WO2003062437A1 - Procede de production de sel d'ammonium d'$g(a)-hydroxyacide - Google Patents

Procede de production de sel d'ammonium d'$g(a)-hydroxyacide Download PDF

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WO2003062437A1
WO2003062437A1 PCT/JP2002/000312 JP0200312W WO03062437A1 WO 2003062437 A1 WO2003062437 A1 WO 2003062437A1 JP 0200312 W JP0200312 W JP 0200312W WO 03062437 A1 WO03062437 A1 WO 03062437A1
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general formula
microbial
ammonium salt
strain
substituent
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PCT/JP2002/000312
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Yoichi Kobayashi
Kasumi Maeda
Original Assignee
Nippon Soda Co.,Ltd.
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Publication date
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
    • C12P7/42—Hydroxy-carboxylic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/06—Arthrobacter

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing ⁇ -hydroxyammonium salt by hydrolyzing ⁇ -hydroxynitrile using a microbial catalyst derived from a specific microbial strain, and a microbial strain used in the method.
  • ⁇ -Hydroxy acid ammonium salt can be converted to free monohydroxy acid by a usual method.
  • ⁇ -Hydroxy acid or ⁇ 3 ⁇ 4—Hydroxy acid ammonium salt, lactic acid and ammonium lactate are used in the food industry, brewing industry, pharmaceutical industry, etc.
  • 2-hydroxy-4-methylthiobutyric acid and 2-hydroxy 4- Ammonium methylthiobutyrate is useful as a feed additive for livestock
  • ⁇ -hydroxyisobutyric acid is useful as a raw material for organic synthesis.
  • a method for producing ⁇ -hydroxy acid from ⁇ -hydroxy nitrile by microorganisms for example, a method for producing lactic acid, glycolic acid, etc. using microorganisms of the genera Bacillus, Nocteridium, Micrococcus and Brevi bacterium (Japanese Patent Publication No. No. 58-151,200), a method for producing lactic acid, glycolic acid and 2-hydroxyisobutyric acid by a microorganism belonging to the genus Corynebacterium (Japanese Patent Application Laid-Open No.
  • Lactic acid Lactic acid, 2-Hydroxyisobutyric acid, 2-Hydroxyisobutyric-propionic acid, and Lactic acid produced by microorganisms of the genera Pseudomonas, Arthrobacter, Aspergillus, Penicillium, Cocliobolus, and Fusarium. Method for producing mandelic acid (Japanese Patent Application Laid-Open No. 63-222696), Arthrobacter spp., Aspergillus spp.
  • Japanese Unexamined Patent Publication No. Sho 61-56086 discloses that the concentration of lactic acid accumulated by microorganisms belonging to the genus Corynebacterium is 9.8% by weight, and the production rate is 257 mmo1 / min / g— The dry cell weight (30 hours for 4 hours) is disclosed in Japanese Unexamined Patent Publication (Kokai) No.
  • the concentration of lactic acid accumulated by microorganisms belonging to the genus Pseudomonas is 10% by weight
  • the concentration of lactate accumulated by microorganisms belonging to the genus 0.15% by weight and the concentration of 2-hydroxyhydroxybutyric acid accumulated by microorganisms belonging to the genus Pseudomonas to 0.8% by weight were found to be 0.18% by weight.
  • the publication discloses that the concentration of 2-hydroxymethyl-4-butyric acid accumulated at 188 mM (2.8% by weight) and a production rate of 4.7 mmol // 45 OD by Caseobacter sp.
  • An object of the present invention is to produce ⁇ -hydroxyammonium salt using a specific microbial strain capable of accumulating ⁇ -ammonium ammonium salt at a high concentration and maintaining an industrially satisfactory production rate for a long period of time. Method Is to provide.
  • the present inventors have found that the activity of microorganisms that produce ammonium salt of hydroxy acid from monohydroxynitrile is not suppressed by high concentrations of monohydroxynitrile or ammonium salt of hydroxy acid for a long time.
  • ⁇ —Hydroxy Arthrobacter sp. NSSC newly isolated by the mutation treatment of Arthrobacter sp. NSSC 104 (FE RM BP-5829), which is the highest microorganism ever known to produce ammonium citrate salt 2 04 (FE RM BP-7662)) was found to have the desired activity, and the present invention was completed.
  • the present invention relates to a compound represented by the general formula [I] :: CH (0 H) CN (wherein, R is a hydrogen atom, a C i -C 6 alkyl group which may have a substituent, C 2 -C 6 alkenyl group, C 1 -C 6 alkoxyl group which may have a substituent, aryl group which may have a substituent, aryl group which may have a substituent —Shows a alkoxy group or a heterocyclic group which may have a substituent (s).)
  • Is converted to a compound represented by the general formula [II]: RCH (0H) COO— ⁇ 4 + (wherein R has the same meaning as described above.)
  • the average production rate of the ammonium monohydroxylate represented by the general formula [II] Microorganisms that can maintain at least 100 / mo1 / min / g dry cell weight for 14 days or more
  • a microbial catalyst derived from a microbial strain capable of accumulating 20 to 60% by weight of an ⁇ -hydroxyammonium salt of the general formula [II] therein.
  • NSSC 204 or a microorganism derived from the microorganism which is represented by the general formula (II) according to claim 3.
  • ⁇ -Hydroxy acid ammonium represented by The method for producing a salt (Claim 6), wherein the aryl group which may have a substituent is a phenyl group, which is represented by the general formula [ ⁇ ] according to any one of Claims 1 to 5,
  • Process for producing ⁇ -hydroxyammonium salt (Claim 7) The ⁇ -hydroxynitrile is lactonitrile, acetonocyanhydrin, mandelonitrile or 2-hydroxy-4-methylthiobutyronitrile.
  • the present invention also relates to a method (claim 8) for producing an ⁇ -hydrogen ammonium oxyacid salt represented by the general formula [ ⁇ ] according to any one of claims 1 to 7.
  • the present invention provides a compound represented by the general formula [I]: RCH (OH) CN (wherein R may be a hydrogen atom or may have a substituent (: may have a C 6 alkyl group or a substituent).
  • R may be a hydrogen atom or may have a substituent (: may have a C 6 alkyl group or a substituent).
  • Good C 2 -C 6 alkenyl group, optionally substituted Ci Ce alkoxyl group, optionally substituted aryl group, optionally substituted aryloxy group or ⁇ - hydroxycarboxylic nitrile represented by) represents an heterocyclic group which may have a substituent group, the general formula [II]:.
  • the average production rate of a-hydroxyammonium salt represented by the general formula [II] is defined as At least 100 // molmin per g dry cell weight can be maintained for 14 days or more without additional body catalyst.
  • the microorganism strain (claim 9) is a microorganism strain capable of accumulating 20 to 60% by weight of the ⁇ -hydroxyammonium ammonium salt represented by the general formula [II] in the reaction system.
  • microorganism strain according to claim 9 or 10 wherein the microorganism strain belonging to the genus Arthrobacter is Arthrobacter sp. NSSC 204 (Claim 11).
  • the above-mentioned microbial catalyst is preferably a microbial catalyst having an average production rate of 200, am ⁇ 1 / min or more, and more preferably a ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ or more.
  • the microbial catalyst derived from the above-mentioned microbial strain is derived from a microbial strain capable of accumulating 20 to 60% by weight of the ⁇ -hydroxyammonium ammonium salt represented by the general formula [II] in the reaction system. Preferred microbial catalysts. Then, 20 to 60% by weight of the ammonium salt of hydroxy acid represented by the general formula [II] can be accumulated in the reaction system, and the hydroxy acid represented by the general formula [II] can be accumulated.
  • the average production rate of ammonium salt is a microbial strain that can maintain 100 mol ⁇ mol Zmin per g dry cell weight for 14 days or more without adding fresh cell catalyst. Examples thereof include a microorganism strain belonging to the genus Arthrobacter, specifically, Arthrobacter sp. NSSC 204 or a microorganism strain derived from the strain.
  • Arthrobacter sp. NSSC 204 is the highest microorganism among the microorganisms known to produce ammonium salt of hydroxy acid sp. NSSC 104 (FE RM BP—5829) It was newly isolated by the mutation treatment. The parent strain, Arthrobacter sp. NSSC104, was discovered by the present inventors.
