PT1488801E - ''composição química de igf-i para o tratamento e a prevenção de doenças neurodegenerativas'' - Google Patents
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DESCRIÇÃO "COMPOSIÇÃO QUÍMICA DE IGF-I PARA O TRATAMENTO E A PREVENÇÃO DE DOENÇAS NEURODEGENERATIVAS"
CAMPO DA INVENÇÃO A invenção refere-se à preparação e produção de novas formulações (microesferas e comprimidos) para a administração de substâncias activas, incluindo IGF-I, e a sua utilização no tratamento e prevenção de doenças neurodegenerativas como a doença de Alzheimer ou a ataxia cerebelosa, entre outras.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
Actualmente, não existe um medicamento ou um método que proteja contra doenças neurodegenerativas. Este tipo de doenças tem cada vez mais importância em países desenvolvidos devido ao envelhecimento progressivo da população, pois muitas dessas doenças estão associadas à idade (Amaducci, L. e Tesco, G., «Aging as a major risk for degenerative diseases of the central nervous System», Curr. Opin. Neurol., 7: 283-286 [1994]). Contudo, apesar de as causas das doenças como a demência de Alzheimer ou a doença de Parkinson estarem a ser estudadas intensivamente e se começar a reconhecer um importante componente genético (Heintz, N. e Zoghbi, H.Y., «Insights from mouse models into the molecular basis of neurodegeneration», Annu. Rev. Physiol., 62: 779-802 [2000]), ainda não existe nenhum tratamento eficaz, sendo, portanto, a 2 prevenção extremamente importante. 0 facto de muitas destas doenças terem um componente claramente hereditário permite prever o desenvolvimento, ou a predisposição para desenvolver uma doença neurodegenerativa. Isto quer dizer que se podem tomar medidas protectoras contra a doença antes de ela aparecer. Por exemplo, uma medida preventiva que está prestes a ser testada em populações em risco de desenvolver a doença de Alzheimer é a vacinação (Gurwitz, D., «Immunization for Alzheimer's disease: yet closer to clinicai trials», Trends Immunol., 22: 542-543, [2001]), porque existem indivíduos predispostos geneticamente para sofrer da doença, sendo a idade avançada um factor de risco. Há uma série de proteínas de origem natural que têm actividade hormonal trófica terapêutica e que têm de ser administradas por via parentérica porque são degradadas pelo sistema digestivo. A mais conhecida destas proteínas é a insulina e tem-se levado a cabo durante muitos anos a procura de sistemas alternativos para a administração. As injecções diárias, mesmo as injecções subcutâneas, têm dois problemas principais: o doente tenta evitá-las (adesão diminui), reduzindo assim a biodisponibilidade e, por conseguinte, a eficácia terapêutica. No caso do factor trófico IGF-I, cuja eficácia terapêutica está actualmente a ser testada num largo leque de doenças (para uma lista de ensaios clínicos actualmente a decorrer nos Estados Unidos: http://clinicaltrials.gov/ct/gui/c/a2b/_action/_GetStudy?_JSe rvSessionIdzone%20ct=lbfy4qa8h%201), tem-se observado que injecções subcutâneas repetidas ao longo do dia são mais 3 eficazes que uma injecção única (Woodal, S. M., Breier, B. H. , 0'Sullivan, U. e Gluckman, P. D., «The effect of the frequency of subcutaneous insulin-like growth factor I administration on weight gain in growth hormone deficient mice», Horm. Metab. Res., 12: 581-584 [1991]), provavelmente porque a elevação nos níveis sanguíneos é mais sustentada.
