WO2019225600A1 - ハイドロゲルの評価方法 - Google Patents

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WO2019225600A1
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hydrogel
cells
measurement
measurement step
living cells
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剛久 花輪
弥生 河野
大 儘田
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学校法人東京理科大学
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms

Definitions

  • the present invention relates to a method for evaluating a hydrogel.
  • hydrogel which is a polymer having a three-dimensional network structure
  • the hydrogel retains a large amount of water due to the three-dimensional network structure.
  • hydrogels derived from pullulan, dextran, collagen, alginate, polyvinyl alcohol, etc.
  • hydrogels Various hydrogels derived from pullulan, dextran, collagen, alginate, polyvinyl alcohol, etc.
  • their mechanical strength, water retention, cell adhesion, biocompatibility and other properties are known.
  • a hydrogel with high cell adhesiveness can be used in fields such as regenerative medicine as a cell scaffold.
  • a hydrogel with low cell adhesion can be used as a wound dressing containing a therapeutic agent.
  • Patent Document 1 discloses a hydrogel containing a mixture of crosslinked pullulan and dextran that can be used as a scaffold for cells suitable for tissue repair, tissue regeneration, and the like.
  • the present invention has been made in view of the above, and an object of the present invention is to provide a method for evaluating a hydrogel that can easily measure cell adhesion and cytotoxicity of the hydrogel.
  • ⁇ 1> First measurement step of culturing adhesive cells on a hydrogel, staining the live cells with a stain that develops color in the live cells, and measuring the number of viable cells by microscopic observation, and the first measurement After the step, the hydrogel is washed, and the cells for the hydrogel are measured based on the second measurement step of measuring the number of living cells by microscopic observation, the measurement result in the first measurement step, and the measurement result in the second measurement step.
  • a hydrogel evaluation method comprising: an adhesive evaluation step for evaluating adhesiveness.
  • ⁇ 2> The hydrogel evaluation method according to ⁇ 1>, wherein, in the first measurement step and the second measurement step, the adhesive cells are cultured in a recess provided in a plate-like hydrogel substrate.
  • hydrogel evaluation method according to ⁇ 1> or ⁇ 2>, further including a toxicity evaluation step of evaluating the cytotoxicity of the hydrogel based on a measurement result in the first measurement step.
  • ⁇ 4> The hydrogel evaluation method according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 3>, wherein the staining agent is MTT.
  • ⁇ 5> Based on the measurement process of culturing cells on a hydrogel, staining live cells with a dye that develops color in live cells, and measuring the number of viable cells by microscopic observation, and the measurement results in the measurement process A toxicity evaluation step for evaluating the cytotoxicity of the hydrogel, and a hydrogel evaluation method.
  • the adherent cells are cultured on the hydrogel, the living cells are stained with a stain that develops color in the living cells, and the number of living cells is observed by microscopic observation.
  • a first measurement step for measuring the above, a second measurement step for washing the hydrogel after the first measurement step, and measuring the number of viable cells by microscopic observation, a measurement result in the first measurement step, and the second measurement An adhesion evaluation step for evaluating cell adhesion to the hydrogel based on the measurement results in the step.
  • the hydrogel to be evaluated is not particularly limited as long as it is a polymer having a three-dimensional network structure holding water.
  • a gel is mentioned.
  • macromolecule may be sufficient.
  • the form of the hydrogel is not particularly limited, but may be a hydrogel filled in a microplate, a petri dish or the like, or a plate-like hydrogel base material having a concave portion created using a mold.
  • a solution is poured into a mold having a convex portion at the center, gelled by a freeze-thaw method, etc.
  • a method of producing a plate-like hydrogel substrate having a recess in the surface As an example of the freeze-thaw condition, a PVA derivative may be exemplified as a condition in which a process of freezing at ⁇ 20 ° C. for 18 hours and thawing at 35 ° C. for 6 hours is one cycle, and this is performed several times.
