WO2003077940A1 - Composicion quimica de igf-i para el tratamiento y prevencion de enfermedades neurodegenerativas - Google Patents

Composicion quimica de igf-i para el tratamiento y prevencion de enfermedades neurodegenerativas Download PDF

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Celia Carrascosa
Cristina LÓPEZ LÓPEZ
Eva María CARRO DÍAZ
Ignacio TORRES ALEMÁN
Juan José TORRADO DURAN
Santiago Torrado Duran
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Consejo Superior De Investigaciones Científicas
Universidad Complutense De Madrid
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Definitions

  • the invention relates to the preparation and obtaining of new compositions (microspheres and capsules) for administration of active ingredients, among others, IGF-I, and their use in the treatment and prevention of neurodegenerative diseases such as, among others, Alzheimer's disease or cerebellar ataxia.
  • IGF-I extended-release systems
  • trophic factors including IGF-I (Lam XM, Due ⁇ as ET, Daugherty AL, Levy N, and Cleland JL "Sustained relée of recombinant human insulin-like growth factor-I for treatment of diabetes "J. Contr Re ⁇ 67: 281-292 (2000); Singh M, Shirley B, Bajwa K, Samara E, Hora M, and O'Hagan D," Controlled relée of recombinant insulin-like growth factor from a novel formulation of polylactide-co-glycolide microparticles "J. Contr. Re ⁇ .
  • the invention relates to new therapeutic compositions of slow administration of IGF-I, a method of preparing and obtaining them and their use in the preparation of medicaments for the treatment and prevention of neurodegenerative diseases such as, among others, the disease of Alzheimer's or cerebellar ataxia.
  • These compositions correspond to microspheres smaller than 5 micrometers, among other features, and with subcutaneous implantation capsules.
  • the invention is directed to prevent diseases of the nervous system due to loss of neurons, whether of genetic or sporadic origin. It consists of subcutaneous administration of a long-lasting and biodegradable therapeutic formulation, developed in the present invention, containing the natural neuroprotective factor IGF-I.
  • the novelty of this application is that it is achieved that the symptoms of neurodegenerative disease, valued in different animal models of hereditary cerebellar ataxia and Alzheimer's disease and in old rats, do not appear as long as this long-term formulation is administered periodically (see Example 2 , 3 and 4; Figure 2).
  • the administration of this formulation becomes very comfortable (once or twice a month) (Figure IB), and greater therapeutic efficacy is achieved than with daily subcutaneous injection of IGF-I (Figure 1A) since therapeutic levels are They keep much longer.
  • As the route of administration is subcutaneous, smaller particles (smaller than 5 micrometers) have been developed since they pass more easily through the injection needles.
  • an object of the present invention is a therapeutic formulation or composition containing the natural neuroprotective factor IGF-I, hereinafter the therapeutic composition of the present invention, which allows the slow release of intact and functionally active IGF-I and which is constituted by microspheres of high viscosity copolymers with a diameter of less than 5 micrometers, generally between 1 and 2 micrometers, and preferably close to 1.3 micrometers.
  • the therapeutic composition provided by this invention comprises a therapeutically effective amount of IGF-I together with at least one pharmaceutically acceptable excipient.
  • Said therapeutic composition is useful for administration and / or application in the body of a mammal, preferably the human being.
  • the amount of the therapeutic composition of the present therapeutically effective invention to be administered as well as its dosage to treat a pathological state will depend on numerous factors, including age, patient status, disease severity, route. and frequency of administration, etc.
  • the therapeutic composition containing IGF-I provided by this invention may be presented in any form of administration deemed suitable for subcutaneous administration, for which the pharmaceutically acceptable excipients necessary for the formulation of the desired administration form will be included.
  • a review of the different pharmaceutical forms of drug administration and of the excipients necessary to obtain them can be found, for example, in the "Galenica Pharmacy Treaty", C Faul ⁇ ⁇ Trillo, 1993, Luzán 5, SA Ediations, Madrid.
  • a further object of the present invention is a process for preparing and obtaining the therapeutic composition of the present invention, hereinafter the method of the present invention, based on the triple emulsion and solvent extraction technique and which, at least, is Performs as follows: -
  • the copolymers used are of high viscosity between 0.5 and 1.5 dl / g, and more preferably with a viscosity of 0.8 dl / g,
  • High homogenization speeds are used, preferably at 13500 rpm
  • the solutions used have a non-alkaline pH, and - other high molecular weight proteins, among others, albumin and gelatin are dispensed with.
  • a particular object of the present invention is the process of the present invention where the copolymer is, among others, a 50:50 lactic and glycolic acid copolymer (PLGA 50:50).
  • Another additional object of the present invention is a therapeutic composition obtained by the process of the present invention.
  • these microspheres of copolymers of lactic and glycolic acid can be prepared in addition to the triple emulsion and solvent extraction process, among others, by the atomization technique by experts in the field , whereby therapeutic formulations of the present invention prepared and obtained by these techniques form part of the present invention.
  • the atomization process has been described for the preparation of microspheres in numerous works such as the following: P. Johansen, E. Estévez, R. Zurbriggen, HP Merkle, R. Gluck, G. Corradin and B. Gander. Towards clinical testing of a single-administration tetanus vaccines based on PLA / PLGA microspheres. Vaccine 2000.
  • the administration of the therapeutic composition in the form of microspheres to transgenic mice suffering from Alzheimer's disease and in old rats decreased the symptoms associated with said disease, such as, among others, beta-amyloid deposits, reactive gliotic lesions (see Example 3 and 4, Figure 2).
  • the present invention describes the use of any of these compositions in the preparation of medicaments for the treatment and prevention of neurodegenerative diseases such as, among others, Alzheimer's disease, cerebellar ataxia, ataxia-telangiectasia, vascular dementia, multiple sclerosis, stroke, peripheral neuropathies and brain or spinal trauma.
  • neurodegenerative diseases such as, among others, Alzheimer's disease, cerebellar ataxia, ataxia-telangiectasia, vascular dementia, multiple sclerosis, stroke, peripheral neuropathies and brain or spinal trauma.
  • a further object of the present invention is a method of preparing and obtaining the tablet of the present invention based on the following technique:
  • IGF-I is dissolved in 0.01 mM acetic acid, - Cyclosporine is added to this solution,
  • a further object of the present invention is the use of the tablet of the present invention in the preparation or preparation of medicaments for the treatment and prevention of neurodegenerative diseases such as, among others, Alzheimer's disease, cerebellar ataxia, ataxia-telangiectasia, vascular dementia, multiple sclerosis, stroke, peripheral neuropathies and cerebral or spinal trauma.