Uma solução para este problema está a ser procurada no desenvolvimento de sistemas de libertação lenta (depot) para factores tróficos, incluindo IGF-I (Lam, X.M., Duenas, E.T., Daugherty, A.L., Levy, N. e Cleland, J.L., «Sustained release of recombinant human insulin-like growth factor-I for treatment of diabetes», J. Contr. Rei., 67: 281-292 [2000];
Singh, M., Shirley, B., Bajwa, K., Samara, E., Hora, M. e 0'Hagan, D., «Controlled release of recombinant insulinlike growth factor from a novel formulation of polylactide-co-glycolide microparticles», J. Contr. Rei., 70: 21-28 [2001]; Meinel, L., Illi, O.E., Zapf, J. , Malfanti, M., Merkle, H.P. e Gander, B., «Stabilizing insulin-like growth factor-I in poly [D, L-lactide-co-glycolide] microspheres», J. Contr. Rei., 70: 193-202 [2001]). As companhias farmacêuticas especializadas em factores tróficos estão a trabalhar no desenvolvimento de uma formulação desse tipo. Estudos anteriores demonstraram a utilidade do IGF-I formulado em sistemas osmóticos de libertação controlada que são administrados subcutaneamente. Estes sistemas produzem efeitos terapêuticos em alguns processos patológicos (Fernandez, A.M., Gonzalez de la Vega, A. e Torres-Aleman, I. , «Insulin-like growth factor restores motor coordination 4 in a rat model of cerebellar ataxia», Proc. Nat. Acad. Sei., (USA) 95: 1253-1258 [1998]). Contudo, eles têm a desvantagem de serem volumosos (e, por conseguinte, difíceis de implantar em seres humanos) e necessitarem da remoção do dispositivo osmótico quando cessa a libertação de fármaco. De modo a evitar esta desvantagem, podem ser desenvolvidas pequenas preparações biodegradáveis de libertação lenta. Têm sido utilizados copolímeros biodegradáveis de ácido láctico e de ácido glicólico, semelhantes àqueles utilizados no fabrico de fios de sutura absorvíveis, com maior frequência para este propósito. Existem diferentes copolímeros nos quais a proporção e a viscosidade do ácido poliláctico e do ácido poliglicólico podem ser variados. Isto torna possível controlar a velocidade de libertação do fármaco e, por conseguinte, prolongar a absorção do fármaco e a duração dos seus efeitos. Normalmente, quanto maior for a proporção de ácido poliláctico em relação ao ácido poliglicólico, menor é a velocidade de libertação do fármaco. Por outro lado, quanto maior for a viscosidade intrínseca do polímero, menor é a velocidade de libertação. Especificamente, foram publicados recentemente três estudos sobre o IGF-I (Lam, X.M., Duenas, E.T., Daugherty, A.L., Levy, N. e Cleland, J.L., «Sustained release of recombinant human insulin-like growth factor-I for treatment of diabetes», J. Contr. Rei., 67: 281-292 [2000]; Singh, M., Shirley, B., Bajwa, K., Samara, E., Hora, M. e 0'Hagan, D., «Controlled release of recombinant insulin-like growth factor from a novel formulation of polylactideco-glycolide microparticles», J. Contr. Rei., 70: 21-28 [2001]; Meinel, L., Illi, O.E., Zapf, J., Malfanti, M., Merkle, H.P., 5
Gander, B., «Stabilizing insulin-like growth factor-I in poly [D,L-lactide-co-glycolide] microspheres», J. Contr. Rei., 70: 193-202 [2001]), em que foi utilizado um copolimero de 50:50 ácido láctico e ácido glicólico (Resomer 502H, Boehringer Ingelheim). Os procedimentos de preparação envolvem ou a atomização ou a técnica de emulsão tripla. São utilizados diferentes sistemas na técnica de emulsão tripla para aumentar o tamanho das microesferas resultantes. Logo, no trabalho de M. Singh et al. (Singh, M., Shirley, B., Bajwa, K., Samara, E., Hora, M. e 0'Hagan, D., «Controlled release of recombinant insulin-like growth factor from a novel formulation of polylactide-co-glycolide microparticles», J. Contr. Rei., 70: 21-28 [2001]), é induzida uma alteração de pH para produzir a precipitação parcial de IGF-I, enquanto no trabalho de L. Meinel et al. (Meinel, L., Illi, O.E., Zapf, J., Malfanti, M., Merkle, H.P., Gander, B., «Stabilizing insulin-like growth factor-I in poly[D,L-lactide-co-glycolide] microspheres», J. Contr. Rei., 70: 193-202 [2001]) são utilizadas velocidades de agitação lentas e são adicionadas proteinas como gelatina e albumina para obter microesferas de tamanho grande. Em todos estes sistemas, as microesferas resultantes têm mais de 30 micrómetros de diâmetro, nomeadamente entre 30 a 125 micrómetros, dependendo do estudo.
BREVE DESCRIÇÃO A invenção refere-se a novas formulações terapêuticas para a administração lenta de IGF-I, um procedimento para a 6 preparação e a produção dessas formulações e a sua utilização na produção de medicamentos para o tratamento e prevenção de doenças neurodegenerativas como a doença de Alzheimer ou a ataxia cerebelosa, ente outras. Estas formulações correspondem a microesferas com menos de 5 micrómetros de diâmetro, entre outras características, e a comprimidos para implantação subcutânea.
