JPH1010125A - 全血の一工程アッセイ方法および装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、細胞および細胞成分を含み、または含む疑い
のある流体試験サンプルの対象の被分析物のアッセイに
おいて使用するための装置から成る。本発明の装置は各
々、試験サンプルの非細胞画分から細胞画分を分離する
ための親水性細胞トラップを含む。非細胞画分は、装置
の多孔性、吸収性または吸湿性膜を通って移動し、それ
らの膜は、染料ゾーン、試験ゾーンおよび対照ゾーンを
含む少なくとも３つの別々のゾーンにおいて試薬が含浸
されている。対照ゾーンにおける明確に目に見えるパタ
ーンの形成は、試験が適正に行われたことを示し、試験
ゾーンにおける目に見えるパターンの形成または相対強
度は、試験サンプルにおける被分析物の有無を示す。本
発明の装置は、特に、赤血球および他の細胞を血液から
予め分離することなく、また液相での反射率を測定する
必要なく、全血におけるリガンドをアッセイするのに適
している。本発明のアッセイを行うための方法も開示す
る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、生物学的流体サン
プルをアッセイするための方法および装置に関する。特
に、本発明は、アッセイを行う前にサンプルから細胞画
分を分離する必要のない、全血サンプル中の被分析物を
検出するための方法および装置に関する。

【０００２】

【従来の技術】種々の体液のアッセイで使用するため
の、試薬を含浸させた毛管膜の開発により、使用が簡単
で、比較的迅速に（例えば、10分以内に）結果が得られ
る試験装置を生産することが可能になった。おそらく、
そのような装置の最も一般的な応用は、ヒトの妊娠指示
薬としてのヒト絨毛性ゴナドトロピンの検出にある。そ
のような装置の例は、本出願人による米国特許 No. 5,3
84,264ならびに EPO公開公報 No. 0560411A2、PCT 出願
No. PCT/GB/00322 および米国特許 No. 4,366,241に記
載されている。それらの最も簡単な形態では、そのよう
な装置により、アッセイおよび結果の読み取りを一工程
で行うことができる。例えば、液体サンプル（尿など）
を吸収性の膜に載せると、その中にある対象の被分析物
が対応するリガンドに結合し、結果（すなわち、特定の
複合体の生成）が、サンプル装填ゾーンから分離した検
出ゾーンにおいて視覚的に示される。

【０００３】そのような装置は、典型的には比較的大き
い細胞を含まない（従って、毛管作用などにより試薬含
浸膜を容易に通過する）体液のアッセイに対しては十分
機能するが、全血などの大きい細胞を含む体液における
被分析物のアッセイに対しては適応できていない。その
代わりに、全血に存在する被分析物のアッセイは、典型
的には、実質的に細胞を含まない血漿または血清画分に
対して行われ、従って、サンプルは、アッセイを行う前
に赤血球および他の細胞を除く必要がある。

【０００４】米国特許 No. 5,304,468に記載の装置は、
表向きは、被分析物、特にグルコースをアッセイする前
に全血から血漿または血清画分を単離する必要を回避す
るものである。記載された装置（試験片）は、向かい合
うサンプル導入表面および試験表面を含み、後者に試薬
を含浸させる。陽性または陰性の結果は、光学的に検出
される試験表面での反射率の変化によって示される。開
示によれば、反射率の変化の検出は、試験サンプル中の
赤血球の存在の影響を受けないので、全血サンプルは、
サンプル導入表面に適用してもよい。しかし、結果は反
射率の変化で測定されるので、開示された装置を使用し
てアッセイを行うためには、光学測定装置が必要であ
る。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、アッセイを
行う前にサンプル中の細胞から非細胞液体画分を分離す
る必要なく、細胞含有流体サンプル中の被分析物の一工
程アッセイを行うための装置および方法から成る。さら
に、本発明は、サンプル中の細胞成分を除くための疎水
性フィルムの使用または、それに続く除いた成分をアッ
セイ装置から除去するための洗浄工程を必要としない。
さらに、本発明に従って行われたアッセイの結果は、別
の測定装置を使用することなく、また、試験サンプルの
反射率に関係なく、視覚的に読み取ることができる。す
なわち、本発明によるアッセイを行うには、必要量の試
験サンプル（好ましくは、全血）を本発明の装置に導入
し、次いで、短時間に装置の検出ゾーンに現れる色の変
化などを観察するだけでよい。

【０００６】このために、本発明の装置は、試験サンプ
ルを親水性サンプル導入膜に導入する箇所に細胞トラッ
プを含む。該トラップは、好ましくは被分析物サンプル
中の細胞の予想される直径より小さい有効直径の孔を有
する層状の親水性メッシュであり、これを、サンプル導
入膜と流体連絡するように配置する。すなわち、使用に
際しては、試験サンプルの流体画分のみが細胞トラップ
を通過してサンプル導入膜に入る。次いで、サンプル導
入膜に入った流体は、その膜を通って試薬含浸染料ゾー
ンに入った後、試験および対照ゾーンに入る。本発明の
装置の最も好ましい態様では、陽性または陰性の試験結
果を誘導するために、視覚的に検出できる特定の染料
（金属含有無機化合物のゾルなど）を使用する。