  • the cells used for evaluation of cell adhesion to hydrogel are not particularly limited as long as they are adhesive cells.
  • the staining agent is not particularly limited as long as it develops color in living cells, and 3- (4,5-dimethyl-2-thiazolyl) -2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide (MTT), calcein acetoxy Methyl ester (calcein AM), 7-isobutoxycarbonyloxy-3H-phenoxazin-3-one (CytoRed), fluorescein diacetate (FDA), 5- (6-)-carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) And 2 ′, 7′-bis- (2-carboxyethyl) -5- (6-)-carboxyfluorescein, acetoxymethyl ester (BCECF-AM), and the like.
  • MTT 3- (4,5-dimethyl-2-thiazolyl) -2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide
  • MTT calcein acetoxy Methyl ester
  • the stain When the stain is taken into living cells, it develops color by being hydrolyzed, reduced, etc. by the enzyme. For example, taking MTT as an example, MTT, which is a yellow solution, is reduced by a dehydrogenase to be converted into a blue formazan dye, which is a hardly soluble precipitate. Since the dehydrogenase is an enzyme associated with the mitochondrial electron transport system, no formazan dye is produced in dead cells.
  • the hydrogel Since the hydrogel has a porous structure and adsorbs the staining agent, when the staining agent is dropped onto the cells on the hydrogel, the hydrogel is also stained in the same manner as the cells.
  • the staining agent When a staining agent that develops color in living cells is used, the staining agent is converted into a different pigment in the living cells by the above-described mechanism of action, and thus the living cells are stained in a color different from that of the hydrogel.
  • cells on the hydrogel are stained using a stain that does not develop color in living cells, it is difficult to identify the cells because the hydrogel and cells are stained in the same color.
  • the number of viable stained cells is measured by microscopic observation.
  • the measurement method is not particularly limited, for example, the number of viable cells may be counted by visual observation, or the area of the color-developing portion caused by the viable cells may be measured by image analysis and regarded as the number of viable cells.
  • the number of living cells on the hydrogel obtained as a result is taken as the measurement result in the first measurement step.
  • the type of microscope is not particularly limited, but for a translucent or opaque hydrogel with low light transmission, an epi-illumination microscope is used instead of a transmission microscope.
  • the hydrogel is washed. This removes cells that did not adhere to the hydrogel.
  • the number of viable cells adhered to the hydrogel obtained as a result is taken as the measurement result in the second measurement step.
  • the cell adhesiveness of the hydrogel is evaluated based on the measurement result in the first measurement step and the measurement result in the second measurement step. Specifically, for example, the ratio of the measurement result in the second measurement step to the measurement result in the first measurement step may be calculated and evaluated as the cell adhesion rate.
  • the hydrogel evaluation method may include a step of evaluating the cytotoxicity of the hydrogel based on the measurement result in the first measurement step. For example, the number of viable cells contained in the cells seeded in the hydrogel in advance is confirmed, and the cells that have been killed by the influence of the hydrogel during the culture from the difference from the number of viable cells obtained in the first measurement step A number can be calculated.
  • the step of evaluating the cytotoxicity is included, the cell adhesion and cytotoxicity of the hydrogel can be evaluated in a series of steps.
  • the hydrogel evaluation method includes culturing cells on the hydrogel, staining the living cells with a stain that develops color in the living cells, and measuring the number of living cells by microscopic observation. And a toxicity evaluation step for evaluating the cytotoxicity of the hydrogel based on the measurement result in the measurement step.
  • hydrogel Since the hydrogel, the staining agent, and the method for measuring the number of viable cells by microscopic observation are the same as those in the first embodiment, description thereof is omitted.
  • the cell used for the evaluation of cytotoxicity to the hydrogel is not particularly limited, and may be an adherent cell or a floating cell.
