WO2003062417A1

WO2003062417A1 - Produit de ligation arn-adn, et utilisation correspondante

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Publication number: WO2003062417A1
Application number: PCT/JP2003/000544
Authority: WO
Inventors: Naoto Nemoto; Toru Sasaki; Miwa Shiratori
Original assignee: Mitsubishi Chemical Corporation
Priority date: 2002-01-22
Filing date: 2003-01-22
Publication date: 2003-07-31

Description

R NA- D N A結合体およぴその利用技術分野

本発明は、互いに相補的な配列を有する一本鎖 R N Aと一本鎖 D N Aとをァニ一リングさせた後に R NAリガーゼで処理することを特徴とする核酸の連結方法並びにその利用に関する。

さらに本発明は、標的 m R NAと結合させた後に翻訳することにより、該標的 m R N Aとそれがコードするタンパク質との連結体を作製させることができる核酸構築物、並びにその利用に関する。

さらに本発明は、標的 m R N Aとそれがコードするタンパク質との連結体を用いる核酸およびノまたはタンパク質の選択方法、並びに、タンパク質と被験物質との相互作用の検出方法に関する。

さらに本発明は、酵素反応で最終脱保護を行なうピューロマイシン誘導体およぴ支持体に関する。

さらに本発明は、ランダム配列から成るぺプチドライブラリ一などの比較的短いアミノ酸残基を有する目的ぺプチドまたは目的タンパク質を無細胞翻訳系において機能的に発現させる際に有用な支持体タンパク質、上記支持体タンパク質を用いてペプチドライブラリーを機能的に発現させる方法、並びに上記支持体タンパク質を用いて機能性ぺプチド又はタンパク質をスクリーニングする方法に関する。

さらに本発明は、互いに相捕的な共通配列を有する異なる 2種類の 1本鎖または 2本鎖 D N Aをプライマーの非存在下において連結する方法、並びに上記した核酸の連結方法を用いてぺプチドライブラリーなどのぺプチド又はタンパク質を発現させる方法に関する。景技術 ( 1 ) 遺伝子工学において核酸の切断および連結は最も重要な基本的手法の一つである。 2種類の核酸を連結させる方法としては、従来はライゲーシヨンが主であり、 D N Aリガーゼを用いたものがほとんどであった。

一方、 RN Aの連結は T 4 RN Aリガーゼを用いて、主に人工 rRNAの合成 (Bruce AG, Uhlenbech 0C: Biochemistry, (1982)21(5) 855-61) や全長 c DNA 作製のための mRNAの 5' 端へのプライマー付加する方法（TrouttAB, et al. ： Proc Natl Acad Sci USA (1992) 89 (20)： 9823-5) などがある。

最近になって進化分子工学の手法として mRNAとそれによりコードされたタンパク質を無細胞翻訳系の中で共有結合させる技術（in vitro virus 法） (Nemoto, N. , et al. (1997) FEBS Lett. 414, 405- 408)が登場し、そこで mRNA とその 3' 末端に DNAを連結する必要がでてきた。一般に RN Aは一本鎖であるため、繫げょうとする DNAと RNAの配列に相捕な添え木となる DNAをハイブリダィズさせて、 DNAリガーゼで連結する方法が考えられる。しかし，これは効率の面で好ましくなく、 in vitro virus法の利用にあたって大きな課題となっている。

一方、西垣らは一本鎖の DNA同志を連結させるために，それらの一部に相補な配列を持たせ，ハイブリダィズさせることで、濃度効果を高め， T4RNAリガーゼを用いて効率良く一本鎖 DNA同志を連結させる方法を考案している（Y 一ライゲーション法とも称される） (K. Nis igaki, (1998) Molecular Diversity, 4： 187-190)。し力しながら、一本鎖 RNAと一本鎖 DNAとを Y—ライゲーション法を用いて連結することは報告されていない。

(2) 1990年に開発されたファージディスプレイ法（Scott JK &Smith GP, (1990) Science, 249； 386-390) は、様々なタンパク質を大腸菌ファージ表面に提示して特定のターゲット分子に特異的に結合するタンパク質を迅速に見い出すことができる進化分子工学的手法の一つである。ファージディスプレイ法の実用化により、この手法を利用して様々な応用が始まった。また、大腸菌等の細胞表面の膜タンパク質を利用してこのようなランダムな配列のペプチドを提示し、機能ペプチドを取得する方法も開発された（Lu, Z. et al. (1995) Bio/Technology 13： 366-372) 。

これらの方法はいずれも機能べプチドを取得する有効な方法であるが、生細胞を用いるため、提示するペプチド配列に片寄りが生じるなどの問題点も有している。

一方、 1 9 9 7年に開発された in vitro virus法は、無細胞翻訳系中において mR NAとそれによりコードされたタンパク質を mR NAの 3，末端側にピューロマイシン付スぺーサを介して連結させる方法である（Nemoto, N. et al. (1997) FEBS Lett. 414, 405-408, Roberts, R. W. et al (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 12297 - 12302) 。このようにして作成された mR NAとタンパク質との複合体；以下これを単に「R NA—タンパク質複合体」と称することがある）では、無細胞翻訳系でタンパク質を発現させるために、生細胞を用いた場合に問題となる配列の片寄りが生じにくく、また、 1回でスクリーニングするライブラリーサイズが大きいという利点を有する。し力しながら、下記するような幾つかの問題点も有している。

ファージディスプレイ法又は大腸菌の表面にぺプチド等を提示する方法の場合には、培地中からのタンパク質又はペプチドの精製が容易であるが、無細胞翻訳系は細胞を破碎した中からの抽出物であるため、 R N A分解酵素や D N A分解酵素等のような夾雑物の含有量が極めて多い。また、 in vitro virus法で作製される in vitro virus virionは、核酸とタンパク質が結合した形態であるが、このうちの核酸部分は遺伝子情報をコードしているため分解されることで大きなダメージを受ける。従って、 in vitro virus法では、 in vitro virus virionを無細胞翻訳系から迅速に分離することが重要な課題である。また、 in vitro virus virion の mR N Aはなるべく早く D NAに転化して分解されにくくすることが望ましい。しかし、無細胞翻訳系の中での逆転写は困難であるため、無細胞翻訳系から in vitro virus virionを迅速に分離することが望ましい。従来の in vitro virus virionの精製技術としては大きく 2つに分けることができる。一つは、 poly Aを含む puromycinスぺーサを利用して oligo dTで精製する方法 (RW Roberts & JW Szostack (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94, 12297-12302) であり（図 1の（ 1 ) を参照）、もう一つは、遺伝子の両端に FLAG と His X 6タグを連結させておき翻訳後、 F L A G抗体及ぴ N i— N T Aカラムで精製するやり方である（AD Keefe & JW Szostak, (2001) Nature, 410, 715 - 718) (図 1の（2 )を参照）。これらのスぺーサによって精製は可能であるが、 in vitro virus virionを安定ィヒするために逆転写することが難しい。

そこで、逆転写可能な T型の puromycinスぺーサが提案された（I Tabuchi, et al. (2001) FEBS lett. 508 (3) ; 309-312) (図 1の（3 ) を参照）。このような T型の puromycin スぺーサを用いることにより、逆転写が可能になり in vitro virus virionを D N A化して安定化することができる。し力し、この場合、精製に際し、図 1の（1 )の場合のようにスぺーサを用いて精製することができない。また、図 1の（2 )の場合のようにタンパク質側で精製することは可能であるが、 mR N Aにァフィ二ティータグをコードさせることが必要になる。

( 3 ) アミノアシル tRNA3'—末端部分の構造疑似体としてリポソーム上においてぺプチド鎖に結合し翻訳反応を停止するピュー口マイシンは、遺伝情報とその翻訳産物を結び付けるための分子ッールとして近年分子進化工学などの分野で注目され始め、実用的な誘導体が数多く合成されるようになっている（Nemoto, N. et al (1997) FEBS Lett. 414, 405-408, Roberts, R. W. et al (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 12297-12302) ₀ 分子進化工学的な応用（In Vitro Virus法）に用いられる誘導体には、ピューロマイシン及ぴそれを m R N Aに結合させるための相補 D NA、さらに精製や検出のためのプローブなどが含まれることが必要とされ、それらは一般にオリゴヌクレオチド合成の手法、すなわちホスホアミダイト法によつて調製されている。分子進化工学分野以外でのピューロマイシンの応用例としては、タンパクの C末端を特異的に蛍光プローブなどで修飾する C末端ラベル法があり (Nemoto, N. , et al (1999) FEBS Lett. 462, 43 - 46)、この場合も用いられるピユーロマイシン誘導体の調製にはホスホアミダイト法が使われることが多い。ピューロマイシンをホスホアミダイト法の 3，一支持体に導入して用いる場合、通常のヌクレオシドと同様に 5 ' 一水酸基はジメトキシトリチル（DMT) 基で保護し、 2 ' —水酸基は通常の 3 ' —水酸基の代わりとしてコハク酸を介して担体に結合させ、ァミノ酸部分の α—アミノ基は伸長反応終了後の濃ァンモユア水による脱保護で除去できるトリフルォロアセチル（Tfac) 基で保護するのが一般的であると考えられる。実際にこのような形でピューロマイシンを C P G (Controlled Pore Glass) 上に固定した支持体（ピューロマイシン CPG) がダレンリサーチ社より市販されるようになつており、 3，一末端にピューロマイシンを有するオリゴヌクレォチドを固相合成機上で合成することが一般的に可能になっている。蛍光プローブなども実用的なホスホアミダイトに誘導体化されたものが入手可能であれば合成機上で導入することができ、ある程度の機能が導入されたピュー口マイシン誘導体の調製が可能である。

ピューロマイシン C P Gの Tfac基は伸長サイクルにおける反応に耐え、濃アンモニァ水処理によりリン酸ジエステルの保護基であるシァノエチル基や塩基部分の保護基などと共に除去されるという点で通常のホスホアミダイト法による D N A合成に適している。し力し、合成機上でピューロマイシン誘導体を合成した後にさらに修飾などの反応を行なう場合、 a—アミノ基が脱保護された状態で次の反応に進むことは多くの場合困難を伴う。例えば、固相合成後にプローブなどを配列の途中に導入することを考えてオリゴヌクレオチドを合成する時はァミノ修飾 dT

(グレンリサーチ）のような特殊ホスホアミダイトを特定の場所に力ップリングさせ、合成終了後に活性ェステルイ匕されたプローブなどでこのアミノ基を修飾するのが一般的であるが、ピューロマイシンの α—ァミノ基が脱保護されている時はァミノ修飾 dT部分だけで特異的に修飾反応を行なうことが難しくなる。 α—ァミノ基はピュー口マイシンの活性に必須の官能基であるためそれが修飾された誘導体には活性を全く期待できないばかりでなく、他のアミノ基のみで修飾された目的物を分離精製することも誘導体がある程度の大きさを持ったオリゴマーになれば不可肯に近くなる。

新たな機能が付加されたピューロマイシン誘導体を容易に調製するための手段を得ることはその応用展開を効率的に進めるためにも重要であると考えられる。用途に合わせて特殊なホスホアミダイトを合成することも 1つの手段であるが、合成にコストがかかるだけでなく、ホスホアミダイト法の反応に耐えられない物質は数多くあり、誘導体化も制限を受けることになる。 _α—了ミノ基の保護基を残した状態でホスホアミダイト法による合成を完了させ、修飾反応を行なった後に副反応を起こさない穏やかな条件で a—アミノ基を脱保護することが可能になれば、市販の試薬などを用いて様々な誘導体化を容易に行なうことが出来るようになるのは確実である。

Tfac 基に代わる新たなピューロマイシンひーァミノ基の保護基には幾つかの条件が求められる。まず Tfac基と同様にホスホアミダイト法の伸長サイクルにおける各反応に耐えられること、そして Tfac基と異なり濃ァンモユア水処理による脱保護反応で除去されないこと、さらに副反応を起こさない条件で最終的に除去されること、の主に 3点である。一般に用いられるァミノ保護基の中でこれらの条件を満たすものは皆無に近く、例えば代表的なァミノ保護基である Boc (t-butoxycarbonyl)基は、伸長サイクルにおける脱保護において徐々に遊離が進むだけでなく、完全な脱保護をトリフルォロ酢酸溶液中で行なおうとした時に、アデノシンゃグァノシンでの脱プリンという深刻な副反応を伴うためホスホアミダイト法による DNA合成には適さなレ、。実用レベルですべての条件を満たす保護基を得るためには、新規の脱保護法の導入も含めた対応策の検討が必要となる。

( 4 ) 様々な配列のペプチドまたはタンパク質をファージ等のコートタンパク質と融合させてディスプレイ（ファージディスプレイ法）（Scott, J. K. & Smith, G. P. , (1990) Science 1990, 249： 386 - 390) させることにより、目的分子に結合する機能ペプチドをこのファージ集団から取得する方法が開発されている。また、大腸菌等の細胞表面の膜タンパク質を利用してこのようなランダムな配列のペプチドを提示し、機能ペプチドを取得する方法も開発された（Lu, Z. et al. (1995) Bio/Technology 13： 366-372)。これらの方法はいずれも機能ペプチドを取得するための有効な方法であるが、生細胞を用いるため提示するぺプチド配列に片寄りが生じるなどの問題点も有している。

一方、最近になって無細胞翻訳系中で mRNAとそれにコードされたタンパク質を mR A の 3'末端側にピューロマイシン付スぺーサを介して連結させる方法が開発された (Nemoto, N. et al. (1997) FEBS Lett. 414, 405-408, Roberts, R. W. et al (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 12297-12302)。この方法では無細胞翻訳系を用いるため上述のような配列の片寄りが生じることはない。ただし、短いペプチドは無細胞翻訳系では発現しにくく mRNAに比べて小さいため、ランダムなぺプチドを提示するための支持体となるタンパク質が必要となる。支持体となるタンパク質はそれ自体がフォールデイングしゃすく、提示するぺプチドとの相互作用が生じにくいことが要求される。また、 mRNA等の核酸や他のタンパク質と相互作用しにくいことが望ましい。現在、このような複数の要求にあったタンパク質を作成することが求められている。フォールデイングしやすく Cysを含まない支持体としては、 Staphylococcus areusのプロティン Aの一部 B ドメイン B (Moks, T. , et al. , (1986) Eur. J. Biochem. 156, 637-643. ) が知られている。し力し、 B ドメインは IgGの Fcフラグメントに強く結合するために、例えば抗体のェピトープをスクリーニングする際の支持体としては使用できない。

( 5 ) 従来より遺伝子組み換え等で DNAの連結は最も基本的で重要な技術となつている。一般的に最もよく使われている方法は、 2本鎖 DNAを T4 DNA Ligase (Sgaramella V, & Ehrlich SD (1978) Eur J Biochem 86， 531-537)を用いて連結させる方法である。この場合、連結しようとする DNAには用いる制限酵素の認識部位が含まれていないことが必要であり、従ってあらかじめ連結しょうとする DNA の 1次配列は既知の必要がある。一方、 1985年にポリメラーゼ連鎖反応法（PCR法）（Saiki RK, et al. , (1985) Science, 230, 1350-1354)が報告されたことにより、これを利用した DNA連結法である Overlap extension PCR法が Hortonらによって開発された（Horton RM, et al. , (1989) Gene, 77， 61- 68)。これは連結しょうとする 2つの DNA断片のうち、片方の 3 '末端側ともう一方の 5 ' 末端側に相捕な共通配列を持たせる（overlap させる）ことで、制限酵素を使わずに連結させることができる点で優れた方法であった。連結された DNAはその両端から増幅させるための PCR用プライマーで容易に連結された DNAを取得できる。これは特定の DNA断片同志を連結する際に極めて有用である。

1 9 9 0年、様々なタンパク質を大腸菌ファージ表面に提示して特定のターゲット分子に特異的に結合するタンパク質を迅速に見い出す進化分子工学的手法であるファージディスプレイ法（Scott JK &Smith GP, (1990) Science, 249； 386-390) が実用化され、様々な応用が始まった。その際、ファージのコートタンパク質の N末端側に DNAレベルでランダムな配列を連結させる必要がある。 DNA をファージのゲノムに挿入するためには、ファージゲノムのそのものの長さが PCRするには長いため、 Overlap extension PCR法を用レヽず制限酵素を用いて揷入箇所で切断後、同じ制限酵素サイトを両端にもつ DNAを挿入していた。挿入する DNA にランダムな配列がある場合、その中に制限酵素部位があると切断されるため、ライブラリの配列が制限されることになる。

一方、 1 9 9 7年に開発された in vitro virus法は無細胞翻訳系中で mR Aとそれにコードされたタンパク質を mRNAの 3，末端側にピューロマイシン付スぺーサを介して連結させる（Nemoto, N. et al. (1997) FEBS Lett. 414, 405-408， Roberts, R. W. et al (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 12297 - 12302)。この場合、 PCRプロセスと無細胞翻訳系プロセスのみであるためファージデイスプレイのように制限酵素を用いた連結法を用いる必要はない。従来の PCR法ではプライマーにより元の 1本の铸型 MAから 1万倍以上の DNAが複製する。これは数種類の DNAを連結する場合には問題とならないが、 in vitro virus法のように 1 0の 1 3乗の様々な配列を含むライブラリを必要とする場合には，通常の PCR では元のライブラリの多様性を著しく損なう。したがって多様性を損なわずにランダムな DNAライブラリを連結し、 mRNAを作成する技術が求められている。上記した通り、 in vitro virus法のように in vitroで莫大な配列空間をもつライブラリ集団を扱う場合、スクリーニング過程までそのライブラリの多様性を保持させる技術は極めて重要である。

in vitro virus法では l ml当たり 1 0の 1 3乗を超える分子がスクリーユング可能である。これは従来のファージディスプレイ法が l ml当たり 1 0の 7乗程度の分子数であることに比べると飛躍的な向上となる。し力し、コピー数が多く含まれるとスクリーニングする実際の分子種が減少する。 PCR法で 2 0サイクルの反応をくり返すとそれだけで、理論的には 1 0の 6乗のコピー数となり、 in vitro virus法でもファージディスプレイ法と同等の多様性しか持たないことになる。発明の開示

本発明の第一の目的は、一本鎖 R N Aと一本鎖 D N Aとを連結するための新規な方法、例えば、 in vitro virus virionを作製するための鎵型となる構造物（以下、これを in vitro virus genomeと称することがある）の新規な構築法を提供することである。これに関連して、本発明はまた、短時間に効率よく R N A— D NA結合体を製造する方法を提供することを目的とする。本発明はさらに、上記方法により得られた R N A— D N A結合体を無細胞翻訳系に付してタンパク質と R NAの結合体を効率よく製造する方法を提供することを目的とする。

本発明の第二の目的は、煩雑な操作をすることなく in vitro virus genomeに親和性物質を付け、 in vitro virion の精製に有用で、かつ支持体に固定化してプロテインチップ作成する際においても有用な技術を提供することである。

本発明の第三の目的は、煩雑な操作をすることなく in vitro virus genomeに親和性物質を付け、 in vitro virus virion の精製に有用で、かつ支持体に固定化してプロティンチップを作成する際においても有用な核酸とタンパク質との複合体（核酸一タンパク質複合体）を用いる、所望の機能を有するタンパク質の効率的な選択方法等を提供することである。

本発明の第四の目的は、ピューロマイシンのひーァミノ基が酵素的に脱保護されるようにァミノ酸誘導体またはべプチド誘導体で保護した新規ピュー口マイシン誘導体を提供することである。

本発明の第五の目的は、比較的短いぺプチドを無細胞翻訳系で発現させることを可能とする支持体タンパク質、より具体的には、フォールデイングしやすく、提示するぺプチドとの相互作用が生じにくい支持体タンパク質、及び mRNA等の核酸や他のタンパク質と相互作用しにくい支持体タンパク質を提供することである。本発明の第六の目的は、ランダム配列などの目的配列をコ一ドした DNA断片のコピー数を増やさずに他の D N A断片と連結させて、 in vitro virus genome に用いるための一本鎖 R NAを作製するための方法を提供することである。本発明者らは上記した本発明の第一の目的を解決するために鋭意検討した結果、互いに相補的な配列を有する一本鎖 R N Aと一本鎖 D N A又はその誘導体とをァニーリングさせた後に RN Aリガーゼで処理することにより、短時間に効率よく R NA— D NA結合体を製造することができることを見出した。

即ち、本発明によれば、（1 )互いに相捕的な配列を有する一本鎖 R NAと一本鎖 D NA又はその誘導体とをァユーリングさせる工程；及ぴ

( 2 ) ァエーリング産物を R NAリガーゼで処理して、一本鎖 R NAの 3 ' 末端と一本鎖 D N A又はその誘導体の 5，末端とを連結する工程：

を含む R N A— D N A結合体の製造方法が提供される。

本発明の好ましい態様によれば、（1 ) 蛋白質をコードするコード配列を含み、 3，末端側に 5 ' から 3，方向にアニーリング配列とブランチ配列とを有する一本鎖 R NAと、 3，から 5，方向に上記アニーリング配列と相補的な配列とブランチ配列とを有する一本鎖 D NA又はその誘導体とをアニーリングする工程；及び (2) アニーリング産物を RN Aリガーゼで処理して、一本鎖 RN Aの 3，末端と一本鎖 DN A又はその誘導体の 5，末端とを連結する工程：

を含む R N A— D N A結合体の製造方法が提供される。

好ましくは、一本鎖 RNAは mRNA又は mRNAライブラリーである。好ましくは、一本鎖 RNAは、（1) プロモーター配列、（2) 翻訳の際にリボソームによって認識される塩基配列、及ぴ（3) 目的タンパク質をコードする配列を有することを特徴とする。

好ましくは、目的タンパク質は、目的ペプチド又は目的タンパク質と、 30から 200アミノ酸残基からなる球状タンパク質から成ることを特徴とする目的ぺプチド又は目的タンパク質を融合タンパク質として発現及ぴ提示するための支持体タンパク質とから成る融合タンパク質である。

好ましくは、一本鎖 DNA又はその誘導体として、 3' 末端に核酸誘導体が結合している一本鎖 DN Aの誘導体を使用する。

好ましくは、一本鎖 DNA又はその誘導体として、 3' 末端に核酸誘導体がスぺーサ一を介して結合している一本鎖 D N Aの誘導体を使用する。

好ましくは、一本鎖 DNA又はその誘導体として、 3，末端に、一本鎖 RNA の逆転写の際にプライマーとして作用する配列を有する一本鎖 DN Aの誘導体を使用する。

好ましくは、一本鎖 DNA又はその誘導体として、 3，末端に、該一本鎖 RN Aの逆転写のためのプライマ一配列を有し、かつ核酸誘導体を末端に有するスぺーサ一が枝分かれした状態で結合している一本鎖 D N Aの誘導体を使用する。好ましくは、核酸 |導体は、ピューロマイシン、 3， -N-アミノアシルピュー口マイシンァミノヌクレオシド、 3' - N -ァミノアシルアデノシンァミノヌクレオシドの化学構造骨格を含む化合物又はそれらの類縁体である。

好ましくは、スぺーサ一は、ポリエチレン又はポリエチレングリコールなどの高分子である。

R N Aリガーゼは好ましくは T4RNAリガーゼである。本発明のさらに別の側面によれば、本発明の方法により得られる RNA— DN A結合体が提供される。

本発明のさらに別の側面によれば、本発明の方法により得られる RNA— DN A結合体を逆転写反応に付して DN A結合体を製造する方法が提供される。本発明のさらに別の側面によれば、本発明の方法により得られる RNA— DN A結合体をタンパク質翻訳系に導入して RN Aをタンパク質に翻訳することを特徴とする、 RNAと該 RNAによりコードされるタンパク質から成る RNA—タンパク質複合体の製造方法が提供される。

本発明のさらに別の側面によれば、上記した方法により製造される RNA—タンパク質複合体が提供される。

本発明のさらに別の側面によれば、上記した本発明の RNA—タンパク質複合体を逆転写反応に付することを特徴とする、 DNAと該 DNAによりコードされるタンパク質から成る核酸一タンパク質複合体の製造方法が提供される。

本発明のさらに別の側面によれば、上記した製造方法により製造される核酸一質複合体が提供される。さらに、本発明者らは上記した本発明の第二の目的を解決するために鋭意検討した結果、一本鎖 RNAの 3，末端側の配列とアニーリングすることができる一本鎖 DNA配列の 3，末端に、該一本鎖 RNAの逆転写のためのプライマー配列と、核酸誘導体を末端に有するスぺーサ一とが枝分かれした状態で結合した丁字型の構造を有する核酸構築物（以下、 T- Spacerとも称する）において、 5' 末端側に親和性物質と制限酵素認識部位を導入した T - Spacerを用いることにより、一本鎖 R N Aとそれがコードするタンパク質との複合体を簡単に作製でき、かつ精製できることを見出した。

即ち、本発明によれば、一本鎖 RNAの 3，末端側の配列とアニーリングすることができる一本鎖 DNA配列を 3' 末端側に含み、該一本鎖 DNA配列がその 3，末端に、該一本鎖 RNAの逆転写のためのプライマー配列を有し、かつ核酸誘導体を末端に有するスぺーサ一が枝分かれした状態で結合しており、該一本鎖

DNA配列の 5，末端側に親和性物質が結合している、一本鎖 RNAとそれがコードするタンパク質との複合体を作製するための核酸構築物が提供される。好ましくは、該一本鎖 DNA配列の 5，末端側に制限酵素認識部位が存在する。本発明の第一の好ましい態様によれば、一本鎖 R N Aの 3，末端側の配列と了ニーリングすることができる一本鎖 D N A配列を 3，末端側に含む、一本鎖 R N Aとそれがコードするタンパク質との複合体を作製するための核酸構築物において、

(1) 該一本鎖 DNA配列が、その 3，末端に、該一本鎖 RN Aの逆転写のためのプライマー配列を有し、かつ核酸誘導体を末端に有するスぺーサ一が枝分かれした状態で結合しており、

( 2 )該核酸構築物にぉレ、て該一本鎖 RNAとアニーリングしない 5'末端側は、ループ領域を介して互いに相補的な二本鎖配列を形成しており、

( 3 ) 該ループ領域に親和性物質が結合している、

ことを特徴とする上記の核酸構築物が提供される。

本発明の第二の好ましい態様によれば、一本鎖 RNAの 3，末端側の配列とァニーリングすることができる一本鎖 DN A配列を 3 ' 末端側に含む、一本鎖 RN Aとそれがコードするタンパク質との複合体を作製するための核酸構築物において、

(1) 該一本鎖 DNA配列が、その 3，末端に、該一本鎖 RNAの逆転写のためのプライマー配列を有し、かつ核酸誘導体を末端に有するスぺーサ一が枝分かれした状態で結合しており、

( 2 )該核酸構築物において該一本鎖 RN Aとァニーリングしない 5 '末端側は、相補 DN A鎖と化学的に結合して互いに相補的な二本鎖配列を形しており、

(3) 該相補 DNA鎖の 3' 末端に親和性物質が結合している、

ことを特徴とする上記の核酸構築物が提供される。

好ましくは、上記の二本鎖配列中には制限酵素認識部位が存在する。好ましくは、核酸誘導体は、ピューロマイシン、 3， -N-アミノアシルピュー口マイシンァミノヌクレオシド、 3， - N-ァミノアシルアデノシンアミノヌクレオシドの化学構造骨格を含む化合物又はそれらの類縁体である。

好ましくは、スぺーサ一はポリエチレン又はポリエチレングリコールなどの高分子である。

好ましくは、親和性物質はビォチン又はポリ A配列である。

本発明の別の側面によれば、上記した核酸構築物と一本鎖 RNAとをァニーリングさせ、該核酸構築物の二本鎖領域の 5，末端と一本鎖 RNAの 3' 末端とをライゲーシヨンさせることを含む、 RNA— DNA結合体の作製方法が提供される。

好ましくは、ライゲーションは T4RNAリガーゼを用いて行なう。

好ましくは、一本鎖 RNAは mRNA又は mRNAライブラリーである。好ましくは、一本鎖 RNAは、（1) プロモーター配列、（2) 翻訳の際にリボソームによって認識される塩基配列、及び（3) 目的タンパク質をコードする配列を有する。

好ましくは、目的タンパク質は、目的ペプチド又は目的タンパク質と、 30から 200アミノ酸残基からなる球状タンパク質から成ることを特徴とする目的べプチド又は目的タンパク質を融合タンパク質として発現及ぴ提示するための支持体タンパク質とから成る融合タンパク質である、

本発明のさらに別の側面によれば、上記方法により得られる RN A— DN A結合体、並びに該 R NA— D N A結合体を支持体上に固定ィヒしたチップが提供される。

本発明のさらに別の側面によれば、上記方法により得られる RNA— DNA結合体を逆転写反応に付して DNA結合体を製造する方法、上記方法により得られる D N A結合体、並びに該 D N A結合体を支持体上に固定化したチップが提供される。