DESCRIÇÃO PORMENORIZADA A invenção está concebida para prevenir doenças do sistema nervoso causadas por perda de neurónios, quer de origem genética, quer de origem esporádica. Consiste na administração subcutânea de uma formulação terapêutica de longa duração e biodegradável, que é desenvolvida na presente invenção e que contém o factor neuroprotector natural IGF-I. A novidade deste pedido é que ele previne o aparecimento de sintomas de doença neurodegenerativa, como se avaliou em modelos animais de ataxia cerebelosa hereditária e de doença de Alzheimer, e em ratazanas velhas através da administração periódica desta formulação de longa duração (ver Exemplos 2, 3 e 4; Figura 2) . Além disso, a administração desta formulação é muito cómoda (uma ou duas vezes por mês) (Figura 1B) e a sua eficácia terapêutica é maior do que aquela de injecções subcutâneas diárias de IGF-I (Figura IA) , pois os níveis terapêuticos são mais mantidos. A via de administração é a subcutânea, pelo que foram desenvolvidas partículas mais pequenas (menos que 5 micrómetros) para passarem mais facilmente através de agulhas de injecção. 7
Assim, um objectivo da presente invenção é uma formulação ou composição terapêutica que contém o factor neuroprotector natural IGF-I, referido aqui como a formulação terapêutica da presente invenção, que permite a libertação lenta de IGF-I intacto e funcionalmente activo e que é constituída por microesferas de copolímeros de elevada viscosidade com menos de 5 micrómetros de diâmetro, geralmente, entre 1 a 2 micrómetros de diâmetro e preferencialmente cerca de 1,3 micrómetros de diâmetro. A formulação terapêutica proposta por esta invenção consiste numa quantidade terapeuticamente eficaz de IGF-I juntamente com um excipiente farmacologicamente adequado. Esta formulação terapêutica é útil para administração e/ou aplicação em espécies de mamíferos, preferencialmente em seres humanos. A quantidade terapeuticamente eficaz da formulação da presente invenção a ser administrada, assim como a dosagem desta para tratar um estado patológico, depende de numerosos factores, incluindo a idade, o estado do doente, a gravidade da doença, a via e a frequência de administração, entre outros. A formulação terapêutica contendo IGF-I fornecida por esta invenção pode ser administrada através de qualquer forma de administração considerada adequada para administração subcutânea, incluindo os excipientes farmacologicamente aceitáveis necessários para a formulação de acordo com a forma de administração. Pode-se encontrar uma revisão de formas farmacológicas para a administração de medicamentos e os excipientes necessários no Tratado de Farmacia Galenica [Tratado de Farmácia Galénica], C. Fauli i Trillo, 1993, Luzán 5, SA Editions, Madrid. 0 efeito possível sobre a velocidade de libertação foi compensado ao utilizar um copolímero mais viscoso como o Resomer506 (Boehringer Ingelheim) em vez do 502H, como descrito em estudos anteriores. Assim, é sugerida a utilização de um copolímero com uma viscosidade de 0,8 dl/g, em vez daquele descrito nos estudos citados, que tem uma viscosidade de 0,2 dl/g. Para obter microesferas mais pequenas, utilizou-se a técnica de emulsão tripla. Nesta técnica utiliza-se uma solução de IGF-I como base, juntamente com velocidades de homogeneização elevadas para alcançar a fase interna mais pequena possível na emulsão. Além disso, no método proposto na presente invenção não é utilizado pH alcalino (no qual o IGF-I se pode tornar insolúvel) ou outras proteinas de peso molecular elevado (albumina, gelatina, etc.). Isto origina pequenas microesferas, normalmente com 1 a 2 micrómetros, que são mais apropriadas para administração subcutânea através de injecção por agulha. como o
Um objectivo adicional da presente invenção é um procedimento para a preparação e produção da formulação terapêutica referida na presente invenção, referido aqui 9 procedimento da presente invenção, baseado na técnica de emulsão tripla e na extracção do solvente como se segue: - Os copolimeros utilizados são de viscosidade elevada, entre 0,5 dl/g e 1,5 dl/g, preferencialmente 0,8 dl/g; - São utilizadas velocidades de homogeneização elevadas, preferencialmente 13500 rpm; - As soluções utilizadas têm um pH não alcalino; e - Não são utilizadas proteínas de peso molecular elevado como a albumina e gelatina.
Um objectivo particular da presente invenção é o procedimento da invenção através do qual o copolímero é 50:50 de ácido láctico e ácido glicólico (PLGA 50:50), entre outros.
Outro objectivo da presente invenção é a formulação terapêutica obtida através do procedimento da presente invenção.
Como referência e exemplo não limitante da técnica de emulsão tripla, são citados os estudos publicados de Lam et al., Singh et al. e Meinel et al. (Lam, X.M., Duenas, E.T., Daugherty, A.L., Levy, N. e Cleland, J.L., «Sustained release of recombinant human insulin-like growth factor-1 for treatment of diabetes», J. Contr. Rei., 67: 281-292 [2000];
Singh, M., Shirley, B., Bajwa, K., Samara, E., Hora, M. e 0'Hagan, D., «Controlled release of recombinant insulin-like growth factor from a novel formulation of polylactide-co-glycolide microparticles», J. Contr. Rei., 70: 21-28 [2001]; 10
Meinel, L., Illi, O.E., Zapf, J. , Malfanti, M., Merkle, H.P. e Gander, B., «Stabilizing insulin-like growth factor-I in poly [D,L-lactide-co-glycolide] microspheres», J. Contr. Rei., 70: 193-202 [2001]).
