WO2003074099A1

WO2003074099A1 - Materiau de base pour regeneration tissulaire, materiau de transplantation et son procede de preparation

Info

Publication number: WO2003074099A1
Application number: PCT/JP2003/002531
Authority: WO
Inventors: Nobuhiko Yui; Masakazu Kato; Rika Fukushima
Original assignee: Japan Tissue Engineering Co.,Ltd
Priority date: 2002-03-06
Filing date: 2003-03-05
Publication date: 2003-09-12
Also published as: AU2003213367A1; JP4104556B2; JPWO2003074099A1

Description

明細書組織再生用基材、移植用材料及びその製法技術分野

本発明は、整形外科、口腔外科、形成外科などの医療分野に広く利用可能な組織再生用基材、移植用材料及びその製法に関する。背景技術

近年、再生医療や組織工学が注目されている。組織工学では、細胞増殖の足場として組織再生用基材が重要な役割を担っている。組織再生用基材に求められる機能としては、生体親和性、分解性、力学的強度などがある。

従来、このような組織再生用基材として、コラーゲンゃポリグリコール酸などが知られているが、動物由来のマトリクスでは未知のウィルスなどの感染性が否定できないこと、一方、人工物であっても分解産物が炎症反応を誘起する可能性があること、更に、分解 · 消失の時間制御が困難であることなどが未だ解決されていない。

これらの問題を解決するために、本発明者らは W O 0 2 0 2 1 5 9 (国際公開公報）において、複数の環状分子を貫通させた線状分子の両末端に加水分解性結合を介して嵩高い置換基を有する生体親和性基が導入されたポリ口タキサン、又は、このポリ口タキサンにつき隣接するポリロタキサン 1分子中に含まれる環状分子同士、生体親和性基同士もしくは環状分子と生体親和性基とを架橋結合で架橋して網目構造としたポリ口タキサンヒドロゲルからなる組織再生用基材を提案している。

しかしながら、前出の公報で提案した組織再生用基材では、細胞接着性が十分でないことがあり、細胞播種において効率よく組織再生用基材に細胞を保持させることが難しいことがあった。

本発明は上記問題点を解決することを課題とするものであり、細胞接着性を向上させた組織再生用基材を提供することを目的の一つとする。また、良好に組織を再建できる移植用材料を提供することを目的の一つとする。更に、そのような移植用材料の製法を提供することを目的の一つとする。発明の開示

本発明の第 1は、複数の環状分子を貫通させた線状分子の両末端に加水分解性結合を介して嵩高い置換基を有する生体親和性基が導入されたポリ口タキサン、又は、このポリ口タキサンにつき隣合うポリ口夕キサン 1分子中に含まれる環状分子同士、生体親和性基同士もしくは環状分子と生体親和性基とを架橋結合で架橋して網目構造としたポリ口夕キサンヒドロゲルからなる組織再生用基材において、前記複数の環状分子には細胞接着性を付与する修飾基を有するものがあることを特徴とする。この組織再生用基材を用いて例えば軟骨細胞を培養すると、細胞は軟骨細胞様の形態を維持しながら増殖する。また、この組織再生用基材を単体で生体内に移植しても細胞形態や増殖を阻害することがほとんどないため組織再生が可能である。特に、環状分子が細胞接着性を付与する修飾基を有しているため、このような修飾基がない場合に比べて細胞を効率よく保持することができる。

本発明の組織再生用基材において、線状分子や環状分子は生体親和性 (生体にほとんど害を与えない性質）を有するものであれば特に限定されないが、線状分子としては、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリエチレンダリコールとポリプロピレングリコールとの共重合体、及びポリメチルビニルエーテルからなる群より選ばれる一種又は二種以上であることが好ましい。このように構成する環状分子や線状分子として、生体親和性に優れているものを選ぶことにより、合成されたポリ口タキサンやポリ口タキサンヒドロゲルは生体親和性に優れ、組織再生用移植材料として適している。また、平均分子量は 2 0 0〜 1 0 0 0 0 0、特に 4 0 0〜 5 0 0 0であることが好ましい。環状分子としては、 α、）3又はアーシクロデキストリンであることが好ましいが、これと類似の環状構造を持つものであってもよく、そのような環状構造としては環状ポリエーテル、環状ポリエステル、環状ポリエーテルアミン、環状ポリアミン等が挙げられる。線状分子と環状分子の組み合わせとしては、ひ—シクロデキストリンとポリエチレングリコールとの組合せが好ましい。

本発明の組織再生用基材において、加水分解性結合としては、生体内で加水分解する結合であればどのような結合であってもよい。このうち、生体内で速やかに非酵素的に加水分解することを考慮すればエステル結合であることが好ましい。

組織再生用基材がポリ口タキサンヒドロゲルの場合、架橋結合はウレタン結合、アミド結合、カルバミド結合、エーテル結合、スルフィド結合又はシッフ塩基型結合が好ましい。また、架橋結合は、環状分子同士を架橋する場合、加水分解性結合よりも水に対して安定であることが好ましい。これは、先に加水分解性結合が分解して線状分子の両末端から嵩高い置換基を有する生体親和性基が外れ、架橋結合された環状分子が一度期に脱離することにより、良好な分解パターンが得られるからである。