本発明のさらに別の側面によれば、上記の RNA— DNA結合体をタンパク質翻訳系に導入して RNAをタンパク質に翻訳することを特徴とする、 RNAと該 RNAによりコードされるタンパク質から成る RNA—タンパク質複合体の製造方法が提供される。

好ましくは、翻訳は無細胞翻訳系で行なう。

本発明のさらに別の側面によれば、上記の RNA— DNA結合体をタンパク質翻訳系に導入して RNAをタンパク質に翻訳することにより得られる、 RNAと該 RNAによりコードされるタンパク質から成る RNA—タンパク質複合体、並ぴに該 RN A—タンパク質複合体を支持体上に固定化したチップが提供される。本発明のさらに別の側面によれば、上記の RNA—タンパク質複合体を逆転写反応に付することを特徴とする、 DNAと該 DNAによりコードされるタンパク質から成る核酸一タンパク質複合体の製造方法、該製造方法により得られる核酸 —タンパク質複合体、並びに、該核酸一タンパク質複合体を支持体上に固定化したチップが提供される。さらに本発明者らは、上記した本発明の第三の目的を解決するために鋭意検討した結果、一本鎖 RNAの 3，末端側の配列とアニーリングすることができる一本鎖 DNA配列の 3，末端に、該一本鎖 RNAの逆転写のためのプライマー配列と、核酸誘導体を末端に有するスぺーサーとが枝分かれした状態で結合した丁字型の構造を有する核酸構築物（以下、 T- Spacerとも称する）において、 5' 末端側に親和性物質と制限酵素認識部位を導入した T-Spacerを用いることにより、一本鎖 R N Aとそれがコードするタンパク質との複合体を簡単に構築することができ、さらにこの核酸とタンパク質との複合体を用いることにより効率的に所望の機能を有するタンパク質を選択できることを見出した。

即ち、本発明によれば、（1) 上記した本発明による RNA— DNA結合体を調製する調製工程、 (2) 調製工程で得られた RNA— DNA結合体をタンパク質翻訳系に導入して RNAをタンパク質に翻訳させて RNAと該 RNAによりコードされるタンパク質から成る RN A—タンパク質複合体を構築する構築工程、 ( 3 ) 構築工程で得られた R N A—タンパク質複合体を被験物質との相互作用に基づいて選抜する選抜工程、および、（5) 選抜工程で選択された RNA—タンパク質複合体の核酸部分を増幅する増幅工程とを含むことを特徴とする核酸および Zまたはタンパク質の選択方法が提供される。

本発明の好ましい態様によれば、増幅工程で得られた核酸を、一本鎖 RNAとして RNA— DNA結合体を調製する調製工程に供し、（1) 調製工程、 (2) 構築工程、 ( 3 ) 選抜工程、および、（ 5 ) 増幅工程を繰り返し行うことを特徴とする上記方法が提供される。

また、本発明の別の態様によれば、（1) )—本鎖 RNAの 3，末端側の配列とアニーリングすることができる一本鎖 D N A配列を 3，末端側に含む核酸構築物を調製し、（b)該核酸構築物と一本鎖 RNAとをアニーリングさせ、（c) 該アニーリング産物の一本鎖 RN Aの 3，末端と核酸構築物の 5' 末端とを連結させて RNA— DNA結合体を調製する調製工程、 (2) 調製工程で得られた R NA— DNA結合体をタンパク質翻訳系に導入して RN Aをタンパク質に翻訳させて RNAと該 RNAによりコードされるタンパク質から成る核酸一タンパク質複合体を構築する構築工程、（3) 構築工程で得られた核酸一タンパク質複合体を被験物質との相互作用に基づいて選抜する選抜工程、（4) 選抜工程で選択された核酸一タンパク質複合体の核酸部分に変異を導入する変異導入工程、およぴ、 ( 5 ) 変異導入工程で得られた核酸部分を増幅する増幅工程とを含むことを特徴とする核酸およぴ Zまたはタンパク質の選択方法が提供される。

本発明の好ましい態様によれば、増幅工程で得られた核酸を、一本鎖 RNAとして RNA— DNA結合体を調製する調製工程に供し、（1) 調製工程、 (2) 構築工程、（3) 選抜工程、（4) 変異導入工程、および、（5) 増幅工程を繰り返し行うことを特徴とする上記方法が提供される。

さらに、本発明の別の態様によれば、（1) (a) —本鎖 RNAの 3' 末端側の配列とァニーリングすることができる一本鎖 D N A配列を 3 ' 末端側に含む核酸構築物を調製し、（b) 該核酸構築物と一本鎖 RNAとをアニーリングさせ、 ( c ) 該アニーリング産物の一本鎖 R NAの 3，末端と核酸構築物の 5，末端とを連結させて R NA— D NA結合体を調製する調製工程、（2 ) 該 RNA— D N A結合体をタンパク質翻訳系に導入して R NAをタンパク質に翻訳させて R NA と該 R NAによりコードされるタンパク質から成る核酸一タンパク質複合体を構築する構築工程、および、（6 ) 構築工程で得られた核酸一タンパク質複合体と被験物質との相互作用を調べる検定工程とを含むことを特徴とするタンパク質と被験物質との相互作用の検出方法が提供される。さらに本発明者らは上記した本発明の第四の目的を解決するために鋭意検討を重ね、ホスホアミダイト法におけるすべての反応に耐え、なおかつ副反応を起こさない穏やかな条件で除去される保護基としてべプチダーゼによって加水分解されるアミノ酸誘導体を考え、幾つかの保護基とぺプチダーゼの組合わせを検討した。その結果、 Z (benzyloxycarbonyl) 基で保護されたフエ二ルァラニン（Z - Phe基）とキモトリプシンの組み合わせが実用的であることを見い出した。

即ち、本発明によれば、下記式（1 ) で表されるピューロマイシン誘導体又はその塩が提供される。

X (式中、 R¹は水素原子、又は水酸基の保護基を示し；

R ²は水素原子又は反応性基を示し；

Xはアミノ酸残基あるいはペプチドを示し、 Xにおいて、そのカルボキシル基がピューロマイシン中のアミノ基とアミド結合により結合しており、該アミノ酸残基あるいはぺプチドの αアミノ基および側鎖の官能基は所望により保護されていてもよい。)

好ましくは、アミノ酸残基あるいはぺプチドは芳香族アミノ酸残基である。好ましくは、該芳香族アミノ酸残基はフエ二ルァラニン残基である。

特に好ましくは、 Xは、 Ν α— (N o;—ベンジルォキシカルボユルフェ二ルァラニル基である。

好ましくは、 R ²が示す反応性基は、末端にカルボキシル基を有する反応性基である。

特に好ましくは、 R ²が示す反応性基はスクシニル基である。

本発明の別の側面によれば、上記のピューロマイシン誘導体を支持体に結合してなる、ピューロマイシン誘導体固定化支持体が提供される。

好ましくは、本発明のピューロマイシン誘導体固定化支持体は、 R ²が示す反応性基と、支持体中の反応性基とを反応させることにより得ることができる。

好ましくは、支持体は、 C P G (Controlled Pore Glass)である。

本発明のさらに別の側面によれば、上記のピューロマイシン誘導体をぺプチダーゼあるいはプロテアーゼで処理することにより、下記式（2 ) で表される化合物を製造することを含む、ピュー口マイシン誘導体の脱保護方法が提供される。

(式中、 R¹は水素原子、又は水酸基の保護基を示し； R ²は水素原子又は反応性基を示す。）

好ましくは、ぺプチダーゼあるいはプロテアーゼはキモトリプシンである。本発明のさらに別の側面によれば、上記したピューロマイシン誘導体又はピューロマイシン誘導体固定化支持体を用いた核酸化合物の製造方法が提供される。本発明のさらに別の側面によれば、上記したピューロマイシン誘導体を有する核酸化合物が提供される。

本発明のさらに別の側面によれば、上記した核酸化合物をぺプチダーゼあるいはプロテアーゼで処理することによりピューロマイシン誘導体の脱保護を行う、脱保護方法が提供される。

好ましくは、ぺプチダーゼあるいはプロテアーゼはキモトリプシンである。さらに本発明者らは上記した本発明の第五の目的を解決するために鋭意検討した結果、支持体タンパク質としては、（1 )球状タンパク質であってフォールディングしゃすい、かつ（2 ) 安定性があるという条件が必要であることを見出し、これらの条件を満たすタンパク質として Oct- 1の Pou- specific domain (73ァミノ酸残基）（Dekker, N. et al. (1993) Nature 362, 852-854) を支持体タンパク質の候補として選択した。そして、このタンパク質中の Cys残基を Ala残基に置換した変異体タンパク質を作成し、このタンパク質を支持体としてペプチドライブラリ一を無細胞翻訳系で発現させた結果、機能性ぺプチドを効率よく発現できることを見出した。

即ち、本発明によれば、 3 0から 2 0 0アミノ酸残基からなる球状タンパク質カら成ることを特徴とする、目的ぺプチド又は目的タンパク質を融合タンパク質として発現及ぴ提示するための支持体タンパク質が提供される。

上記した本発明の支持体タンパク質のなかでも好ましい態様によれば、システイン残基を含まない支持体タンパク質；タンパク質の二次構造としてシート構造を有さず、 αヘリックス構造からなる支持体タンパク質；タンパク質の立体構造において、 Ν末端と C末端が離れている支持体タンパク質；及び、他の生体高分子と相互作用しなレ、支持体タンパク質が提供される。

本発明の特に好ましい態様によれば、下記の何れかのアミノ酸配列を有する、目的ペプチド又は目的タンパク質を融合タンパク質として提示するための支持体タンパク質が提供される。

( 1 ) 配列番号 2 1に記載のァミノ酸配列；又は

( 2 )配列番号 2 1に記載のアミノ酸配列において 1から数個のアミノ酸が欠失、置換、付加および Ζまたは挿入しているアミノ酸配列であって、球状タンパク質を構成するアミノ酸配列：

本発明の別の側面によれば、目的べプチド又は目的タンパク質をコードする塩基配列および上記した何れかの支持体タンパク質をコードする塩基配列が直接またはリンカ一を介して連結してなる、目的ペプチド又は目的タンパク質と支持体タンパク質とから成る融合タンパク質をコードする核酸またはその修飾体が提供される。

本発明のさらに別の側面によれば、目的ぺプチド又は目的タンパク質と上記した何れかの支持体タンパク質とから成る融合タンパク質が提供される。

本発明のさらに別の側面によれば、上記した核酸またはその修飾体を、無細胞翻訳系または生細胞において発現させる工程を含む、融合タンパク質を製造する方法が提供される。

本発明のさらに別の側面によれば、目的べプチド又は目的タンパク質をコードする塩基配列おょぴ上記した何れかの支持体タンパク質をコードする塩基配列が直接またはリンカ一を介して連結してなる目的ぺプチド又は目的タンパク質と支持体タンパク質とから成る融合タンパク質をコードする mR NAであって、その 3 ' 末端に核酸誘導体が結合している mR NAを、無細胞翻訳系または生細胞において発現させる工程を含む、融合タンパク質とそれをコードする核酸とから成る複合体を製造する方法が提供される。

好ましくは、核酸誘導体は、ピューロマイシン、 3， -N-アミノアシルピュー口マイシンァミノヌクレオシド、 3' - N-ァミノァシルアデノシンァミノヌクレオシドの化学構造骨格を含む化合物又はそれらの類縁体である。

好ましくは、融合タンパク質をコードする mR NAとして、 3，末端に核酸誘導体がスぺーサーを介して結合している _mR NAを使用する。

好ましくは、スぺーサ一はポリエチレン又はポリエチレンダリコールなどの高分子である。

本発明のさらに別の側面によれば、（1 ) 無細胞翻訳系または生細胞において、目的ぺプチド又は目的タンパク質を含むライブラリ一を、上記した何れかの方法により、本発明の支持体タンパク質との融合タンパク質の形態で発現させるェ程；及び、

( 2 ) 工程（1 ) で得られた融合タンパク質をスクリーニングすることにより所望の機能を有する目的ぺプチド又は目的タンパク質を選択する工程：

を含む、機能性ぺプチド又はタンパク質のスクリーニング方法が提供される。さらに本発明者らは上記した本発明の第六の目的を解決するために鋭意検討を行い、先ず、互いに相補的な共通配列を有する異なる 2種類の 1本鎖または 2本鎖 D NAを連結するために P C Rを行う際に、プライマーを用いないで P C R反応を行った。この場合、連結した全長 2本鎖 D NAの他に、連結されなかった D N Aの相補鎖がそのまま残ることになる。通常、このような余分な DNAは精製すべきであるが 1 0 0塩基以上あるためプライマー除去用の簡易カラムを使うことができず、電気泳動後ゲルから切り出す必要がある。これは作業上効率が悪く収率が低下することが分かっている。

そこで、この問題を回避するために、 T 7 RNAポリメラーゼ等のウィルス由来の RNA ポリメラーゼはプロモータ特異性が高く、 2本鎖 D N Aを特異的に認識するという性質を有することを利用して、一切の精製作業をせずに R N Aが合成されるかどうカ調べた。その結果、所期の目的どおりの R N Aが合成されることがわかった。また、同時に混在する D N Aは D N A分解酵素を用いて分解後、精製することで容易に除去できることもわかった。

即ち、本発明によれば、互いに相補的な共通配列を有する異なる 2種類以上の 1本鎖または 2本鎖 D NAをプライマーの非存在下において D N A合成酵素を用いて反応させる工程、上記工程で得た混合物を用いて R NAポリメラーゼの存在下で転写反応を行レ、 R N Aを合成する工程、および D N A分解酵素で D N Aを分解する工程を含む、上記した本発明の方法に用いるための一本鎖 R N Aの製造方法が提供される。

好ましくは、 D N A合成酵素を用いた反応は、 T a qポリメラーゼを用いるポリメラーゼ連鎖反応（P C R) である。

好ましくは、異なる 2種類以上の 1本鎖または 2本鎖 D N Aのうちの片方の D N Aは目的配列を含む D N Aである。より好ましくは、異なる 2種類以上の 1本鎖または 2本鎖 D NAのうちの片方の D NAは目的配列を含む D NAであり、他方の D NAが転写、翻訳のための配列、タグをコードする配列、あるいは支持体タンパク質をコードする配列のようなコンスタントな配列（コンスタント配列）である。

好ましくは、支持体タンパク質が、 3 0から 2 0 0アミノ酸残基からなる球状タンパク質から成るタンパク質である。

本発明のさらに別の側面によれば、上記した方法により得られる R N Aが提供される。

本発明のさらに別の側面によれば、（ 1 )互いに相補的な共通配列を有する異なる 2種類の 1本鎖または 2本鎖 DN Aをプライマーの非存在下において DN A合成酵素を用いて反応させることにより、連結した DNAと連結しない DNAを含む混合物を調製する工程；

(2) 工程（1) で得た混合物を用いて RN Aポリメラーゼの存在下で転写反応を行い RN Aを合成する工程；及び

(3) 工程（2) で得た RNAを、無細胞翻訳系または生細胞において発現させる工程を含む、タンパク質の製造方法が提供される。

本発明のさらに別の側面によれば、（1)互いに相補的な共通配列を有する異なる 2種類の 1本鎖または 2本鎖 DNAをプライマーの非存在下において DNA合成酵素を用いて反応させることにより、連結した DNAと連結しない DNAを含む混合物を調製する工程；

(2) 工程（1) で得た混合物を用いて RN Aポリメラーゼの存在下で転写反応を行い RN Aを合成する工程；

(3) 工程（2) で得た RN Aの 3' 末端を核酸誘導体で修飾する工程；及ぴ

(4) 工程（3) で得た 3' 末端を核酸誘導体で修飾した RNAを、無細胞翻訳系または生細胞において発現させる工程を含む、タンパク質とそれをコードする核酸との複合体の製造方法が提供される。

好ましくは、核酸誘導体は、ピューロマイシン、 3， -N-アミノアシルピュー口マイシンァミノヌクレオシド、 3， - N -ァミノァシルアデノシンァミノヌクレオシドの化学構造骨格を含む化合物又はそれらの類縁体である。

好ましくは、 mRNAとして、 3，末端に核酸誘導体がスぺーサーを介して結合している mRN Aを使用する。

好ましくは、スぺーサ一はポリエチレン又はポリエチレンダリコールなどの高分子である。図面の簡単な説明

図 1は、従来の in vitro virus virionの精製技術の具体例を示す。

図 2は、本発明による Y—ライゲーション法を用いた in vitro virusのゲノム構築の模式図である。

図 3は、本発明で使用可能な核酸構築物の構造を示す。

図 4は、本発明で使用可能な核酸構築物の具体例を示す。

図 5は、ライゲーシヨン前の mR NA、及び RT- thioとのライゲーシヨン後の m R N Aを電気泳動した結果を示す図である。

図 6は、ライゲーシヨン後の m R N Aの逆転写産物（レーン 3 )、及ぴそれを R ase Hで処理した産物（レーン 2 ) を電気泳動した結果を示す図である。

図 7は、ライゲーシヨン前の m R NA、及ぴ Hybri spacerとのライゲーシヨン後の m R N Aを電気泳動した結果を示す図である。

図 8は、ライゲーション産物を無細胞翻訳系に添加して得られる翻訳産物を 1 5 % S D S—ポリアクリルアミドゲルで電気泳動した結果を示す図である。

図 9は、 mRNAと本発明の T- Spacer (T- splint3FA)とのライゲーションの結果を示す図である。

図丄 CUa-、本発明の T一 Spacerを含む in vitro virus genomeを用レヽて in vitro virus virionを开$成した結果を示す。

図 1 1 fま、本発明の T— Spacerを含む in vitro virus genomeを逆早s吞した結果を示す。

図 1 2は、本発明の T- Spacerを含む in vitro virus genomeを用いて作製した in vitro virus virionを逆した結果を示す。

図 1 3は、 T - spacer (親和性物資としてビォチンを使用）を用いて in vitro virusを精製した結果を示す。

図 1 4は、 T- spacer (親和性物資として Poly Aを使用）を用いて in vitro virus を精製した結果を示す。

図 1 5は、本発明の方法に従い Pool (ネガティブコントロール ZP0U) から protein Aの B ドメインを選択した結果を示す。

図 1 6は、本発明の方法に従い Pool (ネガティブコントロール ZP0U) から protein Aの B ドメインを選択した結果を示す。

図 1 7は、実施例 4で合成した ZF-puromycin CPGを用いたスぺーサーを電気泳動した結果を示す。

図 1 8は、本発明の概要の模式図を示す。

図 1 9は、本発明の一実施例として糖鎖結合ぺプチドのスタリ一ニングの模式図を示す。

図 2 0は、 DNA"T7- Kozac"、 DNA "Lec- random"及ぴ支持体のコンスタントな配列を持つ DNA "Pou"の構築を示す。

図 2 1は、連結産物" T' 7- Lec- random"を 8 M尿素変性ァクリルァミド電気泳動で解析した結果を示す。

図 2 2は、連結産物〃T' 7-Lec- random-Pou"を 8 M尿素変性ァクリルァミド電気泳動で解析した結果を示す。

図 2 3は、 T， 7- Lec- random- Pouの転写産物を 8 M尿素変性ァクリルァミド電気泳動で解析した結果を示す。

図 2 4は、糖鎖ぺプチドのスクリ一二ングの結果を示す。

図 2 5は、糖鎖ぺプチドのスクリ一二ングの結果として取得された配列をシークエンスした結果を示す。括弧は水素結合できるアミノ酸を示す。選択前より選択後の方が、水素結合可能なアミノ酸を多く含む配列が選択されてきている。発明を実施するための最良の形態

以下、本発明の実施の形態についてより詳細に説明する。

( I ) R NA- D N A結合体の製造方法およびその利用

本発明による R N A— D N A結合体の製造方法は、

( 1 ) 互いに相補的な配列を有する一本鎖 R NAと一本鎖 D N A又はその誘導体とをァエーリングさせる工程；及び

(2) アニーリング産物を RNAリガーゼで処理して、一本鎖 RNAの 3，末端と一本鎖 DNA又はその誘導体の 5，末端とを連結する工程：

を含むことを特徴とする。

本発明の方法では、結合するべき一本鎖 RNAと一本鎖 DNA (又はその誘導体）は互いに相捕的な配列を有することが必要である。互いに相補的な配列を有する一本鎖 R N Aと一本鎖 D N Aとを好適な条件下でァニーリングすることにより両者を会合させ、次いで、 RNAリガーゼで処理することにより両者を効率よく連結することができる。

本発明の方法は、 Y—ライゲーシヨン法で DN A同志を連結させる方法を発展させたものである。本発明では、連結すべき核酸の片方を RNAにすることによつて得られた RNA— DNA結合体を新しい用途に用いることにより、効率の良い新規の in vitro virus genome ( Nemoto, N. , et, al. (1997) FEBS Lett. 414, 405-408. )の構築法を提供することが可能になる。

本発明の方法では、 Y—ライゲーシヨン法により RNAの 3 ' 末端と、その R N A中の配列と相補的な配列を有する D N Aの 5，末端とを R N Aリガーゼで共有結合させる。本発明の方法で用いる RNAは一本鎖 RNAであり、より具体的には、蛋白質をコードするコード配列を含む RNAであることが好ましく、また 3' 末端側に 5' から 3' 方向にアニーリング配列とブランチ配列とを有することが好ましい。

本明細書で言うブランチ配列とは、一本鎖 RN A及び一本鎖 DN A又はその誘導体中のアニーリング配列同士がアニーリングした際に互いにアニーリングせず、一本鎖の状態で存在する配列である。一本鎖 RN A及び一本鎖 DN A又はその誘導体中におけるブランチ配列の長さは、両者を RN Aリガーゼ処理により連結できる程度の長さであれば特に限定されない。一般にブランチ配列の長さは短い;^ が連結効率は高いが、上限は特に制限されない。ブランチ配列の長さは、好ましくは 1から 100塩基、より好ましくは 1から 10塩基程度である。両核酸中の己列の長さは同一でも異なっていてもよい。

本明細書で言ぅァニーリング配列とは、結合すべき D N Aとァニーリングすることができる配列であり、一本鎖 R N A中のァニーリング配列に相補的な配列力結合すべき一本鎖 D NA中に存在することになる。アニーリング配列の長さは、両鎖がハイブリダイズすることができるのに十分な長さであれば特に限定されないが、一般的には 1 0から 5 0塩基、より好ましくは 1 0から 3 0塩基程度である。

本発明の方法で結合される一本鎖 R N Aと一本鎖 D N A又はその誘導体は互ヽに相補的な配列を有することにより、両者は一定の条件下でァニーリングすることが可能になる。より詳細には、一本鎖 R NA中のアニーリング配列と、一本鎖 D N A又はその誘導体中の上記アニーリング配列と相補的な配列とがハイブリダィズすることにより両配列は二本鎖を形成する。その際、一本鎖 R NA中のブランチ配列と一本鎖 D N A又はその誘導体中のブランチ配列は一本鎖のまま存在するため、これらの部分は全体としては Y字の形を形成することになる（図 2の一番上の図を参照）。Y—ライゲーション法という名称はこの構造体の形に由来する。この方法の特徴は 2種の核酸を連結する反応を分子間反応から分子内反応としたことにより連結効率を向上させることができる点にある。従って、低濃度の基質についても応用することが可能である。

本発明の方法では先ず、上記した互いに相補的な配列を有する一本鎖 R N Αと一本鎖 D N A又はその誘導体（以下、これらをまとめて「一本鎖核酸」と称することがある）とをァユーリングさせる。

アニーリングは上記した 2種の一本鎖核酸を適当な緩衝液（以後の操作の便宜上から言うと、 RN Aリガーゼ用の緩衝液が好ましい）に溶解し、高温から段階的に低温にすることにより行なうことができる。このような温度変化は P C R装置などを用いて行なうこともできる。アニーリング条件の一例としては、 9 4 ¾ から 2 5 °Cまで 1 0分かけて冷却するという条件が挙げられるが、これは一例にすぎず、温度おょぴ時間は適宜変更することができる。アニーリングの条件（緩衝液の組成、アニーリング温度、及びアニーリング時間など）は、アニーリング配列の長さや塩基組成などに応じて適宜設定することができる。

アニーリング反応における一本鎖 RNAと一本鎖 DNA又はその誘導体のモル比はアニーリング反応が進行する限り、特に限定されないが、反応効率の観点からは、 1 ： 1〜1 ： 2. 5程度であることが好ましい。

一本鎖 RN Aと一本鎖 DNA又はその誘導体とのアニーリング後、ァニーリング産物は RNAリガーゼで処理して、一本鎖 RNAの 3，末端と一本鎖 DN A又はその誘導体の 5，末端とが連結される。

本発明で用いる RN Aリガーゼは 2つの一本鎖核酸同士を連結できるものであればよく、好ましくは T 4 RNAリガーゼを使用できる。

なお、アニーリングの際の溶液として RNAリガーゼの緩衝液として適当なものを使用した場合には、ァニーリング生成物を含む溶液をそのままリガーゼ反応に使用することができ、そうでない場合には、アニーリング生成物を通常の核酸精製方法により回収した後、 RNAリガーゼ用の緩衝液に溶解してリガーゼ反応用の溶液を調製する。

連結反応（リガーゼ反応）の条件は、使用する RNAリガーゼの活性が発揮される条件であればよく、例えば、好適な緩衝液（例えば、 T4 RNA ligase buffer (50mM Tris-HCl, pH7.5, lOraM MgCl₂, lOmM DTT, lmM ATP)など）中で、 25 °Cの温度一定で反応させたり、あるいは 25°Cで 30分間と 45°Cで 2分間のサイクルを反復した後に 25°Cで 30分間反応させたりすることができる。ここに示した温度及ぴ反応時間は一例に過ぎず反応効率が高くなるように適宜設定変更することができる。

反応後にフエノール抽出及びエタノール沈殿などの常法により反応生成物を精製することにより、 RNA— DNA結合体を得ることができる。このようにして得られる RNA—DN A結合体自体も本発明の範囲内である。

本発明で用いる一本鎖 R N Aの種類は特に限定されず、天然の組織又は細胞由来の RNAでも、 DNAからインビトロで発現させた RNAでもよい。また、一本鎖 R NAの構成要素である核酸の全てがリボヌクレオチドである必要はなく、その一部のみが R NAタイプであるものでもよく、それ以外の領域は、でもよい。また、ペプチドでも糖などが結合したものでもよい。

本発明で用いる一本鎖 R N Aの長さは、連結反応が可能である限り、特に限定されない。一般的には、一本鎖 R NAの長さは、数十塩基から数十キロ塩基程度であり、例えば 1 0塩基から 5 0， 0 0 0塩基程度であり、より好ましくは 2 0 塩基から 1 0， 0 0 0塩基程度である。

本発明で用いる一本鎖 R NAは、蛋白質をコードする配列を含むことが好ましく、具体的には mR NA又は mR NAライブラリーであることが好ましい。

本発明の方法で得られる R NA— D N A連結体をタンパク質翻訳系に導入するような場合には、連結すべき一本鎖 R NAは、（1 ) プロモーター配列、（2 ) 翻訳の際にリボソームによって認識される塩基配列、及び（3 ) 目的タンパク質をコードする配列が含まれていることが好ましい。さらに、 F L A G、 H i sタグ等のタグ配列をコードする配列あるいは P C Rにより増幅するための共通配列を含むことができる。

プロモータ一配列の種類は、適用する発現系に適したものを適宜選択すればよく特に限定されない。例えば、大腸菌ウィルス T7の RNA polymeraseによって認識される T7 プロモーター配列あるいは S P 6プロモーター配列などが挙げられる。

翻訳の際にリボソームによって認識される D NA配列としては、翻訳の際に真核細胞のリボソームによつて認識される R N A酉 5列 (Kozak配列）に対応する D N A配列や原核細胞のリボソームによつて認識されるシャイン ·ダルガノ配列

(Shine- Dalgarno)、オメガ配歹 IJ等の tabacco mosaic virusのリボソームによつて認識される配列、 rabbit β一 globlin、 Xenopus β -globlin あるいは bromo mosaic virusのリボゾーム認識領域などが挙げられる。

目的タンパク質をコードする配列の種類は特に限定されず、目的に応じて適宜選択できる。

本発明で用いる一本鎖 D NA又はその誘導体としては、天然由来の D NAから作成した一本鎖 D N Aでもよいし、遺伝子組換え技術により作成した一本鎖 D N Aでもよいし、化学合成により作成した一本鎖 D NAでもよい。

また、一本鎖 D N Aの構成要素である核酸の全てがデォキシリボヌクレオチドである必要はなく、その一部のみが D NAタイプであるものでもよく、それ以外の領域は、リポヌクレオチドでもデォキシリボヌクレオチドでも P N Aタイプでもよレ、。また、ペプチドでも糖などが結合したものでもよレ、。

