MXPA04008402A - Composicion quimica de igf-i para el tratamiento y prevencion de enfermedades neurodegenerativas. - Google Patents

Abstract

La invencion se refiere a nuevas composiciones terapeuticas de administracion lenta de IGF-I, a un procedimiento de preparacion y obtencion de las mismas y a su empleo para la elaboracion de medicamentos para el tratamiento y prevencion de enfermedades neurodegenerativas como, entre otras, la enfermedad de Alzheimer o la ataxia cerebelar; estas composiciones corresponden con microesferas de tamano menor de 5 micrometros, entre otras caracteristicas, y con capsulas de implantacion subcutanea.

Description

COMPOSICION QUIMICA DE IGF-I PARA EL TRATA IENTO Y PREVENCION DE ENFERMEDADES NEURODEGENERATIVAS CAMPO DE LA INVENCION La invención se refiere a la preparación y obtención de nuevas composiciones (microesferas y comprimidos) de administración de principios activos, entre otros, IGF-I, y su utilización en el tratamiento y prevención de enfermedades neurodegenerativas como, entre otras, la enfermedad de Alzheimer o la ataxia cerebelar.

ESTADO DE LA TECNICA En la actualidad no existe ninguna droga o método que proteja frente a enfermedades neurodegenerativas. Este tipo de enfermedades están creciendo en importancia en los países desarrollados debido al paulatino envejecimiento de la población ya que muchas de ellas están asociadas a la edad (Amaducci L, and Tesco G, Aging as a major risk for degenerative diseases of the central nervous system, Curr. Opin. Neurol., 7: 283-286 (1994)). Sin embargo, aunque se están estudiando intensamente las causas de enfermedades como demencia de Alzheimer o enfermedad de Parkinson, y se está empezando a reconocer un_ componente cjenéticp importante (Heintz N, and Zoghbi HY, Insights from mouse models into the molecular basis of neurodegeneration, Annu. Rev. Physiol, 62: 779-802 (2000)), no existe de momento ningún tratamiento efectivo, con lo que su prevención es de extrema importancia. El hecho de que muchas de ellas tengan un claro componente hereditario permite que se pueda predecir si se va desarrollar o se tiene predisposición a desarrollar una enfermedad neurodegenerativa. Esto significa que se pueden tomar medidas protectoras frente a la enfermedad antes de que ésta haga su aparición. Por ejemplo, un sistema preventivo que está a punto de ensayarse en poblaciones de riesgo para el Alzheimer es la vacunación (Gurwitz D, Immunization for Alzheimer's disease: yet closer to clinical triáis, Trends Immunol. 22: 542-543, (2001 )) ya que existen sujetos genéticamente predispuestos a padecerlo y la edad avanzada es un factor de riesgo. Existen una serie de proteínas de origen natural con actividad trófica hormonal terapéutica que han de ser administradas por vía parenteral debido a que son degradadas por el sistema digestivo. La más conocida es la insulina, de la que se están intentando desarrollar sistemas alternativos de administración desde hace muchos años. La administración diaria por inyección, aunque sea subcutánea, tiene dos problemas principales: el paciente tiende a evitarla (la fidelidad disminuye), y la biodisponibilidad, y por tanto la eficacia terapéutica puede verse reducida. Para el caso del factor trófico IGF-I, cuya eficacia terapéutica para un amplio rango de enfermedades está_ si_endo_ensayada_enJa actualidad (Relación de ensayos clínicos que se están realizando en la actualidad en Estados Unidos: http://clinicaltrials.qov/ci gui/c/a2b/action/GetStudv?JServSessionldzone ct=1 bfv4qa8h1 ), se ha observado que la administración repetida a lo largo del dia por via subcutánea es mas eficaz que una única inyección (Woodal SM, Breier BH, O'Sullivan U, Gluckman PD. The effect of the frequency of subcutaneous insulin-like growth factor I administration on weight gain in growth hormone deficient mice. Horm Metab Res 12: 581 -584 (1991 )), probablemente debido a que los niveles en sangre permanecen elevados por mas tiempo. Una solución que se está intentando para este problema es el desarrollo de sistemas de liberación prolongada ("depot") de factores tróficos, incluido el IGF-I (Lam XM, Dueñas ET, Daugherty AL, Levy N, and Cleland JL "Sustained reléase of recombinant human insulin-like growth factor-l for treatment of diabetes" J. Contr Reí 67: 281-292 (2000); Singh M, Shirley B, Bajwa K, Samara E, Hora , and O'Hagan D, "Controlled reléase of recombinant insulin-like growth factor from a novel formulation of polylactide-co-glycolide microparticles" J. Contr. Reí. 70: 21-28 (2001 ); Meinel L, lili OE, Zapf J, Malfanti M, Merkle HP, Gander B, "Stabilizing insulin-like growth factor-l in poly (D.L-lactide-co-glycolide) microspheres" J. Contr. Reí. 70: 193-202 (2001 )). Las compañías farmacéuticas especializadas en factores tróficos están dedicando grandes esfuerzos a desarrollar este tipo de formulación. Estudios previos han demostrado la utilidad de IGF-I formulada en sistemas osmóticos de administración subcutánea de liberación controlada. Estos sistemas producen _efectos„ terapéuticos . en_ algunos _ procesos , patológicos (Fernandez AM, González de la Vega A, Torres-Alemán I, "Insulin-like growth factor restores motor coordination in a rat model of cerebellar ataxia". Proc. Nat. Acad. Sci. (USA) 95: 1253-1258 (1998)). Sin embargo, dichos sistemas tienen la desventaja de ser muy voluminosos (y por lo tanto de difícil implantación en seres humanos) y de que es preciso retirar el dispositivo osmótico una vez finalizada la liberación. Con el fin de evitar este inconveniente se pueden fabricar preparados biodegradables de tamaño reducido y de liberación prolongada. Con este fin se emplean cada vez con más frecuencia copolímeros biodegradables de ácido láctico y glicólico, semejantes a los empleados en la fabricación de hilo de sutura reabsorbible. Existen distintos copolímeros en los que se pueden variar las proporciones de poliláctico y poliglicólico y la viscosidad de los mismos. De esta forma se puede controlar la velocidad de cesión del fármaco incorporado, y consecuentemente prolongar su absorción y la duración de sus efectos. Normalmente cuanto mayor sea la proporción de poliláctico en relación a la de poliglicólico, menor es la velocidad de cesión. Por otro lado, a mayor viscosidad intrínseca del polímero, menor es la velocidad de liberación. Concretamente, con el IGF-I, se han publicado recientemente tres trabajos (Lam XM, Dueñas ET, Daugherty AL, Levy N, and Cleland JL "Sustained reléase of recombinant human insulin-like growth factor-l for treatment of diabetes" J. Contr Reí 67: 281-292 (2000); Singh M, Shirley B, Bajwa K, Samara E, Hora M, and O'Hagan D, "Controlled reléase of recombinant insulin-like growth factor from a novel formulation of polylactjde^co-glycolide mjcropart 21 -28 (200 ); Meinel L, lili OE, Zapf J, Malfanti M, Merkle HP, Gander B, "Stabilizing insulin-like growth factor-l in poly (D,L-lactide-co-glycolide) microspheres" J. Contr. Rel. 70: 193-202 (2001 )) en los que se utiliza el copolímero de ácido láctico y glicólico en proporción 50:50 (Resomer 502H de la empresa Boehringer Ingelheim). Los procedimientos de preparación son o bien por atomización, o por la técnica de triple emulsión. En la técnica de triple emulsión se utilizaron distintos sistemas para aumentar el tamaño de las microesferas resultantes. Así, en el trabajo de M. Singh y col. (Singh M, Shirley B, Bajwa K, Samara E, Hora M, and O'Hagan D, "Controlled reléase of recombinant insulin-like growth factor from a novel formulation of polylactide-co-glycolide microparticles" J. Contr. Rel. 70: 21 -28 (2001 )), se induce un cambio de pH que produce una precipitación parcial de IGF-I, mientras que en el trabajo de L. Meinel y col. (Meinel L, lili OE, Zapf J, Malfanti M, Merkle HP, Gander B, "Stabilizing insulin-like growth factor-l in poly (D,L-lactide-co-glycolide) microspheres" J. Contr. Rel. 70: 193-202 (2001 )), se emplean velocidades de agitación lenta y se incorporan proteínas como gelatina y albúmina que van a dar lugar a la obtención de microesferas de gran tamaño. En todos estos sistemas descritos las microesferas resultantes tienen un tamaño superior a 30 micrómetros, concretamente entre 30 y 125 micrómetros que varía dependiendo del trabajo.

BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION La invención se refiere a nuevas composiciones terapéuticas de administración lenta de IGF-I, a un procedimiento de preparación y obtención de las mismas y a su utilización en la elaboración de medicamentos para el tratamiento y prevención de enfermedades neurodegenerativas como, entre otras, la enfermedad de Alzheimer o la ataxia cerebelar. Estas composiciones se corresponden con microesferas de tamaño menor de 5 micrometros, entre otras características, y con comprimidos de implantación subcutánea.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION La invención va dirigida a prevenir enfermedades del sistema nervioso debidas a pérdida de neuronas ya sean de origen genético o esporádico. Consiste en la administración por vía subcutánea de una formulación terapéutica de larga duración y biodegradable, desarrollada en la presente invención, conteniendo el factor natural neuroprotector IGF-I. La novedad de esta aplicación es que se consigue que los síntomas de enfermedad neurodegenerativa, valorada en diferentes modelos animales de ataxia cerebelar hereditaria y de enfermedad de Alzheimer y en ratas viejas, no aparezcan mientras se administre periódicamente dicha formulación de larga duración (ver Ejemplos 2, 3 y 4; Figuras 2A a 2D). Además, la administración de esta formulación se hace muy cómoda (1 ó dos veces al mes) (Figura 1 B), y se consigue una eficacia terapéutica mayor que con inyección subcutánea diaria de IGF-I (Figura 1A) ya que los niveles terapéuticos se mantienen mucho más tiempo. Como la vía de administración es subcutánea, se han desarrollado partículas de menor tamaño (menores de 5 micrometros) ya que pasan con mayor facilidad a través de las agujas de inyección. Así, un objeto de la presente invención lo constituye una formulación ó composición terapéutica que contiene el factor natural neuroprotector IGF-I, en adelante composición terapéutica de la presente invención, que permite la liberación lenta de IGF-I intacto y funcionalmente activo y que está constituida por unas microesferas de copolímeros de alta viscosidad y con un diámetro menor de 5 micrometros, generalmente entre 1 y 2 micrometros, y preferentemente cercano a 1.3 micrometros. La composición terapéutica proporcionada por esta invención comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de IGF-I junto con, al menos, un excipiente farmacéuticamente aceptable. Dicha composición terapéutica es útil para su administración y/o aplicación en el cuerpo de un mamífero, preferentemente el ser humano. La cantidad de la composición terapéutica de la presente invención terapéuticamente eficaz que debe administrarse así como su dosificación para tratar un estado patológico dependerá de numerosos factores, „ _entre_|os que se encuentra Ja_ edad,._ eL.estadcL del paciente, la severidad de la enfermedad, la ruta y frecuencia de administración, etc.

La composición terapéutica que contiene IGF-I proporcionada por esta invención pueden presentarse en cualquier forma de administración que se considere adecuada para su administración subcutánea, para la que se incluirán los excipientes farmacéuticamente aceptables necesarios para la formulación de la forma de administración deseada. Una revisión de las distintas formas farmacéuticas de administración de medicamentos y de los excipientes necesarios para la obtención de las mismas puede encontrarse, por ejemplo, en el "tratado de Farmacia Galénica", C Faulí í Trillo, 1993, Luzán 5, SA Ediciones, Madrid. El posible efecto en la velocidad de cesión se ha compensado con la utilización de copolímeros de mayor viscosidad como el Resomer 506 (Boehringer Ingelheim) en lugar del 502H descrito en los trabajos previos. Así, se propone el empleo de un cbpolímero de una viscosidad de 0.8 dl/g, en lugar del descrito en los trabajos citados que tiene una viscosidad de 0.2 dl/g. Para obtener estas microesferas de menor tamaño se empleó la técnica de triple emulsión en la que se utiliza como base una solución de IGF-I y altas velocidades de homogenización, para tener el menor tamaño posible de fase interna en la emulsión. Además, en el método propuesto en la presente invención, se prescinde de la utilización de pH alcalinos (en los que se puede insolubilizar IGF-I) y de otras proteínas de alto peso molecular (albúmina, gelatina, etc). De esta forma se obtienen microesferas de pequeño tamaño, generalmente entre 1- ^ rn[crómetros, más apropiadas . ara |a administración subcutánea por inyección con agujas.