  • neurodegenerative diseases such as, among others, Alzheimer's disease, cerebellar ataxia, ataxia-telangiectasia, vascular dementia, multiple sclerosis, stroke, peripheral neuropathies and cerebral or spinal trauma.
  • FIG. 1 IGF-I levels in blood after a single subcutaneous injection of IGF-I (A) remain elevated less than 24 hours, while after subcutaneous injection (se) of IGF-I microspheres (B), these remain elevated for at least 2 weeks.
  • FIG. 1 Preventive effect of treatment with IGF-I depots in neurodegenerative diseases in A) Mice with hereditary cerebellar ataxia treated with IGF-I microspheres (A), with IGF-I capsules (B) and the control group without Treatment (empty microspheres) (•) The degree of motor coordination is assessed with the "rota- rod" test described in Fernández et al (1998) B) Old rats treated with IGF-I microspheres in which amyloidosis was assessed associated with neurodegeneration during normal aging of animals by immunostaining of the GFAP protein, C) Old rats treated with IGF-I microspheres in which amyloidosis associated with neurodegeneration during normal aging of animals was assessed by determining the GFAP protein levels in brain (cortex), and D)
  • cortex cortex
  • CSF cerebrospinal fluid
  • Example the. Subcutaneous injection of IGF-I ( Figure 1A) Lyophilized recombinant human IGF-I (rhIGF-I) is dissolved (GroPep,
  • the preparation of the IGF-I microspheres was carried out by means of a modification of the above-described method of triple emulsion and solvent extraction A / O / A (Singh M, Shirley B, Bajwa K, Samara E, Time M, and O'Hagan D (2001) Controlled relay of recombinant insulin-like growth factor from a novel formulation of polylactide-co-glycolide microparticles J.
  • Control Relay 70: 21-28 that allows the effective release of an intact and biologically active IGF-I (el L, lili OE, Zapf J, Malfanti M, Peter MH, and Gander B (2001) Stabilizing insulin-like growth factor-I in poly (D, L-lactide-co-glycolide) microspheres J.
  • Control Relay 70: 21-28 Controlled relay of recombinant insulin-like growth factor from a novel formulation of polylactide-co-glycolide microparticles.
  • IGF-I insulin growth factor-I
  • acetic acid 100 microliters of 0.01 mM acetic acid.
  • tween 20 10.5 mg of tween 20 (Serva, Germany).
  • the emulsion is homogenized at 13500 rpm, using a Polytron ® for 2 minutes, to obtain a first A / O binary emulsion of small particle size. Subsequently, said emulsion is added to a solution of 400 ml of PBS buffer of pH 7.4, formed for 1 liter with 6.8 g of monopotassium phosphate and 195.5 ml of 0.2M NaOH solution.
  • PBS buffer has 8 g of polyvinyl alcohol (15000 polyvinyl alcohol, Fluka, Switzerland).
  • a triple AJO / A emulsion is obtained.
  • This triple emulsion is kept under gentle agitation (700 rpm) for 4 hours for the methylene chloride to evaporate, and thus forming the microspheres.
  • the microspheres recover by centrifugation at 6000 rpm for 20 minutes and the supernatant is decanted. They are then washed with deionized water and again centrifuged and decanted. The washing process is repeated three times.
  • microspheres are lyophilized and stored in a refrigerator (4 ° C) until they are used.
  • the loading level of rhIGF-I in the microspheres was determined by dissolving 10 mg of microspheres in 1 ml of 1N NaOH by stirring overnight at room temperature. The protein concentration was assessed by UN absorption at 284 nm, using an extinction coefficient of 1,043 (mg / ml) "1 cm " 1 for rhIGF-I in ⁇ aOH 1 ⁇ .
  • the size of the microsphere was determined by laser diffraction (Galai ® Cis-1). Diluted samples from several batches were run in triplicate, and the average diameter was estimated for each batch.
  • the morphology of the microspheres was analyzed by electron microscopy (JEOL 6400).
  • the resulting microspheres have an average particle size of 1.3 ⁇ 1 micrometers, and a richness of 5%.
  • the encapsulation percentage was 70%.
  • Subcutaneous administration of these IGF-I microspheres to adult rats (5 mg / kg) caused the blood levels of IGF-I to remain elevated for at least 2 weeks ( Figure IB). It should be noted that the relative small diameter of these microspheres facilitated the injection of said suspension through a 23 G needle.
  • Example le - Preparation of IGF-I implantation capsules To prepare a batch of 10 tablets, 15 mg of IGF-I (GroPep,
  • biconvex capsules or tablets of 6 mm in diameter and 3 mm thick of 50 mg and with a richness of 1.5 mg of IGF-I per capsule are obtained. These tablets are implanted by means of a small incision and without the need for anesthesia under the skin of the "ped" mice and since it is made of biodegradable material, it does not need to be removed.
  • Example 2. Treatment of mice with hereditary degeneration of the cerebellum (Purkinje cell degeneration) using microspheres and IGF-I implantation capsules
  • IGF-I microspheres were administered by injection subcutaneous at a dose of 100 ⁇ g / kg once every two weeks after two first doses of 50 and 75 ⁇ g / kg ( Figure 2A).
  • mice showed a normal degree of coordination of movements while maintaining the treatment (100 days) with the microspheres (Figure 2 A, line with triangles) and also with capsules (Figure 2A, line with squares), in comparison with the data observed in healthy mice (the treated mice presented maximum motor coordination values close to 300 sec similar to those observed in healthy mice (data not shown)) while in the control group the symptoms of ataxia did not disappear (values of maximum motor coordination of the order of 200-240 sec).
  • the levels of beta-amyloid (BA) (assessing by bands the bands obtained by weste ⁇ i blot) in the cortex and hippocampus of untreated transgenic mice were 7 and 25 times higher than those found in their non-diseased siblings (APP- - / -) while the transgenic mice treated with IGF-I presented levels of ⁇ A equal to the non-diseased animals (p ⁇ 0.01 vs untreated Tg2576).
  • mice Animals. Adult and old Wistar rats (250-350 gr), Tg2576 transgenic mice, endogamically crossed male and female "pcd" (Purkinje cell degeneration) mice, and baits of non-ataxic mice grouped by age and sex in conjunction with C57 mice , as a control group, were used in accordance with EU Directive 86/609 / EEC. The animals were kept under standard laboratory conditions.