本発明で用いる一本鎖 D NA又はその誘導体の長さは、連結反応が可能である限り、特に限定されない。一般的には、一本鎖 D NAの長さは、数塩基から数百塩基程度であり、例えば 1 0塩基から 5 0 0塩基程度であり、より好ましくは 2 0塩基から 2 0 0塩基程度である。

本発明の方法では、一本鎖 D N A又はその誘導体として、 3，末端に核酸誘導体が結合している一本鎖 D N Aの誘導体を使用することが好ましい。

このような一本鎖 D N Aの誘導体を使用して無細胞タンパク質翻訳系又は生細胞中でタンパク質の翻訳を行った場合、 2本鎖でリボソームを止め、ピューロマイシンがリボソームの Aサイトに入れることによりタンパク質と結合させることができる（図 2を参照)。

この核酸誘導体としては、無細胞タンパク質翻訳系又は生細胞中でタンパク質の翻訳が行われた時に、合成されたタンパク質の C末端に結合する能力を有する化合物である限り限定されなレ、が、その 3 '末端がアミノアシル tRNAに化学構造骨格が類似しているものを選択することができる。代表的な化合物として、アミド結合を有するピューロマイシン（Puromycin)、 3， -N-アミノアシルピューロマィシンァミノヌクレ才シド (3， -N-Aminoacylpuromycin aminonucleoside、 PANS— アミノ酸）、たとえば、ァミノ酸部がグリシンの PANS-Gly、ァミノ酸部がバリンの PANS-Val、ァミノ酸部がァラ二ンの PANS - Ala、その他、ァミノ酸部が全ての各アミノ酸に対応する PANS—アミノ酸化合物が挙げられる。また、 3，一アミノアデノシンのァミノ基とアミノ酸のカルボキシル基が脱水縮合して形成されるアミド結合で連結した 3， - N -ァミノアシルァデノシンアミノヌクレオシト (3， -Aminoacyladenosine aminonucleoside, AANS—ァ ^ノ酸八ァことえば、ァミノ酸部がグリシンの AANS- Gly、ァミノ酸部がバリンの AANS- Val、ァミノ酸部がァラニンの NS- Ala、その他、アミノ酸部が全アミノ酸の各アミノ酸に対応する AANS-ァミノ酸化合物を使用できる。

また、ヌクレオシドあるいはヌクレオシドとアミノ酸のエステル結合したものなども使用できる。さらにまた、核酸あるいは核酸に類似した化学構造骨格及び塩基を有する物質と、アミノ酸に類似した化学構造骨格を有する物質とを化学的に結合した化合物は、すべて本方法において用いられる核酸誘導体に含まれる。核酸誘導体としては、ピューロマイシン、 P AN S—アミノ酸もしくは AAN S—アミノ酸がリン酸基を介してヌクレオシドと結合している化合物がより好ましい。これらの化合物の中でピューロマイシン、リポシチジルピューロマイシン、デォキシシチジルピューロマイシン、デォキシゥリジルピューロマイシンなどのピューロマイシン誘導体が特に好ましい。

本発明の方法では、一本鎖 D N A又はその誘導体として、 3，末端に核酸誘導体がスぺーサーを介して結合している一本鎖 D NA又はその誘導体を使用することが好ましい。

スぺーサ一としては、ポリエチレン又はポリエチレングリコールあるいはその誘導体などの高分子物質や、オリゴヌクレオチドゃぺプチドあるいはその誘導体などの生体高分子物質等が用いられ、好ましくはポリエチレングリコ一ルが用レヽられる。スぺーサ一の長さは特に限定されなレ、が、好ましくは、分子量 1 5 0〜 6 0 0 0である力、または主鎖の原子数は 1 0原子から 4 0 0原子であり、さらに好ましくは、分子量 6 0 0〜3 0 0 0である力、または主鎖の原子数が 4 0原子から 2 0 0原子である。スぺーサ一には、デォキシリポヌクレオチドなどの核酸おょぴその誘導体、フルォレセイン等の蛍光色素およびその誘導体、ピオチン等の親和性物質およびその誘導体、あるいは生化学または化学反応により切断される結合を持つ物質、例えば、 5—置換一 2—二トロアセトフヱノン誘導体などの光分解性物質等を含むことができる。

上記したような一本鎖 D N Aの誘導体は、それ自体既知の化学結合方法によつて製造することができる。具体的には、リン酸ジエステル結合で合成ュニットを結合させる場合は、 D N A合成機に一般的に用いられているホスホアミダイド法などにより固相合成で合成することが可能である。ぺプチド結合を導入する場合は、活性エステル法などにより合成ユニットを結合させるが、 D NAとの複合体を合成する場合は、両方の合成法に対応が可能な保護基が必要になる。

本発明の方法で得られる R NA— D N A連結体は、これをタンパク質翻訳系に導入してタンパク質に翻訳することにより R N A—タンパク質複合体が形成されるが、この中には R NAが含まれ、これを逆転写反応に付することにより R N A に相補的な D N A配列を含む結合体を製造することが可能である。

即ち、上記した R N Aと D N Aとの Y—ライゲーシヨン法による連結反応後に、該連結体をタンパク質翻訳系に導入して R N Aをタンパク質に翻訳し、さらにその後に逆転写酵素を用いて反応させると R NAから D NAへの転写反応により R NA—D NA—タンパク質連結体を製造することができる。このような逆転写反応を意図する場合、一本鎖 D N A又はその誘導体の 3 ' 末端に、一本鎖 R NAの逆転写の際にプライマーとして作用する配列を存在せしめておくことが好ましい。このようなプライマー配列を存在させておくことにより、プライマーを新たに添加することなく逆転写反応を行なうことができる。

本発明の好ましい態様によれば、一本鎖 D NAの誘導体として、一本鎖 R NA の 3，末端側の配列に相補的な一本鎖 D N A配列を含み、該 D N A配列の 3，末端に、該一本鎖 R NAの逆転写のためのプライマー配列を有し、さらに核酸誘導体を末端に有するスぺーサ一が枝分かれした状態で該一本鎖 D N A配列のレ、ずれかに結合している核酸構築物を使用することができる。なお、このような核酸構築物は T字型の構造を有するため、本明細書においては、 T- Spacer とも称する。このような T- Spacerの具体例を図 4に示す。なお、本明細書で言う「一本鎖 R NAの逆転写のためのプライマー配列」とは、核酸構築物（T- Spacer) と一本鎖 R NAとのライゲーシヨンにより得られる本発明の核酸構築物を逆転写反応系に導入した場合に、逆転写反応を開始するためのプライマー配列として作用する塩基配列を意味し、一般的には、一本鎖 R NAの配列と相補的な配列から構成されることが好ましい。

さらに、本発明によれば、本発明の方法で得られる R NA— D NA結合体をタンパク質翻訳系に導入して一本鎖 R NAをタンパク質に翻訳することを特徴とする、 R NAと該 R NAによりコードされるタンパク質から成る R NA—タンパク質複合体の製造方法、並びに当該製造方法により製造される R NA—タンパク質複合体が提供される。

核酸からそれがコードするタンパク質を人工的に生成させるための転写翻訳系は当業者に公知である。具体的には、適当な細胞よりタンパク質合成能を有する成分を抽出し、その抽出液を用いて目的の蛋白質を合成させる無細胞蛋白質合成系が挙げられる。このような無細胞蛋白質合成系には、リボゾーム、開始因子、伸長因子及び t R NA等の転写 ·翻訳系に必要な要素が含まれている。

このような無細胞蛋白質合成系（細胞溶解物由来の系）としては、原核又は真核生物の抽出物により構成される無細胞翻訳系が挙げられ、例えば大腸菌、ゥサギ網状赤血球抽出液、小麦胚芽抽出液などが使用できるが、 D NA又は R NAから目的とする蛋白質を産生するものであればいずれでもよい。また、無細胞翻訳系はキットとして市販されているものを使用することができ、例えば、ゥサギ網状赤血 ¾佃出液 (Rabbit Reticulocyte Lysate Systems, Nuclease Treated, Promega)や小麦胚芽抽出液（PR0TEI0S, T0Y0B0; Wheat Germ Extract, Promega) などが挙げられる。

タンパク質翻訳系としては、生細胞を使用してもよく、具体的には、原核又は真核生物、例えば大腸菌の細胞などが使用できる。

無細胞翻訳系又は生細胞などは、その中にタンパク質をコードする核酸を添加又は導入することによってタンパク質合成が行われるものである限り制限されなレ、。

本発明では、 RNA— DNA連結体を上記したようなタンパク質翻訳系に導入して一本鎖 RNAをタンパク質に翻訳した後、リボゾームを除去することによつて、 RNAと該 RNAによりコードされるタンパク質から成る RNA—タンパク質複合体を製造することができる。

さらに本発明によれば、上記で得られる RNA—タンパク質複合体を逆転写反応に付することを特徴とする、 DNAと該 DNAによりコードされるタンパク質から成る核酸一タンパク質複合体の製造方法、並びに当該製造方法により製造される核酸一タンパグ質複合体が提供される。

即ち、 RNAと該 RNAによりコードされるタンパク質から成る RNA—タンパク質複合体を逆転写酵素で処理することにより、 RNAから D N Aへの逆転写が起こり、 DNAと該 DNAによりコードされるタンパク質から成る RNA— D NA—タンパク質複合体が製造されることになる。さらに得られた RNA— DN A—タンパク質複合体の RN Aを RNA分解酵素などを用いて分解することによれば DNA—タンパク質複合体が製造される。本明細書では、上記 RNA— DN A—タンパク質複合体おょぴ D N A—タンパク質複合体をあわせて「核酸一タンパク質複合体」と称することがある。

上記のようにして得られる、 RN A—タンパク質複合体及び核酸一タンパク質複合体は、核酸の機能の解析などにおいて有用な材料を提供するものである。

(I I) 核酸構築物およびその利用

(1) 本発明の核酸構築物

本発明の核酸構築物は、一本鎖 RN Aとそれがコードするタンパク質との複合体又は核酸一タンパク質複合体を作製するために使用するものであり、その構造は、一本鎖 RNAの 3，末端側の酉己列とァニーリングすることができる一本鎖 D N A配列を 3，末端側に含み、該一本鎖 DN A配列の 3，末端に、該一本鎖 RN Aの逆転写のためのプライマー配列を有し、さらに核酸誘導体を末端に有するスぺーサ一が該一本鎖 D NAのいずれかに枝分かれした状態で結合しており、該ー本鎖 D NA配列の 5，末端側に親和性物質が結合していることを特徴とする。親和性物質は、 R N A—タンパク質複合体又は核酸一タンパク質複合体を固相に結合させるためや、精製を行なうために用いられる。

本発明の核酸構築物の一例の模式図を図 ₃に示す。図 ₃に示す核酸構築物は、固定化した R NA—タンパク質複合体又は核酸一タンパク質複合体（以下、これらを「in vitro virus virionj と称することがある。）を親和性物質を介して結合している固相（支持体）上から切り離すための制限酵素認識部位をもつ 2本鎖 D NAと、親和性物質としてピオチンまたは poly Aを有している。なお、図 3は、該核酸構築物に一本鎖 R NA (mR NA) をアニーリングさせた状態を示している。

親和性物質を in vitro virus virionの精製に用いる例としては、親和性物質として polyAを用いる場合、 dTカラムによって精製する方法や、親和性物質として His - tagを用いる場合は N iを用いて精製する方法、並びに親和性物質として FLAGペプチドを用いる場合はこの抗体を用レ、て精製する方法などがある。

本発明の核酸構築物の具体例の構造を図 4に示す。一本鎖 D N A配列の 5 ' 末端側の構造としては、一本鎖 D N A配列がループ領域を介して互いに相補的な二本鎖配列を形成しており、該ループ領域に親和性物質が結合しており、該ニ本鎖配列中に制限酵素認識部位が存在している構造（図 4の T- splintlFB、 T-splint4FB) あるいは、相補 DNA鎖と化学的に結合して互いに相補的な二本鎖配列を形成しており、該相補 D N A鎖の 3 '末端に親和性物質が結合しており、該ニ本鎖配列中に制限酵素認識部位が存在している構造（図 4の T- splint3FB、 T - splint3FA、 T - splint6FB、 T- splint6FA) などが挙げられる。

なおここで言う「化学的に結合」の具体例としては、 Psoralenを有する核酸と別の核酸とを混合して、紫外線を照射することによって両核酸を化学的に結合する場合、架橋剤により結合する場合、 R N Aリガーゼなどによつて結合する場合、あるいは前述の Y—ライゲーシヨンによって結合する場合などが挙げられる。架橋剤として具体的には、 N— （6—マレイミドカプロィルォキシ）スクシイミド等の 2価性試薬が挙げられる。

以下、本発明の核酸構築物の各構成要素について説明する。

(RNAに相補的な一本鎖 D N A配列）

本発明の核酸構築物は、一本鎖 RN Aの 3，末端側の配列とァニーリングすることができる一本鎖 DNA配列を 3，末端側に含む。これにより、本発明では、互いに相補的な配列を有する一本鎖 R N Aと一本鎖 D N Aとを好適な条件下でァニーリングすることにより両者をアニーリングさせ、次いで、 RNAリガーゼで処理することにより両者を効率よく連結することができる。

一本鎖 RNAの 3，末端側の配列とアニーリングすることができる一本鎖 DN A配列とは、互いにアニーリングすることができる配列であり、 RNA配列に相捕的な配列を有する DN A配列を言う。このような相捕的な配列の長さは、両鎖がアニーリングすることができるのに十分な長さであれば特に限定されないが、一般的には 10から 50塩基、より好ましくは 10から 30塩基程度である。本発明で用いる一本鎖 DN Aとしては、天然由来の DN Aから作成した一本鎖

DNAでもよいし、遺伝子組換え技術により作成した一本鎖 DN Aでもよいし、化学合成により作成した一本鎖 DN Aでもよい。

また、一本鎖 DN Aの構成要素である核酸の全てがデォキシリボヌクレオチドである必要はなく、その一部のみが DNAタイプであるものでもよく、それ以外の領域は、リボヌクレオチド（2' — O—メチルリボヌクレオチドなどの RN A タイプ）でもデォキシリボヌクレオチド誘導体でも PNAタイプでもよレ、。また、ぺプチドでも糖などが結合したものでもよレ、。

本発明で用いる一本鎖 DN Aの長さは、特に限定されないが、一般的には、数塩基から数百塩基程度であり、例えば 10塩基から 500塩基程度であり、より好ましくは 20塩基から 200塩基程度である。

(プライマー配列）

本発明の核酸構築物の一本鎖 DN A配列の 3，末端には、 RNAの逆転写のためのプライマー配列が結合している。

本明細書で言う「一本鎖 R NAの逆転写のためのプライマー配列」とは、核酸構築物（T - Spacer) と一本鎖 R NAとのライゲーシヨンにより得られる核酸構築物を逆転写反応系に導入した場合に、逆転写反応を開始するためのプライマー配列として作用する塩基配列を意味し、一般的には、一本鎖 R NAの配列と相補的な配列から構成されることが好ましい。

このような R NAの逆転写のためのプライマーを有することにより、本発明の核酸構築物を用いれば R NA—タンパク質複合体の R N Aの D N A化も容易に可能である。即ち、本発明の核酸構築物は、逆転写プライマーの役割も持っため、 in vitro virus virion をカラム等の固相に固定化するなどしてバッファー交換後、ただちに逆転写して R N Aを D N A化し、 in vitro virus virion を安定ィ匕することができる。従来の in vitro virus virionではタンパク質翻訳系の反応液中から精製できず、しかも外から添加した逆転写プライマーを一本鎖 R NAにハイブリダィゼーションさせるために温度を上げることが必要であつたが、これは連結させたタンパク質を変性させる可能性があり大きな問題となっていた。本発明の核酸構築物ではこのような問題がなく、 in vitro virus virion の D NA 化による安定化が容易である。

(核酸誘導体を末端に有するスぺーサ一）

本発明の核酸構築物の一本鎖 D N A配列には、核酸誘導体を末端に有するスぺーサ一が、枝分かれした状態で結合している。

このような一本鎖 D N Aの誘導体を使用して無細胞タンパク質翻訳系又は生細胞中でタンパク質の翻訳を行った場合、 2本鎖でリボソームを止め、核酸誘導体 (例えば、ピューロマイシンなど）がリボソームの Aサイトに入れることによりタンパク質と結合させることができる。

この核酸誘導体としては、無細胞タンパク質翻訳系又は生細胞中でタンパク質の翻訳が行われた時に、合成されたタンパク質の C末端に結合する能力を有する化合物である限り限定されなレ、が、その 3 '末端がアミノアシル tRNAに化学構造骨格が類似しているものを選択することができる。代表的な化合物として、アミド結合を有するピューロマイシン（Puromycin)、 3，アミノアシルピューロマィンンァノヌクレオシド (3， -N-Aminoacylpuromycin aminonucleoside、 PANS— アミノ酸）、たとえば、アミノ酸部がグリシンの PANS- Gly、アミノ酸部が/ リンの PANS - Val、アミノ酸部がァラニンの PANS - Ala、その他、アミノ酸部が全ての各アミノ酸に対応する PANS—アミノ酸化合物が挙げられる。

また、 3，一アミノアデノシンのァミノ基とアミノ酸のカルボキシル基が脱水縮合して形成されるアミド結合で連結した 3 ' -N-アミノアシルアデノシンアミノヌクレ Γシド (3， -Aminoacyladenosine aminonucleoside, AA S—ァミノ酸)、にとえば、ァミノ酸部がグリシンの AANS - Gly、ァミノ酸部がバリンの AA S - Val、ァミノ酸部がァラニンの S - Ala、その他、アミノ酸部が全アミノ酸の各アミノ酸に対応する AANS -ァミノ酸化合物を使用できる。

また、ヌクレオシドあるいはヌクレオシドとアミノ酸のエステル結合したものなども使用できる。さらにまた、核酸あるいは核酸に類似した化学構造骨格及び塩基を有する物質と、アミノ酸に類似した化学構造骨格を有する物質とを化学的に結合した化合物は、すべて本発明で用いられる核酸誘導体に含まれる。

核酸誘導体としては、ピューロマイシン、 P AN S—アミノ酸もしくは AAN S—アミノ酸がリン酸基を介してヌクレオシドと結合している化合物がより好ましい。これらの化合物の中でピューロマイシン、リボシチジルピューロマイシン、デォキシシチジルピューロマイシン、デォキシゥリジルピューロマイシンなどのピューロマイシン誘導体が特に好ましい。

本発明では、核酸誘導体はスぺーサーを介して一本鎖 D N Aに結合している。スぺーサ一としては、ポリエチレン又はポリエチレングリコールあるいはその誘導体などの高分子物質や、オリゴヌクレオチドゃぺプチドあるいはその誘導体などの生体高分子物質等が用いられ、好ましくはポリエチレングリコールが用いられる。スぺーサ一の長さは特に限定されないが、好ましくは、分子量 1 5 0〜6 0 0 0である力、または主鎖の原子数は 1 0原子から 4 0 0原子であり、さらに好ましくは、分子量 6 0 0〜3 0 0 0である力、、または主鎖の原子数が 4 0原子から 2 0 0原子である。

上記したような核酸誘導体は、それ自体既知の化学結合方法によって製造することができる。具体的には、リン酸ジエステル結合で合成ュニットを結合させる場合は、 D NA合成機に一般的に用いられているホスホアミダイド法などにより固相合成で合成することが可能である。ペプチド結合を導入する場合は、活性ェステル法などにより合成ュニットを結合させるが、 D NAとの複合体を合成する場合は、両方の合成法に対応が可能な保護基が必要になる。

(制限酵素認識部位）

本発明の核酸構築物の好ましい態様においては、 5 ' 末端側には、制限酵素認識部位が存在する。 5 ' 末端側とは親和性物質に隣接する位置を意味する。制限酵素認識部位は通常は、 DNA の 2本鎖から構成される。このような制限酵素認識部位を導入することにより、 in vitro virus virion を親和性物質から切り離すことができる。例えば、 in vitro virus virion を親和性物質を介して固相に結合させている場合、 in vitro virus virion を固相（支持体）上から切り離すことが可能になる。即ち、親和性物質同士（例えば、ビォチン一ストレブトァビジンなど）の結合等により支持体に強く結合した in vitro virus virionを 3 7 °C という温和な条件下で制限酵素によって切り離し精製する.ことができる。制限酵素認識部位の配列は特に限定されず、 PvuII など任意の制限酵素認識配列を使用することができる。

(親和性物質）

本発明の核酸構築物には、親和性物質が結合している。親和性物質を導入することにより、本発明の核酸構築物を作成した in vitro virus virion並びにそれを用いた作成した各種核酸構築物を固相（支持体）に容易に結合させることができる。親和性物質の種類は特に限定されないが、例えば、ビォチン、ポリ A、各種の抗原又は抗体、 FLAG、 His タグなどが挙げられる。親和性物質は核酸構築物に上記したようなスぺーサーを介して結合していてもよい。 (2) RNA— DNA結合体とその製造

本発明によれば、上記 (1) に記載した核酸構築物と一本鎖 RNAとをァニーリングさせ、該核酸構築物の二本鎖領域の 5 ' 末端と一本鎖 RN Aの 3，末端とをライゲーションさせることを特徴とする、 RNA— DNA結合体の製造方法、並びに当該製造方法により製造される RNA—DNA結合体が提供される。

本発明では、互いに相補的な配列を有する一本鎖 RNAと一本鎖 DNAとを好適な条件下でアニーリングすることにより両者をアニーリングさせ、次いで、 R NAリガーゼで処理することにより両者を効率よく連結することができる。

本発明の方法では先ず、上記した互いに相補的な配列を有する一本鎖 R N Aと本発明の核酸構築とをアニーリングさせる。

アニーリングは上記した 2種の核酸を適当な緩種 ϊ液（以後の操作の便宜上から言うと、 RN Aリガーゼ用の緩種夜が好ましい）に溶解し、高温から段階的に低温にすることにより行なうことができる。このような温度変化は P C R装置などを用いて行なうこともできる。アニーリング条件の一例としては、 94°Cから 2 5°Cまで 10分かけて冷却するという条件が挙げられる力これは一例にすぎず、温度おょぴ時間は適宜変更することができる。アニーリングの条件（緩衝液の組成、アニーリング温度、及ぴアニーリング時間など）は、アニーリング酉 δ列の長さや塩基組成などに応じて適宜設定することができる。

アニーリング反応における一本鎖 RNAと、核酸構築物とのモル比はァニーリング反応が進行する限り、特に限定されないが、反応効率の観点からは、 1 ： 1 〜1 ： 2. 5程度であることが好ましい。

一本鎖 RN Αと核酸構築物とのアニーリング後、アニーリング産物では、一本鎖 RNAの 3，末端と核酸構築物の 5' 末端とが連結される。この連結は、一本鎖 RNAの 3' 末端と核酸構築物の 5' 末端とが連結すればいずれの方法によつてもよいが、例えば、 RNAリガーゼ、架橋剤等、上述の「科学的結合」を行う具体例に挙げた方法等を用いることができる。

本発明で用いる R N Aリガーゼは 2つの一本鎖核酸同士を連結できるものであればよく、好ましくは T 4 R NAリガーゼを使用できる。

なお、アニーリングの際の溶液として R NAリガーゼの緩衝液として適当なものを使用した場合には、ァニーリング生成物を含む溶液をそのままリガーゼ反応に使用することができ、そうでない場合には、アニーリング生成物を通常の核酸精製方法により回収した後、 R N Aリガーゼ用の緩衝液に溶解してリガーゼ反応用の溶液を調製する。

連結反応（リガーゼ反応）の条件は、使用する R NAリガーゼの活性が発揮される条件であればよく、例えば、好適な緩衝液（例えば、 T4 RNA ligase buffer (50m Tris-HCl, pH7. 5, lOmM MgCl₂, lOmM DTT, IraM ATP)など）中で、 2 5 °Cの温度一定で反応させたり、あるいは 2 5 °Cで 3 0分間と 4 5 °Cで 2分間のサイクルを反復した後に 2 5 °Cで 3 0分間反応させたりすることができる。ここに示した温度及び反応時間は一例に過ぎず反応効率が高くなるように適宜設定変更することができる。

反応後にエタノール沈殿などの常法により反応生成物を精製することにより、 R NA— D NA結合体を得ることができる。このようにして得られる R NA— D N A結合体自体も本発明の範囲内である。

本発明で用いる一本鎖 R N Aの種類は特に限定されず、天然の組織又は細胞由来の R NAでも、 D NAからインビトロで発現させた R NAでもよい。

また、一本鎖 R N Aの構成要素である核酸の全てがリボヌクレオチドである必要はなく、その一部のみが R NAタイプであるものでもよく、それ以外の領域は、でもよレ、。また、ペプチドでも糖などが結合したものでもよい。

本発明で用いる一本鎖 R NAの長さは、連結反応が可能である限り、特に限定されなレ、。一般的には、一本鎖 R NAの長さは、数十塩基から数十キロ塩基程度であり、例えば 1 0塩基から 5 0， 0 0 0塩基程度であり、より好ましくは 2 0 塩基から 1 0， 0 0 0塩基程度である。

本発明で用いる一本鎖 R N Aは、蛋白質をコードする配列を含むことが好ましく、具体的には mRNA又は mRNAライブラリ一であることが好ましい。

本発明の方法で得られる RNA— DNA連結体を転写翻訳系に導入するような場合には、連結すべき一本鎖 RNAは、（1) プロモーター配列、（2) 翻訳の際にリボソームによって認識される DN A配列、及ぴ（3) 目的タンパク質をコードする配列が含まれていることが好ましい。さらに、 FLAG、 H i sタグ等のタグをコードする配列、あるいは P C Rにより増幅するための共通配列を含むこともできる。

プロモーター配列の種類は、適用する発現系に適したものを適宜選択すればよく特に限定されない。例えば、大腸菌ウィルス T7の RNA polymeraseによって認識される T7プロモーター配列、 S P 6プロモーター配列などが挙げられる。翻訳の際にリボソームによって認識される DNA配列としては、翻訳の際に真核細胞のリボソームによつて認識される R N A配列（Kozak配列）に対応する D N A配列や原核細胞のリボソームによつて認識されるシャイン ·ダルガノ配列 (Shine-Dalgarno) オメガ配歹 lj等の tabacco mosaic virusのリボソームによつて認識される酉己列、 rabbit _globlin、 Xenopus β -globlin あるいは bromo mosaic virusのリボゾーム認識領域などが挙げられる。

(3) RNA—タンパク質複合体とその製造

さらに、本発明によれば、上記（2) に記載のRNA_DNA結合体をタンパク質翻訳系に導入して一本鎖 RNAをタンパク質に翻訳することを特徴とする、 RNAと該 RNAによりコードされるタンパク質から成る RNA—タンパク質複合体の製造方法、並びに当該製造方法により製造される RNA—タンパク質複合体が提供される。

核酸からそれがコードするタンパク質を人工的に生成させるための転写翻訳系は当業者に公知である。具体的には、適当な細胞よりタンパク質合成能を有する成分を抽出し、その抽出液を用いて目的の蛋白質を合成させる無細胞蛋白質合成系が挙げられる。このような無細胞蛋白質合成系には、リボゾーム、開始因子、伸長因子及ぴ t R N A等の転写 ·翻訳系に必要な要素が含まれている。

このような無細胞蛋白質合成系（細胞溶解物由来の系）としては、原核又は真核生物の抽出物により構成される無細胞翻訳系が挙げられ、例えば大腸菌、ゥサギ網状赤血球抽出液、小麦胚芽抽出液などが使用できるが、 D NA又は R NAから目的とする蛋白質を産生するものであればいずれでもよい。また、無細胞翻訳系はキットとして市販されているものを使用することができ、例えば、ゥサギ網状赤皿球抽出液 (Rabbit Reticulocyte Lysate Systems, Nuclease Treated, Promega)や小麦胚芽抽出液（PRETEIOS, TOYOBO； Wheat Germ Extract, Promega) などが挙げられる。

無細胞翻訳系又は生細胞などは、その中にタンパク質をコードする核酸を添カロ又は導入することによってタンパク質合成が行われるものである限り制限されなレ、。

本発明では、 R NA— D NA連結体を上記したような転写翻訳系に導入して一本鎖 R NAをタンパク質に翻訳した後、リボゾームを除去することによって、 R NAと該 R NAによりコードされるタンパク質から成る R NA—タンパク質複合体を製造することができる。

( 4 ) 逆転写反応とその産物

本発明によれば、上記（2 ) に記載の R N A— D N A結合体または上記（3 ) に記載の R N A—タンパク質複合体を逆転写反応に付することを特徴とする、核酸一タンパク質複合体の製造方法、並びに当該製造方法により製造される核酸一タンパク質複合体が提供される。

