WO2003086334A1 - Produit tonique pour la pousse de cheveux - Google Patents

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WO2003086334A1
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group
compound
hair
wnt
hydrogen atom
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PCT/JP2003/004884
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Akiko Ikeda
Hideki Shinonaga
Natsuko Fujimoto
Yoko Kasai
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Taisho Pharmaceutical Co., Ltd.
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Definitions

  • the present invention relates to a hair papilla cell growth promoter, a hair growth agent, and a hair restorer. More specifically, the present invention relates to a hair papilla cell growth promoter, a hair growth agent and a hair restorer containing a WNT-5A function inhibitor as an active ingredient. The present invention also relates to a method for screening a hair papilla cell growth promoter based on WNT-5A function inhibitory action. The end of the scenery
  • Human hair follicles are composed of various epithelial and interdermal cells such as keratinocytes, dermal papilla cells, fibroblasts, and sebaceous cells.
  • the hair growth cycle (hair cycle) is regulated.
  • the body of the hair is formed by the proliferation of hair follicle keratinocytes, and controls the proliferation, differentiation and apoptosis of these hair follicle keratinocytes, and plays a central role in hair cycle regulation. Is responsible for the nipple. Therefore, it is important to study the effects on hair papilla cells in developing hair growth / growth agents.
  • ⁇ T-15A is a secretory glycoprotein belonging to the Medical T family.
  • the WNT family has about 20 types of molecules, each of which is widely conserved from nematodes to mammals. These WNTs are known to be important intercellular signal molecules that control fetal axis formation and organ formation (Aimu. Rev. Cell Dev. Biol. 14, 59-88 (1998), Genes & Dev. 11, 3286-3305 (1997)).
  • the receptor for WNTs is a seven-transmembrane type Frizzled, and there are 10 types in humans (Aimu. Rev. Cell Dev. Biol.
  • An object of the present invention is to provide a screening method using a molecule that controls the proliferation of hair papilla cells, a hair papilla cell growth promoter, and a hair growth or hair growth agent based on a novel action.
  • a hair papilla cell growth promoter comprising a compound having a WNT-5A function inhibitory activity.
  • a hair papilla cell proliferation promoter comprising a compound having an orchid T-5A production inhibitory action.
  • R 1 and R 2 are the same or different and represent a hydrogen atom, an alkyl group or a C 2 _ 6 alkanoyl group,
  • X represents a hydrogen atom or a halogen atom
  • R 3 a and R 3 b represents a hydrogen atom or a hydroxyl or different
  • R 4, R 5, R 6 , R 7, R 8 and R 9 are identical or different and represent a hydrogen atom, a hydroxyl group, or indicates a halogen atom or a C 2 _ 6 alkanoyloxymethyl noisy Ruo alkoxy group, or adjacent groups together To form a pi bond or an ether bond, or R 5 and R 8 or R 5 and R 9 together to form an ether bond.
  • R 1 and R 2 are the same or different and represent a hydrogen atom, a 6 alkyl group or a C 2 _ 6 alkanoyl group,
  • X represents a hydrogen atom or a Hagen atom
  • R 3c ⁇ Pi R 3 ⁇ may be the same or different and represent a hydrogen atom, a hydroxyl group or a C t _ 6 alkoxy group to indicate carded or with R 3d are together a connexion Okiso group, a hydroxy I amino group or a C, _ 6 Arukokishii Forming a mino group,
  • RRR 6, R 7, R 8 and R 9 are identical or different and represent a hydrogen atom, a hydroxyl group, halogen atom or a C 2 _ 6 alkanoyloxymethyl noisy Ruo xylene or a group, or adjacent groups Te summer together pi bond or R 5 and R 8 or R 5 together form an ether bond, or form an ether bond.
  • a hair papilla cell growth promoter comprising the compound represented by the formula:
  • R la and R 2a are the same or different and each represents a hydrogen atom, C t _ 6 alkyl groups, (: Bok 6 ⁇ Rukanoiru group, (CH 2 ) p CO-YR 10 (wherein, Y represents an oxygen atom or a sulfur atom, R 10 represents a hydrogen atom, an alkyl group or a substituted or unsubstituted aryl group, and P is 0 or 1 A) a group represented by
  • R 11 is a substituted or unsubstituted cycloalkyl group or a substituted or unsubstituted C ⁇ , which represents a heterocyclic ring, and Q represents 0 or 1).
  • a group represented by CO R 12 (wherein, R 12 represents a substituted or unsubstituted aryl group or a substituted or unsubstituted C 2 ; represents a heterocyclic ring),
  • X represents a hydrogen atom or a halogen atom
  • R 3e and R 3 f are the same or different and represent a hydrogen atom, a hydroxyl group, ⁇ it 6 alkoxy group or a C t _ 6 alkanoyloxymethyl noisy Ruo xylene or a group, or R 3e and R 3 f is together a connexion Okiso group, Forming a hydroxyimino group or _ 6 alkoxyimino group,
  • R 4a , R 5a , R 6a , R 7 R 8a and R 9a are the same or different and are a hydrogen atom, a hydroxyl group, a halogen atom or
  • ZR 13 (wherein, Z is an oxygen atom or a sulfur atom, R 13 is an alkyl group, Arukanoiru group or a substituted or unsubstituted Ariru group showing a.) Or indicate to a represented Ru group, or adjacent groups together a connexion or form a pi bond or an ether bond, or become R and R 8 a or R 5 a and R 9 a guard ⁇ to form an ether bond,
  • R 6b represents a hydrogen atom or forms an ether bond together with R 3 e or R 3 f .
  • a hair-growing agent or a hair-growing agent comprising the above-mentioned hair-papillary-cell proliferation-promoting agent as an active ingredient. I do.
  • a method for screening for a hair papilla cell growth promoter which comprises selecting a substance that inhibits the function of WNT-5A.
  • the present invention also provides a method for selecting a substance that inhibits the function of ⁇ T-15A, comprising the following steps (a) to (c): It is. 03 04884
  • step (b) lysing the human ⁇ T-5A-expressing cells cultured in step (a), extracting RNA, and measuring the amount of WNT-5 ⁇ mRNA:
  • step (c) a step of comparing the amount of WNT-5A mRNA measured in step (b).
  • Fig. 1 shows an electrophoretogram showing that WNT-5A mRNA is expressed in dermal papilla cells.
  • Fig. 2 shows that the test compound decreases the amount of WNT-5A mRNA in dermal papilla cells. The electropherogram is shown.
  • FIG. 3 shows a graph showing that the test compound has a hair papilla cell growth promoting activity.
  • FIG. 4 is an electrophoretogram showing reduction of WNT-5A mRNA in monkey skin organ culture.
  • FIG. 5 shows the results of PCNA staining of telogen and anagen hair follicles in monkey skin organ culture.
  • FIG. 6 presents a histogram showing that Compound 7 increases hair bulb diameter in monkey skin organ culture.
  • FIG. 7 shows a histogram showing that compound 3 increases hair bulb diameter in monkey skin organ culture.
  • Figure 8 shows enlarged photographs of the skin before and after application for 6 months in the macaque hair growth test
  • a compound that inhibits the function of T-15A refers to a compound that inhibits the binding of T-15A to WNT-5A receptor. Or a compound that suppresses the production of WNT-5A, preferably the production of lightning T-5A 0304884 A compound that inhibits production.
  • WNT-5A is a secreted glycoprotein belonging to the WNT family, whose expression has been confirmed in humans, mice, rats, African algae, etc., but it is human WNT-5A ( SEQ ID NO: 1) Compounds that inhibit function are preferred.
  • a compound that inhibits the binding of WNT-15A to the TOT-5A receptor is defined as a compound that acts on the WNT-5A or WNT-5A receptor to temporarily bind the T15A to the T-15A receptor.
  • Specific examples of the WNT-5A receptor include human Frizzled5 (SEQ ID NO: 4) and rat Frizzled2 (SEQ ID NO: 6).
  • the compound may be peptidic or non-peptidic, but is preferably a non-peptidic inhibitor which has an advantage of a long action time.
  • the compound can be selected by a screening system using labeled ⁇ T-15A and m-NT-5A receptors, and preferably has an IC 50 of 30 or less, more preferably 10 / M These are:
  • the compound that suppresses 5A production means a compound that suppresses the expression of the WNT-5A gene.
  • the compounds may be peptidic or non-peptidic, but non-peptidic inhibitors, which have the advantage of long action times, are preferred.
  • the compound can be selected based on the decrease in the amount of WNT-5A protein (SEQ ID NO: 1) or the amount of WNT-5A mRNA (SEQ ID NO: 2), and is preferably determined by the method of Hartley et al. (Drug Metabolism). and Dis position 28 (5), 608-616 (2000), and the IC 5 E include: a nucleic acid pro one poor Ssi method according to test example 4) to be described later, hereinafter the well because more preferably 10 M is there.
  • Formula (I), the _ 6 alkyl group in the compounds represented by (II) and (DO, means a straight or branched alkyl group of from 1 to 6 carbon atoms, specifically, for example, Examples include methyl group, ethyl group, propyl group, isopropyl group, butyl group, isobutyl group, tert-butyl group, pentyl group, 2-ethylpropyl group, and hexyl group.
  • the C 6 alkanol group means a linear or branched alkynyl group having 1 to 6 carbon atoms, specifically, for example, an acetyl group, a propionyl group, a butyryl group, a t-butylyl group and the like. Can be mentioned.
  • ( ⁇ _ 6 alkoxy group means a linear or branched alkoxy group having 1 to 6 carbon atoms, specifically, for example, methoxy group, ethoxy group, propoxy group, isopropoxy group, butoxy group , Isobutoxy group, sec-butoxy group, tert-butoxy group, pentoxy group, isopentyloxy group, neopentyloxy group, tert-pentoxy group, 1-methylbutoxy group, 2-methylbutoxy group, Examples thereof include a 1,2-dimethylpropoxy group, a hexyloxy group, and an isohexyloxy group.
  • the ci _ 6 Arukokishiimino group means a linear or branched alkoxy Shiimino group of from 1 to 6 carbon, specifically, for example, N- Metokishiimino group, N - Etokishiimi amino group, N- Examples include a propoxyimino group, an N-isopropoxyimino group, an N-butoxyimino group, an N-isobutoxyimino group, an N-pentyloxyimino group, and an N-hexyloxyimino group.
  • alkanoyloxy group means a linear or branched alkanoyloxy group having 1 to 6 carbon atoms, specifically, for example, acetoxy group, propionyloxy group, pivaloyloxy group, etc. Is mentioned.
  • the C 3 _ 1 Q cycloalkyl group means a cycloalkyl group having 3 to 10 carbon atoms, specifically, for example, a cyclopropyl group, a cyclobutyl group, a cyclopentyl group, a cyclohexyl group, a cycloheptyl Group, cyclooctyl group, cyclononyl group and the like.
  • cycloalkyl group examples include a halogen atom replacing the hydrogen atom of the cycloalkyl group, and substituted or unsubstituted C 1 .
  • aryl groups include phenyl, naphthyl, and anthracene groups.
  • TJP03 / 04884 Examples of the substituted aryl group include a halogen atom for the aryl group and a substituted or unsubstituted C 1 .
  • Alkyl group a hydroxyl group, CH hydroxyalkyl group, Cal Bokishiru group, a mercapto group, an indazolyl group, an indolyl group, ( ⁇ - 5 alkylthio O group, Shiano group, a nitro group, an amino group, an amide group, Asechiruamino group and ⁇ Bok 5 alkoxy
  • Aryl groups substituted with one or more groups selected from the group consisting of groups can be mentioned.
  • heterocycles include furan, pyrrol, thiophene, oxazole
  • Isooxazole thiazole, imidazole, pyrazole, pyran, pyridin, piperidine, pyridazine, pyrimidine, pyrazine, quinoline and the like.
  • hetero ring examples include a hydrogen atom in the hetero ring, a halogen atom, and substituted or unsubstituted C 1 .
  • Hetero rings substituted with one or more groups selected from the group consisting of 5 alkoxy groups can be mentioned.
  • the ether bond one hundred and one, the formula - (C3 ⁇ 4) m - 0- ( CH 2) n - (wherein, m and n represents an integer of, respectively it 1-3, alkylene group in the formula is an alkyl . but it may also be substituted with a group) or the formula - 0- (CH 2) 0- (wherein, m represents an integer of 1 to 3, alkylene down group in the formula is substituted by an alkyl group May be used.)
  • R 3e and R 6b are the same as above.
  • R 3f and R 4a and (R and R Sa ) form a pi bond.
  • compound 77) is preferable in that it effectively suppresses the expression of T-5A mRNA in dermal papilla cells and promotes the proliferation of dermal papilla cells.
  • R la and R 2a represent (CH 2 ) p CO—Y—R 10 (wherein, Y represents an oxygen atom or a sulfur atom, and R lfl represents a hydrogen atom.
  • (:. 6 shows an alkyl group or a substituted or unsubstituted ⁇ Li Ichiru group, p is indicating 0 or 1) is a group table in compounds (e.g., compound 52) or COR 12 (wherein And R 12 represents a substituted or unsubstituted aryl group or a substituted or unsubstituted heterocyclic ring.)
  • compound 58 is a compound of WNT-5A mRNA in hair papilla cells. It is preferred in that it effectively suppresses expression and promotes proliferation of hair papilla cells.
  • R 7a is Z-R 13 in group (wherein, Z is an oxygen atom or a sulfur atom, R 13 is showing a C 2 _ 6 Arukanoiru group or a substituted or unsubstituted Ariru group.) Represented by Certain compounds (eg, compound 53) are preferred because they effectively suppress the expression of WNT-5A mRNA in dermal papilla cells and promote the proliferation of dermal papilla cells.
  • the compound represented by the formula (II) can be produced, for example, by combining the following production methods.
  • R 1 , R 2 , R 4 , R 5 , R 6 , R 7 , R 8 , R 9 and X are the same as defined above.
  • An organic solvent eg, tetrahydrofuran, geethylether, ethyl alcohol
  • a reducing agent such as sodium borohydride, lithium borohydride, and if necessary, salts such as LiCl, MgCl 2 , CeCI 3 , CaCl 2 , and NiCl , Methyl alcohol, etc.
  • a compound of the formula (VI) is obtained by a commonly used separation method such as column chromatography Can be separated and purified.
  • the compound of the formula (VIII) is obtained by treating the compound of the formula (VII) with an acid or a base in a suitable organic solvent (for example, tetrahydrofuran, getyl ether, ethyl alcohol, methyl alcohol and the like).
  • a suitable organic solvent for example, tetrahydrofuran, getyl ether, ethyl alcohol, methyl alcohol and the like.
  • the production of the compound (1, 60 to 78) represented by the formula (K) is carried out in a medium containing various nutrients in accordance with the production of general fermentation products.
  • Chlamydosporia TF_0480te is cultured under favorable conditions (cultivated with Pochonia chlamydosporia var. Chlamydosporia TF_0480te).
  • the medium is mainly a liquid medium and consists of a carbon source, a nitrogen source, and inorganic salts. If necessary, vitamins, precursors, and antifoaming agents can be added, and the pH is adjusted to around 7.
  • a carbon source for example, glucose, dextrin, glycerin, starch and the like are used alone or in combination.
  • the nitrogen source for example, meat extract, oatmeal, yeast extract, soybean powder, polypeptone, corn steep liquor, urea, ammonium salt and the like are used alone or in combination.
  • the inorganic salt for example, monobasic phosphate, magnesium sulfate, sodium chloride, calcium carbonate or the like is used alone or in combination.
  • Adekinol or a silicon compound can be used as the defoaming agent.
  • Aerobic culture such as shaking culture and aeration and agitation culture is suitable for the culture method, and culture is performed at PH 4 to 10, 25 to 35 ° C for 2 to 5 days, and preferably at 25 to 28 ° C for 3 days.
  • Isolation of 1,60 to 78 produced by this culture may be performed according to a general method for collecting fermentation products. For example, the following method is effective. That is, after completion of the culture, a culture filtrate is obtained by centrifugation or filtration, and is adsorbed on a polystyrene resin such as Diaion HP-20 (trade name, manufactured by Mitsubishi Chemical Corporation). Elute with solvent.
  • the cells are extracted with an organic solvent such as lower alcohol or acetone. Then, the cell extract and the eluate from the adsorption resin are combined, concentrated under reduced pressure, and the remaining aqueous layer is extracted by adding an organic solvent such as ethyl acetate, black form, n-phenol, and the like. Is concentrated. The obtained residue is again Dissolved in organic solvents such as benzene, ethyl acetate, acetone, methanol, and gel-form, and used for silica gel column chromatography, gel filtration carm chromatography, and reverse-phase partitioning.
  • the compound of the present invention can be purified and isolated by performing chromatography.
  • the strain that produces the active ingredient of the present invention is a strain newly isolated from the soil by the present inventors, and has the microorganism name of ⁇ Poconia chlamydosporia variety Chlamydosporia TF-0480 (Pochonia chlamydosporia var.chlamydosporia TF-048).
  • the colony formed by this strain on a cornmeal agar plate at 26 ° C for 14 days was observed with an optical microscope.
  • the conidium-forming cells (phialides) were solitary directly on the mycelium or 2 to 4 cells formed in a ring form.
  • the conidiophore was indistinguishable from the vegetative mycelium.
  • Multiple conidia are formed at the tip of the fiaraid, and become a coamy.
  • the phialide has a cylindrical shape with a tapered tip, a smooth surface, no color, a length of 13-35 ⁇ m, a thickness of 0.8-1.7 ⁇ m at the base, and 0.5-0.8m near the tip. Conidia are oval to rarely subglobular, often with a slightly protruding base.
  • the surface is smooth, colorless and the size is 2.2-5.0X1.8-2.8 ⁇ m.
  • pale yellow, multicellular, thick-membrane spores (dictiochlamidospores) having a reticulated septum at the tip of short stems generated from hyphae on the medium surface or on the medium.
  • chlamydospores are also formed in the medium.
  • the size of chlamydospores is 14-20X12-1 22 m. Even if the culture was extended for more than one month, no morphology of teleomorph was observed.
  • This strain grows in the pH 6.0 sub-mouth liquid medium at a temperature of 15 to 31 ° C, and the optimal temperature is 25 to 27 ° C.
  • This strain grows in YpSs liquid medium at 26 ° C in the range of ⁇ 3-10, and the optimum pH is 5-7.
  • this strain was named "Poconia chlamydosporia variety Chlamydosporia TF-0480 (Pochonia chlamydosporia var. Chlamydosporia TF-0480) J.
  • hair papilla cell growth promoter means a drug or a reagent having an action of increasing the number of hair papilla cells.
  • the hair papilla cell growth promoter of the present invention is characterized in that it is based on the inhibitory action of WNT-5A function.
  • WNT-5A activates the ⁇ T /) 3-catenin pathway. It suppresses the function of WNTs (l, 8, etc.) in the T-1 class.
  • WNTs l, 8, etc.
  • the proliferation of hair papilla cells is controlled. Therefore, even a compound having a completely different structure (for example, compound 24, compound 79, compound 7, etc.) has an excellent dermal papilla cell growth-promoting effect as long as it has an excellent WNT-5A function inhibitory effect. .
  • Cell proliferation can be measured by a method known to those skilled in the art, and examples thereof include viable cell count using an appropriate chromogenic substrate, and [3H] -thymidine incorporation method.