本発明の組織再生用基材において、線状分子の両末端の生体親和性基としては、生体に対する親和性が高い基（生体に対して安全性の高い基）であればどのような基であってもよいが、例えばアミノ酸、オリゴぺプチド、オリゴ糖類又は糖誘導体であることが好ましい。アミノ酸としては、例えばァラニン、パリン、ロイシン、イソロイシン、メチォニン、プロリン、フエ二ルァラニン、トリプトファン、ァスパラギン酸、ダル夕ミンサン、グリシン、セリン、スレオニン、チロシン、システィン、リジン、アルギニン、ヒスチジン等が挙げられる。また、オリゴぺプチドとしては、前出のアミノ酸の複数がぺプチド結合して形成されたもの等が挙げられる。また、オリゴ糖類としては、繰り返し単位が 1〜 5であり、構成多糖としてデキストラン、ヒアルロン酸、キチン、キトサン、アルギン酸、コンドロイチン硫酸、でんぷんからなるもの等が挙げられる。更に、糖誘導体としては、オリゴ糖類、多糖又は単糖をァセチル化やイソプロピル化等の化学修飾した化合物等が挙げられる。このうち、ベンゼン環を有するアミノ酸、例えば L一フエ二ルァラニン、 Lーチロシン、 L—トリブトファン等が好ましい。

本発明の組織再生用基材において、生体親和性基の嵩高い置換基としては、線状分子から環状分子が抜け落ちるのを防止できればどのような基であってもよいが、例えば 1以上のベンゼン環を有する基又は 1以上の第三ブチルを有する基が好ましい。 1以上のベンゼン環を有する基としては、例えばべンジルォキシカルボニル（Z ) 基、 9ーフレオレニルメチルォキシカルボニル（F m o c ) 基、ベンジルエステル（O B z ) 基等が挙げられ、また、 1以上の第三ブチルを有する基としては、第三ブチルカルボニル（B o c ) 基、アミノ酸第三ブチルエステル（〇B u 基）等が挙げられるが、このうち、ベンジルォキシカルポニル基が好ましい。

本発明の組織再生用基材としては、上記線状分子がポリエチレンダリコール、上記環状分子が α—シクロデキストリン、上記加水分解性結合がエステル結合、上記嵩高い置換基を有する生体内分解性基がベンジルォキシカルボ二ルー L —フエ二ルァラニンであることが特に好ましい。なお、 α—シクロデキストリンをポリエチレングリコールに貫通させる場合、 α—シクロデキストリンとポリエチレングリコールの繰り返し単位（エチレンォキシド単位）の比の化学量論数は 1 ： 2といわれている。本発明の組織再生用基材において、前記修飾基は、正に荷電する基であることが好ましい。一般に、細胞はプラス及びマイナスの両電荷を有しているもののマイナスの電荷が多いことが知られており全体的には負電荷を有していることから、修飾基として正に荷電して正電荷を持つ基を導入すれば細胞接着性が向上し、細胞を効率よく保持することができるため好ましい。

本発明の組織再生用基材において、前記修飾基は、窒素原子を含む基であることが好ましい。窒素原子は正に荷電してカチオン化する性質を有していることから、負電荷を有している細胞との接着性が向上し、細胞を効率よく保持することができるため好ましい。窒素原子を含む基としては、例えば以下のアミノ化剤によって環状分子に導入されるァミノ基が挙げられる。即ち、ヒドラジン、 1， 2—ジアミノエタン（ェチレンジァミン）、 1， 3—ジァミノプロパン、 1 , 4—ジァミノブタン、 1 , 5—ジァミノプロパン、 1 , 6—ジァミノへキサンなどのジァミンアルカン類、 ο—フエ二レンジァミン、 m—フエ二レンジァミン、 p _ フエ二レンジァミンなどのジァミノベンゼン類、ポリリジン、ポリビニルァミン、キトサンなどのポリアミン類（複数のアミノ基を有する高分子化合物）などが挙げられる。

前記修飾基がアミノ基の場合において、ポリ口タキサンヒドロゲルへのァミノ基の導入割合と、組織再生用基材を用いて所定の細胞を培養したときの細胞増殖状態又はグリコサミノダリカン産生状態との相関関係を予め求めておき、該相関関係に照らして所望の細胞増殖状態又はダリコサミノグリカン産生状態となるようにァミノ基の導入割合を設定してもよい。例えば、採取細胞の量が多いときには細胞増殖能は低くてもグリコサミノグリカンの産生能が高いアミノ基の導入割合を採用し、採取細胞の量が少ないときにはグリコサミノグリカンの産生能が低くても細胞増殖能が高いアミノ基の導入割合を採用してもよい。

その他に、前記修飾基は、ポリカチオンであってもよい。この場合も、負電荷を有している細胞との接着性が向上し、細胞を効率よく保持することができるため好ましい。ポリカチオンは正電荷を多数有する高分子化合物であり、例えば四級アンモニゥムを含む高分子化合物などが挙げられる。

本発明の組織再生用基材において、前記修飾基は、疎水性の基であることが好ましい。一般に、修飾基として疎水性基を導入すれば細胞接着性が向上し、細胞を効率よく保持することができるため好ましい。

本発明の組織再生用基材において、前記修飾基は、ァシル基、コレステロール、トリグリセリド、リン脂質、グリセ口糖脂質及びスフインゴ糖脂質からなる群より選ばれた 1種又は 2種以上であることが好ましい。これらの基は水酸基を保護することにより疎水性になることから細胞接着性が向上し、細胞を効率よく保持することができるため好ましい。このうちァシル基としては、例えば以下のァシル化剤によって環状分子に導入される基が挙げられる。即ち、無水酢酸、無水プロパン酸、無水ブタン酸、無水安息香酸などの酸無水物、酢酸クロリドなどの酸ハライドなどが挙げられるが、このうち酸無水物が好ましい。