【０００７】本発明の装置は、装置の種々の成分を含む
試験片およびカセットなど、適切などんな形状であって
もよい。本発明の方法によれば、少量の試験サンプル
（好ましくは、全血）をピペットにより、または滴下も
しくは他の方法（例えば、指に針を刺して直接接触させ
る）により、細胞トラップに入れる。サンプルに存在す
る（分離した細胞成分の膜に結合していない）被分析物
と１種以上の特異的リガンドとの結合により、試験結果
を示す特定の視覚的パターンが形成される。

【０００８】本発明を使用すると、少なくとも１種類の
特異的リガンド（結合相手）が公知である（例えば、ポ
リクローナルまたはモノクローナル抗体）、流体サンプ
ルに存在するどんな被分析物（例えば、全血中の可溶抗
原）も検出することができる。本発明は、特に、感染性
および非感染性病原体と関連した、モノエピトープおよ
びポリエピトープ抗原および抗体ならびに生理学的化合
物および薬物の検出に有用である。本発明の装置は、全
血サンプルのアッセイで特に使用することができるが、
他の液体サンプル、特に、細胞またはそれに匹敵する大
きさの他の妨害粒子が存在することが知られているサン
プルのアッセイに使用することもできる。

【０００９】

【課題を解決するための手段】

１．定義 理解を容易にするために、本明細書全体にわたって下記
の定義を適用する。 ａ）被分析物 １個以上の結合部位（例えば、エピトープ）、すなわ
ち、別の分子または化合物が結合する箇所を含む分子ま
たは化合物。 ｂ）リガンドおよび結合対 被分析物上の特定の結合部位に結合して「結合対」を形
成する分子または化合物。対象のどの被分析物／リガン
ド結合対も本発明に使用することができる。構造的に
は、リガンドとして、タンパク質、ペプチド、炭水化
物、多糖、核酸、オリゴヌクレオチド、ハプテンおよび
それらの組み合わせが挙げられる。機能的には、リガン
ドとして、抗体、抗原（例えば、微生物抗原、前立腺特
異抗原）、ホルモン（例えば、甲状腺刺激ホルモン）、
薬物、酵素、アレルゲンならびにそれらの断片、変異体
および組み合わせが挙げられるが、それらに限定されな
い。当業者であれば、そのようなリガンドおよび対応す
る結合対には精通しており、または容易に特定すること
ができる。

【００１０】ｃ）試験サンプル 特定のアッセイが特異的である、対象の被分析物を含む
疑いのある流体。 ｄ）標識 試験サンプル中の対象の被分析物の有無または濃度範囲
を示すためのアッセイで使用される、信号（色の変化な
ど）の形成を直接的または間接的に媒介する分子または
化合物。標識としては、酵素、蛍光体、リポゾーム、赤
血球ゴースト、ポリマーマイクロカプセル、着色ポリマ
ー粒子（ラテックス）が挙げられ、好ましくは、金属含
有化合物のゾルが挙げられる。

【００１１】ｅ）金属標識 金属含有ゾル、すなわちポリマーと混合した、もしくは
ポリマー核上に被覆した酸化金属、水酸化金属、金属
塩、金属もしくは金属含有化合物などの金属または金属
化合物の標識。これらの金属標識は、上述した金属また
は金属化合物ゾルの脱水形態を含むことができ、好まし
くは、コロイド状の金の脱水形態を含む。 ｆ）複合体 使用されている文脈に応じて、「複合体」は、被分析物
および１種以上のリガンドによって形成される、または
標識リガンドおよび固定化リガンドによって形成される
いずれかの多重分子複合体を意味する。サンドイッチ型
イムノアッセイでは、例えば次の複合体：アッセイで最
初に生成する被分析物／標識リガンド二重型（「第一複
合体」）およびアッセイで二番目に生成する被分析物／
標識リガンド／固定化リガンド三重型（「第二複合
体」）が生じる。

【００１２】ｇ）細胞成分 細胞膜ならびにミトコンドリアおよび核などの細胞内構
造を意味する。 ｈ）非細胞画分 その中に存在する被分析物および本発明の装置の細胞ト
ラップに捕獲されなかった細胞成分を含む、試験サンプ
ルの液相を意味する。

【００１３】２．本発明の装置の好ましい態様 本発明の装置は、本発明の材料要素を含むどんな形状ま
たは立体配置もとることができるが、装置の好ましい立
体配置は、本発明の装置の内部成分を含む試験片および
カセットである。すなわち、本発明の装置は、本明細書
では、試験片およびカセット型装置として記載するが、
本発明は、これらの特定の立体配置に限定するものと理
解されるものではない。

【００１４】本発明に従って構成される試験片を図１に
示す。図の左側に、細胞トラップ１を、サンプル導入膜
３の上にある層状メッシュとして示す。試験サンプルを
入れるための細胞トラップ１への通路は、カバー５にあ
る窓４によって得られる。カバー５は、試験片の上部表
面全部または一部にわたって延びた疎水性材料の薄層ま
たはフィルムである。カバー５は試験片から省くことが
できるが、窓４によりサンプルを正確に入れるのを助
け、細胞トラップ１を汚染から保護し、細胞トラップ１
のサンプル導入膜３からの分離を防ぐ役目がある。すな
わち、本発明の試験片にカバー５を含めるのが好まし
い。