  • the color-developing substrate it is preferable to use tetrazolium salts such as MTT, MTS, XTT and the like, and Alamar Tablets.
  • the “hair growth agent or hair restorer” is used for the purpose of inducing hair growth, promoting hair growth, preventing hair loss, and the like.
  • the target of application includes, for example, improvement or prevention of alopecia areata and male pattern baldness.
  • the effect of the hair-growing agent / hair-growth agent of the present invention is due to the effect of promoting the growth of the dermal papilla cells based on the suppression of WNT-5A function.
  • This mechanism of action enhances the decreased cell proliferation ability of the hair loss dermal papilla, and forms a developed hair dermal papilla tissue. Is also expected to be effective.
  • a synergistic effect can be expected by combination with a hair growth agent and a hair restorer having other action points.
  • the hair growth agent and the hair growth agent of the present invention can be administered in various dosages and administration forms based on the respective compounds.
  • the dose varies depending on the type of hair restorer and the form of administration.
  • the compound represented by the formula ( ⁇ ) when applied by application (lotion, ointment, gel, etc.), 0.0001 to 10% by weight , Preferably 0.001 to 5% by weight, more preferably 0.001 to 1% by weight.
  • the dose is preferably 1 to 100 mgZkgZ days.
  • the mode of administration of the hair growth agent of the present invention z is not particularly limited.
  • a T-5A production inhibitor such as a compound represented by the formula (IX) is effectively used.
  • the hair growth agent to be used is provided in the form of a water-soluble composition.
  • various additives humidityectants, thickeners, preservatives, oxidizing agents
  • the hair growth agent Z of the present invention can be provided, for example, as a hair conditioning composition such as hair tonic, hair oil, hair mousse, or gel, or an ointment.
  • a T-15A production inhibitor for example, a compound represented by the formula (IX)
  • a suitable buffer such as purified water or a phosphate buffer.
  • it is prepared as an emulsion and administered topically as a liquid formulation for the scalp.
  • the liquid preparation may be applied directly to the scalp, or may be applied using an injection nozzle such as a spray.
  • a WNT-5A production inhibitor for example, a compound represented by the formula (K) may be used as a fat, fatty oil, lanolin, petrolatum, paraffin, It can be topically administered as an external preparation for ointments and creams by mixing with plasters, resins, plastics, glycols, higher alcohols, glycerin, 7K, emulsifiers, suspending agents and the like.
  • a WNT-15 production inhibitor for example, a compound represented by the formula (IX)
  • a powder It may be used as an external preparation such as a powder or a solid preparation to be dissolved or suspended in a solvent before use and applied to the scalp.
  • a pharmaceutically acceptable carrier excipient, binder, disintegrant, corrigent, etc.
  • a T-5A production inhibitor such as a compound represented by the formula (K)
  • Tablets, capsules, granules, powders, syrups and the like obtained by formulating a pharmaceutical composition obtained by blending with a diluent, a solubilizing agent, etc. according to a usual method. It is preferably provided in the form of a preparation, suspension, solution or the like.
  • the present invention is also a method for screening for a hair papilla cell growth promoter, which comprises selecting a compound that inhibits the function of ⁇ T-5A.
  • Selecting a compound that inhibits the function of WNT-5A means, for example, selecting a WNT-5A production inhibitor, ie, screening. You can also select the WNT-5A receptor antagonist.
  • test substance used in the screening method of the present invention any substance can be used.
  • the type of the test substance is not particularly limited, and may be an individual low molecular compound, a compound present in a natural product extract, or a synthetic peptide. Further, it may be a compound library or a combinatorial library. The construction of a compound library is known to those skilled in the art, and a commercially available compound library can also be used.
  • the compound to be screened preferably has a molecular weight of 3000 or less from the viewpoint of use as a pharmaceutical, and is preferably a low molecular weight compound having a molecular weight of 600 or less from the viewpoint of enabling oral administration by application.
  • a labeled ⁇ T-5A protein and tXWNT—5A receptor are used to detect or measure the label, thereby obtaining a ⁇ T-5A protein and a T-book.
  • Labels include radioisotopes (32P, 33P, 1311, 1251, 3H, 14C, 35S, etc.), enzymes (alkaline phosphatase, horseradish peroxidase, etc.), fluorescence material
  • an in vitro Atsey system is performed in a non-cellular system. Specifically, either the WNT-5A protein or the ⁇ T-15A receptor was bound to the support, the test substance was added to the other, and the mixture was incubated, washed, and bound to the support. What is necessary is just to detect or measure the binding of the other protein to the protein.
  • the support to which the protein is bound includes, for example, insoluble polysaccharides, such as agarose, dextran, cellulose, synthetic resins, such as polystyrene, polyacrylamide, and silicon. More specifically, commercially available beads and plates manufactured using them as raw materials are used.
  • the screening of the compound for inhibiting 5A production can be performed using the amount of WNT-5A mRNA or the amount of WNT-5A protein as an index.
  • the expression level can also be detected by linking a reporter gene to the promoter region of the WNT-5A gene.
  • SEQ ID NO: 3 is preferably used as the promoter of the WNT-5A gene.
  • repo overnight gene examples include GFP gene (Green Fluorescent Protein), GUS gene (i3-Glucuronidase), LUC gene (Lucif erase), and CAT (Chloram phenicol acetyl trans ferase) gene.
  • the ⁇ T one 5A mRNA amount as when an index, for example, using a human ⁇ T one 5A-expressing cells, the addition of the test substance, 37 ° C, 5% C0 2 - the number of the incubator 95% air Time After culturing, lyse the cells, extract the RNA, and measure the amount of T-15A mRNA using RT-PCR, etc., to search for a substance that has the activity to reduce the amount of T-15A mRNA. be able to.
  • the primer used for PCR is not particularly limited as long as it is specific to WNT-5A mRNA, and it can be designed from the sequence of T_5A mRNA.
  • it is preferably Forward Primer AATGTCTTCCAAGTTCTTCCTAGTGGC (SEQ ID NO: 8).
  • Rev Primer GATGTCGGAATTGATACTGGCA SEQ ID NO: 9).
  • the ⁇ T one 5A protein content as when an index, for example, using a human Wnt-5A-expressing cells, the addition of the test substance, 37 ° C, 5% C0 2 - several hours in an incubator of 95% air
  • the protein is extracted using a culture medium or by lysing the cells, and the WNT-5A protein content is measured by ELISA (enzyme-1 inked immunosorbent assay) or the like. It is possible to search for a substance having an activity of reducing the expression level.
  • ELISA enzyme-1 inked immunosorbent assay
  • Example 16 (Compound 31) Radicicol (10.8 g) was dissolved in ethyl acetate (140 ml), 5% palladium on carbon (pet type) (255 mg) was added, the atmosphere was replaced with hydrogen (1 atm), and the mixture was stirred at room temperature for 3 hours. After the palladium carbon was filtered, the filtrate was concentrated under reduced pressure. The obtained residue was purified by silica gel chromatography [Silica Gel 60 (trade name, manufactured by Merck)], and eluted with n-hexane: ethyl acetate (2: 1) to give compound 4 (3.43). Compound 3 (4. g) was obtained by eluting with n-hexane: ethyl acetate (3: 2).
  • the obtained ethyl acetate layer was dried over anhydrous sodium sulfate, and the ethyl acetate was distilled off under reduced pressure to obtain a gum (1.46 g).
  • a column of silica gel [Silica Gel 60 (trade name, manufactured by Merck)] prepared by dissolving the obtained substance in a mixed solvent of black mouth formumethanol (4: 1) and wetting with n-hexane. 400 ml).
  • Fraction (1) was dissolved in a small amount of tetrahydrofuran, and preparative high-performance liquid chromatography using acetonitrile-water (pH 3.5, acetic acid) (35:65) mobile column [Column: YMC-Pack Pro C18 AS- 343 (20 X 250 mm), detection UV absorption 254 nm, flow rate lOml / min], collect three fractions, concentrate each fraction under reduced pressure Compound 36 (11.3 mg, 20 min) and Compound 38 (10.lmg, 25 min) were obtained together with Compound 9 (87.2 mg).
  • fraction (2) is dissolved in a small amount of tetrahydrofuran, purified by preparative high-performance liquid chromatography under the same conditions as fraction (1), two fractions are collected, and each fraction is concentrated under reduced pressure.
  • Compound 37 (19.8 mg, 25 min) and Compound 39 (23.2 mg, 27 min) were obtained.
  • Example 20 (Compounds 40, 41)
  • Radicicol (406 mg) was dissolved in N, N-dimethylformamide (6 ml), and triethylamine (57.6 mg) and thiophenol (260 mg) were added under ice-cooling, followed by stirring overnight under ice-cooling.
  • Dilute hydrochloric acid was added to the reaction solution, extracted with ethyl acetate, washed with water and saturated saline in this order, dried over anhydrous magnesium sulfate, and then dried under reduced pressure.
  • Zinc sulfate ( ⁇ ) heptahydrate 0.001% Zinc sulfate ( ⁇ ) heptahydrate 0.001%
  • Silica gel [Silica Gel 60 (trade name, manufactured by Merck)] prepared by dissolving a portion (30 g) of a culture extract in a mixed solvent of black-mouthed form-methanol (4: 1) and moistened with n-hexane Column (1600 ml). Elution was performed sequentially with a mixed solvent of n-hexane monoethyl acetate. The fraction eluted with n-hexane-ethyl acetate (4: 1) (13 Orag), (2: 1) eluted fraction (1) (1.88 g), (2) (780 mg) and (1: 2) eluted fraction (3.56 g) were obtained.
  • the fraction (1) is dissolved in a small amount of methanol, and acetonitrile-water (pH 3.5, vinegar) Preparative high-performance liquid chromatography using 4884 acid) (30:70) as the mobile phase [column: YMC-; Pack Pro C18 AS-343 (20 x 250 mm), detection UV absorption 254 nm, flow rate lOml / min] Purification, fractionation of four fractions, concentration of each fraction under reduced pressure, compound 64 (35.4 mg, 21 min), compound 72 (13.7 mg, 27 min), compound 71 (6.6 mg, 29 min), compound 65 (4. lmg, 33 min) was obtained.
  • the culture extract (39.5 g) obtained in the same manner as in Example 36 was dissolved in n-hexane (300 ml ⁇ 2), and the resulting precipitate was filtered to remove the solvent.
  • the obtained precipitate (8.1 g) was dissolved in a mixed solvent of chloroform-methanol (4: 1) and wetted with silica-gel form [Silica Gel 60 (trade name, manufactured by Merck)]. It was adsorbed on a column (650 ml). Elution was carried out sequentially with a mixed solvent of chloroform and methanol to obtain a fraction (318 mg) eluted with chloroform and methanol (88:12).
  • the culture extract (39.5 g) obtained in the same manner as in Example 36 was dissolved in n-hexane (300 ml ⁇ 2), and the resulting precipitate was filtered to remove the solvent.
  • the resulting precipitate (8.1 g) was dissolved in a mixed solvent of black form-methanol (4: 1) and wetted with black form [silica gel 60 (trade name, manufactured by Merck)]. Adsorbed to a column (650 ml). Elution was carried out sequentially with a mixed solvent of black form-methanol to obtain a fraction (1.5 g) eluted with black form-methanol (100: 0).
  • Silica gel [Silica Gel 60 (trade name) prepared by dissolving the culture extract (500 g) obtained in the same manner as in Example 36 in a mixed solvent of black-mouthed form-methanol (4: 1) and moistened with black-mouthed form is used. , Manufactured by Merck)]] (6000 ml). The mixture was eluted sequentially with a mixed solvent of chloroform-methanol to obtain a fraction (57 g) eluted with chloroform-methanol (95: 5).
  • the fraction (2) was purified by preparative high-performance liquid chromatography using a mobile phase of acetonitrile-water (pH 3.5, acetic acid) (45:55), and two fractions were collected. And each down pressure concentrated to give the compound 73 (38. Lmg, 10min), the compound 77 (67.2mg, 26min) was obtained.
  • Example 41 Compound 67, 75
  • a culture extract (500 g) obtained in the same manner as in Example 36 was dissolved in a mixed solvent of black-mouthed form-methanol (4: 1), and the silica gel [Silica Gel 60 (trade name) prepared by wetting with black-mouthed form , Manufactured by Merck)]] (6000 ml). Elution was performed sequentially with a mixed solvent of chloroform-methanol to obtain a fraction eluted with chloroform-methanol (95: 5) (57 g), and a portion (18 g) of this fraction was further dissolved in a mixed solvent of n-hexane-ethyl acetate.
  • the semi-pure sample was purified by preparative thin-layer chromatography [Silic a Gel 60 F254 (trade name, manufactured by Merck), 20 cm x 20 cm, 0.5 tall] using chloroformumethanol (90:10) as a developing solvent.
  • the portion having an Rf value of 0.5 was collected, extracted with ethyl acetate, and concentrated under reduced pressure to obtain compound 75 (4.3 mg).
  • Table 2 shows the compounds synthesized in the above Examples, the purified compounds, and their data.
  • Human dermal papilla cells were purchased from Toyobo and cultured using MEM (Invitrogen) supplemented with 12% FBS. Human follicle keratinocytes were separated from the depilated hair and cultured using KGM-2 (Sanko Junyaku) according to the method of roughing (J. Dermatol. Sci. 2, 66-70 (1991)).
  • the hair papilla cells at the fifth passage and the hair follicle keratinized cells at the second passage were seeded on a 10 cm Petri dish so as to have 2 ⁇ 10 6 cells lsZwe 11, and cultured in a small scale. After removing the medium and washing the cells with PBS (1), total RNA was extracted using TRIzol reagent (Invitrogen).
  • Human dermal papilla cells were purchased from Toyobo and cultured using MEM (Invitrogen) supplemented with 12% FBS.
  • WNT-5A forward AATGTCTTCCAAGTTCTTCCTAGTGGC (SEQ ID NO: 8), ⁇ T-1 5A reverse: GATGTCGGAATTGATACTGGCA (SEQ ID NO: 9), GAPDH forward: ACCAC AGTCCATGCCATCAC (SEQ ID NO: 10), GAPDH reverse: TCCACCACCCTGTTGCTGTA (SEQ ID NO: 11)) 0.4 xM each, and SUPERSCRIPT One—Step RT—PCR with PLATINUM
  • the CNT was repeated for 30 seconds at 72 ° C and 30 seconds at 72 ° C for 23 or 20 cycles to amplify the 0
  • the reaction solution was subjected to electrophoresis using 1.5% agarose gel and stained with ethidium bromide. The result is shown in figure 2.
  • Test example 3 Test for dermal papilla cell growth promotion
  • Human dermal papilla cells were purchased from Toyobo and cultured using MEM (Invitrogen) supplemented with 12% FBS.
  • the dermal papilla cells at the fifth passage were seeded at 1.5 ⁇ 10 4 cells lsZwell in a 96-well plate for spheroid culture, and cultured overnight.
  • the medium was replaced with a compound-free medium or a medium containing Compounds 1, 2, 3, 4, 5, 7, 9, or 24, and culturing was continued for another 72 hours.
  • the number of cells at the end of the culture was measured using Cell counting kit (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). That is, 5 hours before the end of culture, add 1Z10 amount of WST-1 reagent to the culture medium, The absorbance (OD 450 nm / 620 nm) of the medium was measured. A positive correlation was found between the cell number and the absorbance in the range of 0.25 to 4 ⁇ 10 4 cells sZwell.
  • T-5A was expressed in human dermal papilla cells
  • the amount of ⁇ T-5A mRNA in human dermal papilla cells was reduced by the compound according to the present invention, and that It was shown that the compound having the activity of decreasing mRNA amount has the activity of promoting the proliferation of hair papilla cells.
  • Test Example 4 WNT-5A mRNA level reduction activity of compound (Table 2) (Quantitative determination of mRNA by QuantiGene method)
  • Human dermal papilla cells were purchased from Toyobo and cultured using MEM (Invitrogen) supplemented with 12% FBS.
  • a probe set specific to ⁇ T-5A or GAPDH was added and reacted at 53T for 20 hours.
  • an amplification probe consisting of bDNA was added and reacted at 46 ° C for 1 hour.
  • a labeled probe labeled with Alkaline Phosphatase was subsequently added, and reacted at 46 ° C for 1 hour.
  • the substrate Lumi-Phos Plus was added, and after reacting at 46 ° C for 30 minutes, the amount of chemiluminescence was measured using WALLAC 1420ARVO SX . 03 04884
  • a WNT-5A-specific probe set was designed based on the nucleotide sequence of the protein translation region of human WNT-5A mRNA. 10 probes (SEQ ID NOS: 12 to 21) as Capture Extender (CE), 31 probes (SEQ ID NOs: 22 to 52) as Label Extender (LE), and 9 probes (SEQ ID NOs: 53 to 60) as Blocker ) It was used.
  • a bDNA probe set for human GAPDH (XenoTech LLC, B0960) was used.
  • the mRNA level of WNT-5A and GAPDH is expressed as a relative value (%) to the control without compound.
  • the compound concentration ( IC5e value) that reduces the mRNA level to 50% is calculated, and the mRNA reduction by the compound is calculated. It was used as an indicator of activity.
  • Table 3 shows the effects of the compounds on the mRNA levels of WNT-5A and GAPDH.
  • the values in the table are the average values of two wells. These compounds reduced WNT-5A mRNA levels in dermal papilla cells. IC 5 of the most active compound. The value was 0.12 / M. WNT- 5A IC 5 of mRNA loss. Regarding the values, no decrease was observed in the GAPDH mRNA level measured at the same time.
  • Human dermal papilla cells were purchased from Toyobo and cultured using MEM (Invitrogen) supplemented with 12% FBS.
  • the dermal papilla cells at the fifth passage were seeded at a density of 1.5 ⁇ 10 4 cells / well in a 96-well plate for spheroid culture, and cultured overnight.
  • the medium was replaced with a compound-free medium or a compound-supplemented medium, and culturing was further performed for 72 hours.
  • the number of cells at the end of the culture was measured using a Cell counting kit (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). That is, 5 hours before the end of the culture, 1/10 volume of the WST-1 reagent was added to the medium, and at the end of the culture, the absorbance (OD450nm / 620nm) of the medium was measured. A positive correlation was observed between the cell number and the absorbance in the cell number range of 0.25 to 4 ⁇ 10 4 cells / well.
  • Table 4 shows the effect of the compound having the activity of reducing the amount of WNT-5A mRNA on the proliferation of dermal papilla cells.
  • the values in the table are the average values of 6 wells for the control group and 3 weII for the compound addition group. Student's t-test was used for comparison between the control group and the compound-added group.
  • Test Example 6 Decrease of ⁇ T-5A mRNA in monkey skin organ culture
  • the reaction solution was subjected to electrophoresis using 1.5% agarose gel, and stained with Cyber Green I (Yukara).
  • Fig. 4 shows the results.
  • Test Example 7 Increase of Proliferating Cell Nuclear Antigen (PC NA) positive cells in monkey skin organ culture
  • the skin of the back of a cynomolgus monkey (oss, 6 years old) was collected and divided under a stereoscopic microscope into 5 mm x 8 mm, and each skin tissue piece was added with no compound or compound 7 or 3
  • the cells were cultured using Williams' Medium E (Invitrogen) containing 10 g / ml of Insulin (Sigma) and 10 ng / ml of Hydrocortisone (Krapo II).