  • a cell suspension in which the number of viable cells has been measured in advance is seeded on a hydrogel, incubated, a staining agent is added dropwise, and then incubated for an appropriate time.
  • the number of viable stained cells is measured by microscopic observation, and the cytotoxicity of the hydrogel is evaluated based on the measurement result and the number of viable cells initially seeded. Specifically, for example, the ratio of the measurement result obtained by microscopic observation to the number of viable cells initially seeded may be calculated and evaluated as a cytotoxic rate.
  • hydrogel evaluation method according to the first embodiment and the second embodiment, cell adhesion and cytotoxicity of the hydrogel can be easily measured. Thereby, effective hydrogel can be selected according to a use.
  • Example 1 In Example 1, the cell adhesion test and cytotoxicity test of the hydrogel were performed by the following methods.
  • the hydrogel base material used as evaluation object was produced as follows. First, ultrapure water was added to EXCEVAL (registered trademark, manufactured by Kuraray Co., Ltd.), which is a derivative of polyvinyl alcohol (PVA), to prepare a solution having an EXCEVAL concentration of 10 w / v%. Next, a metal piece (diameter 20 mm, thickness 10 mm) sterilized by dry heat at 180 ° C. for 1 hour was placed in the center of a stainless steel petri dish (diameter 40 mm, thickness 15 mm). Then, the 10 w / v% EXCEVAL solution was filled on the stainless steel petri dish and gelled by a freeze-thaw method.
  • EXCEVAL registered trademark, manufactured by Kuraray Co., Ltd.
  • PVA polyvinyl alcohol
  • the gelled 10 w / v% EXCEVAL hydrogel was removed from the stainless steel petri dish and inverted to prepare a plate-shaped hydrogel substrate having a recess.
  • freeze-thawing one cycle of freezing at ⁇ 20 ° C. for 18 hours and thawing at 35 ° C. for 6 hours was performed.
  • ⁇ Cell adhesion test> HaCaT cells were seeded at 10000 cells / cm 2 in the recesses of the prepared 10 w / v% EXCEVAL hydrogel substrate and incubated for 24 hours, and then MTT reagent was added dropwise and incubated for 2 hours. Subsequently, the concave part of the said hydrogel base material was observed using the episcopic microscope, and the number of living cells which developed color with the MTT reagent was measured. The hydrogel substrate was washed with a phosphate buffer (PBS) for 15 minutes using a shaker. Then, the concave part of the said hydrogel base material was observed again with the episcopic microscope, and the number of living cells was measured.
  • PBS phosphate buffer
  • FIG. 1A is a microscope image of the hydrogel substrate before washing with PBS
  • FIG. 1B is a microscope image of the hydrogel substrate after washing with PBS. From FIG. 1A, the survival of the cells on the hydrogel was confirmed. From FIG. 1B, it was confirmed that the number of cells on the hydrogel was clearly reduced, and most of the cells were washed away. From this, it is considered that most cells that survived on the 10 w / v% EXCEVAL hydrogel did not adhere.
  • ⁇ Cytotoxicity test> Similar to the cell adhesion test, HaCaT cells were seeded at 10,000 cells / cm 2 in the recesses of the prepared 10 w / v% EXCEVAL hydrogel substrate, incubated for 24 hours, and MTT reagent was then added dropwise. Incubated for 2 hours. Subsequently, the concave part of the said hydrogel base material was observed using the episcopic microscope, and the number of living cells which developed color with the MTT reagent was measured. Since cell survival was confirmed, it was determined that there was no cytotoxicity.
  • Comparative Example 1 In Comparative Example 1, the number of cells on the hydrogel was measured by the following method.
  • the hydrogel to be evaluated was prepared as follows. First, ultrapure water is added to EXCEVAL, and solutions with concentrations of EXCEVAL of 2.5 w / v%, 5.0 w / v%, 7.5 w / v%, and 10.0 w / v% are prepared. Four 24-well plates filled with different concentrations of solutions were prepared. In addition, PVA POVAL (Kuraray Co., Ltd.) was added with ultrapure water to prepare 2.5 w / v%, 5.0 w / v%, 7.5 w / v%, and 10.0 w / v% solutions. Four 24-well plates were prepared in which solutions of all these concentrations were filled in different wells.