  • Earthlobacta NSSC 204 (FE RM BP-7662) was deposited with the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (1-1, Higashi 1-1, Tsukuba, Ibaraki, Japan) on June 22, 2000 Have been. Its bacteriological properties are as follows. Form Polymorphic bacilli
  • NSSC204 strain was identified as a new strain belonging to the genus Arthrobacter.
  • the NSSC 204 strain exhibits concentration tolerance even at 50% by weight to 60% by weight of -hydroxynitrile [I] and / or ⁇ -hydroxyammonium ammonium salt [II].
  • the microorganism strain according to the present invention includes, when converting ⁇ -hydroxynitrile represented by the general formula [I] to ammonium ⁇ -hydroxylate salt represented by the general formula [II],
  • the above average production speed is more than 200 ⁇ mo1 / in, especially more than 300zmol / min.
  • Microbial strains having the above-mentioned activity are preferable, and microbial strains capable of accumulating 20 to 60% by weight of ⁇ -hydroxyammonium ammonium salt represented by the general formula [II] in the reaction system are more preferable. .
  • the method for creating the microbial strain of the present invention is not particularly limited, and may be, for example, a screening means from soil or the like, a mutation means by radiation / ultraviolet rays or a mutagenic agent, a gene recombination means, a cell fusion means, etc. Can be mentioned, but a mutation means is preferable in view of the simplicity of the operation.
  • a mutation means for example, a known microbial strain having the ability to convert ⁇ -hydroxynitrile to ⁇ -hydroxyammonium salt can be used by a conventional method using radiation, ultraviolet rays, or a mutation agent.
  • strains with excellent production (accumulation concentration and production rate) of ⁇ -hydroxyammonium salt from ⁇ -hydroxynitrile, and ⁇ -hydroxynitrile and ⁇ -hydroxyammonium salt It can be obtained by screening strains showing resistance in a high concentration solution.
  • the strains selected in the primary screening may be subjected to secondary screening under more stringent conditions, or the strains selected in the primary screening may be mutated again, and then subjected to more stringent conditions.
  • the desired strain can be obtained by secondary screening.
  • the cultivation of the microorganism according to the present invention is carried out in a usual medium containing an enzyme inducer, a carbon source that can be assimilated by the microorganism, a nitrogen source, inorganic ions, and if necessary, an organic nutrient source.
  • an enzyme inducer nitrile compounds such as isoptyronitrile, cyclic amide compounds such as ⁇ -force prolactam and the like are used.
  • the carbon source carbohydrates such as glucose, alcohols such as ethanol, organic acids, and the like are appropriately used. Amino acids, nitrates, ammonium salts and others are used as nitrogen sources.
  • inorganic ions phosphate ions, calcium ions, magnesium ions, sulfate ions, iron ions and others are used as required.
  • organic nutrients vitamins, amino acids and the like, and corn starch, yeast extract, polybeptone, meat extract, and the like containing them are appropriately used.
  • the cultivation may be carried out under aerobic conditions while controlling ⁇ 6 to 9 and the temperature at 25 to 37 ° C in an appropriate range.
  • the microbial catalyst derived from the microbial strain used in the hydrolysis reaction of ⁇ -hydroxynitrile to ⁇ -hydroxyammonium salt by the microorganism of the present invention includes: An extract of the microorganism or an enzyme isolated from the microorganism can be used. Such a microorganism catalyst is obtained by collecting the cells cultured as described above and immobilizing the cells, if necessary, the crude enzyme. It can be prepared as a processed product of cells such as an immobilized enzyme. When immobilizing cells or enzymes, commonly used immobilization techniques such as a carrier binding method and an inclusive method can be applied. In the case of preparing a crude enzyme, a commonly used enzyme purification technique such as ammonium sulfate precipitation or chromatography can be applied after crushing the cells with an ultrasonic wave, a high-pressure homogenizer, or the like.
  • the hydrolysis of ⁇ -hydroxynitrile to ⁇ -hydroxyammonium salt is carried out by contacting the microbial catalyst with ⁇ -hydroxynitrile in an aqueous solvent, but the microbial cells are converted to dry weight. It is usually used at a concentration of 0.01 to 10% by weight, and after completion of the reaction, it is recovered by filtration, centrifugation or ultrafiltration membrane concentration method, and can be repeatedly used for the hydrolysis reaction.
  • the aqueous solvent include an aqueous solution containing water, a salt such as a buffer, or an organic solvent, and these may be separated into two phases.
  • R is a hydrogen atom, a C i -C 6 alkyl group which may have a substituent, a C 2 -C 6 alkenyl group which may have a substituent, Has a substituent A C i -c 6 alkoxyl group, an aryl group which may have a substituent, an aryloxy group which may have a substituent or a heterocyclic group which may have a substituent. Shown. )) ⁇ -hydroxynitrile which may have a substituent c!
  • the alkyl group of C 6, C i to the alkylthioalkyl group or C ⁇ hydroxycarboxylic alkyl group c 6 of C 6, preferably a is full We two Le group as a good Ariru group which may have a substituent Examples thereof include those represented by the general formula [I]. Specific examples of hydroxynitrile include lactonitrile, acetonitrile, mandelonitrile, and the like.
  • 2-hydroxy-14-methylthiobutyronitrile and the like can be mentioned.
  • These hydroxynitrile [I] are usually used in the reaction at a concentration of 0.1 to 50% by weight, and if necessary, may be added sequentially during the reaction.
  • the pH of the reaction may be maintained between 5 and 10 with a suitable buffer or acid and alkali.
  • the reaction temperature may be maintained at 4 to 50 ° C, preferably 20 to 40 ° C.
  • the reaction temperature may be changed as needed, and a reaction system in which the temperature is gradually raised or lowered may be employed.
  • the time required for the hydrolysis reaction of ⁇ -hydroxynitrile to ⁇ -hydroxyammonium salt is not particularly limited, but the ⁇ -hydroxynitrile used in the reaction solution usually takes 6 to 120 hours.
  • ⁇ -ammonium ammonium salt [II] corresponding to [I] for example, ammonium lactate, ammonium 2-hydroxyhydroxybutyrate, ammonium mandelate, ammonium 2-hydroxy-14-methylthiobutyrate in high concentration, for example, 20% Accumulates at high concentrations of at least% by weight.
  • the cells used for the reaction can be repeatedly used for the hydrolysis reaction without a substantial decrease in activity.
  • the product can be separated and purified by conventional methods such as concentration and extraction, and if necessary, can be separated from ammonia by extraction with an organic solvent under acidic conditions, thermal decomposition, and the like.
  • Example 1
  • Test tube with 2 ml of medium containing 0.3% gravy, 0.5% peptone and 0.5% salt Then, 20 ml of a medium having the following composition was placed in a 100 ml Erlenmeyer flask with a baffle, and sterilized with 121 each for 15 minutes. After inoculating a loopful of Earthlobacta sp. NSSC 204 strain into a 2 ml test tube and culturing with shaking at 30 ° C overnight, 0.2 ml was transferred to an Erlenmeyer flask with a baffle. 30 for 5 days. The cells were shake-cultured in C.
  • the cells obtained by centrifuging the culture solution are washed with physiological saline, and 4% by weight of the cells in terms of dry weight is added to 0.1 M phosphate buffer (pH 7.5). Suspended in water. Next, 2-hydroxy-14-methylthiobutyronitrile was added to a final concentration of 237 mM, and the hydrolysis reaction was carried out at 30 ° C. with gentle shaking. The same amount of 2-hydroxy-4-methylthiobutyronitrile was added repeatedly seven times every hour after the addition, and further added eight times every 1.5 hours, for a total reaction time of 19 hours. .
  • a reaction for producing ammonium 2-hydroxy-4-methylthiobutyrate at a constant rate was performed by controlling the temperature.
  • the pre-culture medium 0.5 wt% yeast extract, 0.5 wt% of glucose, 0.5 wt% .epsilon. force caprolactam, 0.1 wt% K 2 HP 0 4, 0. 1 wt% KH 2 P 0 4, 0.