本発明の組織再生用基材は、複数のシクロデキストリンを貫通させた線状分子の両末端に加水分解性結合を介して嵩高い置換基を有する生体親和性基が導入されたポリ口タキサンと N , N ' —力ルポニルジイミダゾールとを反応させて得られた反応生成物に、ポリエチレンダリコールビスアミンおよびアミノ化剤を反応させることにより得られたものであつてもよい。このようにして得られた化合物はポリ口タキサンヒドロゲルがアミノ化されたものであるため、ヒドロゲル内に正電荷が導入されて細胞接着性が向上する。なお、線状分子、加水分解性結合、嵩高い置換基及び生体親和性基としては、前述したものを採用してもよい。

本発明の組織再生用基材は、複数のシクロデキストリンを貫通させた線状分子の両末端に加水分解性結合を介して嵩高い置換基を有する生体親和性基が導入されたポリ口タキサンと N， N ' 一カルボニルジイミダゾ一ルとを反応させて得られた反応生成物に、ポリエチレングリコールビスァミンおよびァシル化剤を反応させることにより得られたものであつてもよい。このようにして得られた化合物はポリ口タキサンヒドロゲルがァシル化されたものが得られるため、疎水性が増して細胞接着性が向上する。なお、線状分子、加水分解性結合、嵩高い置換基及び生体親和性基としては、前述したものを採用してもよい。

本発明の組織再生用基材は、細胞を培養又は組み込み可能な形態であれば特にどのような形態であろうと限定されない。例えばシート状にしてその上に細胞を播種したり、細胞とともにゲル状にして細胞を包埋したり、ゲル状にしてその上に細胞を播種したり、溶媒に溶かしてその溶液に細胞を播種したり、溶媒に懸濁させてその懸濁液に細胞を播種したりしてもよい。特に、細胞を保持 ·培養しやすくする点を考慮すれば、ポリ口タキサン又はポリ口タキサンヒドロゲルの多孔体を用いることが好ましい。このときの孔については細胞を保持できる大きさ ·密度であれば特に限定されない。また、細胞と組み合わせず組織再生用基材を単体で生体内に移植する場合にも、組織再生用基材の形態が限定されることはない。好ましくは移植周辺組織からの細胞が増殖するのに好適な環境を与えるため、多孔体にすることが好ましい。その際、孔の大きさ、密度は移植周辺組織から細胞が侵入し、細胞増殖や基質産生等の組織再生するのに適当な大きさ、密度とすればよく、特に限定はされない。また、多孔体の製法としては、周知の方法を適用可能であり、例えば、炭酸水素ナトリウム存在下でゲル化する方法や、含水ヒドロゲルを真空凍結乾燥する方法等が適用可能である。

本発明の組織再生用基材は特にどのような細胞の培養又は組み込みに用いてもよいが、例えば、接着依存性細胞であることが好ましく、例えば、軟骨細胞、骨芽細胞、線維芽細胞、表皮細胞、上皮細胞、脂肪細胞、肝細胞、塍細胞、筋細胞又はこれらの前駆細胞や、間葉系幹細胞、胚性幹細胞（E S細胞）等が挙げられる。これらの細胞は移植対象部位に応じて単独で用いてもよいし 2種以上を用いてもよい。これらの細胞は、細胞種に応じた公知の採取方法によって生体から採取すればよく、また、採取された細胞をそのまま使用してもよいし、適当な培地で所定期間培養することで増殖または分化させたあとに組織再生用基材に播種してもよい。

本発明の組織再生用基材を用いて組織を再生する方法としては、組織再生用基材を単体で使用する方法や、この組織再生用基材に単に細胞を組み込み使用する方法や、この組織再生用基材で細胞を培養して使用する方法などが挙げられる。また、細胞を固定化する方法としては、例えば、ポリ口タキサンヒドロゲルにあっては高濃度の細胞培養液を添加しゲルの膨潤と共に細胞をゲル孔内へ取り込ませることにより固定化する方法、回転培養する方法、細胞を播種したあと細胞に影響を与えない程度に減圧することにより固定化する方法などが挙げられる。

本発明の組織再生用基材に細胞が培養されているか又は細胞が組み込まれた移植用材料を用いれば、組織再生用基材を単体で使用するよりも早期に組織再生が可能となる。この移植用材料を製造する方法としては、特にどのような製造方法でもよいが、前記組織再生用基材を使用目的に応じて適当な大きさ又は形状にしたあと、この組織再生用基材に細胞を培養するか組み込むことにより移植用材料を得ることが好ましい。例えば、耳の軟骨の再建に用いる場合には、耳の適用部位に適合するよう整形 ·加工した組織再生用基材に細胞懸濁液を注入して、一定期間培養して移植用材料としてもよい。この場合、この移植用材料は耳の適用部位に埋め込まれる。逆に、組織再生用基材に細胞を培養又は組み込んだあと、この移植用材料を利用時又は出荷時に適応部位に応じた適切な大きさ又は形状にしてもよい。

本発明の組織再生用基材に例えば軟骨細胞が培養された移植用材料では、培養細胞は軟骨細胞様の形態を維持しながら増殖し、軟骨基質を豊富に産生している。軟骨組織は、軟骨細胞とその細胞が産生する基質によって主に修復されるため、予めこれらが豊富に含有されていることは、その移植用材料が高い組織再生能力を有することを意味している。このように、培養操作を行った場合には、組織修復に必要な細胞を増殖させること、あるいは、細胞の産生物質（基質や成長因子など）を移植用材料中に担持できる点で好ましいが、何らかの理由によって細胞が死滅した場合でも、細胞が産生した基質や成長因子は移植用材料中に残存するため組織再生には有効である。さらに、前記組織再生用基材に例えば軟骨細胞を播種しただけ、即ち、培養せずに単に組み込んだだけでも、細胞の形態が維持されるために移植直後からこれらの細胞が組織再生に機能し、移植用材料として有効である。図面の簡単な説明