Un objeto adicional de la presente invención lo constituye un procedimiento de preparación y obtención de la composición terapéutica de la presente invención, en adelante procedimiento de la presente invención, basado en la técnica de triple emulsión y extracción de solvente y que, al menos, se realiza de la siguiente forma: - Los copoliméros utilizados son de alta viscosidad entre 0.5 y 1.5 dl/g, y más preferentemente con una viscosidad de 0.8 dl/g, - Se utilizan altas velocidades de homogenización, preferentemente a 13500 rpm - Las soluciones utilizadas presentan un pH no alcalino, y - Se prescinde de otras proteínas de alto peso molecular, entre otras, albúmina y gelatina. Un objeto particular de la presente invención lo constituye el procedimiento de la presente invención donde el copolímero es, entre otros, un copolimero de ácido láctico y glicólico 50:50 (PLGA 50:50). Otro objeto adicional de la presente invención lo constituye una composición terapéutica obtenida por el procedimiento de la presente invención. Como referencia y a nivel de ilustración, no limitativa, de la técnica de triple emulsión se presentan los trabajos publicados de Lam XM et al, Singh M et al y Meinel L et al (Lam XM, Dueñas ET, Daugherty AL, Levy Nu and Cíela nd_ JL_"Sustained reléase jof jecombjnant human ...insulin-like growth factor-l for treatment of diabetes" J. Contr Reí 67: 281-292 (2000); Singh M, Shirley B, Bajwa K, Samara E, Hora M, and O'Hagan D, "Controlled reléase of recombinant insulin-like growth factor from a novel formulation of poiylactide-co-glycolide microparticles" J. Contr. Reí. 70: 21-28 (2001 ); Meinel L, lili OE, Zapf J, Malfanti M, Merkle HP, Gander B, "Stabilizing insulin-like growth factor-l in poly (D,L-lactide-co-glycolide) microspheres" J. Contr. Reí. 70: 193-202 (2001)). Por otro lado, y tal como se indicaba en la introducción estas microesferas de copolímeros de ácido láctico y glicólico se pueden elaborar además de por el procedimiento de triple emulsión y extracción de solvente, entre otras, por la técnica de atomización por expertos en la materia, por lo que formulaciones terapéuticas de la presente invención preparadas y obtenidas por estas técnicas forman parte de la presente invención. El procedimiento de atomización se ha descrito para la elaboración de microesferas en numerosos trabajos por ejemplo los siguientes: P. Johansen, E. Estévez, R. Zurbriggen, H.P. Merkle, R. Gluck, G. Corradin y B. Gander. Towards clinical testing of a single-administration tetanus vaccines based on PLA/PLGA microspheres. Vaccine. 2000. 19(9-10): 1047-54; P. Johansen, Y. Men, R. Audran, G. Corradin, H.P. Merkle y B. Gander. Improving stability of microencapsulated tetanus toxoid by co-encapsulation of additives. Pharmaceutical Research. 1998. 15(7): 1 103-10; S. Takada, Y. Uda, H. Toguchi y Y. Ogawa. Application of a spray-drying technique in the production of THR-containing injectable sustaine_dHelease microparticles of biodegradable polymers. PDA Journal of Pharmaceutical Science and Technology. 1995. 49(4): 180-4; F. Pavanetto, I. Genta, P. Giunchedi y B. Conti. Evaluation of spray drying as a method for polylactide and polylactide-co-glycolide microsphere preparation. Journal of Microencapsulation. 1993. 10(4):487-97; B. Bittner y T. Kissel. Ultrasonic atomization for spray drying: a versatile technique for the preparation of protein loaded biodegradable microspheres. Journal of Microencapsulation. 1999. 16(3): 325-341 . Tanto las microesferas como los comprimidos se administran periódicamente por inyección o implantación subcutánea. La eficacia protectora frente a enfermedad neurodegenerativa se mantiene de manera prolongada: se ha administrado durante casi 5 meses a ratones pcd que padecen neurodegeneración hereditaria y éstos no han desarrollado la enfermedad neurodegenerativa - hereditaria en todo este tiempo. Es decir, mientras se mantenga la administración, la enfermedad no aparece, si se interrumpe la administración, la enfermedad se manifiesta, aunque en estadios iniciales de la enfermedad, la re-administración del producto permite que los síntomas de la enfermedad vuelvan a desaparecer (Figura 2A). Por otro lado, la administración de la composición terapéutica en forma de microesferas a ratones transgénicos enfermos de Alzheimer y en ratas viejas disminuyó los síntomas asociados a dicha enfermedadcomo son, entre otros, los depósitos de beta-amiloide, las lesiones glióticas reactivas (ver Ejemplos 3 y 4, Figuras 2B a 2D). La presente invención describe la utilización de cualquiera de estas composiciones en la preparación de medicamentos para el tratamiento y prevención de enfermedades neurodegenerativas como, entre otras, enfermedad de Alzheimer, ataxia cerebelosa, ataxia-teiangiectasia, demencia vascular, esclerosis múltiple, ictus, neuropatías periféricas y trauma cerebral o -espinal. Así, un objeto de la presente invención lo constituye la utilización de la composición terapéutica de la presente invención en la elaboración o preparación de medicamentos para el tratamiento y prevención de enfermedades neurodegenerativas como, entre otras, enfermedad de Alzheimer, ataxia cerebelosa, ataxia-telangiectasia, demencia vascular, esclerosis múltiple, ictus, neuropatías periféricas y trauma cerebral o espinal. Además de estas pequeñas microesferas, y con el fin de obtener preparados de muy larga duración de efectos se han desarrollado comprimidos de implantación subcutánea (ver Ejemplo 1 c), en adelante comprimido de la presente invención, de los cuales no se han encontrado referencias, ni datos de estudios previos por otros autores. Así, un objeto adicional de la presente invención lo constituye este comprimido con una capacidad de liberación prolongada de IGF-I. Un objeto adicional de la presente invención lo constituye un procedimiento de preparación y obtención del comprimido de la presente invención basado en la siguiente técnica: - El IGF-I se disuelve en ácido acético 0.01 mM, - A esta solución se le añade ciclosporina, - _ Esta, mezcla jse . añade ai. copolímero de ácido , láctico, y glicólico (Resomer 503 H de Boehringer Ingelhem) y se amasa suavemente, pasando a continuación el producto a través de una malla de 2 mm de luz, - Se deja secar a temperatura ambiente durante tres horas y se vuelve a pasar por la malla anterior, y - Se deja secar otras 15 horas a temperatura ambiente y se comprime con punzones cóncavos de 6 mm de diámetro Finalmente, un objeto adicional de la presente invención lo constituye la utilización del comprimido de la presente invención en la elaboración o preparación de medicamentos para el tratamiento y prevención de enfermedades neurodegenerativas como, entre otras, enfermedad de Alzheimer, ataxia cerebelosa, ataxia-telangiectasia, demencia vascular, esclerosis múltiple, ictus, neuropatías periféricas y trauma cerebral o espinal.

BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS Figuras 1A y 1 B.- Los niveles de IGF-I en sangre tras una única inyección subcutánea de IGF-I (FIG. 1A) se mantienen elevados menos de 24 horas, mientras que tras inyección subcutánea (se) de microesferas de IGF-I (FIG. 1B), éstos se mantienen elevados durante al menos 2 semanas. Figuras 2A a 2D.- Efecto preventivo del tratamiento con depots de IGF-I en enfermedades neurodegenerativas en FIG. 2A) Ratones con ataxia cerebelar _ here^jterja_ trataos con microesferas de IGF-I ( ), con comprimidos de IGF-I ( ) y el grupo control sin tratamiento (microesferas vacías) (·) El grado de coordinación motora se valora con el test de "rota-rod" descrito en Fernández et al (1998) FIG. 2B) Ratas viejas tratadas con microesferas de IGF-I en las que se valoró la amiloidosis asociada a neurodegeneracion durante el envejecimiento normal de los animales mediante inmunotinción de la proteína GFAP, FIG. 2C) Ratas viejas tratadas con microesferas de IGF-I en las que se valoró la amiloidosis asociada a neurodegeneracion durante el envejecimiento normal de los animales mediante la determinación de los niveles de la proteína GFAP en cerebro (corteza), y FIG. 2D) Ratas viejas tratadas con microesferas de IGF-I en las que se valoró la amiloidosis asociada a neurodegeneracion durante el envejecimiento normal de los animales mediante la determinación de los niveles de beta-amiloide en cerebro (corteza) y líquido cefalorraquídeo (CSF).

EJEMPLOS EJEMPLO 1 Elaboración y administración de preparaciones de administración de IGF-I EJEMPLO 1A Invección subcutánea de IGF-I (Figura 1A) Se disuelve IGF-I humano recombinante (rhIGF-l) liofilizado (GroPep, Australia) en suero salino (CLNa 0.9%) a una concentración de 500 µg/100 µ?. Ratas Wistar adultas de 300 grs (n=6 por cada tiempo de recogida) reciben una única inyección subcutánea (en la escápula) de 100 µ?. Para valoración del IGF-I en suero por radioinmunoensayo (I. Torres-Alemán, S. Pons, L.M. García-Segura. Climbing fiber deafferentation reduces insuline-like growth factor I (IGF-I) contení in cerebellum. Brain Res. 564: 348-351 (1991 ); S Pons and I Torres-Alemán Basic fibroblast growth factor modulates insuline- like growth factor-I, its receptor, and its binding proteins in hypothalamic cell cultures. Endocrinology 131 : 2271 -2278 (1992)) la sangre se extrae del tronco tras anestesia y decapitación del animal a distintos tiempos tras la inyección del IGF-I. ^ . Como- se- describe ~en la Figura ? A una inyección subcutánea única de IGF-I (1.8 mg/kg) en ratas adultas provocó un rápido incremento de los niveles de IGF-I aunque estos se mantienen así durante menos de 24 horas (Figura 1A).

