WO2003085402A1 - Piece d'essai pour chromatographie et son procede de production - Google Patents

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WO2003085402A1
WO2003085402A1 PCT/JP2003/004377 JP0304377W WO03085402A1 WO 2003085402 A1 WO2003085402 A1 WO 2003085402A1 JP 0304377 W JP0304377 W JP 0304377W WO 03085402 A1 WO03085402 A1 WO 03085402A1
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test piece
chromatography
metal salt
sample solution
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PCT/JP2003/004377
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Keiko Yugawa
Fumihisa Kitawaki
Tatsurou Kawamura
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Matsushita Electric Industrial Co., Ltd.
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Publication date
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    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54366—Apparatus specially adapted for solid-phase testing
    • G01N33/54386—Analytical elements
    • G01N33/54387—Immunochromatographic test strips
    • G01N33/54388—Immunochromatographic test strips based on lateral flow
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/46—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans from vertebrates
    • G01N2333/47—Assays involving proteins of known structure or function as defined in the subgroups
    • G01N2333/4701—Details
    • G01N2333/4737—C-reactive protein

Definitions

  • the present invention relates to a chromatographic test strip capable of easily and quickly performing high-precision quantification of a specific component in a sample solution.
  • Dry chemistry is a method in which a liquid sample is spotted on a reagent stored in a dry state in a solid phase matrix such as a film or test paper, and the target substance in the sample solution is measured. .
  • Devices used for dry chemistry include a single-layer type in which a reagent is supported on filter paper and a multi-layer type in which a developing layer, a reaction layer, a reagent layer, and the like are stacked. All devices have the following features: reagents are already supported on the solid phase matrix, so no reagent preparation is required, they can be stored in a small space, and only a small amount of sample solution is required. .
  • a typical dry chemistry test method is immunochromatography, which is a test method utilizing an antigen-antibody reaction and capillary action.
  • the devices used for immunochromatography include an antibody immobilized on a solid-phase matrix made of a material impregnated with the solvent of a sample solution represented by membrane fill (hereinafter abbreviated as immobilized antibody).
  • immobilized antibody an antibody labeled with a labeling substance (hereinafter abbreviated as a labeled antibody) is carried in a dry state.
  • a sample solution containing the substance to be detected 104 is introduced from one end of the test piece, and as shown in Fig. 5 (b), the labeled antibody 105
  • the sample solution reaches the labeled part 102, which is contained in the sample solution in an elutable state, by capillary action, where the complex of the labeled antibody 105 and the detection target substance 104 is formed. Formed Is done.
  • the formed complex 107 reaches the immobilization part 103 carrying the immobilized antibody 106 along the flow caused by the capillary action of the sample solution. Then, it is captured by the immobilized antibody 106 by the antigen-antibody reaction.
  • Advantages of the measurement method using the immunochromatography method include, in addition to the advantages of the dry chemistry described above, simplicity of operation, quick determination, and reduction in measurement cost. Therefore, it can be applied not only to clinical tests but also to point-of-care (hereinafter abbreviated as POC), which has attracted attention in recent years. It is a collective term for clinical tests in which shortening the time to get out is most important. Solution issues
  • the blood taken into a blood collection tube using a syringe needle is used.
  • a part is used as a sample solution.
  • Blood collection tubes contain various reagents depending on the application.
  • blood collection tubes for measuring blood glucose, aldosterone, or prostaglandin E2 contain the chelating agent EDTA.
  • EGTA is also expected to have a chelating effect, and may be added to blood collection tubes.
  • carboxylic acids such as citric acid, fluoric acid, and oxalic acid may also exhibit a chelating effect, and in particular, cunic acid is often contained in blood collection tubes.
  • the substance to be detected is protein and the structure of the protein contains a divalent metal ion such as calcium ion, if the substance having the above-described chelating effect is present in the sample solution, chelation occurs. Because a substance with an effect takes in it, Divalent metal ions are excreted from within the structure of the protein to be detected. For this reason, the three-dimensional structure of the protein to be detected may change.
  • CRP is a pentamer composed of five subunits, and calcium ions are contained in four of the five subunits.
  • the three-dimensional structure changes as calcium ions escape.
  • calcium ions may fall off from the CRP and the three-dimensional structure may change.
  • an antibody that binds to the detection target substance containing divalent metal ions is used, so that it does not bind to the detection target substance having the changed structure, or the detection target substance and the antibody There may be a change in the affinity with For this reason, accurate results may not be obtained.
  • the present invention has been made in view of the above circumstances, and has as its object to provide a chromatographic test strip that can accurately measure a target substance in a sample solution. Disclosure of the invention
  • the test piece for chromatography of the present invention is a test piece for chromatography for measuring a substance to be detected contained in a sample solution, and has a sample introduction part, a label part, and an immobilization part, A substrate on which the sample introduction unit, the label unit, and the immobilization unit are arranged so that the sample solution introduced into the sample introduction unit moves to the immobilization unit via the label unit.
  • a metal salt is contained in at least one of the sample introduction part, a part between the sample introduction part and the label part, and the label part.
  • the substance to be detected even when the substance to be detected holds a metal ion therein, the substance to be detected releases the metal ion by contacting with a substance having a chelating effect, and even if the three-dimensional structure changes, The sample solution comes into contact with the metal salt before contacting the label. As a result, the target substance returns to the original three-dimensional structure by taking in the metal ions. Therefore, using a blood collection tube containing a substance having a chelating effect Even when handling, the target substance in the sample solution can be measured and detected accurately.
  • the metal salt may be present on the surface or inside of the base material.
  • the labeling section includes a first binding substance labeled with a labeling substance and specifically binding to the detection target substance, and the immobilization section includes a second binding substance specifically binding to the detection target substance. May be included.
  • the first binding substance and the second binding substance may be configured to be antibodies that specifically bind to the detection target substance.
  • the substance to be detected can be measured by immunochromatography.
  • the metal salt may be a salt of a divalent metal ion.
  • the divalent metal ion may be a calcium ion.
  • the first binding substance and the second binding substance may be configured to be anti-CRP antibodies.
  • the metal salt may be composed of calcium chloride.
  • Another chromatographic test strip of the present invention is a chromatographic test strip for measuring a substance to be detected contained in a sample solution, comprising: a base material; and a metal salt provided on the base material. And a first binding substance that is provided on the base material in contact with the sample introduction layer and that is labeled with a label substance and specifically binds to the detection target substance, in the sample liquid.
  • An immobilized label layer that includes an elutable state, and a second binder that is provided on the substrate in contact with the label layer and specifically binds to the detection target substance in an immobilized state. And a chemical layer.