Por outro lado, como indicado na introdução, estas microesferas de copolimeros de ácido láctico e de ácido glicólico também podem ser preparadas por especialistas na matéria, através do procedimento de emulsão tripla e de extracção de solvente e através da técnica de atomização, entre outras, razão pela qual as formulações terapêuticas da presente invenção preparadas e obtidas utilizando estas técnicas são parte da presente invenção. O procedimento de atomização para a preparação de microesferas tem sido descrito em muitos estudos como os que se seguem: P. Johansen, E. Estévez, R. Zurbriggen, H.P. Merkle, R. Gluck, G. Corradin e B. Gander, «Towards clinicai testing of a single-administration tetanus vaccines based on PLA/PLGA microspheres», Vaccine, 2000, 19(9-10): 1047-54; P. Johansen, Y. Men, R. Audran, G. Corradin, H.P. Merkle e B. Gander, «Improving stability of microencapsulated tetanus toxoid by co-encapsulation of additives», Pharmaceutical Research, 1998, 15(7): 1103-10; S. Takada, Y. Uda, H. Toguchi e Y.
Ogawa, «Application of a spray-drying technique in the production of THR-containing injectable sustained-release microparticles of biodegradable polymers», PDA Journal of Pharmaceutical Science and Technology, 1995, 49(4): 180-4; F. Pavanetto, I. Genta, P. Giunchedi e B. Conti, «Evaluation of spray drying as a method for polylactide and polylactide-co- 11 glycolide microsphere preparation», Journal of Microencapsulation, 1993, 10(4): 487-97; B. Bittner e T. Kissel, «Ultrasonic atomization for spray drying: a versatile technique for the preparation of protein loaded biodegradable microspheres», Journal of Microencapsulation, 1999, 16(3): 325-341.
As microesferas e os comprimidos são ambos administrados periodicamente através de injecção subcutânea ou implantação. A eficácia de protecção contra doença neurodegenerativa é prolongada: administrou-se a ratos PCD que sofriam de neurodegeneração hereditária esta formulação durante quase cinco meses, sem que eles desenvolvessem doença neurodegenerativa hereditária durante esse período de tempo. Isto significa que, enquanto o fármaco é administrado, a doença não aparece, mas ela reaparece se a administração for interrompida. Nos estados iniciais da doença, a readministração do produto faz com que desapareçam os sintomas da doença (Figura 2A) . Por outro lado, a administração da formulação terapêutica de microesferas a ratos transgénicos com doença do tipo Alzheimer e a ratazanas velhas reduziu os sintomas associados a esta doença, como os depósitos beta-amilóides e lesões glióticas reactivas, entre outros (ver Exemplos 3 e 4, Figura 2). A presente invenção descreve a utilização de qualquer uma destas formulações na preparação de medicamentos para o tratamento e prevenção de doenças neurodegenerativas como a doença de Alzheimer, ataxia cerebelosa, ataxia- 12 telangiectasia, demência vascular, esclerose múltipla, AVC, neuropatia periférica e traumatismo cerebral ou medular, entre outras. Por conseguinte, um objectivo da presente invenção é a utilização da formulação terapêutica da presente invenção na preparação ou produção de medicamentos para o tratamento e prevenção de doenças neurodegenerativas como a doença de Alzheimer, ataxia cerebelosa, ataxia-telangiectasia, demência vascular, esclerose múltipla, AVC, neuropatia periférica e traumatismo cerebral ou medular, entre outras.
Além destas pequenas microesferas, também têm sido desenvolvidos comprimidos para implantação subcutânea para obter preparações com efeitos de muito longa duração (ver Exemplo lc), referidos aqui como comprimidos da presente invenção, para os quais não foram encontrados referências ou dados de estudos anteriores por outros autores. Logo, um objectivo adicional da presente invenção é este comprimido para libertação prolongada de IGF-I.
Um objectivo adicional da presente invenção é o procedimento para a preparação e produção do comprimido da presente invenção que é baseado na seguinte técnica: - Dissolve-se IGF-I em ácido acético 0,01 mM; - Adiciona-se ciclosporina a esta solução; - Esta mistura é adicionada ao copolimero de ácido láctico e de ácido glicólico (Resomer 503H da Boehringer 13
Ingelheim) e amassada suavemente, e o produto é depois filtrado através de uma malha de 2 mm; - Deixa-se secar a temperatura ambiente durante três horas e é novamente filtrada através da malha de 2 mm; e - Deixa-se secar mais 15 horas a temperatura ambiente e comprime-se com formas côncavas com 6 mm de diâmetro.