  • Reagents 125 INa (Amersham, Great Britain) was used to iodinate rhIGF-I. Unless stated otherwise, the remaining reagents used in the present invention come from Sigma (USA) or Merck (Spain).
  • mice Multiple blood samples taken from each animal were performed in adult rats and serum IGF-I levels were determined before and after subcutaneous (se) administration of rhIGF-I .
  • the microsphere doses (5 mg / kg) were prepared as a suspension in a sterile saline solution for immediate administration in bolus.
  • another group of rats received a subcutaneous bolus of a conventional injection of a solution of 1.8 mg / kg of rhIGF-I.
  • blood samples were taken through the subclavian vein at different times after injection. The relative high doses used allowed to ensure its detection in the serum after its injection. Because it is difficult to perform multiple blood sample extractions in mice, these were carried out in different mice at different times. Because pcd mice are difficult to breed, they were only used to determine the therapeutic efficacy of IGF-I microspheres.

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Abstract

La invención se refiere a nuevas composiciones terapéuticas de administración lenta de IGF-I, a un procedimiento de preparación y obtención de las mismas y a su empleo para la elaboración de medicamentos para el tratamiento y prevención de enfermedades neurodegenerativas como, entre otras, la enfermedad de Alzheimer o la ataxia cerebelar.Estas composiciones se corresponden con microesferas de tamaño menor de 5 micrometros, entre otras características, y con cápsulas de implantación subcutánea.

Description

TITULO
COMPOSICIÓN QUÍMICA DE IGF-I PARA EL TRATAMIENTO Y PREVENCIÓN DE ENFERMEDADES NEURODEGENERATIVAS
SECTOR DE LA TÉCNICA
La invención se refiere a la preparación y obtención de nuevas composiciones (microesferas y cápsulas) de administración de principios activos, entre otros, IGF-I, y su utilización en el tratamiento y prevención de enfermedades neurodegenerativas como, entre otras, la enfermedad de Alzheimer o la ataxia cerebelar.
ESTADO DE LA TÉCNICA
En la actualidad no existe ninguna droga o método que proteja frente a enfermedades neurodegenerativas. Este tipo de enfermedades están creciendo en importancia en los países desarrollados debido al paulatino envejecimiento de la población ya que muchas de ellas están asociadas a la edad (Amad cci L, and Tesco G, Aging as a major ris for degenerative diseases of the central nervous system, Curr. Opin. Neurol., 7: 283-286 (1994)). Sin embargo, aunque se están estudiando intensamente las causas de enfennedades como demencia de Alzheimer o enfermedad de Parkinson, y se está empezando a reconocer un componente genético importante (Heintz N, and Zoghbi HY, Insights from mouse models into the molecular basis of neurodegeneration, Annu. Rev. Physiol, 62: 779-802 (2000)), no existe de momento ningún tratamiento efectivo, con lo que su prevención es de extrema importancia. El hecho de que muchas de ellas tengan un claro componente hereditario permite que se pueda predecir si se va desarrollar o se tiene predisposición a desarrollar una enfermedad neurodegenerativa. Esto significa que se pueden tomar medidas protectoras frente a la enfermedad antes de que ésta haga su aparición. Por ejemplo, un sistema preventivo que está a punto de ensayarse en poblaciones de riesgo para el Alzheimer es la vacunación (Gurwitz D, Immunization for Alzheimer's disease: yet closer to clinical triáis, Trends Immunol. 22: 542-543, (2001)) ya que existen sujetos genéticamente predispuestos a padecerlo y la edad avanzada es un factor de riesgo. Existen una serie de proteínas de origen natural con actividad trófica hormonal terapéutica que han de ser administradas por vía parenteral debido a que son degradadas por el sistema digestivo. La más conocida es la insulina, de la que se están intentando desarrollar sistemas alternativos de administración desde hace muchos años. La administración diaria por inyección, aunque sea subcutánea, tiene dos problemas principales: el paciente tiende a evitarla (la fidelidad disminuye), y la biodisponibilidad, y por tanto la eficacia terapéutica puede verse reducida. Para el caso del factor trófico IGF-I, cuya eficacia terapéutica para un amplio rango de enfennedades está siendo ensayada en la actualidad (Relación de ensayos clínicos que se están realizando en la actualidad en Estados Unidos: http://clinicaltrials.gOv/ct/gui/c/a2b/action/GetStudy7JServSessionIdzone ct=lbfy4qa8h i), se ha observado que la administración repetida a lo largo del dia por via subcutánea es mas eficaz que una única inyección (Woodal SM, Breier BH, O'Sullivan U, Gluckman PD. The effect of the frequency of subcutaneous insulin-like growth factor I administration on weight gain in growth hormone deficient mice. Horm Metab Res 12: 581-584 (1991)), probablemente debido a que los niveles en sangre pennanecen elevados por mas tiempo.