EJEMPLO 1 B Elaboración de microesferas de IGF-I La preparación de las microesferas de IGF-I se realizó mediante una modificación del método descrito anteriormente de triple emulsión y extracción de solvente A/O/A (Singh M, Shirley B, Bajwa K, Samara E, Hora M, and O'Hagan D (2001 ) Controlled reléase of recombinant insulin-like growth factor from a novel formulation of polylactide-co-glycolide microparticles. J. Control Reléase 70: 21-28) que permite la liberación eficaz de un IGF-I intacto y biológicamente activo (Meinel L, lili OE, Zapf J, alfanti M, Peter MH, and Gander B (2001 ) Stabilizing insulin-like growth factor-l ¡n poly(D,L-lactide-co- glycolide) microspheres. J. Control Reléase 70: 193-202; Singh M, Shirley B, Bajwa K, Samara E, Hora M, and O'Hagan D (2001 ) Controlled reléase of recombinant insulin-like growth factor from a novel formulation of polylactide-co-glycolide microparticles. J. Control Reléase 70: 21-28). Se parten de 40 mg de IGF-I que se disuelven en 100 microlitros de ácido acético 0.01 mM. A esta disolución se le añaden 0.7 mi de fosfato monosódico 10 mM (pH 6.0) conteniendo 10.5 mg de tween 20 (Serva, Alemania). Paralelamente se disolvieron en 500 mg del copolímero de ácido láctico y gl ¡cólico 50:50 (PLGA 50:50, Resomer® 506, Alemania), con una viscosidad inherente de 0.8 dl/gr, en 10 mi de cloruro de metileno, que se mezcla con la fase acuosa de IGF-I. La emulsión se homogeniza a 3500 rpm, utilizando un Polytron® durante 2 minutos, para obtener una primera emulsión binaria A/O de pequeño tamaño de partícula. Posteriormente, se añade dicha emulsión a una solución de 400 mi de tampón PBS de pH 7.4, formado para 1 litro con 6.8 g de fosfato monopotásico y 195.5 mi de solución de NaOH 0.2M. Este tampón PBS tiene incorporado 8 g de alcohol polivinílico (alcohol polivinílico 15000, Fluka, suiza). Al incorporar la primera emulsión sobre la solución de PBS y después de agitar enérgicamente con un homogenizador a 13500 rpm durante 2 minutos (Ultraturrax®), se obtiene una triple emulsión A O/A. Esta triple emulsión se mantiene en agitación suave (700 rpm) durante 4 horas para que se vaya evaporando el cloruro de metileno, y formándose así las microesferas. Posteriormente, las microesferas se recuperan mediante una centrifugación a 6000 rpm durante 20 minutos y se decanta el sobrenadante. A continuación se lavan con agua desionizada y de nuevo se centrifugan y decantan. El proceso de lavado se repite tres veces. Por último, las microesferas se liofilizan y se conservan en nevera (4°C) hasta su utilización. El nivel de carga de rhIGF-l en las microesferas se determinó mediante la disolución de 10 mg de microesferas en 1 mi de NaOH 1 N mediante agitación durante toda la noche a temperatura ambiente. La concentración proteica se valoró mediante absorción UV a 284 nm, utilizando un -coeficiente -de extinción de 1.043 (mg/ml) -cm:1 para rhIGF-l en- NaOH 1 N-. El tamaño de la microesfera se determinó mediante difracción láser (Galai® Cis-1 ). Las muestras diluidas de varios lotes fueron corridas por triplicado, y se estimó para cada lote el diámetro medio. La morfología de la microesferas se analizó mediante microscopía electrónica (JEOL 6400). Las microesferas resultantes tienen un tamaño medio de partícula de 1.3+1 micrómetros, y una riqueza del 5%. El porcentaje de encapsulación fue del 70%. La administración subcutánea de estas microesferas de IGF-I a ratas adultas (5 mg/kg) provocó que los niveles en sangre de IGF-I se mantuvieran elevados durante al menos de 2 semanas (Figura 1 B). Hay que indicar que el relativo pequeño diámetro de estas microesferas facilitó la inyección de dicha suspensión a través de una aguja 23 G.

EJEMPLO 1C Elaboración de comprimidos de implantación de ¡GF-I Para preparar un lote de 10 comprimidos se pesan 15 mg de IGF-I (GroPep, Australia) que posteriormente se disuelven en 1.5 mi de ácido acético 0.01 mM. A esta solución se le añaden 30 mg de ciclosporina que queda en suspensión. Esta mezcla se añade a 455 mg de copolímero de ácido láctico y glicólico (Resomer 503 H de Boehringer Ingelhem) y se amasa suavemente, pasando a continuación el producto a través de una malla de 2 mm de luz. Se deja secar a temperatura ambiente durante tres horas y se vuelve . a _ pasar._p.on Ja__malla anterior. Se_ deja_secar_ otras ..15 horas a temperatura ambiente y se comprime con punzones cóncavos de 6 mm de diámetro, ajustando el peso de los comprimidos a 50 mg. De esta forma se obtienen comprimidos biconvexos de 6 mm de diámetro y 3 mm de espesor de 50 mg y con una riqueza de 1.5 mg de IGF-I por comprimido. Estos comprimidos se implantan mediante una pequeña incisión y sin necesidad de anestesia debajo de la piel de los ratones "pcd" y ai ser de material biodegradable no necesita ser retirada.