Finalmente, um objectivo adicional da presente invenção é a utilização do comprimido da presente invenção na elaboração ou preparação de medicamentos para o tratamento e prevenção de doenças neurodegenerativas como a doença de Alzheimer, ataxia cerebelosa, ataxia-telangiectasia, demência vascular, esclerose múltipla, AVC, neuropatia periférica e traumatismo cerebral ou medular, entre outras.
DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
Figura 1. Os niveis de IGF-I no sangue após uma única injecção subcutânea de IGF-I (A) permanecem elevados por menos de 24 horas, enquanto no caso de uma injecção subcutânea (s.c.) de microesferas de IGF-I (B) os niveis de IGF-I permanecem elevados durante pelo menos 2 semanas.
Figura 2. 0 efeito preventivo do tratamento com depot de IGF-I nas doenças neurodegenerativas em A) ratos com ataxia cerebelosa hereditária tratados com microesferas de IGF-I (A) , comprimidos de IGF-I () , e um grupo de controlo não tratado (microesferas vazias) (·). Avalia-se a grau de coordenação motora através do teste rota-rod descrito por 14
Fernandez et al. (1998). B) Ratazanas velhas tratadas com microesferas de IGF-I em que se avaliou a amiloidose associada à neurodegeneração durante o envelhecimento normal dos animais através de imunomarcação da proteína GFAP. C) Ratazanas velhas tratadas com microesferas de IGF-I em que se avaliou a amiloidose associada à neurodegeneração durante o envelhecimento normal dos animais ao determinar os níveis da proteína GFAP no cérebro (córtex). D) Ratazanas velhas tratadas com microesferas de IGF-I em que se avaliou a amiloidose associada à neurodegeneração durante o envelhecimento normal dos animais ao determinar os níveis de beta-amilóide no cérebro (córtex) e no líquido cefalorraquidiano (LCR).
EXEMPLOS
Exemplo 1. Elaboração e administração de preparações de IGF-I
Exemplo la. Injecção subcutânea de IGF-I (Figura IA)
Dissolve-se IGF-I recombinante humano liofilizado (rhIGFI) (GroPep, Austrália) numa solução de soro fisiológico (NaCl a 0,9%) para obter uma concentração de 500 pg/100 μΐ.
Administraram-se a ratazanas Wistar adultas com 300 gramas de peso (n=6 para cada período de captação) uma única injecção subcutânea (na omoplata) de 100 μΐ. Para determinar o IGF-I sérico por radioimunoensaio (I. Torres-Aleman, S. Pons, L. M. Garcia-Segura, «Climbing fiber deafferentation reduces 15 insulin-like growth factor I (IGF-I) content in cerebellum», Brain Res., 564: 348-351 [1991]; S. Pons e I. Torres-Aleman, «Basic fibroblast growth factor modulates insulin-like growth factor-I, its receptor, and its binding proteins in hypothalamic cell cultures», Endocrinology, 131: 2271-2278 [1992]), colheu-se sangue depois da anestesia e do sacrifício dos animais em diferentes alturas depois da injecção de IGF-I.
Como está descrito na Figura IA, uma única injecção subcutânea de IGF-I (1,8 mg/kg) em ratazanas adultas causou um rápido aumento dos níveis de IGF-I, apesar de esses níveis se manterem durante menos de 24 horas (Figura IA).
Exemplo lb. Elaboração de microesferas de IGF-I A preparação de microesferas de IGF-I foi levada a cabo utilizando uma modificação do método de extracção do solvente A/O/A e emulsão tripla previamente descrito (Singh, M., Shirley, B., Bajwa, K., Samara, E., Hora, M. e 0'Hagan, D. (2001), «Controlled release of recombinant insulin-like growth factor from a novel formulation of polylactide-co-glycolide microparticles», J. Control Release, 70: 21-28), que permitiu uma libertação eficaz de IGF-I intacto e biologicamente activo (Meinel, L., Illi, O.E., Zapf, J., Malfanti, M., Peter, M.H. e Gander, B. (2001), «Stabilizing insulin-like growth factor-I in poly(D,L-lactide-co-glycolide) microspheres», J. Control Release, 70: 193-202). O método começa com 40 mg de IGF-I dissolvido em 100 16 microlitros de ácido acético a 0,01 mM. A esta dissolução adiciona-se 0,7 ml de fosfato monossódico 10 mM (pH 6,0), contendo 10,5 mg de Tween 20 (Serva, Alemanha). Em simultâneo, dissolveram-se 500 mg de um copolimero de 50:50 de ácido láctico e ácido glicólico (PLGA 50:50, Resomer® 506, Alemanha), com uma viscosidade inerente de 0,8 dl/g, em 10 ml de cloreto de metileno, que foi misturado com a fase aquosa de IGF-I. A emulsão foi homogeneizada a 13500 rpm, utilizando um Polytron® durante 2 minutos para obter a primeira emulsão binária A/O de tamanho de partícula pequeno. Depois, esta emulsão foi adicionada a uma solução de 400 ml de um tampão PBS, pH 7,4, preparada para 1 litro com 6,8 g de fosfato monopotássico e 195,5 ml de solução