JP2002265492A - ピューロマイシン誘導体及びその利用 - Google Patents
ピューロマイシン誘導体及びその利用Info
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- JP2002265492A JP2002265492A JP2001065257A JP2001065257A JP2002265492A JP 2002265492 A JP2002265492 A JP 2002265492A JP 2001065257 A JP2001065257 A JP 2001065257A JP 2001065257 A JP2001065257 A JP 2001065257A JP 2002265492 A JP2002265492 A JP 2002265492A
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- 0 CN(C)c1ncnc2c1nc[n]2[C@@]([C@@]1O)OC(CNC(CN(C(C*)=O)I*)=O)C1NC([C@](*)Cc(cc1)ccc1OC)=O Chemical compound CN(C)c1ncnc2c1nc[n]2[C@@]([C@@]1O)OC(CNC(CN(C(C*)=O)I*)=O)C1NC([C@](*)Cc(cc1)ccc1OC)=O 0.000 description 1
Abstract
(57)【要約】
【課題】 ピューロマイシン誘導体を効率よく合成する
ための方法を確立すること。 【解決手段】 下記式（１）で表される化合物又はその
塩。 【化１】 （式中、Ｌ1はスペーサー基を示し、Ｒ1は反応性基を示
し、Ｎｕはピリミジン塩基又はプリン塩基の残基を示
す。）
ための方法を確立すること。 【解決手段】 下記式（１）で表される化合物又はその
塩。 【化１】 （式中、Ｌ1はスペーサー基を示し、Ｒ1は反応性基を示
し、Ｎｕはピリミジン塩基又はプリン塩基の残基を示
す。）
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、ピューロマイシン
誘導体、並びにその利用に関する。より詳細には、本発
明は、合成ユニットの結合にペプチド結合が用いられた
ピューロマイシン誘導体（ＰＮＡ化ピューロマイシン誘
導体）、並びにその利用に関する。
誘導体、並びにその利用に関する。より詳細には、本発
明は、合成ユニットの結合にペプチド結合が用いられた
ピューロマイシン誘導体（ＰＮＡ化ピューロマイシン誘
導体）、並びにその利用に関する。
【０００２】
【従来の技術】抗生物質であるピューロマイシンは、リ
ボソーム上でｍＲＮＡがタンパク質に翻訳される際に合
成途中のタンパク質のＣ末端に取り込まれることでタン
パク質合成を阻害する。本発明者らはこの性質を利用す
ることでピューロマイシン誘導体をプロテオーム研究や
進化分子工学に応用する方法をこれまでに２つ確立し
た。第１の方法は、タンパク質のＣ末端を１分子ラベル
する方法であり、有機合成で得られたピューロマイシン
誘導体の存在下で目的のタンパク質のｍＲＮＡを翻訳す
ることにより蛍光色素やビオチンなどの分子プローブで
Ｃ末端が特異的に修飾されたタンパク質を調製すること
ができる（Nemoto, N., et al (1999) FEBSLett. 462,
43-46）。第２の方法は、In Vitro Virus法と呼ばれる
ものであり、スペーサーを介してピューロマイシンとｍ
ＲＮＡをあらかじめ結合させ、これを翻訳することによ
り遺伝情報を有するタンパク質のライブラリーを得るこ
とができる（Nemoto, N. et al (1997) FEBS Lett. 41
4, 405-408, Roberts, R. W. etal (1997) Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 94, 12297-12302）。
ボソーム上でｍＲＮＡがタンパク質に翻訳される際に合
成途中のタンパク質のＣ末端に取り込まれることでタン
パク質合成を阻害する。本発明者らはこの性質を利用す