  • NSSC204 strain was inoculated into the preculture medium, followed by shaking culture at 33 ° C. for 3 days for preculture.
  • the cornstarch contains 20% by weight of 10 N sodium hydroxide! )
  • An aqueous solution adjusted to H 7.0 was prepared, and the resulting insolubles were removed by centrifugation, and the supernatant was used as a corn steep liquor extract.
  • Sterilization was performed by sterilizing the corn steep liquor extract by filtration, and other medium components by heat sterilization at 120 ° C for 20 minutes.
  • the growth medium was inoculated with the culture solution obtained in the above preculture, and cultured at 33 ° C with aeration and stirring.
  • a liquid medium consisting of 95.5% by weight of corn steep liquor extract and 2.2% by weight of glucose prepared in the same sterilization method as above from 6 hours to 12 hours after the start of culture 2.5 liters was fed. About one hour after the end of the fed-batch, the dissolved oxygen concentration recovered and the logarithmic growth phase ended. Immediately after the end of the logarithmic growth phase, 56 Om 1 of a 50% by weight glucose solution previously sterilized at 110 ° C. for 20 minutes was fed over about 10 hours. After the completion of the glucose feeding, the ripening culture was continued for another 3 days under aeration and stirring at 33 ° C. The cells were collected from this culture by centrifugation, and washed with physiological saline to obtain 660 g of wet cells (132 g as dry weight).
  • Ultrafiltration (UF) membrane separator Ultrafiltration (UF) membrane separator, automatic dilution deviceOnline high-speed liquid mouth chromatography with auto injector, 300 ml 1 volume stirred type reaction tank equipped with pH controller Cell catalyzed arthrobacter from sp. NSS 86.0 g of wet cells of C204 (17.2 g as dry weight) was added, and diluted with 189.2 ml of water.
  • Example 2 The reaction was carried out under exactly the same conditions as in Example 2 using the bacterial cell Arthrobacter sp. NSSC 104 strain obtained by culturing under exactly the same conditions as in Example 2, and the following results were obtained. was gotten.
  • Amount of bacterial cell used 86.0 g (17.2 g as dry weight) / Same as in Example 2 Reaction temperature: 21 V ⁇ 35 ° C (27 days) Z Same as Example 2
  • the total amount of 2-hydroxy-4-methylthiobutyronitrile added after the start of the continuous reaction was 1.01 kg, and the total amount of the filtrate passing through the membrane was 5.23 kg.
  • the membrane permeate filtrate obtained was analyzed by high performance liquid chromatography. As a result, the product 2-hydroxy-4-methylthiobutanoic acid was present at 20.7% by weight. Since the purity of 14-methylthiobutyronitrile was 95.0%, the molar yield of the product was calculated to be 98.5%. From the above reaction results, the average production rate of 2-hydroxy-4-ammonium ammonium 4-methylthiobutanoate per cell catalyst was calculated to be 388.5 o 1 / min / g—dry cell weight (35 ° C / 1 8 hours).
  • the present invention by using a microorganism having a concentration tolerance to monohydroxynitrile [I] and / or ⁇ -hydroxyacid ammonium salt [II] and a durable microorganism having a long-lasting activity for a long time, Since the ammonium salt of hydroxy acid [II] is accumulated at a high concentration and the microbial cell catalyst can be used repeatedly, it is possible to efficiently produce the ammonium salt of ⁇ -hydroxy acid [II].

Description

W 明 細 書
—ヒ ドロキシ酸アンモニゥム塩の製造法 技術分野 ：