  • the skin of the back of a cynomolgus monkey (oss, 6 years old) was collected, divided under a stereoscopic microscope into 5 mm x 8 mm, and each skin tissue piece was added with no compound or with compound 7 or compound 3
  • the cells were cultured using Williams' Medium E (Invitrogen) containing 10 g / ml of Insulin (Sigma) and 10 ng / ml of Hydrocortisone (Kurapo).
  • the figure is a histogram showing the distribution of the hair bulb diameter. All the hair follicles contained in each skin tissue piece were classified into the groups of the hair bulb diameters shown in the figure, and the number of hair follicles classified into each group was calculated as the total number of hair follicles separated from the tissue piece. It was expressed as a relative value (%) with respect to.
  • FIG. 6 shows the effect of the culture with the addition of compound 7. The average value of the bulb diameter of the hair follicles contained in the skin pieces cultured in the presence of compound 7 for 30 days was significantly higher than that of the control without compound. Looking at the distribution, the control with no compound added was 140 zm or more.
  • the largest number of hair follicles had a hair bulb diameter of less than 170 im, but with the addition of Compound 7, the proportion of hair follicles having a hair bulb diameter of 170 II m or more and less than 200 ⁇ m was the largest.
  • the proportion of hair follicles having a hair bulb diameter of 170 m or more increased from 57.6% in the control without compound addition to 82.4% in the compound 7 addition.
  • FIG. 7 shows the effect of the culture added with compound 3.
  • the average value of the bulb diameter of the hair follicles contained in the skin pieces cultured for 30 days in the presence of Compound 3 was significantly higher than that of the control containing no compound.
  • the hair follicles with the diameter of the hair bulb of m or more and less than 200 m were the most frequent, but the hair bulb of 200 Um or more and less than 230 m with the addition of Compound 3
  • the proportion of hair follicles having a diameter was the largest.
  • the proportion of hair follicles having a hair bulb diameter of ⁇ 70 ⁇ ⁇ or more was 55.8% in the control without the compound, but increased to 74.5% in the compound 3 addition.
  • Experimental Example 9 Macaca fascicularis hair growth test
  • a mouthwash containing 0.3% of Compound 7 was applied to the frontal region of a macaque monkey (male, 14 years old) with alopecia symptom once a day, 5 times a week, for 6 months.
  • marking was performed on the hair loss area of the frontal region with a tattoo, and enlarged photographs of the skin including the tattoo were taken before the start of the application and after the application for 6 months.
  • FIG. 8 shows enlarged photographs of the skin before and after application of the lotion containing compound 7 for 6 months.
  • TOT-5A is expressed in human dermal papilla cells
  • the amount of TOT-5A mRNA in human dermal papilla cells is reduced by the compound according to the present invention
  • WNT-5A It was shown that the compound having the activity of decreasing mRNA level has the activity of promoting the proliferation of hair papilla cells.
  • the compound of the present invention can reduce the amount of WNT-5A mRNA in hair follicles in monkey skin organ culture, and can reduce PCNA in both telogen and anagen hair follicles.
  • 03 04884 It was shown that the number of proliferating cells positive for staining was significantly increased, and that the diameter of the hair bulb of the hair follicle was increased.
  • the compound according to the present invention was shown to have an effect of improving alopecia in a macaque monkey, a model animal for androgenetic alopecia.
  • a compound that promotes the proliferation of dermal papilla cells contributes to the formation of developed dermal papilla tissue by promoting the reduced cell proliferation ability in the dermal papilla of the hair loss follicle. As a result, hair growth is promoted.
  • ⁇ T-5A function inhibitors for example, ⁇ A compound having an activity to reduce the amount of T-5A mRNA or a pharmaceutically acceptable salt thereof has a hair papilla cell proliferation activity and is expressed by a novel mechanism of action. Useful as a hair preparation / hair restorer.
  • the present invention provides an entirely new concept that a compound that inhibits the function of WNT-5A becomes an agent for improving or preventing alopecia, and a compound that inhibits the function of WNT-5A. Screening is useful for the development of a new hair growth agent Z.

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Description

育毛剤
技術分野
本発明は、 毛乳頭細胞増殖促進剤、 発毛剤及び育毛剤に関するものである。 具 体的には、 WNT— 5Aの機能阻害物質を有効成分とする毛乳頭細胞増殖促進剤、 発 毛剤及び育毛剤に関するものである。 また、 WNT— 5A機能阻害作用に基づく毛乳 頭細胞増殖促進剤のスクリーニング方法に関するものである。 景技 了
ヒト毛髪毛包は、 角化細胞、 毛乳頭細胞、 繊維芽細胞及び脂腺細胞等の様々な 上皮系及び真皮間様系の細胞から構成されており、 これらの細胞間相互作用を介 して、 毛髪の成長サイクル （毛周期） が調節されている。 毛の本体は、 毛包角化 細胞の増殖 Z分ィヒ （角化） により形成されるが、 この毛包角化細胞の増殖、 分化 及びアポトーシスを制御し、 毛周期調節の中心的な役割を担っているのは、 毛乳 頭である。 したがって、 発毛剤/育毛剤を開発する上で毛乳頭細胞に対する作用 を研究することは重要と考えられる。 しかし、 これまでに毛乳頭細胞の増殖能及 び毛周期調節能を制御する分子機構については、 ほとんど明らかにされていない 一方、 丽 T一 5Aは、 醫 Tファミリーに属する分泌性糖蛋白質である。 WNTフアミ リーには、 約 20種類の分子が存在し、 各分子は線虫から哺乳類まで広く保存され ている。 これら WNTsは、 胎生期の体軸形成や器官形成を制御する重要な細胞間シ グナル分子であることが知られている （Aimu. Rev. Cell Dev. Biol. 14, 59- 88 (1998) 、 Genes&Dev. 11, 3286-3305 (1997) ) 。 WNTsの受容体は、 7回膜 貫通型の Frizzledで、 ヒトでは 10種類存在する （Aimu. Rev. Cell Dev. Biol. 14, 59-88 (1998) 、 Genes&Dev. 11, 3286-3305 (1997) ) 。 WNTと Frizzled の結合の組み合わせに依存して、 3種類のシグナル伝達経路 （WNT//3—力テニ ン経路、 PCP経路、 颗 T/Ca2 +経路） が存在する （Arnrn. Rev. Cell Dev. Biol. 14, 59-88 (1998) ) 。
近年、 WNT//3-カテニン経路が毛包形成に重要であることが明らかにされた （G 4 enes & Dev. 8, 2691-2703 (1994)、 Cel l 95, 605-614 (1998)、 Dev. Biol . 07 , 133-149 (1999)、 Genes & Dev. 14, 1181 - 1185 (2000)、 Cel l 105, 533-545 (2001) ) 。 1998年には、 安定化 /3 -カテニンの皮膚におけるトランスジエニック マウスが作製され、 このマウスは毛包新生が亢進し多毛となることが報告された
(Cel l 95, 605-614 (1998) ) 。 また、 2000年には、 毛乳頭細胞の毛包誘導能の 維持に、 WNT/ ]3 -カテニンシグナルが重要であることが報告された （Genes & Dev . 14， 1181-1185 (2000) ) 。
しかし、 WNT- 5Aからのシグナル伝達は、 ]3 -カテニン経路ではなく、 Ca2 +経路 を介することが明らかにされており （Dev. Biol. 182, 114-120 (1997)、 Curr.
Biol. 9, 695-698 (1999) ) 、 WNT-5Aと毛包新生との関連性については何ら報告 はない。
この他、 アフリカッメガエル丽 T— 5A mRNA をヒト Fr izz led5 mRNAとともにァ フリカツメガエル初期胚に注入すると二次体軸が誘導する （Science275，1652 - 16 54 (1997) ) 一方、 WNT-1ゃ而 T- 8 mRNAの注入により誘導される二次体軸形成を丽 T —5Aが抑制するという報告 (J. Cel l Biol . 133, 1123-1137 (1996) ) や、 アフリカ ッメガエル WNT— 5Aは、 ラット Frizzled2と結合し、 Ca2 +経路を介して CamKI I (Ca 2 + /calmodul in-dependent protein kinase I I) と PKC ^protein kinase I I) が 活性化されるなどの報告 (Curr. Biol. 9， 695 - 698 (1999) ) があるが、 生理 的な意味は未だ解明されておらず、 WNT— 5Aと発毛/育毛との関連性についても 何ら報告はない。 発明の開示
本発明は、 毛乳頭細胞の増殖を制御する分子を用いたスクリーニング方法、 毛 乳頭細胞増殖促進剤並びに新規な作用に基づく発毛剤又は育毛剤を提供すること を目的とする。
本発明者らは上記目的のため鋭意研究を行つた結果、 毛乳頭細胞に西 T一 5Aが 高発現していること、 WNT— 5Aが毛乳頭細胞の増殖能に関与することを発見した 。 さらにこの知見に基づき検討を重ねた結果、 TOT— 5Aの機能を阻害することに より毛乳頭細胞の増殖を顕著に促進し、 毛包の毛球部位を増大することを見出し 、 本発明を完成するに至った。
すなわち、 本発明の 1態様によると、 WNT— 5Aの機能阻害活性を有する化合物 を含有する毛乳頭細胞増殖促進剤を提供する。
また、 本発明の他の態様によると、 蘭 T— 5A産生抑制作用を有する化合物を含有 する毛乳頭細胞増殖促進剤を提供する。
また、 本発明の他の態様によると、 式 （I)
Figure imgf000004_0001
[式中、 R1及び R2は 同一又は異なって水素原子、 アルキル基又は C2 _ 6ァ ルカノィル基を示し、
Xは水素原子又はハロゲン原子を示し、
R3 a及び R3 bは異なって水素原子又は水酸基を示し、
R4、 R5、 R6 , R7、 R8及び R9は同一又は異なって水素原子、 水酸基、 ハロゲ ン原子又は C2 _ 6アルカノィルォキシ基を示すか、 又は隣り合う基が一緒になつ てパイ結合又はエーテル結合を形成するか、 あるいは R5と R8若しくは R5と R9 が一緒になつてエーテル結合を形成する。 ]で表される化合物を提供する。
また、 本発明の他の態様によると、 式 （I I)
Figure imgf000005_0001
[式中、 R1及び R2は 同一又は異なって水素原子、 6アルキル基又は C2_6ァ ルカノィル基を示し、
Xは水素原子又はハ口ゲン原子を示し、
R3c及ぴ R3 άは同一又は異なって水素原子、 水酸基又は C t _ 6アルコキシ基を示 すか、 あるいは と R3dが一緒になつてォキソ基、 ヒドロキシィミノ基又は C , _6アルコキシィミノ基を形成し、
R R R6、 R7、 R8及び R9は同一又は異なって水素原子、 水酸基、 ハロゲ ン原子又は C2_6アルカノィルォキシ基を示すか、 又は隣り合う基が一緒になつ てパイ結合又はエーテル結合を形成するか、 あるいは R5と R8若しくは R5と が一緒になつてエーテル結合を形成する。 ]で表される化合物を含有する毛乳頭 細胞増殖促進剤を提供する。
また、 本発明の他の態様によると、 式 （K)
Figure imgf000005_0002
[式中、 Rl a及び R2aは 同一又は異なって水素原子、 Ct_6アルキル基、 （：卜6ァ ルカノィル基、 (CH2) p CO-Y-R10 (式中、 Yは酸素原子又は硫黄原子を示し、 R10 は 水素原子、 アルキル基又は置換若しくは無置換のァリ一ル基を示し、 Pは 0又は 1を示す。 ） で表される基、
(CH2) q R11 (式中、 R11 は置換若しくは無置換のシクロアルキル基又は 置換若しくは無置換の C^,。ヘテロ環を示し、 Qは 0又は 1を示す。 ） で表され る基、 又は CO R12 (式中、 R12 は置換若しくは無置換のァリール基又は置換 若しくは無置換の C2 。ヘテロ環を示す。 ） で表される基を示し、
Xは水素原子又はハロゲン原子を示し、
R3e及び R3 fは同一又は異なって水素原子、 水酸基、 〇ぃ6アルコキシ基又は Ct _6アルカノィルォキシ基を示すか、 又は R3eと R3 fが一緒になつてォキソ基、 ヒ ドロキシィミノ基又は _6アルコキシィミノ基を形成し、
R4a、 R5a、 R6a、 R7 R8 a及び R9 aは同一又は異なって水素原子、 水酸基、 ハロゲン原子又は
Z-R13 (式中、 Zは酸素原子又は硫黄原子を示し、 R13 は アルキル基、 アルカノィル基又は置換若しくは無置換のァリール基を示す。 ） で表され る基を示すか、 又は隣り合う基が一緒になつてパイ結合又はエーテル結合を形成 するか、 あるいは R と R8 a若しくは R5 aと R9 aがー緖になってエーテル結合を 形成し、
R6bは水素原子を示すか、 あるいは R3 e若しくは R3 f と一緒になつてェ一テル結 合を形成する。 ]で表される化合物を含有する毛乳頭細胞増殖促進剤を提供する また、 本発明の他の態様によると、 上記毛乳頭細胞増殖促進剤を有効成分とす る発毛剤又は育毛剤を提供する。
また、 本発明の他の態様によると、 WNT— 5Aの機能を阻害する物質を選択するこ とを特徴とする、 毛乳頭細胞増殖促進剤のスクリーニング方法を提供する。
また、 本発明は、 丽 T一 5Aの機能を阻害する物質を選択する方法であって、 下記（ a)〜（c)の工程を含むことを特徴とする毛乳頭細胞増殖促進剤のスクリーニング 方法である。 03 04884
(a)ヒト WNT— 5A発現細胞を被検化合物を添加した培地を用いて培養する工程：
(b)工程（a)で培養したヒト颗 T—5A発現細胞を溶解して RNAを抽出し、 WNT— 5Α mR NA量を測定する工程：及び