即ち、 R N A部分を含む核酸を逆転写酵素で処理することにより、 R NAから D NAへの逆転写が起こり、 R NA部分の塩基配列を D NAに転換することができる。逆転写反応に必要な試薬及ぴ反応条件は当業者に周知であり、必要に応じて適宜選択することができる。

( 5 ) 本発明の核酸構築物を用いて作製した核酸含有産物を固定化したチップ本発明によれば、上記（2 ) に記載の R NA— D NA結合体、上記（3 ) に記載の R NA—タンパク質複合体、並びに上記（4 ) に記載の核酸一タンパク質複合体を支持体上に固定ィヒしたチップが提供される。

本発明の核酸構築物には親和性物質が結合している。従って、この親和性物質に親和性を有する物質を予め固定化した支持体に、本発明の核酸構築物を用いて作製した上記の核酸一タンパク質複合体を接触させることにより、当該核酸一タンパク質複合体を支持体上に容易に固定ィ匕することができる。このようにして作製されるチップは、核酸の機能の解析などにおレ、て有用である。

親和性物質の組み合わせとしては、ビォチン /ストレプトァビジン、ポリ A配列ノオリゴ d T配列、抗原/抗体、 Hisタグ配列 ZN i、リガンド /レセプター、 F L AGZ抗 F L AG抗体などが挙げられるが、これらに限定されるものではなレ、。

チップの作製に用いる支持体としては、通常の核酸またはタンパク質の固定化に用いることができる支持体であれば特に限定されない。支持体としては、親和性物質同士の間の結合形成に悪影響を及ぼさないものであれば、その形状は特に限定されず、例えば、平板、マイクロウェル、ビーズ等の任意の形態をとることができる。支持体の材質としては、例えば、ガラス、セメント、陶磁器等のセラミックス；ポリエチレンテレフタレート、酢酸セ/レロース、ビスフエノーノレ Aのポリカーボネート、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート等のポリマー類；シリコン、活十生炭、多孔質ガラス、多孔質セラミックス、多孔質シリコン、多孔質活性炭、織編物、不織布、濾紙、短繊維、メンブレンフィルタ一等の多孔質物質を挙げることができる。

( I I I ) 核酸および/またはタンパク質の選択方法

( 1 ) R NA— D NA結合体を調製する調製工程本発明で用いる核酸構築物は、一本鎖 R N Aとそれがコードするタンパク質との結合体を作製するために使用するものであり、その構造は、一本鎖 RNAの 3' 末端側の配列とアニーリングすることができる一本鎖 DNA配列を 3，末端側に含む。該核酸構築物は、該一本鎖 DNA配列の 3' 末端に、該一本鎖 RNAの逆転写のためのプライマー配列を有し、核酸誘導体を末端に有するスぺーサ一が枝分力れした状態で結合している構造を有するものが好ましい。さらに、該一本鎖 DNA配列の 5，末端側に親和性物質が結合している構造を有するものも好ましい。このような核酸構築物の詳細は、本明細書中の上記 (I) および（I I) に記載した通りである。

(2) 核酸一タンパク質複合体を構築する構築工程

上記により製造した RNA— DN A結合体を翻訳系に導入して一本鎖 R N Aをタンパク質に翻訳する。

核酸からそれがコードするタンパク質を人工的に生成させるための転写翻訳系は当業者に公知であり、明細書中の上記 (I) および（I I) に記載した通りである。

本発明では、 RNA— DNA結合体（in vitro virus genome) を上記したような翻訳系に導入して一本鎖 RNAをタンパク質に翻訳した後、リポゾームを除去することによって、 RNAと該 RNAによりコードされるタンパク質から成る R N A—タンパク質複合体（in vitro virus virion) を製造することができる。本発明においては、上記に記載の RNA— DNA結合体または RNA—タンパク質複合体を逆転写反応に付することにより、 R N A— D N A—タンパク質複合体として用いてもよい。さらに、得られた RNA—DNA—タンパク質複合体の R N Aを R N A分解酵素などを用レ、て分解することによれば、 D N A—タンパク質複合体が製造される。

即ち、 RN A—タンパク質複合体の RN A部分を逆転写酵素で処理することにより、 RNAから DNAへの逆転写が起こり、 RNA部分の塩基配列をDNAに転換することができる。逆転写反応に必要な試薬及び反応条件は当業者に周知であり、必要に応じて適宜選択することができる。

かくして調製される核酸一タンパク質複合体には、さらに上記（I I ) の方法によれば親和性物質を結合させることができる。従って、この親和性物質に結合しうる物質を予め固定ィ匕した支持体に、前記核酸構築物を用いて調製した核酸一タンパク質複合体を接触させることにより、当該核酸含有産物を支持体上に容易に固定化することができる。この固定化物を洗浄後、適当な方法、例えば適当な溶出液により溶出する、あるいは、核酸構築物中に存在する制限酵素認識部位を利用する等して支持体から切断して、核酸一タンパク質複合体を精製することができる。親和性物質とそれに結合しうる物質の組み合わせ、並びに支持体については、本明細書中の上記（I I ) に記載した通りである。

( 3 ) 核酸一タンパク質複合体を選抜する選抜工程

上記 ( 2 ) で構築された in vitro virus virion中のタンパク質が有する機能 (生物活性）を用いて所望の機能を有するタンパク質を in vitro virus virion として選択して取得することができる。

この選抜工程とは、 in vitro virus virionを構成するタンパク質部の機能（生物活性）を評価し、目的とする生物活性に基づいて in vitro virus virionを選択する工程を意味する。即ち、構築された in vitro virus virionと相互作用をし得る被験物質、例えばタンパク質、ペプチド、核酸、糖質、脂質、低分子化合物等との相互作用の有無や強弱に基づいて、 in vitro virus virion を選択することができる。これらの被験物質は、前記した固相（支持体）に結合させて用いることもできる。このような工程はそれ自体既知の方法、例えば、 Scott, J. K. & Smith, G. P. (1990) Science, 249, 386—390; Devlin, P. E. et al. (1990) Science, 249, 404-406； Mattheakis, L. C. gt al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91， 9022-9026等に記載されている方法等により行うことができる。

選抜工程に付する in vitro virus virionは、上記 R N A—タンパク質複合体でもよいし、 R N A部分を D N Aに逆転写した核酸一タンパク質複合体でもよレ、。このうち、核酸一タンパク質複合体を用いれば、核酸部分の安定性がよいため好ましい。

(5) 増幅工程

上記（3) で選択された in vitro virus virionは、これを再度被検物質との相互作用に基づいて選抜することにより、該相互作用がより適当なタンパク質を選抜おょぴ取得することができる。一度選抜された in vitro virus virionを、再度被検物質と接触させるためには、選抜された in vitro virus virionの一本鎖 RN A部分を必要に応じて逆転写する等した後に、これを増幅し、増幅された DNA鎖をもとに（2) 構築工程を行って in vitro virus virionを製造して、

(3) 選抜工程に付することにより可能となる。これら（1)調製工程、（2) 構築工程、 (3) 選抜工程、（5) 増幅工程を必要に応じてくりかえし行うことにより、被験物質との相互作用がより適当なタンパク質を選抜およぴ取得することができる。

このうち、（1) および（2) の工程については上記（I) および（I I) に詳述したとおりに行うことができる。ここで、選抜工程に供する in vitro virus virionは核酸一タンパク質複合体が好ましい。これにより以降の工程における in vitro virus virionの安定性等が増加する。

(5)増幅工程は、 PCRを用いて、例えば以下のように行うことが好ましい。 in vitro virus virion の核酸中、増幅するのは、少なくともタンパク質をコードしている部分（以下、これを「ORF」と称することがある）を含む領域である。該領域を増幅するのに用いられる PCRプライマーとしては、特に制限はないが、全ての in vitro virus virionに共通に用いられる配列として、 5' 側のプライマーは、 ORFの 5，上流側に連結されている配列が、また 3，側のプライマ一は、 ORFの 3，側に連結されている配列が好ましく用いられる。具体的には、上記（I) および（I I) に記載の構造を有する in vitro virus virion の場合、 5，側のプライマーは、翻訳の際にリボソームによって認識される DN A配列などが好ましく用いられ、 3' 側のプライマーは、タグ配列や共通配列が好ましく用いられる。かくして増幅された DNAは、 ORFのみを含むものであるので、上記（I) および（I I) に記載の（1) プロモーター配列、（2) 翻訳の際にリボソームによって認識される DN A配列（以下、これらを「5' 側付加配列」と称することがある）、タグ配列、共通配列、並びにアニーリング配列、ブランチ配列など（以下、これらを「3' 側付加配列」と称することがある）を結合する。これらの配列の結合は、 DNAライゲ一ス、下述するオーバーラップエクステンション法、 PCR法を用いて行うことができる。 PCRのプライマーとしては、増幅された D N Aの 5 '末端と共通の配列を 3 '末端に有する 5 '付加配列からなるものと、増幅された DNAの 3，末端と共通の配列を 5，末端に有する 3，付加配列からなるものが用いられる。

オーバーラップエクステンション法による結合方法は、まず増幅された DNA の 5' 末端と共通の配列を 3' 末端に有する 5，付加配列を用意し、これをァニ一リングさせた後に、 DNAポリメラーゼなどを用いて 2本鎖 DNAを合成し、さらに増幅された DN Aの 3' 末端と共通の配列を 5' 末端に有する 3' 付加配列を用意し、これをアニーリングさせた後に、 DNAポリメラーゼなどを用いて 2本鎖 DN Aを合成する方法である。上記の 5，側付加配列および 3' 側付加配列の結合は、片方ずつ行っても、両方同時に行ってもよい。かくして合成された 2本鎖 DNAは、これを両末端の塩基配列を有するプライマー等を用いてさらに PCRで増幅してもよレヽ。

(4) 変異導入工程、 (5) 増幅工程、及び（6) 検定工程

上記（3) で選択された in vitro virus virion (核酸一タンパク質複合体）の核酸部分に変異を導入し、増幅を行う。これら（1)調製工程、（2)構築工程、

(3) 選抜工程、（4) 変異導入工程、 (5) 増幅工程を必要に応じて繰り返し行うことによりタンパク質の機能（生物活性）の改変及び新たな機能の創製が可能となる。この内、（1) 及び（2) の工程については上記に詳述した構築方法に従って行うことができる。ここで、選抜工程に供する in vitro virus virionは逆転写を行ったものが好ましい。これにより、以降の工程における virionの安定性等が増加する。

( 4 )変異導入及び（ 5 )増幅の工程において、選択された in vitro virus virion の核酸部に必要に応じて変異を導入して PC R等で増幅する。ここで、 in vitro virus virionの核酸部が： m RNAの場合は、逆転写酵素により c DNAを合成した後に変異の導入を行えば良く、核酸部の増幅は変異導入しながら行っても良い。変異導入は、すでに確立している Error- prone PCR (Leung, D. W. , et al.， (1989) J. Methods Cell Mol. Biol. , 1， 11—15) や Sexual PCR ( S temmer, W. P. C. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA91, 10747-10751)を用いて容易に行うことができる。

さらに、変異が導入され増幅された in vitro virus virionの核酸部を用いて、

(1) 調製工程にて RNA— DNA結合体を調製し、それを用いて（2) 構築ェ程にて核酸一タンパク質複合体を調製し、それを（3) 選抜工程にかけ目的とする生物活性によって選択し、さらに（4)変異導入及び増幅を行うことができる。これらの工程を必要に応じて繰り返すことにより、タンパク質の機能改変及ぴ新たな機能を有するタンパク質の創製が可能となる。

本発明のタンパク質一タンパク質またはタンパク質一核酸相互作用の検定方法における、核酸一タンパク質複合体を構築する構築工程は、一般には、（1) 遺伝子ライブラリ一や c DNAライブラリ一から mRN Aを合成し、 in vitro virus genome (RNA— DNA結合体）を調製する調製工程、及び、（2) 無細胞タンパク質合成系を利用して、 mRNAとそれに対応するタンパク質とをリボソーム上で連結した in vitro virus virionを構築する構築工程を含む。

(1) の工程は、配列既知の DNAで ORFに対応する配列を含む cDNAや配列未知の D N Aで適当な制限酵素で断片化した断片を含む cDNAから RNA ポリメラーゼを用いて mRNAを合成し、 in vitro virus genome (RNA-DN A結合体）を構築することに相当する。

上記 ( 1 ) の in vitro virus genomeの構築と、 ( 2 ) の in vitro virus virion の構築工程は、上記に詳述した方法に従って行うことができる。 in vitro virus virion と他のタンパク質や核酸（D NAまたは R NA) との相互作用を調べる検定工程（6 ) は、構築された核酸一タンパク質複合体の中から所望の機能をもつタンパク質を選抜する選抜工程（3 ) 、必要に応じて、逆転写、増幅、配列決定等の工程も含まれる。

( 3 ) の選抜工程では、標的のタンパク質や核酸（D NAまたはR NA) や他の物質、例えば糖質や脂質などをマイクロプレートゃビーズに予め共有結合や非共有結合を介して結合させておき、これに（2 )調製工程で調製した in vitro virus genome (R NA— D NA結合体）を加え、ある温度条件で、一定時間反応させた後、洗浄し、標的に結合しない in vitro virus virionを除去する。その後、標的に結合した in vitro virus virionを遊離させる。この工程は、前記の通り、すでに確立している方法で行うことができる。

( 6 ) の検定工程には、（3 ) の選抜工程で遊離した in vitro virus virionを、例えば P C Rにより増幅させ、増幅した D NAを直接あるいはクローユングした後、その配列を決定する工程も含まれる。相互作用の検出は、 virionの逆転写後に行うのが好ましい。これにより、 virionの安定性が増し、また相互作用の妨害作用も減少し、より精度の高い相互作用の検出が可能となる。

本発明の検出方法により、（1)配列既知あるいは未知の遺伝子 D NAから mR N Aを合成し、 in vitro virus genome (R NA— D NA結合体）を構築し、（2)それ用レヽて in vitro virus virion 構築し、 (3) in vitro virus virionの中力ら標的のタンパク質あるいは核酸あるレ、は他の物質、たとえば糖質や脂質などと結合するもののみを選択し、（4)選択した in vitro virus virionを逆転写、増幅、クローユング、配列決定することにより、機能未知の遺伝子に対応する遺伝子産物（タンパク質）の機能を同定することが可能になる。

なお、本明細書における、上記した核酸の単離 ·調製、核酸の連結、核酸の合成、 P C R、プラスミドの構築、無細胞系での翻訳等の遺伝子操作技術は、特に明記しない限り、 Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Pressに記載の方法またはそれに準じた方法により行うことができる。

( I V) ピューロマイシン誘導体およびその利用

( 1 ) ピューロマイシン誘導体

本発明は、下記式（1 )で表されるピューロマイシン誘導体又はその塩に関する (

式（1 ) 中、 R¹は水素原子、又は水酸基の保護基を示し；

R ²は水素原子又は反応性基を示し；

Xはアミノ酸残基あるいはペプチドを示し、 Xにおいて、そのカルボキシル基がピュー口マイシン中のァミノ基とアミド結合により結合しており、該ァミノ酸残基あるいはペプチドの αアミノ基および側鎖の官能基は所望により保護されていてもよい。

R ¹が示す水酸基の保護基としては、有機化学合成の分野で既知の保護基が挙げられ、具体的には、ジメトキシトリチル基の他に以下のものが挙げられる。

(エーテル型）

メチル基、メトキシメチル基、メチルチオメチル基、ベンジルォキシメチル基、 t—ブトキシメチル基、 2—メトキシェトキシメチノレ基、 2 , 2， 2—トリクロ口エトキシメチル基、ビス（2—クロ口エトキシ）メチル基、 2— （トリメチルシリル）エトキシメチル基、テトラヒドロビラニル基、 3—ブロモテトラヒドロビラ二ル基、テトラヒドロチォピラニル基、 4—メトキシテトラヒドロビラニル基、 4—メトキシテトラヒドロチォピラニル基、 4ーメトキシテトラヒドロチォビラニル S， S—ジォキシド基、テトラヒドロフラニル基、テトラヒドロチオフラニル基、トリイソプロビルシリルォキシメチル基（TOM基）；

1—エトキシェチル基、 1—メチルー 1ーメトキシェチル基、 1— (イソプロポキシ）ェチ 7レ基、 2， 2， 2—トリクロロェチノレ基、 2 - (フエ二ルセレニル）ェチ/レ基、 t—ブチル基、ァリル基、シンナミル基、 p—クロ口フエ二ル基、ベンジノレ基、 p—メトキシべンジノレ基、 o—ニト口べンジノレ基、一二トロべンジル基、 p—ハロベンジル基、 ρ—シァノベンジル基、 3—メチル一2—ピコリル N—ォキシド基、ジフエニルメチル基、 5—ジベンゾスべリル基、トリフエニルメチル基、一ナフチルジフヱニルメチル基、 p—メトキシフエニルジフエニルメチノレ基、 - ( ρ ' 一ブロモフエナシノレオキシ）フエニルジフエニルメチル基、 9一アントリル基、 9 _ ( 9—フエニル）キサンテュル基、 9 - ( 9—フエニル — 1 0—ォキソ）アントリル基、ベンズィソチアゾリル S， S—ジォキシド基、；トリメチルシリル基、トリェチルシリル基、イソプロピルジメチルシリル基、 tーブチルジメチルシリル基 (T B DM S基）、（トリフエニルメチル）ジメチルシリノレ基、 t—ブチルジフエニルシリル基、メチルジイソプロビルシリル基、メチルジー t一ブチルシリル基、トリベンジルシリル基、トリー p—キシリルシリル基、トリイソプロビルシリル基、トリフエニルシリル基；

(エステル型）

ホノレメート、ベンゾイノレホノレメート、アセテート、クロ口アセテート、ジクロ口アセテート、トリクロ口アセテート、トリフルォロアセテート、メトキシァセテート、トリフエニルメトキシアセテート、フエノキシアセテート、 p—クロ口フエノキシアセテート、 2 , 6—ジクロロー 4一メチルフエノキシアセテート、 2， 6—ジクロロー 4 _ ( 1， 1， 3， 3—テトラメチルブチル）フエノキシァセテート、 2 , 4一ビス ( 1 , 1ージメチルプロピル) フエノキシアセテート、クロロジフエニノレアセテート、 p—P—フエ二ノレアセテート、 3—フエ二ノレプロピオネート、 3—ベンゾィルプロピオネート、イソブチレート、モノスクシノエート、 4一ォキソペンタノエート、ピバロエート、ァダマントエート、クロトネート、 4ーメトキシクロトネート、（E) — 2—メチル _ 2—ブテノエート、ベンゾエート、 o— （ジブロモメチレ）ベンゾエート、 o— （メトキシカノレポ二ノレ）ベンゾエート、 p—フエニルベンゾエート、 2， 4， 6— トリメチノレべンゾエート、 p— P—べンゾエート、ひ一ナフトェート；

(カーボネート型）

メチルカーポネート、ェチルカーボネート、 2， 2， 2—トリクロロェチルカ一ボネート、イソブチルカ一ボネ一ト、ビニノレ力一ボネート、ァリルカ一ボネ一ト、シンナミノレカーボネート、 p—ニトロフエ二ノレカーボネート、ベンジルカーボネート、 p—メトキシベンジルカーボネート、 3, 4—ジメトキシベンジルカーボネート、 o—ニトロべンジレカーボネート、 p—ニトロべンジノレカーボ不一ト、 S—べンジノレチ才カーボネート；

(その他）

N—フエ二ルカルバメート、 N—イミダゾリルカルバメート、ボレート、ニトレート、 N， N, N，， N' —テトラメチルホスホロジアミダート、 2， 4—ジニトロフエニノレスノレフエネート：

上記した保護基の導入法及ぴ脱保護法は当業者に公知であり、例えば、 Teodora, W. Green, Protective Groups in Organic Syntnesis, John & Wiley & Sons Inc. (1981) などに記載されている。

R²が示す反応性基としては、連結基を介して末端に反応性の官能基を有する基が挙げられる。反応性の官能基としては、一 COOH、 -OH, _NH₂、一 CHO、一 NHNH₂、一 NCS、エポキシ基、またはビエル基などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。 R ²が示す反応性基の好ましい例としては、末端にカルボキシル基 (-COOH) を有する反応性基が挙げられ、特に好ましくは、スクシ二ル基（一 COCH₂CH₂COOH) である。 Xがペプチドを示す時、それに含まれる残基数は特に限定されないが、好ましくは 2〜1 0残基である。

Xが示すアミノ酸残基、あるいはぺプチドに含まれるアミノ酸残基の種類は特に限定されず、天然型アミノ酸と非天然型アミノ酸の何れでもよく、 Xが示す芳香族ァミノ酸残基としては、芳香族基を含むアミノ酸であればその種類は特に限定されず、天然型アミノ酸でも非天然型アミノ酸の何れでもよく、また ο;—アミノ酸、 3—アミノ酸、 γ—アミノ酸、 δ—アミノ酸の何れでもよいが、好ましくは天然型アミノ酸である α—アミノ酸である。

非天然型アミノ酸とは、天然型蛋白質を構成する天然型アミノ酸（全部で 2 0 種類）以外の全てのアミノ酸を意味し、具体的には、（1 ) 天然型アミノ酸中の原子を他の物質で置換した非天然型ァミノ酸、（ 2 )天然型ァミノ酸の側鎖の光学異性体、（ 3 )天然型ァミノ酸の側鎖に置換基を導入した非天然型ァミノ酸、並びに

( 4 ) 天然型アミノ酸の側鎖を置換して疎水性、反応性、荷電状態、分子の大きさ、水素結合能などを変化させた非天然型アミノ酸などが挙げられる。これらの非天然型アミノ酸残基についても、式（1 ) で表されるピューロマイシン誘導体をぺプチダーゼあるいはプロテアーゼで処理することにより脱保護できる基であれば使用することができる。

Xが示すァミノ酸残基あるいはぺプチドの好ましい例は、例えばぺプチダーゼあるいはプロテアーゼがキモトリプシンである場合は芳香族アミノ酸残基であり、特に好ましくは αアミノ基がベンジルォキシカルボニル基などで保護されたフエ二ルァラニン残基である。

Xが示すアミノ酸残基あるいはぺプチドは、該アミノ酸残基あるいはぺプチドのカルボキシル残基がピューロマイシン中のアミノ基とアミド結合により結合している。

また、該ァミノ酸残基あるいはべプチドの αァミノ基およぴ側鎖のァミノ基は所望により保護されていてもよい。ァミノ基の保護基としては、有機化学合成の分野で既知の保護基が挙げられ、具体的には、ホルミル基、 C 1—6アルキル一力ルポニル基（例えばァセチル、ェチルカルポニル等）、 C 1一 6アルキルースルホニル基、 tert—ブチルォキシカルボニル基、ベンジルォキシカルボ二ル基、ァリルォキシカルポニル基、フルォレニルメチルォキシカルボニル基、ァリール力ルポニル基 (例えばフエ二ルカルポニル、ナフチルカルポニル等）、了リ一ルスルホニル基（例えばフエニルスルホニノレ、ナフチノレス/レホニル等）、 C 1— 6ァノレキノレオキシ一力ルポニル基 (例えば、メトキシカルボニル、エトキシカルボニル等）、 C 7 - 1 0 ァラルキル一カルボニル基（例えばべンジルカルボニル等）、メチル基、ァラルキル基（例えばベンジル、ジフエニルメチル、トリチル基等）、フタロイル基等が用いられる。これらの基は 1ないし 3個のハロゲン原子（例えばフッ素、塩素、臭素等）、エトロ基等で置換されていてもよく、その具体例としては、 p—ニトロベンジノレォキシカノレボニノレ基、 p—クロ口べンジルォキシカノレポ二ノレ基、 m—クロ口べンジルォキシカルボニル基、 p _メトキシベンジルォキシカルボニル基などが挙げられる。特に好ましいァミノ基の保護基の具体例としては、ベンジルォキシカルボニル基、 tert-ブチルォキシカルボニル基が挙げられる。

また、該アミノ酸残基あるいはペプチドの側鎖のカルボキシル基、水酸基、メルカプト基、グァニジノ基、イミダゾール基なども、所望により有機化学合成の分野で既知の保護基を用いて保護されていてもよレ、。具体的には、カルボキシル基の保護基としてはエステル型としてメチル、ェチル、 t -プチル、 1-ァダマンチル、ベンジル、 2-フエニルイソプロピル、フエナシルなどが、水酸基の保護基としては t-ブチル基、トリチル基、ベンジル基、 2-ブロモベンジルォキシカルボ二ル基などが、メルカプト基の保護基としては t -プチル基、トリチル基、 p メトキシベンジル基、ァセトアミドメチル基などが、グァニジノ基の保護基としては p - トルエンスルホニル基、 4 -メトキシ 2， 3 , 6 -トリメチルベンゼンスルホニル基、 2, 2, 5， 7, 8-ペンタメチルクロマン- 6 -スルホエル基などが、ィミダゾール基の保護基としては t -ブチルォキシカルボニル基、ベンジルォキシメチル基、トリチル基などがそれぞれ用いられる。

式（1 ) のピューロマイシン誘導体は、側鎖に存在する官能基の種類によっては塩の形態で存在することができる場合があるが、そのような塩の形態の式（1 ) のピューロマイシン誘導体も本発明の範囲内である。

塩の種類は特に限定されないが、例えば、酸付加塩、金属塩、アンモニゥム塩、又は有機アミン付加塩等が包含される。酸付加塩としては、塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩等の無機酸塩、酢酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、又はクェン酸塩等の有機酸塩が挙げられる。金属塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩、マグネシウム塩、カルシウム塩等のアルカリ土類金属塩、ァルミニゥム塩、又は亜鉛塩等が挙げられ、アンモニゥム塩としては、アンモニゥム又はテトラメチルアンモニゥム等の塩が拳げられ、有機ァミン付加塩としては、モルホリン又はピペリジン等の付加塩が挙げられる。

式（1 ) のピューロマイシン誘導体には、位置異性体、幾何異性体、互変異性体、又は光学異性体のような異性体が存在する力全ての可能な異性体、並びに

2種類以上の該異性体を任意の比率で含む混合物も本発明の範囲内のものである。また、式（1 ) のピューロマイシン誘導体又はその塩は、水あるいは各種溶媒との付加物（水和物又は溶媒和物）の形で存在することもあるが、これらの付カロ物も本発明の範囲内のものである。また、式（1 ) のピューロマイシン誘導体及ぴその塩の任意の結晶形も本発明の範囲内のものである。

式（1 ) で表されるピューロマイシン誘導体は、ぺプチダーゼあるいはプロテアーゼで処理することにより、本明細書に定義した式（2 ) で表される化合物が生成する。このようなぺプチダーゼあるいはプロテアーゼ処理によるピューロマイシン誘導体の脱保護方法も本発明の範囲内に属するものである。

ぺプチダーゼあるいはプロテアーゼとしてはサーモライシン、キモトリプシン、エラスターゼ、ペプシン、プロティナ一ゼエンドプロティナーゼ Glu-Cなどが挙げられるが、これらはピューロマイシンの αアミノ基を含むアミド結合を加水分解する酵素であれば特に限定されない。

Xが示すァミノ酸残基あるいはペプチドと、ぺプチダーゼあるいはプロテアーゼの組合わせの好ましい具体例は、 Ν-アルファ-ベンジルォキシカルボユルフェニルァラニノレ基とキモトリプシンである。

( 2 ) ピューロマイシン誘導体の製造

本発明の式（1 )で表されるピューロマイシン誘導体は以下の実施例に記載するように、ピューロマイシンを出発物質として使用し、それに含まれる官能基を修飾することにより製造することができる。例えば、 N α—（N o;—ベンジルォキシカルボエルフェ二ルァラ二ル）一 p_Uromycin を製造する場合、ピューロマイシン 2塩酸塩を適当な溶媒（例えば、水）に溶解した後、ジメトキシェタン（DME)と 10%炭酸ナトリゥム水溶液を加える。この溶液に benzyloxycarbonyl基で保護されたフエ二ルァラ二ルー OSuを DMEに溶かした溶液を加え、さらに 10%炭酸ナトリゥム水溶液を加えて反応させることにより、目的化合物を合成することができる。

式（ 1 )において Xが示す芳香族ァミノ酸残基が N a—ベンジルォキシカルボ二ルフエニルァラエル基以外の基であるピュー口マイシン誘導体を製造する場合は、 benzyloxycarbonyl基で保護されたフエ二ルァラ二ルー Osuの代わりに対応する試薬を使用すればよい。