  • the substance to be detected even when the substance to be detected holds a metal ion therein, the substance to be detected releases the metal ion by contacting with a substance having a chelating effect, and even if the three-dimensional structure changes, The sample solution comes into contact with the metal salt before contacting the label. As a result, the target substance returns to the original three-dimensional structure by taking in the metal ions. Therefore, even when a sample solution is handled using a blood collection tube or the like containing a substance having a chelating effect, the substance to be detected in the sample solution can be accurately measured and detected. Further, according to the present invention, the sample introduction layer is provided in contact with the labeling layer. Therefore, the amount of solvent in the sample solution that is lost during the development of the sample solution is reduced. Therefore, a sufficient amount of the sample solution can be supplied to the labeling layer and the immobilization layer.
  • composition provided with the absorption layer for absorbing the above-mentioned sample liquid provided in contact with the above-mentioned immobilization layer on the above-mentioned substrate It is good also as composition provided with the absorption layer for absorbing the above-mentioned sample liquid provided in contact with the above-mentioned immobilization layer on the above-mentioned substrate.
  • the method for producing a test piece for chromatography is a method for producing a test piece for chromatography for measuring a substance to be detected contained in a sample solution, comprising the steps of: (a) preparing a base material sheet; A metal salt-carrying region, a labeled antibody-containing region, and an immobilized antibody region, which extend in parallel with each other, and wherein the labeled antibody-containing region corresponds to the metal salt-carrying region.
  • the metal salt-supporting region carries a metal salt
  • the labeled antibody-containing region is labeled with a labeling substance, and specifically binds to the detection target substance. 1st join
  • the substance is contained in the sample solution in a state that can be eluted
  • the immobilized antibody region contains the second binding substance that specifically binds to the detection target substance in an immobilized state.
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing a test piece for immunochromatography.
  • 2 (a) to 2 (c) are diagrams schematically showing the principle of measurement using a test piece for immunochromatography.
  • 3 (a) to 3 (c) are process diagrams showing a method for producing a test piece for immunochromatography.
  • FIG. 4 (a) is a top view showing a test piece for immunochromatography
  • FIG. 4 (b) is a cross-sectional view taken along line XX shown in FIG. 4 (a).
  • FIG. 5 is a diagram schematically showing the principle of measurement using a conventional test piece for immunocytomatography. Best Embodiment
  • FIG. 1 is a diagram showing a test piece for immunochromatography of the present embodiment
  • FIGS. 2 (a) to 2 (c) schematically show the operation when the test piece for immunochromatography of this embodiment is used.
  • FIG. 1 is a diagram showing a test piece for immunochromatography of the present embodiment
  • FIGS. 2 (a) to 2 (c) schematically show the operation when the test piece for immunochromatography of this embodiment is used.
  • FIG. 1 is a diagram showing a test piece for immunochromatography of the present embodiment
  • FIGS. 2 (a) to 2 (c) schematically show the operation when the test piece for immunochromatography of this embodiment is used.
  • the immunochromatographic test strip 10 of the present embodiment is composed of a base material 11 having a sample introduction section 12, a label section 13, and an immobilization section 14. ing.
  • Substrate 11 is made of a material that is impregnated with the solvent of the sample solution containing the substance to be detected.
  • it is made of a porous material such as nitrocellulose membrane, cellulose acetate membrane, glass fiber filter paper, and nonwoven fabric. Have been.
  • nitrocellulose membranes are preferred. These materials can evolve the solvent of the sample solution by capillary action.
  • the sample introduction section 12 is an area where a sample liquid containing the substance to be detected is introduced (for example, dropped), and carries a metal salt.
  • the labeled portion 13 contains a labeled antibody 15 labeled with a labeling substance in a state that it can be eluted into the sample solution.
  • a labeled antibody 15 labeled with a labeling substance in a state that it can be eluted into the sample solution.
  • an antibody that specifically binds to the detection target substance is used.
  • An immobilized antibody 16 is immobilized on the immobilization section 14.
  • the immobilized antibody 16 one that specifically binds to the substance to be detected is used.
  • the metal salt supported on the sample inlet 12 is selected according to the substance to be detected.c
  • the substance to be detected is CRP holding calcium ions
  • the CRP retains the three-dimensional structure of CRP.
  • Calcium salt is used to supply calcium ions.
  • the labeled antibody 15 and the immobilized antibody 16 included in the labeled portion 13 and the immobilized portion 14 respectively use an anti-CRP antibody retaining calcium ions.
  • metal salt labeled antibody 15 and immobilized antibody Body 16 is selected.
  • an immunochromatography test piece 10 is prepared, and a sample solution containing the substance 17 to be detected is placed in a sample introduction section 1 2 at one end of the immunochromatography test piece 10. To be dropped.
  • the sample solution reaches the label section 13 by capillary action, as shown in FIG. 2 (b).
  • a complex 18 of the labeled antibody 15 and the target substance 17 is formed by the antigen-antibody reaction.
  • the formed complex 18 reaches the immobilization section 13 where the immobilized antibody 16 is immobilized along the flow of the sample solution due to the capillary action, where the immobilized antibody 16 is immobilized by an antigen-antibody reaction.
  • a complex 19 is formed, as shown in FIG. 2 (c).
  • components other than the complex 18 pass through the immobilization section 13 along the flow of capillary action, so that only the complex 19 remains in the immobilization section 13.
  • the output derived from the labeled substance 15 for example, measuring the reflection absorbance
  • the detection of the substance 17 to be detected in the sample liquid and the concentration of the substance 17 to be detected in the sample liquid are measured. Becomes possible.
  • the immunochromatography test strip 10 of the present embodiment even when the target substance 17 holds metal ions inside, the chelating effect of the target substance 17 contained in the blood collection tube or the like is suppressed. Even when the metal ions are released by contact with the substance and the three-dimensional structure is changed, the sample solution can be used for immunochromatography-one test piece 10 before contacting the labeled antibody 15 contained in the labeled portion 13. Contact with metal salt immobilized on As a result, the detection target substance 17 returns to the original three-dimensional structure by taking in the metal ion. Therefore, even when a sample solution is handled using a blood collection tube or the like containing a substance having a chelating effect, the target substance 17 in the sample solution can be accurately measured and detected.
  • the labeled portion 15 contains the labeled antibody 15 labeled with a labeling substance in a state that can be eluted in the sample solution.
  • a labeling substance in a state that can be eluted in the sample solution.
  • Specific examples include, but are not limited to, antibodies labeled with gold colloid.
  • Chromatographic test strips may be prepared by including nucleotides or the like labeled with a labeling substance having a specific sequence in the labeling part 13 in a state that they can be eluted into the sample solution.
  • the metal salt may be carried on at least one of the sample introduction part 12, the part from the sample introduction part 12 to the label part 13, and / or the label part 13.
  • the reaction time between the detection target substance 17 and the metal salt becomes longer, and the three-dimensional structure of the detection target substance 17 becomes large. It is particularly preferable because the return effect is enhanced.
  • the substance 17 to be detected is not particularly limited, but a protein containing a metal salt in its structure can be measured and detected.