EJEMPLO 2 Tratamiento de ratones con degeneración hereditaria del cerebelo (Purkinie cell degeneration) mediante microesferas y comprimidos de implantación de 1GF-1 En ratones de dos meses de edad con ataxia cerebelar hereditaria (ratones pcd "Purkinje cell degeneration", Jackson Labs) que manifiestan la enfermedad al mes de vida (descoordinación motora que lleva a la muerte prematura) se administraron microesferas de IGF-I por inyección subcutánea a dosis de 100 µ?/kg una vez cada dos semanas tras dos primeras dosis de 50 y 75 µg kg (Figura 2A). Para determinar la regresión o no de los síntomas tras este tratamiento se determinó su capacidad motora una vez por semana en el test de rota-rod (A.M. Fernandez, A. González de la Vega, I. TORRES-ALEMAN. Insulin-like growth factor restores motor coordination in a rat model of cerebellar ataxia. Proc. Nat. Acad. Sci. (USA) 95: 1253-1258 (1998)). El experimento se realizó en dos lotes independientes de 6 ratones cada vez. El resultado fue que los ratones mostraron un grado normal de coordinación de movimientos mientras se mantuvo el tratamiento (100 días) con las microesferas (Figura 2A, línea con triángulos) e igualmente con comprimidos (Figura 2A, línea con cuadrados), en comparación con los datos observados en ratones sanos (los ratones tratados presentaron valores de coordinación- motora -máxima ^cercanos 3 300 -seo -de-forma, similar a -los observados en ratones sanos (datos no mostrados)) mientras que en el grupo control no desaparecieron los síntomas de ataxia (valores de coordinación motora máxima del orden de 200-240 sec). Hay que indicar que a lo largo del tiempo una vez administrada una dosis de IGF-I, ya sea mediante microesferas o comprimidos, la disminución de los niveles de IGF-I se correlaciona con la pérdida de la capacidad de coordinación motora y que al administrar nuevas dosis de IGF-I (tras la segunda dosis (14 días) y tercera dosis (28 días) de las microesferas y tras la nueva reimplantación del comprimido (70 días) los síntomas de la enfermedad vuelven a desaparece. Nótese también que la eficacia del o tratamiento con las microesferas depende de la dosis administrada (Figura 2A) de tal forma que no se observa disminución de la coordinación motora con la dosis de 100 µg/kg al contrario que lo observado con las dosis iniciales de 50 y 75 µg/kg.

EJEMPLO 3 Tratamiento de animales transgénicos enfermos de Alzheimer con microesferas IGF-I.

En ratones transgénicos de 10 meses de edad que presentan un exceso de beta-amiloide por transgénesis del gen de APP humano mutado (ratones Tg2576, ver Hsiao et al., 1996 (Hsiao K, Chapman P, Nilsen S. — Eckman ~C,-Harigaya-Y,-Younkin S, Ynag F, Colé G. Correlative memory - déficits, Abeta elevation, and amyloid plaques in transgenic mice. Science. 274: 99-102, (1996)), mantenidos en condiciones estándar de estabulación: ciclos de 12 horas de luz-oscuridad y agua y comida libre) se administraron microesferas de IGF-I durante un mes y posteriormente se valoraron los niveles de beta-amiloide cerebral medíante western blot. Los niveles de beta- amiloide (ß?) (valorando por densitometría las bandas obtenidas por western blot) en la corteza e hipocampo de los ratones transgénicos sin tratar eran de 7 y 25 veces más altos que los encontrados en sus hermanos no enfermos (APP--/-) mientras que los ratones transgénicos tratados con IGF-I presentaron niveles de ß? iguales a los animales no enfermos (p<0.01 vs Tg2576 sin tratar).

EJEMPLO 4 Prevención de la enfermedad de Alzheimer (prevención de la amiloidosis en cerebro) en ratas viejas con microesferas IGF-I En ratas Wistar viejas de 18 meses de edad , mantenidas en condiciones estándar de luz y comida, se administraron las microesferas de - IGF-I durante 1 mes y se determinaron la aparición de lesiones glióticas en el parénquima cerebral (corteza frontal) mediante la inmunotinción de la proteína GFAP (Lee, CK. Weindruch, R & Prolla, TA. Gene-expression profile of the ageing brain in mice. Nature Genet 25, 294-297 (2000)) (Figura 2B), la determLnación__de .ios _ niveles _de_ Ja . _prptejna_ GFA_P_ (Figura __2C) y. la determinación de ß? en cerebro (corteza) y líquido cefalorraquídeo (CSF) (Vaucher, E. et al. Amyloid ß peptide levéis and ¡ts effects on hippocampal acetylcholine reléase in aged, cognitively impaired and unimpaired rats. J chem Neuroanat 21 , 323-329 (2001 )) (Figura 2D) mediante western blot. Altos niveles de proteína GFAP o de péptido beta-amiloide en cerebro y/o bajos niveles de péptido beta-amiloide en líquidocefalorraquídeo son síntomas de la amiloidosis asociada a la neurodegeneración de Alzheimer. Todos estos parámetros fueron similares entre las ratas viejas tratadas con IGF-I y las ratas adultas, mientras que en estos dos casos anteriores los niveles eran menores que los observados en ratas viejas no tratadas (Figura 2B, 2C y 2D). Hay que indicar que los niveles de ß? en CSF se incrementaron en ratas viejas tratadas con IGF-I por aclaración del ? (Figura 2D, panel inferior).

Materiales y métodos Animales Las ratas Wistar adultas y viejas (250-350 gr), los ratones transgénicos Tg2576, los ratones macho y hembra "pcd" (Purkinje cell degeneration) cruzados endogámicamente, y las carnadas de ratones no atáxicos agrupados por edad y sexo conjuntamente con ratones C57, como grupo control, fueron utilizados de acuerdo con la Directiva EU 86/609/EEC. Los animales se mantuvieron bajo condiciones estándares de laboratorio.