de 0,2 M de NaOH. Este tampão de PBS contém 8 g de álcool polivinílico (álcool polivinílico 15000, Fluka, Suíça). Ao deitar a primeira emulsão na solução de PBS e depois agitar vigorosamente com um homogeneizador a 13500 rpm durante 2 minutos (Ultraturrax®), obtém-se uma emulsão tripla A/O/A. Esta emulsão tripla é suavemente agitada (700 rpm) durante 4 horas enquanto o cloreto de metileno evapora, formando assim microesferas. Depois, as microesferas são recuperadas por centrifugação a 6000 rpm durante 20 minutos e o supernadante é decantado. Em seguida, as microesferas são lavadas com água desionisada e novamente centrifugadas e decantadas. O processo de lavagem é repetido três vezes. Finalmente, as esferas são liofilizadas e refrigeradas (4°C) até à sua utilização. 17 A quantidade de rhIGF-I nas microesferas foi determinada pela dissolução de 10 mg de microesferas em 1 ml de NaOH 1 N, sendo a solução agitada durante a noite à temperatura ambiente. A concentração de proteínas foi calculada por meio de absorção UV a 284 nm utilizando um coeficiente de extinção de 1043 (mg/ml)'1cm'1 para rhIGF-I em NaOH 1 N. O tamanho da microesfera foi determinado por difracção laser (Galai® Cis-I). As amostras diluídas de vários lotes foram analisadas em triplicado e considerou-se o diâmetro médio para cada lote. A morfologia da microesfera foi analisada através de microscopia electrónica (JEOL 6400). As microesferas resultantes têm um tamanho de partícula médio de 1,3 ± 1 micrómetros e uma força de 5%. A percentagem de encapsulação foi de 70%. A administração subcutânea destas microesferas de IGF-I em ratazanas adultas (5 mg/kg) produziu níveis de IGF-I no sangue que se mantiveram altos durante 2 semanas (Figura 1B). O tamanho relativamente pequeno destas microesferas facilitou a injecção desta suspensão através de uma agulha de 23G.
Exemplo lc. Elaboração de comprimidos de implantação de IGF-I
Para preparar um lote de 10 comprimidos, pesaram-se 15 mg de IGF-I (GroPep, Austrália) e depois dissolveram-se em 1,5 ml de ácido acético 0,01 mM. Adicionou-se a esta solução 30 mg de ciclosporina e manteve-se em suspensão. Esta mistura foi adicionada a 455 mg de um copolímero de ácido láctico e ácido 18 glicólico (Resomer 503H, Boehringer Ingelheim) e amassada suavemente, sendo o produto depois filtrado através de uma rede de 2 mm. Foi deixado a secar a temperatura ambiente durante três horas e novamente filtrado com uma rede de 2 mm. Foi deixado a secar a temperatura ambiente durante mais 15 horas e foi comprimido com formas côncavas de 6 mm de diâmetro, ajustando o peso do comprimido até 50 mg. Isto originou comprimidos biconvexos, que têm um diâmetro de 6 mm, uma grossura de 3 mm, um peso de 50 mg e um conteúdo de IGF-I por comprimido de 1,5 mg. Estes comprimidos são implantados por meio de uma pequena incisão sem anestesia sob a pele de ratos pcd; como material biodegradável que são, não são para ser retirados.
Exemplo 2. Tratamento de ratos com degeneração cerebelosa hereditária (degeneração de células de Purkinje) utilizando microesferas e comprimidos de implantação de IGF-I.
Administraram-se microesferas de IGF-I por injecção subcutânea a uma dose de 100 pg/kg de duas em duas semanas, depois de duas doses iniciais de 50 pg/kg e 75 pg/kg a ratos com dois meses de idade com ataxia cerebelosa hereditária (pcd, ou «degeneração de células de Purkinje», ratos, Jackson Labs) que mostraram sinais da doença no primeiro mês de vida (descoordenação motora que conduzia a morte prematura) (Figura 2A) . Para determinar se os sintomas remitiam com o tratamento, avaliou-se a capacidade motora uma vez por semana com o teste rota-rod (A. M. Fernandez, A. Gonzalez de la Vega, I. Torres-Aleman, «Insulin-like growth factor restores 19 motor coordination in a rat model of cerebellar ataxia», Proc. Nat. Acad. Sei. (USA), 95: 1253-1258 [1998]). A experiência foi levada a cabo em dois lotes em separado de 6 ratos de cada vez. 0 resultado foi que os ratos mostraram um grau normal de coordenação de movimentos enquanto o tratamento (100 dias) com quer microesferas (Figura 2A, linha com triângulos), quer comprimidos (Figura 2A, linha com quadrados) se manteve, em comparação com as descobertas em ratos saudáveis (os ratos tratados tinham valores máximos de coordenação motora de quase 300 segundos, o que foi semelhante às descobertas feitas nos ratos saudáveis [dados não apresentados]), ao passo que os sintomas de ataxia não desapareceram no grupo de controlo (valores máximos de coordenação motora de 200 a 240 segundos).