  • the detection target substance 17 include CRP, troponin, calmodulin, pulp albumin and the like.
  • the metal ion constituting the metal salt is not limited to the metal ion contained in the detection target substance 17.
  • the metal ion constituting the metal salt is not limited to the metal ion contained in the detection target substance 17.
  • calcium ion, strontium ion, manganese ion, magnesium ion and the like can be mentioned.
  • the metal ion constituting the metal salt is the same as the metal ion contained in the substance 17 to be detected, the affinity between the substance 17 to be detected, the labeled antibody 15 and the immobilized antibody 16 will differ. It is preferable because one does not decrease.
  • the metal salt can be used without any particular limitation as long as it dissolves in the sample solution.
  • the metal salt is a halide salt, a nitrate salt, or a sulfate salt
  • the metal salt has high solubility, so that the metal salt is easily supported on the immunochromatography test piece 10 of the present embodiment, and the metal ion is contained in the sample solution. Is preferred because it easily dissolves.
  • CRP which is one of the markers for infectious disease
  • CRP contains calcium ions in its structure, so the metal ions that constitute the salts of divalent metal ions are calcium ions.
  • the salt of the divalent metal ion is calcium chloride because the solubility is high and the cost is low.
  • the sample liquid may be any of an aqueous solution and an organic solution, and examples thereof include a body fluid, river water, seawater, groundwater, an aqueous solution in which soil and food are dissolved, and the like.
  • a body fluid include blood, plasma, serum, urine, saliva, sweat, and tears.
  • the sample liquid is preferably blood.
  • the amount of the metal salt carried on the immunochromatographic test piece 10 of the present embodiment may be adjusted according to the concentration of the chelating agent that can be contained in the sample solution.
  • the EDTA concentration in the blood obtained from the blood collection tube is generally in the range of 3 mM to 1 O mM. It is preferable to support a metal salt so that metal ions are supplied.
  • the molar concentration of calcium ions is preferably equal to or higher than the molar concentration of EDTA.
  • Both the labeled antibody 15 and the immobilized antibody 16 may be a monoclonal antibody or a polyclonal antibody. However, when a monoclonal antibody is used, it is preferable that steric hindrance does not occur when the labeled antibody 15 and the immobilized antibody 16 are bound via the substance 17 to be detected.
  • Examples of the labeling substance for labeling the labeled antibody 15 include coloring substances, fluorescent substances, phosphorescent substances, luminescent substances, redox substances, enzymes, nucleic acids, vesicles, and the like.
  • examples of the coloring substance include gold colloid, silver colloid, selenium colloid, colored latex, cyanine, and azo. In particular, gold colloid particles are preferably used.
  • Examples of the fluorescent substance include an aromatic compound such as pyrene, an aromatic compound such as dansyl, in which a functional group is substituted, fluorescein, rhodamine, and coumarin.
  • Examples of the phosphorescent substance include benzophenone.
  • Examples of the luminescent substance include substances that cause a luminescent reaction between luciferin and ATP.
  • Examples of the redox substance include substances that generate an electric current by a redox reaction between glucose and glucose oxidase.
  • ERs include micelles and ribosomes, etc.o
  • a base sheet 31 is prepared.
  • the base material sheet 31 is formed of the same material as the base material 11 described above.
  • Cellulose 1> Made of porous materials such as raw membrane, cellulose acetate membrane, glass fiber filter paper, and non-woven fabric.
  • the base sheet 31 is impregnated with a solution in which a metal salt is dissolved, and dried, so that the metal salt-supporting region 32 becomes a labeled antibody labeled with a labeling substance.
  • the metal salt-supporting region 32 becomes a labeled antibody labeled with a labeling substance.
  • the immobilized antibody is immobilized to form the immobilized antibody region 34.
  • the labeled antibody and the immobilized antibody used at this time specifically bind to the substance to be detected.
  • the metal salt-carrying region 32, the labeled antibody-containing region 33, and the immobilized antibody region 34 are formed on the base sheet 31 so as to extend in parallel with each other, and the labeled antibody-containing region 33 is formed of the metal salt. It is formed between the carrying region 32 and the immobilized antibody region 3.
  • the metal salt-carrying region 32, the labeled antibody-containing region 33, and the immobilized antibody region 34 are cut into strips along a direction perpendicular to them.
  • a test piece 10 for immunochromatography of the present embodiment is obtained.
  • FIG. 4 (a) is a top view showing the immunochromatographic test piece of the present embodiment
  • FIG. 4 (b) is a cross-sectional view taken along line X--X shown in FIG. 4 (a).
  • the immunochromatographic test piece 40 of the present embodiment comprises a substrate 41, a label layer 43 provided on the substrate 41, Layer 44, a sample introduction layer 42 provided on the base material 41 and provided in contact with the labeling layer 43, and a sample introduction layer 42 provided on the base material 41 and contacting the immobilization layer 44. And an absorbing layer 46 provided.
  • the material forming the base material 41 is not particularly limited, but it is preferable to use a material that does not pass through the solvent of the sample solution containing the substance to be detected.
  • Specific examples include resins such as polyethylene terephthalate.
  • Materials for forming sample introduction layer 42, labeling layer 43, immobilization layer 44, and absorption layer 46 Is made of a material that impregnates the solvent of the sample solution containing the substance to be detected.For example, it is made of a porous material such as nitrocellulose membrane, cellulose acetate membrane, glass fiber filter paper, and nonwoven fabric. . In particular, a nitrocellulose-based membrane is preferred. These materials can evolve the solvent of the sample solution by capillary action. In the present embodiment, non-woven fabric, Whatman-labeled filter paper, nitrocellulose membrane, and glass are used as materials for forming the sample introduction layer 42, the labeling layer 43, the immobilization layer 44, and the absorption layer 46, respectively. Fiber filter paper is used.
  • the sample introduction layer 42 is a region where a sample solution containing the substance to be detected is introduced (for example, dropped), and carries a metal salt.
  • the labeling layer 43 contains a labeled antibody 15 labeled with a labeling substance, which can be eluted into the sample solution.
  • a labeled antibody (not shown) that specifically binds to the detection target substance is used.
  • An immobilized antibody 45 is immobilized on the immobilization layer 44.
  • an antibody that specifically binds to a detection target substance is used.
  • the absorption layer 46 absorbs the sample liquid from the immobilization layer 44.
  • the sample introduction layer 42 is provided in contact with the labeling layer 43, the sample lost during the development of the sample solution The amount of solvent in the liquid decreases. Therefore, a sufficient amount of the sample solution can be supplied to the labeling layer 43 and the immobilization layer 44.
  • the absorption layer 46 for absorbing the sample liquid since the absorption layer 46 for absorbing the sample liquid is laminated, the extra sample liquid contained in the labeling layer 43 and the immobilization layer 44 can be absorbed.