ることでピューロマイシン誘導体をプロテオーム研究や
進化分子工学に応用する方法をこれまでに２つ確立し
た。第１の方法は、タンパク質のＣ末端を１分子ラベル
する方法であり、有機合成で得られたピューロマイシン
誘導体の存在下で目的のタンパク質のｍＲＮＡを翻訳す
ることにより蛍光色素やビオチンなどの分子プローブで
Ｃ末端が特異的に修飾されたタンパク質を調製すること
ができる（Nemoto, N., et al (1999) FEBSLett. 462,
43-46）。第２の方法は、In Vitro Virus法と呼ばれる
ものであり、スペーサーを介してピューロマイシンとｍ
ＲＮＡをあらかじめ結合させ、これを翻訳することによ
り遺伝情報を有するタンパク質のライブラリーを得るこ
とができる（Nemoto, N. et al (1997) FEBS Lett. 41
4, 405-408, Roberts, R. W. etal (1997) Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 94, 12297-12302）。
【０００３】ピューロマイシンはヌクレオシド骨格を有
しており、その誘導体は核酸合成の方法の中で現在最も
主流であり核酸自動合成機にも応用されているホスホア
ミダイト法を用いて合成することができる。例えばデオ
キシシチジンとビオチンを導入した誘導体は、これらの
ホスホアミダイト誘導体をピューロマイシンの5'末端に
通常のホスホアミダイト法の合成サイクルで順次結合さ
せていくことで合成することができる。しかし指定され
た配列を持ったオリゴヌクレオチドを確実に得ることを
目的として開発されたホスホアミダイト法は、ヌクレオ
チド以外のユニットの導入や複雑な誘導体の合成には必
ずしも適しておらず、さらに効率よく誘導体を大量調製
することにも向いていない。
しており、その誘導体は核酸合成の方法の中で現在最も
主流であり核酸自動合成機にも応用されているホスホア
ミダイト法を用いて合成することができる。例えばデオ
キシシチジンとビオチンを導入した誘導体は、これらの
ホスホアミダイト誘導体をピューロマイシンの5'末端に
通常のホスホアミダイト法の合成サイクルで順次結合さ
せていくことで合成することができる。しかし指定され
た配列を持ったオリゴヌクレオチドを確実に得ることを
目的として開発されたホスホアミダイト法は、ヌクレオ
チド以外のユニットの導入や複雑な誘導体の合成には必
ずしも適しておらず、さらに効率よく誘導体を大量調製
することにも向いていない。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、ピューロマ
イシン誘導体を効率よく合成するための方法を確立する
ことを解決すべき課題とした。本発明はまた、タンパク
質の効率のよいＣ末端ラベルを行なうために使用するこ
とができるピューロマイシン誘導体を提供することを解
決すべき課題とした。本発明はさらにピューロマイシン
誘導体を利用して核酸とそれがコードするタンパク質の
複合体を形成させるための方法を提供することを解決す
べき課題とした。
イシン誘導体を効率よく合成するための方法を確立する
ことを解決すべき課題とした。本発明はまた、タンパク
質の効率のよいＣ末端ラベルを行なうために使用するこ
とができるピューロマイシン誘導体を提供することを解
決すべき課題とした。本発明はさらにピューロマイシン
誘導体を利用して核酸とそれがコードするタンパク質の
複合体を形成させるための方法を提供することを解決す
べき課題とした。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明者らは上記課題を
解決するために鋭意検討した結果、合成ユニットの結合
にペプチド結合が用いられたピューロマイシン誘導体
（ＰＮＡ化ピューロマイシン誘導体）を合成し、これを
用いてタンパク質のＣ末端１分子ラベルを行なうと効率
よくタンパク質をラベル化できることを見出した。本発
明はこの知見に基づいて完成したものである。
解決するために鋭意検討した結果、合成ユニットの結合
にペプチド結合が用いられたピューロマイシン誘導体
（ＰＮＡ化ピューロマイシン誘導体）を合成し、これを