  • the solution filled in the eight 24-well plates was gelated by the freeze-thaw method under the following four conditions.
  • the freeze-thaw conditions were 1 cycle, 2 cycles, 3 cycles, and 4 cycles of freezing at ⁇ 20 ° C. for 18 hours and thawing at 35 ° C. for 6 hours.
  • the hydrogel in the frozen and thawed well was washed with PBS, added with DMEM medium, and allowed to stand for 24 hours.
  • the cells were stained blue-violet with crystal violet, but the hydrogel was also stained blue-purple due to adsorption of the staining agent. For this reason, the cells on the hydrogel could not be identified, and the number of cells could not be measured. Therefore, the hydrogel was taken out from the 24-well plate and washed under reflux. Crystal violet in the hydrogel could be removed, but the number of cells could not be measured because the cells were also decolorized.

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Abstract

ハイドロゲル上で接着性細胞を培養し、生細胞内で発色する染色剤を用いて生細胞を染色し、顕微鏡観察により生細胞数を測定する第１測定工程と、第１測定工程後にハイドロゲルを洗浄し、顕微鏡観察により生細胞数を測定する第２測定工程と、第１測定工程における測定結果と第２測定工程における測定結果とに基づき、ハイドロゲルに対する細胞接着性を評価する接着性評価工程と、を含むハイドロゲルの評価方法を提供する。

Description

ハイドロゲルの評価方法
　本発明は、ハイドロゲルの評価方法に関する。
　近年、三次元網目構造を有する高分子であるハイドロゲルが、医療用材料として注目されている。ハイドロゲルは、上記三次元網目構造によって多量の水を保持している。
　ハイドロゲルとしては、プルラン、デキストラン、コラーゲン、アルギン酸塩、ポリビニルアルコール等に由来する種々のハイドロゲルが知られており、それらの機械的強度、保水性、細胞接着性、生体適合性等の特性に応じた用途がある。例えば、細胞接着性の高いハイドロゲルは、細胞の足場として再生医療等の分野で利用することができる。反対に、細胞接着性の低いハイドロゲルは、治療薬を含有する創傷被覆剤等として利用することができる。
　例えば、特許文献１には、組織修復、組織再生等に適している細胞の足場として用いることができる架橋したプルラン及びデキストランの混合物を含むハイドロゲルが開示されている。
特開２０１４－１４０３８１号公報
　上述した通り、近年、特性の異なる様々なハイドロゲルが開発されているため、それらの細胞接着性、生体適合性等の特性を簡便に評価し、用途に応じて最適なハイドロゲルを選択することが望まれる。