  • the structure in which the absorbing layer 46 is provided is adopted, but the structure in which the absorbing layer 46 is not provided may be used as necessary.
  • the labeling layer 43 also serves as the sample introduction layer 42
  • the sample solution is directly applied to the labeling layer 43, so that the sample solution is applied to the immunochromatographic test piece 40. Can be introduced.
  • the substance to be detected was measured using the immunochromatographic test piece 10 of the first embodiment.
  • the substance to be detected in the sample solution was detected by visually checking the labeling substance 15 remaining on the immobilization section 14.
  • a substrate 11 (width: 5 mm, length: 50 mm) made of nitrocellulose membrane is immersed in a 10 mM calcium chloride aqueous solution, taken out as it is, and dried until water evaporates to form a sample introduction section 12. did.
  • the anti-CRP serum (immune animals: Goat, Cosmo Bio) was affinity-purified, and an anti-CRP antibody (5 mg / ml) sensitized to gold colloid particles as a labeling substance was used as a labeling antibody 15.
  • the label part 13 was formed by carrying 50 ⁇ l on the dried substrate 11.
  • the prepared immunochromatographic test strip 10 Using the prepared immunochromatographic test strip 10, it contained 3.7 mg of EDTA-2Na, and collected 1 ml of blood into a blood collection tube (manufactured by FALC Obio systems) for measuring blood glucose, HbAl and HbAlc. 50 ⁇ 1 of the collected control blood (CRP lmg / d 1) was introduced into the sample introduction part 12 as a sample solution, and incubated at room temperature for 5 minutes.
  • Example 1 As in Example 1, a control blood (CRP lmg / d1) 50/1 sample was used as the sample solution, except that it was not immersed in an aqueous solution of calcium chloride. Introduced into pieces.
  • the present invention is useful in the fields of environmental measurement, food management and medical diagnosis.

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Description

明糸田書
クロマトグラフィ一用試験片およびその製造方法 技術分野
本発明は、 試料液中の特定成分について、 迅速かつ高精度な定量を簡便に実施 することができるクロマトグラフィー用試験片に関する。 背景技術
従来、 試料液中の特定成分について、 試料液の希釈や撹拌などを行なうことな く簡易に定量する方法として、 ドライケミストリーが提案されている。
ドライケミストリーとは、 フィルムや、 試験紙のような固相マトリクスに乾燥 状態で保存された試薬に対して、 液状の試料を点着させて、 試料液中の検出対象 物質を測定する方法である。
ドライケミストリーに用いるデバイスとしては、 濾紙に試薬を担持させた単層 式と、 展開層、 反応層、 試薬層などを積層させた多層式とがある。 いずれのデバ イスも、 試薬が既に固相マトリクス上に担持されているため、 試薬の調製が不要 で、 小スペースで保存でき、 試料液量を少量しか必要としないこと等が特徴とし てあげられる。
代表的なドライケミストリーによる検査法として、 抗原抗体反応と毛細管現象 を利用した検査法である免疫クロマトグラフィーが挙げられる （例えば、 特開平
1 0 - 7 3 5 9 2号公報に記載されている） 。 免疫クロマトグラフィ一に用いる デバイスとしては、 メンプレンフィル夕一に代表される試料液の溶媒を含浸する 材料からなる固相マトリクスに、 固定化された抗体 （以下、 固定化抗体と略称す る） と標識物質により標識された抗体 （以下、 標識抗体と略称する） が、 それそ れ乾燥状態で担持されている試験片がある。
測定の際に、 図 5 ( a ) に示すように、 検出対象物質 1 0 4を含む試料液を試 験片の一端から導入すると、 図 5 ( b ) に示すように、 標識抗体 1 0 5が試料液 中に溶出可能な状態で含まれている標識部 1 0 2に、 毛細管現象によって試料液 が到達し、 そこで標識抗体 1 0 5と検出対象物質 1 0 4との複合体 1 0 7が形成 される。 さらに、 図 5 ( c ) に示すように、 形成された複合体 1 0 7は試料液の 毛細管現象による流れに沿って、 固定化抗体 1 0 6が担持された固定化部 1 0 3 に到達し、 ここで抗原抗体反応によって固定化抗体 1 0 6に捕らえられる。 複合 体 1 0 7以外のものは毛細管現象の流れにのり、 固定化部 1 0 3を通過するので、 固定化部 1 0 3には複合体 1 0 8だけが残る。 ここで、 標識物質 1 0 5に由来す る出力を測定することによって、 試料液中の検出対象物質 1 0 4の検知ゃ濃度の 測定が可能になる。 抗原抗体反応の形態としては、 サンドイッチ型の反応のほか に競合型の反応を利用する免疫クロマトグラフィー法もあるが、 試験片の構造お よび測定の方法は同様である。