Deverá notar-se que, enquanto se administrava uma dose de IGF-I, quer por meio de microesferas ou comprimidos, a diminuição nos níveis de IGF-I se correlacionou com a perda de coordenação motora. Quando foram administradas as novas doses de IGF-I (depois da segunda dose [14 dias] e a terceira dose [28 dias] de microesferas e depois da implantação do segundo comprimido [70 dias]), os sintomas da doença remitiram novamente. Note-se que a eficácia do tratamento com microesferas depende na dose administrada (Figura 2A), de tal maneira que não se observou nenhuma perda de coordenação motora com a dose de 100 pg/kg, em contraste com as doses iniciais de 50 pg/kg e 75 pg/kg. 20
Exemplo 3. Tratamento de ratos transgénicos com doença de tipo Alzheimer utilizando microesferas de IGF-I
Analisaram-se os níveis cerebrais de beta-amilóide com Western-blot em ratos transgénicos de dez meses de idade, com beta-amilóides em excesso devido a transgénese do gene APP humano mutado (ratos Tg2576, ver Hsiao et al., 1996 (Hsiao, K., Chapman, P., Nilsen, S., Eckman, C., Harigaya, Y., Younkin, S., Ynag, F., Cole, G., «Correlative memory déficits, Abeta elevation, and amyloid plaques in transgenic mice», Science, 274: 99-102, [1996]), mantidos sob condições de jaula habituais: ciclos de 12 horas de luz e escuridão e água e comida ad libitum) aos quais foram administrados microesferas de IGF-I durante um mês. Os níveis de beta-amilóides (βΑ) (como determinado pela avaliação das bandas obtidas por Western-blot com densitometria) no córtex e no hipocampo de ratos transgénicos não tratados foram 7 e 25 vezes superiores aos verificados em companheiros de jaula sem a mesma doença (hmutAPP-7') , ao passo que os ratos transgénicos tratados com IGFI tiveram os mesmos níveis de beta-amilóides dos animais sem a doença (p<0,01 versus Tg2576 não tratados).
Exemplo 4. Prevenção da doença de Alzheimer (prevenção de amiloidose cerebral) em ratazanas velhas com microesferas de IGF-I
Administraram-se microesferas de IGF-I durante um mês a ratazanas Wistar velhas, com 18 meses de idade, mantidas sob 21 condições normais de luz e alimentação, e o aparecimento de lesões glióticas no parênquima cerebral (córtex frontal) foi determinado por imunomarcação GFAP (Lee, C.K., Weindruch, R., Prolla, T. A., «Gene-expression profile of the ageing brain in mice», Nature Genet, 25, 294-297 [2000]) (Figura 2b). Determinaram-se por Western-blot os níveis de proteínas GFAP no cérebro (Figura 2c) e os níveis de beta-amilóides no cérebro (córtex) e no líquido cefalorraquidiano (LCR) (Vaucher, E. et al. «Amyloid β peptide leveis and its effects on hippocampal acetylcholine release in aged, cognitively impaired and unimpaired rats», J. Chem. Neuroanat., 21, 323— 329 [2001]) (Figura 2d) . Níveis altos de proteína GFAP ou péptido beta-amilóide no cérebro e/ou níveis baixos de péptido beta-amilóide no líquido cefalorraquidiano SãO sintomas da amiloidose associada à neurodegeneração de Alzheimer Todos estes parâmetros são semelhantes entre ratazanas velhas tratadas com IGF-I e ratazanas adultas, ao passo que nos dois últimos casos os níveis foram mais baixos dos que os observados em ratazanas velhas não tratadas (Figuras 2b, 2c e 2d) . Dever-se-á notar que os níveis de beta-amilóide no LCR estavam aumentados nas ratazanas velhas tratadas com IGF-I devido à depuração de beta-amilóide (Figura 2d, painel inferior).
MATERIAIS E MÉTODOS
Animais. Utilizaram-se, de acordo com a Directiva da UE 86/609/CEE, ratazanas adultas de linha pura e Wistar velhas (250-450 g), ratos Tg2576 transgénicos, ratos machos e fêmeas 22 pcd (degeneração de células de Purkinje) e ninhadas de ratos não atáxicos com a mesma idade e o mesmo sexo com ratos C57 como grupo de controlo. Os animais foram mantidos sob condições laboratoriais normais.