【００１５】カバー５に向かい合うのは、薄い疎水性の
基板６である。基板６は、下記の試験片の全ての機能成
分の硬質支持体として、また、流体が試験片から出て装
置の底表面を通過するためのバリヤとして作用する。カ
バー５および基板６として使用するのに適した材料とし
ては、セルロース誘導体、ポリビニル化合物およびポリ
アクリル化合物ならびに他の固体ポリマーが挙げられ、
それらはカバー５および基板６を形成するために使用す
ることができ、または、カバーもしくは基板が異なる材
料（紙など）で構成される場合の被覆材として使用する
ことができる。カバー５および基板６の試験片における
好ましい位置を図２に示す。

【００１６】細胞トラップ１の構造は、図３にさらに詳
細に示す。図３に示すように、細胞トラップ１は重複す
る横断面に配向した多層繊維（繊維６ａおよび６ｂで表
す）から成り、メッシュを形成している（重複する繊維
の下にある層は幻影で示す）。重複する繊維によって形
成される孔は、試験サンプル中の赤血球または他の細胞
の予想される直径を越えてはならず、好ましくは該直径
未満である。濾過を容易にするために、細胞トラップの
上部繊維層の孔の大きさは、下部繊維層における孔の大
きさと異なっていてもよい。本明細書では、細胞トラッ
プのある層における最も小さい孔の大きさを、細胞トラ
ップの有効な孔の大きさとする。ヒトの赤血球の場合、
平均直径は 7.7μであり、平均の厚さは約２μである。
理解を容易にするために、細胞トラップ１で分離すべき
細胞は、本明細書では赤血球とするが、理解されるよう
に、本発明は、赤血球を含む試験サンプルでの使用に限
定されない。

【００１７】図３（他の図とはスケールが異なる）に示
すように、細胞トラップ１の各孔（孔７によって表す）
の有効サイズは、捕獲される細胞の大きさ（図３で細胞
１０によって表す）より幾分小さい。各孔の境界を形成
する繊維は、試験サンプルに触れても変形しないよう
に、すなわち孔の大きさが拡大しないように堅く編んで
ある。細胞を効率的に分離するために、一般的には、細
胞トラップ１の有効な孔の大きさが、捕獲すべき細胞の
予想される直径より少なくとも 10 % 小さいのが好まし
い。本発明の範囲内では、試験サンプルは、異質の細胞
集団を含んでいてもよい。そのような場合、有効な孔の
大きさは、試験サンプル中の最も小さい細胞の直径より
少なくとも 10 % 小さいのが好ましい。また、より小さ
い孔を使用すると、本発明装置の細胞成分および全細胞
の捕獲能を高めることができる。全ての場合において、
孔の大きさは、試験サンプルの非細胞流体画分の通過が
妨げられて、孔を通ってサンプル導入膜３に入ことがで
きないほど小さくあるべきではない。

【００１８】当業者であれば理解されるように、試験サ
ンプル中に存在する赤血球または他の細胞は、予想され
る大きさでない可能性があり、予想よりも小さい場合
は、細胞トラップ１の孔を通過することができるだろ
う。すなわち、細胞トラップ１の捕獲能を高めるために
は、少なくとも２層、好ましくは３層より多くの重複す
る繊維が一層ごとに横切る方向に積み重なって細胞トラ
ップ１を形成する。

【００１９】さらに、図３には均一に重複する繊維を示
すが、当業者であれば理解されるように、よりランダム
に配向した繊維を細胞トラップ１に使用してもよい。そ
のような構造では、孔の全てが均一の大きさとはならな
い。従って、細胞トラップ１に載せた被分析物サンプル
中の赤血球が重複した繊維の１層以上を通過する可能性
がある。細胞トラップ１の重複した繊維の各層は、表面
層で捕獲されない細胞がトラップのより深い層で捕獲さ
れるよう、横断するように配向させるべきである。その
ためには、細胞トラップ１は、少なくとも３層の重複す
る繊維を含むことが好ましい。試験サンプルの非細胞流
体画分がより容易に細胞トラップ１を通ってサンプル導
入膜３にしみ込むようにするために、細胞トラップ１
は、好ましくは、全厚が 0.1 mm 〜 3 mm である。細胞
トラップ１の窓４（図１）から試験サンプルを入れるた
めに利用できる表面積は、試験サンプルの体積および入
れる方法に応じて変わり、本発明によるほとんどの全血
サンプルの試験の場合、約 3mm² 〜 25 mm² の表面積
が適切であると予想される。

【００２０】細胞トラップ１の繊維は、赤血球を捕獲す
るための特定の電荷または個々の厚さを有する必要はな
い。しかし、被分析物サンプルの非細胞画分が細胞トラ
ップ１を通ってサンプル導入膜３に入るのを助けるため
に、細胞トラップ１は、流体がトラップの孔をしみ通る
のを妨げられないように、幾分か親水性であるのが望ま
しい。記載した特徴を有する繊維材料であればいずれも
細胞トラップ１として使用することができる。層状のナ
イロンまたはセルロースフィルター材料（ニトロセルロ
ースなど）の完成したパッドまたは細片を使用すると便
利である。