Una solución que se está intentando para este problema es el desarrollo de sistemas de liberación prolongada ("depot") de factores tróficos, incluido el IGF-I (Lam XM, Dueñas ET, Daugherty AL, Levy N, and Cleland JL "Sustained reléase of recombinant human insulin-like growth factor-I for treatment of diabetes" J. Contr Reí 67: 281-292 (2000); Singh M, Shirley B, Bajwa K, Samara E, Hora M, and O'Hagan D, "Controlled reléase of recombinant insulin-like growth factor from a novel formulation of polylactide-co-glycolide microparticles" J. Contr. Reí. 70: 21-28 (2001); Meinel L, lili OE, ZapfJ, Malfanti M, Merkle HP, Gander B, "Stabilizing insulin-like growth factor-I in poly (D,L-lactide-co-glycolide) microspheres" J. Contr. Reí. 70: 193- 202 (2001)). Las compañías farmacéuticas especializadas en factores tróficos están dedicando grandes esfuerzos a desarrollar este tipo de formulación. Estudios previos han demostrado la utilidad de IGF-I formulada en sistemas osmóticos de administración subcutánea de liberación controlada. Estos sistemas producen efectos terapéuticos en algunos procesos patológicos (Fernandez AM, González de la Vega A, Torres-Alemán I, "h sulin-like growth factor restores motor coordination in a rat model of cerebellar ataxia". Proc. Nat. Acad. Sci. (USA) 95: 1253-1258 (1998)). Sin embargo, dichos sistemas tienen la desventaja de ser muy voluminosos (y por lo tanto de difícil implantación en seres humanos) y de que es preciso retirar el dispositivo osmótico una vez finalizada la liberación. Con el fin de evitar este inconveniente se pueden fabricar preparados biodegradables de tamaño reducido y de liberación prolongada. Con este fin se emplean cada vez con más frecuencia copolímeros biodegradables de ácido láctico y glicólico, semejantes a los empleados en la fabricación de hilo de sutura reabsorbible. Existen distintos copolímeros en los que se pueden variar las proporciones de poliláctico y poliglicólico y la viscosidad de los mismos. De esta forma se puede controlar la velocidad de cesión del fármaco incorporado, y consecuentemente prolongar su absorción y la duración de sus efectos. Normalmente cuanto mayor sea la proporción de poliláctico en relación a la de poliglicólico, menor es la velocidad de cesión. Por otro lado, a mayor viscosidad intrínseca del polímero, menor es la velocidad de liberación. Concretamente, con el IGF-I, se han publicado recientemente tres trabajos (Lam XM, Dueñas ET, Daugherty AL, Levy N, and Cleland JL "Sustained reléase of recombinant human insulin-like growth factor-I for treatment of diabetes" J. Contr Reí 67: 281-292 (2000); Singh M, Shirley B, Bajwa K, Samara E, Hora M, and O 'Hagan D, "Controlled reléase of recombinant insulin-like growth factor from a novel formulation of polylactide-co-glycolide microparticles" J. Contr. Reí. 70: 21-28 (2001); Meinel L, lili OE, Zapf J, Malfanti M, Merkle HP, Gander B, "Stabilizing insulin-like growth factor-I in poly (D,L-lactide-co-glycolide) microspheres" J. Contr. Reí. 70: 193-202 (2001)) en los que se utiliza el copolímero de ácido láctico y glicólico en proporción 50:50 (Resomer 502H de la empresa Boehringer Ingelheim). Los procedimientos de preparación son o bien por atomización, o por la técnica de triple emulsión. En la técnica de triple emulsión se utilizaron distintos sistemas para aumentar el tamaño de las microesferas resultantes. Así, en el trabajo de M. Singh y col. (Singh M, Shirley B, Bajwa K, Samara E, Hora M, and O 'Hagan D, "Controlled reléase of recombinant insulin-like growth factor from a novel fonnulation of polylactide-co-glycolide microparticles" J. Contr. Reí. 70: 21-28 (2001)), se induce un cambio de pH que produce una precipitación parcial de IGF-I, mientras que en el trabajo de L. Meinel y col. (Meinel L, lili OE, Zapf J, Malfanti M, Merkle HP, Gander B, "Stabilizing insulin-like growth factor-I in poly (D,L-lactide-co-glycolide) microspheres" J. Contr. Reí. 70: 193-202 (2001)), se emplean velocidades de agitación lenta y se incorporan proteínas como gelatina y albúmina que van a dar lugar a la obtención de microesferas de gran tamaño. En todos estos sistemas descritos las microesferas resultantes tienen un tamaño superior a 30 micrómetros, concretamente entre 30 y 125 micrómetros que varía dependiendo del trabajo.
DESCRIPCIÓN Breve descripción
La invención se refiere a nuevas composiciones terapéuticas de administración lenta de IGF-I, a un procedimiento de preparación y obtención de las mismas y a su utilización en la elaboración de medicamentos para el tratamiento y prevención de enfermedades neurodegenerativas como, entre otras, la enfermedad de Alzheimer o la ataxia cerebelar. Estas composiciones se corresponden con microesferas de tamaño menor de 5 micrometros, entre otras características, y con cápsulas de implantación subcutánea. Descripción detallada La invención va dirigida a prevenir enfermedades del sistema nervioso debidas a pérdida de neuronas ya sean de origen genético o esporádico. Consiste en la administración por vía subcutánea de una formulación terapéutica de larga duración y biodegradable, desarrollada en la presente invención, conteniendo el factor natural neuroprotector IGF-I. La novedad de esta aplicación es que se consigue que los síntomas de enfermedad neurodegenerativa, valorada en diferentes modelos animales de ataxia cerebelar hereditaria y de enfermedad de Alzheimer y en ratas viejas, no aparezcan mientras se administre periódicamente dicha formulación de larga duración (ver Ejemplo 2, 3 y 4; Figura 2). Además, la administración de esta formulación se hace muy cómoda (1 ó dos veces al mes) (Figura IB), y se consigue una eficacia terapéutica mayor que con inyección subcutánea diaria de IGF-I (Figura 1A) ya que los niveles terapéuticos se mantienen mucho más tiempo. Como la vía de administración es subcutánea, se han desarrollado partículas de menor tamaño (menores de 5 micrómetros) ya que pasan con mayor facilidad a través de las agujas de inyección.
Así, un objeto de la presente invención lo constituye una formulación ó composición terapéutica que contiene el factor natural neuroprotector IGF-I, en adelante composición terapéutica de la presente invención, que permite la liberación lenta de IGF-I intacto y funcionalmente activo y que está constituida por unas microesferas de copolímeros de alta viscosidad y con un diámetro menor de 5 micrometros, generalmente entre 1 y 2 micrometros, y preferentemente cercano a 1.3 micrometros.
La composición terapéutica proporcionada por esta invención comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de IGF-I junto con, al menos, un excipiente farmacéuticamente aceptable. Dicha composición terapéutica es útil para su administración y/o aplicación en el cuerpo de un mamífero, preferentemente el ser humano.
La cantidad de la composición terapéutica de la presente invención terapéuticamente eficaz que debe administrarse así como su dosificación para tratar un estado patológico dependerá de numerosos factores, entre los que se encuentra la edad, el estado del paciente, la severidad de la enfermedad, la ruta y frecuencia de administración, etc.
La composición terapéutica que contiene IGF-I proporcionada por esta invención pueden presentarse en cualquier forma de administración que se considere adecuada para su administración subcutánea, para la que se incluirán los excipientes farmacéuticamente aceptables necesarios para la formulación de la forma de administración deseada. Una revisión de las distintas formas farmacéuticas de administración de medicamentos y de los excipientes necesarios para la obtención de las mismas puede encontrarse, por ejemplo, en el "tratado de Farmacia Galénica", C Faulí í Trillo, 1993, Luzán 5, SA Ediciones, Madrid.