図 1はポリ口タキサンの合成手順を表す説明図、図 2は C D I — P R の合成手順を表す説明図、図 3はアミノ化ヒドロゲルの合成手順を表す説明図、図 4はァセチル化ヒドロゲルの合成手順を表す説明図、図 5はポリリジン固定化ヒドロゲルの合成手順を表す説明図、図 6は細胞接着性の評価を表すグラフ、図 7は細胞増殖性の評価を表すグラフ、図 8はアミノ基量と細胞増殖能との関係を表すグラフ、図 9はァミノ基量とグリコサミノグリカンの産生能との関係を表すグラフ、図 1 0はァミノ基量と 1細胞あたりのダリコサミノダリカンの産生量との関係を表すグラフである。発明を実施するための最良の形態

[実施例 1] ポリ口タキサンの合成（図 1参照）

[ 1 - 1 ] 両末端にアミノ基を有する P E Gの合成

分子量 3300のポリエチレングリコール（P EG) ( 33 g, 1 0 mm o 1 ) と無水コハク酸（ 20 g , 2 0 0 mm o 1 ) をトルエン（ 2 20 m l ) に溶解させ、この溶液を 1 5 で 5時間還流させた。反応終了後、過剰のジェチルエーテルに注ぎ込み、濾別 ·減圧乾燥して粗生成物を得た。これをジクロロメタンに溶解させ、不溶物を遠心分離により除去し、過剰のジェチルェ一テルに注ぎ込んで、濾別 ·減圧乾燥後に両末端に力ルポキシル基を有する P EG (化合物 A) を白色粉末として得た。この化合物 A ( 2 0 g， 5. 7mmo 1 ) と N—ヒドロキシスクシンイミド（HO S u) ( 1 7. 1 g , 148. 2 mm o 1 ) を 1 , 4 —ジォキサンとジクロロメタンの混合溶液（ 3 50 m l , 体積比 1 ： 1) に溶解させ、氷冷後ジシクロへキシルカルポジィミド（D C C) (2 3. 5 g, 1 14mmo 1 ) を加えた。氷冷したまま 1時間攪拌し、その後室温で終夜攪拌した。副生成物のジシクロへキシルウレァを濾別し、濾液は濃縮してから過剰のジェチルエーテルに注ぎ込んだ。濾別 ·減圧乾燥後にカルボキシル基が活性化された P EG (化合物 B) を白色粉末として得た。次いで、エチレンジァミン（0. 4m l , 6mmo l ) を溶解させたジクロロメタン（7 5m l ) に、化合物 B ( 1 0 g, 2. 7 m mo 1 ) を溶解させたジクロロメタン（7 5m l ) を滴下し、滴下終了後から室温で 1時間攪拌した。反応終了後、溶液を過剰のジェチルエーテルに注ぎ込み、濾別 ·減圧乾燥後に両末端にアミノ基を有する P E G (化合物 C) を白色粉末として得た。

[ 1 - 2] 擬ポリ口タキサンの調製

ひ一シクロデキストリン（ α— C D) (4 8 g, 4 9. 2 mm o 1 ) の飽和水溶液（3 1 1 m l ) に化合物 C (4 g， 1. 1 2 mm o 1 ) の水溶液（2 0m l ) を室温で滴下した。 1時間超音波を照射しながら攪拌し、その後室温で 2 4時間攪拌した。遠心分離により白色の沈殿物を回収し、 5 0 で減圧乾燥を行い、白色粉末の擬ポリロタキサンを得た。なお、ポリ口タキサンとは、多数の環状分子（例えばシクロデキストリン）に線状分子（例えば P E G) が貫通し、その線状分子の両末端を嵩高い置換基でキャップしたものをいい、擬ポリロタキサンとは、ポリ口タキサンの両末端を未だ嵩高い置換基でキヤップしていないものをいう。

[ 1 - 3] 末端キャップ剤の調製

_ CDの脱離を防止する嵩高い置換基としてべンジルォキシカルボ二ルー L—フエ二ルァラニン（Z— L— P h e、 Zはベンジルォキシカルポ二ル基を表す）を導入するために、 Z— L一 P h eのカルボキシル基の活性化を行った。すなわち、 Z— L一 P h e ( 1 0 0 g, 3 3 4m mo 1 ) を 1 , 4一ジォキサン（ 8 0 0 m l ) に溶解させ、氷冷しながら H〇S u ( 3 8. 4 2 g , 3 34mmo 1 ) を加えた。 1時間後に D C C ( 7 5. 7 g , 3 6 7 mmo 1 ) を溶解させた 1， 4—ジォキサン溶液（2 0 0m l ) をゆっくり加え、氷冷したまま 1時間攪拌し、その後室温で終夜攪拌した。副生成物のジシクロへキシルゥレアを濾別し、濾液は濃縮してから過剰のジェチルエーテルに注ぎ込み、濾別 ·減圧乾燥後に粗生成物を得た。室温でできるだけ飽和濃度になるように粗生成物をジクロロメタンに溶解させた後、石油エーテルを適量加え冷蔵し、再結晶を行った。結晶を濾別 ·減圧乾燥して白色針状結晶の Z— L一 P h eのスクシンイミドエステル（Z _L— P h e— O S u) を得た。