【００２１】図１に戻ると、サンプル導入膜３は細胞ト
ラップ１の下に位置し、細胞トラップ１と流体連絡して
いる。本明細書において、「流体連絡」は、互いに接触
しているが、必ずしも固定している必要はない構造を意
味する。好ましくは、サンプル導入膜３は細胞トラップ
１よりも多孔性であり、また、細胞トラップ１からの流
体の一方向の流動を容易にするために幾分かはより親水
性である。あるいは、細胞トラップ１を形成するために
使用される材料によってサンプル導入膜３を形成しても
よい。

【００２２】図１に示すように、サンプル導入膜３は完
全に細胞トラップ１のすぐ下に置く。しかし、図１の試
験片の構造全体が記載されていると、当業者であれば、
サンプル導入膜３は、細胞トラップ１のすぐ下に、試薬
含浸膜 20 に向かう流動方向に対して斜めに置き得るこ
とが認識される。本発明装置の全ての態様において、サ
ンプル導入膜３および細胞トラップ１は、流体連絡の状
態にあるべきである。

【００２３】サンプル導入膜３が細胞トラップ１よりも
高度な多孔性を有する別の材料である場合は、吸収性、
多孔性、吸湿性または他のどんな親水性材料も膜の形成
に使用することかできる。そのような材料の例は周知で
あり、堅く織った紙、ニトロセルロース、繊維ガラスお
よび多孔性プラスチック（高分子量ポリプロピレンおよ
びアクリロニトリルなど）が挙げられる。好ましくは、
選択される材料の多孔性が、２、３秒で約 20 〜 40 μ
l の血液の流体成分を吸収するのに十分であるようにす
る。本発明の試験片を使用する方法に関して後にさらに
記載するように、好ましくは、アッセイ中にサンプル導
入膜３の近接端に緩衝液を載せて、比較的少量の被分析
物サンプルが試験片の種々の膜を進むのを助ける。この
ために、緩衝液ゾーン１３を図１に幻影で示す。

【００２４】理解されるように、緩衝液は、本発明の装
置を使用して行うことができる全てのアッセイの実施に
重要というわけではない。すなわち、全ての流体流動
を、試験サンプルから得られる液体によって付与するこ
ともできる。しかし、緩衝液を使用すると、一般に、必
要な試験サンプルの量が最少になり、アッセイをより速
く完了することができる。

【００２５】サンプル導入膜３は、染料含浸膜１５と流
体連絡している。特に、１種以上の標識リガンド（例え
ば、抗体または抗原）は、可溶アミノシランまたは当業
者に周知の他の適する結合手段の使用によって、多孔
性、吸収性または吸湿性膜に結合する。好ましい膜材料
は、例えば Lydall, Inc. から "MANNIWEB" または "MA
NNIGLAS"の商品名で市販されているような繊維ガラスで
ある。他の適する材料としては、ポリエチレンまたはニ
トロセルロースのパッドおよび細片が挙げられ、これら
の材料にリガンドを結合させる手段は周知である。ある
いは、染料含浸膜１５が、サンプル導入膜３の一部であ
ってもよい。しかし、標識したリガンドのサンプル導入
膜３への逆流を最少にするために、染料含浸膜１５は別
個の構造体であるのが好ましく、最も好ましくは、一般
に、下記に記載する試薬含浸膜の方向に配向した繊維を
含む繊維材料（上述した繊維ガラスなど）である。

【００２６】標識したリガンドは、周知の手段に従って
調製される。視覚的に明らかな反応を生じるために、金
属含有ゾルの標識が好ましく、コロイド状の金またはセ
レンの標識が最も好ましい。適する製品の例としては、
Janssen Life Sciences Productsから市販されているコ
ロイド状の金がある。これらのコロイド状金属は、さら
に試薬を添加することなく、視覚的に特徴的なパターン
を生じる。しかし、蛍光体（フルオレセインなど）およ
び酵素（米国特許 No. 4,275,149（参考文献として本明
細書に含まれている）で特定される酵素など）を使用す
ることもできる。試験サンプルと標識したリガンドとの
接触を最大にするために、後者の占める領域（試験ゾー
ン２１および対照ゾーン２２）は、その膜の一方の側か
ら他方の側に伸びるのが好ましい。

【００２７】第一の固定化リガンドは、試験ゾーン２１
（染料含浸膜１５に近接して置かれる）の試薬含浸膜２
０上で固定化される。これが、サンプル試験領域の位置
となる。試薬含浸膜２０は好ましくは、試験片の寿命お
よび試験で生じる視覚的反応の明確さを高めるためにゼ
ラチンで被覆した多孔性細片である。第一の固定化リガ
ンドは、周知の手段、例えば共有結合または不溶タンパ
ク質被覆表面への付着など（例えば、米国特許 No. 4,2
00,690（参考文献として本明細書に含まれている）参
照）によって試薬含浸膜２０に固定して結合させること
ができる。

【００２８】好ましくは、第一の固定化リガンドが占め
る領域は、試験ゾーン２１において試薬含浸膜２０の端
から端に伸びた棒または楕円形の形を有する。棒などの
単純で、一方向の配置を使用することにより、より複雑
な形（「＋」または「−」など）が特定の結果を示すた
めに十分形成されているかどうかを調べる必要性が回避
される。さらに、簡単な形状を使用することにより、立
ち上がり縁効果の影響が克服され、結果の視覚的解釈が
より容易になる。