El posible efecto en la velocidad de cesión se ha compensado con la utilización de copolímeros de mayor viscosidad como el Resomer 506 (Boehringer Ingelheim) en lugar del 502H descrito en los trabajos previos. Así, se propone el empleo de un copolímero de una viscosidad de 0,8 dl/g, en lugar del descrito en los trabajos citados que tiene una viscosidad de 0,2 dl/g. Para obtener estas microesferas de menor tamaño se empleó la técnica de triple emulsión en la que se utiliza como base una solución de IGF-I y altas velocidades de homogenización, para tener el menor tamaño posible de fase interna en la emulsión. Además, en el método propuesto en la presente invención, se prescinde de la utilización de pH alcalinos (en los que se puede insolubilizar IGF-I) y de otras proteínas de alto peso molecular (albúmina, gelatina, etc). De esta forma se obtienen microesferas de pequeño tamaño, generalmente entre 1-2 micrómetros, más apropiadas para la administración subcutánea por inyección con agujas. Un objeto adicional de la presente invención lo constituye un procedimiento de preparación y obtención de la composición terapéutica de la presente invención, en adelante procedimiento de la presente invención, basado en la técnica de triple emulsión y extracción de solvente y que, al menos, se realiza de la siguiente forma: - Los copoliméros utilizados son de alta viscosidad entre 0.5 y 1.5 dl/g, y más preferentemente con una viscosidad de 0.8 dl/g,
Se utilizan altas velocidades de homogenización, preferentemente a 13500 rpm
Las soluciones utilizadas presentan un pH no alcalino, y - Se prescinde de otras proteínas de alto peso molecular, entre otras, albúmina y gelatina. Un objeto particular de la presente invención lo constituye el procedimiento de la presente invención donde el copolímero es, entre otros, un copolimero de ácido láctico y glicólico 50:50 (PLGA 50:50). Otro objeto adicional de la presente invención lo constituye una composición terapéutica obtenida por el procedimiento de la presente invención.
Como referencia y a nivel de ilustración, no limitativa, de la técnica de triple emulsión se presentan los trabajos publicados de Lam XM et al, Singh M et al y Meinel L et al (Lam XM, Dueñas ET, Daugherty AL, Levy N, and Cleland JL "Sustained reléase of recombinant human insulin-like growth factor-I for treatment of diabetes" J. Contr Reí 67: 281-292 (2000); Singh M, Shirley B, Bajwa K, Samara E, Hora M, and O 'Hagan D, "Controlled reléase of recombinant insulin-like growth factor from a novel formulation of polylactide-co-glycolide microparticles" J. Contr. Reí. 70: 21-28 (2001); Meinel L, lili OE, Zapf J, Malfanti M, Merkle HP, Gander B, "Stabilizing insulin-like growth factor-I in poly (D,L-lactide-co-glycolide) microspheres" J. Contr. Reí. 70: 193- 202 (2001)).
Por otro lado, y tal como se indicaba en la introducción estas microesferas de copolímeros de ácido láctico y glicólico se pueden elaborar además de por el procedimiento de triple emulsión y extracción de solvente, entre otras, por la técnica de atomización por expertos en la materia, por lo que formulaciones terapéuticas de la presente invención preparadas y obtenidas por estas técnicas forman parte de la presente invención. El procedimiento de atomización se ha descrito para la elaboración de microesferas en numerosos trabajos por ejemplo los siguientes: P. Johansen, E. Estévez, R. Zurbriggen, H.P. Merkle, R. Gluck, G. Corradin y B. Gander. Towards clinical testing of a single-administration tetanus vaccines based on PLA/PLGA microspheres. Vaccine. 2000. 19(9-10): 1047-54; P. Johansen, Y. Men, R. Audran, G. Corradin, H.P. Merkle y B. Gander. Improving stability of microencapsulated tetanus toxoid by co- encapsulation of additives. Pharmaceutical Research. 1998. 15(7): 1103-10; S. Takada, Y. Uda, H. Toguchi y Y. Ogawa. Application of a spray-drying technique in the production of THR-containing injectable sustained-release microparticles of biodegradable polymers. PDA Journal of Pharmaceutical Science and Technology. 1995. 49(4): 180-4; F. Pavanetto, I. Genta, P. Giunchedi y B. Conti. Evaluation of spray drying as a method for polylactide and polylactide-co-glycolide microsphere preparation. Journal of Microencapsulation. 1993. 10(4):487-97; B. Bittner y T. Kissel. Ultrasonic atomization for spray drying: a versatile technique for the preparation of protein loaded biodegradable microspheres. Journal of Microencapsulation. 1999. 16(3):325-341. Tanto las microesferas como los comprimidos se administran periódicamente por inyección o implantación subcutánea. La eficacia protectora frente a enfermedad neurodegenerativa se mantiene de manera prolongada: se ha administrado durante casi 5 meses a ratones pcd que padecen neurodegeneración hereditaria y éstos no han desarrollado la enfermedad neurodegenerativa hereditaria en todo este tiempo. Es decir, mientras se mantenga la administración, la enfermedad no aparece, si se interrumpe la administración, la enfermedad se manifiesta, aunque en estadios iniciales de la enfermedad, la re-administración del producto permite que los síntomas de la enfermedad vuelvan a desaparecer (Figura 2A). Por otro lado, la administración de la composición terapéutica en forma de microesferas a ratones transgénicos enfermos de Alzheimer y en ratas viejas disminuyó los síntomas asociados a dicha enfermedadcomo son, entre otros, los depósitos de beta-amiloide, las lesiones glióticas reactivas (ver Ejemplo 3 y 4, Figura 2).
La presente invención describe la utilización de cualquiera de estas composiciones en la preparación de medicamentos para el tratamiento y prevención de enfermedades neurodegenerativas como, entre otras, enfermedad de Alzheimer, ataxia cerebelosa, ataxia-telangiectasia, demencia vascular, esclerosis múltiple, ictus, neuropatías periféricas y trauma cerebral o espinal. Así, un objeto de la presente invención lo constituye la utilización de la composición terapéutica de la presente invención en la elaboración o preparación de medicamentos para el tratamiento y prevención de enfermedades neurodegenerativas como, entre otras, enfermedad de Alzheimer, ataxia cerebelosa, ataxia-telangiectasia, demencia vascular, esclerosis múltiple, ictus, neuropatías periféricas y trauma cerebral o espinal. Además de estas pequeñas microesferas, y con el fin de obtener preparados de muy larga duración de efectos se han desarrollado comprimidos o cápsulas de implantación subcutánea (ver Ejemplo le), en adelante comprimido de la presente invención, de los cuales no se han encontrado referencias, ni datos de estudios previos por otros autores. Así, un objeto adicional de la presente invención lo constituye este comprimido o cápsula con una capacidad de liberación prolongada de IGF-I.