(c)工程（b)で測定した WNT― 5 A mRNA量を比較する工程。 図面の簡単な説明
図 1は、 毛乳頭細胞に WNT— 5A mRNAが発現していることを示す電気泳動図を表す 図 2は、 被検化合物が毛乳頭細胞において WNT— 5A mRNA量を減少させることを示 す電気泳動図を表す。
図 3は、 被検化合物が毛乳頭細胞の増殖促進活性を有することを示すグラフを表 す。
図 4は、 サル皮膚器官培養における WNT— 5A mRNAの減少を示す電気泳動図である 図 5は、 サル皮膚器官培養における休止期毛包及び成長期毛包の P C NA染色の 結果を表す。
図 6は、 化合物 7がサル皮膚器官培養における毛球部径を増大させることを示す ヒストグラムを表す。
図 7は、 化合物 3がサル皮膚器官培養における毛球部径を増大させることを示す ヒストグラムを表す。
図 8は、 ベニガオザル発毛試験における 6ヶ月間塗布前後の皮膚拡大写真を表す
発明の実施の形態
以下、 本発明を更に具体的に説明する。
<WNT一 5 Aの機能を阻害する化合物 >
本発明において 「顺 T一 5Aの機能を阻害する化合物」 （以下、 「WNT— 5A機能阻 害剤」 ということがある。 ） とは、 丽 T一 5Aと WNT— 5A受容体の結合を阻害する化 合物、 又は、 WNT— 5Aの産生を抑制する化合物を意味し、 好ましくは雷 T— 5Aの産 0304884 生を抑制する化合物である。
WNT-5Aは、 ヒト、 マウス、 ラット、 アフリカッメガエル等でその発現が確認さ れている WNTファミリーに属する分泌性糖蛋白質であるが、 医薬品として使用す る点からヒトの WNT- 5A (配列番号 1) 機能を阻害する化合物が好ましい。
WNT一 5 Aと TOT— 5 A受容体の結合を阻害する化合物とは、 WNT— 5A又は WNT - 5A受 容体に作用することにより暫 T一 5 Aと爾 T一 5 A受容体の結合を阻害し、 WNT- 5 Aによ るシグナル伝達を抑制するものを意味し、 好ましくは Ca2 +経路を介したシグナル 伝達を抑制する化合物であり、 例えば、 WNT— 5A受容体アン夕ゴニストを挙げる ことができる。 WNT- 5A受容体としては、 具体的には例えば、 ヒト Frizzled5 (配 列番号 4) 、 ラット Frizzled2 (配列番号 6) を挙げることができる。 当該化合 物は、 ペプチド性でも非ペプチド性でもよいが、 作用時間が長い利点がある非べ プチド性の阻害剤が好ましい。 また、 当該化合物は、 標識した丽 T一 5A及 m?NT— 5A受容体を用いたスクリーニング系により選択することができ、 好ましくは IC50 が 30 以下のものであり、 更に好ましくは 10 /M以下のものである。
體 T一 5A産生を抑制する化合物とは、 WNT— 5A遺伝子の発現を抑制する化合物を 意味する。 当該化合物は、 ペプチド性でも非ペプチド性でもよいが、 作用時間が 長い利点がある非ペプチド性の阻害剤が好ましい。 また、 当該化合物は、 WNT— 5 A蛋白質量 （配列番号 1) 又は WNT— 5A mRNA量 （配列番号 2) の減少を指標とし て選択することができ、 好ましくは Hart leyらの方法 （Drug Metabolism and Dis position 28 (5), 608-616 (2000)、 後述する試験例 4) に準じた核酸プロ一プア ッセィ方法により IC5 Eが 以下のものであり、 更に好ましくは 10 M以下のも のである。
特に好ましくは、 式 （I) 、 (II) 及び （K) で表される化合物である。
式 （I) 、 (II) 及び （DO で表される化合物において _6アルキル基とは、 炭素数 1〜 6の直鎖又は分枝鎖状のアルキル基を意味し、 具体的には、 例えばメ チル基、 ェチル基、 プロピル基、 イソプロピル基、 ブチル基、 イソブチル基、 t e r t—ブチル基、 ペンチル基、 2—ェチルプロピル基、 へキシル基等が挙げら れる。 C卜 6アルカノィル基とは、 炭素数 1〜 6の直鎖又は分枝鎖状のアル力ノィル 基を意味し、 具体的には、 例えばァセチル基、 プロピオニル基、 プチリル基、 t —プチリル基等を挙げることができる。
(^ _ 6アルコキシ基とは、 炭素数 1〜6の直鎖又は分枝鎖状のアルコキシ基を 意味し、 具体的には、 例えばメトキシ基、 エトキシ基、 プロポキシ基、 イソプロ ポキシ基、 ブトキシ基、 イソブトキシ基、 s ec-ブトキシ基、 t er t-ブトキシ基、 ペンチロキシ基、 イソペンチロキシ基、 ネオペンチロキシ基、 t er t-ペンチロキ シ基、 1一メチルブトキシ基、 2—メチルブトキシ基、 1， 2—ジメチルプロボ キシ基、 へキシロキシ基、 イソへキシロキシ基等が挙げられる。
Ci _ 6アルコキシィミノ基とは、 炭素数 1〜 6の直鎖又は分枝鎖状のアルコキ シィミノ基を意味し、 具体的には、 例えば N-メトキシィミノ基、 N -エトキシイミ ノ基、 N-プロボキシィミノ基、 N-イソプロボキシィミノ基、 N-ブトキシィミノ基 、 N -イソブトキシィミノ基、 N-ペンチルォキシィミノ基、 N-へキシルォキシイミ ノ基等が挙げられる。
_ 6アルカノィルォキシ基とは、 炭素数 1〜 6の直鎖又は分枝鎖状のアル力 ノィルォキシ基を意味し、 具体的には、 例えばァセトキシ基、 プロピオ二ルォキ シ基、 ピバロィルォキシ基等が挙げられる。
C3 _ 1 Qシクロアルキル基とは、 炭素数 3〜10のシクロアルキル基を意味し、 具 体的には、 例えばシクロプロピル基、 シクロブチル基、 シクロペンチル基、 シク 口へキシル基、 シクロへプチル基、 シクロォクチル基、 シクロノニル基等が挙げ られる。
置換 C3 。シクロアルキル基の例としては、 シクロアルキル基の水素原子をハ ロゲン原子、 置換若しくは無置換の C 1 。アルキル基、 水酸基、 C卜 5ヒドロキ シアルキル基、 カルボキシル基、 メルカプト基、 インドリル基、 〇ト5アルキル チォ基、 アミノ基、 アミド基及び アルコキシ基からなる群より選ばれる 1 つ以上の基で置換されたシクロアルキル基を挙げることができる。
ァリール基の例としては、 フエニル基、 ナフチル基、 アントラセン基等を挙げ ることができる。 TJP03/04884 置換ァリール基の例としては、 ァリール基の水素原子をハロゲン原子、 置換若 しくは無置換の C1 。アルキル基、 水酸基、 CHヒドロキシアルキル基、 カル ボキシル基、 メルカプト基、 インダゾリル基、 インドリル基、 （^-5アルキルチ ォ基、 シァノ基、 ニトロ基、 アミノ基、 アミド基、 ァセチルァミノ基及び〇卜5 アルコキシ基からなる群より選ばれる 1つ以上の基で置換されたァリール基を挙 げることができる。
c2 。ヘテロ環の例としては、 フラン、 ピロ一ル、 チォフェン、 ォキサゾール
、 イソォキサゾール、 チアゾール、 イミダゾール、 ピラゾール、 ピラン、 ピリジ ン、 ピぺリジン、 ピリダジン、 ピリミジン、 ピラジン、 キノリン等を挙げること ができる。
置換 C2 。ヘテロ環の例としては、 ヘテロ環の水素原子をハロゲン原子、 置換 若しくは無置換の C1 。アルキル基、 水酸基、 C!-sヒドロキシアルキル基、 力 ルポキシル基、 メルカプト基、 インダゾリル基、 インドリル基、 5アルキル チォ基、 シァノ基、 ニトロ基、 アミノ基、 アミド基、 ァセチルァミノ基及び c,_
5アルコキシ基からなる群より選ばれる 1つ以上の基で置換されたへテロ環を挙 げることができる。
エーテル結合とは、 一〇一、 式 - (C¾)m- 0- (CH2)n - (式中、 m及び nはそれぞ れ 1〜 3の整数を表し、 式中のアルキレン基はアルキル基で置換されていてもよ い。 ） 又は、 式- 0- (CH2) 0- (式中、 mは 1〜3の整数を表し、 式中のアルキレ ン基はアルキル基で置換されていてもよい。 ） を意味する。
パイ結合又はエーテル結合を形成する隣り合う基の組み合わせとしては、 （ R 4と R5) 、 （R5と R6) 、 （R6と R7) 、 （R7と R8) 及び （R8と R9) を挙げ ることができる （式 （EC における R4a〜R9aも同様） 。
式 （K) で表される化合物の中でより好ましくは式 （I) で表される化合物であ り、 更に好ましくは R3 aが水素原子であり、 R3bは水酸基である化合物である。 また、 化合物の安定性の点から、 式（IIa)、 式（IIb)、 式 （lie) で表される化 合物が好ましい。 [式 (II) において （R4と R5) 及び （R6と R7) がパイ結合を形成する化合物]
Figure imgf000011_0001
(式中、 R R2、 R3e、 R3d、 R8、 R9及び Xは前記と同意義である。 ）
[式 （Π) において （R4と R5) がパイ結合を形成し、 ； 6及び R7は水素原子を である化合物]
Figure imgf000011_0002
(式中、 R R2、 R3c, R3d、 R8、 R9及び Xは前記と同意義である。 ） [式（II)において、 R4、 R5、 R6及び R7が水素原子である化合物]
Figure imgf000011_0003
(式中、 R R2、 R3e、 R3d、 Rs、 R9及び Xは前記と同意義である。 ） また、 式 （K) で表される化合物のうち R3eと R6bがー緒になってエーテル結 合を形成し、 （R3f と R4a) 及び （R と RSa) がパイ結合を形成する化合物 （ 例えば化合物 77など） は、 毛乳頭細胞における而 T- 5A mRNAの発現を効果的に抑 制し、 毛乳頭細胞の増殖を促進する点で好ましい。
また、 式 （K) で表される化合物のうち Rla、 R2aが、 （CH2) pCO— Y— R10 (式中、 Yは酸素原子又は硫黄原子を示し、 Rlfl は水素原子、 （： 6アルキ ル基又は置換若しくは無置換のァリ一ル基を示し、 pは 0又は 1を示す。 ） で表 される基である化合物 （例えば化合物 52など） や COR12 (式中、 R12 は置換 若しくは無置換のァリール基又は置換若しくは無置換のへテロ環を示す。 ) で表 される基である化合物 （例えば化合物 58など） は、 毛乳頭細胞における WNT- 5A m RNAの発現を効果的に抑制し、 毛乳頭細胞の増殖を促進する点で好ましい。
また、 R7aが Z—R13 (式中、 Zは酸素原子又は硫黄原子を示し、 R13 は C2 _6アルカノィル基又は置換若しくは無置換のァリール基を示す。 ） で表される基 である化合物 （例えば化合物 53など） は、 毛乳頭細胞における WNT- 5A mRNAの発 現を効果的に抑制し、 毛乳頭細胞の増殖を促進する点で好ましい。
式 （II) で表される化合物は、 例えば、 以下の製法を組み合わせることにより 製造することができる。
Figure imgf000013_0001
+
Figure imgf000013_0002
(式中、 R R2、 R3 c , R3 d、 R8、 R9及び Xは前記と同意義である。 ） 式 （I I I) の化合物をパラジウム炭素などの触媒存在下、 有機溶媒 （例えば、 酢酸ェチル、 テトラヒドロフラン、 ジェチルエーテル、 エチルアルコール、 メチ ルアルコールなど） 中、 水素添加反応を行い、 式 （IV) 若しくは式 （IV' ) の化 合物、 あるいはこれらの混合物を得る。 これらの式 （IV) 及び式 （IV' ) の化合 物は力ラムクロマトグラフィーなど通常用いられる分離法にて分離精製すること ができる。
Figure imgf000015_0001
Ε S=
CD CD A
O CD
ェ—：r
Figure imgf000015_0002
^881-0/e0df/I3d t££9W£0 OAV (式中、 Rl、 R2、 R4、 R5、 R6、 R7、 R8、 R9及び Xは前記と同意義である 式 （V) の化合物を水素化ホウ素カリウム、 水素化ホウ素ナトリウム、 水素化ホ ゥ素リチウムなどの還元剤と、 必要に応じて LiCl、 MgCl2、 CeCI3、 CaCl2、 NiCl 等の塩類の共存下有機溶媒 （例えば、 テトラヒドロフラン、 ジェチルェ一テル、 エチルアルコール、 メチルアルコールなど） 中、 _20〜100° (：、 好ましくは 0〜20 °Cで反応させ、 式 （VI) の化合物を得る。 式 （VI) の化合物はカラムクロマトグ ラフィーなど通常用いられる分離法にて分離精製することができる。
91
Figure imgf000017_0001
88 0/£0dt/∑Jd ι?εε98θ/εο Ο/Α (式中、 R R2、 R3 c、 R3 d、 R4、 R5、 R6、 R7及び Xは前記と同意義であ る。 ）
式 （VI I) の化合物を適当な有機溶媒 （例えば、 テトラヒドロフラン、 ジェチル エーテル、 エチルアルコール、 メチルアルコールなど） 中、 酸又は塩基で処理す ることにより、 式 （VI I I) の化合物を得る。 また、 式 （K) で表される化合物 （1， 60〜78) の生産は、 大略一般の発酵生 産物を生産する場合に準じ、 各種の栄養物を含む培地で
Pochonia chl amydosporia var. chlamydospor ia TF_0480teを好 的条件下（培 養することにより行う。
培地は主として液体培地を用い、 炭素源、 窒素源、 無機塩よりなり、 必要に応 じてビタミン類、 先駆物質及び消泡剤を加えることができ、 p Hは 7前後に調整 する。 炭素源としては、 例えばグルコース、 デキストリン、 グリセリン、 澱粉な どを単独又は混合して用いる。 窒素源としては、 例えば肉エキス、 オートミール 、 酵母エキス、 大豆粉、 ポリペプトン、 コーンスティ一プ'リカ一、 尿素、 アン モニゥム塩などを単独又は混合して用いる。 無機塩としては、 例えばリン酸一力 リウム、 硫酸マグネシウム、 塩化ナトリウム、 炭酸カルシウムなどを単独又は混 合して用いる。 消泡剤としてはアデ力ノール、 シリコン化合物を用いることがで きる。 培養方法は振とう培養、 通気撹拌培養などの好気的培養が適しており、 P H 4〜10、 25〜35°Cで 2〜5日間、 望ましくは 25〜28°Cで 3日間培養する。 この培養により生産された 1、 60〜78 を単離するには、 発酵生産物を採取す る一般的な方法に準じて行えばよい。 例えば次のような方法が効果的である。 す なわち、 培養終了後遠心分離又は濾過により培養濾液を得、 ダイヤイオン H P— 2 0 (商品名、 三菱化学社製） などのポリスチレン樹脂に吸着させた後、 低級ァ ルコール、 アセトンなどの有機溶媒で溶出させる。 菌体は低級アルコール、 ァセ トンなどの有機溶媒で抽出する。 次いでこの菌体抽出液及び吸着樹脂からの溶出 液を合わせて減圧濃縮し、 残った水層に酢酸ェチル、 クロ口ホルム、 n—プ夕ノ —ルなどの有機溶媒を加え抽出し、 抽出液を濃縮する。 得られた残渣を再度 ゼン、 酢酸ェチル、 アセトン、 メタノール、 クロ口ホルムなどの有機溶媒に溶解 し、 シリカゲルカラムクロマトグラフィー、 ゲル濾過カルムクロマトグラフィー 及び逆層分配用〇 D Sを充填したカラムクロマトグラフィ一及び高速液体ク口マ トグラフィーを行うことにより本発明化合物を精製単離することができる。
本発明の有効成分を生産する菌株は、 本発明者らが土壌から新たに分離した菌 株であり、 微生物の名称 「ポコニァ クラミドスポリア バラエティー クラミ ドスポリア TF-0480 (Pochonia chlamydospor ia var. chl amydosporia TF-048
0) 」 及び微生物寄託番号 「FERM BP_8332 」 として， 独立行政法人産業技術総 合研究所特許生物寄託センタ一 （日本国茨城県つくば巿東 1丁目 1番地 1中央第 6 ) に 2003年 3月 14日に寄託されている。
この菌株の菌学的性状を以下に示す。
1 ) 培地上での生育状態
本菌は、 各種寒天平板培地上で良好な生育を示し、 試験した培地上で良好又は 中程度に胞子を形成する。 各種培地上、 26°C、 2週間で形成したコロニーの特徴 を次の表 1に示した。 なお色の表示は、 A. Kornerupら著 『Diz ionario dei color i』 Mus terschmidt (1978年）のカラーコードを引用した。
Figure imgf000020_0001
*-2： 1/2希釈オートミール寒天培地 (ディフコ社製、バクトオートミール寒天を 1 /2希釈で 調製し、最終寒天濃度が 2%になるように寒天を追加）
*- 3 :コーンミール寒天培地 (ディフコ社製、コーンミール寒天）
*- 4:麦芽エキス寒天培地（Nakase,丁.， 6th ed.， pp.617, Japan Collection of
Microorganisms, the Institute of Physical and Chemical Research, Saitama, 1995)
* - 5:サブロー寒天培地 (栄研化学㈱製、 E-MF03)
*- 6 :三浦寒天培地（Miura, K. and .Kudo.Trans. Mycol. Soc. Japan, 1 1 :116-118, 1970) 2) 形態
本菌がコーンミール寒天平板上、 26°C、 14日間の培養で形成したコロニ一を、 光学顕微鏡にて観察した結果、 分生子形成様式はフィァ口型であった。 分生子形 成細胞 （フィアライド） は菌糸上に直接単生又は 2〜 4個が輪生状に生じる、 分 生子柄は栄養菌糸との区別が不明瞭であった。 分生子はフィアラィドの先端で複 数個形成され、 粘塊状となる。 フィアライドは先端部分が先細りの円筒形で、 表 面は平滑、 無色、 長さは 13— 35^ m、 太さは基部で 0.8— 1.7^ m、 先端付近で は 0.5— 0.8 mである。 分生子は、 楕円形から、 まれに亜球形で、 多くは基部が わずかに突出する。 表面は平滑、 無色、 大きさは 2.2— 5.0X1.8— 2.8^ mであ る。 また、 培地表面や培地上の菌糸から生じた短い柄の先端に淡黄色、 多細胞、 網状隔壁を有する厚膜胞子 （デイクティオクラミドスポア） を単生する。 わずか ではあるが厚膜胞子は培地中でも形成される。 厚膜胞子の大きさは、 14-20X12 一 22 mである。 なお、 培養を 1力月以上延長してもテレオモルフの形態は認め られなかった。
3) 生理的性質
①生育温度範囲及び最適温度
本菌株は PH6.0のサブ口一液体培地において、 15〜31°Cの範囲で生育し、 最 適温度は 25〜27°Cである。
②生育 P H範囲及び最適 p H
本菌株は YpSs液体培地中 26°Cにおいて ρΗ3〜10の範囲で生育し、 最適 pH は 5〜7である。
4) 好気性、 嫌気性の区別 ； 好気性
上記の形態的特徴及び培養上の性状から、 ① K.H.Domschら著 『 Compendium o f soil fungi Vol.1 』 IHW_Verlag (1980年） 、 及び② G.L.Barron著『 The Gen era of Hyphoomyceies from soil J Williams & Wilkins (1968年） 等に記載さ れた多くの既知種と本菌の特徴を比較検討した結果、 Verticillium chlamydospo riaや Diheterospora chlamydosporiaの分類名称で知られる不完全菌のー菌種と 極めて良く一致しており、 同一種であることが示唆された。 なお、 本菌種は、 ③ R. Zare, W. Gams and H. C.Evans 『 A revision of Verticil Hum section Pros trata. V. The genus Pochonia, with notes on Rotiferophthora』 73，ト 2,p51 -86 (2001年） により分子系統学的な再検討が行われ、 Pochonia属を正式属名と して再記載されており、 さらに本菌のように Vert ici 11 ium型分生子が連鎖しない 菌種に対し、 Pochonia chlamydosporia var. chlamydosporiaなる変種名が提 されている。