[ 1 - 4] ポリ口タキサンの調製

Z -L -P h e -O S u ( 8 0 g , 2 0 0 mm o 1 ) をジメチルスルフォキシド（DMS O) (6 0m l ) に溶解させ、擬ポリ口タキサン（4 5 g、 2mmo 1 ) を加えた。この不均一溶液を室温で攪拌しながら、均一になるように少しずつ DM S Oを加えて 9 6時間攪拌した。反応終了後、反応溶液を過剰のジェチルェ一テルに注ぎ込み、粗生成物を得た。粗生成物をアセトン、ジメチルホルムアミド（DMF) の順で洗浄して不純物（未反応 Z— L— P h e—〇 S u、 a -CO, 化合物 Cなど）を除去し、濾別 ·減圧乾燥して生分解性のポリ口タキサンを白色粉末として得た。合成の確認は、 1H— NMRにより行った。また、このポリ口夕キサンの α— CD貫通数を 1H— NMRでの P E Gのプロトンと a— C Dの 1位のプロトンとの積分比から求めたところ、 2 3であった。

[実施例 2] CD I活性化ポリ口タキサンの調製（図 2参照）

実施例 1で得られたポリ口タキサン（ l g， 0. 0 3 6 9 m o 1 , C D= 0. 8 7 1 mm o 1 , OH= 1 5. 6 mm o 1 ) を DMS O ( 1 0 m l ) に窒素雰囲気下で溶解させ、 N, N' 一カルボニルジイミダゾール（CD I ) 2. 54 g ( 1 5. 6mmo 1 ；ポリ口タキサン中の水酸基と等量）を加え、窒素雰囲気下室温で反応を行い、 3時間経過後エーテルに滴下して白色沈殿物を生成させ、これをろ過し室温で減圧乾燥して白色粉末の CD I活性化ポリ口タキサン（CD I — P R) を得た。この CD I — P Rの活性化率を紫外吸光分光計を用いて 2 0 7 nmの吸光度から算出したところ、 9 1. 3 7 %であった。

[実施例 3] アミノ化ヒドロゲルの調製（図 3参照）

実施例 2で得られた CD I — P R 2. 347 g (ポリ口タキサンとして l g) を DM S〇 5 m 1 に溶解させ、そこへ融解した両末端にァミノ基を有するポリエチレングリコール（PEG— BA, 平均分子量 2 0 0 0 ) 1. 742 6 gを加えて撹拌した。さらに炭酸水素ナトリウム 3 0 gを加え、よく撹拌した後に、ポリテトラフルォロエチレン製のスぺーサ（直径 1. 3 cm, 深さ 1 cm) に 0. 8 gずつ入れて、 3 5でで 1 日ゲル化反応を行い、ポリ口タキサンヒドロゲルとした。反応終了後、エチレンジァミン 5m l を DMS 05 00m l に溶解した溶液にこのポリ口タキサンヒドロゲルを加えて、 2 5 で 1 2時間アミノ化反応を行つた。ここで、ゲル化反応において未反応の活性化部位に対してェチレンジァミンが付加することでァミノ化されると考えられる。アミノ化反応終了後、反応生成物を 2 0重量％のクェン酸水溶液に浸潰して、炭酸水素ナトリウムの発泡および溶出を 9時間行うことにより多孔質化を行つた。発泡 ·溶出終了後に得られた反応生成物を蒸留水で洗浄し、エタノールで脱水和を行い、最後に凍結乾燥してアミノ化ヒドロゲルを得た。このアミノ化ヒドロゲルの推定構造を図 3に示す。

[実施例 4] ァセチル化ヒドロゲルの調製（図 4参照）

実施例 2で得られた CD I — P R 2. 347 g (ポリ口タキサンとして l g) を DMS〇 5m 1 に溶解させ、そこへ融解した両末端にァミノ基を有するポリエチレングリコール（P EG— BA, 平均分子量 2 00 0 ) 1. 7426 gを加えて撹拌した。さらに炭酸水素ナトリウム 30 gを加え、よく撹拌した後に、ポリテトラフルォロエチレン製のスぺーサ（直径 1. 3 cm, 深さ 1 c m) に 0. 8 gずつ入れて、 3 5 で 1 日ゲル化反応を行い、ポリ口タキサンヒドロゲルとした。反応終了後、無水酢酸 2 5m l とピリジン 3 7. 5m lを DMS〇 5 0 0m l に溶解した溶液にこのポリ口タキサンヒドロゲルを加えて、 2 5でで 1 2時間ァセチル化反応を行った。ここで、ゲル化反応において未反応の活性化部位と未活性の水酸基に対してァセチル基が導入されると考えられる。ァセチル化反応終了後、反応生成物を 2 0重量％のクェン酸水溶液に浸漬して、炭酸水素ナトリゥムの発泡および溶出を 9時間行うことにより多孔質化を行った。発泡 ·溶出終了後に得られた反応生成物を蒸留水で洗浄し、エタノールで脱水和を行い、最後に凍結乾燥してァセチル化ヒドロゲルを得た。このァセチル化ヒドロゲルの推定構造を図 4に示す。