【００２９】第二の固定化リガンドは、染料含浸膜１５
に遠い対照ゾーン２２に位置する。第二の固定化リガン
ドは、標識したリガンドの少なくとも一つに対して特異
的な親和性を有するべきである。第二の固定化リガンド
の固定化は、上記の第一の固定化リガンドに関して記載
した方法と同様にして行うことができる。比較を容易に
するために、対照ゾーン２２の形状および向きは、試験
ゾーンの形状および向きと同様にすべきである。当業者
であれば理解されるように、試薬含浸膜２０上の試験ゾ
ーン２１および対照ゾーン２２の位置を逆にして、前者
が染料含浸膜１５に遠く、後者が近接するようにしても
よい。

【００３０】吸収性パッド２３は、試薬含浸膜２０と流
体連絡し、過剰の流体の貯臓器として、および試薬含浸
膜２０に沿った一方向流体流を付与するためのポンプと
して作用する。後者のためには、吸収性パッド２３が好
ましくは、試薬含浸膜２０とその対照ゾーン２２に遠い
端で重複する。。当業者であれば理解されるように、本
発明のいくつかの態様は、吸収性パッドを含まなくても
よい。その機能は、例えば、試薬含浸膜２０の末端を延
ばすことにより満たすことができる。しかし、最適に行
うためには、吸収性パッドを含む態様が好ましい。

【００３１】試験片の使用に対する指示は、試験片のカ
バーまたはパッケージに印刷することができ、および／
または印刷物に印刷して試験片とともにパッケージす
る。好ましくは、試験片は、試験片、使用説明書、乾燥
剤の包み、試験サンプルを計量するための毛管装置、緩
衝液、緩衝液を計量するためのピペットならびに被分析
物サンプルを試験片に載せた後に緩衝液および試験片の
緩衝液導入ゾーンを入れるカップなどの反応チャンバー
で構成されるキットの一部である。アッセイ法を行う際
に使用するそのようなキットの構成物品（例えば、印刷
された使用説明書は除く）は、好ましくは、１つ以上の
密閉したパッケージ（ホイルの包みなど）に入れて密封
すべきである。

【００３２】３．別の態様：容器の装置 あるいは、本発明の試験片に関して記載した成分は全て
（カバー５および基板６を除く）、図４に示すように、
固体プラスチックのベース２６にしっかり適合する固体
プラスチックカバー２５で構成される流体を通さないハ
ウジングに入れることができる。試験サンプルを細胞ト
ラップ１に入れるための穴２７は、カバー２５に置く。
好ましい態様では、緩衝液を装置に入れるための穴２８
もカバー２５に置く。しかし、試験サンプルおよび緩衝
液を同じ穴を通して入れる他の態様も本発明の範囲内で
ある。試薬含浸膜２０を見るための表示穴２９もカバー
２５に置く。

【００３３】本発明で使用するための特に好ましいカセ
ット設計は、米国特許 No. 5,384,264に開示されてお
り、該特許の明細書はその範囲で参考文献として本明細
書に含まれている。No. 5,384,264 特許および本明細書
により構成されるカセット装置を図５の分解図で簡単に
示す。これを見ると、ベース２６は明瞭に２つの領域に
分かれることが分かる。第一は底面３１、側壁３２およ
びスロープ３３によって定義される窪み３０である。好
ましい態様では、垂直のバー３４（図示していない）が
カバー２５から窪み３０にスロープ３３とちょうど隣接
して下方に伸びており、染料含浸膜１５がスロープ３３
に沿って正しい位置に保持される。

【００３４】基板２６の第二の領域は、スロープ３３の
上部で始まり、窪み３０に平行に離れて伸びた台３６を
形成する拡張表面から成る。好ましくは、流体の溝４０
を、過剰の液体用の別の貯臓器として、台３６の近接端
に含む。台３６は、スロープ３３から基板２６の長さだ
け張り出してもよいし、または、基板２６から離れた端
の少し手前で止まって、過剰の液体を集めるための流体
の第二の溝４１のための場所を残してもよい。試薬含浸
膜は、ほぼ台３６（表示穴２９の向かい合う位置の下）
の長さに沿って配置し、吸収性パッド２３は、台３６の
離れた端に位置して、流体の溝４１の上に張り出しても
よい。乾燥剤の錠剤は流体の溝４１に入れることができ
る。乾燥剤は、装置の貯蔵期間中の試薬の保存に必要な
低い湿度条件を提供する。あるいは、乾燥剤の錠剤また
は包みを密閉した保護ポーチに入れて装置に含めること
もできる。

【００３５】４．本発明装置の使用方法 試験サンプルは、胎児、新生児、少年少女または成人か
ら得た血液、尿、リンパ液、腹腔内液、粗組織抽出物ま
たはホモジネートなどのいずれかの体液を表すが、好ま
しくは全毛細血管血または静脈血である。ほとんどの適
用に対して、本発明での使用には、約５μl 〜 50 μl
の試験サンプルで十分であり、好ましくは 20 μl 〜 3
0 μl である。