以上のことから、 本菌株を 「ポコニァ クラミドスポリア バラエティ一 ク ラミドスポリア TF-0480 (Pochonia chlamydosporia var. chlamydosporia TF -0480) J と命名した。 ぐ毛乳頭細胞増殖促進剤 >
本発明において 「毛乳頭細胞増殖促進剤」 とは、 毛乳頭細胞の数を増加させる 作用を有する医薬又は試薬を意味する。
本発明の毛乳頭細胞増殖促進剤は、 WNT— 5A機能の阻害作用に基づくことを特 徵とする。 WNT-5Aは、 丽 T/)3- catenin経路が活性化する丽 T- 1 classの WNTs(l、 8 など）の機能を抑制することから、 颗 T-5Aの機能の調整あるいは丽 T-5Aの発現を 調整することにより毛乳頭細胞の増殖を制御する。 したがって、 優れた WNT— 5A 機能の阻害作用を有すれば、 全く構造の異なる化合物 （例えば、 化合物 24、 化合 物 79、 化合物 7など） であっても、 優れた毛乳頭細胞増殖促進作用を有する。
物 24
化合物 79
Figure imgf000022_0001
化合物 7
Figure imgf000023_0001
細胞の増殖は、 当業者に公知の方法により測定することが可能であり、 例えば 適当な発色基質を用いた生細胞数計測、 [3H] -チミジン取り込み法等を挙げるこ とができる。 発色基質としては、 MTT、 MTS、 XTT等のテトラゾリゥム塩やアラマ 一ブル一を用いることが好ましい。
<発毛剤 Ζ育毛剤 >
本発明において 「発毛剤又は育毛剤」 とは、 発毛誘導、 毛成長促進、 脱毛予防 などの目的で使用されるものである。 本発明の発毛剤ノ育毛剤を医薬として用い る場合、 適用対象としては、 例えば円形脱毛症や男性型脱毛症の改善あるいは予 防などを挙げることができる。
また、 本発明の発毛剤/育毛剤の効果は、 WNT-5A機能の抑制に基づく毛乳頭細 胞増殖促進作用によるものである。 かかる作用機序により脱毛部毛乳頭において 低下している細胞増殖能を亢進し、 発達した毛乳頭組織を形成するため、 これま での育毛剤 Ζ発毛剤では効果がえられなかった症状にも有効であることが予想さ れる。
さらに他の作用点を有する発毛剤、 育毛剤との組み合わせにより相乗的な効果 を期待できる。
本発明の発毛剤 Ζ育毛剤は、 それぞれの化合物に基づき、 種々の投与量及び投 与形態で投与することができる。
投与量は、 育毛剤の種類、 投与形態により異なるが、 例えば、 式 （Κ) で表さ れる化合物を塗布投与 （ローション剤、 軟膏剤、 ゲル剤等） する場合、 0. 0001 〜10重量％で投与することができ、 好ましくは 0. 001〜5重量％、 更に好ましく は 0. 001〜1重量％である。 また、 式 （Κ) で表される化合物を成人男性に経口 投与 （散剤、 錠剤又はカプセル剤） する場合は、 l〜100mgZkgZ日とすること が好ましい。 本発明の発毛剤 z育毛剤の投与形態は特に限定されるものではないが、 外用で の使用では、 颗 T— 5A産生抑制剤、 例えば式 (IX) で表される化合物、 を有効成 分とする発毛剤ノ育毛剤は、 水溶性組成物の形態で提供されることが好ましい。 このような水溶性組成物の製造には、 本発明の効果を損なわない限り医薬品、 医 薬部外品又は化粧品の製造に用いられる各種の添加物 （保湿剤、 増粘剤、 防腐剤 、 酸化防止剤、 香料、 色剤等） を配合することができる。 本発明の発毛剤 Z育毛 剤は、 例えばへアトニック、 ヘアオイル、 ヘアムース、 ゲルなどの調髪用組成物 、 軟膏などとして提供することが可能である。
本発明の発毛剤及び育毛剤を液剤とする場合には、 爾 T一 5A産生抑制剤、 例え ば式 （IX) で表される化合物、 を精製水、 リン酸緩衝液等の適当な緩衝液、 生理 的食塩水、 リンガー溶液、 ロック溶液等の生理的塩類溶液、 エタノール、 グリセ リン及び慣用される界面活性剤等と適当に組み合わせた滅菌された水溶液、 非水 溶液、 懸濁液、 リボソーム又はェマルジヨンとして調製され、 頭皮用液状製剤と して局所的に投与される。 またその際、 液状製剤を直接頭皮に塗布してもよく、 スプレー等の射出ノズルを用いて塗布してもよい。
本発明の発毛剤及び育毛剤を半固形製剤とする場合には、 WNT— 5A産生抑制剤 、 例えば式 (K) で表される化合物を脂肪、 脂肪油、 ラノリン、 ワセリン、 パラ フィン、 蠟、 硬膏剤、 樹脂、 プラスチック、 グリコール類、 高級アルコール、 グ リセリン、 7K、 乳化剤、 縣濁化剤等と混和して軟膏、 クリーム等の外用として局 所投与できる。
本発明の発毛剤及び育毛剤を固形製剤とする場合には、 WNT一 5 Α産生抑制剤、 例えば式 (IX) で表される化合物、 を適当な添加剤と適宜混合して、 散剤、 粉剤 等の外用剤として、 又は、 溶剤に用時溶解又は懸濁して頭皮に塗布するための固 形製剤としてもよい。
また、 経口での使用する場合には、 颗 T— 5A産生抑制剤、 例えば式 (K) で表 される化合物、 を製剤上許容しうる担体 （賦形剤、 結合剤、 崩壌剤、 矯味剤、 矯 臭剤、 乳化剤など） 、 希釈剤、 溶解補助剤などと配合して得られる医薬組成物を 通常の方法に従って製剤して得られる錠剤、 カプセル剤、 顆粒剤、 散剤、 シロッ プ剤、 懸濁剤、 溶液剤などの形態で提供されることが望ましい。
なお、 これらの製剤化は、 通常の製剤化技術を使用することができる くスクリーニング方法 >
本発明はまた、 颗 T— 5Aの機能を阻害する化合物を選択することを特徴とする 、 毛乳頭細胞増殖促進剤のスクリーニング方法である。
WNT— 5Aの機能を阻害する化合物 （以下、 「颗 T一 5A機能阻害剤」 ということが ある。 ) を選択するとは、 例えば、 WNT— 5A産生抑制剤を選択、 即ちスクリー二 ングすることでもよく、 また、 WNT— 5A受容体アン夕ゴニストを選択することで もよい。
本発明のスクリーニング方法に供される被検物質としては、 任意の物質を使用 することができる。 被検物質の種類は特に限定されず、 個々の低分子化合物でよ いし、 天然物抽出物中に存在する化合物でもよく、 合成ペプチドでもよい。 また 、 化合物ライブラリー、 コンビナトリアルライブラリ一であってもよい。 化合物 ライブラリ一の構築は当業者に公知であり、 また市販の化合物ライブラリーを使 用することもできる。 スクリーニングの対象とする化合物は、 医薬品として用い る観点から分子量 3000以下であることが好ましく、 塗布ノ経口投与を可能とする 観点から、 分子量 600以下の低分子ィヒ合物であることが好ましい。
① WNT— 5 A受容体アンタゴニストのスクリーニング方法
蘭 T一 5 A受容体アンタゴニストのスクリーニング方法において、 標識した丽 T- 5 A蛋白質及 tXWNT— 5A受容体を用いて、 該標識を検出又は測定することにより、 丽 T - 5A蛋白質と冊 T— 5A受容体の結合の形成の有無を調べてもよい。 標識としては 、 放射性同位元素 （32 P、 33 P、 131 1、 125 1、 3H、 14C、 35 S等） 、 酵素 （ アルカリフォスファタ一ゼ、 ホースラデイシュパーォキシ夕ーゼ等） 、 蛍光物質
(フルォロセィンィソチオシァネ一ト等) 等を挙げることができる。 これらは市 販のものを入手することができ、 公知の方法によって標識される。
in vi troのアツセィ系の 1つの具体例は、 非細胞系において行われる。 具体的 には WNT-5A蛋白質又は颗 T一 5A受容体のいずれか一方を支持体に結合させ、 ここ にもう一方と被検物質を加え、 インキュベートした後洗浄して支持体に結合した 蛋白質に対するもう一方の蛋白質の結合を検出又は測定すればよい。 蛋白質を結合させる支持体としては、 例えば不溶性の多糖類、 例えば、 ァガロ ース、 デキストラン、 セルロース、 合成樹脂、 例えばポリスチレン、 ポリアクリ ルアミド、 シリコン等が挙げられる。 より具体的にはそれらを原料として製造さ れる市販のビーズ、 プレートが用いられる。
② WNT— 5 A産生抑制化合物のスクリ一ニング方法
冊 T一 5A産生抑制化合物のスクリーニングは、 WNT— 5A mRNA量又は WNT-5A蛋白 質量を指標として行うことができる。 また、 WNT— 5A遺伝子のプロモー夕一領域 にレポーター遺伝子を連結して発現量を検出することもできる。 WNT— 5A遺伝子 のプロモ一夕一としては、 配列番号 3を使用することが好ましい。
レポ一夕一遺伝子としては、 例えば、 GFP遺伝子 （Green Fluorescent Protein ) 、 GUS遺伝子 ( i3 -Glucuronidase) 、 LUC遺伝子 (Luc i f erase) 、 CAT (Chloram phenicol acetyl trans ferase) 遺伝子 を挙げることができる。
丽 T一 5A mRNA量を指標とした場合としては、 例えば、 ヒト丽 T一 5A発現細胞を 用い、 被検物質を添加し、 37°C、 5 %C02— 95 %airのインキュベータ内で数時間 培養後、 細胞を溶解して RNAを抽出し、 RT— PCRなどを用いて丽 T一 5A mRNA量を測 定することにより、 颗 T一 5A mRNA量を減少させる活性を有する物質を探索するこ とができる。 PCRに用いるプライマーとしては、 WNT— 5A mRNAに特異的なもので あれば特に制限はなく、 醫 T_ 5A mRNAの配列から設計することができるが、 好ま しくは、 Forward Primer AATGTCTTCCAAGTTCTTCCTAGTGGC (配列番号 8 ) 及び Rev erse Pr imer GATGTCGGAATTGATACTGGCA (配列番号 9 ) である。
丽 T一 5A蛋白質量を指標とした場合としては、 例えば、 ヒト WNT— 5A発現細胞 を用い、 被検物質を添加し、 37°C、 5 %C02— 95%airのインキュベータ内で数時 間培養後、 培養培地を用いて又は細胞を溶解して蛋白質を抽出し、 ELISA (enzym e-1 inked immunosorbent assay) 等を用いて WNT— 5A蛋白質量を測定することに より、 WNT— 5A蛋白質発現量を減少させる活性を有する物質を探索することがで さる。 以下、 実験例に基づき本発明を更に説明するが、 本発明はこれらにより何ら限 定されるものではない。
実施例 1 (化合物 3、 4 )
ラデイシコール (化合物 1 ： 10. 8g)を酢酸ェチル（140ml)に溶解し、 5 %パラジ ゥム炭素 （ウエットタイプ） （255mg)を加え、 水素置換 （1気圧） し室温で 3時 間撹拌した。 パラジウム炭素を濾過後、 濾液を減圧留去した。 得られた残渣をシ リカゲルクロマトグラフィ一にて精製し、 n-へキサン：酢酸ェチル = 2 ： 1で溶 出させることで、 目的化合物 4 (3. 43g)を得、 n -へキサン：酢酸ェチル = 3 ： 2 で溶出させることで、 目的化合物 3 (4. 14g)を得た。 実施例 2 (化合物 7、 8 )
化合物 3 (602. 5mg)をメタノール（13ml)に溶解し、 塩化セリウム (I I I) 7水和 物 (2. 14g)を加え、 室温で 30分間撹拌した。 この溶液に水素化ホウ素ナトリウム（ 180mg)を氷冷しながら徐々に加えた後、 室温で 5分間撹拌した。 反応液に飽和リ ン酸水素ニナトリゥム (40ml)を加え水 (40ml)で希釈した後、 有機溶媒を減圧留去 した。 残った水層を酢酸ェチル (300ml X 2)で抽出し、 得られた酢酸ェチル層を無 水硫酸ナトリウムで乾燥後、 酢酸ェチルを減圧留去した。 残渣をシリカゲル分取 薄層クロマトグラフィー （20cmX 20cm， 1. 0腿厚、 クロ口ホルム：メタノール =9 3： 7で展開、 酢酸ェチルで溶出） により粗精製した。 得られた粗精製物を高速 液体クロマトグラフィー （20 ψ Χ 250ΐΜ, YMC-Pack Pro C18， 水 （酢酸添加、 pH3 . 5) ：ァセトニトリル =65： 35で溶出） により精製し、 目的化合物 （化合物 7 : 1 44. 9mg 化合物 8 ： 13. 8mg) を得た。 実施例 3 (化合物 9，10)
化合物 4 (26. 5mg)をメタノール（5ml)に溶解し、 塩化セリウム （I I I) 7水和物 (l OOmg)を加え、 室温で 30分間撹拌した。 この溶液に水素化ホウ素ナトリウム（60 mg)を氷冷しながら徐々に加えた後、 室温で 30分間撹拌した。 反応液に飽和リン 酸水素ニナトリウム（12ml)を加え水 (20ml)で希釈した後、 有機溶媒を減圧留去し た。 残った水層を酢酸ェチル（30ml X 2)で抽出し、 得られた酢酸ェチル層を無水 硫酸ナトリウムで乾燥後、 酢酸ェチルを減圧留去した。 残渣をシリカゲル分取薄 層クロマトグラフィ一 （20cmX 20cm, 0. 25mm厚、 クロ口ホルム：メタノール = 94 ： 6で展開、 酢酸ェチルで溶出） により精製し、 目的化合物 （化合物 9 ： 5. 7mg 、 化合物 10： 8. 8mg) を得た。 実施例 4 (化合物 5 )
ラデイシコール（91. 5mg)をメタノール（5ml)に溶解し、 塩化セリウム （I I I) 7 水和物（88mg)を加え、 室温で 10分間撹拌した。 この溶液に水素化ホウ素ナトリウ ム（60mg)を氷冷しながら徐々に加えた後、 室温で 30分間撹拌した。 反応液に飽和 リン酸水素ニナトリゥム（20ml)を加え水 (20ml)で希釈した後、 有機溶媒を減圧留 去した。 残った水層を酢酸ェチル (50ml X 3)で抽出し、 得られた酢酸ェチル層を 無水硫酸ナトリウムで乾燥後、 酢酸ェチルを減圧留去した。 残渣をシリカゲル分 取薄層クロマトグラフィー （20cmX 20cm， 0. 5mm厚、 クロ口ホルム：メタノール = 9 ： 1で展開、 酢酸ェチルで溶出） により精製し、 目的化合物 5 (27. 2mg)を得 た。 実施例 5 (化合物 2 )
ラディシコール（15. 3mg)をピリジン（1. 5ml)に溶解し、 無水酢酸（4ml)を加え室 温で 6. 5時間撹拌した後、 反応液に氷水（20ml)を加え酢酸ェチル（20ml)で抽出し た。 酢酸ェチル層を水 (20ml X 2)で洗浄し、 無水硫酸ナトリウムで乾燥後、 酢酸 ェチルを減圧留去した。 得られた残渣をシリカゲル分取薄層クロマトグラフィー (20cmX 20cm, 0. 5匪厚、 クロ口ホルム：メタノール =95： 5で展開、 酢酸ェチ ルで溶出） により精製し、 目的化合物 2 (18. 5mg)を得た。 実施例 6 (化合物 11)
ラディシコ一ル a9. Omg)をジメチルスルホキシド（1ml)に溶解し、 炭酸力リゥ ム（3mg)とヨウ化メチル (4ml)を加え室温で 6. 5時間撹拌した。 反応液に水（20ml) を加え酢酸ェチル（20ml)で抽出し、 酢酸ェチル層を無水硫酸ナ卜リゥムで乾燥後 、 酢酸ェチルを減圧留去した。 得られた残渣をシリカゲル分取薄層クロマトダラ フィー （20cmX 20cm， 0. 5mm厚、 クロ口ホルム：メタノール =95： 5で展開、 酢 酸ェチルで溶出） により精製し、 目的化合物 11 (15. 3mg)を得た。 実施例 7 (化合物 16、 17、 19、 23)
ラディシコール（930mg)を 1， 4-ジォキサン（14ml)に溶解し、 1規定塩酸（12ml) を加え室温で 2時間撹拌した後、 水 (40ml)で希釈し酢酸ェチル（100ml)で抽出し た。 酢酸ェチルを無水硫酸ナトリウムで乾燥後、 酢酸ェチルを減圧留去した。 得 られた残渣をシリカゲル分取薄層クロマトグラフィー （20cmX 20cm， 1. 0腿厚、 クロ口ホルム：メタノール： n-へキサン = 5 ： 1 ： 5で展開、 酢酸ェチルで溶出 ) により粗精製した。 得られた粗精製物を高速液体クロマトグラフィー （20 Φ Χ 250腿， YMC-Pack Pro C18, 水 （酢酸添加、 H3. 5) ：ァセトニトリル = 70： 30〜4 0 : 60、 グラジェントで溶出） により精製し、 目的化合物 （化合物 16： 11. 4mg、 化合物 17： 19. 4mg、 化合物 19： 32. 6mg、 化合物 23： 103. 7mg) を得た。 実施例 8 (化合物 12、 13)
ラディシコール（232. 6mg)を 1， 4-ジォキサン（4ml)に溶解し、 1規定塩酸（lml) を加え室温で 30分間撹拌した後、 1規定水酸ィ匕ナトリウムで中和した。 溶媒を減 圧濃縮後メ夕ノールを 20ml加えて溶解させ、 綿栓濾過後メ夕ノ一ルを減圧留去し た。 得られた残渣を高速液体クロマトグラフィー （20 φ Χ 250ιηιη, YMC-Pack Pro C18, 水 （酢酸添加、 PH3. 5)：ァセトニトリル = 65： 35で溶出） により精製し、 目的化合物 （化合物 12： 42. 6mg、 化合物 13： 10. 4mg) を得た。 実施例 9 (化合物 18)
5 mlのジメチルホルムアミドに 1 m 1のォキシ塩化リンを氷冷しながら滴下した 後、 室温で 30分間撹拌した。 この溶液をラデイシコール（98. 5mg)のジメチルホル ムアミド溶液 (4ml)に氷冷しながら徐々に加えた後、 室温で 24時間撹拌した。 反 応液を酢酸ェチル（100ml)で希釈した後、 水（100ml X 3)で洗浄し、 酢酸ェチル層 を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、 酢酸ェチルを減圧留去した。 得られた残渣をシ リカゲル分取薄層クロマトグラフィー （20cmX 20cm， 0. 5廳厚、 クロ口ホルム： メタノール =94 : 6で展開、 酢酸ェチルで溶出） により精製し、 目的化合物 （ィ匕 合物 18) (61. 8mg)を得た。 実施例 10 (化合物 14、 15)
ラデイシコール（378mg)を 1, 4-ジォキサン（4ml)に溶解し、 1規定塩酸（1ml)を 加え室温で 20分間撹拌した後、 1規定水酸化ナトリウムで中和した。 溶媒を減圧 濃縮後メ夕ノールを 20ml加えて溶解させ、 綿栓濾過後メ夕ノ一ルを減圧留去した 。 得られた残渣を高速液体クロマトグラフィー （20 φ Χ 250πιιη, YMC-Pack Pro CI 8, 水 （酢酸添加、 PH3. 5) ：ァセトニトリル =70： 30で溶出） により精製し、 目 的化合物 （化合物 14： 10. 7mg、 化合物 15： 9. 9mg) を得、 同時に化合物 12 (40. 6mg )も得られた。 実施例 H (化合物 20、 21、 22)
化合物 3 (96. 3mg)を 1, 4 -ジォキサン（2ml)に溶解し、 1規定塩酸（2. 5ml)を加え 室温で 16時間撹拌した後、 1規定水酸化ナトリウムで中和した。 溶媒を減圧濃縮 後メタノールを 20ml加えて溶解させ、 綿栓濾過後メタノールを減圧留去した。 得 られた残渣を高速液体クロマトグラフィー （20 Φ Χ 250画， YMC-Pack Pro C18， 水 （酢酸添加、 PH3. 5) ：ァセトニトリル =45： 55で溶出） により精製し、 目的化 合物 (化合物 20： 9. 3mg、 化合物 21： 22. Orag, 化合物 22： 26. 2mg) を得た。 実施例 12 (化合物 25、 26)
化合物 7 (34mg)を N， N—ジメチルホルムアミド（2ml)に溶解し、 水酸化カリウム (3mg)とヨウ化メチル（500 1)を加え室温で 4. 5時間撹拌した。 反応液に水（20ml) を加え酢酸ェチル（20ml)で抽出し、 酢酸ェチル層を無水硫酸ナトリゥムで乾燥後 、 酢酸ェチルを減圧留去した。 得られた残渣を少量のアセトンに溶解し、 ァセト 二トリル一水（p H3. 5、 酢酸） (38： 62) を移動層とした分取高速液体クロマト グラフィー [カラム： YMC- Pack Pro C18 AS- 343 (20 φ X 250mm) 、 検出 UV吸 収 254n m、 流速 10ml/min] にて精製し、 2つの画分を分取し各画分を減圧濃縮 して、 化合物 25 (6. 4mg， 39min)、 化合物 26 (14. 5mg， 29min)を得た。 実施例 13 (化合物 27)