[実施例 5] ポリリジン固定化ヒドロゲルの調製（図 5参照）

ポリ ε一リジンは、有機溶媒に溶解しないため α— CDと反応させて擬ポリロタキサン型ポリリジンとしたあと反応系に添加した。即ち、予めポリ £ —リジンと α— CDとを反応させて擬ポリ口タキサン型ポリリジンとし、これをァミノ化剤とした。この擬ポリロタキサン型ポリリジン 1. 7 8 3 3 g (0. 0 7 3 8 mmo 1 ；ポリロタキサンの 2等量）と実施例 2で得られた CD I — P R 2. 34 7 g (ポリ口タキサンとして l g) を DM S 05 m 1に溶解させ、そこへ融解した両末端にァミノ基を有するポリエチレングリコール（P EG— BA, 平均分子量 2 00 0 ) 1. 742 6 gを加えて撹拌した。さらに炭酸水素ナトリウム 3 0 gを加え、よく撹拌した後に、ポリテトラフルォロエチレン製のスぺーサ（直径 1. 3 cm, 深さ 1 c m) に 0. 8 gずつ入れて、 3 5 で 1 日ゲル化反応を行った。 DM S O中では擬ポリ口タキサン型ポリリジンの解離が生起するため、ポリ ε—リジンのァミノ基が露出されて CD I — P Rとの反応が進行しゲル内に固定化される。ゲル化反応終了後に、反応生成物を 2 0重量％のクェン酸水溶液に浸潰して、炭酸水素ナ卜リゥムの発泡および溶出を 9時間行うことにより多孔質化を行った。発泡 •溶出終了後に反応生成物を蒸留水で洗浄し、エタノールで脱水和を行レ最後に凍結乾燥してポリ ε—リジン固定化ヒドロゲルを得た。このポリ ε 一リジン固定化ヒドロゲルの推定構造を図 5に示す。

[実施例 6] 接着効率の測定

実施例 3で得たアミノ化ヒドロゲルと、実施例 3においてアミノ化反応を省略して得たヒドロゲル（以下、非修飾ヒドロゲルという）とを用いて細胞培養実験を行った。即ち、アミノ化ヒドロゲルおよび非修飾ヒドロゲルの各々を 1 2分割し、十分に水洗後、 7 0 %エタノールに 3 0 分間浸潰して滅菌した。その後、培養用シャーレに移し、滅菌缶の中で蓋を開封した状態にして 50でで一晩乾燥した。分割した各ヒドロゲルに 1 X 1 0⁷ c e 1 1 s /mLに調整したゥサギ軟骨細胞懸濁液を 2 0 L滴下した。この状態で 3 0分間放置した後、 24穴プレートに移し、培養用培地 2 mLを加えた。また、検量線作成のために、 6. 4 X 1 0⁶ c e 1 1 s ZmLの細胞懸濁液を調整し、 24穴プレートに 6. 4 X 1 0⁵〜： L X 1 0⁴c e l l s/ 1 0 0 m L /ゥエルとなるように調整した。接着効率の測定は、各ヒドロゲルから零れ落ちた細胞数を MTTアツセィで計測することにより行った。 MTTアツセィでは、 MTT試薬が細胞内酵素活性によって還元されてフオルマザンが生成されることからフオルマザンは生細胞数の酵素活性に相関しているため、フオルマザンの吸光度を測定することにより細胞数を計測することができる。まず、播種 24時間後の培養していた各ヒドロゲル入りの 24穴プレー卜を、 3 7 に設定したマイクロプレートミキサで 2時間撹拌した。この操作により接着せずに溜まっている細胞をヒドロゲルより洗い出した。その後、ヒドロゲルを別の 24穴プレートに移し、培養用培地 2 mLを各穴に加えて軟骨細胞培養実験に供した。一方、零れ落ちた（洗い出した）細胞が存在する 24穴プレートには、 MT T試薬 5 0 Lを各穴に滴下し、マイクロインキュベータで 24時間攪拌しながら培養した。培養後、 MTTが細胞内脱水素酵素により還元されて生成するフオルマザンを 0. O mo l ZLの HC 1 Zイソプロパノール 1 0 00 Lで可溶化して、溶液 2 0 0 Lを 96穴プレー卜に移して吸光度（A 5 7 0Z6 5 0) を測定し、接着効率の測定を行つた。検量線用プレートも同様の操作で処理した。その結果、図 6に示すように、アミノ化ヒドロゲルで培養したものは検出限界以下であったのに対し、非修飾ヒドロゲルで培養したものは播種細胞数に対し 42. 6 %が非修飾ヒドロゲルに取り込まれずに零れ落ちた結果となった。なお、 MTTは 3— (4， 5—ジメチルー 2 _チアゾィル） — 2, 5—ジフエニル— 2 H—テトラゾリゥムブ口マイドの略である。

[実施例 7] 細胞増殖性の評価

軟骨細胞培養実験に供した 24穴プレートでは、 3 7T：、 5 %C02 インキュベータ内で 2 1日間静置培養を行った。培養中は、経時的に顕微鏡観察を行い、 MTTアツセィによる細胞数の計測を行った。その結果、アミノ化ヒドロゲルで培養したものと非修飾ヒドロゲルで培養したものとではほぼ同様の増殖曲線が得られた。ただし、培養 2 1日後以降は、アミノ化ヒドロゲルで培養したものの方が非修飾ヒドロゲルで培養したものに比べ生細胞数が多くなり、培養 2 8日後には非修飾ヒドロゲル中の生細胞数は 1. 8 X 1 0⁶c e 1 1 s /担体（n= 3) であったのに対し、アミノ化ヒドロゲル中の生細胞数は 2. 7 X 1 0⁶c e 1 1 s / 担体（n= l ) と、ほぼ 5倍の細胞数となった。

また、アミノ化ヒドロゲルで培養したものと非修飾ヒドロゲルで培養したものの培養 28日後のアルシアンブル一による染色像を撮影したところ、いずれも強度のアルシアンブルー陽性像が得られ、軟骨基質（酸性ムコ多糖（グリコサミノダリカン）類）が産生していることが確認できた。ただし、アミノ化ヒドロゲルで培養したものでは、アルシアンブルー陽性部位が担体全体に連続していたのに対し、非修飾ヒドロゲルで培養したものでは、細胞コロニーが散在しそのコロニー周囲にァルシアンブルー陽性部位が限定されており、両者は明確に差別化することがでさた。