上記で得られる誘導体（以下、ピューロマイシン誘導体 Aと称する）は、式（1 ) においてが水素原子を示し、 R ²が水素原子を示すピューロマイシン誘導体である。式（1 ) において R¹が水酸基の保護基を示すピューロマイシン誘導体は、ピユーロマイシン誘導体 Aの 5，位の水酸基を保護することにより製造することができる。例えば、水酸基の保護基として、ジメトキシトリチル基を使用する場合は、ピューロマイシン誘導体 Aを適当な溶媒（例えば、ピリジン）に溶解し、塩化ジメトキシトリチルを加えて反応させることにより、目的とする 5 '位の水酸基が保護されたピューロマイシン誘導体（以下、これをピュー口マイシン誘導体 Bと称する）を製造することができる。ジメトキシトリチル基以外の保護基を使用する場合は、塩化ジメトキシトリチルの代わりに対応する試薬を使用すればよい。

上記で得られるピューロマイシン誘導体 Bは、式（1 ) において R¹が水酸基の保護基を示し、 R ²が水素原子を示すピューロマイシン誘導体である。式（1 ) において R¹が水酸基の保護基を示し、 R ²が反応性基を示すピューロマイシン誘導体は、ピューロマイシン誘導体 Bの 2，位の水酸基に反応性基を導入することにより製造することができる。例えば、反応性基としてスクシ二ル基を使用する場合は、ピューロマイシン誘導体 Bを適当な溶媒（例えば、ピリジン）に溶解し、無水コハク酸とジメチルァミノピリジンのピリジン溶液を加えて反応させることにより、目的とするピュー口マイシン誘導体の 2，位の水酸基に反応性基を導入した誘導体を製造することができる。スクシニル基以外の反応性基を使用する場合は、無水コハク酸とジメチルァミノピリジンの代わりに好適な反応性試薬を使用すればよい。

( 3 ) ピューロマイシン誘導体固定化支持体

本発明の式（1 ) のピューロマイシン誘導体は、支持体に結合することにより、ピューロマイシン誘導体固定ィ匕支持体として使用することができる。このようなピユーロマイシン誘導体固定化支持体も本発明の範囲内に属するものである。

本発明のピュー口マイシン誘導体固定化支持体は、以下の実施例に具体的に記載する通り、式（1 ) のピューロマイシン誘導体における R ²が示す反応性基と、支持体中の反応性基とを反応させることにより製造することができる。

支持体としては、 R ²が示す反応性基と反応して結合することができる官能基を有する支持体であればその種類は特に限定されないが、具体例としては、例えば、 CPG LCA (CPG) , NovaSyn TG amino resin (novabiochem , Amino PEGA resin (novabiochem) , TentaGel S NH2 SS (Advanced Chemtech)などカ挙げられる。

( 4 ) ピューロマイシン誘導体の利用

本発明のピューロマイシン誘導体は液相での合成にも応用できるが、本発明者らは、以下の実施例に示す通り、先ず、 2種類の固相担体に本発明のピューロマイシン誘導体を固定し、ホスホアミダイト法によりオリゴマーを合成したのちにピューロマイシンのひ -ァミノ基が Z- Phe基で保護されていること、及ぴ Z_Phe基がキモトリプシン処理でほぼ定量的に脱保護されることを確認した。

Z - Phe基は疎水性が高いため、逆相高速液体クロマトグラフィ（逆相 HPLC) による脱保護の確認と精製は極めて容易であった。合成機上で 61ュニットから成る誘導体の合成を試みた場合も合成、脱保護ともに大きな問題は観察されず、さらに最終的に得られた誘導体は In Vitro Virus法における応用で期待された活性を示し、 Z-Phe基がピューロマイシンの保護基として充分実用的であることが証明された。上記の結果から分かるように、本発明のピューロマイシン誘導体はホスホアミダィト法に限らず、ピューロマイシンの誘導体を合成するための多くの合成法に適用することができる。さらに、酵素的に除去できる保護基を導入して選択的な反応を容易にするという考え方は、ピュー口マイシン誘導体の合成に限らず合成手法が確立された核酸などの生体高分子の合成に幅広く応用することが可能である。

従って、本発明の式（1 ) で表されるピューロマイシン誘導体を含む核酸化合物は全て本発明の範囲内に属するものである。また、本発明のピューロマイシン誘導体又はピューロマイシン誘導体固定化支持体を用いた核酸化合物の製造方法も本発明の範囲内に属するものである。

即ち、本発明のピューロマイシン誘導体固定化支持体を通常のホスホアミダイト法に付し、 αァミノ基が保護されたピューロマイシン誘導体を 3' -末端にもつ核酸化合物を通常のアル力リ脱保護により支持体から切り出し、さらに精製を行うことにより、本発明のピューロマイシン誘導体を 3， -末端に有する核酸化合物を製造することができる。

また、本発明の上記核酸ィヒ合物に種々の修飾反応を施したのち、酵素で処理することでピュー口マイシンの αアミノ基を脱保護することも可能である。

本明細書で言う核酸化合物とは天然型の核酸のみならず、非天然型の核酸も含むものである。即ち、天然型の核酸を構成するヌクレオチドある A、 G、 C、 T 及ぴ Uのみで構成される核酸のみでなく、これらの修飾ヌクレオチドが含まれていてもよい。修飾ヌクレオチドの具体例としては、ビォチン化 d T、 Amino modifier C6 dT、フルォレセイン d Tなどが挙げられる。また、核酸化合物の中には適当なスぺーサ一基が存在してもよく、スぺーサ一基の具体例としては、ポリエチレン又はポリエチレンダリコールなどの高分子が挙げられる。

(V) 支持体タンパク質およびその利用本発明は、ぺプチド及ぴタンパク質の機能を損なうことなく提示するための支持体タンパク質に関するものであり、特に in vitro virus法等で無細胞翻訳系中で種々のタンパク質を提示させ、その中から機能性タンパク質（ペプチド）を取得する際に用いるものである。

支持体タンパク質としては、一般的には、以下の条件を満たすものが好ましい。 ( 1 ) 球状タンパク質であってフォールデイングしやすい、（2 ) 安定性がある、 ( 3 ) ジスルフィド（S - S) 結合を含まない等である。本発明者らは今回、これらの条件を満たすタンパク質として Oct - 1の Pou- specific domain (73ァミノ酸残基）（Dekker, N. et al. (1993) Nature 362, 852 - 854) を選んだ。このタンパク質は 1つだけ Cys残基を含むため、この Cys残基を Ala残基に置換した変異体を作成した（配列番号 2 1 )。このようなタンパク質は提示しょうとするペプチドに Cysが含まれていてもこの支持体タンパク質と S-S結合して構造を変えることはない。また、このタンパク質は N末端側と C末端側が離れているためにランダムなペプチドを N末端側に提示した際に、 C末端側にあるスぺーサ部分（in vitro virus 法の場合）と相互作用しにくいと考えられる。このタンパク質は 4つの α ヘリックスからなりフォールデイングしやすいと考えられ、また、無細胞翻訳系においては短ヽぺプチドは発現されにくいことから、このような支持体と融合タンパク質を作る必要性がある。

従って、機能ぺプチドを取得可能な形で提示できるこのような支持体用タンパク変異体は無細胞翻訳系を用いる in vitro virus法等の技術で今後、重要な役割を担うと考えられる。

本発明の支持体タンパク質は、 3 0から 2 0 0アミノ酸残基からなる球状タンパク質から成ることを特徴とする。好ましくは、システィン残基を含まず、 Pシート構造を有さず、ひへリックス構造からなり、立体構造において N末端と C末端が離れていることが好ましく、また他の生体高分子と相互作用しないタンパク質であることが好ましい。

本発明において、目的ペプチド又は目的タンパク質は特に限定されず、スクリ一ユングの目的に応じて任意の性質を有するペプチド又はタンパク質を、本明細書で言う目的ペプチド又は目的タンパク質として使用することができる。

例えば、レセプターに結合可能なリガンド、細胞内への移行性に寄与する移行シグナルペプチド又はシグナルタンパク質、またはスクリーニングに用いる多数の不特定のランダムべプチドなどを挙げることができる。これらの目的ぺプチドまたは目的タンパク質は、標的物質を、主にタンパク質一タンパク質相互作用により認識する。従って、目的タンパク質は、標的物質を直接または間接的に相互作用により十分認識可能であるものが好ましい。なお、前記レセプターとしては、例えば、細胞表面の受容体タンパク質、抗体、増殖因子等がある。さらに、本発明の目的タンパク質は、 D NA、 R N Aなどのポリヌクレオチドに結合するものであってもよい。

本発明における好ましい実施形態の 1つとしては、特定のターゲットとの特異的な相互作用を有する特定のァミノ酸配列を有する目的タンパク質を、スクリーユングし、さらには同定するために、ランダムに選ばれた連続する、または不連続なアミノ酸配列を有するランダム配列を目的ぺプチドと使用することができる。例えば 1 0個のランダムに選ばれた 2 0種類のアミノ酸からなる組合せは理論上約 1 X 1 0 ¹³種類（約 1 0兆個）となり、スクリ一二ングにより特定ァミノ酸配列を検出するには十分と考えられる。

本発明においては、目的ペプチド又は目的タンパク質としてランダムに選ばれるアミノ酸の数に特に制限はなレ、。当業者に公知の合成手段を用いることにより、所望の数の、好ましくは 3から 4 0個のランダムペプチドを合成することは当業者には容易である。例えば、このようなランダムペプチドをコードする D NAの合成は、市販の自動 D NA合成装置等を用いても可能である。

本発明の特に好ましい実施形態において、目的ぺプチドとしてランダムぺプチドを呈示させる場合、該ランダムペプチドをコードする D NA (ランダム D NA) は、好ましくは式：（NNK) n (式中、 Nは A， G, C , または Tの何れかのデォキシリボヌクレオチドであり、 Kは Gまたは Tの何れかのデォキシリボヌクレォチドであり、 nはこれらランダム部分のアミノ酸数を表す。）によって表すことができる。本発明では、 nは、少なくとも 3以上であることが好ましく、さらに好ましくは 5から 4 0アミノ酸をコードする数であることが望ましい。但し、この nの数の制限は、該ランダム D N Aの合成手法によつて制限されるものではなく、 nの数の上限に実質上の制限はない。

また、目的タンパク質の両側に（N端側及び C端側）にシスティンを付加して含ませることにより、目的タンパク質を効率よく呈示させることができる場合がある。ここでいう目的タンパク質の N端側とは、目的タンパク質の N末端の場合のみならず目的タンパク質の N末端から数個から数十個のァミノ酸を隔てた場所のいずれの場合をも含み、また目的タンパク質の C端側とは、目的タンパク質の C末端の場合のみならず目的タンパク質の C末端から数個から数十個のアミノ酸を隔てた場所のいずれの場合をも含む意味である。

システィンを介して分子中にループを有する分子には、免疫グロプリンフアミリーの免疫グロブリン（I g G、 I g M)、 T細胞受容体、 MH Cクラス II分子、 L F A— 3、 I C AM— 1、 V C AM— 1等が知られている。ループを形成させるのに適した目的タンパク質の大きさは、これら既知の分子を参照して設計可能である。

本発明の支持体タンパク質の具体例としては、下記の何れかのアミノ酸配列を有するタンパク質が挙げられる。

( 1 ) 配列番号 2 1に記載のァミノ酸配列；又は

( 2 )配列番号 2 1に記載のアミノ酸配列において 1から数個のアミノ酸が欠失、置換、付加おょぴ Zまたは挿入しているアミノ酸配列であって、球状タンパク質を構成するアミノ酸配列：

本明細書において、「アミノ酸配列において 1から数個のアミノ酸が欠失、置換、付加および/または挿入しているアミノ酸配列」における 1から数個とは一般的には 1から 2 0個、好ましくは 1から 1 0個、より好ましくは 1から 5個、特に好ましくは 1から 3個程度を意味する。さらに、本発明は、目的ぺプチド又は目的タンパク質と上記した本発明の支持体タンパク質とから成る融合タンパク質にも関する。上記融合タンパク質は、例えば、目的ぺプチド又は目的タンパク質をコードする塩基配列および本発明の支持体タンパク質をコードする塩基配列が直接またはリンカーを介して連結してなる、目的ぺプチド又は目的タンパク質と支持体タンパク質とから成る融合タンパク質をコードする核酸またはその修飾体を、無細胞翻訳系または生細胞において発現させることにより調製することができる。

本発明における、融合タンパク質をコードする核酸とは、支持体タンパク質をコードする核酸と目的ぺプチド又は目的タンパク質をコードする核酸とを含む核酸である。上記核酸は、上記融合タンパク質を機能的に提示する性質を損なわない限り、任意の位置、例えば、支持体タンパク質をコードする核酸と目的ぺプチド又は目的タンパク質をコードする核酸との間に、スぺーサーその他の任意のァミノ酸をコードする D NAを含んでいてもよい。

本発明の核酸の合成は、市販の自動 D N A合成装置等を用いて当業者であれば容易に行うことができる。また、配列番号 2 1に記載のアミノ酸配列において 1 から数個のアミノ酸が欠失、置換、付加および/または挿入しているアミノ酸配列であって、球状タンパク質を構成するァミノ酸配列をコードする核酸も同様に市販の自動 D N A合成装置等を用いて合成することができる。

本発明においては、スクリーニング後に、公知の生物学的手法を適用することによって、目的ペプチド又は目的タンパク質を分離回収することができる。例えば、支持体タンパク質と目的ペプチド又は目的タンパク質の間に適当なスぺーサーァミノ酸配列を設けることにより好適に該目的タンパク質を分離することができる。このようなスぺーサーァミノ酸配列の挿入は公知の分子生物化学的手法に基づいて行うことができる。例えば、目的のアミノ酸配列をコードする D NAを任意の位置に、公知の遺伝子操作技術を用いて挿入することができる。例えば、スぺーサーをトロンビンにより切断するような場合には、

(Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser ) をコードする D N A (CTG- GTT- CCG- CGT- GGA- TCC) を支持体タンパク質と目的ペプチド又は目的タンパク質との間に導入することにより、該ペプチドが発現し、トロンビンにより切断可能となる。同様に、スぺーサーを FactorXaで切断する場合においては、（lie- Glu- Gly- Arg- X, Xは Arg, Pro 以外のァミノ酸）をコードする D N A (ATC-GAA-GGT-CGT-YYY、 YYYは Arg, Proをコードしない D NA) を導入すればよい。

本明細書で言う「核酸またはその修飾体」における修飾体の種類は特に限定されず、当分野で公知の任意の核酸修飾体を包含する。本発明で使用できる核酸修飾体の一つの具体例としては、その 3 ' 末端に核酸誘導体が結合しているものが挙げられる。即ち、本発明の好ましい実施態様では、目的ペプチド又は目的タンパク質をコードする塩基配列およぴ本発明の支持体タンパク質をコードする塩基配列が直接またはリンカーを介して連結してなる目的べプチド又は目的タンパク質と支持体タンパク質とから成る融合タンパク質をコードする m R NAであって、その 3 ' 末端に核酸誘導体が結合している mR N Aを、無細胞翻訳系または生細胞において発現させることにより、融合タンパク質とそれをコードする核酸とから成る複合体が製造される。

また、 3 ' 末端に核酸誘導体が結合している mR NAを使用して無細胞タンパク質翻訳系又は生細胞中でタンパク質の翻訳を行った場合、 2本鎖でリボソームを止め、ピューロマイシンなどの核酸誘導体がリボソームの Aサイトに入れることによりタンパク質と結合させることができる。

この核酸誘導体としては、無細胞タンパク質翻訳系又は生細胞中でタンパク質の翻訳が行われた時に、合成されたタンパク質の C末端に結合する能力を有する化合物である限り限定されないが、その 3 '末端がアミノアシル tRNAに化学構造骨格が類似しているものを選択することができる。代表的な化合物として、アミド結合を有するピューロマイシン（Puromycin)、 3， -N-アミノアシルピューロマィシンァ ^ノヌクレオシド (3， -N-Aminoacylpuromycin aminonucleoside、 PANS— アミノ酸）、たとえば、ァミノ酸部がグリシンの PANS- Gly、ァミノ酸部がバリンの PANS-Val、アミノ酸部がァラニンの PANS - Ala、その他、アミノ酸部が全ての各アミノ酸に対応する PANS—アミノ酸化合物が挙げられる。

また、 3，一アミノアデノシンのァミノ基とアミノ酸のカルボキシル基が脱水縮合して形成されるアミド結合で連結した 3， - N -ァミノアシルアデノシンアミノヌクレオシド (3， -Aminoacyladenosine aminonucleoside, AANS—ァミノ酸、 7ことえば、ァミノ酸部がグリシンの AA S - Gly、ァミノ酸部がパリンの MNS-Val、ァミノ酸部がァラニンの AANS- Ala、その他、アミノ酸部が全アミノ酸の各アミノ酸に対応する AANS-ァミノ酸化合物を使用できる。

また、ヌクレオシドあるいはヌクレオシドとアミノ酸のエステル結合したものなども使用できる。さらにまた、核酸あるいは核酸に類似した化学構造骨格及び塩基を有する物質と、アミノ酸に類似した化学構造骨格を有する物質とを化学的に結合した化合物は、すべて本方法において用いられる核酸誘導体に含まれる。核酸誘導体としては、ピューロマイシン、 P AN S—アミノ酸もしくは AAN S—アミノ酸がリン酸基を介してヌクレオシドと結合している化合物がより好ましい。これらの化合物の中でピューロマイシン、リボシチジ /レピュー口マイシン、デォキシシチジルピューロマイシン、デォキシゥリジノレピューロマイシンなどのピュー口マイシン誘導体が特に好ましい。

本発明の方法では、融合タンパク質をコードする核酸又はその修飾体として、 3 ' 末端に核酸誘導体がスぺーサーを介して結合している核酸修飾体を使用することが好ましい。

スぺーサ一としては、ポリエチレン又はポリエチレングリコー^レあるいはその誘導体などの高分子物質や、オリゴヌクレオチドゃぺプチドあるいはその誘導体などの生体高分子物質等が用いられ、好ましくはポリエチレンダリコールが用いられる。スぺーサ一の長さは特に限定されないが、好ましくは、分子量 1 5 0〜 6 0 0 0である力、または主鎖の原子数は 1 0原子から 4 0 0原子であり、さらに好ましくは、分子量 6 0 0〜3 0 0 0である力 \ または主鎖の原子数が 4 0原子から 2 0 0原子である。

上記したような核酸誘導体は、それ自体既知の化学結合方法によって製造することができる。具体的には、リン酸ジエステル結合で合成ユニットを結合させる場合は、 D NA合成機に一般的に用いられているホスホアミダイド法などにより固相合成で合成することが可能である。ペプチド結合を導入する場合は、活性ェステル法などにより合成ュニットを結合させるが、 D NAとの複合体を合成する場合は、両方の合成法に対応が可能な保護基が必要になる。

本発明の方法では、上記した核酸またはその修飾体を、タンパク質翻訳系または生細胞において発現させることにより融合タンパク質を製造することが好ましレ、。核酸からそれがコードするタンパク質を人工的に生成させるための転写翻訳系は当業者に公知である。具体的には、本明細書中の上記（I I ) に記載した通りである。

かくして得られた上記融合タンパク質とそれをコードする核酸の複合体又は本発明の目的ペプチド又は目的タンパク質と支持体タンパク質とから成る融合タンパク質を目的タンパク質として上記（I ) および（I I ) に記載の方法により構築された in vitro virus virionは、上記（I I I ) の選抜工程、（4 ) 変異導入工程、（ 5 )増幅工程などを適宜行なうことにより、所望のポリぺプチドまたはタンパク質を取得することができる。本発明には、上記の工程で得られる in vitro virus virionも含まれる。

さらに本発明では、目的ペプチド又は目的タンパク質としてペプチドライブラリー又はタンパク質ライブラリーを使用することができる。このようなライブラリ一を本発明の支持体タンパク質と融合させた形態で発現させて得られる融合タンパク質をスクリーニングし、所望の機能を有する目的ぺプチド又は目的タンパク質を選択することにより、機能性ぺプチド又はタンパク質をスクリ一ユングすることができる。

(V I ) 核酸の連結方法おょぴその利用

本発明の核酸の連結方法は、ランダムな配列を含む多様性のある D NAライプラリ断片と、転写 ·翻訳のための配列、タグをコードする配列、あるいは支持体タンパク質をコードする配列のようなコンスタントな配列（以下、これらを「コンスタント配列」と称することがある）をもつ DN A断片とを多様性を損なわない形で連結させる場合に使用することができる。また、本発明は、そのようにして連結した DNAを錶型にした転写による、 in vitro virus virion製造用の一本鎖 RN Aの製造に関するものである。

本発明の核酸の連結方法は、互いに相補的な共通配列を有する異なる 2種類以上の 1本鎖または 2本鎖 DNAをプライマーの非存在下において DNA合成酵素を用いて反応させることを特徴とする。 '

互いに相補的な共通配列とは、好適な条件下でァニーリングできる程度の相補性を有していればよく、完全（即ち、 100%) に相補的である必要はない。また、相補配列の長さも特に限定されないが、通常は 5塩基から 100塩基、好ましくは 5塩基から 50塩基程度である。

DN A合成酵素は、各種の DN Aポリメラーゼを使用できるが、好ましくは T a qポリメラーゼである。本発明では、 T a qポリメラーゼを用いるポリメラーゼ連鎖反応（PCR) により DNAを連結するのが好ましい。

T a qポリメラーゼなどの DN Aポリメラーゼを用いた核酸合成反応は当業者に公知の通常の条件下で行うことができる。具体的には、連結すべき 2種類の D NA断片、 dNTP混合物及ぴ DNAポリメラーゼを好適な緩衝液に添加し、好適な温度で一定時間ィンキュベートすることにより核酸合成反応を行うことができる。核酸合成反応を PC Rにより行う場合には、 DN Aポリメラーゼとして T a qポリメラーゼを使用し、例えば、 95°Cで 30秒（変性）、 54°Cで 2秒（ァユーリング）、及ぴ 74で 30秒（伸長）のサイクルを複数回（例えば、 25回程度）繰り返すことにより核酸合成を行うことができる。 PCR反応の条件（温度及ぴ時間、サイクル数）などは連結すべき核酸の種類などに応じて適宜変更することができる。

本発明は上記した方法により得られる D N Aの連結体も包含する。

本発明の好ましい態様では、異なる 2種類以上の 1本鎖または 2本鎖 D のうちの片方の D NAが D NAライブラリーなどである。他方の D NAがコンスタント配列を有する D N Aである。

本発明において、目的配列の種類は特に限定されず、スクリーニングの目的に応じて任意の配列を使用することができる。目的配列の具体例及び好ましい実施形態については、本明細書中の上記（V) に記載した通りである。

本発明の好ましい態様では、異なる 2種類の 1本鎖または 2本鎖 D N Aのうちの他方の D N Aはコンスタント配列を有する D N Aである。

コンスタント配列として用いられる支持体タンパク質としては、 3 0から 2 0 0ァミノ酸残基からなる球状タンパク質から成る支持体タンパク質を用いることが好ましい。さらに好ましくは、システィン残基を含まず、タンパク質の二次構造として ;8シート構造を有さず、 αヘリックス構造からなり、タンパク質の立体構造において Ν末端と C末端が離れていて、他の生体高分子と相互作用しない支持体タンパク質を使用することができる。

上記したような支持体タンパク質の具体例としては、下記の何れかのァミノ酸配列を有する支持体タンパク質が挙げられる。

( 1 ) 配列番号 2 1に記載のァミノ酸配列；又は

( 2 )配列番号 2 1に記載のアミノ酸配列において 1から数個のアミノ酸が欠失、置換、付加および/または挿入しているアミノ酸配列であって、球状タンパク質を構成するアミノ酸配列：

本明細書において、「ァミノ酸配列において 1から数個のァミノ酸が欠失、置換、付加および/または挿入しているァミノ酸配列」における 1から数個とは一般的には 1から 2 0個、好ましくは 1から 1 0個、より好ましくは 1から 5個、特に好ましくは 1から 3個程度を意味する。

なお、本発明で用いる D NAの合成は、市販の自動 D NA合成装置等を用いて当業者であれば容易に行うことができる。また、配列番号 2 1に記載のアミノ酸配列において 1から数個のアミノ酸が欠失、置換、付加おょぴ Ζまたは挿入しているアミノ酸酉己列であって、球状タンパク質を構成するアミノ酸配列をコードする核酸も同様に市販の自動 DN A合成装置等を用いて合成することができる。さらに本発明によれば、（1)互いに相補的な共通配列を有する異なる 2種類の 1本鎖または 2本鎖 DNAをプライマーの非存在下において DNA合成酵素を用いて反応させることにより、連結した DNAと連結しない DNAを含む混合物を調製する工程；及ぴ

を含む、核酸を連結及び転写するための方法が提供される。

上記工程 (1) は本明細書中上記した通り行うことができる。

上記工程（2) は、工程（1) で得られる連結した DN Aを転写して RN Aを生成する工程である。工程 (1) で得られる反応混合物中には、連結した DNA と連結しない DN Aの両方が含まれている。本発明では、この反応混合物をそのまま用いて RNAポリメラーゼの存在下で転写反応を行うことにより、連結された DNAのみが転写される。これは、 T 7 RNAポリメラーゼ等のウィルス由来の RNAポリメラーゼはプロモータ特異性が高く、 2本鎖 DNAを特異的に認識するという性質を利用しているためである。即ち、本発明では、上記したようなプロモータ特異性が高く、 2本鎖 DNAを特異的に認識するウィルス由来の RN Aポリメラーゼを使用することが好ましく、 T 7 RNAポリメラーゼを使用することが特に好ましい。このような RNAポリメラーゼを使用することにより、反応混合物の精製操作をせずに R N Aを合成することができる。

上記転写反応により得られた反応混合物を DNA分解酵素で処理することにより混合物中に存在する DNAを分解し、除去することにより、ランダム配列の多様性を維持したまま RN Aのみを単離することができる。本発明は上記した方法により得られる RNAも包含する。

さらに本発明は、（ 1 )互いに相捕的な共通配列を有する異なる 2種類の 1本鎖または 2本鎖 DN Aをプライマーの非存在下において DN A合成酵素を用いて反応させることにより、連結した DNAと連結しない D N Aを含む混合物を調製する工程；

(2) 工程（1) で得た混合物を用いて RNAポリメラーゼの存在下で転写反応を行い RNAを合成する工程；

(3) DNA分解酵素で DNAを分解する工程；及ぴ

(4) 工程 (3) で得た RNAを含む核酸構築物を、無細胞翻訳系または生細胞において発現させる工程を含む、タンパク質の製造方法；並びに、

( 1 ) 互いに相補的な共通配列を有する異なる 2種類の 1本鎖または 2本鎖 DN Aをプライマーの非存在下において DNA合成酵素を用いて反応させることにより、連結した DNAと連結しない DNAを含む混合物を調製する工程；

(2) 工程 (1) で得た混合物を用いて RN Aポリメラーゼの存在下で転写反応を行い RN Aを合成する工程；

(3) DN A分解酵素で DN Aを分解する工程；及び '

(4) 工程（3) で得た RNAの 3，末端を核酸誘導体で修飾する工程；及ぴ

(5) 工程（4) で得た 3' 末端を核酸誘導体で修飾した RNAを、無細胞翻訳系または生細胞において発現させる工程を含む、タンパク質とそれをコードする核酸との複合体の製造方法を提供する。また、上記（3) で得られた RNAを用いて上記（I) または（I I) に記載の方法により in vitro virus virionを製造することができる。

上記したような 3 ' 末端に核酸誘導体が結合している mRNAを使用して無細胞タンパク質翻訳系又は生細胞中でタンパク質の翻訳を行つた場合、 2本鎖でリポソームを止め、ピューロマイシンなどの核酸誘導体がリボソームの Aサイトに入れることによりタンパク質と結合させることができる。この核酸誘導体としては、本明細書中の上記（V) に記載したものが挙げられる。

本発明の方法では、 RNAの 3，末端に核酸誘導体がスぺーサーを介して結合している核酸修飾体を使用することが好ましい。スぺーサ一としては、本明細書中の上記（V) に記載したものが挙げられる。

上記したような核酸誘導体は、それ自体既知の化学結合方法によって製造することができる。具体的には、本明細書中の上記 (V) に記載した通りである。本発明の方法では、上記した核酸またはその修飾体を、無細胞翻訳系または生細胞において発現させることによりタンパク質を製造することが好ましい。

核酸からそれがコードするタンパク質を人工的に生成させるための転写翻訳系は当業者に公知であり、具体的には、本明細書中の上記（I I ) に記載したものが挙げられる。

本発明では、目的配列としてペプチドライブラリー又はタンパク質ライブラリ一をコードする配列を使用することができる。このようなライブラリー D NAを本究明の核酸の連結方法に従って支持体タンパク質と連結した形で機能的に発現させたものをスクリーニングし、所望の機能を有する目的ぺプチド又は目的タンパク質を選択することにより、機能性ぺプチド又はタンパク質をスクリ一ユングすることができる。実施例