化合物 7 (55mg)をピリジン（1 ml)に溶解し、 無水酢酸（3 ml)を加えた後、 室温で 1 7時間撹拌した。 反応液に水 (50ml)を加え酢酸ェチル（50ml)で抽出した。 酢酸ェ チル層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、 酢酸ェチルを減圧留去した。 得られた残 渣を少量のアセトンに溶解し、 ァセトニトリル一水（P H3. 5、 酢酸） (60： 40) を移動層とした分取高速液体クロマトグラフィー [カラム： YMC_Pack Pro C18 AS-343 (20 Χ 250mm) 、 検出 UV吸収 254n m、 流速 10ml/min] にて精製し 、 得られた画分を減圧濃縮して、 化合物 27 (64. 7mg， 18min)を得た。 実施例 14 (化合物 28、 29)
化合物 8 (131nig)を N， N—ジメチルホルムアミド（2ml)に溶解し、 水酸化力リウ ム（3mg)とヨウ化メチル (2ml)を加え室温で Ί時間撹拌した。 反応液に水 (40ml)を 加え酢酸ェチル (40ml)で抽出し、 酢酸ェチル層を無水硫酸ナトリゥムで乾燥後、 酢酸ェチルを減圧留去した。 得られた残潦を少量のアセトンに溶解し、 ァセトニ トリル一水（ρ Η3· 5、 酢酸） (38： 62) を移動層とした分取高速液体クロマトグ ラフィー [カラム： YMC - Pack Pro C18 AS-343 (20 φ X 250mm) 、 検出 UV吸 収 254 n m、 流速 10ml/min] にて精製し、 2つの画分を分取し各画分を減圧濃縮 して、 化合物 28 (14. 2mg, 52min)、 化合物 29 (31. 7mg, 37min)を得た。 実施例 15 (化合物 30)
化合物 8 (72mg)をピリジン（2ml)に溶解し、 無水酢酸（2ml)を加えた後、 室温で 1 7時間撹拌した。 反応液に水（50ml)を加え酢酸ェチル（50ml)で抽出した。 酢酸ェ チル層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、 酢酸ェチルを減圧留去した。 得られた残 渣を少量のアセトンに溶解し、 ァセトニトリル一水（ρ Η3· 5、 酢酸） （53 : 47) を移動層とした分取高速液体クロマトグラフィー [カラム： YMC- Pack Pro CI 8 AS-343 (20 φ Χ 250mm) 、 検出 UV吸収 254n m、 流速 lOml/min] にて精製し 、 得られた画分を減圧濃縮して、 化合物 30 (45. 5mg, 30min)を得た。 実施例 16 (化合物 31) ラデイシコール（10.8g)を酢酸ェチル（140ml)に溶解し、 5%パラジウム炭素 （ゥェ ットタイプ） （255mg)を加え、 水素置換 （1気圧） し室温で 3時間撹拌した。 パ ラジウム炭素を濾過後、 濾液を減圧濃縮した。 得られた残渣をシリカゲルクロマ トグラフィ一 [Silica Gel 60 (商品名、 Merck社製） ] にて精製し、 n—へキサ ン：酢酸ェチル （2 : 1) で溶出させることで、 化合物 4(3.43g)を得、 また n— へキサン：酢酸ェチル （3 : 2) で溶出させることで、 化合物 3(4. g)を得た。 化合物 3と化合物 4の間の画分（3.08g)の一部（500mg)を少量の N， N—ジメチルホ ルムアミドに溶解し、 ァセトニトリル—水（pH3.5、 酢酸） (38： 62) を移動層 とした分取高速液体クロマトグラフィー [カラム： YMC- Pack Pro C18 AS-343 (20 φ X 250mm) 、 検出 UV吸収 254nm、 流速 lOml/min] にて精製し、 2つの 画分を分取し各画分を減圧濃縮して、 化合物 3 (177.8mg)とともに化合物 31 (20.7m g, 23m in)を得た。 実施例 17 (化合物 32, 33， 34)
ラデイシコール（11.9g)を酢酸ェチル a60ml)に溶解し、 5%パラジウム炭素 （ゥェ ットタイプ） （300mg)を加え、 水素置換 （1気圧） し室温で 3時間撹拌した。 ノ ラジウム炭素を濾過後、 濾液を減圧濃縮した。 得られた残渣をシリカゲルクロマ トグラフィー [Silica Gel 60 (商品名、 Merck社製） ] にて精製し、 n—へキサ ン：酢酸ェチル （2 : 1) で化合物 4を溶出させ、 n—へキサン：酢酸ェチル （ 3 : 2) で化合物 3を溶出させた。 さらに n—へキサン：酢酸ェチル （1 : 1) で溶出した画分を減圧濃縮し、 粗精製物 (936mg)を得た。 得られた粗精製物を少 量のアセトンに溶解し、 、 ァセトニトリル—水（pH3.5、 酢酸） （34 : 66) を移 動層とした分取高速液体クロマトグラフィー [カラム： YMC-Pack Pro C18 AS-34 3 (20 Χ 250mm) 、 検出 UV吸収 254nm、 流速 10ml/min] にて精製し、 3つ の画分を分取し各画分を減圧濃縮して、 化合物 32(17. ½ig， 17min)、 化合物 33 (49 .4mg, 18min)及び化合物 34(347.4mg, 21min)を得た。 実施例 18 (化合物 35)
ラディシコール（210mg)をピリジン（4ml)に溶解し、 室温でヒドロキシルアミン塩 酸塩 a80mg)を加えた後、 40°Cに昇温し 2. 5時間撹拌した。 室温に戻した後、 水 a 00ml)を加え酢酸ェチル（80ml)で抽出した。 酢酸ェチル層を無水硫酸ナトリ ゥムで乾燥後、 酢酸ェチルを減圧留去した。 得られた残渣を分取薄層クロマトグ ラフィー [Silica Gel 60 F254 (商品名、 Merck社製） 、 厚さ 0.5imn] にてクロ口 ホルム一メタノール （90 : 10) を展開溶媒として精製し、 Rf値が 0.65の部分を回 収して酢酸ェチルで抽出、 減圧濃縮して化合物 35 (40. Omg)を得た。 実施例 19 (化合物 36, 37, 38, 39)
ラデイシコール（11.9g)を酢酸ェチル a60ml)に溶解し、 5%パラジウム炭素 （ゥェ ットタイプ） （300mg)を加え、 水素置換 （1気圧） し室温で 3時間撹拌した。 パ ラジウム炭素を濾過後、 濾液を減圧濃縮した。 得られた残渣をシリカゲルクロマ トグラフィー [Silica Gel 60 (商品名、 Merck社製） ] にて精製し、 n—へキサ ン：酢酸ェチル （2 ： 1) で溶出した画分を減圧濃縮し、 化合物 4を主成分とす る画分（1537mg)を得た。 この画分をメタノ一ル（21ml) /テトラヒドロフラン（7ml) に溶解し、 塩ィ匕セリウム （ΙΠ) 7水和物（2130mg)を加え、 室温で 30分間撹拌した 。 この溶液に水素化ホウ素ナトリゥム（790mg)を氷冷しながら徐々に加えた後、 室温で 10分間撹拌した。 反応液を水 (30ml)で希釈した後 1規定塩酸水溶液を加え pHを中性にした後、 さらに水（30ml)で希釈する。 水層を酢酸ェチル（100mlx2) で抽出し、 得られた酢酸ェチル層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、 酢酸ェチルを 減圧留去し、 ガム状物質（1.46g)を得た。 得られた物質をクロ口ホルムーメタノ ール （4 : 1) の混合溶媒に溶解し、 n—へキサンで湿潤させて調製したシリカ ゲル [Silica Gel 60 (商品名、 Merck社製） ] のカラム （400ml) に吸着させた 。 η—へキサン一酢酸ェチルの混合溶媒で順次溶出し、 η—へキサン—酢酸ェチ ル （2 ： 1) で化合物 4を溶出させた後、 η—へキサン—酢酸ェチル （3 : 2) で溶出し、 画分 （1) (190mg) 、 画分 （2) (398mg)をそれぞれ減圧濃縮す ることで得た。 画分 （1) を少量のテトラヒドロフランで溶解し、 ァセトニト リル—水（pH3.5、 酢酸） (35： 65) を移動層とした分取高速液体クロマトダラ フィー [カラム： YMC- Pack Pro C18 AS- 343 (20 X 250mm) 、 検出 UV吸収 25 4nm、 流速 lOml/min] にて精製し、 3つの画分を分取し各画分を減圧濃縮して 、 化合物 9(87.2mg)とともに化合物 36(11.3mg， 20min)、 化合物 38 (10. lmg, 25min )を得た。 また画分 （2) を少量のテトラヒドロフランで溶解し、 画分 （1) と同条件で分取高速液体クロマトグラフィーにて精製し、 2つの画分を分取し各 画分を減圧濃縮して、 化合物 37(19.8mg, 25min)、 化合物 39 (23.2mg， 27m in)を得 た。 実施例 20 (化合物 40, 41)
化合物 7(61mg)を N, N—ジメチルホルムアミド（3ml)に溶解し、 水酸化カリウム (5rag)と 1一ブロモブタン（lml)を加え室温で 3.5時間撹拌した。 反応液に水（20ml )を加え酢酸ェチル（30ml)で抽出し、 酢酸ェチル層を無水硫酸ナ卜リゥムで乾燥 後、 酢酸ェチルを減圧留去した。 得られた残渣を少量のアセトンに溶解し、 ァセ トニトリル一水（pH3.5、 酢酸）を移動層として （60 : 40) 〜 （90 : 10) のダラ ジェントをかけ、 分取高速液体クロマトグラフィー [カラム： YMC- Pack Pro C18 AS - 343 (20 Χ 250mm) 、 検出 UV吸収 254nm、 流速 10ml/min] にて精製し 、 2つの画分を分取し各画分を減圧濃縮して、 化合物 40(25.6mg， 33iin), 化合 物 41(21.4mg， 40min)を得た。 実施例 21 (化合物 42, 43)
化合物 7(67mg)を N， N—ジメチルホルムアミド（3ml)に溶解し、 水酸化カリウム (5mg)と 1一プロモへキサン（lml)を加え室温で 3.5時間撹拌した。 反応液に水（20 ml)を加え酢酸ェチル（30ml)で抽出し、 酢酸ェチル層を無水硫酸ナトリゥムで乾 燥後、 酢酸ェチルを減圧留去した。 得られた残渣を少量のアセトンに溶解し、 ァ セトニトリル—水（ρΗ3·5、 酢酸）を移動層として （60 : 40) 〜 （90 : 10) のグ ラジェントをかけ、 分取高速液体クロマトグラフィー [カラム： YMC- Pack Pro C 18 AS- 343 (20 X 250mm) 、 検出 UV吸収 254nm、 流速 10ml/min] にて精製 し、 2つの画分を分取し各画分を減圧濃縮して、 化合物 42(24.9mg, 38min)、 化 合物 43 (32.9mg， 53min)を得た。 実施例 22 (化合物 44) 化合物 7(62mg)を N, N—ジメチルホルムアミド（3ml)に溶解し、 水酸化カリウム (5rag)と 1一ブロモプロパン（lml)を加え室温で 1.5時間撹拌した。 反応液に水（20 ml)を加え酢酸ェチル (30ml)で抽出し、 酢酸ェチル層を無水硫酸ナトリゥムで乾 燥後、 酢酸ェチルを減圧留去した。 得られた残渣を少量のアセトンに溶解し、 ァ セトニトリル一水（pH3.5、 酢酸）を移動層として （45 : 55) 〜 （85 : 15) のグ ラジェントをかけ、 分取高速液体クロマトグラフィー [カラム： YMC- Pack Pro C 18 AS-343 (20 φ X 250mm) 、 検出 UV吸収 254nm、 流速 lOml/min] にて精製 し、 得られた画分を減圧濃縮して、 化合物 44(45.3mg, 38min)を得た。 実施例 23 (化合物 45)
化合物 7(64mg)を N， N—ジメチルホルムアミド（3ml)に溶解し、 水酸化カリウム (5mg)と 2— （プロモメチル） シクロへキサン（2ml)を加え室温で 7時間撹拌した 。 反応液に水（20ml)を加え酢酸ェチル (30ml)で抽出し、 酢酸ェチル層を無水硫酸 ナトリウムで乾燥後、 酢酸ェチルを減圧留去した。 得られた残渣を少量のァセト ンに溶解し、 ァセトニトリル一水（pH3.5、 酢酸）を移動層として （65 : 35) 〜 (85： 15) のグラジェントをかけ、 分取高速液体クロマトグラフィー [カラム： YMC-Pack Pro C18 AS-343 (20 X 250mm) 、 検出 UV吸収 254nm、 流速 10ml/ min] にて精製し、 得られた画分を減圧濃縮して、 化合物 45 (24.7mg, 70min)を得 た。 実施例 24 (化合物 46)
化合物 7(200mg)を N, N—ジメチルホルムアミド aoml)に溶解し、 臭化水素酸（5 ml)を加え 110°Cで 6時間撹拌した。 反応液に酢酸ェチル（150ml)を加え炭酸水素 ナトリウム（150mlx2) で洗浄し、 酢酸ェチル層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後 、 酢酸ェチルを減圧留去した。 得られた残渣を少量のメタノールに溶解し、 ァセ トニトリル一水（pH3.5、 酢酸）を移動層として （38 : 62) 〜 （50 : 50) のダラ ジェントをかけ、 分取高速液体クロマトグラフィー [カラム： YMC- Pack Pro C18
AS-343 (20 ΦΧ 250mm) 、 検出 UV吸収 254nm、 流速 10ml/min] にて精製し 、 得られた画分を分取し減圧濃縮して、 化合物 46(17.0mg， 18min)を得た。 4884
実施例 25 (化合物 47)
化合物 62 (154mg)を酢酸ェチル（5ml)に溶解し、 5%パラジウム炭素 （ウエットタイ プ） （30mg)を加え、 水素置換 （1気圧） し室温で 90分間撹拌した。 パラジウム炭 素を濾過後、 濾液を減圧濃縮して、 化合物 47 (134. 8mg)を得た。 実施例 26 (化合物 48)
化合物 61 (21 lmg)を酢酸ェチル（11ml)に溶解し、 5%パラジウム炭素 （ウエット夕 イブ） （42mg)を加え、 水素置換 （1気圧） し室温で 90分間撹拌した。 パラジウム 炭素を濾過後、 濾液を減圧濃縮した。 得られた残渣 (184mg)を分取薄層クロマト グラフィー [S i l i ca Gel 60 F254 (商品名、 Merck社製） 、 20cmx20cm、 厚さ 0. 5 mm] にてクロ口ホルム—メタノール （95 : 5) を展開溶媒として精製し、 Rf値が 0 . 5の部分を回収して酢酸ェチルで抽出した後、 減圧濃縮して化合物 48 (159. 7mg) を得た。 実施例 27 (化合物 49, 50)
化合物 61 (233mg)をメタノール（10ml)/テトラヒドロフラン（2ml)に溶解し、 塩化 セリウム （IE) 7水和物（754mg)を加え、 室温で 30分間撹拌した。 この溶液に水 素化ホウ素ナトリゥム（236mg)を氷冷しながら徐々に加えた後、 室温で 10分間撹 拌した。 反応液を水 (30ml)で希釈した後 1規定塩酸水溶液 (3ml)を加え p Hを中 性にした後、 さらに水（30n )で希釈する。 水層を酢酸ェチル a 00mlx2)で抽出し 、 得られた酢酸ェチル層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、 酢酸ェチルを減圧留去 し、 白色粉末 (267mg)を得た。 得られた粉末を少量のメタノールで溶解し、 ァセ トニトリル一水（p H3. 5、 酢酸） (45： 55) を移動層とした分取高速液体クロマ トグラフィ一 [カラム： YMC- Pack Pro C18 AS-343 (20 <i) X 250mm) 、 検出 UV 吸収 254 n m、 流速 l Oml/min] にて精製し、 2つの画分を分取し各画分を減圧濃 縮して、 化合物 49 (49. 3mg， 19min)、 化合物 50 (184. 6mg, 21min)を得た。 実施例 28 (化合物 51)
化合物 62 (191mg)をメタノール（1 Oml) /テトラヒドロフラン（4ml)に溶解し、 塩化 セリウム （IE) 7水和物（641mg)を加え、 室温で 30分間撹拌した。 この溶液に水 素化ホウ素ナトリゥム（216nig)を氷冷しながら徐々に加えた後、 室温で 10分間撹 拌した。 反応液を水 (30ml)で希釈した後 1規定塩酸水溶液 (3ml)を加え p Hを中 性にした後、 さらに水（30ml)で希釈する。 水層を酢酸ェチル（100mlx2)で抽出し 、 得られた酢酸ェチル層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、 酢酸ェチルを減圧留去 し、 無色油状物質（182mg)を得た。 得られたオイルを少量のメタノールで溶解し 、 ァセトニトリル一水（p H3. 5、 酢酸） (30： 70) を移動層とした分取高速液体 クロマトグラフィー [カラム： YMC_Pack Pro C18 AS- 343 (20 Χ 250mm) 、 検 出 UV吸収 254n m、 流速 10ml/min] にて精製し、 得られた画分を減圧濃縮して 、 化合物 51 (137. 3mg， 29min)を得た。 実施例 29 (化合物 52)
ラデイシコール （205 mg)をアセトン （10 ml)に溶解し、 S—クロロアセチルチ オフエノ一ル （330 mg)及び炭酸カリウム （310 mg)を加え、 室温で 1. 5時間攪拌 した。 反応液に水を加え、 酢酸ェチルで抽出した。 飽和食塩水で洗浄後， 無水硫 酸マグネシウムで乾燥した後、 減圧乾固させた。 残渣をシリカゲルカラムクロマ トグラフィー （20 g、 酢酸ェチル： n—へキサン = 1 : 2) により粗精製した。 得 られた粗精製物を高速液体クロマトグラフィ一 （20 X 250腿， YMC-Pack Pro CI 8, 水 （酢酸添加、 PH3. 5) ：ァセトニトリル =65 : 35で溶出） により精製し、 化合 物 52 (105 mg)を得た。 実施例 30 (化合物 53)
ラデイシコール (406 mg)を N，N-ジメチルホルムアミド (6 ml)に溶かし、 氷冷下 トリェチルァミン （57. 6 mg)及びチォフエノール （260 mg)を加え、 引き続き氷 冷下一晩攪拌した。 反応液に希塩酸を加え、 酢酸ェチルで抽出し、 水、 飽和食塩 水で順に洗浄し、 無水硫酸マグネシウムで乾燥した後、 減圧乾固させた。 得られ た残渣のうちの 238 mgを高速液体クロマトグラフィ一 （20 Φ Χ 250匪， YMC-Pack Pro C18, 水 （酢酸添加、 pH3. 5) ：ァセ卜二卜リル = 65 : 35で溶出） により精製 し、 化合物 53 (46. 0 mg)を得た。 実施例 31 (化合物 54， 55)
ラデイシコール （378 mg)を Ν, Ν-ジメチルホルムアミド （6 ml)に溶かし、 氷冷下 トリェチルァミン （56. 4 mg)及びチォ酢酸 （163 mg)を加え、 引き続き氷冷下一 晚攪拌した。 反応液に希塩酸を加え、 酢酸ェチルで抽出し、 水、 飽和食塩水で順 に洗浄し、 無水硫酸マグネシウムで乾燥した後、 減圧乾固させた。 得られた残渣 のうちの 238 mgを高速液体クロマトグラフィー （20 Φ Χ 250匪， YMC-Pack Pro CI 8, 水 （酢酸添加、 PH3. 5) ：ァセトニトリル = 65 : 35で溶出） により精製し、 ィ匕 合物 54 (49. 0 mg)、 化合物 55 (15. 7 mg)を得た。 実施例 32 (化合物 56)
ラデイシコール （131 mg)をアセトン （10 ml)に溶解し、 ブロモ酢酸メチル （219 mg)及び炭酸カリウム （183 mg)を加え、 室温で 3時間攪拌した。 反応液に希塩酸 を加え、 酢酸ェチルで抽出した。 飽和食塩水で洗浄後， 無水硫酸マグネシウムで 乾燥して、 減圧乾固させた。 得られた残渣を酢酸ェチルより再結晶して化合物 56 (81. 8 mg)を得た。 実施例 33 (化合物 57)