本発明は特定の微生物菌株に由来する微生物触媒を用いて α —ヒ ドロキシニト リルを加水分解し、 α—ヒ ドロキシ酸アンモニゥム塩を製造する方法や、 該方法 に用いられる微生物菌株に関する。 α —ヒ ドロキシ酸アンモニゥム塩は通常の方 法により遊離の 一ヒ ドロキシ酸に導く ことができる。 α —ヒ ドロキシ酸又は <¾ —ヒ ドロキシ酸アンモニゥム塩のうち乳酸や乳酸ァンモニゥムは食品工業、 醸造 工業、 製薬工業等に用いられ、 2 —ヒ ドロキシ— 4ーメチルチオ酪酸や 2 —ヒ ド ロキシー 4—メチルチオ酪酸アンモニゥム塩は家畜の飼料添加物として、 また α 一ヒ ドロキシイソ酪酸は有機合成原料として有用である。 背景技術 ：
α —ヒ ドロキシニトリルから微生物によって α—ヒ ドロキシ酸を製造する方法 としては、 例えばバチルス属、 ノ クテリジゥム属、 ミクロコッカス属及びブレビ パクテリゥム属の微生物による乳酸、 グリコール酸等の製造方法 （特公昭 5 8 - 1 5 1 2 0号公報） 、 コリネバクテリゥム属に属する微生物による乳酸、 グリコ ール酸及び 2 —ヒ ドロキシイソ酪酸の製造法（特開昭 6 1 - 5 6 0 8 6号公報）、 シユードモナス属、 アースロバクター属、 ァスペルギルス属、 ぺニシリウム属、 コク リオボラス属、 及びフザリウム属の微生物による乳酸、 2—ヒ ドロキシイソ 酪酸、 2—ヒ ドロキシ一 2—ヒ ドロキシフヱニルプロピオン酸及びマンデル酸の 製造方法 （特開昭 6 3— 2 2 2 6 9 6号公報） 、 アースロバクタ一属、 ァスペル ギルス属、 バチルス属、 バクテリ ジゥム属、 ブレビバクテリウム属、 コク リオバ ラス属、 コリネバクテリウム属、 ミ クロコッカス属、 ノカルディア属、 ぺニシリ ゥム属、 シユー ドモナス属及びフザリウム属の微生物による、 2—ヒ ドロキシ一 3 ， 3—ジメチルー 4 一プチロラク ト ンの製造法 （特開昭 6 4— 1 0 9 9 6号公 報） 、 ロ ドコッカス属、 シユー ドモナス属、 アースロバクター属及びブレビバタ テリゥム属の微生物による 2 —ヒ ドロキシィソ酪酸の製造法 （特開平 4— 4 0 8 9 7号公報） 、 カセォバクター属、 シュ一 ドモナス属、 アル力リゲネス属、 コリ ネバクテリウム属、 ブレビバクテリウム属、 ノカルディア属、 ロ ドコッカス属及 びアースロバクタ一属の微生物による 2—ヒ ドロキシー 4ーメチルチオ酪酸の製 造法 （特開平 4一 4 0 8 9 8号公報） 、 パントエア属、 ミ クロコッカス属、 パク テリジゥム属、 バチラス属等の微生物による α—ヒ ドロキシ一 4—メチルチオ酪 酸の製造法 （特開平 8 - 1 7 3 1 75号公報） 、 アル力リゲネス · フヱカリス A T C C 875 0 > ロ ドコッカス ' エスピー HT 2 9— 7、 ゴルドナ ' テラェ MA — 1による α—ヒ ドロキシ一 4—メチルチオ酪酸の製造法 （W 09 6— 0 94 0 3号公報） 等が知られている。 これら先行文献に開示された α—ヒ ドロキシ酸の 製造においては、 <¾ーヒ ドロキシニト リルを微生物触媒で加水分解し、 先ず α— ヒ ドロキシ酸アンモニゥム塩を得て、 これを通常の方法、 例えば酸による中和、 イオン交換樹脂カラム、 電気透析、 熱分解等の方法により、 遊離の α—ヒ ドロキ シ酸を製造している。
これら α—ヒ ドロキシ酸の製造方法は、 いずれも目的とする物質を高濃度で生 成蓄積させることにおいて満足しうるものではなく、 また、 目的物質の微生物触 媒あたりの生産速度も工業的見地から十分とは言えない。 例えば、 前記特開昭 6 1 - 5 6 0 8 6号公報にはコリネバクテリゥム属に属する微生物による乳酸蓄積 濃度が 9. 8重量％、生産速度が 2 57 mm o 1 /m i n/g—乾燥細胞重量（3 0で 4時間） であることが、 特開昭 6 3 - 22 2 6 9 6号公報にはシュ一 ドモ ナス属に属する微生物による乳酸蓄積濃度が 1 0重量％、 アースロバクタ一属に 属する微生物による乳酸蓄積濃度が 0. 1 5重量％、 シユー ドモナス属に属する 微生物による 2—ヒ ドロキシィソ酪酸蓄積濃度が 0. 8重量％であることが、 特 開平 4一 4 0 8 9 8号公報にはカセォバクター s p. B C 2 3株による 2—ヒ ド 口キシ— 4—メチルチオ酪酸蓄積濃度が 1 88 mM (2. 8重量％) 、 生産速度 が 4. 7mm o l / /4 5 O D - 6 3 0 nm (2 5 °C) であることが、 特開平 8 - 1 73 1 75号公報にはバクテリディウム *エスピー R 34 1 (F E RM- P 2 7 1 9 ) による 2—ヒ ドロキシー 4—メチルチオ酪酸蓄積濃度が 0. 7 9重 量％であることが、 W09 6— 0 94 0 3号公報にはアル力リゲネス · フエカリ ス AT C C 875 0株による 2—ヒ ドロキシー 4ーメチルチオ酪酸蓄積濃度が 9 4 0 mm o 1 /L ( 1 4. 1重量％) 、 生産速度が 8. 7 m m o 1 /m i n/ g —乾燥細胞重量 （2 5 °CZ 1 8 0時間） 、 ゴルドナ · テラエ MA— 1株による 2 ーヒ ドロキシ— 4ーメチルチオ酪酸蓄積濃度が 1. 5 m 0 1 /L (2 2. 5重 量％) 、 生産速度が 2 5 0 mm o 1 /m i nZg -乾燥細胞重量 （3 5 °C初速度） であることがそれぞれ記載されている。
このように生成物の蓄積濃度が低い理由として、 一ヒ ドロキシニト リルが水 溶液中で対応するアルデヒ ドもしくはケ トンと青酸に部分的に解離し （ケミカル レビューズ （Chemical Reviews) 第 42卷、 1 89ページ、 1 948年） 、 青酸 によって酵素活性が阻害されることが挙げられる （ァグリカルチュラル バイオ ロジカル ケミスト リ一 （Agricultural Biological Chemistry) 第 4 6卷、 1 1 6 5ページ、 1 9 82年） 。 また解離したアルデヒ ドの作用で酵素が短時間で 失活する可能性も指摘されており、 これを解決するための方法として、 酸性亜硫 酸イオン又は亜ジチオン酸イオンを添加する方法 （特開平 5 _ 1 92 1 8 9号公 報） 、 亜リ ン酸イオン又は次亜リ ン酸イオンを添加する方法 （特開平 7— 2 1 3 2 9 6号公報） が提案されている。 しかしながらこれらの添加物を使用しても α ―ヒ ドロキシ酸の生成蓄積濃度は高いものではない。 アル力リゲネス ·エスピー B C 3 5 - 2株によるマンデル酸の蓄積濃度 1 6. 6重量％ (特開平 5 - 1 9 2 1 8 9号公報） 、 ゴルドナ · テラエ ΜΑ— 1株によるマンデル酸の蓄積濃度 1 2 重量％ (特開平 7— 2 1 3 2 9 6号公報） がそれぞれの特許で最も高い生成物蓄 積濃度として、 実施例に示されている。 発明の開示 ：
一般的に生成物の蓄積濃度が低い場合、 あるいは生成物の微生物触媒あたりの 生産速度が低い場合や生成速度がある程度速くても長期間維持できない場合、 こ れを製造するための設備が複雑かつ大規模になることは当業者によく知られてい る。 このため上述のような公知の方法によって工業的に α—ヒ ドロキシ酸を製造 することは製造効率の点で問題があった。 本発明の課題は、 α—ヒ ドロキシ酸ァ ンモニゥム塩を高濃度に蓄積し、 かつ工業的に満足できる生産速度を長期間維持 できる特定の微生物菌株を用いる、 α—ヒ ドロキシ酸アンモニゥム塩の製造方法 を提供することにある。
本発明者らは 一ヒ ドロキシニト リルから、 ーヒ ドロキシ酸アンモニゥム塩 を生成する微生物について、 高濃度の 一ヒ ドロキシニトリル又は ヒ ドロキ シ酸アンモニゥム塩によって活性の抑制を受けにく く、 長期間活性が持繞する耐 久性を有し、 なおかつ高濃度の α—ヒ ドロキシ酸アンモニゥム塩を高速度で蓄積 する能力を有する工業的に有利な微生物の探索を鋭意行った結果、 《 —ヒ ドロキ シ酸アンモニゥム塩の生産能力が今まで知られた微生物で最も高いアースロバク ター ·エスピー N S S C 1 04 (F E RM B P— 5829) の変異処理により 新たに分離されたアースロバクタ一 · エスピー （Arthrobacter sp. ) N S S C 2 04 (F E RM B P— 7662) ) が目的とする活性を有することを見い出し、 本発明を完成させた。