【００３６】本発明の方法は、試験サンプルを本発明に
従って構成した装置（試験片またはカセット）の細胞ト
ラップに適用することにより行う。細胞成分を含む（ま
たは含む疑いのある）試験サンプルに対しては、細胞画
分と非細胞画分との分離に十分な時間、通常は約 60 〜
120秒を与える。上記工程が完了した後、緩衝液を装置
の緩衝液ゾーンまたは穴を通して添加する。

【００３７】添加する緩衝液の量は、試験サンプルが洗
い流されるのを避けるように制限しなければならない。
一般に、試験サンプルを試験装置の膜に沿って進めるた
めの使用には、５滴未満（好ましくはたっぷり３滴）の
緩衝液で十分である。適する緩衝液としては、試験サン
プルまたはその成分と反応しない、薬剤的に許容されう
る水性緩衝液が挙げられる。当業者であれば、そのよう
な緩衝液に精通しているだろうし、または容易に確認す
ることができ、例えば、生理的食塩水、リンゲル溶液な
どが挙げられる。緩衝液は、緩衝液用の穴に滴下するこ
とができ（カセット型装置の場合）、または必要体積の
緩衝液を反応容器（カップ）に入れた後、試験片の緩衝
液ゾーンをその中に漬浸することにより添加する（本発
明の試験片の態様の場合）。試験サンプルおよび緩衝液
は共に、装置に添加するときは、室温（約 15 〜 30
℃）にすべきである。

【００３８】試験サンプルおよび緩衝液を添加すると、
約 10 分でに結果を読み取ることができる。緩衝液の使
用を必要としない態様では、結果は、試験サンプルの非
細胞画分が試験装置の膜を通る流速に応じてよりゆっく
り展開すると考えられる。緩衝液を使用しない場合、結
果は、バンドが対照ゾーンに現れるのとほぼ同時に読み
取られる。バンドが現れない場合、または対照のバンド
が明確でないか、完全には形成されない場合、そのアッ
セイは、試験サンプル中の被分析物の有無を示すことが
できないとみなし、再び行うべきである。

【００３９】特に、サンドイッチ型アッセイでは、試験
サンプル中に対象の被分析物があるならば、染料ゾーン
で標識リガンドに結合して、第一の複合体を形成する。
第一の複合体および未結合の標識リガンドは試験サンプ
ルと混合され、毛管作用（ "wicking"）によって染料含
浸膜（染料ゾーン）から装置の試薬含浸膜に一緒に運ば
れる。

【００４０】サンプルは試薬含浸膜を通過し、第一の複
合体があるならば、試薬含浸膜上に固定化された未標識
リガンドと接触して共に結合し、標識リガンド−被分析
物−固定化リガンドの第二の複合体を形成する。第二の
複合体が形成されると、目に見える色パターンが試験ゾ
ーンに現れる。試験サンプル中の被分析物に結合してい
ない標識リガンドは、wicking によって対照ゾーンに移
動し続け、そこで固定化されたリガンドと接触する。標
識リガンドは、対照ゾーンで固定化リガンドに結合して
第三の複合体を形成し、こうして対照ゾーンに捕獲され
る。本発明の範囲内では、対照ゾーンで複合体を形成す
る標識リガンドが第一および第二の複合体を形成する標
識リガンドと同じであってもよく、または、異なる標識
リガンドであッてもよい。対照ゾーンで固定化されたリ
ガンドは、第三の複合体を形成するための標識リガンド
に対して特異的な親和性を有するべきである。第三の複
合体の生成は、対照ゾーンでの目に見えるパターンによ
って示される。

【００４１】サンドイッチイムノアッセイ法の他に、他
のアッセイ法を本発明の装置で実行することができる。
これらの方法としては、競合および阻害アッセイが挙げ
られる。競合アッセイでは、被分析物および標識リガン
ドが同じ親和特性を有し、固定化リガンドとの結合に対
して競合する。すなわち、被分析物の不在下では、試験
ゾーンにおけるパターン（例えば、バンド）の強度が最
大である。存在する場合は、被分析物が固定化リガンド
に結合し、従って標識リガンドが試験ゾーンに捕獲され
るのを防ぐ。すなわち、試験バンドの強度は、試験サン
プル中の被分析物の濃度に応じて低下する。

【００４２】阻害アッセイでは、試験ゾーンにおける被
分析物および固定化リガンドが標識リガンドに対して親
和性を有する。被分析物の不在下では、標識リガンドが
固定化リガンドによって捕獲され、目に見えるパターン
が試験ゾーンに生じる。存在する場合は、被分析物が標
識リガンドに結合し、従って、試験ゾーンでの固定化リ
ガンドへの結合が防止される。その結果得られる試験バ
ンドの強度は、試験サンプル中の被分析物の濃度に応じ
て低下する。

【００４３】本発明の範囲内の全てのアッセイ法は、試
験結果が２つの様式、すなわち視覚的確認様式および比
較様式のうちの一つで読み取れるように設計することが
できる。視覚的確認様式では、陽性または陰性の結果
（ある濃度以上の被分析物の有無）を、試験ゾーンにお
けるある種のパターンまたは色の可視性によって求め
る。対照ゾーンでのパターンは、装置の機能性の内部コ
ントロールとしてのみの役割を果たす。比較様式では、
陽性または陰性の結果が、試験ゾーンおよび対照ゾーン
で生じたパターンの強度を視覚的に比較することにより
得られる。すなわち、後者の場合、対照ゾーンのパター
ンは、内部定性コントロールとして、および比較様式で
結果を読み取るための参照標準としての両方の役割を果
たす。