化合物 7 (116 mg)をアセトン （10 ml)に溶解し、 ブロモ酢酸メチル （330 mg)及 び炭酸カリウム （276 mg)を加え、 室温で 3日間攪拌した。 反応液に希塩酸を加え 、 酢酸ェチルで抽出した。 飽和食塩水で洗浄後， 無水硫酸マグネシウムで乾燥し た後、 減圧乾固させた。 得られた残渣を酢酸ェチルより再結晶して化合物 57 (27 . 7 mg)を得た。 実施例 34 (化合物 58)
ラデイシコール （103 mg)を N，N-ジメチルホルムアミド （6 ml)に溶解し、 ニコチ ン酸 （190 mg)、 1-ェチル -3- (3-ジメチルァミノプロピル）カルポジイミド塩酸塩 (270 mg)及び 4-ジメチルァミノピリジン（37. 7 mg)を加え、 室温で 3. 5時間攪拌し た。 反応液に水を加え、 酢酸ェチルで抽出した。 飽和食塩水で洗浄後， 無水硫酸 マグネシウムで乾燥した後、 減圧乾固させた。 得られた残渣をアセトン -水よ り再結晶して化合物 58(94.5 mg)を得た。 実施例 35 (化合物 59)
化合物 56 (312 mg)をメタノール (60 ml)に懸濁し、 水酸化カリウム (206 mg)- 水 （20 ml)を加え室温で 15分攪拌した。 反応液に希塩酸を加え、 酢酸ェチルで抽 出した。 飽和食塩水で洗浄後， 無水硫酸マグネシウムで乾燥した後、 減圧乾固さ せた。 得られた残渣を高速液体クロマトグラフィー （20Φ Χ 250ΙΜΙ， YMC-Pack Pr o C18, 水 （酢酸添加、 PH3.5) ：ァセトニトリル = 65:35で溶出） により精製し 、 化合物 59 (10.6 mg)を得た。 実施例 36 (化合物 60, 61， 62， 63, 68， 70)
グルコース 2.0%、 マンニトール 4.0%、 オートミール 2.0%、 酵母エキス 0.4、 硫酸 鉄 （H) · 7水和物 0.001%、 硫酸亜鉛 (Π) 7水和物 0.001%、 硫酸マンガン （Π ) 4一 5水和物 0.001%、 硫酸銅 （Π) 5水和物 0.0005%からなる pH 6の無菌液体 培地に Pochonia chlamydosporia var. chlamydosporia TF-0480株を接種し、 26 、 72時間振盪培養した。 次に 50L容ジャ一 1基を用いて、 種培養と同じ組成の 無菌培地 30Lに前記種培養液 300mlを接種し、 26°C、 144時間撹拌通気培養した。 培養終了後培養液を遠心分離し、 菌体と上清に分離した。 上清を 1.5Lの HP— 20 (商品名、 三菱化学社製） に吸着させ、 水で洗浄した後 3Lのメタノールで 溶出した。 この溶出液を減圧濃縮後、 得られた水層を酢酸ェチルで抽出した。 酢 酸ェチル層を無水硫酸ナトリゥムで脱水後、 減圧濃縮し褐色シロップ状物質 60 g を得た。
培養エキスの一部 （30 g) をクロ口ホルム—メタノール （4 : 1) の混合溶媒に 溶解し、 n—へキサンで湿潤させて調製したシリカゲル [Silica Gel 60 (商品 名、 Merck社製） ] のカラム （1600ml) に吸着させた。 n—へキサン一酢酸ェチ ルの混合溶媒で順次溶出し、 n—へキサン—酢酸ェチル （4 : 1) 溶出画分 （13 Orag) 、 （2 : 1) 溶出画分 （1) (1.88g) 、 (2) (780mg) 、 （1 ： 2) 溶 出画分 （3.56g) を得た。 n—へキサン一酢酸ェチル （4 : 1) 溶出画分 （130mg ) を少量のアセトンに溶解し、 ァセトニトリル一水（PH3.5、 酢酸） (55： 45) を移動層とした分取高速液体クロマトグラフィー [カラム： YMC-Pack Pro C18 A S-343 (20φ X250mm) 、 検出 UV吸収 254nm、 流速 lOml/min] にて精製し、 2つの画分を分取し各画分を減圧濃縮して、 化合物 63(23.5mg, 20min), 化合物 7 0(4.8mg, 24min)を得た。 また n—へキサン一酢酸ェチル （2 : 1) 溶出画分
(1) (1.88g) をアセトン （30ml) で再結晶し、 化合物 61 (277mg)を得、 溶出画 分 （2) (780mg) を分取薄層クロマトグラフィー [Silica Gel 60 F254 (商品 名、 Merck社製） 、 20cmx20cm、 厚さ 1腿] にて n—へキサン—アセトン （3 ： 2) を展開溶媒として精製し、 Rf値が 0.4の部分を回収して酢酸ェチルで抽出し た後、 減圧濃縮して化合物 60(80.3mg)を得た。 次に n—へキサン—酢酸ェチル （ 1 ： 2) 溶出画分 （3.56g) をクロ口ホルム一メタノール （4 ： 1) の混合溶媒 に溶解し、 クロ口ホルムで湿潤させて調製したシリカゲル [Silica Gel 60 (商 品名、 Merck社製） ] のカラム （880ml) に吸着させた。 クロ口ホルム—メタノ一 ルの混合溶媒で順次溶出し、 クロ口ホルム一メタノール （98 : 2) 溶出画分 （92 6mg) を得、 アセトン一メタノール （lmlZSml) で再結晶することで化合物 62 ( 339mg)を得た。 またクロ口ホルム一メタノール （97 : 3) 溶出画分 （1.42g) を セフアデックス LH— 20 (商品名、 アマシャムフアルマシアバイオテク社製)
(メタノール、 900ml) のカラムクロマトグラフィー、 続いてァセトニトリル一 水（pH3.5、 酢酸） （30 : 70) を移動層とした分取高速液体クロマトグラフィー
[カラム： YMC_Pack Pro C18 AS-343 (20 φ X 250mm) 、 検出 UV吸収 254nm 、 流速 lOml/min] にて精製し、 得られた画分を減圧濃縮して、 化合物 68(4.5mg， 21min)を得た。 実施例 37 (化合物 64, 65， 71, 72， 76)
実施例 36と同様にして得た培養エキスの一部 （30g) をクロ口ホルム一メタノー ル （4 ： 1) の混合溶媒に溶解し、 クロ口ホルムで湿潤させて調製したシリカゲ ル [Silica Gel 60 (商品名、 Merck社製） ] のカラム （700ml) に吸着させた。 クロ口ホルム—メタノ一ルの混合溶媒で順次溶出し、 クロ口ホルム—メタノール (93： 7) 溶出画分を 2つに分け、 画分 （1) (156mg) 、 (2) (164mg) とし た。 画分 （1) を少量のメタノールに溶解し、 ァセトニトリル—水（pH3.5、 酢 4884 酸） (30： 70) を移動層とした分取高速液体クロマトグラフィー [カラム： YMC -; P ack Pro C18 AS - 343 (20 X 250mm) 、 検出 UV吸収 254nm、 流速 lOml/min] にて精製し、 4つの画分を分取し各画分を減圧濃縮して、 化合物 64(35.4mg， 21m in), 化合物 72(13.7mg, 27min)、 化合物 71(6.6mg， 29min)、 化合物 65 (4. lmg， 33 min)を得た。 また画分 （2) を同条件の分取高速液体クロマトグラフィーにて精 製し、 得られた画分を分取し減圧濃縮して、 化合物 71(3.7mg)とともに化合物 76 ( 4.5mg, 20min)を得た。 実施例 38 (化合物 69， 74)
実施例 36と同様にして得た培養エキス（39.5g) を n—へキサン （300mlx2) で 溶解し、 生成する沈殿を濾過し溶媒を除去した。 得られた沈殿 （8.1g) をクロ口 ホルム一メタノール (4： 1) の混合溶媒に溶解し、 クロ口ホルムで湿潤させて 調製したシリカゲル [Silica Gel 60 (商品名、 Merck社製） ] のカラム （650ml ) に吸着させた。 クロ口ホルム一メタノールの混合溶媒で順次溶出し、 クロロホ ルム—メタノール （88 : 12) 溶出画分 （318mg) を得た。 得られた画分を少量の メタノールに溶解し、 ァセトニトリル一水（pH3.5、 酢酸） (30： 70) を移動層 とした分取高速液体クロマトグラフィー [カラム： YMC- Pack Pro C18 AS- 343 (2 0 Χ 250πιιη) 、 検出 UV吸収 254nm、 流速 lOml/min] にて精製し、 2つの画 分を分取し各画分を減圧濃縮して、 化合物 74(15.3mg， 19min)、 化合物 69 (8. Omg, 38m in)を得た。 実施例 39 (化合物 66)
実施例 36と同様にして得た培養エキス（39.5g) を n—へキサン （300mlx2) で 溶解し、 生成する沈殿を濾過し溶媒を除去した。 得られた沈殿 （8.1g) をクロ 口ホルム一メタノール （4 : 1) の混合溶媒に溶解し、 クロ口ホルムで湿潤させ て調製したシリカゲル [Silica Gel 60 (商品名、 Merck社製） ] のカラム （650 ml) に吸着させた。 クロ口ホルム一メタノールの混合溶媒で順次溶出し、 クロ口 ホルム一メタノール （100 : 0) 溶出画分 （1.5g) を得た。 続いて n—へキサン 一酢酸ェチルの混合溶媒でシリカゲルカラム （620ml) を行い、 n—へキサン一 酢酸ェチル （2 : 1) 溶出画分 （321mg) を得た。 得られた画分を少量のァセト ンに溶解し、 ァセトニトリル一水（ρΗ3·5、 酢酸） （45： 55〜70： 30、 グラジェ ント） を移動層とした分取高速液体クロマトグラフィー [カラム： YMC- Pack Pro C18 AS- 343 (20 Χ 250mm) 、 検出 UV吸収 254nm、 流速 lOml/rain] にて精 製し、 化合物 66( .4mg， 34min)を得た。 実施例 40 (化合物 73, 77， 78)
実施例 36と同様にして得た培養エキス （500g) をクロ口ホルム一メタノール （4 ： 1) の混合溶媒に溶解し、 クロ口ホルムで湿潤させて調製したシリカゲル [Si lica Gel 60 (商品名、 Merck社製） ] のカラム （6000ml) に吸着させた。 クロ 口ホルム一メタノールの混合溶媒で順次溶出し、 クロ口ホルム一メタノール （95 ： 5) 溶出画分 （57 g) を得、 その一部 （18 g) をさらに n—へキサン—酢酸ェ チルの混合溶媒でシリカゲルカラム （800mU を行い、 n—へキサン—酢酸ェチ ル （2 ： 1) 溶出画分を 2つに分け、 画分 （1) (126mg) 、 (2) (985mg) と した。 画分 （1) を少量のアセトンに溶解し、 ァセトニトリル—水（pH3.5、 酢 酸） (55： 45) を移動層とした分取高速液体クロマトグラフィー [カラム： YMC-P ack Pro C18 AS - 343 (20 X 250mm) 、 検出 UV吸収 254nm、 流速 10ml/min] にて精製し、 得られた画分を減圧濃縮して、 化合物 78(13.4mg， 26min)を得た。 また画分 （2) を移動層をァセトニトリル一水（pH3.5、 酢酸） （45 : 55) とし た分取高速液体クロマトグラフィ一にて精製し、 2つの画分を分取しそれぞれ減 圧濃縮して、 化合物 73(38. lmg, 10min)、 化合物 77 (67.2mg, 26min)を得た。 実施例 41 (化合物 67， 75)
実施例 36と同様にして得た培養エキス （500 g) をクロ口ホルム一メタノール （ 4 : 1) の混合溶媒に溶解し、 クロ口ホルムで湿潤させて調製したシリカゲル [ Silica Gel 60 (商品名、 Merck社製） ] のカラム （6000ml) に吸着させた。 ク ロロホルム一メタノールの混合溶媒で順次溶出し、 クロ口ホルム一メタノール （ 95 : 5) 溶出画分 （57g) を得、 その一部 （18g) をさらに n—へキサン—酢酸 ェチルの混合溶媒でシリカゲルカラム （800ml) を行い、 n—へキサン一酢酸ェ チル （1 ： 2) 溶出画分 （890mg) を得た。 得られた画分を少量のアセトンに溶 解し、 ァセトニトリル—水（pH3.5、 酢酸） (40： 60) を移動層とした分取高速 液体クロマトグラフィー [カラム： YMC- Pack Pro C18 AS - 343 (20 φ X 250mm) 、 検出 UV吸収 254nm、 流速 lOml/min] にて精製し、 2つの画分を分取し得ら れた画分を減圧濃縮して、 化合物 67(17.4mg, llmin)とともにセミピュアサンプ ル（23.9mg)を得た。 セミピュアサンプルを 分取薄層クロマトグラフィー [Silic a Gel 60 F254 (商品名、 Merck社製） 、 20cmx20cm、 厚さ 0.5腿] にてクロロホ ルムーメタノール （90 : 10) を展開溶媒として精製し、 Rf値が 0.5の部分を回収 して酢酸ェチルで抽出後、 減圧濃縮して化合物 75 (4.3mg)を得た。 上記実施例にて合成した化合物及び精製した化合物並びにそのデータを表 2に 示す。
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t'SstO/eodf/iad 1?££980/£ O
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19
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試験例 1 毛乳頭細胞における丽 T- 5A mRMの発現
ヒト毛乳頭細胞は、 東洋紡から購入し、 12%FBSを添加した MEM (インビトロジ ェン） を用いて培養した。 ヒト毛包角化細胞は、 荒瀨らの方法 （J. Dermatol . Sci . 2, 66-70 (1991) ) に従って、 抜毛髪から分離し KGM-2 (三光純薬) を用いて培養 した。
継代 5回目の毛乳頭細胞及び継代 2回目の毛包角化細胞を、 2 X 106 cel lsZwe 11となるように 10cmシャーレに播種し、 ニ晚培養した。 培地を除去し、 細胞を PB S (一） で洗浄後、 TRIzol試薬 （インビトロジェン） を用いて total RNAを抽出 した。 各 total RNA 50ng、 WNT— 5A又は glyceraldehyde-3- phosphate dehydro genase (GAPDH) 特異的なプライマー （暫 T一 5A forward： AATGTCTTCCAAGTTCTTC CTAGTGGC (配列番号 8 ) 、 WNT- 5A reverse： GATGTCGGAATTGATACTGGCA (配列番 号 9 ) 、 GAPDH forward： ACCACAGTCCATGCCATCAC (配列番号 10) 、 GAPDH rever se： TCCACCACCCTGTTGCTGTA (配列番号 11) ) 各 0. 4 xM、 及び SUPERSCRIPT One— Step RT-PCR wi th PLATINUM Taq (インビトロジェン） を用いて、 SUPERSCRIPT One-Step RT-PCR wi th PLATI而 M Taq添付のプロトコールに従い、 全量 の反応系で、 50°Cで 30分間 f i rs t s trand合成を行った後、 94 で 2分間加熱、 その後、 94°Cで 30秒、 55°Cで 30秒、 72°Cで 30秒を 23又は 20サイクル繰り返し、 各 cDNA断片を増幅した。
この反応液を、 1. 5 %ァガ口一スゲルを用いて電気泳動し、 ェチジゥムブロマ ィドにて染色した。 結果を図 1に示す。
毛乳頭細胞 (DPC) 由来の RNAを用いた場合は、 WNT— 5A特異的なプライマーを 用いた 23サイクルの PCRにおいて、 顕著な cDNA断片の増幅が認められた。 一方、 毛包角化細胞 (HFC) 由来の RNAを用いた場合は、 同条件において、 増幅産物は認 められなかった。 試験例 2 WNT- 5A mRNA量減少活性の測定
ヒト毛乳頭細胞は、 東洋紡から購入し、 12 %FBSを添加した MEM (インビトロジ ェン） を用いて培養した。
継代 5回目の毛乳頭細胞を、 1. 6 X 105 cel ls/wel lとなるように 12穴プレート に播種し、 一晩培養した。 化合物無添加培地、 又は化合物 1、 2、 3、 4、 5、 7、 9又は 24添加培地と交換し、 更に 24時間、 培養を行った。 培養終了時、 培地 を除去し、 細胞を PBS (—） で洗浄後、 TRIzoI試薬 （インビトロジェン） を用い て toial RNAを抽出した。 各 total RNA 50ng、 WNT— 5A又は GAPDH特異的なプライ マ一 （WNT— 5A forward： AATGTCTTCCAAGTTCTTCCTAGTGGC (配列番号 8 ) 、 丽 T一 5A reverse： GATGTCGGAATTGATACTGGCA (配列番号 9 ) 、 GAPDH forward： ACCAC AGTCCATGCCATCAC (配列番号 10) 、 GAPDH reverse： TCCACCACCCTGTTGCTGTA (配 列番号 11) ) 各 0. 4 xM、 及び SUPERSCRIPT One— Step RT—PCR wi th PLATINUM Taq (インビトロジェン） を用いて、 SUPERSCRIPT One-S tep RT—PCR wi th PLAT INUM Taq添付のプロトコールに従い、 全量 25 1の反応系で、 50°Cで 30分間 f irs t s trand合成を行った後、 94°Cで 2分間加熱、 その後、 94°Cで 30秒， 55°Cで 30秒 , 72°Cで 30秒を 23又は 20サイクル繰り返し、 WNT— 5八又は6 1¾11の0^^断片を増幅 した。
この反応液を、 1. 5 %ァガロースゲルを用いて電気泳動し、 ェチジゥムブロマ イドにて染色した。 結果を図 2に示す。
丽 T一 5A特異的なプライマ—を用いた 23サイクルの： PCRにおいて、 化合物無添加 で培養した場合と比較して、 化合物を添加した培養では、 颗 T一 5A cDNA断片の 増幅が顕著に減少した。
一方、 GAPDH特異的なプライマーを用いた 20サイクルの PCRにおいて、 GAPDH c DNA断片の増幅は、 化合物の添加の有無に関わらず、 変動が認められなかった。 試験例 3 毛乳頭細胞増殖促進活性試験
ヒト毛乳頭細胞は、 東洋紡から購入し、 12%FBSを添加した MEM (インビトロジ ェン） を用いて培養した。
継代 5回目の毛乳頭細胞を、 1. 5 X 104 cel lsZwel lとなるようにスフエロィド 培養用 96穴プレートに播種し、 一晩培養した。 化合物無添加培地、 又は化合物 1 、 2、 3、 4、 5、 7、 9又は 24添加培地と交換し、 更に 72時間培養を行った。 培養終了時の細胞数を Cel l count ing ki t (和光純薬） を用いて測定した。 即ち 、 培養終了 5時間前に培地の 1Z10量の WST— 1試薬を培地に添加し、 培養終了時 、 培地の吸光度 (O. D. 450nm/620nm) を測定した。 細胞数と吸光度は、 細胞数 0 . 25〜4 X 104 cel l sZwel lの範囲で正の相関関係が認められた。
その結果、 WNT— 5A mRNA量減少活性を有する化合物が、 毛乳頭細胞の増殖を促 進する活性を有することが明らかになった （図 3 ) 。 図中の値は、 対照群 6 wel l 、 化合物添加群 3 wel lの平均値である。 対照群と化合物添加群との比較にはスチ ユーデントの t検定を用いた。
* ： P<0. 05、 * * ： P<0. 01、 * * * ： P<0. 001
上記実験例により、 醫 T—5Aがヒト毛乳頭細胞に発現していること、 ヒト毛乳 頭細胞の丽 T—5A mRNA量が本発明に係る化合物により減少すること、 更に、 蘭 T 一 5A mRNA量減少活性を有する化合物が、 毛乳頭細胞の増殖を促進する活性を有 することが示された。 試験例 4 ：化合物 （表 2 ) の WNT- 5A mRNA量減少活性 （QuantiGene法による mR NAの定量）
ヒト毛乳頭細胞は、 東洋紡から購入し、 12%FBSを添加した MEM (インビトロジ ェン） を用いて培養した。