Un objeto adicional de la presente invención lo constituye un procedimiento de preparación y obtención del comprimido de la presente invención basado en la siguiente técnica:
El IGF-I se disuelve en ácido acético 0,01 mM, - A esta solución se le añade ciclosporina,
- Esta mezcla se añade al copolímero de ácido láctico y glicólico (Resomer 503 H de Boehringer Ligelhem) y se amasa suavemente, pasando a continuación el producto a través de una malla de 2 mm de luz, Se deja secar a temperatura ambiente durante tres horas y se vuelve a pasar por la malla anterior, y
Se deja secar otras 15 horas a temperatura ambiente y se comprime con punzones cóncavos de 6 mm de diámetro
Finalmente, un objeto adicional de la presente invención lo constituye la utilización del comprimido de la presente invención en la elaboración o preparación de medicamentos para el tratamiento y prevención de enfermedades neurodegenerativas como, entre otras, enfermedad de Alzheimer, ataxia cerebelosa, ataxia-telangiectasia, demencia vascular, esclerosis múltiple, ictus, neuropatías periféricas y trauma cerebral o espinal. DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
Figura 1.- Los niveles de IGF-I en sangre tras una única inyección subcutánea de IGF-I (A) se mantienen elevados menos de 24 horas, mientras que tras inyección subcutánea (se) de microesferas de IGF-I (B), éstos se mantienen elevados durante al menos 2 semanas.
Figura 2.- Efecto preventivo del tratamiento con depots de IGF-I en enfermedades neurodegenerativas en A) Ratones con ataxia cerebelar hereditaria tratados con microesferas de IGF-I (A), con cápsulas de IGF-I (B) y el grupo control sin tratamiento (microesferas vacías) (•) El grado de coordinación motora se valora con el test de "rota- rod" descrito en Fernández et al (1998) B) Ratas viejas tratadas con microesferas de IGF-I en las que se valoró la amiloidosis asociada a neurodegeneración durante el envejecimiento normal de los animales mediante inmunotinción de la proteína GFAP, C) Ratas viejas tratadas con microesferas de IGF-I en las que se valoró la amiloidosis asociada a neurodegeneración durante el envejecimiento normal de los animales mediante la determinación de los niveles de la proteína GFAP en cerebro (corteza), y D)
Ratas viejas tratadas con microesferas de IGF-I en las que se valoró la amiloidosis asociada a neurodegeneración durante el envejecimiento normal de los animales mediante la determinación de los niveles de beta-amiloide en cerebro (corteza) y líquido cefalorraquídeo (CSF).
EJEMPLOS
Ejemplo 1.- Elaboración y administración de preparaciones de administración de
IGF-I
Ejemplo la. -Inyección subcutánea de IGF-I (Figura 1A) Se disuelve IGF-I humano recombinante (rhIGF-I) liofilizado (GroPep,
Australia) en suero salino (CLNa 0.9%) a una concentración de 500 μg/100 μl. Ratas Wistar adultas de 300 grs (n=6 por cada tiempo de recogida) reciben una única inyección subcutánea (en la escápula) de 100 μl. Para valoración del IGF-I en suero por radioinmunoensayo (I. Torres- Alemán, S. Pons, L.M. García-Segura. Climbing fiber deafferentation reduces insuline-like growth factor I (IGF-I) content in cerebellum. Brain Res. 564: 348-351 (1991); S Pons and I Torres-Alemán Basic fibroblast growth factor modulates insuline-like growth factor-I, its receptor, and its binding proteins in hypothalamic cell cultures. Endocrinology 131: 2271-2278 (1992)) la sangre se extrae del tronco tras anestesia y decapitación del animal a distintos tiempos tras la inyección del IGF-I.
Como se describe en la Figura 1A una inyección subcutánea única de IGF-I (1,8 mg/kg) en ratas adultas provocó un rápido incremento de los niveles de IGF-I aunque estos se mantienen así durante menos de 24 horas (Figura 1 A). Ejemplo Ib.- Elaboración de microesferas de IGF-I
La preparación de las microesferas de IGF-I se realizó mediante una modificación del método descrito anteriormente de triple emulsión y extracción de solvente A/O/A (Singh M, Shirley B, Bajwa K, Samara E, Hora M, and O'Hagan D (2001) Controlled reléase of recombinant insulin-like growth factor from a novel formulation of polylactide-co-glycolide microparticles. J. Control Reléase 70: 21-28) que permite la liberación eficaz de un IGF-I intacto y biológicamente activo (Meinel L, lili OE, Zapf J, Malfanti M, Peter MH, and Gander B (2001) Stabilizing insulin-like growth factor-I in poly(D,L-lactide-co- glycolide) microspheres. J.Control Reléase 70: 193-202; Singh M, Shirley B, Bajwa K, Samara E, Hora M, and OΗagan D (2001) Controlled reléase of recombinant insulin-like growth factor from a novel formulation of polylactide-co-glycolide microparticles. J.Control Reléase 70: 21-28). Se parten de 40 mg de IGF-I que se disuelven en 100 microlitros de ácido acético 0,01 mM. A esta disolución se le añaden 0,7 mi de fosfato monosódico 10 mM (pH 6,0) conteniendo 10,5 mg de tween 20 (Serva, Alemania). Paralelamente se disolvieron en 500 mg del copolímero de ácido láctico y glicólico 50:50 (PLGA 50:50, Resomer® 506, Alemania), con una viscosidad inherente de 0.8 dl/gr, en 10 mi de cloruro de metileno, que se mezcla con la fase acuosa de IGF-I. La emulsión se homogeniza a 13500 rpm, utilizando un Polytron® durante 2 minutos, para obtener una primera emulsión binaria A/O de pequeño tamaño de partícula. Posteriormente, se añade dicha emulsión a una solución de 400 mi de tampón PBS de pH 7,4, formado para 1 litro con 6,8 g de fosfato monopotásico y 195,5 mi de solución de NaOH 0,2M. Este tampón PBS tiene incorporado 8 g de alcohol polivinílico (alcohol polivinílico 15000, Fluka, suiza). Al incorporar la primera emulsión sobre la solución de PBS y después de agitar enérgicamente con un homogenizador a 13500 rpm durante 2 minutos (Ultraturrax®), se obtiene una triple emulsión AJO/ A. Esta triple emulsión se mantiene en agitación suave (700 rpm) durante 4 horas para que se vaya evaporando el cloruro de metileno, y formándose así las microesferas. Posteriormente, las microesferas se