　本発明は、上記に鑑みてなされたものであり、ハイドロゲルの細胞接着性及び細胞毒性を簡便に測定することができるハイドロゲルの評価方法を提供することを目的とする。
　上記課題を解決するための具体的な手段には、以下の実施態様が含まれる。
＜１＞ハイドロゲル上で接着性細胞を培養し、生細胞内で発色する染色剤を用いて生細胞を染色し、顕微鏡観察により生細胞数を測定する第１測定工程と、該第１測定工程後に前記ハイドロゲルを洗浄し、顕微鏡観察により生細胞数を測定する第２測定工程と、前記第１測定工程における測定結果と前記第２測定工程における測定結果とに基づき、前記ハイドロゲルに対する細胞接着性を評価する接着性評価工程と、を含むハイドロゲルの評価方法。
＜２＞前記第１測定工程及び前記第２測定工程では、プレート状のハイドロゲル基材に設けられた凹部内で前記接着性細胞を培養する＜１＞に記載のハイドロゲルの評価方法。
＜３＞前記第１測定工程における測定結果に基づき、前記ハイドロゲルの細胞毒性を評価する毒性評価工程をさらに含む＜１＞又は＜２＞に記載のハイドロゲルの評価方法。
＜４＞前記染色剤がＭＴＴである＜１＞～＜３＞のいずれか１項に記載のハイドロゲルの評価方法。
＜５＞ハイドロゲル上で細胞を培養し、生細胞内で発色する染色剤を用いて生細胞を染色し、顕微鏡観察により生細胞数を測定する測定工程と、前記測定工程における測定結果に基づき、前記ハイドロゲルの細胞毒性を評価する毒性評価工程と、を含むハイドロゲルの評価方法。
　本発明によれば、ハイドロゲルの細胞接着性及び細胞毒性を簡便に測定することができるハイドロゲルの評価方法を提供することができる。
実施例の細胞接着性試験における洗浄前のハイドロゲルの顕微鏡画像を示す図である。 実施例の細胞接着性試験における洗浄後のハイドロゲルの顕微鏡画像を示す図である。
　以下、本発明の実施形態について説明する。ただし、本発明は以下の実施形態に限定されるものではない。
［第１実施形態］
　本発明の第１実施形態に係るハイドロゲルの評価方法は、ハイドロゲル上で接着性細胞を培養し、生細胞内で発色する染色剤を用いて生細胞を染色し、顕微鏡観察により生細胞数を測定する第１測定工程と、該第１測定工程後に上記ハイドロゲルを洗浄し、顕微鏡観察により生細胞数を測定する第２測定工程と、上記第１測定工程における測定結果と上記第２測定工程における測定結果とに基づき、上記ハイドロゲルに対する細胞接着性を評価する接着性評価工程と、を含む。
　評価対象となるハイドロゲルは、水を保持している三次元網目構造を有する高分子であれば特に制限されない。例えば、寒天、カラギーナン、デキストラン、プルラン、キトサン、セルロース、ゼラチン、セリシン、フィブロイン、コラーゲン、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリアクリルアミド（ＰＡＡ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）等に由来するハイドロゲルが挙げられる。また、上記高分子の誘導体に由来するハイドロゲルであってもよい。
　ハイドロゲルの形態は特に制限されないが、マイクロプレート、シャーレ等に充填したハイドロゲルであっても、鋳型を用いて作成した凹部を有するプレート状のハイドロゲル基材であってもよい。
　凹部を有するプレート状のハイドロゲル基材の作製方法としては、例えば、中心に凸部を有する鋳型に溶液を流し込み、凍結融解法等によりゲル化した後、ハイドロゲルを取り外し反転させることにより、中心に凹部を有するプレート状のハイドロゲル基材を作製する方法等が挙げられる。凍結融解の条件は、ＰＶＡ誘導体を例に挙げると、－２０℃で１８時間凍結し、３５℃で６時間融解する工程を１サイクルとし、これを数回行う条件としてもよい。