継代 5回目の毛乳頭細胞を、 IX 104 cells/wellとなるように 96穴プレートに播 種し、 一晩培養した。 化合物無添加培地、 又は化合物添加培地と培地交換し、 更 に 24時間、 培養を行った。 培養終了後、 QuantiGene High Volume Kit (バイ エルメディカル) を用いて、 Branched DNA(bDNA) Signal Amplification法 （ Drug Metabolism and Disposition 28(5),608-616(2000)) により、 而 T- 5A又は GAPDHの mRNA量を定量した。 即ち、 QuantiGene High Volume Kit添付のプロト コールに従い、 Lysis Mixtureを用いて細胞を溶解し、 溶解液を Capture plate に添加した。 更に、 丽 T- 5A又は GAPDH特異的なプローブセットを添加し、 53Tで 2 0時間、 反応させた。 0.03% Lauryl Sulfateを含む 0.1XSSCを用いてプレートを 洗浄後、 bDNAからなる増幅プローブを添加し、 46°Cで 1時間反応させた。 プレー トを洗浄後、 続いて Alkaline Phosphatase標識した標識プローブを添加し、 46 °Cで 1時間反応させた。 プレートを洗浄後、 基質 Lumi-Phos Plusを添加し、 46 °Cで 30分間反応後、 化学発光量を WALLAC 1420ARVOS Xを用いて測定した。 03 04884
WNT- 5A特異的なプローブセットは、 ヒト WNT-5A mRNAの蛋白質翻訳領域の 塩基配列に基づいて設計した。 Capture Extender(CE)として 10本のプローブ （ 配列番号 12— 21) を、 Label Extender(LE)として 31本のプローブ （配列番号 22 - 52) を、 Blockerとして 9本のプローブ （配列番号 53— 60) を使用した。
また、 GAPDH特異的なプロ一ブセットとして、 bDNA probe set for human GAPD H (XenoTech LLC, B0960)を使用した。
WNT-5A及び GAPDHの mRNA量は、 化合物無添加対照に対する相対値 （％) として 表し、 mRNA量を 50%に減少させる化合物濃度 （IC5 e値） を算出して、 化合物によ る mRNA減少活性の指標とした。
WNT-5A及び GAPDHの mRNA量に及ぼす化合物の影響を表 3に示す。 表中の値は 2 w e l lの平均値である。 これらの化合物は、 毛乳頭細胞において、 WNT- 5A mRNA量を 減少させた。 最も活性の強い化合物の IC5。値は 0. 12 / Mであった。 WNT- 5A mRNA量 減少の IC5。値においては、 同時に測定した GAPDH mRNA量には減少が認められなか つた。
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ΟΖΚ εに 8 LL
W99 998 9L
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HadVD VS-丄 NM
(ΙΛΙ^) 0 OI ε辇
蒙 odf/ェ:) d ^εε98ο/εο ΟΛΧ 試験例 5 ：化合物 （表 2 ) の毛乳頭細胞増殖促進活性
ヒト毛乳頭細胞は、 東洋紡から購入し、 12%FBSを添加した MEM (インビトロジ ェン） を用いて培養した。
継代 5回目の毛乳頭細胞を、 1.5 X 104 cells/wellとなるようにスフエロイド培 養用 96穴プレートに播種し、 一晩培養した。 化合物無添加培地、 又は化合物添加 培地と交換し、 更に 72時間、 培養を行った。 培養終了時の細胞数を Cell counti ng kit (和光純薬） を用いて測定した。 即ち、 培養終了 5時間前に培地の 1/10量 の WST-1試薬を培地に添加し、 培養終了時、 培地の吸光度 （O.D. 450nm/620nm ) を測定した。 細胞数と吸光度は、 細胞数 0.25〜4X 104 cells/wellの範囲で正の 相関関係が認められた。
WNT-5A mRNA量減少活性を有する化合物が、 毛乳頭細胞の増殖に及ぼす影響を 、 表 4に示す。 表中の値は、 対照群 6 wel l、 化合物添加群 3 we I Iの平均値である 。 対照群と化合物添加群との比較にはスチュ一デントの t検定を用いた。
*:P<0.05, **:P<0.01, ***:P<0.001
WNT-5A mRNA量減少活性を有する化合物はいずれも、 16 において顕著な毛乳 頭細胞増殖促進活性を示した。 IC5。値が 1 M未満の、 強い丽 T- 5A mRNA減少活性 を示す化合物 1, 2, 18， 35, 52, 53, 及び 58については、 1 Mにおいても有意 な増殖促進活性を示した。
4884
表 4
Δ O.D. 450nm/620nm (% of control)
W_ ca
化合物番号 1 4 16 { μ Μ)
1 132.9 + 11 ·6 183.7 1 1 , 1 144.7 土 13.0
2 142.6 土 り *** 167.3 土 8 5 *** 241.0 土 25.3 ***
3 92.9 ± 1.6 92.9 土 9.9 244.2 ± 33.4 ***
4 97.4 土 24.4 148.2 + 4 9 180.2 + ^ **
5 1 10.2 ± 45.0 174.7 Q Q 236.4 26 4
7 82.6 土 3.9 169.7 士 10.4 194.8 + 12 7 ***
18 1 15.6 ± 9.0 * 147.1 土 1 1 3 210.9 -J— K Q
士 **
24 108.2 ± 6.9 104.3 土 10.5 1 19.7
土 *** 土 ΐ 8·3 ***
35 160.8 181.6 158.6
38 103.5 土 2.6 89.6 士 7.3 124.9 ± 5.1 **
52 124.5 _|_ Λ Q *** 143.2 + 0 *** 197.0 士 5.4 ***
53 126.6 土 14.3 ** 149.5 1 12 P *** 184.4 土 3.6 ***
54 80.0 土 2.4 97.1 土 5.6 135.0 + ο。 ***
55 89.0 ± 1.8 126.9 1 7 *** 175.6 + 9.8 ***
58 123.3 150.4 + 9 A *** 217.4 土 14.5 ***
65 92.1 土 6.7 87.6 土 8.7 141.0 ± 5.3 ***
73 91.7 土 5.7 81.2 土 7.8 205.6 _j_ 9 ク ***
76 80.0 土 5.6 77.1 土 7.0 120.7 士 6.3 *
77 81.6 土 4.4 86.3 土 5.0 180.8 土ク 1.7 ***
79 87.5 土 9.9 98.6 土 3.6 120.0 士 4.1 **
*: pぐ 0.05, **: pぐ 0.01 , ***: p<0.001
試験例 6 ：サル皮膚器官培養における丽 T-5A mRNAの減少
力二クイザル （ォス、 6年齢） の背部皮膚を採取し、 実体顕微鏡下で 5mmX8 mmに分割後、 各皮膚組織片を、 化合物無添加又は化合物 7若しくは化合物 3を 添加した、 10 g/mlの Insulin (シグマ） 、 10iig/mlの Hydrocortisone (クラポ ゥ） を含む Williams' MediumE (インビトロジェン） を用いて培養した。
培養 11日目に皮膚組織片から毛包を分離し、 TRIzol試薬 （インビトロジェン ) を用いて total UNAを抽出した。 各 total RNA200ng、 WNT- 5A又は GAPDH特異 的なプライマ一 （WNT-5A sense： AATGTCTTCCAAGTTCTTCCTAGTGGC
(配列番号 8 ) 、 WNT-5A antisense： GATGTCGGAATTGATACTGGCA (配 列番号 9 ) 、 GAPDH sense： ACCACAGTCCATGCCATCAC (配列番号 10) 、 GAPDH antisense： TCCACCACCCTGTTGCTGTA (配列番号 11) ) 各 0.4 M M、 及び SUPERSCRIPT One-Step T-PCR with PLATINUM Taq (インビ トロジェン） を用いて、 SUPERSCRIPT One-Step RT-PCR with PLATINU M Taq添付のプロトコールに従い、 全量 25 lの反応系で、 50°Cで 30分間 first s trand合成を行った後、 94 で 2分間加熱、 その後、 94°Cで 30秒， 55°Cで 30秒 , 72°Cで 30秒を 40又は 30サイクル繰り返し、 WNT-5A又は GAPDHの cDNA断 片を増幅した。
この反応液を、 1.5%ァガロースゲルを用いて電気泳動し、 サイバーグリーン I (夕カラ） にて染色した。 結果を図 4に示す。
WNT-5A特異的なプライマ—を用いた 40サイクルの PCRにおいて、 化合物無 添加で培養した場合と比較して、 化合物 7又は化合物 3を添加した培養において は、 WNT-5A cDNA断片の増幅が顕著に減少した。
一方、 GAPDH特異的なプライマーを用いた 30サイクルの PCRにおいて、 GAPDH cD NA断片の増幅は、 化合物の添加の有無に関わらず、 変動が認められなかった。 試験例 7 ：サル皮膚器官培養における Proliferating Cell Nuclear Antigen (PC NA) 陽性細胞の増加
力二クイザル （ォス、 6年齢） の背部皮膚を採取し、 実体顕微鏡下で 5mmX8 mmに分割後、 各皮膚組織片を、 化合物無添加又は化合物 7若しくは化合物 3を 添加した、 10 g /mlの Insulin (シグマ） 、 10ng/mlの Hydrocortisone (クラポ ゥ） を含む Williams' MediumE (インビトロジェン） を用いて培養した。
培養 30日目に、 皮膚組織片を 10%中性ホルマリンを用いて室温で固定した。 パラフィン切片を作製し、 1 %BSA添加 PBSを加え室温で 30分間放置し、 更に 0 .1Mのクェン酸緩衝液で煮沸処理を行った。 抗 PCNA抗体 （ダコジャパン、 200 倍希釈） と 4 °Cで一晩反応させ、 続いてピオチン化抗マウス IgG抗体を反応させ た後、 ABC standard kit (ベクター） と反応させ、 AEC substarate (シグマ ) を用いて発色させた。
その結果、 毛包及び表皮基底層の細胞において、 特異的なポジティブ反応が認 められた。 毛包においては、 休止期毛包、 成長期毛包のいずれにおいても、 毛乳 頭及びダ一マルシーズにおける PCNA陽性細胞数が、 化合物 7又は化合物 3の添 加培養により顕著に増加した （図 5 ) 。 試験例 8 ：サル皮膚器官培養における毛球部径の増大
力二クイザル （ォス、 6年齢） の背部皮膚を採取し、 実体顕微鏡下で 5mm X 8m mに分割後、 各皮膚組織片を、 化合物無添加又はィヒ合物 7若しくは化合物 3を添 カロした、 10 g/mlの Insulin (シグマ） 、 10ng/mlの Hydrocortisone (クラポゥ ) を含む Williams' MediumE (インビトロジェン） を用いて培養した。
培養 30日目に、 各皮膚組織片に含まれる全ての毛包を分離し、 毛球部の直径 を実体顕微鏡下で測定した。
結果を図 6及び 7に示す。 表中の数値は、 各皮膚組織片に含まれる全ての毛包 の毛球部径の平均値 ±s.e.である。 対照群と化合物添加群との比較にはスチュー デントの t検定を用いた。 *:P<0.05
また、 図は毛球部径の分布を示すヒストグラムである。 各皮膚組織片に含まれ る全ての毛包を、 図中に示した毛球部径のグループに各々分類し、 各グループに 分類された毛包の数を、 組織片から分離した毛包総数に対する相対値 （％) で表 した。 図 6は化合物 7添加培養の影響を示す。 化合物 7の存在下で 30日間培養 した皮膚片に含まれる毛包の毛球部径の平均値は、 化合物無添加対照と比較して 有意に高値であった。 分布をみると、 化合物無添加対照においては 140 z m以上 170 i m未満の毛球部径を有する毛包が最も多かったが、 化合物 7添加において は 170 II m以上 200 β m未満の毛球部径を有する毛包の割合が最大であつた。 170 m以上の毛球部径を有する毛包の割合は、 化合物無添加対照では 57.6%であつ たが、 化合物 7添加では 82.4%に増加した。
一方、 図 7は化合物 3添加培養の影響を示す。 化合物 7の場合と同様に、 化合 物 3存在下で 30日間培養した皮膚片に含まれる毛包の毛球部径の平均値は、 化 合物無添加対照と比較して有意に高値であった。 分布は、 化合物無添加対照にお いては m以上 200 m未満の毛球部径を有する毛包が最も多かったが、 ィ匕 合物 3添加においては 200 U m以上 230 m未満の毛球部径を有する毛包の割合 が最大であった。 Γ70 ^ ιη以上の毛球部径を有する毛包の割合は、 化合物無添加 対照では 55.8%であったが、 化合物 3添加では 74.5%に増加していた。 実験例 9 ：ベニガオザル発毛試験
脱毛症状が認められるベニガオザル （雄、 14年齢） の前頭部に、 化合物 7を 0. 3%含む口一シヨン 1 mLを、 1日 1回、 週 5回、 6ヶ月間、 塗布投与した。 塗布開始前 に、 前頭脱毛部にタトウーによるマーキングを行い、 タトウーを含む同部位の皮 膚拡大写真を、 塗布開始前及び 6ヶ月間塗布後に撮影した。
化合物 7を含む口一ションの 6ヶ月間塗布前後の皮膚拡大写真を、 図 8に示す 。 塗布前は、 細い軟毛が多いのに対し、 6ヶ月間塗布後の同部位では、 軟毛の数 が減少し、 太い硬毛の数の増加が認められた。 化合物 7を含むローションの 6ケ 月間の塗布により、 ベニガオザルの前頭部における脱毛症状に明らかな改善が認 められた。 上記の実験例により、 TOT- 5Aがヒト毛乳頭細胞に発現していること、 ヒ卜毛乳 頭細胞の TOT- 5A mRNA量が本発明に係る化合物により減少すること、 更に、 WNT - 5 A mRNA量減少活性を有する化合物が、 毛乳頭細胞の増殖を促進する活性を有する ことが示された。
また、 本発明に係る化合物は、 サル皮膚器官培養においても、 毛包の WNT - 5A mRNA量を減少させること、 休止期毛包、 成長期毛包のいずれにおいても P C N A 03 04884 染色陽性の増殖性細胞を顕著に増加させること、 更に、 毛包の毛球部径を増大さ せることが示された。
更に、 本発明に係る化合物は、 男性型脱毛症のモデル動物であるべニガオザル において、 脱毛症状の改善作用を有することが示された。
したがって、 毛乳頭細胞の増殖を促進する化合物は、 脱毛部毛包の毛乳頭にお いて低下している細胞増殖能を宂進させることにより、 発達した毛乳頭組織の形 成に寄与し、 その結果として発毛が促進される。 産業上の利用可能性
丽 T- 5A機能阻害剤、 例えば、 丽 T- 5A mRNA量を減少させる活性を有する化合物 又はその医薬上許容される塩は、 毛乳頭細胞増殖活性を有し、 新規な作用機序に よる発毛剤/育毛剤として有用である。
本発明は、 WNT— 5Aの機能を阻害する化合物が、 脱毛症の改善剤若しくは予防 剤になるという、 今までにない全く新しい概念を提供するものであり、 WNT— 5A の機能を阻害する化合物のスクリーニングは、 新規な発毛剤 Z育毛剤の開発に有 用である。

Claims

請求の範囲
1 . WNT— 5Aの機能阻害活性を有する化合物を含有する毛乳頭細胞増殖促進剤。
2 . WNT— 5Aの機能を阻害する化合物が WNT— 5A産生抑制剤である、 請求項 1に記 載の毛乳頭細胞増殖促進剤。
3 . 式 （I)
Figure imgf000077_0001
(式中、 R1及び R2は 同一又は異なって水素原子、 アルキル基又は C 2 _ 6 アルカノィル基を示し、
Xは水素原子又はハロゲン原子を示し、
R3 a及び R3 bは異なって水素原子又は水酸基を示し、
R4、 R5、 R R7、 R8及び R9は同一又は異なって水素原子、 水酸基、 ハロゲ ン原子、 C 6アルカノィルォキシ基を示すか、 又は隣り合う基が一緒になつて パイ結合又はエーテル結合を形成するか、 あるいは R5と R8若しくは R5と が 一緒になつてエーテル結合を形成する。 ） で表される化合物。
4 . 式 （I I)
Figure imgf000078_0001
(式中、 R1及び R2は 同一又は異なって水素原子、 _6アルキル基又は C2_6 アルカノィル基を示し、 Xは水素原子又はハロゲン原子を示し、
R3 c及び R3 dは同一又は異なって水素原子、 水酸基又は _ 6アルコキシ基を示 すか、 あるいは R3e及び R3dが一緒になつてォキソ基、 ヒドロキシィミノ基又は 〇ぃ6アルコキシイミノ基を形成し、
R4、 R5、 R6、 R7、 Rs及び R9は同一又は異なって水素原子、 水酸基、 ハロゲ ン原子、 C2_6アルカノィルォキシ基を示すか、 又は隣り合う基が一緒になつて パイ結合又はエーテル結合を形成するか、 あるいは R5と R8若しくは R5と が 一緒になつてエーテル結合を形成する。 ） で表される化合物を含有する毛乳頭細 胞増殖促進剤。
5. 式 （IX)
Figure imgf000078_0002
[式中、 R1 a及び R2 aは 同一又は異なって水素原子、 Cい 6アルキル基、 〇卜 6ァ (CH2) p CO-Y-R10 (式中、 Yは酸素原子又は硫黄原子を示し、 R1Q は 水素原子、 _6アルキル基又は置換若しくは無置換のァリール基を示し、 pは 0又は 1を示す。 ） で表される基、
(CH2) q R11 (式中、 RH は置換若しくは無置換のシクロアルキル基又は 置換若しくは無置換の C2 。ヘテロ環を示し、 Qは 0又は 1を示す。 ） で表され る基、 又は COR12 (式中、 R12 は置換若しくは無置換のァリ一ル基又は置換 若しくは無置換の C2 。ヘテロ環を示す。 ） で表される基を示し、
Xは水素原子又はハ口ゲン原子を示し、
R3e及び R3fは同一又は異なって水素原子、 τΚ酸基、 C 6アルコキシ基又は ― 6アル力ノィルォキシ基を示すか、 又は R3 e及び R3 fが一緒になつてォキソ基、 ヒドロキシィミノ基又は (^_6アルコキシイミノ基を形成し、
R4a、 R5a、 RSa、 R7a、 R8 a及び R9 aは同一又は異なって水素原子、 水酸基、 ハロゲン原子又は
Z-R13 (式中、 Zは酸素原子又は硫黄原子を示し、 R13 は 6アルキル基、 アルカノィル基又は置換若しくは無置換のァリール基を示す。 ） で表され る基を示すか、
又は隣り合う基が一緒になつてパイ結合又はエーテル結合を形成するか、 あるいは R5 aと R8 a若しくは R5 aと R9 aが一緒になってエーテル結合を形成し、
R6bは水素原子を示すか、 あるいは R3e若しくは R3f と一緒になつてェ一テル結 合を形成する。 ]で表される化合物を含有する毛乳頭細胞増殖促進剤。
6. 請求項 1、 2、 4又は 5に記載の毛乳頭細胞増殖促進剤を有効成分とする発 毛剤又は育毛剤。
7. 薬学的に有効量の TOT— 5Aの機能阻害活性を有する化合物をヒトに投与する ことを特徴とする、 発毛又は育毛方法。
8. 発毛剤又は育毛剤の製造における、 需 T— 5Aの機能阻害活性を有する化合物 の使用。
9 . 丽 T一 5Aの機能を阻害する化合物を選択することを特徴とする、 毛乳頭細胞 増殖促進剤のスクリーニング方法。
1 0 . 下記 (a)〜（c)の工程を含むことを特徴とする請求項 9記載の方法。
(a)ヒ卜 WNT—5A発現細胞を化合物を添加した培地を用いて培養する工程：
(b)工程（a)で培養したヒト WNT— 5A発現細胞を溶解して RNAを抽出し、 WNT— 5A mR NA量を測定する工程：及び
(c)工程（b)で測定した醫 T一 5A mRNA量を比較する工程。
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