recuperan mediante una centrifugación a 6000 rpm durante 20 minutos y se decanta el sobrenadante. A continuación se lavan con agua desionizada y de nuevo se centrifugan y decantan. El proceso de lavado se repite tres veces. Por último, las microesferas se liofilizan y se conservan en nevera (4°C) hasta su utilización. El nivel de carga de rhIGF-I en las microesferas se determinó mediante la disolución de 10 mg de microesferas en 1 mi de NaOH 1N mediante agitación durante toda la noche a temperatura ambiente. La concentración proteica se valoró mediante absorción UN a 284 nm, utilizando un coeficiente de extinción de 1.043 (mg/ml)"1 cm"1 para rhIGF-I en ΝaOH 1Ν. El tamaño de la microesfera se determinó mediante difracción láser (Galai® Cis-1). Las muestras diluidas de varios lotes fueron corridas por triplicado, y se estimó para cada lote el diámetro medio. La morfología de la microesferas se analizó mediante microscopía electrónica (JEOL 6400). Las microesferas resultantes tienen un tamaño medio de partícula de 1,3±1 micrómetros, y una riqueza del 5%. El porcentaje de encapsulación fue del 70%. La administración subcutánea de estas micro esferas de IGF-I a ratas adultas (5 mg/kg) provocó que los niveles en sangre de IGF-I se mantuvieran elevados durante al menos de 2 semanas (Figura IB). Hay que indicar que el relativo pequeño diámetro de estas microesferas facilitó la inyección de dicha suspensión a través de una aguja 23 G. Ejemplo le- Elaboración de cápsulas de implantación de IGF-I. Para preparar un lote de 10 comprimidos se pesan 15 mg de IGF-I (GroPep,
Australia) que posteriormente se disuelven en 1,5 mi de ácido acético 0,01 mM. A esta solución se le añaden 30 mg de ciclosporina que queda en suspensión. Esta mezcla se añade a 455 mg de copolímero de ácido láctico y glicólico (Resomer 503 H de Boehringer Ingelhem) y se amasa suavemente, pasando a continuación el producto a través de una malla de 2 mm de luz. Se deja secar a temperatura ambiente durante tres horas y se vuelve a pasar por la malla anterior. Se deja secar otras 15 horas a temperatura ambiente y se comprime con punzones cóncavos de 6 mm de diámetro, ajusfando el peso de las cápsulas a 50 mg. De esta forma se obtienen cápsulas ó comprimidos biconvexos de 6 mm de diámetro y 3 mm de espesor de 50 mg y con una riqueza de 1,5 mg de IGF-I por cápsula. Estos comprimidos se implantan mediante una pequeña incisión y sin necesidad de anestesia debajo de la piel de los ratones "ped" y al ser de material biodegradable no necesita ser retirada. Ejemplo 2.- Tratamiento de ratones con degeneración hereditaria del cerebelo (Purkinje cell degeneration) mediante microesferas y cápsulas de implantación de IGF-I
En ratones de dos meses de edad con ataxia cerebelar hereditaria (ratones pcd "Purkinje cell degeneration", Jackson Labs) que manifiestan la enfermedad al mes de vida (descoordinación motora que lleva a la muerte prematura) se administraron microesferas de IGF-I por inyección subcutánea a dosis de 100 μg/kg una vez cada dos semanas tras dos primeras dosis de 50 y 75 μg/kg (Figura 2A). Para determinar la regresión o no de los síntomas tras este tratamiento se determinó su capacidad motora una vez por semana en el test de rota-rod (A.M. Fernandez, A. González de la Vega, I. TORRES-ALEMÁN, msulin-like growth factor restores motor coordination in a rat model of cerebellar ataxia. Proc. Nat. Acad. Sci. (USA) 95: 1253-1258 (1998)). El experimento se realizó en dos lotes independientes de 6 ratones cada vez. El resultado fue que los ratones mostraron un grado normal de coordinación de movimientos mientras se mantuvo el tratamiento (100 días) con las microesferas (Figura 2 A, línea con triángulos) e igualmente con cápsulas (Figura 2A, línea con cuadrados), en comparación con los datos observados en ratones sanos (los ratones tratados presentaron valores de coordinación motora máxima cercanos a 300 sec de forma similar a los observados en ratones sanos (datos no mostrados)) mientras que en el grupo control no desaparecieron los síntomas de ataxia (valores de coordinación motora máxima del orden de 200-240 sec).
Hay que indicar que a lo largo del tiempo una vez administrada una dosis de IGF-I, ya sea mediante microesferas o cápsulas, la disminución de los niveles de IGF-I se correlaciona con la pérdida de la capacidad de coordinación motora y que al administrar nuevas dosis de IGF-I (tras la segunda dosis (14 días) y tercera dosis (28 días) de las microesferas y tras la nueva reimplantación de la cápsula (70 días) los síntomas de la enfermedad vuelven a desaparece. Nótese también que la eficacia del tratamiento con las microesferas depende de la dosis administrada (Figura 2A) de tal forma que no se observa disminución de la coordinación motora con la dosis de 100 μg/kg al contrario que lo observado con las dosis iniciales de 50 y 75 μg/kg. Ejemplo 3.- Tratamiento de animales transgénicos enfermos de Alzheimer con microesferas IGF-I.
En ratones transgénicos de 10 meses de edad que presentan un exceso de beta- amiloide por trans génesis del gen de APP humano mutado (ratones Tg2576, ver Hsiao et al., 1996 (Hsiao K, Chapman P, Nilsen S. Eckman C, Harigaya Y, Younkin S, Ynag F, Colé G. Correlative memory déficits, Abeta elevation, and amyloid plaques in transgenic mice. Science. 274: 99-102, (1996)), mantenidos en condiciones estándar de estabulación: ciclos de 12 horas de luz-oscuridad y agua y comida libre) se administraron microesferas de IGF-I durante un mes y posteriormente se valoraron los niveles de beta-amiloide cerebral mediante western blot. Los niveles de beta-amiloide (BA) (valorando por densitometría las bandas obtenidas por westeπi blot) en la corteza e hipocampo de los ratones transgénicos sin tratar eran de 7 y 25 veces más altos que los encontrados en sus hermanos no enfermos (APP--/-) mientras que los ratones transgénicos tratados con IGF-I presentaron niveles de βA iguales a los animales no enfermos (p<0.01 vs Tg2576 sin tratar).