すなわち本発明は、 一般式 〔 I〕 ： ： C H (0 H) C N (式中、 Rは水素原子、 置換基を有してもよい C i〜 C6のアルキル基、 置換基を有してもよい C2〜 C6の アルケニル基、 置換基を有してもよい C1〜C6のアルコキシル基、 置換基を有し てもよぃァリール基、 置換基を有してもよいァリ—ルォキシ基又は置換基を有し てもよい複素環基を示す。）で表される α—ヒ ドロキシニト リルを、一般式〔II〕 ： R C H (0 H) C O O— ΝΗ4+ (式中、 Rは前記と同一の意味を示す。 ） で表され る α—ヒ ドロキシ酸アンモニゥム塩に変換するに際し、 一般式 〔II〕 で表される 一ヒ ドロキシ酸アンモニゥム塩の平均生産速度として、 新鮮菌体触媒の追加を 行うことなく、 g乾燥菌体重量当たり少なく とも 1 00 / m o 1 /m i nを 14 日間以上維持することができる微生物菌株に由来する微生物触媒を用いることを 特徴とする一般式〔II〕で表される α—ヒ ドロキシ酸アンモニゥム塩の製造法（請 求項 1) 、 微生物菌株に由来する微生物触媒が、 反応系中に一般式 〔II〕 で表さ れる α—ヒ ドロキシ酸ァンモニゥム塩を 2 0〜 60重量％蓄積することができる 微生物菌株に由来する微生物触媒であることを特徴とする請求項 1記載の一般式 〔II〕 で表される ーヒ ドロキシ酸ァンモニゥム塩の製造法 （請求項 2) 、 微生 物菌株に由来する微生物触媒が、 アースロバクタ一属に属する微生物菌株に由来 する微生物触媒であることを特徴とする請求項 1又は 2記載の一般式 〔II〕 で表 される α—ヒ ドロキシ酸ァンモニゥム塩の製造法 （請求項 3) 、 アースロバクタ ー属に属する微生物菌株が、 アースロバクタ一 'エスピー （Arthrobacter sp. ) N S S C 2 04又は当該菌株より誘導された微生物菌株であることを特徴とする 請求項 3記載の一般式 〔II〕 で表される —ヒ ドロキシ酸アンモニゥム塩の製造 法 （請求項 4) 、 微生物菌株に由来する微生物触媒が、 微生物菌体、 該微生物の 菌体処理物、 該微生物の抽出物又は該微生物から単離された酵素であることを特 徵とする請求項 1〜4のいずれか記載の一般式 〔II〕 で表される α—ヒ ドロキシ 酸アンモニゥム塩の製造法 （請求項 5) 、 置換基を有してもよい Ci Csのアル キル基が、 C 〜 C6のアルキルチオアルキル基又は C i〜 C6のヒ ドロキシアルキ ル基であることを特徴とする請求項 1 ~ 5のいずれか記載の一般式 〔II〕 で表さ れる α—ヒ ドロキシ酸アンモニゥム塩の製造法 （請求項 6) 、 置換基を有しても よいァリール基が、 フヱニル基であることを特徴とする請求項 1〜 5のいずれか 記載の一般式 〔Π〕 で表される α—ヒ ドロキシ酸ァンモニゥム塩の製造法 （請求 項 7 ) α—ヒ ドロキシニ ト リルが、 ラク トニ ト リル、 アセ ト ンシアンヒ ドリ ン、 マンデロニト リル又は 2—ヒ ドロキシー 4ーメチルチオプチロニトリルであるこ とを特徴とする請求項 1〜 7のいずれか記載の一般式 〔Π〕 で表される α—ヒ ド 口キシ酸アンモニゥム塩の製造法 （請求項 8) に関する。
また本発明は、 一般式 〔 I〕 ： R C H (OH) CN (式中、 Rは水素原子、 置 換基を有してもよい (： 〜 C6のアルキル基、 置換基を有してもよい C2~C6のァ ルケニル基、 置換基を有してもよい Ci Ceのアルコキシル基、 置換基を有して もよぃァリール基、 置換基を有してもよいァリ一ルォキシ基又は置換基を有して もよい複素環基を示す。） で表される α—ヒ ドロキシニトリルを、一般式 〔II〕 ： C Η (0 H) C O O— ΝΗ4 + (式中、 Rは前記と同一の意味を示す。 ） で表され る α—ヒ ドロキシ酸アンモニゥム塩に変換するに際し、 一般式 〔II〕 で表される a—ヒ ドロキシ酸アンモニゥム塩の平均生産速度として、 新鮮菌体触媒の追加を 行うことなく、 g乾燥菌体重量当たり少なく とも 1 0 0 //m o l m i nを 14 日間以上維持することができることを特徴とする微生物菌株 （請求項 9) 、 微生 物菌株が、 反応系中に一般式 〔II〕 で表される α—ヒ ドロキシ酸アンモニゥム塩 を 20〜 6 0重量％蓄積することができる微生物菌株であることを特徴とする請 求項 9記載の微生物菌株 （請求項 1 0) 、 微生物菌株が、 アースロバクタ—属に 属する微生物菌株であることを特徴とする請求項 9又は 1 0記載の微生物菌株 (請求項 1 1 )、アースロバクター属に属する微生物菌株が、アースロバクタ一 · エスピー （Arthrobacter sp. ) N S S C 2 04 (F E RM B P— 76 6 2) で あることを特徴とする請求項 1 1記載の微生物菌株 （請求項 1 2) 、 アースロバ クター属に属する微生物菌株が、 アースロバクタ一 'エスピー （Arthrobacter sp.) N S S C 2 04から誘導された微生物菌株であることを特徴とする請求項 1 1記載の微生物菌株 （請求項 1 3) に関する。
本発明の一般式 〔II〕 ： R C H (0 H) C 00—NH4+ (式中、 Rは水素原子、 置換基を有してもよい Ci Csのアルキル基、 置換基を有してもよい C2〜C6の アルケニル基、 置換基を有してもよい（：！〜 C6のアルコキシル基、 置換基を有し てもよぃァリール基、 置換基を有してもよいァリ—ルォキシ基又は置換基を有し てもよい複素環基を示す。 ） で表される α—ヒ ドロキシ酸アンモニゥム塩の製造 法としては、 一般式 〔 I〕 ： R C H (0 H) C N (式中、 Rは前記と同一の意味 を示す。 ） で表される α—ヒ ドロキシニトリルを、 一般式 〔II〕 で表される α— ヒ ドロキシ酸アンモニゥム塩に変換するに際し、 一般式 〔II〕 で表される α—ヒ ドロキシ酸ァンモニゥム塩の平均生産速度として、 新鮮菌体触媒の追加を行うこ となく、 g乾燥菌体重量当たり 1 0 0 zm o l Zm i nを 1 4日間以上維持する ことができる微生物菌株に由来する微生物触媒を用いる一般式 〔II〕 で表される α—ヒ ドロキシ酸アンモニゥム塩の製造法であれば、 特に制限されるものではな いが、 上記微生物触媒として、 上記平均生産速度 2 0 0 ,a m ο 1 /m i n以上の 微生物触媒が好ましく、 δ Ο Ο μπι ο ΐ Ζπι ί η以上の微生物触媒がより好まし い
また、 上記微生物菌株に由来する微生物触媒としては、 反応系中に一般式 〔II〕 で表される α—ヒ ドロキシ酸アンモニゥム塩を 2 0 - 6 0重量％蓄積することが できる微生物菌株に由来する微生物触媒が好ましい。 そして、 反応系中に一般式 〔II〕 で表される ーヒ ドロキシ酸アンモニゥム塩を 2 0〜6 0重量％蓄積する ことができ、 かつ、 一般式 〔II〕 で表される ーヒ ドロキシ酸アンモニゥム塩の 平均生産速度として、 新鮮菌体触媒の追加を行うことなく、 g乾燥菌体重量当た り 1 0 0〃 m o l Zm i nを 1 4日間以上維持することができる微生物菌株とし ては、 アースロバクタ一属に属する微生物菌株を例示することができ、 具体的に はアースロバクタ一 ·エスピー （Arthrobacter sp. ) N S S C 204又は当該菌 株より誘導された微生物菌株を挙げることができる。
上記アースロバクター 'エスピー （Arthrobacter sp. ) N S S C 2 04は、 ーヒ ドロキシ酸アンモニゥム塩の生産能力が今まで知られた微生物で最も高い アースロバクタ一 s p. N S S C 1 04 (F E RM B P— 5829) の変異処 理により新たに分離されたものである。 親株であるアースロバクタ一 s p. N S S C 1 04は本発明者等によって見出されたものである。