用いてタンパク質のＣ末端１分子ラベルを行なうと効率
よくタンパク質をラベル化できることを見出した。本発
明はこの知見に基づいて完成したものである。
【０００６】即ち、本発明によれば、下記式（１）で表
される化合物又はその塩が提供される。
される化合物又はその塩が提供される。
【化７】 （式中、Ｌ1はスペーサー基を示し、Ｒ1は反応性基を示
し、Ｎｕはピリミジン塩基又はプリン塩基の残基を示
す。）
し、Ｎｕはピリミジン塩基又はプリン塩基の残基を示
す。）
【０００７】式（１）において好ましくは、Ｌ1は炭素
数１〜６のアルキレン基を示し、特に好ましくは、Ｌ1
はエチレン基である。式（１）において好ましくは、Ｒ
1はアミノ基または保護されたアミノ基である。式
（１）において好ましくは、Ｎｕはピリミジン塩基の残
基であり、特に好ましくは、Ｎｕはシトシンの残基であ
る。本発明の特に好ましい式（１）の化合物は、下記式
（２）で表される化合物又はその塩である。
数１〜６のアルキレン基を示し、特に好ましくは、Ｌ1
はエチレン基である。式（１）において好ましくは、Ｒ
1はアミノ基または保護されたアミノ基である。式
（１）において好ましくは、Ｎｕはピリミジン塩基の残
基であり、特に好ましくは、Ｎｕはシトシンの残基であ
る。本発明の特に好ましい式（１）の化合物は、下記式
（２）で表される化合物又はその塩である。
【化８】
【０００８】本発明の別の側面によれば、下記式（３）
で表される化合物又はその塩が提供される。
で表される化合物又はその塩が提供される。
【化９】 （式中、Ｌ1及びＬ3は各々独立にスペーサー基を示し、
Ｌ2は連結基を示し、Ｎｕはピリミジン塩基又はプリン
塩基の残基を示し、Ｘは標識物質の残基を示す。）
Ｌ2は連結基を示し、Ｎｕはピリミジン塩基又はプリン
塩基の残基を示し、Ｘは標識物質の残基を示す。）
【０００９】式（３）において好ましくは、Ｌ1及びＬ3
は各々独立に炭素数１〜６のアルキレン基を示す。式
（３）において好ましくは、Ｌ2は−ＣＯ−ＮＨ−基で
あり、窒素原子がＬ1と連結し、炭素原子がＬ3と連結し
ている。式（３）において好ましくは、Ｎｕはピリミジ
ン塩基の残基である。式（３）において好ましくは、Ｎ
ｕはシトシンの残基である。式（３）において好ましく
は、Ｘは蛍光物質の残基を示す。本発明の特に好ましい
式（３）の化合物は、式（４）で表される化合物又はそ
の塩である。
は各々独立に炭素数１〜６のアルキレン基を示す。式
（３）において好ましくは、Ｌ2は−ＣＯ−ＮＨ−基で
あり、窒素原子がＬ1と連結し、炭素原子がＬ3と連結し
ている。式（３）において好ましくは、Ｎｕはピリミジ
ン塩基の残基である。式（３）において好ましくは、Ｎ
ｕはシトシンの残基である。式（３）において好ましく
は、Ｘは蛍光物質の残基を示す。本発明の特に好ましい
式（３）の化合物は、式（４）で表される化合物又はそ
の塩である。
【化１０】
【００１０】本発明のさらに別の側面によれば、下記式
（５）で表される化合物又はその塩が提供される。
（５）で表される化合物又はその塩が提供される。
【化１１】 （式中、Ｌ1、Ｌ3、Ｌ6、Ｌ8、Ｌ9、Ｌ11及びＬ13は各
々独立にスペーサー基を示し、Ｌ2、Ｌ4、Ｌ5、Ｌ7、Ｌ
10、Ｌ12は各々独立に連結基を示し、Ｎｕはピリミジン
塩基又はプリン塩基の残基を示し、Ｘ1及びＸ2は各々独
立に標識物質の残基を示す。）
々独立にスペーサー基を示し、Ｌ2、Ｌ4、Ｌ5、Ｌ7、Ｌ
10、Ｌ12は各々独立に連結基を示し、Ｎｕはピリミジン
塩基又はプリン塩基の残基を示し、Ｘ1及びＸ2は各々独
立に標識物質の残基を示す。）
【００１１】式（５）において好ましくは、Ｌ1、Ｌ3、
Ｌ6、Ｌ8、Ｌ9、Ｌ11及びＬ13は各々独立に各々独立に
炭素数１〜６のアルキレン基を示す。式（５）において
好ましくは、Ｌ2、Ｌ4、Ｌ5、Ｌ7、Ｌ10、Ｌ12は各々独
立に−ＣＯ−ＮＨ−基である。式（５）において好まし
くは、Ｎｕはピリミジン塩基の残基である。式（５）に
おいて好ましくは、Ｎｕはシトシンの残基である。式
（５）において好ましくは、Ｘは蛍光物質の残基を示
す。本発明の特に好ましい式（５）の化合物は、式
（６）で表される化合物又はその塩である。