[実施例 8 ] アミノ基量と細胞増殖能との相関及びアミノ基量とダリコサミノダリカン産生能との相関

エチレンジァミンによりアミノ基を導入したアミノ化ヒドロゲルとして、実施例 3に準じて下記表に示すコード番号 Am i n o— 2〜 7を作製した。ここで、 Am i n o— 1はコントロールであり、エチレンジァミンによるアミノ基の導入を行っていないポリ口タキサンヒドロゲルである。下記表中、アミノ基量とは、ドライゲル 1 gに対するァミノ基の mo 1数を表す数値である。表中の Am i n o _ lでは、アミノ基を導入していないにもかかわらずアミノ基量が 1 2 mo 1 程度となつているが、これはァミノ化前のポリ口タキサンヒドロゲル中に含まれる NHによるものと思われる。このため、 Am i n o— 2〜 7のァミノ基の導入割合は、各ァミノ基量から Am i n o - 1のアミノ基量を差し引いた値と推定される。

アミノ基量

コード置換基

mol/g Dried gel)

Δ"\ mlflil【lリ 11

なし 12.02

(control)

Amino - 2 アミノ基 35.72

Ammo - 3 アミノ基 65.01

Amino - 4 アミノ基 70.96

Amino - 5 アミノ基 75.33

Amino— 6 アミノ基 80.79

Amino - 7 アミノ基 88.23 各コードのポリ口タキサンヒドロゲルを用いた細胞培養は以下のようにして行った。即ち、各コードのポリ口タキサンヒドロゲルを 4分割し、十分に水洗後（蒸留水中での撹拌（3 0分間）を 4度行った）、 7 0 % エタノールに 3 0分間浸漬して滅菌した。その後、 2 4穴プレートに移し、安全キャビネット内で一晩送風乾燥した。このポリ口タキサンヒド口ゲルに 1 X 1 0⁷ c e 1 1 s ZmLに調整したゥサギ軟骨細胞液を 2 滴下した。 3 0分間放置した後、培養用培地を加えた。また、検量線作成のために、 6. 4 X 1 0⁶ c e 1 I s mLの細胞懸濁液を調整し、 2 4穴プレートに 6. 4 X 1 0⁵〜 l X 1 0⁴ c e l l s /^/ 1 0 0 0 (1 L/w e 1 1の範囲で播種した。 3 7 、 5 %〇〇₂ィンキュベ一夕内で 24日間静置培養を行った。培地交換は 3〜4日ごとに行った。

生細胞数の測定は以下のようにして行った。即ち、 2 4穴プレートから各コ一ドのポリ口タキサンヒドロゲルにつきそれぞれ 4つずつ取り出し、新たな 2 4穴プレートに入れて 1 0 %F B SZP B S l mLと MT T溶液 1 0 0 Lを添加し、マイクロインキュベータで 24時間撹拌しながら培養した。 0. O mo l ZL HC 1 /イソプロパノール 1 m Lを加えて撹拌しながら生成フオルマザンを可溶化させた。 9 6穴プレ一卜に 2 00 Lずつ入れて吸光度（A 57 0 Z 6 5 0 ) を測定し、測定した吸光度を別途作成した検量線に照らして生細胞数を求めた。

グリコサミノダリカン（GAG) の定量は以下のようにして行った。即ち、 24穴プレートから各コードのポリ口タキサンヒドロゲルにつきそれぞれ 4つずつ取り出し、 48穴プレートに P B S 0. 5mLと共に入れた。 2時間マイクロインキュベータで撹拌しながら洗浄した。この洗净操作をもう一度繰り返した後、一昼夜 4でで保管した。 P B Sを吸引後、細胞分散液 0. 5mLを添加し、マイクロインキュベータで 3時間撹拌しながらインキュベーションし、細胞基質を分解した。測定には、簡易型 ·酸性ムコ多糖定量キット（ホクドー社製）を用いた。まず、未知検体 1 0 0 Lをマイク口遠心チューブに入れ、用事調製（緩衝液 5 3. 6mLに対して発色原液 1. 7mLを加えて撹拌）した反応溶液 1. 3 mLを添加し撹拌した。 5〜 2 0分後の反応液 2 O O w Lを 9 6穴プレートに移して直ちに吸光度（ 6 5 0 nm) を測定し、測定した吸光度を別途作成した検量線に照らして GAGの産生量を求めた。なお、検量線を作成する際には、標準溶液を 1 0 0, 40， 2 0 , 1 0, 5 , 2. 5， 1. 2 5 gZmLの濃度に調製し、未知検体と同様に操作した。これらの結果を図 8及び図 9に示す。図 8は、生細胞数の測定結果に基づき、アミノ基量と細胞増殖能（培養 0日目に対する比率）との関係をグラフ化したものであり、図 9は、 GAGの定量結果に基づき、アミノ基量と GAG産生能との関係をグラフ化したものである。これらの図から明らかなように、細胞増殖能についてはアミノ基量が高い方（6 5 S O ^mo l Zg) が良好であつたのに対して、 GAG産生能についてはァミノ基量が低い方（ 7 5 /mo 1 以下）が良好であった。ちなみに、アミノ基量と 1細胞あたりの GAG産生量との関係をグラフ化したところ、図 1 0に示すようにアミノ基量が高くなるに従い、 1細胞あたりの GAG産生量が低くなる傾向を示した。