アースロバクタ一 N S S C 1 04 (F E RM B P— 582 9) は独立行政法 人産業技術総合研究所（日本国茨城県つくば市東 1丁目 1番地 1中央第 6)に 1996 年 2月 6 日付で寄託されており、 その菌学的性質については W 097/32030 に記 載されている。
アースロバクタ一 N S S C 2 04 (F E RM B P— 7662) も同様に、 独 立行政法人産業技術総合研究所 （日本国茨城県つくば市東 1丁目 1番地 1中央第 6) に 2000年 6月 22日付で寄託されている。その菌学的性質は以下の通りである。 形態 多形桿菌
グラム染色性 陽性
r o d— c o c c u sサイクノレ 有
芽胞 無
運動性 Ant, 細胞壁のジァミノ酸 リ ジン
酸素に対する態度 好気的
力タラ一ゼ +
D N Aの分解 +
ゼラチンの液化 +
デンプンの分解 +
カゼィンの分解 +
栄養要求性 m
グリ コリル試験 キノ ン系 MK - 9 (H2 )
以上の菌学的性質を、 Bergey's Manual of Systematic Bacteriology(1986) に基づいて検索した結果、 N S S C 2 04株はアースロバクタ一（Arthrobacter) 属に属する新菌株と同定された。 また、 この N S S C 2 04株は ーヒ ドロキシ 二ト リル 〔 I〕 及び/又は α—ヒ ドロキシ酸アンモニゥム塩 〔II〕 の 5 0重量％ 〜 6 0重量％でも濃度耐性を示す。
本発明に係る微生物菌株としては、 一般式 〔 I〕 で表される α—ヒ ドロキシニ トリルを、 一般式 〔II〕 で表される α—ヒ ドロキシ酸アンモニゥム塩に変換する に際し、 一般式 〔II〕 で表される α—ヒ ドロキシ酸アンモニゥム塩の平均生産速 度として、 新鮮菌体触媒の追加を行うことなく、 g乾燥菌体重量当たり少なく と も 1 0 0 m o l Zm i nを 1 4日間以上維持することができる微生物菌株であ れば、 特に制限されるものではないが、 上記微生物菌株として、 上記平均生産速 度 2 0 0〃 m o 1 / i n以上、 特に 3 0 0 zm o l /m i n以上の活性を有す る微生物菌株が好ましく、 反応系中に一般式 〔II〕 で表される α—ヒ ドロキシ酸 アンモニゥム塩を 2 0〜 6 0重量％蓄積することができる微生物菌株がより好ま しい。
本発明の微生物菌株の創製方法としては特に制限されるものではなく、 土壌等 からのスク リ一ニング手段、 放射線 ·紫外線や変異薬剤による突然変異手段、 遺 伝子組換え手段、 細胞融合手段などを用いる方法を挙げることができるが、 操作 の簡便性からして突然変異手段が好ましい。 かかる突然変異手段としては、 例え ば、 α—ヒ ドロキシニトリルを α—ヒ ドロキシ酸ァンモニゥム塩に変換する能力 を有する公知の微生物菌株に、 放射線 ·紫外線や変異薬剤を用いた常法による変 異処理を施した後、 α—ヒ ドロキシニト リルから α—ヒ ドロキシ酸アンモニゥム 塩の生産量 （蓄積濃度や生産速度） に優れた菌株や、 α—ヒ ドロキシニトリルや α—ヒ ドロキシ酸アンモニゥム塩の高濃度溶液中で耐性を示す菌株をスク リー二 ングすることにより得ることができる。 また、 一次スクリーニングで選抜された 菌株をより厳しい条件で二次スク リーニングすることにより、 あるいは、 一次ス ク リ一二ングで選抜された菌株に再度突然変異処理を施した後、 より厳しい条件 で二次スク リ一ニングすることにより、 所望の菌株を得ることができる。 本発明にかかる微生物の培養は、 酵素誘導物質、 微生物が資化しうる炭素源、 窒素源、無機イオン、 さらに必要ならば有機栄養源を含む通常の培地で行われる。 酵素誘導物質としては、 イソプチロニトリル等の二トリル化合物、 ε—力プロラ クタムなどの環状アミ ド化合物等が使用される。 炭素源としてはグルコース等の 炭水化物、 エタノール等のアルコール類、 有機酸その他が適宜用いられる。 窒素 源としては、 アミノ酸、 硝酸塩、 アンモニゥム塩その他が用いられる。 無機ィォ ンと しては、 リ ン酸イオン、 カ リ ウムイオン、 マグネシウムイオン、 硫酸イオン、 鉄イオン、 その他が必要に応じて使用される。 有機栄養源としては、 ビタ ミ ン、 アミノ酸など及びこれらを含有するコーンスチ一プリカ一、 酵母エキス、 ポリべ プトン、 肉エキス、 その他が適宜用いられる。 培養は好気的条件下に、 ρ Η 6〜 9、 温度 2 5〜 3 7 °Cの適当な範囲に制御しつつ行えばよい。
本発明の微生物による α—ヒ ドロキシニトリルから α—ヒ ドロキシ酸アンモニ ゥム塩への加水分解反応に用いられる微生物菌株に由来する微生物触媒としては- 微生物菌体、 該微生物の菌体処理物、 該微生物の抽出物又は該微生物から単離さ れた酵素等を挙げることができるが、 かかる微生物触媒は上記のように培養した 菌体を採取し、 必要に応じて固定化菌体、 粗酵素、 固定化酵素等の菌体処理物と して調製することができる。 菌体又は酵素を固定化する場合は担体結合法、 包括 法等の通常行われる固定化技術を適用できる。 粗酵素を調製する場合は、 菌体を 超音波、 高圧ホモジナイザ一等によって破砕した後に、 硫安塩析、 クロマ トグラ フィ一等の通常行われる酵素精製技術が適用できる。
α —ヒ ドロキシニトリルから α—ヒ ドロキシ酸ァンモニゥム塩への加水分解は、 微生物触媒を水性溶媒中で α—ヒ ドロキシニトリルと接触させることによって行 われるが、 微生物菌体は乾燥重量に換算して 0 . 0 1〜 1 0重量％の濃度で通常 使用され、 反応終了後は濾過、 遠心分離又は限外濾過膜濃縮法によって回収され て繰り返し加水分解反応に使用できる。 上記水性溶媒としては、 水、 緩衝剤等の 塩類又は有機溶媒を含む水溶液が挙げられるが、 これらは二相に分離していても よい。
本発明で用いられる一般式 〔 I〕 （Rは水素原子、 置換基を有してもよい C i 〜C 6のアルキル基、 置換基を有してもよい C 2〜 C 6のアルケニル基、 置換基を有 してもよい C i〜 c 6のアルコキシル基、 置換基を有してもよいァリール基、 置換 基を有してもよいァリ一ルォキシ基又は置換基を有してもよい複素環基を示 す。） で表される α—ヒ ドロキシニトリルにおける、 置換基を有してもよい c !〜
C 6のアルキル基としては、 C i〜 C 6のアルキルチオアルキル基又は C 〜 c 6のヒ ドロキシアルキル基を、 置換基を有してもよいァリール基としてはフヱ二ル基を 好適に例示することができ、 一般式 〔 I〕 で表される —ヒ ドロキシニト リルの 具体例と しては、 ラク トニ ト リル、 アセ ト ンシアンヒ ドリ ン、 マンデロニ ト リル、
2—ヒ ドロキシ一 4—メチルチオプチロニトリル等を挙げることができる。 これ らの ーヒ ドロキシニ ト リル 〔 I〕 は通常 0 . 1〜 5 0重量％の濃度で反応に使 用され、 必要ならば反応の間、 逐次添加されてもよい。 反応の p Hは適当な緩衝 剤もしく は酸とアルカリによって 5〜 1 0の間に保てばよい。 反応の温度は 4〜 5 0 °C、 好ましくは 2 0〜 4 0 °Cに保てばよい。 反応温度は必要に応じて変化さ せても良く、 徐々に昇温ないし降温させる反応方式も採用することができる。
α—ヒ ドロキシニトリルから α—ヒ ドロキシ酸アンモニゥム塩への加水分解の 反応所要時間は特に制限されないが、 通常 6時間ないし 1 2 0時間で反応液中に 用いた α—ヒ ドロキシニトリル 〔 I〕 に対応する α—ヒ ドロキシ酸アンモニゥム 塩 〔II〕 、 例えば乳酸アンモニゥム、 2 —ヒ ドロキシィソ酪酸ァンモニゥム、 マ ンデル酸ァンモニゥム、 2—ヒ ドロキシ一 4—メチルチオ酪酸アンモニゥムなど が高濃度、 例えば 2 0重量％以上の高濃度で蓄積される。 反応に用いた菌体は、 実質的な活性低下なしに、 繰り返し加水分解反応に使用することができる。 生成 物は、 濃縮、 抽出などの定法によって分離精製することができ、 必要ならば酸性 条件下での有機溶媒抽出、熱分解等によってアンモニアと分離することができる。 発明を実施する為の最良の形態 ：