【００４４】視覚的確認様式での試験結果の例を図６お
よび図７に示す。この場合、図６に示すように、陽性の
結果は、試験ゾーン２１および対照ゾーン２２において
同じ水平のバーが生成することにより示される。これに
対して、陰性の結果は、図７に示すように、対照ゾーン
２２にのみ現れる区別可能な水平バーによって示され
る。

【００４５】他の対照または比較の結果の信号を与える
こともでき、例えば、無効結果が得られたかどうかを当
業者に周知の同様の手段によって示す信号がある（例え
ば、欧州特許出願 No. 8611367.0（公開公報 No. 0217
403 A2）記載の信号系参照）。本発明は、広範囲の被分
析物の検出に用いる装置および方法に適用できる。被分
析物の種類の例として、次のものが挙げられる。すなわ
ち、タンパク質およびタンパク質誘導体（抗体、免疫グ
ロブリン、ホルモン、酵素およびペプチドなど）；感染
性物質（細菌、ウイルス、真菌類、マイコプラズマ、寄
生虫ならびにそれらの産物および成分など）；薬物（治
療薬および乱用薬物など）；および腫瘍マーカーであ
る。特定の例としては、ＨＩＶに対する抗体、H. Pylor
i に対する抗体、Ｃ型肝炎ウイルスに対する抗体、ヒト
絨毛性ゴナドトロピン、エストラジオール、甲状腺刺激
ホルモン、前立腺特異抗原、Ｂ型肝炎表面抗原、ミオグ
ロビンおよび免疫グロブリンＥが挙げられる。

【００４６】

【実施例】本発明を説明する実施例を以下に示すが、以
下の実施例は本発明の範囲を制限するものではなく、本
発明は特許請求の範囲によって定義される。実施例で
は、標準的略号（例えば、時間は「ｈ」）および測定単
位（例えば、ミリリットルは「ml」）を使用する。

【００４７】実施例１ヒト血液中の抗−細菌抗体の検出 全毛細血管血の試験サンプルを、指先に針を刺すことに
よる従来の試料収集法を使用してヒト成人から得た。約
20 μl の血液を、H. pylori に対するヒト抗体の全て
のイソタイプと反応性のある（H. pylori の）ポリエピ
トープ微生物抗原試薬を含むように本発明に従って構成
した試験片の細胞トラップの表面と直接接触させること
により添加した。90秒後、たっぷり３滴の緩衝液（生理
的食塩水）を、３滴の緩衝液を含むカップに試験片を浸
すことにより、試験片の緩衝液ゾーンに添加した。試験
片に添加した試験サンプルおよび緩衝液の添加時の温度
は共に、約 15 〜 30 ℃であった。

【００４８】緩衝液を添加した後、試験片を、緩衝液の
カップに 10 分間、室温で放置した。着色した２つのバ
ンドが試験片の検出ゾーンおよび対照ゾーンに認められ
た。これは、試験サンプル中の抗−H. pylori 抗体に対
して陽性（検出ゾーンにおける着色バンドの出現によっ
て示される）であることを示す適正な試験（対照ゾーン
における対照バンドの出現によって示される）である。
次いで、試験片および未使用の試験サンプルを、従来の
生物学的廃棄物処理法に従って処分した。

【００４９】実施例２全血中の前立腺特異抗原の検出 全静脈血の試験サンプルを、従来の血液試料収集法、す
なわち脈管内注射器を使用して、ヒト成人から得た。約
20 μl の試験サンプルを、ヒト前立腺特異抗原に対し
て特異的なモノクローナル抗体試薬を含むように本発明
に従って構成した容器装置の細胞トラップ上にピペット
で添加した。90秒後、たっぷり３滴の緩衝液（生理的食
塩水）を、ピペットによって細胞トラップに滴下した。
試験片に添加した試験サンプルおよび緩衝液の添加時の
温度は共に、約 15 〜 30 ℃であった。

【００５０】緩衝液を添加した後、装置を、平らで水平
な表面上に 10 分間、室温で放置した。着色した２つの
バンドが試験片の検出ゾーンおよび対照ゾーンに認めら
れた。これは、試験サンプル中のヒト前立腺特異抗原に
対して陽性（検出ゾーンにおける着色バンドの出現によ
って示される）であることを示す適正な試験（対照ゾー
ンにおける対照バンドの出現によって示される）であ
る。次いで、装置および未使用の試験サンプルを、従来
の生物学的廃棄物処理法に従って処分した。

【００５１】本発明を十分に記載したが、記載した態様
に対する改変は、当業者にとって明らかになるであろ
う。そのような改変は全て、本発明の一部であり、特許
請求の範囲内であるとみなされる。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の試験片の分解図である。