Reactivos 125 INa (Amersham, Gran Bretaña) se utilizó para iodinar rhlGF-I. A menos que se diga lo contrario, el resto de reactivos utilizados en la presente invención provienen de Sigma (USA) o de Merck (España).

Diseño experimental del análisis de IGF-I en sangre Las múltiples muestras de sangre tomadas a cada animal se realizaron en ratas adultas y se determinó los niveles de IGF-I en suero antes y después de la administración subcutánea (se) de rhIGF-l. Dependiendo del peso de las ratas se prepararon las dosis de microesferas (50 pg//Kg) como una suspensión en una solución salina estéril para su inmediata administración in bolus. Por otro lado, otro grupo de ratas recibieron un bolus subcutáneo de una inyección convencional de una solución de 1.8 mg/kg de rhIGF-l. En todos los casos las muestras de sangre se tomaron a través de la vena subclavia a diferentes tiempos tras la inyección. Las relativas altas dosis utilizadas permitieron asegurar su detección en el suero tras su inyección. Debido a que es difícil de realizar múltiples extracciones de muestras sanguíneas en ratones, estas se llevaron a cabo en diferentes ratones en los distintos momentos. Debido a que los ratones ped son difíciles de criar, únicamente se emplearon para determinar la eficacia terapéutica de las microesferas de IGF-I. Para ._m¡_n[mjzar Ja_ interferencia, con . IGFBPs. Jas .muestras ..de suero fueron extraídas mediante un papel de silicio C-|8. (Millipore, USA) mientras que las muestras de tejido fueroon hervidas en ácido acético 1 N durante 30 minutos tal como se describió anteriormente por los inventores (Pons S and Torres-Alemán I (1992) Basic fibrobiast growth factor modulates insulin-like growth factor-l, its receptor, and its binding proteins in hypothalamic cell cultures. Endocrinology 131 :2271-2278).

Claims (1)

26 NOVEDAD DE LA INVENCION REIVINDICACIONES

1.- Una composición terapéutica que contiene el factor natural neuroprotector IGF-I que permite la liberación lenta de IGF-I intacto y funcionalmente activo, caracterizada porque está constituida por unas microesferas de copolímeros de alta viscosidad entre 0.5 y 1.5 dl/g y con un diámetro menor de 5 micrometros. 2 - La composición terapéutica de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque las microesferas de copolímeros presentan una viscosidad de 0.8 dl/g y un diámetro cercano a 1.3 micrometros. 3.- Un procedimiento de preparación y obtención de la composición terapéutica de conformidad con las reivindicaciones 1 y 2 mediante la técnica de triple emulsión y extracción de solvente, caracterizado porque se realiza de la siguiente forma: los copoliméros utilizados son de alta viscosidad entre 0.5 y 1.5 dl/g, y más preferentemente con una viscosidad de 0.8 dl/g; se utilizan altas velocidades de homogenización, preferentemente a 13500 rpm; las soluciones utilizadas presentan un pH no alcalino, y se prescinde de otras proteínas de alto peso molecular, entre otras, albúmina y gelatina. 4 - El procedimiento de preparación y obtención de la 27 composición terapéutica de conformidad con la reivindicación 3 caracterizado además porque el copolímero es, entre otros, un copolímero de ácido láctico y glicólico 50:50 (PLGA 50:50). 5.- El uso de la composición terapéutica de conformidad con las reivindicaciones 1 y 2 en la elaboración o preparación de medicamentos para el tratamiento y prevención de enfermedades neurodegenerativas como, entre otras, enfermedad de Alzheimer, ataxia cerebelosa, ataxia-telangiectasia, demencia vascular, esclerosis múltiple, ictus, neuropatías periféricas y trauma cerebral o espinal. 6 - Un comprimido con una capacidad de liberación prolongada de IGF-I caracterizado porque se obtiene mediante un procedimiento basado en la siguiente técnica: el IGF-I se disuelve en ácido acético 0.01 mM, a esta solución se le añade ciclosporina que queda en suspensión, esta mezcla se añade al copolímero de ácido láctico y glicólico (Resomer 503 H de Boehringer lngelhem) y se amasa suavemente, pasando a continuación el producto a través de una malla de 2 mm de luz, se deja secar a temperatura ambiente durante tres horas y se vuelve a pasar por la malla anterior, se deja secar otras 15 horas a temperatura ambiente y se comprime con punzones cóncavos de 6 mm de diámetro. 7.- El uso del comprimido de la reivindicación 6 en la elaboración o preparación de medicamentos para el tratamiento y prevención de enfermedades ^neurodegenerativas como, entre otras, enfermedad de Alzheimer, ataxia cerebelosa, ataxia-telangiectasia, demencia vascular, esclerosis múltiple, ictus, neuropatías periféricas y trauma cerebral o espinal.