以下、 実施例によって本発明をさらに具体的に説明するが、 本発明はこれら実 施例により何ら制限されるものではない。 実施例 1
0 . 3 %肉汁、 0 . 5 %ペプトン及び 0 . 5 %食塩を含む培地 2 m 1 を試験管 に、 下記の組成の培地 20m lを 1 00 m l容量のバッフル付き三角フラスコに 入れ、 各々 1 21でで 1 5分間滅菌した。 アースロバクタ一 s p. N S S C 20 4株を 2 m 1の試験管に一白金耳植菌し、 30°Cで一晩振盪培養した後、 0. 2 m 1をバッフル付き三角フラスコに植え継ぎ、 さらに 5日間 3 0。Cで振遨培養し た。 この培養液を遠心分離して得られた菌体を生理食塩水で洗浄し、 乾燥重量に 換算して 4重量％の菌体を 0. 1 Mリ ン酸緩衝液 （p H 7. 5) に懸濁した。 次 に 2—ヒ ドロキシ一 4—メチルチオプチロニト リルを終濃度 237mMになるよ うに添加し、 30°Cで緩やかに振盪しながら加水分解反応を行った。 添加後 1時 間毎に同量の 2—ヒ ドロキシ— 4—メチルチオプチロニトリルを 7回繰り返し追 加し、 さらに 1. 5時間毎に 8回追加して総計 1 9時間の反応を行った。
コーンスチープリカー 0% (別滅菌）
スクロース 0% (別滅菌）
リ ン酸一力リウム 0 1 %
リ ン酸ニ力リウム 0 1 %
食塩 0 0 2 %
硫酸マグネシゥム 7水塩 0 02 %
硫酸第一鉄 0 00 1% (別滅菌）
ε—力プロラクタム 0, 5 %
ρ Η 7 2 (2 Ν苛性ソーダで調整）
反応終了後、 反応液を遠心分離して菌体を除去し、 遠心上清に含まれる 2—ヒ ドロキシー 4—メチルチオ酪酸の濃度を高速液体クロマトグラフィー （カラム ： T S K g e 1 OD S— 80 TM、 キャ リア ： ァセ トニ ト リル /水ノト リ フルォ 口酢酸 = 80 20 0. 1) を用いて定量した結果、 58. 9重量％の 2—ヒ ドロキシ一 4ーメチルチオ酪酸アンモニゥム塩の蓄積を確認した（収率 98 %) a 全く同様な条件でアースロバクタ一 s p. N S S C 1 04株を用いて反応を実施 したときは、 2—ヒ ドロキシー 4ーメチルチオプチロニトリルの 1回の添加量は 最初の終濃度として 2 O O mMであり、 2—ヒ ドロキシ一 4—メチルチオ酪酸ァ ンモニゥム塩の蓄積濃度は 48. 8重量％で、 収率 96%であった。 実施例 2
流加培養法で得た菌体を用いて、 昇温コントロールにより 2—ヒ ドロキシー 4 ーメチルチオ酪酸ァンモニゥム塩を一定速度で生産する反応を実施した。 前培養 培地として、 0. 5重量％酵母エキス、 0. 5重量％グルコース、 0. 5重量％ ε-力プロラクタム、 0. 1重量％K2H P 04、 0. 1重量％KH2P 04、 0. 0 2重量％硫酸マグネシウム · 7水和物、 0. 1重量％塩化ナトリウム、 0. 0 0 1重量％硫酸第一鉄 · 7水和物を含み、 1 Ν水酸化ナトリウムで ρ Η 7. 2に調 整した液体培地 20 0 m 1を 3リ ツ トル容の三角フラスコに入れ、 1 2 0°Cで 2 0分間滅菌した （硫酸第一鉄のみは別にろ過滅菌して加えた） ものを用い、 この 前培養培地にアースロバクタ一 s p . N S S C 204株を接種して、 33°Cで 3 日間振盪培養して前培養を行った。
次に、 コーンスチ一プリカ一 20重量％を含み、 1 0 N水酸化ナトリウムで！） H 7. 0に調整した水溶液を調製し、 生じた不溶物を遠心分離により除いた上清 液をコーンスチープリカー抽出液とした。 20. 5重量％コーンスチ一プリカ一 抽出液、 0. 5重量％グルコース、 1重量％ ε-力プロラクタムからなる液体培 地 2. 9 リ ッ トルを 1 0リ ッ トル容ジャーファメ ンタ一中に用意した。 滅菌は、 コーンスチープリカ一抽出液はろ過滅菌、 その他の培地成分は 1 20 °C、 2 0分 間の加熱滅菌によつた。 この増殖培地に、前記の前培養で得た培養液を接種して、 33 °Cで通気攪拌培養した。 培養開始後 6時間から 1 2時間の間に、 上記と同様 の滅菌法で調製した 95. 5重量％コーンスチープリカ一抽出液、 2. 2重量％ グルコースからなる液体培地 2. 5 リ ッ トルを流加した。流加終了後約 1時間で、 溶存酸素濃度が回復して対数増殖期が終了した。 対数増殖期終了後直ちに、 予め 1 1 0°C、 20分間滅菌した 50重量％グルコース溶液 56 Om 1 を約 1 0時間 かけて流加した。 グルコースの流加終了後、 33 °Cの通気攪拌条件下、 熟成培養 を更に 3日間続けた。 この培養液から遠心分離により集菌し、 さらに生理食塩水 で洗浄して、 湿菌体 660 g (乾燥重量として 1 32 g) を得た。
限外ろ過 （U F) 膜分離機、 自動希釈装置 ·オー トインジェクター付きのオン ライン高速液体ク口マトグラフィ一装置、 p Hコントローラーを備えた 3 0 0 m 1容攪拌型反応槽に、 上記培養法で得た菌体触媒アルスロバクタ— s p . N S S C 204の湿菌体 8 6. 0 g (乾燥重量として 1 7. 2 g) を添加し、 水で 1 8 9. 2 m lで希釈した。 この反応槽に反応温度 2 1でで、 2—ヒ ドロキシー 4— メチルチオプチロニトリルを 0. 409 g /m i nの速度で連続的に添加し、 合 計で 5 1. 8 g加え終わった時点で、 水の 1. 70 1 g/m i nによる連繞添加 を開始し、 2—ヒ ドロキシー 4—メチルチオプチロニトリルの 0. 4 0 9 gZm i nによる連繞添加を継続しながら、 膜分離機で菌体触媒を分離回収して反応槽 に戻すと同時に、 透過ろ液を 2. 1 1 1 g/m i nで排出した。 また、 反応を通 して p Hを 7. 0に保つように、 28 %アンモニア水を添加した。
この連続反応の間、 オンライン高速液体ク口マ トグラフィ一により 2—ヒ ドロ キシ— 4ーメチルチオプチロニト リルの反応液中濃度を検知し、 約 0. 2重量％ になるように、 反応温度を徐々に上昇させた。 かく して、 2—ヒ ドロキシ— 4一 メチルチオブタン酸アンモニゥム塩を 22. 9重量％ (平均値） 含有する膜透過 ろ液が、 上記一定速度で排出された。 この反応を 27日間継続したところ、 反応 温度は 3 5 °Cまで上昇した。 膜透過ろ液は全量で 85. 1 k gであった。 更に、 この 27日間の連続反応終了後、 反応槽及び反応配管系に存在する滞留液を膜濃 縮洗浄し、 5 34. 5 gの洗浄膜透過ろ液を別に得た。 ここに得られた膜透過ろ 液及び洗浄膜透過ろ液を、 高速液体クロマ トグラフィーで分析したところ、 生成 物である 2—ヒ ドロキシー 4ーメチルチオブタン酸が 20. 0重量％及び 9. 3 5重量％存在し、 用いた基質 2—ヒ ドロキシ一 4ーメチルチオプチロニトリルの 純度が 9 5. 0 %であったことから、生成物のモル収率を計算すると、 9 5. 0 % となった。 以上の反応結果から 2—ヒ ドロキシ一 4—メチルチオブタン酸アンモ ニゥム塩の菌体触媒あたりの平均生産速度を計算すると 174. 5 0 1ノ m i n/g—乾燥菌体重量 （21→35°C/27日間） となる。 比較例 1
実施例 2と全く同条件で培養して得た菌体アースロバクター s p. N S S C 1 04株を菌体触媒として用い、 実施例 2と全く 同条件で反応を行ったところ、 下 記の結果が得られた。
使用菌体触媒量： 8 6. 0 g (乾燥重量として 1 7. 2 g) /実施例 2と同様 反応温度 ： 2 1 V→35 °C (27日間） Z実施例 2と同様
2—ヒ ドロキシ一 4—メチルチオプチロニト リル添加速度 ： 0. 227 g/ i n
水添加速度： 0. 945 g/m i n
ろ液排出速度 ： 1. 1 73 g/m i n
2—ヒ ドロキシ一 4—メチルチオブタン酸ァンモニゥム塩平均蓄積濃度： 2 2.