Reagentes. Utilizou-se 125 INa (Amersham, Grã-Bretanha) para iodar rhIGF-I. Excepto quando indicado em contrário, o resto dos reagentes utilizados na presente invenção foram da Sigma (EUA) ou Merck (Espanha) .
Desenho experimental da análise de IGF-I no sangue. Colheram-se múltiplas amostras de sangue de cada ratazana adulta e determinaram-se os níveis de IGF-I séricos antes e depois da administração subcutânea (s.c.) de rhIGF-I. Dependendo do peso das ratazanas, as doses de microesferas (50 pg/kg) foram preparadas sob a forma de uma suspensão numa solução de soro estéril para injecção imediata de bólus. Outro grupo de ratazanas recebeu uma bólus de injecção subcutânea convencional de uma solução de 1,8 mg/kg de rhIGF-I. Em todos os casos, as amostras sanguíneas foram retiradas da veia subclávia em alturas diferentes depois da injecção. As doses relativamente altas utilizadas asseguraram a detecção no soro após a injecção. Devido ao facto de ser difícil fazer múltiplas colheitas de amostras sanguíneas em ratos, as amostras foram obtidas a partir de ratos diferentes em alturas diferentes. Devido ao facto de ser difícil criar ratos pcd, eles foram utilizados apenas para determinar a eficácia terapêutica das microesferas IGFI. 23
Para reduzir a interferência com IGFBPs, as amostras de soro foram extraídas utilizando cartuchos Cis (Millipore, EUA), ao passo que as amostras de tecido foram fervidas em ácido acético 1 N durante 30 minutos, tal como foi anteriormente descrito pelos inventores (Pons, S. e Torres-Aleman, I. (1992), «Basic fibroblast growth factor modulates insulin-like growth factor-I, its receptor, and its binding proteins in hypothalamic cell cultures», Endocrinology, 131: (2271— 2278) .
Lisboa, 02/08/2007
Claims (7)
1 REIVINDICAÇÕES 1. Formulação terapêutica contendo o factor neuroprotector natural IGF-I que permite a libertação lenta de IGF-I intacto e funcionalmente activo, caracterizada pelo facto de ser constituída por microesferas de copolímeros de viscosidade elevada, 0,5 dl/g a 1,5 dl/g, com um diâmetro de menos de 5 micrómetros.
2. Formulação terapêutica de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo facto de as microesferas dos copolímeros terem uma viscosidade de 0,8 dl/g e um diâmetro de cerca de 1,3 micrómetros.
3. Procedimento para a preparação e produção de uma formulação terapêutica de acordo com as reivindicações 1 e 2 por meio da técnica de emulsão tripla e da extracção com solvente, caracterizado pelo facto de ser levado a cabo da seguinte maneira: - Os copolímeros utilizados são de viscosidade elevada, entre 0,5 dl/g e 1,5 dl/g, preferencialmente 0,8 dl/g; - São utilizadas velocidades de homogeneização elevadas, preferencialmente 13500 rpm; - As soluções utilizadas têm um pH não alcalino; e - Não são utilizadas proteínas de peso molecular elevado como a albumina e gelatina. 2
4. Procedimento para a preparação e produção da formulação terapêutica de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo facto de o copolímero ser, entre outros, um copolimero de 50:50 de ácido láctico e ácido glicólico (PLGA 50:50).
5. Utilização da formulação terapêutica de acordo com as reivindicações 1 e 2 na elaboração ou preparação de medicamentos para o tratamento e prevenção de doenças neurodegenerativas como a doença de Alzheimer, ataxia cerebelosa, ataxia-telangiectasia, demência vascular, esclerose múltipla, AVC, neuropatia periférica e traumatismo cerebral ou medular, entre outras.
6. Comprimido com uma capacidade de libertação prolongada de IGF-I, caracterizado pelo facto de ser preparado através de um método baseado na técnica seguinte: - Dissolve-se IGF-I em ácido acético 0,01 mM; - Adiciona-se ciclosporina a esta solução e permanece em suspensão; - Esta mistura é adicionada ao copolimero de ácido láctico e de ácido glicólico (Resomer 503H da Boehringer Ingelheim) e amassada suavemente, e o produto é depois filtrado através de uma malha de 2 mm; - Deixa-se secar a temperatura ambiente durante três horas e é novamente filtrada através da malha de 2 mm; e - Deixa-se secar mais 15 horas a temperatura ambiente e comprime-se com formas côncavas com 6 mm de diâmetro. 3
7. Utilização de um comprimido de acordo com a reivindicação 6 na elaboração ou preparação de medicamentos para o tratamento e prevenção de doenças neurodegenerativas como a doença de Alzheimer, ataxia cerebelosa, ataxia-telangiectasia, demência vascular, esclerose múltipla, AVC, neuropatia periférica e traumatismo cerebral ou medular, entre outras. Lisboa, 02/08/2007
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