【図２】本発明の試験片の斜視図である。

【図３】細胞トラップ１を含む層を通る図１の３−３で
切断した拡大断面図である。

【図４】本発明のカセット装置の斜視図である。

【図５】本発明のカセット装置の分解図である。

【図６】サンプル中の被分析物の存在に対して試験ゾー
ンに視覚的結果を示す、本発明の試験片（カバーはな
い）の斜視図である。

【図７】サンプル中の被分析物の存在に対して試験ゾー
ンに別の視覚的結果を示す、本発明の試験片（カバーは
ない）の斜視図である。図において、同じ番号は同じ要
素を示す。

【符号の説明】

１ 細胞トラップ ３ サンプル導入膜 ４ 窓 ５ カバー ６ 基板 15 染料含浸膜 20 試薬含浸膜 21 試験ゾーン 22 対照ゾーン 23 吸収性パッド 40 流体の溝

Claims (16)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 繊維から繊維までの孔の有効サイズが試
   験サンプル中の全ての細胞の予想される最小直径より小
   である少なくとも３層の重複する繊維から成る親水性細
   胞トラップ；細胞トラップと流体連絡する親水性のサン
   プル導入膜；サンプル導入膜と流体連絡する染料含浸
   膜；対照ゾーンおよび少なくとも１つの試験ゾーンを有
   する、染料含浸膜と流体連絡する試薬含浸膜；被分析物
   に結合することができるか、または試験ゾーンでの固定
   化リガンドへの結合を被分析物と競合することができ
   る、染料含浸膜における少なくとも１つの可溶染料標識
   リガンド；被分析物または標識リガンドに結合すること
   ができる、試験ゾーンにおける固定化リガンド；標識リ
   ガンドの少なくとも１つに結合することができる、対照
   ゾーンにおける固定化リガンド；を含み、サンプル導入
   膜、染料含浸膜および試薬含浸膜の各々が疎水性基板上
   に位置する、細胞および細胞成分を含み、対象の被分析
   物を含む疑いのある流体試験サンプルのアッセイ装置。
2. 【請求項２】 少なくとも１つの層における繊維から繊
   維までの孔の有効サイズが８μを超えないことを特徴と
   する請求項１に記載の装置。
3. 【請求項３】 少なくとも１つの層における繊維から繊
   維までの孔の有効サイズが２μを超えないことを特徴と
   する請求項１に記載の装置。
4. 【請求項４】 細胞トラップがサンプル導入膜の上に位
   置することを特徴とする請求項１に記載の装置。
5. 【請求項５】 サンプル導入膜の孔の有効サイズが細胞
   トラップのものと等しいか、それより大きいことを特徴
   とする請求項１に記載の装置。
6. 【請求項６】 細胞トラップが、セルロース誘導体、ナ
   イロン、繊維ガラスおよびそれらの組み合わせから成る
   群から選択される親水性材料で構成されることを特徴と
   する請求項１に記載の装置。
7. 【請求項７】 サンプル導入膜が、セルロース誘導体、
   ナイロン、繊維ガラスおよびそれらの組み合わせから成
   る群から選択される親水性材料で構成されることを特徴
   とする請求項１に記載の装置。
8. 【請求項８】 さらに、前記装置の細胞トラップおよび
   膜を覆う疎水性カバーを含み、該カバーが細胞トラップ
   の上に位置する窓を有することを特徴とする請求項１に
   記載の装置。
9. 【請求項９】 基板が細片であることを特徴とする請求
   項１に記載の装置。
10. 【請求項１０】 基板およびカバーが生体適合性の固体
    で形成され、該基板およびカバーが前記装置の細胞トラ
    ップおよび膜を囲むハウジングを形成することを特徴と
    する請求項８に記載の装置。
11. 【請求項１１】 さらに、試薬含浸膜と流体連絡するよ
    うに位置する吸収性材料を含むことを特徴とする請求項
    １０に記載の装置。
12. 【請求項１２】 前記装置の細胞トラップおよび膜が、
    試験サンプルが細胞トラップからサンプル導入膜、染料
    含浸膜および試薬含浸膜を通って流動するように細片に
    配置されることを特徴とする請求項１に記載の装置。
13. 【請求項１３】 染料含浸膜の標識が、酵素、リポソー
    ム、赤血球ゴースト、ポリマーマイクロカプセル、着色
    ポリマー粒子（ラテックス）から成る群から選択され、
    好ましくは、金属含有化合物のゾルを含むことを特徴と
    する請求項１に記載の装置。
14. 【請求項１４】 標識がコロイド状の金であることを特
    徴とする請求項１３に記載の装置。
15. 【請求項１５】 リガンドが、抗原、抗体、ホルモン、
    酵素、ペプチド、タンパク質、核酸、オリゴヌクレオチ
    ド、糖タンパク質、炭水化物、多糖およびそれらの組み
    合わせから成る群から選択されることを特徴とする請求
    項１に記載の装置。
16. 【請求項１６】 請求項１に記載の装置の細胞トラップ
    に試験サンプルを適用し；対照ゾーンのパターンを検出
    し；そして、試験ゾーンのパターンを検出する；ことを
    含み、その際、対照ゾーンにおける検出可能なパターン
    が適正なアッセイが行われたことを示し、試験ゾーンに
    おける検出可能なパターンが試験サンプル中の被分析物
    の有無を示す、細胞および細胞成分を含み、対象の被分
    析物を含む疑いのある流体試験サンプルのアッセイ方
    法。