　ハイドロゲルに対する細胞接着性の評価に用いる細胞は、接着性細胞であれば特に制限されない。
　接着性細胞を培養しているハイドロゲル上に、染色剤を滴下して、適切な時間インキュベートする。
　染色剤は、生細胞内で発色する染色剤であれば特に制限されず、３－（４，５－ジメチル－２－チアゾリル）－２，５－ジフェニル－２Ｈ－テトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）、カルセインアセトキシメチルエステル（カルセインＡＭ）、７－イソブトキシカルボニルオキシ－３Ｈ－フェノキサジン－３－オン（ＣｙｔｏＲｅｄ）、二酢酸フルオレセイン（ＦＤＡ）、５－（６－）－カルボキシフルオレセインジアセテートスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）、２'，７'－ビス－(２－カルボキシエチル)－５－（６－）－カルボキシフルオレセイン，アセトキシメチルエステル（ＢＣＥＣＦ－ＡＭ）等が挙げられる。
　上記染色剤は、生細胞内に取り込まれると酵素によって加水分解、還元等されることにより発色する。例えば、ＭＴＴを例に挙げると、黄色の溶液であるＭＴＴが、脱水素酵素によって還元されて難溶性沈殿物である青色のホルマザン色素に変換される。上記脱水素酵素は、ミトコンドリアの電子伝達系に関連する酵素であるため、死細胞ではホルマザン色素は生成されない。
　ハイドロゲルは多孔質構造を有し、染色剤を吸着するため、ハイドロゲル上の細胞に染色剤を滴下すると、ハイドロゲルも細胞と同様に染色される。生細胞内で発色する染色剤を用いた場合、染色剤が上記の作用機序により生細胞内で異なる色素に変換されるため、生細胞はハイドロゲルと異なる色に染色される。一方、生細胞内で発色が起こらない染色剤を用いてハイドロゲル上の細胞を染色する場合、ハイドロゲルと細胞とが同色に染色されるため、細胞を識別することが困難となる。
　染色された生細胞数は、顕微鏡観察により測定される。測定方法については特に制限されないが、例えば、目視により生細胞数を計数してもよく、画像解析により生細胞に起因する発色部の面積を測定して生細胞数とみなしてもよい。この結果得られたハイドロゲル上の生細胞数を、第１測定工程における測定結果とする。
　顕微鏡の種類は、特に制限されないが、光透過性が低い半透明又は不透明なハイドロゲルに対しては、透過型顕微鏡ではなく落射型顕微鏡を用いる。
　顕微鏡を用いて観察することにより、生細胞を簡便に測定することが可能となる。
　第１測定工程後、ハイドロゲルを洗浄する。これにより、ハイドロゲル上に接着しなかった細胞は除去される。
　第１測定工程における測定方法と同様の方法により、洗浄されたハイドロゲル上の生細胞数を測定する。この結果得られたハイドロゲルに接着した生細胞数を、第２測定工程における測定結果とする。
　ハイドロゲルの細胞接着性は、第１測定工程における測定結果と第２測定工程における測定結果とに基づき評価される。具体的には、例えば、第１測定工程における測定結果に対する第２測定工程における測定結果の比を細胞接着率として算出し評価してもよい。
　また、本実施形態に係るハイドロゲルの評価方法は、第１測定工程における測定結果に基づき、ハイドロゲルの細胞毒性を評価する工程を含んでもよい。例えば、予めハイドロゲルに播種される細胞に含まれる生細胞数を確認し、第１測定工程にて得られた生細胞数との差から、培養中にハイドロゲルの影響を受けて死滅した細胞数を算出することができる。上記の細胞毒性を評価する工程を含む場合、一連の工程において、ハイドロゲルの細胞接着性と細胞毒性とを評価することができる。
［第２実施形態］