免疫クロマトグラフィ一法を利用した測定方法の利点としては、 上記に示した ドライケミストリーによる利点に加えて、 操作の簡便性、 迅速な判定、 および測 定コストの低下があげられる。 従って、 臨床検査に限らず、 近年着目されている ポイント .ォプ .ケア （以下、 P O Cと略称する） においても、 適用可能である c なお、 P O Cとは、 医療現場において、 検体採取から結果が出るまでの時間の短 縮が最も重要視される臨床検査の総称である。 解決課題
実際の医療現場などで、 上記のような免疫クロマトグラフィー法により検出対 象物質を検出したり、 検出対象物質の濃度を測定する際には、 注射針を用いて採 血管中に取り入れた血液の一部を試料液として用いる。
採血管には用途によって、 いろいろな試薬が含まれている。 例えば血糖、 アル ドステロン、 またはプロスタグランジン E 2測定用の採血管には、 キレート剤で ある E D T Aなどが含まれている。 また、 E G T Aも同様にキレート効果が期待 され、 採血管に添加される可能性がある。 さらにクェン酸、 フ夕ル酸、 シユウ酸 などのカルボン酸類も同様にキレ一ト効果を示すことがあり、 特にクェン酸は採 血管に含まれていることが多い。
検出対象物質が夕ンパク質であり、 且つその夕ンパク質の構造内にカルシウム イオンなどの 2価の金属イオンを含んでいる場合、 上記のキレート効果を有する 物質が試料液中に存在すると、 キレート効果を有する物質がそれを取り込むため、 2価の金属イオンが検出対象物質であるタンパク質の構造内より排出される。 こ のため、 その検出対象物質であるタンパク質の立体構造が変化してしまうことが ある。
例えば、 C R Pは 5つのサブユニットからなる五量体であり、 5つのサブュニ ヅトのうちの 4つにカルシウムイオンが含まれるが、 キレート効果を有する E D T A等と共に溶液内に存在すると、 C R P内よりカルシウムイオンが抜けて立体 構造が変化する。 また、 採血後の血液の保存の状態が悪い場合にも、 C R Pから カルシウムイオンが脱落して立体構造が変化してしまうことがある。
免疫クロマトグラフィー法においては、 2価の金属イオンが含まれた状態の検 出対象物質に結合する抗体を用いているので、 変化した構造の検出対象物質とは 結合しない、 あるいは検出対象物質と抗体とのァフィ二ティ一に変化が生じるこ とがある。 このため、 正確な結果が得られなくなるおそれがある。
本発明は、 上記事情を鑑みてなされたものであり、 試料液中の検出対象物質を 正確に測定することができるクロマトグラフィ—用試験片を提供することを目的 とする。 発明の開示
本発明のクロマトグラフィ一用試験片は、 試料液に含まれる検出対象物質を測 定するためのクロマトグラフィー用試験片であって、 試料導入部と、 標識部と、 固定化部とを有し、 前記試料導入部に導入された前記試料液は、 前記標識部を経 て前記固定化部に移動するように前記試料導入部と、 前記標識部と、 前記固定化 部とが配置された基材からなり、 前記試料導入部、 前記試料導入部から前記標識 部までの間の部分、 及び前記標識部の少なくともいずれかに金属塩が含まれてい る
本発明によれば、 検出対象物質が金属イオンを内部に保持する場合においても、 検出対象物質がキレート効果を有する物質と接触することによって金属イオンを 放出し、 その立体構造が変化しても、 標識部に接触する前に、 試料液が金属塩と 接触する。 このことにより、 検出対象物質は、 金属イオンを取り込んで元の立体 構造に戻る。 従って、 キレート効果を有する物質を含む採血管等を用いて試料液 を取り扱う場合であっても、 試料液中の検出対象物質を正確に測定 ·検出するこ とができる。
前記金属塩は、 前記基材の表面または内部に存在する構成としてもよい。
前記標識部は、 標識物質により標識された、 前記検出対象物質に特異的に結合 する第 1結合物質を含み、 前記固定化部は、 前記検出対象物質に特異的に結合す る第 2結合物質を含む構成としてもよい。
前記第 1結合物質および前記第 2結合物質は、 前記検出対象物質に特異的に結 合する抗体である構成としてもよい。
このことによって、 免疫クロマトグラフィーによる検出対象物質の測定を行な うことができる。
前記金属塩は、 2価の金属イオンの塩である構成としてもよい。
前記 2価の金属イオンは、 カルシウムイオンである構成としてもよい。
前記第 1結合物質および前記第 2結合物質は、 抗 C R P抗体である構成として もよい。
前記金属塩は、 塩化カルシウムである構成としてもよい。
本発明の別のクロマトグラフィー用試験片は、 試料液に含まれる検出対象物質 を測定するためのクロマトグラフィー用試験片であって、 基材と、 前記基材上に 設けられ、 金属塩を備えている試料導入層と、 前記基材上に前記試料導入層に接 触して設けられ、 標識物質により標識された、 前記検出対象物質に特異的に結合 する第 1結合物質を試料液中に溶出可能な状態で含む標識層と、 前記基材上に前 記標識層に接触して設けられ、 前記検出対象物質に特異的に結合する第 2結合物 質を固定化された状態で含む固定化層とを備える。
本発明によれば、 検出対象物質が金属イオンを内部に保持する場合においても、 検出対象物質がキレート効果を有する物質と接触することによって金属イオンを 放出し、 その立体構造が変化しても、 標識部に接触する前に、 試料液が金属塩と 接触する。 このことにより、 検出対象物質は、 金属イオンを取り込んで元の立体 構造に戻る。 従って、 キレート効果を有する物質を含む採血管等を用いて試料液 を取り扱う場合であっても、 試料液中の検出対象物質を正確に測定 ·検出するこ とができる。 また、 本発明によれば、 試料導入層が標識層に接触して設けられて いるため、 試料液の展開の途中で失われる試料液中の溶媒量が減少する。 このた め、 標識層および固定化層に十分な量の試料液を供給することができる。
前記基材上に前記固定化層に接触して設けられた、 前記試料液を吸収するため の吸収層をさらに備える構成としてもよい。
本発明のクロマトグラフィ一用試験片の製造方法は、 試料液に含まれる検出対 象物質を測定するためのクロマトグラフィ一用試験片の製造方法であって、 基材 シートを用意する工程 （a ) と、 前記基材シートに、 金属塩担持領域と、 標識抗 体含有領域と、 固定化抗体領域とを、 それそれが互いに平行に延び、 且つ、 前記 標識抗体含有領域が前記金属塩担持領域と前記固定化抗体領域との間に配置され るように形成する工程 （b ) と、 前記金属塩担持領域、 前記標識抗体含有領域お よび前記固定化抗体領域に対して直交する方向に沿って短冊状に切断する工程 ( c ) とを含み、 前記金属塩担持領域は、 金属塩が担持されており、 前記標識抗 体含有領域は、 標識物質により標識された、 前記検出対象物質に特異的に結合す る第 1結合物質を試料液中に溶出可能な状態で含み、 前記固定化抗体領域は、 前 記検出対象物質に特異的に結合する第 2結合物質を固定化された状態で含む。 このことによって、 試料液中の検出対象物質を正確に測定することができるク 口マトグラフ試験片が得られる。 図面の簡単な説明