以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によつて限定されることはない。なお、本発明による Y—ライゲーシヨン法を用いた in vitro virusのゲノム構築の模式図を図 2に示す。実施例 1

実施例 1一 A： Thioredoxin mRNAと D NA断片のライゲーション及ぴこの D NA 断片からの逆転写

( 1 ) 転写用 D NAの構築と mR NAの作成

転写効率の高い大腸菌ウィルス T7の RNA polymeraseによって認識される D N A配列（T 7プロモーター配列）と翻訳の際に真核細胞のリボソームによって認、識される D N A配列（Kozak配列）と原核細胞のリボソームによって認識される

(シャイン ·ダルガノ配列： Shine-Dalgarno) を有し，その下流に Thioredoxin をコードした DNAを次のように構築した。まず、 T 7 プロモーター配歹 (J (Rosenberg, A. H.， et al. , Gene, 56, 125 - 135 (1987))と Kozakコンセンサス配列及び Shine- Dalgarno配列を含む 1本鎖 DNA (配列番号 1) を有機合成し、これを铸型にして、 DNAプライマー（配列番号 2) と thioredoxinの一部をコードしたプライマー（配列番号 3) によってポリメラーゼ連鎖反応（P C R) を行った。 DN A合成酵素は、 KOD Taq Polymerase (T0YOBO製）を用レ、た。 P C Rの条件は、 95 °C 20秒、 68 °C 2秒、 74°C15秒のサイクルを 30回繰り返した。この PCR産物は、プライマーを除去するために、プライマーリムーバー（エッジサイエンス）でフエノーノレ抽出後、エタノール沈殿した。

一方、 thioredoxinを載せた pTrxFusプラスミド（Invitrogene社製）を铸型として配列番号 3のアンチセンスプライマー（配列番号 4) と DNAプライマー（配列番号 5) を用いてポリメラーゼ連鎖反応を行うことにより、 thioredoxin をコードした DN A領域を増幅した。 PCRの条件は、 95°C20秒、 68°C20秒、 74°C20秒のサイクルを 25回繰り返した。 PCR産物はフエノール抽出後、プライマーリムーバーでエタノール沈殿した。

尚、 DNAプライマー（配列番号 5) は T4 R A ligaseの基質としてより適当な AAAの配列を mRNAが持つようにデザインされている。

上記した 2つの P C R産物を重複伸長 (Overlap extension) 法（Horton RM, et al. (1989) Gene 77, 61-68)に従って結合させ， 2つのプライマー（配列番号 2 と配列番号 5 )で T7プロモーター配列- Kozakコンサンサス配列- Shine - Dalgarno 配列- Thioredoxinを作成した。いずれの P C Rにおいても D N A合成酵素は K0D Taq Polymerase (T0Y0B0製）を用いた。

上記した方法で作成した DNAを、反応液 100 1当たり 10 g力 [1え、 RNA合成ャット Ribomax Large Scale RNA Production System (Promega社製) を使って mRNA に転写した。翻訳効率を上げるためにキャップアナログ（RNA capping Analog; Gibco BRL社製）を最終濃度が 7.2 mMになるように加え、 mRNAの 5' 側を修飾した。キヤップアナ口グおよび過剰の NTP (ヌクレオチド 3リン酸）を除去するために、プライマー除去剤（Primer Remover: Edge Biosystems社製）を使つてエタノール沈殿を行った。

(2) 連結用 DN Aの作製

RT-thio (配列番号 6) は、日本製粉で合成された。 RT- thio は thioredoxin の一部をアンチセンス配列としてもつている。

( 3 ) mR Aと RT - thioの了ニーリング条件

Thioredoxin mRNA及び RT- thioを 1 ： 1.5の割合（モル比）で混合し、 T4 R A ligase buffer (50raM Tris-HCl, pH7.5, lOraM MgC12， lOraM DTT, ImM ATP)に溶解し、特異性を上げるため変性剤として DMSO (Dimethyl sulfoxide)を最終濃度 5 % になるように加えた。

PCR装置を用いて、 94°C〜25°Cまで 10分かけて冷却することによりァニーリングした。

(4) T4 RNA ligaseによるライゲーシヨン反応

(3 ) でァニーリングした溶液中に T4 RNA ligase を 2 5 unit と T4 polynucleotide kinase lOunitカロえ、 25°Cで 15分間反応させた。

反応後， Rneasy Mini (QIAGEN社）を行つてライゲーション産物を精製した。

(5) ライゲーシヨン反応の確認

ライゲーシヨンの効率を確認するために、 6%アクリルアミド 8M尿素変性ゲル電気泳動、 65°C、 220V、 12 OmA、 50分の条件でサンプルを流し、 Vistra Green (Amersham pharmaciaネ: pで染色し、 Molecular Imager (Bio Rad社)で画像ィ匕した。結果を図 5に示す。

図 5において、左のレーンは分子量マーカーを示し、真中のレーンは元の mR NAを泳動したものを示し、右のレーンはライゲーシヨン産物を泳動したものを示す。変性条件下で電気泳動した場合で、ライゲーシヨン産物の方が元の mRN Aよりも分子量が大きくなつていることからライゲーション反応が行なわれていることが確認された。

(6) RT- thioによる逆転写の確認 RT-thioがライゲーシヨンされた精製した mRNAが実際に逆転写できるかどうかを確認した。 8pmol の RT- thio が 3，末端に結合した mRNA を AMV Reverse Transcriptase (Promega)を用いて逆転写した。その後、半分を RNase H (Takara) 2 unitsで分解し、逆転写した DNAがあるかどう力確認した。結果を図 6に示す。図 6において、レーン Mは分子量マーカーを示し、レーン 1はライゲーシヨン前の mR NAを電気泳動したものを示し、レーン 2はライゲーション産物を逆転写した産物を RNase Hで処理した産物を電気泳動したものを示し、レーン 3は、ライゲーション産物を逆転写した産物を電気泳動したものを示す。レーン 2において、逆転写産物に対応するバンドが見られることから、逆転写反応が行なわれたことが確認された。実施例 1— B ： Thioredoxin mRNAに ligation され 7こ hybri spacerによる in vitro virus virion形成

Hybri spacerは実施例 1— Aで用いた RT- thioの 3，側にスぺーサとして PEG (Polyethylene glycol)の誘導体及び dCdC- puromycinを化学的に連結したものであり、いわゆる in vitro virusのスぺーサとして機能するものである。具体的な作製方法は、以下の通りである。

固相支持体の PuromycinCPG (GLEN RESEARCH)を出発物質とし、 D NA合成機上で d C d C、 Spacer- 18 (GLEN RESEARCH)、および Rt- thioの配列に相当するホスホアミダイトを順次連結し、脱保護と精製を行なった。この際、 Spacer-18 の個数を変えることで、 P E Gの長さを変える。次に、通常の D N A合成を行なうことで Hybri spacerカ哈成される。

( 1 ) mRNAと Hybri spacerのライゲーション反応とその確認

上記した RT - thioプライマーを加工した Hybri spacerも実施例 1一 Aと同様の条件でライゲーション反応ができることを確かめるために、実施例 1一 Aと同様の操作に従ってライゲーシヨン反応を行った。反応産物を電気泳動した結果を図 7に示す。図 7において、左のレーンは分子量マーカーを示し、真中のレーンは元の mR NAを泳動したものを示し、右のレーンはライゲーション産物を泳動したものを示す。変性条件下で電気泳動した場合で、ライゲーシヨン産物の方が元の mR N Aよりも分子量が大きくなつていることからライゲーシヨン反応が行なわれていることが確認された。

このライゲーシヨン反応産物を、 RNeasy Mini (QIAGEN社）を行って精製し、 in vitro virus genomeとして用レヽた。

( 2 ) in vitro virus virion形成の確認

in vitro virus virionの形成に関しては，スぺーサ長の影響が大きいため， 4 種類の異なる PEG (具体的には、 Spacer- 18を 5個、 6個、 7個又は 8個連結した）をもつ Hybri spacerを用意し、 mRNAと Hybri spacerのライゲーション産物を（ 1 ) に基づいて調製した。

これらの各スぺーサを付けた mRNA 1 /z gと IMBqの 35S Met (Amersham社）を小麦胚芽無細胞翻訳系に加え、 3 0 °Cで 4 5分間反応させ、最終濃度が 20mM MgCl ₂, 600mM KClになるように塩を加え、 _ 2 0 °Cでー晚冷蔵した。次に翻訳産物に取り込まれないフリーの 35SMet を取り除くために、 Micro BioSpin Coloumn - 6 (Biolad社）を用いて精製後、 EDTAを最終濃度 ΙΟΟ μ Μになるように加えた。これにより mRNAを加えたままのリボソームは完全に離れ、 mRNAとタンパク質が結合した in vito virus virionのみが残る。

上記の通り精製した翻訳産物を 1 5 % S D S—ポリアクリルアミドゲル電気泳動で確認した結果を図 8に示す。

図 8において、レーン 1は、スぺーサーとして spacer- 18 (GLEN RESEARCH社）が 5個連結したもの、レーン 2は 6個、レーン 3は 7個、レーン 4は 8個連結したものを示す。

図 8の結果から分かるように、 spacer- 18 (GLEN RESEARCH社）が 5個連結したスぺーサを用いた場合（レーン 1 ) 力最も効率良く連結していた。実施例 1一 C : T一 Spacerを用いた in vitro virus virion形成と逆転写

( 1 ) T- Spacerの作製法

以下のような修飾 DNAを T- Spacerの原料として DNA合成機で合成した。

DNA1 ： (thiol) (Spc) (Spc) (Spc) (Spc) CC (ZFP)

DNA2 ： (Pso) TACGCCAGCTGCACCCCCCGCCGCCCCCCG (At) CCGC

DNA3 ： CCCGG (Ft) GCAGCTGGCGTATAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA

DNA4 ： CCCGGTGCAGCTGTTTCATC (Bt) CGGAAACAGCTGCACCCCCCGCCG

CCCCCCG(At) (Ft) (Spc) (Spc) (Spc) (Spc) CC (ZFP)

DNA5 ： (thiol) CGCT

配列の中の（thiol)は 5， -Thiol- modifier C6、（Spc)は Spacer 18、（Bt)は Biotin- dT、 (Ft) は Fluorescein- dT、 (At)は Amino- modifier C6 dT、 (Pso)は Psoralen C6 (以上すベてグレンリサーチ）、（ZFP)は Z-phenylalanyl-puromycin をそれぞれ示す。

(A) T-splint3FA

DNA2 (12 nmol) と DNA3 (12 nmol) を TBS緩衝液（25 mM Tris - HC1、 pH7. 0、 100 mM NaCl) 0. 48 mlに溶力し、 85°Cで 40秒加熱したのち室温で放冷した。氷浴上で 5分放置したのちハンディ UVランプ（365 nm) で 8分間光照射し、反応生成物を逆相 HPLCで精製した。この DNA 4 nmolを 0. 1 M リン酸水素 2ナトリウム水溶液 15 μ 1に溶かし、 EMUS (架橋剤；同仁化学）の 5 mM 011?溶液4 1を加えて 20分室温で撹拌した。この溶液に DNA 1 (20nmol) を 0· 1 Mリン酸緩衝液 (ρΗ 7. 1) 40 μ ΐに溶かした溶液を加え、さらに室温で 16時間撹拌した。逆相高速液体クロマトグラフィ（逆相 HPLC) で架橋剤を介して結合した目的物を単離し、 50 mMリン酸緩衝液 (pH 8. 0) に溶かしてキモトリブシン溶液を基質に対して酵素の重量比が 10%程度になるように加えて 36°Cで 1時間放置した。逆相 HPLCで精製し、 T- splint:3FAを得た（図 4 )。

( B ) T-splint4FB

DNA 4 (5 nmol) を 0. 1 M リン酸水素 2ナトリゥム水溶液 15 ^ 1 に溶かし、 Sulfo-KMUS (架橋剤；同仁化学）の 10 niM DMF溶液 5 1を加えて 20分室温で撹拌した。この溶液にさらに DNA 5 (60 nmol) を 0. 1 Mリン酸緩衝液 (pH 7. 1) 0 1に溶かした溶液を加え、さらに室温で 16時間撹拌した。 DNA4と DNA5が架橋剤を介して結合した目的物を逆相 HPLCで精製し、 T-splint3FAと同様にキモトリプシンで消化を行なった。逆相 HPLCで再度精製し、 T-splint4FBを得た（図 4 )。

( 2 ) 転写用 DNAの構築と mRNAの作製

転写効率の高い大腸菌ウィルス T7の RNA polymeraseによって認識される DNA 配列（T7プロモーター配列）と翻訳の際に真核細胞のリボソームによって認識される DNA配列（Kozak配列）と原核細胞のリボソームによつて認識される（シャイン ·ダルガノ配列： Shine- Dalgarno) を有し、その下流に Oct- 1の一部（P0U) と FLAG配列、 T- Spacerと連結するための配列（Y- tag) をコードした DNA (下記の配列番号 7 ) を構築した。

GATCCCGCGA AATTAATACG ACTCACTATA GGGAGACCAC AACGGTTTCC CTCTTGAAAT AATTTTGTTT AACTTTAAGA AGGAGATTCC ACCATGGACC TTGAGGAGCT TGAGCAGTTT GCCAAGACCT TCAAACAAAG ACGAATCAAA CTTGGATTCA CTCAGGGTGA TGTTGGGCTC GCTATGGGGA AACTATATGG AAATGACTTC AGCCAAACTA CCATCTCTCG ATTTGAAGCC TTGAACCTCA GCTTTAAGAA CATGGCTAAG TTGAAGCCAC TTTTAGAGAA GTGGCTAAAT GATGCAGAGG GGGGAGGCAG CGATTACAAG GATGACGATG ACAAGGGCGG AAGCGGACGG GGGGCGGCGG GAAA (配列番号 7 )

作製した DNAを、反応液 100 μ 1あたり 10 μ gを加え、 RNA合成キット Ribomax Large Scale RNA Production System (Promega) を使って mRNAに転写した。翻訳効率をあげるためにキャップアナログ（RNA Capping Analog ； Gibco BRL) を最終濃度が 7. 2mMになるように加え、 mRNAの 5' 側を修飾した。キャップアナログおよび過剰の NTP (ヌクレオチド 3リン酸）を除去するために、プライマー除去剤 (Primer Remover ； Edge Biosystems) を使ってエタノーノレ沈を行った。

( 3 ) mRNAと T- Spacer (T_splint3FA)との ligation

上記（1 ) で作製した T- Spacer (T- splint3FA)と上記（2 ) で作製した mRNA とのライゲーシヨンは、実施例 1一 Aに記載の方法に準じて行なった。具体的には以下の通りである。

上記（2 ) で作製した mRNAと上記（1 ) で作製した T - Spacer (T- splint3FA)を 1 : 1. 2- 1. 5の割合（モル比）で混合し、 T4 R A ligase buffer (50raM Tris- HC1、 pH7. 5、 10mM MgCl ₂、 lOraM DTT、 lmM ATP)に溶解し、特異性をあげるため変性剤として DMSO (Dimethyl sulfoxide)を最終濃度 5%になるように加えた。得られた混合物は、 PCR装置を用いて、 94°C〜25°Cまで 10分かけて冷却することによりァニーリングした。

続けて、上記のアニーリングした溶液中に T4 Polynucleotide Kinase (Takara) と T4 RNA ligase (Takara製）を至適量加え、 25°Cで 30分間反応させた。

反応後、 RNeasy Mini Kit (QIAGEN製）を使って、ライゲーシヨン産物を精製した。ライゲーシヨンの効率を確認するために、 4%アクリルアミド 8M尿素変性ゲル電気泳動、 65° (：、 250V の条件でサンプルを泳動し、 Vistra Green (Amersham Pharmacia)で染色し、 Molecular Imager (Bio Rad)で画像化した。また、スぺーサ一に導入してある蛍光 (Fluorescein)についても確認した。結果を図 9に示す。図 9において、レーン 1は元の mRNAを泳動したものを示し、レーン 2はライゲーシヨン産物を泳動したものを示す。変性条件下で電気泳動した場合、ライゲーシヨン産物の方が元の mRNA よりも分子量が大きくなつていることからライゲーシヨン反応が行われていることが確認された。このライゲーシヨン産物を in vitro virus genomeと名付けた。

( 4 ) T- Spacer (T - splint3FA)を用いた in vitro virus virion形成

in vitro virus genome力 ^s、実際に in vitro virus virionを形成できる力どう力確認した。 in vitro virus genome 4pmolを小麦胚芽無細 J3包翻訳系 PR0TEI0S (T0Y0B0)を用いて、 26°Cで 30分間反応し翻訳させ、ピューロマイシンに翻訳されたペプチドを結合させる（virion化）ために最終濃度が 40mM MgCl₂、 1M KC1になるように塩を加え、 26°Cで 1時間反応させた。

Virion化の効率を確認するために、 5M尿素変性 5%SDS- PAGEゲル、 20mAの条件でサンプルを泳動した。 T - Spacerに導入してある蛍光（Fluorescein)を使って、 Molecular Imager (Bio Rad)で画像化した。結果を図 1 0に示す。

図 1 0において、左のレーンは翻訳反応前のサンプルを泳動したものを示す。右のレーンはビリオン形成後のサンプルを泳動したもの示す。

( 5 ) T- Spacer (T- splint3FA)を用いた逆転写反応の確認

in vitro virus genome I 実際に逆転写できるかどうかを確認した。 2pmol の in vitro virus genome ¾r TrueScript 丄丄 Reverse Transcriptase (sawady) を用いて逆転写した。その後、半分を R ase H(Takara) 2unitsで分解し、逆転写した DNAがあるかどう力確認した。 4%ァクリルァミド 8M尿素変性ゲル電気泳動でサンプルを泳動し、 Vistra Green (Amersham pharmacia製)で染色し、 Molecular Imager (Bio Rad)で画像化した。また、 Spacerに導入してある蛍光（Fluorescein) についても確認した。結果を図 1 1に示す。

図 1 1において、レーン 1は、 in vitro virus genomeを泳動したものを示し、レーン 2は、 in vitro virus genome を逆転写した産物を泳動したものを示し、レーン 3は、 in vitro virus genomeを逆転写した産物を RNase Hで処理した産物を泳動したものを示す。逆転写産物に対応するバンドがみられることから、逆転写反応が行われたことが確認された。

( 6 ) T— spacer (T- splin1:3FA)を用いた in vitro virus virion开成後の逆転写反応の確認

in vitro virus virionを形成し、翻訳系より精製した後、 T- spacerを用いて実際に逆転写できるかどうかを確認した。

8pmolの in vitro virus genomeを上の方法で virionィ匕レ、 buffer交をするために、 Micro BioSpin Column- 6 (Bio- Rad)を用いて脱塩後、 1M NaCl、 lOOmM Tris-HCl (pH8. 0)、 lOmM EDTA、 0. 25% Triton-XlOO になるように調整し、 Biotinylated Oligo (dT) Probe (Promega)を結合させた MAGNOTEX - SA (Takara) 5 μ 1と 4°C、約 1時間結合させる。その後、上清をとり、洗浄 bufferA (lM NaCl, lOOmM Tris-HCl (pH8. 0)、 0. 25% Triton- X100) 20 μ 1で 3回洗い、 buf f erB (500mM NaCl、 lOOmM Tris-HCl (pH8. 0)、 0. 25% Triton- X100) 20 μ 1 で 1 回洗い、 bufferC (250mM NaCl, lOOmM Tris-HCl (pH8. 0)、 0. 25% Triton-XlOO) 20 μ 1で 1 回洗い、その後、 Dep水 10 z lで 3回溶出して in vitro virus が精製できるかどうか確認した。

次に、溶出画分の 1 と 2 をまぜ、 TrueScript II Reverse Transcriptase (sawady)を用いて逆転写した。さらに、ネガティブコントロールとして in vitro virus genome ポンアイブコントローレとして in vitro virus genomeを逆転 ■ したもの（図 1 1 ) とともに、センスプライマー（配列番号 8 ) とアンチセンスプライマー（配列番号 9 ) をもちいて、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR)を行った。 DNA合成酵素は、 TaKaRa Ex Taq (TAKARA)を用いた。

結果を確認するために、 6M尿素変性 6%ポリアクリルアミドゲル、 250Vの条件でサンプノレを泳動し、 Vistra Green (Amersham pharmacia )で染色し、 Molecular Imager (Bio Rad)で画像ィ匕した。結果を図 1 2に示す。

図丄 2におレヽ、レーン I f 、 in vitro virus genome_N レーン 2は、 in vitro virus genomeを逆転写したもの、レーン 3は、ビリオン化後に精製して逆転写した in vitro virusを铸型として PCRを行ったサンプルを泳動したものを示す。ビリオンィ匕後に製して逆転した in vitro virus力 in vitro virus genomeを逆転写したものを錄型として PCRを行ったものと同様に、目的の DNAが増幅できていたことより、ビリオン化後に精製して in vitro virus力 T-sapcerをもちいて、逆転写できたことが確認された。

配列番号 8、 5， -GTT TAA CTT TAA GAA GGA GTT GCC ACC ATG —3，

配列番号 9、 5 ' -TTT CCC GCC GCC CCC CGT CCG CTT CCG CCC TTG TCA TCG TCA TCC

TTG TAA TC —3 , 実施例 2 ：

実施例 2— A ：スぺーサ一の作製

以下のような修飾 DNAをスぺーサ一の原料として DNA合成機で合成した。 DNA 1： (thiol) (Spc) (Spc) (Spc) (Spc) CC (ZFP)

DNA 2： CCCGGTGCAGCTGTTTCATC (Bt) CGGAAACAGCTGCACCCCCC (Ft) CCGCCCCCCG (At) CCG C

DNA 3： (Pso) TACGCCAGCTGCACCCCCCGCCGCCCCCCG (At) CCGC

DNA 4: CCCGG (Ft) GCAGCTGGCGTATAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA

上記配列中の (thiol)、 (Spc)、 (Bt)、 (Ft)、 (At)及び (Pso)はユニットの略称であり、すべてダレンリサーチ社製の合成試薬を用いて配列中に導入した。これらユニットの略称、合成（導入）試薬の品名及びその化学名は、それぞれ次の通りである。

(thiol)

5 - Thiol- modifier C6

(S~Tr i ty 1-6-mer c aptohexy 1 ) - (2-cyanoehyl) - (N, N-diisopropyl) ] -phosphoramid ite

(Spc)

Spacer Phosphoramidite 18

18-Q-Dimethoxytritylhexaet yleneglycol, l—[ (2— cyanoethyl) - (N, N-diisopropy

1) ] -phosphoramidite

(Bt)

Biotin—dT

5， -Dimethoxytrityl-5- [N— ( (4-t-butylbenzoyl) -biotinyl) -aminohexyl)—3- aery limido] - 2， -deoxyUridine, 3， - L (2- cyanoethyl) - (N， N-diisopropyl) ]-phosphoram idite

(Ft)

Fluorescein— dT

5， -Dimethoxytrityl-5- [N- ( (3'， 6， -dipivaloylf luoresceinyl) -aminohexyl) -3-a crylimido] -2' -deoxyUridine, 3， -[ (2- cyanoethyl) - (N， N-diisopropyl) ]-phospho ramidite (At)

Amino— modifier C6 dT

5，一 Dimethoxytrityl - 5 - [N - (trifluoroacetylaminohexyl)— 3— acrylimido]—2，一 deo xyUridine, 3，一 [ (2-cyanoethyl) - (N, N-diisopropyl) ] -pho sphor ami d i t e

(Pso)

Psoralen C6 Phosphoramidite

2— [4， - (hydroxymethyl) -4, 5，， 8— rimethylpsoralen]— hexyl— 1一 0— (2— cyanoethyl) - (N, N-diisopropyl) -pho sphor am i d i t e

また、 (ZFP)は N- CK - (N- a - benzyloxycarbonyl - L- phenylalanyl) -puromycin残基を示し、支持体 CPG に固定して DNA合成機上で使えるようにしたものを特願 2002-044955 号明細書に記載の方法に準じて次の通り合成して配列の 3' 末端に導入した。

ピューロマイシン 2塩酸塩（和光純薬工業） 250 mgを水 3 mlに溶かし、ジメトキシェタン（DME) 2 ml、 10%炭酸ナトリゥム水溶液 0. 5 mlを加えた。撹拌しな力らこの溶夂に Z— Phe_0Su (N- —benzyloxycarbonyl— L— phenylalanine N-hydroxysuccinimide ester ; BACHEM社） 200 mg (1. 1当量）を DME 2 mlに溶力した溶液を加え、さらに 10%炭酸ナトリウム水溶液 0. 5 mlを加えた。 1時間室温で撹拌したのち析出した固体をグラスフィルタ一上で濾取し、 50%DME水溶液 2 ml で 2回、水 2 mlで 3回、冷却した DME 2 mlで 2回洗浄したのち真空ポンプで乾して N- 一 (N— 一 benzyloxycarbonyl— L—pheny丄 alanyl)— puromycin (ZF-puromycin) ¾r 330 mg得た。

ZF- puromycin 315 mgをピリジン 2. 5 mlに溶かし、塩化ジメトキシトリチル 149 mgを加えて室温で 1時間撹拌した。氷浴で冷却してから水 0. 1 mlを加え、 10分撹拌したのち水と酢酸ェチルで分液し、有機層を水で 3回洗ってから濃縮し、真空ポンプで乾燥して粗 5， -dimethoxytrityl ZF-puromycin (DMTr-ZF- puromycin) を 450 mg得た。

DMTr - ZF - puromycin 450 mgをピリジン 2 mlに溶力、し、無水コハク酸 61 mg、ジメチルァミノピリジンの 0. 5 Mピリジン溶液 40 μ 1を加えて、窒素雰囲気下、室温で 3日間撹拌した。氷浴で冷却してから水 0. 1 mlを加え、 10分撹拌したのち水と酢酸ェチルで分液し、有機層を水で 3回、飽和食塩水で 1回洗ったのち濃縮した。酢酸ェチルを展開溶媒としてシリカゲルクロマトグラフィで精製し、目的物である DMTr-ZF-puromycin- 3， -succinateを 385 mg得た。

D Tr-ZF-puromycin-3' -succinate 255 mgをジメチルホノレムァミド（DMF) 0. 4 ml に溶かし、ジィソプロピルカルボジィミド（DIC)の 1. 0 M DMF溶液 0. 2 mlと N-ヒドロキシベンゾトリァゾール (HOBt)の 0. 5 M DMF溶液 0. 4 mlを加え、 16時間室温で撹拌した。この溶液に CPG (CPG LCA00500A ； 0. 17 mmol/g) 500 mgを加えて 2時間室温で撹拌し、さらに DICの 1. 0 M DMF溶液 0. 15 mlと HOBtの 0. 5 M DMF 溶液 0. 3 mlを加えて 16時間室温で撹拌した。 CPGをグラスフィルター上に濾取し、 DMF、 50% DMF水溶液、ァセトニトリルで洗ったのちポンプで乾燥した。全量を DMF 2 mlに懸濁させ、ピリジン 0. 5 ml、無水酢酸 125 mgを加えて 1時間室温で撹拌したのち CPGを濾取して DMFとァセトニトリルで洗浄した。真空ポンプで乾燥し、 ZF- puromycin CPGを 520 mg得た。一部を固相反応用の容器に入れ、トリク口口酢酸の 3%塩ィ匕メチレン溶液を加えて室温で 1分撹拌し、ァセトニトリルで洗浄したのち濃アンモエア水を加えて室温で 2 時間撹拌した。回収された ZF- puromycinを定量し、 CPG 1グラム当たり 28 ^ molと算出した。

( 1 ) T-splintlFB

DNA 2 (4 nmol)を 0. 1 M リン酸水素 2 ナトリゥム水溶液 15 に溶かし、 Ν- (6-maleimidocaproyloxy) succinimide (EMCS) (架橋剤；同仁化学製）の 5 DMF溶液 4 1を力！]えて 20分室温で撹拌した。この溶液に DNA 1 (20 nmol) を 0. 1 Mリン酸緩衝液 (pH 7. 1) ΑΟ μ Ιに溶かした溶液を加え、さらに室温で 16時間撹拌した。逆相高速液体ク口マトグラフィ（逆相 HPLC) で DNA 1と DNA 2が架橋剤を介して結合した目的物を単離し、 50 リン酸緩衝液 (pH 8. 0) に溶かしてキモトリプシン溶液を基質に対して酵素の重量比が 10%程度になるように加えて 36°Cで 1時間放置した。逆相 HPLCで精製し、 T-splintlFBを得た。 ( 2 ) T-splint3FA

