었다. 용액을 0.22um의 멤브레인 필터로 여과를 한 후 -20℃에 보관하였다. 트립신-EDTA 용액 B: 용액A 8ml을 0.1% EDTA를 포함한 인산완충식염수 100ml에 넣어주었다(트립신의 최종 농도는 0.02%, EDTA의 최종농도는 3mM). 용액은 0.22um 멤브레인 필터로 여과를 한 후 사용하였다.
Caco-2 배양은 계대횟수 20∼32번째 것을 사용하였다. 세포는 일반적으로 15% 우태혈청과 1% 비필수 아미노산을 함유한 DMEM 배지에서 배양하였다. 유지를 위해서, 세포는 1주 간격으로 0.02% 트립신-3mM EDTA를 사용해 계대해 주었다. Caco-2 세포를 24웰 조직 배양용기에 2.5X104cfu/ml으로 분주하고 배양하였다. 세포 실험과 유지는 37℃, 10% 이산화탄소 배양기에서 수행하였고 배지는 매일 교환해 주었다. 세포는 배양 15일 이후 완전히 가득 찼을 때 사용하였다.
세포 보관을 위해서 세포는 15% 우태혈청과 1% 비필수 아미노산이 포함된 DMEM에 3X106cfu/ml이 되도록 준비하고 이 현탁액 1∼2ml에 0.15ml의 우태혈청과 0.15ml의 글리세롤을 넣어주고 동결용 튜브에 옮겨 담았다. 계대횟수 18∼20의 세포를 액체질소에 보관하였다.
Caco-2/TC7 세포내로 살모넬라 타이피뮤리움(Salmonella enterica serovar Typhimurium)의 침투저해효과 확인을 위해, 균주 살모넬라 타이피뮤리움(Salmonella enterica serovar Typhimurium strain) ATCC14028을 표지 균주로서 사용하였다. 균주는 루리아 액체배지(LB broth)와 20% 글라이세롤에 담겨 -80℃에 보관하였다. 살모넬라의 분주는 보관균주를 해동하지 않고 멸균된 면봉으로 채취하여 루리아 한천배지에 배양하였다. 37℃에서 18시간 배양 유지 후 플레이트는 4℃에서 15일간 보관하였다. 이 한천배지 플레이트는 살모넬라를 루리아 액체배지에 계대배양할 때에 사용하였다. 균주의 생화학적 특성은 Api 20E를 사용하여 1년에 4번 확인하였다.
실험재료로 겐타마이신 용액(50mg/ml)과 대두카제인 소화한천배지를 준비하였다. 분석방법은, Caco-2 세포를 감염시키기 위하여 살모넬라 균주는 루리아 액체배지에 37℃에서 18시간 동안 배양한 후 새로운 루리아 액체배지에 접종하여 37℃에서 3시간 동안 추가 배양하였다. 감염시키기 전 Caco-2 세포는 인산완충식염수로 2회 세척해주고 500ul/웰의 DMEM을 넣어주었다. 5000g에서 5분간 원심분리 하여 루리아 배지를 제거한 후 박테리아를 DMEM에 4X108cfu/ml이 되도록 희석하였다. 각각의 웰에 250ul의 희석 현탁액을 넣고 250ul의 표본을 넣어주었다. 감염시킨 후 플레이트는 37℃, 10% 이산화탄소 조건에서 1시간 동안 배양하였다.
살모넬라의 내부 침투는 아미노글리코시드계 항생제에 대한 감수성을 사용해 감염된 세포에 있는 박테리아의 양을 측정하여 결정하였다. 1시간 배양 후, 세포는 멸균된 인산완충식염수로 3회 세척하고 100ug/ml의 겐타마이신을 포함한 배지로 1시간을 이어 배양하였다. Caco-2 세포의 융털돌기에 부착한 박테리아는 빠르게 죽지만 세포내로 침투한 세포는 죽지 않았다. 세포는 인산완충식염수로 2회 세척하고 1ml의 멸균된 물로 파쇄하였다. 세포내 살아있는 박테리아의 수를 측정하기 위하여 대두카제인소화 한천배지에 희석을 하여 배양하고 박테리아 콜로니를 계수하였다. 락테올 양성 대조군은 인산완충식염수에 락토바실러스가 6~7x109cfu/ml이 되도록 표 5와 같이 검액을 준비하고, 1노르말 농도의 염산으로 pH 6을 맞추었다. 대조군과 시험군 웰당 살모넬라균수와 유산균수를 표 6에 나타내었고, 살모넬라 균주의 Caco-2 세포 감염에 대한 저해효과를 표 7에 나타냈다.
시료의 성상 동결건조물
락토바실러스 3X1010cfu/g
질량 1g
인산완충식염수 5ml
구분 반응량(ul) 웰당 세포수
(cfu/ml)
대조군 시험군
DMEM 750ul 500
살모넬라 4X108 250ul 250 1.0X108
유산균 시료 0ul 250 1.5X109
시험군 침투저해율(%)
음성대조군 0
양성대조군(락테올) 90.5
Bifidobacterium bifidum CBG-C12 91.2
표 7에서 보는 바와 같이, 본 발명의 균주는 살모넬라 타이피뮤리움의 장세포 침투에 대한 저지 활성이 양성대조구와 유사하거나 그 이상의 효능을 보유한 것으로 나타났다. 따라서, 본 발명의 균주는 CLA 생산능력, 내산성, 내담즙성, 항생재 내성 및 살모넬라 타이피뮤리움의 장세포 침투에 대한 저지 활성을 가진 우수한 프로바이오틱스 균주인 것으로 나타났다.
7) 본 발명의 균주 배양시 탄소원의 종류에 따른 균의 생장 및 CLA 생성량 변화
본 발명의 균주 배양시, 당원의 종류에 따른 생장 및 CLA 생성량의 변화를 확인하기 위해, 포도당(glucose), 과당(fructose), 젖당(lactose) 및 설탕(sucrose) 등 다양한 탄소원이 첨가된 배지에서 균주를 배양하여 생장 정도와 CLA 생성량을 측정하고, 그 결과를 도 3에 나타냈다. 비피도박테리움 비피덤 CBG-12 균주는 생장에 가장 적합한 탄소원은 젖당인 것으로 나타났고, LA 첨가 배지에서 24시간 동안 배양한 후의 CLA 생성량은 포도당과 젖당을 탄소원으로 사용하였을 때 최대값을 나타내었다(도 3).
한국농업미생물자원센터(KACC) KACC91979P 20140930

Claims (11)

  1. 리놀레산(linoleic acid, LA)을 공액리놀레산(conjugated linoleic acid, CLA)으로 전환시킬 수 있는 공액리놀레산 생산능을 가지는 비피도박테리움 비피덤(Bifidobaterium bifidum) CBG-C12 균주(수탁번호 KACC91979P).
  2. 제1항에 있어서, 상기 균주는 내산성, 내담즙성, 항생제 내성 및 항균 활성을 가지는 것을 특징으로 하는 균주.
  3. 제2항에 있어서, 상기 항균 활성은 살모넬라 타이피뮤리움(Salmonella Typhimurium)의 장세포 침투에 대한 저지 활성인 것을 특징으로 하는 균주.
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 함유하는 식품.
  7. 제6항에 있어서, 액상요구르트, 호상요구르트, 치즈, 김치류 및 장류로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 식품.
  8. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 동물 사료용 조성물.
  9. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 자양강장제.
  10. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 암, 동맥경화, 당뇨병 또는 비만의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  11. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 균주를 배양하는 단계를 포함하는 공액리놀레산을 생산하는 방법.
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