以上の結果から、例えば、採取した細胞の量が多いときには、細胞増殖能は低くてよいがダリコサミノダリカンの産生能は高い方が好ましいことがあるため、これに見合ったアミノ基量、具体的には図 8及び図 9 からアミノ基量が 7 5 mo 1 Zg以下、又はアミノ基の導入割合が 6 3 mo 1 以下を採用するようにしてもよい。また、採取した細胞の量が少ないときには、グリコサミノグリカンの産生能が低くても細胞増殖能は高い方が好ましいため、これに見合ったアミノ基量、具体的には図 8及び図 9からアミノ基量が 6 5〜 90 mo l _/ g、又はァミノ基の導入割合が 53〜 78 jizmo 1 Zgを採用してもよい。産業上の利用の可能性

本発明によれば、整形外科、口腔外科、形成外科などの医療分野に広く利用可能な組織再生用基材、移植用材料を提供することができる。

Claims

請求の範囲

1 . 複数の環状分子を貫通させた線状分子の両末端に加水分解性結合を介して嵩高い置換基を有する生体親和性基が導入されたポリ口タキサン, 又は、このポリ口タキサンにつき隣合うポリ口タキサン 1分子中に含まれる環状分子同士、生体親和性基同士もしくは環状分子と生体親和性基とを架橋結合で架橋して網目構造としたポリ口タキサンヒドロゲルからなる組織再生用基材において、

前記複数の環状分子には細胞接着性を付与する修飾基を有するものがある、組織再生用基材。

2 . 前記修飾基は、正に荷電する基である、請求項 1に記載の組織再生用基材。

3 . 前記修飾基は、窒素原子を含む基である、請求項 1に記載の組織再生用基材。

4 . 前記修飾基は、アミノ基である、請求項 1に記載の組織再生用基材。

5 . 前記アミノ基は、アミノ化剤としてジァミノアルカン類及びポリアミン類から選ばれた 1種又は 2種以上を用いて導入したものである、請求項 4に記載の組織再生用基材。

6 . 前記アミノ基は、アミノ化剤としてヒドラジン、 1， 2—ジァミノェ夕ン（エチレンジァミン）、 1 , 3—ジァミノプロパン、 1 , 4ージアミノブタン、 1 , 5—ジァミノプロパン、 1， 6—ジァミノへキサン、 o —フエ二レンジァミン、 m—フエ二レンジァミン及び p —フエ二レンジァミンからなる群より選ばれた 1種又は 2種以上を用いて導入したものである、請求項 4に記載の組織再生用基材。

7 . 前記アミノ基は、アミノ化剤としてジァミノベンゼン類、ポリリジン、ポリビニルァミン及びキトサンからなる群より選ばれた 1種又は 2 種以上を用いて導入したものである、請求項 4に記載の組織再生用基材。

8 . 前記ポリ口タキサンヒドロゲルへの前記アミノ基の導入割合と、前記組織再生用基材を用いて所定の細胞を培養したときの細胞増殖状態又はグリコサミノグリカン産生状態との相関関係を予め求めておき、該相関関係に照らして所望の細胞増殖状態又は所望のグリコサミノグリカン産生状態となるように前記アミノ基の導入割合が設定されている、請求項 4〜 7のいずれかに記載の組織再生用基材。

9 . 前記修飾基は、疎水性の基である、請求項 1記載の組織再生用基材。

1 0 . 前記修飾基は、ァシル基、コレステロール、トリグリセリド、リン脂質、グリセロ糖脂質及びスフィンゴ糖脂質からなる群より選ばれた 1種又は 2種以上である、請求項 1記載の組織再生用基材。

1 1 . 複数のシクロデキストリンを貫通させた線状分子の両末端に加水分解性結合を介して嵩高い置換基を有する生体親和性基が導入されたポリロタキサンと N， N ' 一カルボニルジイミダゾ一ルとを反応させて得られた反応生成物に、ポリエチレングリコールビスァミンおよびアミノ化剤を反応させることにより得られた組織再生用基材。

1 2 . 複数のシクロデキストリンを貫通させた線状分子の両末端に加水分解性結合を介して嵩高い置換基を有する生体親和性基が導入されたポリロタキサンと N , N ' 一カルボニルジイミダゾールとを反応させて得られた反応生成物に、ポリエチレングリコールビスアミンおよびァシル化剤を反応させることにより得られた組織再生用基材。

1 3 . 組織再生用基材を製造する方法であって、

複数のシクロデキストリンを貫通させた線状分子の両末端に加水分解性結合を介して嵩高い置換基を有する生体親和性基が導入されたポリ口タキサンと N , N ' 一カルボニルジイミダゾ一ルとを反応させ、該反応によって得られる反応生成物にポリエチレングリコールビスアミンおよびアミノ化剤を反応させることにより組織再生用基材を製造する方法。

1 4 . 組織再生用基材を製造する方法であって、

複数のシクロデキストリンを貫通させた線状分子の両末端に加水分解性結合を介して嵩高い置換基を有する生体親和性基が導入されたポリ口タキサンと N , Ν ' 一力ルポエルジイミダゾ一ルとを反応させ、該反応によって得られる反応生成物にポリエチレングリコールビスアミンおよびァシル化剤を反応させることにより組織再生用基材を製造する方法。

1 5 . 請求項 1〜 1 2のいずれかに記載の組織再生用基材に細胞が培養されているか又は組み込まれている移植用材料。

1 6 . 請求項 1 ~ 1 2のいずれかに記載の組織再生用基材又は請求項 1 5に載の組織再生用基材にグリコサミノダリ力ンが保持されている移植用材料。

1 7 . 請求項 1〜 1 2のいずれかに記載の組織再生用基材に細胞を培養するか又は組み込むことにより移植用材料を得る移植用材料の製法。