図 1は、 免疫クロマトグラフィー用試験片を表す模式図である。
図 2 ( a ) 〜図 2 ( c ) は、 免疫クロマトグラフィー用試験片を用いた測定の 原理を模式的に表す図である。
図 3 ( a ) 〜図 3 ( c ) は、 免疫クロマトグラフィー用試験片の製造方法を示 す工程図である。
図 4 ( a ) は、 免疫クロマトグラフィー用試験片を表す上面図であり、 図 4 ( b ) は、 図 4 ( a ) 中に示す線 X— Xに沿った断面図である。
図 5は、 従来の免疫ク口マトグラフィ一用試験片を用いた測定の原理を模式的 に示す図である。 最良の実施形態
以下、 図を参照しながら本発明の実施の形態を説明する。
(実施形態 1 )
本実施形態では、 免疫クロマトグラフィ一用試験片を図を参照しながら説明す る。 図 1は、 本実施形態の免疫クロマトグラフィー用試験片を表す図であり、 図 2 ( a ) 〜図 2 ( c ) は本実施形態の免疫クロマトグラフィー用試験片を用いた ときの作用を模式的に表す図である。
図 1に示すように、 本実施形態の免疫クロマトグラフィー用試験片 1 0は、 試 料導入部 1 2と、 標識部 1 3と、 固定化部 1 4とを備える基材 1 1から構成され ている。
基材 1 1は、 検出対象物質を含む試料液の溶媒を含浸する材料から形成されて おり、 例えば、 ニトロセルロース性メンブレン、 酢酸セルロース性メンプレン、 ガラス繊維濾紙、 不織布などの多孔質性材料から形成されている。 特に、 ニトロ セルロース性メンプレンが好ましい。 これらの材料は、 毛細管現象によって試料 液の溶媒を展開することができる。
試料導入部 1 2には、 検出対象物質を含む試料液が導入 （例えば、 滴下） され る領域であり、 金属塩が担持されている。
標識部 1 3には、 標識物質で標識された標識抗体 1 5が試料液中に溶出可能な 状態で含まれている。 標識抗体 1 5は、 検出対象物質に特異的に結合するものが 用いられる。
固定化部 1 4には、 固定化抗体 1 6が固定化されている。 固定化抗体 1 6は、 検出対象物質に特異的に結合するものが用いられる。
試料導入部 1 2に担持されている金属塩は、 検出対象物質に応じて選択される c 例えば、 検出対象物質がカルシウムイオンが保持されている C R Pである場合、 C R Pの立体構造を保持するためにカルシウムイオンが供給されるようにカルシ ゥム塩を用いる。 勿論、 このとき、 標識部 1 3および固定化部 1 4にそれそれ含 まれる標識抗体 1 5および固定化抗体 1 6は、 カルシウムイオンが保持されてい る抗 C R P抗体を用いる。
このように、 検出対象物質に応じて、 金属塩と、 標識抗体 1 5および固定化抗 体 1 6とが選択される。
検出対象物質を測定する際には、 本実施形態の免疫クロマトグラフィ一試験片 1 0では以下のような現象が起こる。
まず、 図 2 ( a ) に示すように、 免疫クロマトグラフィー試験片 1 0を用意し、 検出対象物質 1 7を含む試料液を免疫クロマトグラフィー試験片 1 0の一端にあ る試料導入部 1 2に滴下する。 次に、 試料液の溶媒を試料導入部 1 2から固定化 部 1 6に向かって展開すると、 図 2 ( b ) に示すように、 標識部 1 3に、 毛細管 現象によって試料液が到達し、 抗原抗体反応によって標識抗体 1 5と検出対象物 質 1 7との複合体 1 8が形成される。 形成された複合体 1 8は、 試料液の毛細管 現象による流れに沿って、 固定化抗体 1 6が固定化された固定化部 1 3に到達し、 ここで抗原抗体反応によって固定化抗体 1 6に捕らえられ、 図 2 ( c ) に示すよ うに、 複合体 1 9が形成される。 このとき、 複合体 1 8以外のものは毛細管現象 の流れに沿って、 固定化部 1 3を通過するので、 固定化部 1 3には複合体 1 9だ けが残存する。 ここで、 標識物質 1 5に由来する出力を測定 （例えば反射吸光度 などを測定） することによって、 試料液中の検出対象物質 1 7の検出、 試料液中 の検出対象物質 1 7の濃度の測定が可能になる。
特に、 本実施形態の免疫クロマトグラフィー試験片 1 0によれば、 検出対象物 質 1 7が金属イオンを内部に保持する場合においても、 検出対象物質 1 7が採血 管内等に含まれるキレート効果を有する物質と接触することによって金属イオン を放出し、 その立体構造が変化しても、 標識部 1 3に含まれる標識抗体 1 5に接 触する前に、 試料液が免疫クロマトグラフィ一試験片 1 0に固定化された金属塩 と接触する。 このことにより、 検出対象物質 1 7は、 金属イオンを取り込んで元 の立体構造に戻る。 従って、 キレート効果を有する物質を含む採血管等を用いて 試料液を取り扱う場合であっても、 試料液中の検出対象物質 1 7を正確に測定 - 検出することができる。
本実施形態の免疫クロマトグラフィー試験片 1 0では、 標識部 1 3に標識物質 で標識された標識抗体 1 5が試料液中に溶出可能な状態で含まれている。 具体的 には、 金コロイ ドで標識された抗体が挙げられるがこれに限定されない。 例えば、 標識抗体 1 5に代えて、 標識物質で標識された酵素、 リセプ夕一、 D N Aなどの 特異的配列を有する標識物質で標識されたヌクレオチド等を標識部 1 3に試料液 中に溶出可能な状態で含めることによって、 クロマトグラフィー用試験片として もよい。
金属塩は、 試料導入部 1 2、 試料導入部 1 2から標識部 1 3までの間、 及び標 識部 1 3の少なくともいずれかに担持されていればよい。 特に、 試料導入部 1 2、 または試料導入部 1 2に近い場所に担持されていると、 検出対象物質 1 7と金属 塩との反応時間がより長くなり、 検出対象物質 1 7の立体構造が戻る効果が高く なるため、 特に好ましい。
本実施形態の免疫クロマトグラフィー試験片 1 0では、 検出対象物質 1 7を特 に限定しないが、 金属塩をその構造内に含有するタンパク質を測定 ·検出するこ とができる。 検出対象物質 1 7としては、 例えば、 C R P、 トロポニン、 カルモ ジュリン、 パルプアルブミンなどが挙げられる。
本実施形態において、 金属塩を構成する金属イオンは、 検出対象物質 1 7に含 まれる金属イオンのみに限定されない。 例えば、 カルシウムイオン、 ストロンチ ゥムイオン、 マンガンイオン、 マグネシウムイオンなどが挙げられる。
金属塩を構成する金属イオンが、 検出対象物質 1 7に含まれる金属イオンと同 じであると、 検出対象物質 1 7と標識抗体 1 5および固定化抗体 1 6のそれそれ とのァフィ二ティ一が低減しないので好ましい。
なお、 金属塩は試料液中で溶解するものであれば特に限定されず用いることが できる。 特に、 金属塩がハロゲン化物塩、 硝酸塩、 または硫酸塩であると、 溶解 性が高いため、 本実施形態の免疫クロマトグラフィー試験片 1 0への担持が容易 であり、 かつ試料液中に金属イオンが容易に溶け出すので好ましい。