8重量％
ろ液排出量 ： 47. 3 k g/27日間
2—ヒ ドロキシ一 4ーメチルチオブタン酸ァンモニゥム塩の菌体触媒あたりの 平均生産速度 ： 9 6. 6 0 1 Zm i nZg—乾燥菌体重量 実施例 3
流加培養法で得た菌体を用いて、 定温で 2—ヒ ドロキシー 4ーメチルチオ酪酸 アンモニゥム塩を連続的に生産する反応を実施した。
限外ろ過 （U F) 膜分離機、 自動希釈装置，オー トインジェクター付きのオン ライン高速液体クロマ トグラフィ一装置、 p Hコン ト口一ラーを備えた 3 00 m 1容攪拌型反応槽に、 上記培養法で得た菌体触媒アルスロバクタ一 s p . N S S C 204の湿菌体 86. 0 g (乾燥重量として 1 7. 2 g) を添加し、 水で 1 8 9. 2 m l で希釈した。 この反応槽に反応温度 3 5でで、 2—ヒ ドロキシ— 4— メチルチオプチロニト リルを 0. 974 g/m i nの速度で連繞的に添加し、 合 計で 5 1. 8 g加え終わった時点で、 水の連続添加を 4. 052 g/m i nで開 始し、 2—ヒ ドロキシ一 4—メチルチオプチロニト リルの 0. 974 g/m i n による連続添加を継続しながら、 膜分離機で菌体触媒を分離回収して反応槽に戻 すと同時に、 透過ろ液を 5. 028 gZm i nで排出した。 反応を通して、 p H を 7. 0に保つように、 28 %アンモニア水を添加した。
この連繞反応の間、 オンライン高速液体ク口マトグラフィ一により 2—ヒ ドロ キシー 4—メチルチオプチロニトリルの反応液中濃度を検知し、 約 0. 2重量％ になるように、 2—ヒ ドロキシ一 4ーメチルチオプチロニト リルおよび水の添加 速度を徐々に低下させ、 これに伴い膜透過ろ液の排出速度も低下させた。 この条 件で 1 8時間の反応を継続し、 反応終了時には、 2—ヒ ドロキシ— 4ーメチルチ ォブチロニト リルの添加速度は 0. 902 g/m i n、 膜透過ろ液の排出速度は 4. e S S gZm i nとなった。 2—ヒ ドロキシ一 4—メチルチオプチロニトリ ルの連続反応開始後の添加量合計は 1. 0 1 k gであり、膜透過ろ液は全量で 5. 23 k gであった。 ここに得られた膜透過ろ液を、 高速液体クロマトグラフィ一 で分析したところ、 生成物である 2—ヒ ドロキシー 4ーメチルチオブタン酸が 2 0. 7重量％存在し、 用いた基質 2—ヒ ドロキシ一 4—メチルチオプチロニトリ ルの純度が 95. 0%であったことから、 生成物のモル収率を計算すると、 98. 5 %となった。 以上の反応結果から 2—ヒ ドロキシー 4ーメチルチオブタン酸ァ ンモニゥム塩の菌体触媒あたりの平均生産速度を計算すると 388. 5 o 1 /m i n/g—乾燥菌体重量 （3 5°C/1 8時間） となる。 産業上の利用可能性：
本発明によれば、 一ヒ ドロキシニト リル 〔 I〕 及び/又は α—ヒ ドロキシ酸 アンモニゥム塩 〔II〕 に対する濃度耐性並びに活性が長時間持続する耐久性を有 する微生物を用いることにより、 α—ヒ ドロキシ酸アンモニゥム塩 〔II〕 が高濃 度に蓄積され、 なおかつ微生物菌体触媒が繰り返し使用できるので、 効率的に α ーヒ ドロキシ酸アンモニゥム塩 〔II〕 を製造することが可能である。

Claims

請 求 の 範 囲
1. 一般式 〔 I〕 ： R C H (0 H) C N
(式中、 Rは水素原子、 置換基を有してもよい Ci Ceのアルキル基、 置換基を 有してもよい C2〜 C6のアルケニル基、 置換基を有してもよい C1〜C6のアルコ キシル基、 置換基を有してもよいァリール基、 置換基を有してもよいァリールォ キシ基又は置換基を有してもよい複素環基を示す。 ） で表される α—ヒ ドロキシ 二トリルを、 一般式 〔II〕 ： RC H (0 H) C O O—NH4 + (式中、 Rは前記と同 一の意味を示す。 ） で表される α—ヒ ドロキシ酸ァンモニゥム塩に変換するに際 し、 一般式 〔II〕 で表される α—ヒ ドロキシ酸ァンモニゥム塩の平均生産速度と して、 新鮮菌体触媒の追加を行うことなく、 g乾燥菌体重量当たり少なく とも 1 O O zm o l Zm i nを 1 4日間以上維持することができる微生物菌株に由来す る微生物触媒を用いることを特徴とする一般式 〔II〕 で表される α—ヒ ドロキシ 酸アンモニゥム塩の製造法。
2. 微生物菌株に由来する微生物触媒が、 反応系中に一般式 〔II〕 で表される α ーヒ ドロキシ酸アンモニゥム塩を 20〜 6 0重量％蓄積することができる微生物 菌株に由来する微生物触媒であることを特徴とする請求項 1記載の一般式 〔II〕 で表される α—ヒ ドロキシ酸アンモニゥム塩の製造法。
3. 微生物菌株に由来する微生物触媒が、 アースロバクタ一属に属する微生物菌 株に由来する微生物触媒であることを特徴とする請求項 1又は 2記載の一般式
〔II〕 で表される α—ヒ ドロキシ酸アンモニゥム塩の製造法。
4. アースロバクタ一属に属する微生物菌株が、 アースロバクタ一 ·エスピー
(Arthrobacter sp. ) N S S C 2 04又は当該菌株より誘導された微生物菌株で あることを特徴とする請求項 3記載の一般式 〔II〕 で表される α—ヒ ドロキシ酸 アンモニゥム塩の製造法。
5 . 微生物菌株に由来する微生物触媒が、 微生物菌体、 該微生物の菌体処理物、 該微生物の抽出物又は該微生物から単離された酵素であることを特徴とする請求 項 1〜 4のいずれか記載の一般式 〔II〕 で表される α—ヒ ドロキシ酸アンモニゥ ム塩の製造法。
6 . 置換基を有してもよい 6のアルキル基が、 C i〜 C 6のアルキルチオア ルキル基又は C i〜 C 6のヒ ドロキシアルキル基であることを特徴とする請求項 1 〜 5のいずれか記載の一般式 〔II〕 で表される α—ヒ ドロキシ酸アンモニゥム塩 の製造法。
7 . 置換基を有してもよいァリール基が、 フヱニル基であることを特徴とする請 求項 1〜 5のいずれか記載の一般式 〔II〕 で表される α—ヒ ドロキシ酸アンモニ ゥム塩の製造法。
8 . α—ヒ ドロキシニ ト リルが、 ラク トニ ト リル、 アセ ト ンシアンヒ ドリ ン、 マ ンデロニト リル又は 2—ヒ ドロキシー 4ーメチルチオプチロニトリルであること を特徴とする請求項 1〜 7のいずれか記載の一般式 〔II〕 で表される —ヒ ドロ キシ酸ァンモニゥム塩の製造法。
9 . 一般式 〔 I〕 ： R C H ( 0 H ) C Ν (式中、 Rは水素原子、 置換基を有して もよい（ ！〜 C 6のアルキル基、 置換基を有してもよい C 2〜 C 6のアルケニル基、 置換基を有してもよい（ 〜じ 6のアルコキシル基、 置換基を有してもよいァリ一 ル基、 置換基を有してもよいァリールォキシ基又は置換基を有してもよい複素環 基を示す。 ） で表される α—ヒ ドロキシニト リルを、 一般式 〔II〕 ： R C Η ( 0 H ) C 0 Ο - Η 4 + (式中、 Rは前記と同一の意味を示す。 ） で表される ーヒ ド 口キシ酸アンモニゥム塩に変換するに際し、 一般式 〔II〕 で表される α—ヒ ドロ キシ酸アンモニゥム塩の平均生産速度として、 新鮮菌体触媒の追加を行うことな く、 菌体触媒乾燥重量当たり少なく とも 1 0 0 o 1 Z m i nを 1 4日間以上 維持することができることを特徴とする微生物菌株。
10. 微生物菌株が、 反応系中に一般式 〔II〕 で表される α—ヒ ドロキシ酸アン モニゥム塩を 2 0〜 60重量％蓄積することができる微生物菌株であることを特 徴とする請求項 9記載の微生物菌株。
1 1. 微生物菌株が、 アースロバクタ一属に属する微生物菌株であることを特徴 とする請求項 9又は 1 0記載の微生物菌株。
1 2. アースロバクタ一属に属する微生物菌株が、 アースロバクタ一 .エスピー (Arthrobacter sp. ) N S S C 2 04 (F E RM B P— 76 6 2) であること を特徴とする請求項 1 1記載の微生物菌株。
1 3. アースロバクタ一属に属する微生物菌株が、 アースロバクタ一 · エスピー (Arthrobacter sp. ) N S S C 2 04から誘導された微生物菌株であることを特 徵とする請求項 1 1記載の微生物菌株。
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