DNA 3 (12 nmol)と DNA 4 (12 nmol)を TBS緩衝液 (25 mM Tris - HC1、 pH7. 0、 100 mM NaCl) 0. 48 mlに溶力し、 85°Cで 40秒加熱したのち室温で放冷した。氷浴上で 5分放置したのちハンディ UVランプ（365 nm) で 8分間光照射し、反応生成物を逆相 HPLCで精製した。これを T- splintlFB調製の際と同様に EMCSで DNA 1 と架橋し、キモトリプシン処理ののち精製して T- splint3FAを得た。実施例 2— B ：転写用 D NAの構築と mR NAの作製

転写効率の高い大腸菌ウィルス T7の R A polymeraseによって認識される DNA 配列（T7プロモーター配列）と翻訳の際に真核細胞のリボソームによって認識される DNA配列（Kozak配列）と原核細胞のリボソームによって認識される（シャィン ·ダルガノ配列： Shine- Dalgarno) を有し、その下流に Oct- 1の一部（P0U ；配列番号 1 )と FLAG配列、 T- Spacerと連結するための配列（Y- tag) をコードした DNAを構築した。

GATCCCGCGAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCACAACGGTTTCCCTCTTGAAAT AATTTTGTTTMCTTTAAGAAGGAGATTCCACCATGGACCTTGAGGAGCTTGAGCAGTTT GCCAAGACCTTCAAACAAAGACGAATCAAACTTGGATTCACTCAGGGTGATGTTGGGCTC GCTATGGGGAAACTATATGGAAATGACTTCAGCCAAACTACCATCTCTCGATTTGAAGCC TTGAACCTCAGCTTTAAGAACATGGCTAAGTTGAAGCCACTTTTAGAGAAGTGGCTAMT GATGCAGAGGGGGGAGGCAGCGATTACAAGGATGACGATGACAAGGGCGGAAGCGGACGG GGGGCGGCGGGAAA (配列番号 7 )

上記の方法で作製した DNAを、反応液 100 μ 1あたり 10 μ gを加え、 RNA合成キット Ribomax Large Scale RNA Production System (Promega製) 使って mRNA に転写した。翻訳効率をあげるためにキャップアナログ（RNA Capping Analog ； Gibco BRL製）を最終濃度が 7. 2mMになるように加え、 mRNAの 5'側を修飾した。キヤップアナ口グおよび過剰の NTP (ヌクレオチド 3リン酸）を除去するために、プライマー除去斉！ j (Primer Remover ； Edge Biosystems製) を使ってエタノーノレ沈澱を行った。実施例 2—C ： mR NAと T—スぺーサ一とのライゲーシヨン

上記の実施例 2— Aで作製した T- Spacer (T - splint3FA)と上記の実施例 2— B で作製した mRNAとのライゲーションは、特願 2002-012820号明細書に記載の方法に準じて行なった。具体的には以下の通りである。

上記で作製した mRNAと T- spacerを 1： 1. 2〜1. 5の割合（モル比）で混合し、 T4 RNA ligase buffer (50mM Tris - HC1、 pH7. 5、 lOmM MgCl₂、 lOmM DTT、 ImM ATP) に溶解し、特異性をあげるため変性剤として DMSO (Dimethyl sulfoxide)を最終濃度 5%になるように加えた。得られた混合物は、 PCR装置を用いて、 94°C〜25°C まで 10分かけて冷却することによりアニーリングした。

つづけて、上記のァニーリングした溶液中に T4 Polynucleotide Kinase (Takara 製）と T4 RNA ligase (Takara製）を至適量加え、 25°Cで 30分間反応させた。反応後、 RNeasy Mini Kit (QIAGEN製）を使って、ライゲーシヨン産物を精製した。ライゲーシヨンの効率を確認するために、 4%アクリルアミド 8M尿素変性ゲル電気泳動、 65°C、 250V の条件でサンプルを泳動し、 Vistra Green (Amersham Pharmacia製)で染色し、 Molecular Imager (Bio Rad)で画像ィ匕した。また、 T— spacer に導入してある蛍光（Fluoroscein)についても確認した。この結果から、 mMA と T - spacerとの結合率（RNA- DNA結合体の形成率）は 80〜90%であることが確認された。実施例 2—D： T—スぺーサーを用いた in vitro virus virion开成

in vitro virus genome f>ゝ、笑際に in vitro virus virionを形成できる力どうか確認した。 in vitro virus genome 4pmolを小麦胚芽無細胞翻訳系 PR0TEI0S (T0Y0B0製）を用いて、 26°Cで 30分間反応し翻訳させ、ピューロマイシンに翻訳されたペプチドを結合させる（virion化）ために最終濃度が 40mM M_gCl₂、 1 M KC1 になるように塩を加え、 26°Cで 1時間反応させた。 Virion化の効率を確認するために、 5M尿素変性 5%SDS- PAGEゲル、 20mAの条件でサンプルを泳動した。実施例 2— E ： T一スぺーサーを用いた in vitro virusの精製

in vitro virus virionを开成した後、 T- spacerを用いて、実際に精製できるかどうかを確認した。

( 1 ) ピオチン（T- splintlFB)

8pmolの in vitro virus genomeを上 dの方法で virionィ匕し、 buffer交換をするために、 Micro BioSpin Column- 6 (Bio- Rad製）を用いて脱塩後、 lMNaCl, lOOmM Tris-HCl (pH8. 0)、 lOmM EDTA、 0. 25% Triton- X100 になるように調整し、 MAGNOTEX-SA (Takara製） 5 μ 1 と 4°C、約 2時間結合させる。その後、上清をとり、洗浄 buffer (1M NaCl、 lOOmM Tris-HCl (pH8. 0) 、 lOmM EDTA、 0. 25% Triton- Χ100) 20 μ 1で 3回洗い、その後、 MAGNOTEX- SAを 2つにわけ、一方を制限酵素 Pvu II (Takara製） 37°C、約 1時間処理し、その上清を得て、 in vitro virus が精製できるかどうカゝ確認した。

精製効率を確認するために、 5M尿素変性 5%SDS_PAGEゲル、 20mAの条件でサンプルを泳動した。スぺーサ一に導入してある蛍光（Fluoroscein)を使って、 Molecular Imager (Bio Rad製）で画像化した。その結果を図 1 3に示す。

図 1 3において、レーン 1は、 virion化し BioSpin Column- 6を用いて脱塩された in vitro virusを泳動したものを示し、レーン 2は、 MAGNOTEX- SAと結合させた後の上清を泳動したものを示し、レーン 3〜5は、上清を除いた後の MAGNOTEX- SA を洗浄したものを泳動し、レーン 6は、洗浄した後の MAGNOTEX- SA を泳動し、レーン 7は、洗浄した MAGNOTEX- SAを制限酵素で処理した後の上清を泳動し、レーン 8は、 MAGNOTEX- SAを制限酵素で処理した後の MAGNOTEX- SAを泳動したものを示す。洗浄した MAGNOTEX-SAを制限酵素で処理した後の上清に、 in vitro virusカ存在すること力り、 T— splintスぺーサーを使って in vitro virus が精製できることが確認された。 ( 2 ) Poly A (T-splint3FA)

8pmol の in vitro virus genomeを上 ( 1 ) の方法で virionィ匕し、 buffer 交換をするために、 Micro BioSpin Column- 6 (Bio- Rad製）を用いて脱塩後、 lM NaCl、 lOOmM Tris-HCl (pH8. 0)、 lOmM EDTA、 0. 25% Triton- X100 になるように調整し、 Biotinylated Oligo (dT) Probe (Promega製）を結合させた MAGNOTEX- SA (Takara 製） 5 μ 1と 4° (：、約 1時間結合させる。その後、上清をとり、洗浄 buffer A (1M NaCl、 lOOmM Tris-HCl (pH8. 0)、 0. 25% Triton-XlOO) 20 で 3回洗い、 buffer B (500mM NaCl、 lOOmM Tris-HCl (pH8. 0)、 0. 25% Triton-XlOO) で 1回洗い、 buffer C (250niM NaCl、 100 mM Tris-HCl (pH8. 0)、 0. 25% Triton-XlOO) 20 μ ΐで 1回洗い、その後、 Dep水 10 μ 1で 3回溶出して in vitro virus virion が精製できるかどうカ確認した。

精製効率を確認するために、 5M尿素変性 5%SDS- PAGEゲル、 20mAの条件でサンプルを泳動した。スぺーサ一に導入してある蛍光（Fluoroscein)を使って、 Molecular Imager (Bio Rad製）で画像化した。その結果を図 1 4に示す。

図 1 4において、レーン 1は、 virion化し BioSpin Column - 6を用いて脱塩された in vitro virus genomeを泳動しにもの示し、レーン 2は、 Biotinylated Oligo (dT) Probeを結合させた MAGNOTEX - SAと結合しなかった上清を泳動したものを示し、レーン 3〜7は、上清を除いた後の Biotinylated Oligo (dT) Probe を結合させた MAGNOTEX-SAを洗浄したものを泳動し、レーン 8〜 1 0は、洗浄した Biotinylated Oligo (dT) Probeを結合させた MAGNOTEX- SAを溶出したものを泳動し、レーン 1 1は、溶出した後の Biotinylated Oligo (dT) Probeを結合させた MAGN0TEX-SAを泳動したものを示す。 Biotinylated Oligo (dT) Probeを結合させた MAGNOTEX- SAを溶出したもの in vitro virus virionが存在することから、 T— splint spacerを使って in vitro virus virionが精製できることが確認された。実施例 3 ： Pool (ネガテイブコント口ール ZP0U) からの protein Aの B ドメインの選択

( 1 ) 転写用 DNAの構築

転写効率の高い大腸菌ウィルス T7の RNA polymeraseによって認識される DNA 配列（T7プロモーター配列）と翻訳の際に真核細胞のリボソームによって認識される DNA配列（Kozak配列）と原核細胞のリボソームによつて認識される（シャイン ·ダルガノ酉己歹 IJ： Shine - Dalgarno) を有し、その下流に Oct- 1の一部（ネガティブコントロールノ P0U；配列番号 7 ) あるいは protein Aの B ドメイン（配列番号 1 0 ) と FLAG配列、 T- Spacerと連結するための配列（Y - tag) をコードした DNAを構築した。

GATCCCGCGAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCACAACGGTTTCCCTCTTGAMT

AATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGTTGCCACCATGGATAACAAATTCMCAAAGAACAA

CAAAATGCTTTCTATGAAATCTTACATTTACCTAACTTAAACGAAGAACAACGCAATGGT

TTCATCCAMGCCTAAAAGATGACCCAAGCCAAAGCGCTAACCTTTTAGCAGAAGCTAAA

AAGCTAAATGATGCTCAAGCACCAAAAGCTGACAACAAATTCAACGGGGGAGGCAGCGAT

TACAAGGATGACGATGACAAGGGCGGAAGCGGACGGGGGGCGGCGGGAAA

(配列番号 1 0 )

( 2 ) mR NAの作成

上記（ 1 ) で構築された DNAを実施例 2に記載の方法に従つて転写し、 mR Aを調製した。

( 3 ) mR NAと Tースぺーサ一とのライゲーシヨン

実施例 2— Aで作成した T - Spacer (Tsplint3FA)と上記（ 2 )で作成した各 mRNA とを、実施例 2—Cに記載の方法に従ってライゲーシヨンし、 in vitro virus genomeを調製した ₀

( 4 ) in vitro virus virion形成

実施例 2—Dに記載の方法で、上記 ( 3 ) で調製した in vitro virus genome を用いて virion形成をさせた。

Virion形成させる際に、 B ドメインと P0Uの in vitro virus genomeを、 1 : 1、 1:20、 1:200あるいは 1:200、 1:20000、 1:2000000、 1:200000000であわせて 8 pmol になるようにして翻訳させた。

( 5 ) in vitro virus virionの

実施例 2— E (2) に記載の方法に準じて virion精製を行った。

( 6 ) |g in vitro virus virionの: ^心

上記（5) で得られた in vitro virus精製画分を用いて、実施例 1— Cの（6) に記載の方法に準じて逆転写を行つた。

(7) B ドメインの選択一 1

逆転写反応したもの（それぞれ 40ul) を、 final 50mMTris-HCl、 150raMNaCl、 0.25% Triton - X100、 50 g/ml BSA、 0.5 μ g/ml tRNAになるように調製した（total 50 μΐ) 。これを、 10 μ gの抗 FLAG Μ2抗体（sigma製）を結合させたプロテイン Gセファロースビーズ 10 μ 1 (アマシャム ·ファルマシァ）に 4°C、 1時間結合させ、 40μ 1の TBSで 3回洗い、 20μ 1の 0.1M Glycine- HC1 (pH2.7) で 3回溶出し、それぞれ lM Tris (pH9.0)を Ιμΐ加えることによって、中性にし、 in vitro virus virionを得た。

上記の溶出画分を集め、その 1/1 0量を選択前のサンプルとした。残りの溶出画分を、 final 50mMTr is- HC1、 150mMNaCl 0.25% Triton- X100、 50 μ g/ml BSA、 0.5 g/ml tRNAになるように調製した（total 60.9 1) 。これを、 IgGセファロースビーズ（Amersham pharmacia製）に、 4。Cで 1時間〜ー晚結合させ、 40 μ 1の TBSで 3回洗つた。洗浄後のビーズを選択後のサンプルとした。

選択前、後のサンプルを R aseA処理（lOunit R ase A (QIAGEN製）， 37°C, 30 分）し、次いで proteinase K処理 (100 μ g/ml protease K(GIBC0製） , final lOOmM KC1 (pH8.0), 50mM EDTA, 500raM NaCl, 37°C, 30分）し、エタノール沈澱後 PCR を行った。 DNA合成酵素は、 TaKaRa Ex Taq (TAKARA製）をもちいた。プライマーは、センス側： GTT TAA CTT TAA GAA GGA GTT GCC ACC ATG (配列番号 8) 、アンチセンス側： TTT CCC GCC GCC CCC CGT CCG CTT CCG CCC TTG TCA TCG TCA TCC TTG TAA TC (配列番号 9) を用いた。結果を確認するために、 6M尿素変性 4%ポリアクリルアミドゲル、 250Vの条件でサンプノレを泳動し、 Vistra Green (Amersham pharmacia製)で染色し、 Molecular Imager (Bio Rad製）で画像ィ匕した。その結果を図 1 5に示す。

パンドの定量は Molecular Imager (Bio Rad製）で画像化したものを、解析ソフトを用いて数値ィ匕した。その結果を表 1及ぴ表 2に示す。表中の値は、 P0Uの量を 1としたときの B ドメインの比である。なお、 1： 200以上の割合で P0Uが存在している場合には、 PCRのバンドとして Bドメインのバンドは検出できなかった。

round

表 2

B ドメイン： P0U

1 : 200 1 : 2万 1 : 2百万 1 : 2億

選択前選択後選択前選択後選択刖選択後選択前選択後未検出 0. 58 未検出 0. 86 未検出 0. 40 未検出 0. 38

( 8 ) B ドメインの選択一 2

上記（7 ) 1^st roundで選択、濃縮された B ドメインとネガティブコントロール (POU) DNAをもちいて、 in vitro virus用に再ライブラリー化し、さらに、 B ドメインを次の通り選択した。

先ず、 1^st roundで選択、濃縮された Bドメインとネガティブコント口ール（P0U)

DNAをァガロースゲルで分離し、 QIA quick gel extraction キット（QIAGEN製）で精製した。その DNAに 5' 非翻訳領域を連結させた。 DNA合成酵素は、 TaKaRa Ex Taq (TAKARA製）をもちいた。連結させた 5' 非翻訳領域の配列は次の通りである。 GCT CCG AGC TCA TTA ATA CGA CTC ACT

ATAGGGAGACCACMCGGTTTCCCTCTTGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGTTGCCACCATG

(配列番号 1 1 )

転写以降は、 1^st roundと同様に行った。その結果を図 1 6に示す。

( 9 ) 選択結果の評価

上記の通り、本実施例 3においては、 1^st roundで IgGと反応しない POU in vitro virus genomeに、それぞれの割合いで結合する B ドメイン in vitro virus genome を混ぜて、ビリオン化以降の反応を共に行った。その際、 in vitro virus genome を、計約 8pmolになるように調整して反応を行い、それぞれの過程を踏んだ後、 IgGに結合させる前には in vitro virus virionとしては 0. 1 pmol程度になっている。これを、 1/10量とっておき選択前のサンプルとした。残りの 9/10を IgG カラムに結合させ、洗浄したあと残ったものを選択後のサンプルとした。それぞれについて PCR を行い、泳動したものを図 1 5及ぴ 1 6に示した。

図 1 5は、選択前と選択後の P0Uと Bドメインのバンドの濃さを示しているが、そのまま定量して B ドメインと P0Uが 1 : 20や 1 : 200になっているわけではない。検出されているバンドの比にから逆算して、初め 1 : 200で混ぜたものが、選択後には 1 : 20の選択前に近い比を示すので、 10倍濃縮されたというように考える。今回の結果から考えると、 1 : 200で始めたものは 100倍濃縮されて 1 : 2程度に、 1 : 2万ではじめたものは 1万倍濃縮されて 1 : 2程度に、 1 : 200万ではじめたものは 10万倍濃縮されて 1： 20程度に、 1： 2億ではじめたものは 1000万倍濃縮されて 1： 20 程度になる。

この選択後のものから in vitro virus virionを作製し、 2^nd roundを行った。 1^st roundでそれぞれ 1： 2から 1： 20まで濃縮されているので、 1^st roundの 1： 1力ら 1 : 20でみられた濃縮パターンと同じような結果が得られた（図 1 6 ) 。

今回は、ライブラリ一のサイズとして選択時に約 lxlO¹¹の in vitro virusビリオンを用いて行つたが、目的に合わせてサイズは増減できる。実施例 4 ：

( 1 ) ピューロマイシン支持体 (ZF-Puromycin resin, ZF-Puromycin CPG) の合成ピューロマイシン 2塩酸塩（和光純薬工業） 250 mgを水 3 mlに溶かし、ジメトキシェタン（DME) 2 ml, 10°/。炭酸ナトリウム水溶液 0. 5 mlを加えた。撹拌しながらこの溶液に Z- Phe - OSu (BACHEM社） 200 mg (1· 1当量）を DME 2 mlに溶かした溶液を加え、さらに 10%炭酸ナトリゥム水溶液 0. 5 mlを加えた。 1時間室温で撹拌したのち析出した固体をグラスフィルタ一上で濾取し、 50%DME水溶液 2 mlで 2 回、水 2 mlで 3回、冷却した DME2 mlで 2回洗浄したのち真空ポンプで乾燥して Ν α - (Ν α—べンジルォキシカノレポユルフェニノレアラニノレ） -ピュー口マイシン (ZF-puromycin) (構造を以下に示す）を得た。

H,C.

収量 330 mg。

MS (MALDI-TOF-MS) 754.0 [M+H]+; HI腿（500 MHz, d6- DMSO) 8.46 (IH, s), 8.23 (IH, s)， 8.15 (IH, d), 8,03 (1H， d), 7.50 (IH, d), 7.28 (2H, dd), 7.24-7.17 (10H, m), 6.82 (2H, d), 6.04 (br, IH), 5.99 (d, IH), 4.93 (d, IH), 4.61 (dt, IH), 4. 9-4.44 (m, 2H), 4.22 (td, IH), 3.94 (br, 1H)， 3.70 (s， 3H), 3.67 (s, 1H)， 3.40 (br, 6H)， 3.25 (dd, 2H), 2.93 (ddd, 2H), 2.80 (dd, IH), 2.66 (dd, IH)

ZF-puromycinの一部を 20%グリセロールを含む 25 mM リン酸緩衝液 (pH 8.0) 中でキモトリプシン（重量比で 1/5) と共に 37でで 1時間ィンキュベートした。生成物を逆相 HPLC と MALDI- T0F- MS で分析し、キモトリプシン処理により ZF-puromycinからピューロマイシンが得られていることを確認した。

(MS 472. 6 [M+H] +)

ZF-puromycin 315 mgをピリジン 2. 5 mlに溶かし、塩化ジメトキシトリチル 149 mgを加えて室温で 1時間撹拌した。氷浴で冷却してから水 0. 1 mlを加え、 10分撹拌したのち水と酢酸ェチルで分液し、有機層を水で 3回洗ってから濃縮し、真空ポンプで乾燥して粗 5'—ジメトキシトリチル ZF- puromycin (DMTr-ZF-puromycin) (構造を以下に示す）を 450 mg得た。

DMTr-ZF-puromycin 450 mgをピリジン 2 mlに溶かし、無水コハク酸 61 rag_N ジメチルァミノピリジンの 0. 5 Mピリジン溶液 0 μ 1を加えて窒素雰囲気下室温で 3日間撹拌した。氷浴で冷却してから水 0. 1 mlを加え、 10分撹拌したのち水と酢酸ェチルで分液し、有機層を水で 3回、飽和食塩水で 1回洗ったのち濃縮した。酢酸ェチルを展開溶媒としてシリカゲルクロマトグラフィで精製し、目的物である DMTr-ZF-puromycin-3' -succinate (構造を以下に示す）を 385 mg得た。

DMTr-ZF-puromycin-3' -succinate 255 mgをジメチルホノレムァミド（DMF) 0. 4 ml に溶かし、ジイソプロピルカルポジィミド（DIC) の 1· 0 M DMF溶液 0· 2 ml と N - ヒドロキシベンゾトリアゾール（HOBt) の 0. 5 M DMF溶液 0. 4 mlを加え、 16時間室温で撹拌した。この溶液に NovaSyn TG amino resin (novabiochem ； 0. 29 讓 ol/gram) 500 mgを加えて 2時間室温で撹拌し、さらに DICの 1. 0 M DMF溶液 0. 15 mlと HOBtの 0. 5 M DMF溶液 0. 3 mlを加えて 16時間室温で撹拌した。レジンをグラスフィルター上に濾取し、 DMF、 50% DMF水溶液、ァセトニトリルで洗ったのちポンプで乾燥した。全量を DMF 2 mlに懸濁させ、ピリジン 0. 5 ml、無水酢酸 125 mg を加えて 1時間室温で撹拌したのちレジンを濾取して DMF とァセトニトリルで洗浄した。真空ポンプで乾燥し、式（3 ) の構造を有する ZF- puromycin resin 550 mg を得た。但し、式 ( 3 ) において、 solid support は NovaSyn TG amino resin を示す。

一部を固相反応用の容器に入れ、トリクロ口酢酸の 3%塩化メチレン溶液を加えて室温で 1分撹拌し、ァセトニトリルで洗浄したのち濃アンモニア水を加えて室温で 2時間撹拌した。回収された ZF- puromycinを定量し、レジン 1グラム当たり 45 μ ηιοΐと算出した。

NovaSyn TG amino resinの代わりに CPG (CPG LCA00500A ； 0. 17 mmol/gram) を用いて同様の反応を行ない、 DNA合成機用の式（3 ) の構造を有する ZF- puromycin CPG (28 μ mol/gram) を得た。但し、式（3 ) において、 solid support は CPGを示す。

( 2 ) ZF- puromycin CPGを用いたスぺーサ一の合成

ZF - puromycin CPG 28 mg (0. 8 μ mol 相当）を合成力ラム（グレンリサーチ 20-0030-00) に詰めて合成機にセットし、以下のような配列の修飾 DNAの合成を 1 μ ηιοΐスケールで行なった。配列の中の（At)は Amino modifier C6 dT、（Ft)は Fluorescein dT、（Spc)は Spacer 18 (以上すベてダレンリサーチ）、（ZFP)は ZF- puromycinをそれぞれ示す。

5' -CGGAAACAGCTGCACCCCCCGCCGCCCCCCG (At)

(Ft) (Spc) (Spc) (Spc) (Spc) CC (ZFP) -3，

逆相 HPLCによる精製のあと 35 nmolの目的物が得られた。

このうち 5 nmol を 0. 1 M リン酸水素 2ナトリゥム水溶液 15 ^ 1 に溶かし、 Sulfo-KMUS (架橋剤；同仁化学）の 10 raM DMF溶液 5 μ 1を加えて 20分室温で撹拌した。逆相 HPLCで架橋剤と反応した DNAのフラクションを集め、溶液状態のまま 5' - (thiol) - CGCT-3' (5'末端がチオール修飾されたテトラヌクレオチド） 20 nmol と混合して濃縮し、さらに 0. 1 Mリン酸緩衝液 (pH 7. 1) 100 mlを加えて室温で 16 時間撹拌した。架橋剤を介してテトラヌクレオチドが (At)部分に結合したと考えられる生成物を逆相 HPLCで精製し、 50 raMリン酸緩衝液 (pH 8. 0) に溶かしてキモトリプシン溶液を基質に対して酵素の重量比が 10%程度になるように加えて 36°Cで 1時間放置した。逆相 HPLCで目的物であるスぺーサーを精製した。

上記で得られたスぺーサーを、原料の DNAを同様にキモトリプシンで消化したものと共にポリアクリルアミドゲル（15%)で電気泳動し、スぺーサー（左のレーン）が遅く泳動されていることを確認した（図 1 7 )。実施例 5 ：変異体 Pou- specific domainに提示したランダム- 一からの糖鎖結合べプチドの取得

糖鎖の 1種である N—ァセチルダルコサミンにカルシウム存在下で結合するぺプチド（12残基）が天然のレクチンタンパク質から得られている（Yamamoto, K. , et al. (1992) J. Biochem. Ill 436-439) ₀ そこでこの中の 5残基をランダムな配列にし、これを変異体 Pou- spec ic domain (配列番号 21) の N末端側に融合させてカルシウム存在下で糖鎖に結合するペプチドをスクリーニングできるかどうかを調べた。本実施例の概念の模式図を図 19に示す。

まず、.ペプチドを提示する支持体である変異体 Pou- specific domain DNAを作成するために次のような手順で行つた。

T7プロモーターと Kozac配列をもつ DNA"T7- Kozac" (配列番号 13； gctccgagct cattaatacg actcactata gggagaccac aacggtttcc ctcttgaaax aatttxgttt aactttaaga aggagttgcc accatg) とフンダム酉己歹 (J をもつ DNA "Lec— random" (目 li 列番号 1 4 ： gctcaagctc ctcaaggtcg ccaccgcctc cggaagggtc zyxzyxzyxz yxzyxgaagg tgtcaaattc aacgtcagtc aggtgaataa ttttatcgct catggtggca tctccttctt 120) と支持体のコンスタントな配列を持つ DNA "Pou" (配列番号 1 5 ： gaccttgagg agcttgagca gtttgccaag accttcaaac aaagacgaat caaacttgga ttcactcagg gtgatgttgg gctcgctatg gggaaactat atggaaatga cttcagccaa actaccatct ctcgatttga agccttgaac ctcagcttta agaacatggc taagttgaag ccacttttag agaagtggct aaatgatgca gaggggggag gcagctctag agctg) を有機合成した。なお、配列番号 14において、 X， Υ, Zの各塩基の組成は以下の通りである。これは 20種類のアミノ酸が均等に出現し、かつ終止コドンが少ないように理論計算したものである。

X： A (35%)， T (13%)， G (32%)， C (20%)

Y： A (30%)， T (24%)， G (24%), C (22%)

Z ： A ( 0 %) , T (37%), G (26%)， C (37%)

配歹 U番号 15の Pouは ttgagcttga gcgacgacct tgaggagctt gagca (配歹' J番"^ 1 6 )及ぴ gaggacgggg ggcggcgggg ggcagctcta gagctgcctc cccc 己歹 [J番丄 /ノをプライマーとしてポリメレース連鎖反応（PCR) を行い 2本鎖化した（図 2 0 )。

( 1 ) T 7 -Kozacと Lec - randomの連結

T 7 - Kozacと Lec- randomを連結させるために、プライマーを使わず各々 l pmol を以下の条件で伸長反応サイクルを行った。 Taq polymeraseは EX Taq. (Takara) を 2 units用い、反応条件は、 9 5 °Cで 3 0秒、 6 4 °Cで 2 0秒、 7 2 °Cで 2 0 秒のサイクルを 2 5回くり返す。連結産物 'Ύ 7- Lec- random〃は 8 M尿素変性ァクリルアミド電気泳動で解析した（図 2 1 )。この結果、ほとんど全て連結されたことが確認できた。

( 2 ) T' 7-Lec-randomと Pouの連結

上記（1 )で連結した T，7-Lec- randomと Pouを連結するために、プライマーを使わず各々 1 O pmolを以下の条件で伸長反応サイクルを行った。 Taq polymerase は KOD Dash. (T0Y0B0)を 1. 25units用い、反応条件は、 9 5 °Cで 3 0秒、 5 4 °C で 2秒、 7 4 °C 3 0秒のサイクルを 2 5 回くり返す。連結産物 Ύ 7 - Lec - random-Pou 8 M尿素変性ァクリルァミド電気泳動で解析した（図 2 2 )。この結果、 T' 7-Lec-random-Pou が連結されたことが確認でき、また、 T' 7-Lec-randomと Pouの連結されない側の 1本鎖 DNAも確認された。

( 3 ) T' 7- Lec- random- Pouの転写

上記（2 ) で連結した産物をフエノール処理し、 PrimerRemover (Edge System Science)を用いて精製した。分光計を用いて D N Aのモル濃度を測定し、 2 . 5 /z gを RiboMax T7転写キット（Promega) の反応組成に最終体積 5 0 μ 1になるように加え、 3 7 °Cで 1時間反応させた。次にこの反応液に RQ1 Rnase— free DNase (Promega)を 2 . 5 units加え、 3 7 °Cで 1 5分反応した。これをフエノール抽出し、 PrimerRemoverで精製した。これを 8 M尿素変性アクリルアミド電気泳動で解析した。結果を図 2 3に示す。図 2 3の結果力ら、連結された D NAからの R N Aが主バンドとして転写されたことがわかった。

このように作成したランダムな 5残基を含むレクチン様ぺプチドの配列と支持体タンノク質 Pou— specific domainをコードし 7こ mR NAfま in vitro virus用スぺーサ（DNA- PEG - Puromycin) と 5 0 °Cから 2 0 °Cになるまで 1 5分ほどかけて冷やした後、 T4 RNA ligase (Takara)を加え 2 5 °Cで 2 0分反応させ連結した。 in vitro virus用スぺーサは，ピューロマイシンが固定されだレジン Puromycin CPG (GLEN RESEARCH: 20-4040-01) から 5，側に向けて，スぺーサホスホアミダイト 18 (GLEN RESEARCH: 10-1918-90)を 3ュニット合成し， Amino-Modif ier C6 - dT (GLEN RESEARCH: 10-1039-90) を続けて結合、その後、通常の DNA合成試薬を用いて， D NA合成 (ccccccgccg ccccccgtcc tc；配歹 U番号 1 8 ) を行った.