検出対象物質 1 7が、 感染症のマーカーのひとつである C R Pの場合、 C R P はその構造内にカルシウムイオンを含んでいるので、 2価の金属イオンの塩を構 成する金属イオンがカルシウムイオンであることが好ましく、 中でも 2価の金属 イオンの塩が塩化カルシウムであると、 溶解性が高く、 かつ安価なのでさらに好 ましい。
試料液としては、 水溶液および有機系溶液のいずれでもよく、 例えば、 体液、 河川の水、 海水、 地下水、 土壌や食品を溶解させた水溶液等が挙げられる。 この 中で体液としては、 例えば、 血液、 血漿、 血清、 尿、 唾液、 汗及び涙等が挙げら れる。 中でも、 試料液が血液であることが好ましい。
本実施形態の免疫クロマトグラフィー試験片 1 0への金属塩の担持量は、 試料 液に含まれ得るキレート剤の濃度に合わせて調整すればよい。 試料液として、 採 血管から血液を得る場合、 採血管より得られた血液中の E D T A濃度は、 一般に 3 mM〜 1 O mMの範囲内であるので、 この濃度範囲をカバ一するような量の金 属イオンが供給されるように金属塩を担持させておくことが好ましい。 具体的に は、 E D T Aのモル濃度に対してカルシウムイオンのモル濃度が同等以上である ことが好ましい。
標識抗体 1 5および固定化抗体 1 6は、 ともに、 モノクローナル抗体であって もポリクロ一ナル抗体であってもよい。 ただし、 モノクローナル抗体を用いる場 合には、 標識抗体 1 5と固定化抗体 1 6とが検出対象物質 1 7を介して結合する 際に立体障害が生じないようにすることが好ましい。
標識抗体 1 5を標識する標識物質としては、 例えば、 着色物質、 蛍光物質、 燐 光物質、 発光物質、 酸化還元物質、 酵素、 核酸、 小胞体等が挙げられる。 ここで、 着色物質としては、 金コロイ ド、 銀コロイ ド、 セレニウムコロイ ド、 着色ラテツ クス、 シァニン及びァゾ等が挙げられる。 特に、 金コロイ ド粒子が好適に用いら れる。
蛍光物質としては、 ピレン等の芳香族化合物、 ダンシル等の芳香族化合物に官 能基が置換してあるもの、 フルォレセイン、 ローダミンおよびクマリン等が挙げ られる。 燐光物質としては、 ベンゾフエノン等が挙げられる。 発光物質としては、 ルシフェリンと A T Pとの発光反応を生じるものが挙げられる。 酸化還元物質と しては、 グルコースとグルコースォキシダーゼとの酸化還元反応により電流を生 じるものが挙げられる。 小胞体としては、 ミセルおよびリボソーム等が挙げられ る o
次に、 本実施形態の免疫クロマトグラフィー用試験片の製造方法を図 3 ( a ) 〜 （c ) を参照しながら説明する。
まず、 図 3 ( a ) に示すように、 基材シート 3 1を用意する。 基材シート 3 1 は、 上述した基材 1 1と全く同じ材料で形成されたものであり、 例えば、 ニトロ セルロース 1>生メンプレン、 酢酸セルロース性メンプレン、 ガラス繊維濾紙、 不織 布などの多孔質性材料から形成されている。
次に、 図 3 ( b ) に示すように、 基材シート 3 1に金属塩を溶解した溶液を含 浸し、 乾燥させることによって金属塩担持領域 3 2を、 標識物質で標識された標 識抗体を試料液中に溶出可能な状態で含ませることによつて標識抗体含有領域 3 3を、 固定化抗体を固定化することによって固定化抗体領域 3 4を、 それそれ形 成する。 勿論、 このとき用いられる標識抗体および固定化抗体は、 検出対象物質 に特異的に結合するものである。 金属塩担持領域 3 2、 標識抗体含有領域 3 3お よび固定化抗体領域 3 4は、 基材シート 3 1上にそれそれ互いに平行に延びるよ うに形成され、 標識抗体含有領域 3 3が金属塩担持領域 3 2と固定化抗体領域 3 との間に形成される。
次に、 金属塩担持領域 3 2、 標識抗体含有領域 3 3および固定化抗体領域 3 4 に対して直交する方向に沿って短冊状に切断することによって、 図 3 ( c ) に示 すように、 本実施形態の免疫クロマトグラフィー用試験片 1 0が得られる。
(実施形態 2 )
上記実施形態 1では、 単層型の免疫ク口マトグラフィ一用試験片を参照しなが ら説明したが、 本実施形態では多層型の免疫クロマトグラフィ一用試験片を説明 する。 図 4 ( a ) は、 本実施形態の免疫クロマトグラフィー用試験片を表す上面 図であり、 図 4 ( b ) は、 図 4 ( a ) 中に示す線 X— Xに沿った断面図である。 図 4 ( a ) および （b ) に示すように、 本実施形態の免疫クロマトグラフィー 用試験片 4 0は、 基材 4 1と、 基材 4 1上に設けられた標識層 4 3および固定化 層 4 4と、 基材 4 1上に設けられ、 標識層 4 3に接触して設けられた試料導入層 4 2と、 基材 4 1上に設けられ、 固定化層 4 4に接触して設けられた吸収層 4 6 とを備える。
基材 4 1を形成する材料としては、 特に限定されないが、 検出対象物質を含む 試料液の溶媒を透過しない材料を用いることが好ましい。 具体的には、 ポリェチ レンテレフ夕レートなどの樹脂が挙げられる。
試料導入層 4 2、 標識層 4 3、 固定化層 4 4および吸収層 4 6を形成する材料 は、 検出対象物質を含む試料液の溶媒を含浸する材料から形成されており、 例え ば、 ニトロセルロース性メンブレン、 酢酸セルロース性メンプレン、 ガラス繊維 濾紙、 不織布などの多孔質性材料から形成されている。 特に、 ニトロセルロース 性メンプレンが好ましい。 これらの材料は、 毛細管現象によって試料液の溶媒を 展開することができる。 なお、 本実施形態では、 試料導入層 4 2、 標識層 4 3、 固定化層 4 4および吸収層 4 6を形成する材料として、 それそれ不織布、 ワット マン標識ろ紙、 二トロセルロースメンプレンおよびガラス繊維ろ紙が用いられて いる。
試料導入層 4 2には、 検出対象物質を含む試料液が導入 （例えば、 滴下） され る領域であり、 金属塩が担持されている。
標識層 4 3には、 標識物質で標識された標識抗体 1 5が試料液中に溶出可能な 状態で含まれている。 標識抗体 （不図示） は、 検出対象物質に特異的に結合する ものが用いられる。
固定化層 4 4には、 固定化抗体 4 5が固定化されている。 固定化抗体 4 5は、 検出対象物質に特異的に結合するものが用いられる。
吸収層 4 6は、 固定化層 4 4から試料液を吸収する。
本実施形態の多層型の免疫クロマトグラフィー用試験片 4 0によれば、 試料導 入層 4 2が標識層 4 3に接触して設けられているため、 試料液の展開の途中で失 われる試料液中の溶媒量が減少する。 このため、 標識層 4 3および固定化層 4 4 に十分な量の試料液を供給することができる。
また、 試料液を吸収するための吸収層 4 6が積層されているので、 標識層 4 3 および固定化層 4 4に含まれる余分な試料液を吸収することができる。 なお、 本 実施形態では、 吸収層 4 6を設ける構成としているが、 必要に応じて設けない構 成としても構わない。