　本発明の第２実施形態に係るハイドロゲルの評価方法は、ハイドロゲル上で細胞を培養し、生細胞内で発色する染色剤を用いて生細胞を染色し、顕微鏡観察により生細胞数を測定する測定工程と、該測定工程における測定結果に基づき、上記ハイドロゲルの細胞毒性を評価する毒性評価工程とを含む。
　本実施形態に係る評価対象となるハイドロゲル、染色剤、及び顕微鏡観察による生細胞数の測定方法については、第１実施形態と同様であるため、その説明を省略する。
　ハイドロゲルに対する細胞毒性の評価に用いる細胞は、特に制限されず、接着性細胞であっても、浮遊性細胞であってもよい。
　細胞培養及び染色工程では、予め生細胞数を測定した細胞懸濁液をハイドロゲル上に播種し、インキュベートし、染色剤を滴下した後、適切な時間インキュベートする。
　染色された生細胞数を顕微鏡観察により測定し、この測定結果と最初に播種した生細胞数とに基づき、ハイドロゲルの細胞毒性を評価する。具体的には、例えば、最初に播種した生細胞数に対する上記顕微鏡観察による測定結果の比を細胞毒性率として算出し評価してもよい。
　第１実施形態及び第２実施形態に係るハイドロゲルの評価方法によれば、ハイドロゲルの細胞接着性及び細胞毒性を簡便に測定することができる。これにより、用途に応じて有効なハイドロゲルを選別することができる。
　以下、本発明の実施例を説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例に限定されるものではない。
［実施例１］
　実施例１では、以下の方法により、ハイドロゲルの細胞接着性試験及び細胞毒性試験を行った。
＜ハイドロゲル基材の調製＞
　評価対象となるハイドロゲル基材は、以下のように作製した。
　まず、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）の誘導体であるＥＸＣＥＶＡＬ（登録商標、クラレ社製）に超純水を加え、ＥＸＣＥＶＡＬの濃度が１０ｗ／ｖ％の溶液を調製した。次いで、１８０℃で１時間、乾熱滅菌した金属片（直径２０ｍｍ、厚さ１０ｍｍ）をステンレス製シャーレ（直径４０ｍｍ、厚さ１５ｍｍ）の中心に設置した。そして、上記１０ｗ／ｖ％ＥＸＣＥＶＡＬ溶液を、上記ステンレス製シャーレ上に充填し、凍結融解法によりゲル化した。その後、ゲル化した１０ｗ／ｖ％ＥＸＣＥＶＡＬのハイドロゲルを上記ステンレス製シャーレから取り外し反転させて、凹部を有するプレート状のハイドロゲル基材を作製した。なお、凍結融解は、－２０℃で１８時間凍結し、３５℃で６時間融解する工程を１サイクル行った。
＜細胞接着性試験＞
　まず、調製した１０ｗ／ｖ％ＥＸＣＥＶＡＬのハイドロゲル基材の凹部に、ＨａＣａＴ細胞を１００００細胞／ｃｍ２となるよう播種して２４時間インキュベートした後、ＭＴＴ試薬を滴下して２時間インキュベートした。次いで、落射型顕微鏡を用いて、上記ハイドロゲル基材の凹部を観察して、ＭＴＴ試薬により発色した生細胞数を測定した。そして、上記ハイドロゲル基材を振とう機を用いてリン酸緩衝液（ＰＢＳ）で１５分間振とう洗浄した。その後、再び落射型顕微鏡にて上記ハイドロゲル基材の凹部を観察して、生細胞数を測定した。
　図１ＡはＰＢＳで洗浄前の上記ハイドロゲル基材の顕微鏡画像、図１ＢはＰＢＳで洗浄後の上記ハイドロゲル基材の顕微鏡画像である。図１Ａから、上記ハイドロゲル上での細胞の生存が確認された。そして、図１Ｂから、上記ハイドロゲル上の細胞数は明らかに減少し、ほとんどの細胞が洗い流されたことが確認された。このことから、１０ｗ／ｖ％ＥＸＣＥＶＡＬハイドロゲル上に生存していたほとんどの細胞は接着していなかったと考えられる。
＜細胞毒性試験＞