これを R NA精製カラム（QIAGEN) で精製後、小麦胚芽系の無細胞翻訳系を用いて、 in vitro virus virion (mRNAとタンパク質が結合したもの）を作成、カルシゥム存在下、ノッファー A (Tris-HCl lOmM, NaCl 150 mM, CaCl₂ 25 mM, pH 6. 8) で N—ァセチルダルコサミンを固定したアビジンビーズ（EY Laboratories) と混ぜ、室温で 1時間インキュベーションした。次にバッファー Aで 4回洗浄後、力ルシゥムを除いたバッファー B (Tris-HCl lOmM, NaCl 150 mM, EDTA 2. 5 mM, pH 6. 8) で溶出した。バッファー Aで 4回洗浄すると溶出される in vitro virus virion はほとんどなくなるが、カルシウムのないバッファー Bで洗浄すると in vitro virus virion力³¹再ぴ溶出れること力ら、 in vitro virus virionに提不されていたぺプチドはカルシウムに依存してこの糖鎖に結合するぺプチドであることがわかる（図 2 4 )。

溶出された in vitro virus virionの mR NAは逆転写プライマー (gtcctctaga gctgcc；配列番号 7 J を用いて、 TrueScript II ReverseTranscriptase (ケヮティー）で以下の条件で逆転写した。反応は 2 0 // 1スケール。 9 0 °Cで 2分、 75°C から 25°C^ -— 0 . 0 5 5°C/秒で冷却、 2 5 °Cで 2分。ここで、逆転写酵素、 Rnase Inhibitorを加え、 5 0 で 1時間反応を行った。

その後、この反応液を Ι μ ΐ 取りプライマー（gatcccgcga aattaatacg actcactata ggg ； s己歹 lj番号 2 0 ) と ( gaggacgggg ggcggcgggg ggcagctcta gagctgcctc cccc；配列番号 1 7 ) を用レヽて Extaq Polymerase (Takara) で以下の条件で P C Rした。 9 5 °Cで 3 0秒、 6 4 °Cで 2 0秒、 7 2でで 2 0秒のサイクノレを 2 0回。

また、取得された配列をシークェンスした結果、最初のライプラリーに比べ水素結合しゃす!/、側鎖を多く持つぺプチドが得られてきた（図 2 5 )。このことから、この変異体 Pou - specif ic domainは機能べプチドを提示する支持体タンパク質として有用であることがわかった。産業上の利用の可能性

本発明により、短時間に効率よく R N A— D N A結合体を製造する方法を提供することが可能になった。さらに本発明により、タンパク質と R NAの複合体を効率よく製造することが可能になった。即ち、本発明の方法により、従来の方法では製造の効率が悪かった in vitro virus genomeを短時間に 9 0 %以上の効率で合成することが可能になり、さらにこの R N A— D N A結合体を無細胞翻訳系で翻訳することにより、タンパク質と R NAの結合効率も 1 0倍以上向上させることが可能になった。また、 R NAの逆転写のためのプライマー配列を D NAに付加させることにより、そのまま逆転写することが可能になり、タンパク質と D NAの複合体とすることで安定化することも可能である。本発明の方法は、進化分子工学における様々な新機能タンパク質の取得や，ボストゲノムにおけるタンパク質の相互作用解析に幅広く利用可能である。

また、本発明の T - Spacerは、 mRNAとライゲーションすることにより、 in vitro virus genomeを構築することができ、さらにこれを翻訳することで in vitro virus virionを容易に作製することができる。また、本発明の T- Spacerには、 mRNAの逆転写のためのプライマーとして作用する DNA配列を有していることから、上記で得られた in vitro virus virionを逆転写反応に付することにより、 mRNAを DNA に転換することができる。また、本発明の T - Spacerは親和性物質を有することにより、mRNA側で in vitro virus virionの精製を行なうことができるだけでなく、 mRNA を支持体に固定ィ匕してプロテインチップ作成する際においても有用である。さらに、本発明の T- Spacerを用いて製造された R NA—タンパク質複合体及ぴ D N A—タンパク質複合体は、核酸の機能の解析などにおいて有用な材料となり得るものである。

さらに本発明によれば、上記した特長を有する T - Spacerを用いて製造された核酸一タンパク質複合体（in vitro virus virion) を用いて、所望の機能を（生物活性）を有するタンパク質および/または核酸の効率的な選択、相互作用の検出や機能の解析などが可能となる。

さらに本発明によれば、ピューロマイシンの α—ァミノ基が酵素的に脱保護されるようにァミノ酸誘導体で保護した新規ピューロマイシン誘導体を提供することが可能になった。

さらに本発明によれば、比較的短いぺプチドは無細胞翻訳系で発現させることを可能とする支持体タンパク質を提供することが可能になった。

さらに本発明によれば、ランダムな配列を含む D NAをその多様性を損なわずに支持体タンパク質等のコードされた定型配列 D NAに連結し、続けて R NAに転写できることがわかった。これは in vitro virus法のような in vitroでタンパク質のスクリ一ユングをする場合、極めて重要な方法である。

Claims

請求の範囲

1. (1) 互いに相補的な配列を有する一本鎖 RNAと一本鎖 DN A又はその誘導体とをアニーリングさせる工程；及ぴ

(2) アニーリング産物を RN Aリガーゼで処理して、一本鎖 RN Aの 3，末端と一本鎖 DN A又はその誘導体の 5 ' 末端とを連結する工程：

を含む R N A _ D N A結合体の製造方法。

2. (1) 蛋白質をコードするコード配列を含み、 3，末端側に 5，から 3，方向にアニーリング配列とブランチ配列とを有する一本鎖 RNAと、 3，カゝら 5，方向に上記ァニーリング配列と相補的な配列とブランチ配列とを有する一本鎖 D N A又はその誘導体とをアニーリングする工程；及ぴ

を含む R N A— D N A結合体の製造方法。

3. 一本鎖 RNAが mRNA又は mRNAライブラリーである、請求項 1又は 2に記載の方法。

4. 一本鎖 RNAが、（1) プロモーター配列、（2) 翻訳の際にリボソームによって認識される塩基配列、及ぴ（3) 目的タンパク質をコードする配列を有することを特徴とする、請求項 1力ら 3の何れかに記載の方法。

5. 目的タンパク質が、目的ペプチド又は目的タンパク質と、 30から 20 0ァミノ酸残基からなる球状タンパク質から成ることを特徴とする目的ぺプチド又は目的タンパク質を融合タンパク質として発現及び提示するための支持体タンパク質とから成る融合タンパク質である、請求項 1から 4の何れかに記載の方法。

6. 一本鎖 DNA又はその誘導体として、 3' 末端に核酸誘導体が結合している一本鎖 DNAの誘導体を使用する、請求項 1から 5の何れかに記載の方法。

7. 一本鎖 DN A又はその誘導体として、 3，末端に核酸誘導体がスぺーサ一を介して結合している一本鎖 DNAの誘導体を使用する、請求項 1から 6の何れかに記載の方法。

8. 一本鎖 DN A又はその誘導体として、 3，末端に、一本鎖 RNAの逆転写の際にプライマーとして作用する配列を有する一本鎖 D N Aの誘導体を使用する、請求項 1カゝら 6の何れかに記載の方法。

9. 一本鎖 DNA又はその誘導体として、 3' 末端に、該一本鎖 RNAの逆転写のためのプライマー配列を有し、かつ核酸誘導体を末端に有するスぺーサーが枝分かれした状態で結合している一本鎖 D N Aの誘導体を使用する、請求項 1 から 5の何れかに記載の方法。

10. 核酸誘導体が、ピューロマイシン、 3， -N -アミノアシルピュー口マイシンァミノヌクレオシド、 3' - N-ァミノアシルアデノシンァミノヌクレオシドの化学構造骨格を含む化合物又はそれらの類縁体である、請求項 5から 9の何れかに記載の方法。

1 1. スぺーサ一がポリエチレン又はポリエチレングリコールなどの高分子である、請求項 7から 10の何れかに記載の方法。

12. RNAリガーゼが T4RNAリガーゼである、請求項 1から 11の何れかに記載の方法。

13. 請求項 1から 12の何れかに記載の方法により得られる RNA— DN A結合体。

14. 請求項 1から 12の何れかに記載の方法により得られる RNA— DN A結合体を逆転写反応に付して DN A結合体を製造する方法。

15. 請求項 1から 12の何れかに記載の方法により得られる RNA— DN A結合体をタンパク質翻訳系に導入して RNAをタンパク質に翻訳することを特徴とする、 RNAと該 RNAによりコードされるタンパク質から成る RNA—タンパク質複合体の製造方法。

16. 請求項 15に記載の製造方法により製造される RNA—タンパク質複合体。

17. 請求項 16に記載の RNA—タンパク質複合体を逆転写反応に付することを特徴とする、 DNAと該 DNAによりコードされるタンパク質から成る核酸—タンパク質複合体の製造方法。

18. 請求項 17に記載の製造方法により製造される核酸一タンパク質複合体。

19. 一本鎖 RNAの 3，末端側の配列とアニーリングすることができる一本鎖 DNA配列を 3，末端側に含み、該一本鎖 DNA配列が、その 3，末端に、該一本鎖 R N Aの逆転写のためのプライマ一配列を有し、かつ核酸誘導体を末端に有するスぺーサ一が枝分かれした状態で結合しており、該一本鎖 DN A配列の 5' 末端側に親和性物質が結合している、一本鎖 RNAとそれがコードするタンパク質との複合体を作製するための核酸構築物。

20. 該一本鎖 DN A配列の 5' 末端側に制限酵素認識部位が存在する、請求項 19に記載の核酸構築物。

21. —本鎖 RNAの 3' 末端側の配列とアニーリングすることができる一本鎖 DN A配列を 3，末端側に含む、一本鎖 RN Aとそれがコードするタンパク質との複合体を作製するための核酸構築物において、

(1) 該一本鎖 DN A配列が、その 3，末端に、該一本鎖 RN Aの逆転写のためのプライマー配列を有し、かつ核酸誘導体を末端に有するスぺーサ一が枝分かれした状態で結合しており、

( 2 )該核酸構築物において該一本鎖 RN Aと了ニーリングしない 5 '末端側は、ループ領域を介して互いに相補的な二本鎖配列を形成しており、

( 3 ) 該ループ領域に親和性物質が結合している、

ことを特徴とする上記の核酸構築物。

22. 一本鎖 RNAの 3，末端側の配列とァニーリングすることができる一本鎖 DNA配列を 3，末端側に含む、一本鎖 RNAとそれがコードするタンパク質との複合体を作製するための核酸構築物において、

( 2 )該核酸構築物において該一本鎖 RN Aとァニーリングしない 5，末端側は、相補 DNA鎖と化学的に結合して互いに相補的な二本鎖配列を形成しており、

(3) 該相捕 DNA鎖の 3' 末端に親和性物質が結合している、

ことを特徴とする上記の核酸構築物。

23. 該ニ本鎖配列中に制限酵素認識部位が存在する、請求項 21又は 22 に記載の核酸構築物。

24. 核酸誘導体が、ピューロマイシン、 3， - N -アミノアシルピュー口マイシンアミノヌクレオシド、 3， -N -ァミノァシルアデノシンァミノヌクレオシドの化学構造骨格を含む化合物又はそれらの類縁体である、請求項 19から 23の何れかに記載の核酸構築物。

25. スぺーサ一がポリエチレン又はポリエチレンダリコールなどの高分子である、請求項 19から 24の何れかに記載の核酸構築物。

26. 親和性物質がピオチン又はポリ A配列である、請求項 19から 25の何れかに記載の核酸構築物。

27. 請求項 19から 26の何れかに記載の核酸構築物と一本鎖 R N Aとをァニーリングさせ、該核酸構築物の二本鎖領域の 5，末端と一本鎖 RNAの 3，末端とをライゲーシヨンさせることを含む、 RNA— DNA結合体の作製方法。

28. ライゲーシヨンを T 4 RN Aリガーゼを用いて行なう、請求項 27に記載の方法。

29. —本鎖 RNAが mRNA又は mRNAライブラリーである、請求項 2 7又は 28に記載の方法。

30. —本鎖 RNAが、（1) プロモーター配列、（2) 翻訳の際にリポソ一ムによって認識される塩基配列、及び（3) 目的タンパク質をコードする配列を有することを特徴とする、請求項 27から 29の何れかに記載の方法。

31. 目的タンパク質が、目的ペプチド又は目的タンパク質と、 30から 2 00アミノ酸残基からなる球状タンパク質から成ることを特徴とする目的べプチド又は目的タンパク質を融合タンパク質として発現及び提示するための支持体タンパク質とから成る融合タンパク質である、請求項 27から 30の何れかに記載の方法。

32. 請求項 27から 31の何れかに記載の方法により得られる RNA— D NA結合体。

33. 請求項 32に記載の RNA— DNA結合体を支持体上に固定化したチップ。

34. 請求項 27から 31の何れかに記載の方法により得られる RNA— D N A結合体を逆転写反応に付して D N A結合体を製造する方法。

35. 請求項 27から 31の何れかに記載の方法により得られる RNA— D N A結合体を逆転写反応に付することにより得られる DN A結合体。

36. 請求項 35に記載の DN A結合体を支持体上に固定ィ匕したチップ。

37. 請求項 32に記載の RN A— DN A結合体をタンパク質翻訳系に導入して RNAをタンパク質に翻訳することを特徴とする、 RNAと該 RNAによりコードされるタンパク質から成る RNA—タンパク質複合体の製造方法。

38. 翻訳を無細胞翻訳系で行なう、請求項 37に記載の作製方法。

39. 請求項 32に記載の RN A— DN A結合体をタンパク質翻訳系に導入して RNAをタンパク質に翻訳することにより得られる、 RNAと該 RNAによりコードされるタンパク質から成る RNA—タンパク質複合体。

40. 請求項 39に記載の RNA—タンパク質複合体を支持体上に固定化したチップ。

41. 請求項 39に記載の RNA—タンパク質複合体を逆転写反応に付することを特徴とする、核酸と該核酸によりコードされるタンパク質から成る核酸一タンパク質複合体の製造方法。

42. 請求項 39に記載の RN A—タンパク質複合体を逆転写反応に付することにより得られる核酸一タンパク質複合体。

43. 請求項 42に記載の核酸一タンパク質複合体を支持体上に固定ィヒしたチップ。

44. (1) 請求項 13または 32に記載の RNA— DNA結合体を調製する調製工程、 ( 2 )調製工程で得られた RNA— DN A結合体をタンパク質翻訳系に導入して RNAをタンパク質に翻訳させて RNAと該 RNAによりコードされるタンパク質から成る RNA—タンパク質複合体を構築する構築工程、（ 3 )構築工程で得られた R N A—タンパク質複合体を被験物質との相互作用に基づいて選抜する選抜工程、および、（5)選抜工程で選択された RN A—タンパク質複合体の核酸部分を増幅する増幅工程とを含むことを特徴とする核酸および Zまたはタンパク質の選択方法。

45. 増幅工程で得られた核酸を、一本鎖 RNAとして RNA— DNA結合体を調製する調製工程に供し、（1) 調製工程、（2) 構築工程、（3) 選抜ェ程、および、（5) 増幅工程を繰り返し行うことを特徴とする請求項 44に記載の方法。

46. (1) (a) —本鎖 RN Aの 3，末端側の配列とアニーリングすることができる一本鎖 DN A配列を 3' 末端側に含む核酸構築物を調製し、（b) 該核酸構築物と一本鎖 RN Aとをアニーリングさせ、（c) 該アニーリング産物の一本鎖 RNAの 3，末端と核酸構築物の 5，末端とを連結させて RNA— DNA 結合体を調製する調製工程、（2) 調製工程で得られた RNA— DNA結合体をタンパク質翻訳系に導入して RN Aをタンパク質に翻訳させて RN Aと該 RN A によりコードされるタンパク質から成る RNA—タンパク質複合体を構築する構築工程、 (3) 構築工程で得られた RNA—タンパク質複合体を被験物質との相互作用に基づいて選抜する選抜工程、（4) 選抜工程で選択された RN A—タンパク質複合体の核酸部分に変異を導入する変異導入工程、および、（5) 変異導入工程で得られた核酸部分を増幅する増幅工程とを含むことを特徴とする核酸および Zまたはタンパク質の選択方法。

47. 増幅工程で得られた核酸を、一本鎖 RNAとして RNA— DNA結合体を調製する調製工程に供し、（1) 調製工程、（2) 構築工程、（3) 選抜ェ程、（4) 変異導入工程、および、（5) 増幅工程を繰り返し行うことを特徴とする、請求項 46に記載の方法。

48. (1) (a) —本鎖 RNAの 3，末端側の配列とアニーリングすることができる一本鎖 DNA配列を 3，末端側に含む核酸構築物を調製し、（b) 該核酸構築物と一本鎖 RN Aとをアニーリングさせ、（c) 該アニーリング産物の一本鎖 RNAの 3，末端と核酸構築物の 5，末端とを連結させて RNA— DNA 結合体を調製する調製工程、 (2) 該 RNA— DNA結合体をタンパク質翻訳系に導入して RNAをタンパク質に翻訳させて RNAと該 RNAによりコードされるタンパク質から成る核酸一タンパク質複合体を構築する構築工程、およぴ、

( 6 ) 構築工程で得られた核酸一タンパク質複合体と被験物質との相互作用を調ベる検定工程とを含むことを特徴とするタンパク質と被験物質との相互作用の検出方法。

49. 下記式（1) で表されるピューロマイシン誘導体又はその塩。

(式中、 R¹は水素原子、又は水酸基の保護基を示し；

R ²は水素原子又は反応性基を示し；

Xはアミノ酸残基あるいはペプチドを示し、 Xにおいて、そのカルボキシル基がピュー口マイシン中のァミノ基とアミド結合により結合しており、該ァミノ酸残基あるいはぺプチドのァミノ基おょぴ側鎖の官能基は所望により保護されていてもよい。)

5 0 . アミノ酸残基あるいはペプチドが芳香族アミノ酸残基である、請求項 4 9に記載のピューロマイシン誘導体叉はその塩。

5 1 . 該芳香族ァミノ酸残基がフヱニルァラ二ン残基である、請求項 4 9又は 5 0に記載のピューロマイシン誘導体又はその塩。

5 2 . Xが、 Ν α—（N o;—べンジルォキシカルボユルフェニルァラニル基である、請求項 4 9から 5 1の何れかに記載のピューロマイシン誘導体又はその塩。

5 3 . R ²が示す反応性基力 S、末端にカルボキシル基を有する反応性基である、請求項 4 9から 5 2の何れかに記載のピューロマイシン誘導体又はその塩。

5 4 . R ²が示す反応性基がスクシ二/レ基である、請求項 4 9力ら 5 3の何れかに記載のピュー口マイシン誘導体又はその塩。

5 5 . 請求項 4 9から 5 4の何れかに記載のピューロマイシン誘導体を支持体に結合してなる、ピューロマイシン誘導体固定化支持体。

5 6 . R ²が示す反応性基と、支持体中の反応性基とを反応させることにより得られる、請求項 5 5に記載のピュー口マイシン誘導体固定化支持体。

5 7 . 支持体が、 C P G (Controlled Pore Glass)である、請求項 5 5又は 5 6に記載のピュー口マイシン誘導体固定化支持体。

5 8 . 請求項 4 9から 5 4の何れかに記載のピューロマイシン誘導体をぺプチダーゼあるいはプロテアーゼで処理することにより、下記式（2 ) で表される化合物を製造することを含む、ピュー口マイシン誘導体の脱保護方法。

5 9 . ぺプチダーゼあるいはプロテアーゼがキモトリプシンである、請求項 5 8に記載のピュー口マイシン誘導体の脱保護方法。

6 0 . 請求項 4 9から 5 4の何れかに記載のピュー口マイシン誘導体又は請求項 5 5から 5 7の何れかに記載のピューロマイシン誘導体固定化支持体を用いた核酸化合物の製造方法。

6 1 . 請求項 4 9から 5 4の何れかに記載のピューロマイシン誘導体を有する核酸化合物。

6 2 . 請求項 6 1に記載の核酸ィヒ合物をぺプチダーゼあるいはプロテアーゼで処理することによりピューロマイシン誘導体の脱保護を行う、脱保護方法。

6 3 . ぺプチダーゼあるいはプロテァーゼがキモトリプシンである、請求項 6 2に記載の脱保護方法。

6 4 . 3 0から 2 0 0アミノ酸残基からなる球状タンパク質から成ることを特徴とする、目的ぺプチド又は目的タンパク質を融合タンパク質として発現及ぴ提示するための支持体タンパク質。

6 5 . システィン残基を含まなレ、、請求項 6 4に記載の支持体タンパク質。

6 6 . タンパク質の二次構造として /3シート構造を有さず、 _αヘリックス構造からなる、請求項 6 4又は 6 5に記載の支持体タンパク質。

6 7 . タンパク質の立体構造において、 N末端と C末端が離れている、請求項 6 4から 6 6の何れかに記載の支持体タンパク質。

6 8 . 他の生体高分子と相互作用しない、請求項 6 4から 6 7の何れかに記載の支持体タンパク質。

6 9 . 下記の何れかのアミノ酸配列を有する、目的ペプチド又は目的タンパク質を融合タンパク質として提示するための支持体タンパク質。

( 1 ) 配列番号 2 1に記載のァミノ酸配列；又は

7 0 . 目的ペプチド又は目的タンパク質をコードする塩基配列および請求項 6 4から 6 9の何れかに記載の支持体タンパク質をコードする塩基配列が直接またはリンカ一を介して連結してなる、目的ペプチド又は目的タンパク質と支持体タンパク質とから成る融合タンパク質をコードする核酸またはその修飾体。

7 1 . 目的ペプチド又は目的タンパク質と請求項 6 4から 6 9の何れかに記載の支持体タンパク質とから成る融合タンパク質。

7 2 . 請求項 7 0に記載の核酸またはその修飾体を、無細胞翻訳系または生細胞において発現させる工程を含む、請求項 7 1に記載の融合タンパク質を製造する方法。

7 3 . 目的べプチド又は目的タンパク質をコードする塩基配列および請求項 6 4から 6 9の何れかに記載の支持体タンパク質をコードする塩基配列が直接またはリンカ一を介して連結してなる目的ぺプチド又は目的タンパク質と支持体タンパク質とから成る融合タンパク質をコードする mR NAであって、その 3，末端に核酸誘導体が結合している mR NAを、無細胞翻訳系または生細胞において発現させる工程を含む、融合タンパク質とそれをコードする核酸とから成る複合体を製造する方法。

74. 核酸誘導体が、ピューロマイシン、 3， - N -アミノアシルピュー口マイシンアミノヌクレオシド、 3， - N -ァミノアシルアデノシンアミノヌクレオシドの化学構造骨格を含む化合物又はそれらの類縁体である、請求項 73に記載の方法。

75. 融合タンパク質をコードする mRNAとして、 3 ' 末端に核酸誘導体がスぺーサーを介して結合している _mRNAを使用する、請求項 73又は 74に記載の方法。

76. スぺーサ一がポリエチレン又はポリエチレングリコールなどの高分子である、請求項 74又は 75に記載の方法。

77. ( 1 ) 無細胞翻訳系または生細胞において、目的ぺプチド又は目的タンパク質を含むライブラリーを、請求項 72から 76の何れかの方法により、請求項 64から 69の何れかに記載の支持体タンパク質との融合タンパク質の形態で発現させる工程；及び、

(2) 工程 (1) で得られた融合タンパク質をスクリーニングすることにより所望の機能を有する目的べプチド又は目的タンパク質を選択する工程：

を含む、機能性ぺプチド又はタンパク質のスクリ一二ング方法。

78. 互いに相補的な共通配列を有する異なる 2種類以上の 1本鎖または 2 本鎖 DNAをプライマーの非存在下において DNA合成酵素を用いて反応させる工程、上記工程で得た混合物を用いて RNAポリメラーゼの存在下で転写反応を行い R N Aを合成する工程、および D N A分解酵素で D N Aを分解する工程を含む、請求項 1から 12、 14、 15、 17、 27から 30、 31、 34、 37、 38、 41、 44から 48の何れかに記載の方法に用いるための一本鎖 RNAの製造方法。

79. DN A合成酵素を用いた反応が、 T a qポリメラーゼを用いるポリメラーゼ連鎖反応（P C R)である、請求項 78に記載の一本鎖 RN Aの製造方法。

80. 異なる 2種類以上の 1本鎖または 2本鎖 DN Aのうちの片方の DN A が目的配列を含む DNAである、請求項 78または 79に記載の一本鎖 RNAの製造方法。

81. 異なる 2種類以上の 1本鎖または 2本鎖 DNAのうちの片方の DNA が目的配列を含む DN Aであり、他方の DN Aが支持体タンパク質をコードする DNAである、請求項 78から 80の何れかに記載の一本鎖 RN Aの製造方法。

82. 支持体タンパク質が、 30から 200アミノ酸残基からなる球状タンパク質から成るタンパク質である、請求項 81に記載の核酸の一本鎖 RN Aの製造方法。

83. 請求項 78から 82の何れかに記載の方法により得られる RNA。

84. (1) 互いに相補的な共通配列を有する異なる 2種類以上の 1本鎖または 2本鎖 DN Aをプライマーの非存在下において DN A合成酵素を用いて反応させることにより、連結した D N Aと連結しない D N Aを含む混合物を調製する工程；

(2) 工程（1) で得た混合物を用いて RN Aポリメラーゼの存在下で転写反応を行い RN Aを合成する工程；及ぴ

(3) 工程 (2) で得た RNAを、無細胞翻訳系または生細胞において発現させる工程を含む、タンパク質の製造方法。

85. (1) 互いに相補的な共通配列を有する異なる 2種類以上の 1本鎖または 2本鎖 DN Aをプライマーの非存在下において DN A合成酵素を用いて反応させることにより、連結した DNAと連結しない DNAを含む混合物を調製する工程；

. (2) 工程 (1) で得た混合物を用いて RN Aポリメラーゼの存在下で転写反応を行い RN Aを合成する工程；

(3) 工程（2) で得た RN Aの 3，末端を核酸誘導体で修飾する工程；及び

(4) 工程（3) で得た 3' 末端を核酸誘導体で修飾した RNAを、無細胞翻訳系または生細胞において発現させる工程を含む、タンパク質とそれをコードする核酸との複合体の製造方法。

86. 核酸誘導体が、ピューロマイシン、 3， -N -アミノアシルピュー口マイシンアミノヌクレオシド、 3， -N-Tミノアシルアデノシンァミノヌクレオシドの化学構造骨格を含む化合物又はそれらの類縁体である、請求項 85に記載の方法。

87. mRNAとして、 3，末端に核酸誘導体がスぺーサーを介して結合している mRNAを使用する、請求項 85又は 86に記載の方法。

88. スぺーサ一がポリエチレン又はポリエチレングリコールなどの高分子である、請求項 87に記載の方法。