さらに、 標識層 4 3が試料導入層 4 2を兼ねる構成としても、 その場合には標 識層 4 3に試料液を直接点着することにより、 免疫クロマトグラフィ一用試験片 4 0に試料液を導入することができる。 実施例 以下に、 具体的な実施例を挙げて、 本発明をより詳細に説明する。
(実施例 1)
本実施例では、 上記実施形態 1の免疫クロマトグラフィー用試験片 10を用い て検出対象物質の測定を行なった。 なお、 固定化部 14に留まった標識物質 15 を目視で確認することによって、 試料液内の検出対象物質を検出した。
一免疫クロマトグラフィー用試験片の作製一
二トロセルロースメンプレン製の基材 11 (幅 5 mm、 長さ 50 mm) を 10 mMの塩化カルシウム水溶液に浸潰し、 そのまま取り出して、 水分が蒸発するま で乾燥し、 試料導入部 12を形成した。 次に、 抗 CRP血清 （免疫動物：ャギ、 コスモバイオ製） をァフィ二ティー精製し、 標識物質として金コロイ ド粒子に感 作させた抗 CRP抗体 （5mg/ml) を標識抗体 15として、 乾燥させた基材 11に 50 Ο l担持させることにより標識部 13を形成した。 次に、 ニトロセ ルロースメンブレンに 200 m 1の抗 CR Pモノクローナル抗体 ( 2. 5 mg/ ml ： O-CRP-MCA, オリエンタル酵母社製） を滴下し乾燥させることに よって、 固定化抗体 16として抗 CRPモノクローナル抗体を吸着させた二トロ セルロースメンブレンを作製した。 続いて、 得られたニトロセルロースメンブレ ンを基材 11上に貼付して固定化部 14を形成し、 図 1に示す免疫クロマトグラ フィー用試験片 10を得た。
作製した免疫クロマトグラフィー用試験片 10を用いて、 EDTA— 2Naを 3. 7mg含有し、 血糖、 HbAlおよび HbAl c測定用の採血管 （FALC Ob i o sys t ems社製） に採血量 1 mlで採取したコントロール血液 （C RP lmg/d 1) のうちの 50〃 1を試料液として試料導入部 12に導入し、 5分間室温でィンキュベ一トした。
目視の結果、 固定化部 14に金コロイ ドの赤紫色が確認できた。 このことから、 試料液中の検出対象物質である C R Pを検出することができた。
なお、 本実施例において、 様々な濃度の CRPを含有する血液を免疫クロマト グラフィ一用試験片 10に適用し、 デンシトメ一夕一を用いて、 固定化部 14に おける標識物質を測定したところ、 血液中の C R P濃度と標識物質の濃度に比例 関係があることを確認できた。 (比較例 1)
実施例 1と同様にコントロール血液 （CRP lmg/d 1) 50 / 1を試料液 として、 塩化カルシウム水溶液に浸潰しない以外、 上記実施例 1と同様に作製さ れた免疫ク口マトグラフィ一用試験片に導入した。
目視の結果、 固定化部に色の変化が生じなかったことから、 試料液中の検出対 象物質である CRPを検出することができなかった。 上記のように、 本発明の免疫クロマトグラフィー用試験片によれば、 キレート 効果を有する物質を含む採血管等を用いて試料液を取り扱う場合であっても、 試 料液中の検出対象物質を正確に測定することができる。 産業上の利用可能性
本発明は、 環境測定、 食品管理および医療診断の分野において有用である。

Claims

請求の範囲
1 - 試料液に含まれる検出対象物質を測定するためのクロマトグラフィー用試 験片であって、
試料導入部と、 標識部と、 固定化部とを有し、 前記試料導入部に導入された前 記試料液は、 前記標識部を経て前記固定化部に移動するように前記試料導入部と、 前記標識部と、 前記固定化部とが配置された基材からなり、
前記試料導入部、 前記試料導入部から前記標識部までの間の部分、 及び前記標 識部の少なくともいずれかに金属塩が含まれている、 クロマトグラフィー用試験 片。
2 . 請求項 1に記載のクロマトグラフィー用試験片において、
前記金属塩は、 前記基材の表面または内部に存在する、 クロマトグラフィー用 試験片。
3 . 請求項 1に記載のクロマトグラフィ一用試験片において、
前記標識部は、 標識物質により標識された、 前記検出対象物質に特異的に結合 する第 1結合物質を含み、
前記固定化部は、 前記検出対象物質に特異的に結合する第 2結合物質を含む、 クロマトグラフィー用試験片。
4 . 請求項 3に記載のクロマトグラフィ一用試験片において、
前記第 1結合物質および前記第 2結合物質は、 前記検出対象物質に特異的に結 合する抗体である、 クロマトグラフィー用試験片。
5 . 請求項 1に記載のクロマトグラフィ一用試験片において、
前記金属塩は、 2価の金属イオンの塩である、 クロマトグラフィー用試験片。
6 . 請求項 5に記載のクロマトグラフィ一用試験片にお'いて、
前記 2価の金属イオンは、 カルシウムイオンである、 クロマトグラフィー用試 験片。
7 . 請求項 6に記載のクロマトグラフィー用試験片において、
前記第 1結合物質および前記第 2結合物質は、 抗 C R P抗体である、 クロマト グラフィー用試験片。
8 . 請求項 5に記載のクロマトグラフィ一用試験片において、
前記金属塩は、 塩化カルシウムである、 クロマトグラフィー用試験片。
9 . 試料液に含まれる検出対象物質を測定するためのクロマトグラフィー用試 験片であって、
基材と、
前記基材上に設けられ、 金属塩を備えている試料導入層と、
前記基材上に前記試料導入層に接触して設けられ、 標識物質により標識された、 前記検出対象物質に特異的に結合する第 1結合物質を試料液中に溶出可能な状態 で含む標識層と、
前記基材上に前記標識層に接触して設けられ、 前記検出対象物質に特異的に結 合する第 2結合物質を固定化された状態で含む固定化層と、
を備える、 クロマトグラフィー用試験片。
1 0 . 請求項 9に記載のクロマトグラフィ一用試験片において、
前記基材上に前記固定化層に接触して設けられた、 前記試料液を吸収するため の吸収層をさらに備える、 クロマトグラフィー用試験片。
1 1 . 試料液に含まれる検出対象物質を測定するためのクロマトグラフィー用試 験片の製造方法であって、
基材シートを用意する工程 （a ) と、
前記基材シートに、 金属塩担持領域と、 標識抗体含有領域と、 固定化抗体領域 とを、 それそれが互いに平行に延び、 且つ、 前記標識抗体含有領域が前記金属塩 担持領域と前記固定化抗体領域との間に配置されるように形成する工程 （b ) と、 前記金属塩担持領域、 前記標識抗体含有領域および前記固定化抗体領域に対し て直交する方向に沿って短冊状に切断する工程 （c ) とを含み、
前記金属塩担持領域は、 金属塩が担持されており、
前記標識抗体含有領域は、 標識物質により標識された、 前記検出対象物質に特 異的に結合する第 1結合物質を試料液中に溶出可能な状態で含み、
前記固定化抗体領域は、 前記検出対象物質に特異的に結合する第 2結合物質を 固定化された状態で含む、 クロマトグラフィー用試験片の製造方法。
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