　細胞接着性試験と同様に、調製した１０ｗ／ｖ％ＥＸＣＥＶＡＬのハイドロゲル基材の凹部に、ＨａＣａＴ細胞を１００００細胞／ｃｍ２となるよう播種して２４時間インキュベートした後、ＭＴＴ試薬を滴下して２時間インキュベートした。次いで、落射型顕微鏡を用いて、上記ハイドロゲル基材の凹部を観察して、ＭＴＴ試薬により発色した生細胞数を測定した。細胞の生存が確認されたことから、細胞毒性はないと判断された。
［比較例１］
　比較例１では、以下の方法により、ハイドロゲル上の細胞数の測定を行った。
＜ハイドロゲルの調製＞
　評価対象となるハイドロゲルを以下のように調製した。
　まず、ＥＸＣＥＶＡＬに超純水を加え、ＥＸＣＥＶＡＬの濃度が２．５ｗ／ｖ％、５．０ｗ／ｖ％、７．５ｗ／ｖ％、及び１０．０ｗ／ｖ％の溶液を調製し、これら全ての濃度の溶液が異なるウェルに充填された２４ウェルプレートを４枚準備した。また、ＰＶＡであるＰＯＶＡＬ（クラレ社製）に超純水を加え、２．５ｗ／ｖ％、５．０ｗ／ｖ％、７．５ｗ／ｖ％、及び１０．０ｗ／ｖ％の溶液を調製し、これら全ての濃度の溶液が異なるウェルに充填された２４ウェルプレートを４枚準備した。
　次いで、上記８枚の２４ウェルプレートに充填された溶液を、以下の４条件で凍結融解法によりゲル化した。凍結融解条件は、－２０℃で１８時間凍結し、３５℃で６時間融解する工程を１サイクル、２サイクル、３サイクル、及び４サイクルとした。そして、凍結融解したウェル内のハイドロゲルをＰＢＳで洗浄後、ＤＭＥＭ培地を加え２４時間静置した。
＜ハイドロゲル上の細胞数の測定＞
　各条件で調製したハイドロゲルが充填されたウェル内に、ＨａＣａＴ細胞を５０００細胞／ｃｍ２で播種して２４時間インキュベートした後、ＤＭＥＭ培地を取り除き、４％パラホルムアルデヒド・リン酸緩衝液を用いて１０分間、細胞の固定処理を行った。そして、０．５％クリスタルバイオレットを用いて１５分間、細胞を染色した。その後、超純水でクリスタルバイオレットを洗い流し、落射型顕微鏡を用いて、ハイドロゲル上の細胞数を測定した。
　全条件で調製したハイドロゲルにおいて、クリスタルバイオレットにより細胞が青紫色に染色されたが、ハイドロゲルも染色剤が吸着することにより青紫色に染色された。このため、ハイドロゲル上の細胞を識別できず、細胞数を測定することができなかった。そこで、２４ウェルプレートからハイドロゲルを取り出し還流洗浄した。ハイドロゲル内のクリスタルバイオレットは除去することができたが、細胞も脱色されたため、細胞数を測定できなかった。

Claims (5)

  1. 　ハイドロゲル上で接着性細胞を培養し、生細胞内で発色する染色剤を用いて生細胞を染色し、顕微鏡観察により生細胞数を測定する第１測定工程と、
    　前記第１測定工程後に前記ハイドロゲルを洗浄し、顕微鏡観察により生細胞数を測定する第２測定工程と、
    　前記第１測定工程における測定結果と前記第２測定工程における測定結果とに基づき、前記ハイドロゲルに対する細胞接着性を評価する接着性評価工程と、
    を含むハイドロゲルの評価方法。
  2. 　前記第１測定工程及び前記第２測定工程では、プレート状のハイドロゲル基材に設けられた凹部内で前記接着性細胞を培養する、請求項１に記載のハイドロゲルの評価方法。
  3. 　前記第１測定工程における測定結果に基づき、前記ハイドロゲルの細胞毒性を評価する毒性評価工程をさらに含む、請求項１又は２に記載のハイドロゲルの評価方法。
  4. 　前記染色剤がＭＴＴである、請求項１～３のいずれか１項に記載のハイドロゲルの評価方法。
  5. 　ハイドロゲル上で細胞を培養し、生細胞内で発色する染色剤を用いて生細胞を染色し、顕微鏡観察により生細胞数を測定する測定工程と、
    　前記測定工程における測定結果に基づき、前記ハイドロゲルの細胞毒性を評価する毒性評価工程と、
    を含むハイドロゲルの評価方法。
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