Ejemplo 4.- Prevención de la enfermedad de Alzheimer en ratas viejas con microesferas IGF-I
En ratas Wistar viejas de 18 meses de edad , mantenidas en condiciones estándar de luz y comida, se administraron las microesferas de IGF-I durante 1 mes y se determinaron la aparición de lesiones glióticas en el parénquima cerebral (corteza frontal) mediante la inmunotinción de la proteína GFAP (Lee, CK. Weindruch, R & Prolla, TA. Gene-expression profile of the ageing brain in mice. Nature Genet 25, 294- 297 (2000)) (Figura 2B), la determinación de los niveles de la proteína GFAP (Figura 2C) y la determinación de βA en cerebro (corteza) y líquido cefalorcaquídeo (CSF) (Naucher, E. et al. Amyloid β peptide levéis and its effects on hippocampal acetylcholine reléase in aged, cognitively impaired and unimpaired rats. J chem Νeuroanat 21, 323-329 (2001)) (Figura 2D) mediante westem blot, todos ellos síntomas de la amiloidosis asociada a la neurodegeneración de Alzheimer. Todos estos parámetros fueron similares entre las ratas viejas tratadas con IGF-I y las ratas adultas, mientras que en estos dos casos anteriores los niveles eran menores que los observados en ratas viejas no tratadas (Figura 2B, 2C y 2D). Hay que indicar que los niveles de βA en CSF se incrementaron en ratas viejas tratadas con IGF-I por aclaración del A (Figura 2D, panel inferior). Materiales y métodos
Animales. Las ratas Wistar adultas y viejas (250-350 gr), los ratones transgénicos Tg2576, los ratones macho y hembra "pcd" (Purkinje cell degeneration) cruzados endogámicamente, y las carnadas de ratones no atáxicos agrupados por edad y sexo conjuntamente con ratones C57, como grupo control, fueron utilizados de acuerdo con la Directiva EU 86/609/EEC. Los animales se mantuvieron bajo condiciones estándares de laboratorio.
Reactivos. 125 INa (Amersham, Gran Bretaña) se utilizó para iodinar rhIGF-I. A menos que se diga lo contrario, el resto de reactivos utilizados en la presente invención provienen de Sigma (USA) o de Merck (España).
Diseño experimental del análisis de IGF-I en sangre: Las múltiples muestras de sangre tomadas a cada animal se realizaron en ratas adultas y se determinó los niveles de IGF-I en suero antes y después de la administración subcutánea (se) de rhIGF-I. Dependiendo del peso de las ratas se prepararon las dosis de microesferas (5 mg/Kg) como una suspensión en una solución salina estéril para su inmediata administración in bolus. Por otro lado, otro grupo de ratas recibieron un bolus subcutáneo de una inyección convencional de una solución de 1.8 mg/kg de rhIGF-I. En todos los casos las muestras de sangre se tomaron a través de la vena subclavia a diferentes tiempos tras las inyección. Las relativas altas dosis utilizadas permitieron asegurar su detección en el suero tras su inyección. Debido a que es difícil de realizar múltiples extracciones de muestras sanguíneas en ratones, estas se llevaron a cabo en diferentes ratones en los distintos momentos. Debido a que los ratones pcd son difíciles de criar, únicamente se emplearon para determinar la eficacia terapéutica de las microesferas de IGF-I.
Para minimizar la interferencia con IGFBPs las muestras de suero fueron extraídas mediante un papel de silicio C18. (Millipore, USA) mientras que las muestras de tejido fueroon hervidas en ácido acético 1N durante 30 minutos tal como se describió anteriormente por los inventores (Pons S and Torres-Alemán I (1992) Basic fibroblast growth factor modulates insulin-like growth factor-I, its receptor, and its binding proteins in hypothalamic cell cultures. Endocrinology 131:2271-2278).

Claims

REIVINDICACIONES
1.- Composición terapéutica que contiene el factor natural neuroprotector IGF-I que permite la liberación lenta de IGF-I intacto y funcionalmente activo caracterizado porque está constituida por unas microesferas de copolímeros de alta viscosidad entre 0.5 y 1.5 dl/g y con un diámetro menor de 5 micrometros.
2.- Composición terapéutica según la reivindicación 1 caracterizada porque las microesferas de copolímeros presentan una viscosidad de 0.8 dl/g y un diámetro cercano a 1.3 micrometros.
3.- Procedimiento de preparación y obtención de la composición terapéutica según las reivindicaciones 1 y 2 mediante la técnica de triple emulsión y extracción de solvente caracterizado porque se realiza de la siguiente forma:
Los copoliméros utilizados son de alta viscosidad entre 0.5 y 1.5 dl/g, y más preferentemente con una viscosidad de 0.8 dl/g,
Se utilizan altas velocidades de homogenización, preferentemente a 13500 rpm
- Las soluciones utilizadas presentan un pH no alcalino, y
Se prescinde de otras proteínas de alto peso molecular, entre otras, albúmina y gelatina.
4.- Procedimiento de preparación y obtención de la composición terapéutica según la reivindicación 3 caracterizado porque el copolímero es, entre otros, un copolímero de ácido láctico y glicólico 50:50 (PLGA 50:50).
5.- Utilización de la composición terapéutica según las reivindicaciones 1 y 2 en la elaboración o preparación de medicamentos para el tratamiento y prevención de enfermedades neurodegenerativas como, entre otras, enfemiedad de Alzheimer, ataxia cerebelosa, ataxia-telangiectasia, demencia vascular, esclerosis múltiple, ictus, neuropatías periféricas y trauma cerebral o espinal.
6.- Comprimido con una capacidad de liberación prolongada de IGF-I caracterizado porque se obtiene mediante un procedimiento basado en la siguiente técnica:
- El IGF-I se disuelve en ácido acético 0,01 mM,
- A esta solución se le añade ciclosporina que queda en suspensión, - Esta mezcla se añade al copolímero de ácido láctico y glicólico (Resomer
503 H de Boehringer igelhem) y se amasa suavemente, pasando a continuación el producto a través de una malla de 2 mm de luz, Se deja secar a temperatura ambiente durante tres horas y se vuelve a pasar por la malla anterior, - Se deja secar otras 15 horas a temperatura ambiente y se comprime con punzones cóncavos de 6 mm de diámetro 7.- Utilización del comprimido según la reivindicación 6 en la elaboración o preparación de medicamentos para el tratamiento y prevención de enfermedades neurodegenerativas como, entre otras, enfermedad de Alzheimer, ataxia cerebelosa, ataxia-telangiectasia, demencia vascular, esclerosis múltiple, ictus, neuropatías periféricas y trauma cerebral o espinal.
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