Ｌ6、Ｌ8、Ｌ9、Ｌ11及びＬ13は各々独立に各々独立に
炭素数１〜６のアルキレン基を示す。式（５）において
好ましくは、Ｌ2、Ｌ4、Ｌ5、Ｌ7、Ｌ10、Ｌ12は各々独
立に−ＣＯ−ＮＨ−基である。式（５）において好まし
くは、Ｎｕはピリミジン塩基の残基である。式（５）に
おいて好ましくは、Ｎｕはシトシンの残基である。式
（５）において好ましくは、Ｘは蛍光物質の残基を示
す。本発明の特に好ましい式（５）の化合物は、式
（６）で表される化合物又はその塩である。
【化１２】
【００１２】本発明のさらに別の側面によれば、式
（１）、式（３）又は式（５）で表される化合物又はそ
の塩を構成成分として含むタンパク質又はその誘導体が
提供される。本発明のさらに別の側面によれば、式
（１）、式（３）又は式（５）で表される化合物又はそ
の塩を構成成分として含む核酸又はその誘導体が提供さ
れる。本発明のさらに別の側面によれば、式（１）、式
（３）又は式（５）で表される化合物又はその塩をタン
パク質中に取り込ませる工程を含む、修飾タンパク質の
製造方法が提供される。本発明のさらに別の側面によれ
ば、式（１）、式（３）又は式（５）で表される化合物
又はその塩を核酸中に取り込ませる工程を含む、修飾核
酸の製造方法が提供される。
（１）、式（３）又は式（５）で表される化合物又はそ
の塩を構成成分として含むタンパク質又はその誘導体が
提供される。本発明のさらに別の側面によれば、式
（１）、式（３）又は式（５）で表される化合物又はそ
の塩を構成成分として含む核酸又はその誘導体が提供さ
れる。本発明のさらに別の側面によれば、式（１）、式
（３）又は式（５）で表される化合物又はその塩をタン
パク質中に取り込ませる工程を含む、修飾タンパク質の
製造方法が提供される。本発明のさらに別の側面によれ
ば、式（１）、式（３）又は式（５）で表される化合物
又はその塩を核酸中に取り込ませる工程を含む、修飾核
酸の製造方法が提供される。
【００１３】
【発明の実施の形態】以下、本発明の実施の形態につい
てより詳細に説明する。（Ｉ） 式（１）で表される化合物について 本発明は、合成ユニットの結合にペプチド結合が用いら
れたピューロマイシン誘導体（ＰＮＡ化ピューロマイシ
ン誘導体）に関するものであり、具体的には、式（１）
で表される化合物又はその塩に関するものである。
てより詳細に説明する。（Ｉ） 式（１）で表される化合物について 本発明は、合成ユニットの結合にペプチド結合が用いら
れたピューロマイシン誘導体（ＰＮＡ化ピューロマイシ
ン誘導体）に関するものであり、具体的には、式（１）
で表される化合物又はその塩に関するものである。
【００１４】
【化１３】
【００１５】式（１）において、Ｌ1はスペーサー基を
示し、Ｒ1は反応性基を示し、Ｎｕはピリミジン塩基又
はプリン塩基の残基を示す。Ｌ1が示すスペーサー基と
しては、アルキレン基、アルケニレン基、アルキニレン
基又はこれらの組み合わせが挙げられ、これらの炭素原
子上には１又は複数の置換基が存在していてもよい。主
鎖の炭素数の数は特に限定されないが、好ましくは炭素
数１から１０であり、より好ましくは炭素数１から６で
あり、さらに好ましくは炭素数１から４である。主鎖の
炭素原子上に存在することができる置換基の種類は特に
限定されないが、炭素数１〜４のアルキル基、炭素数１
〜４のアルケニル基、炭素数１〜４のアルキニル基、水
酸基又はハロゲン原子（例えば、フッ素、原子、塩素原
子、臭素原子、ヨウ素原子など）等を挙げることができ
る。Ｌ1が示すスペーサー基としては、無置換のアルキ
レン基、アルケニレン基、アルキニレン基又はこれらの
組み合わせが好ましく、無置換のアルキレン基がより好
ましく、メチレン基、エチレン基、プロピレン基、ブチ
レン基が特に好ましく、エチレン基が最も好ましい。
示し、Ｒ1は反応性基を示し、Ｎｕはピリミジン塩基又
はプリン塩基の残基を示す。Ｌ1が示すスペーサー基と
しては、アルキレン基、アルケニレン基、アルキニレン
基又はこれらの組み合わせが挙げられ、これらの炭素原
子上には１又は複数の置換基が存在していてもよい。主
鎖の炭素数の数は特に限定されないが、好ましくは炭素
数１から１０であり、より好ましくは炭素数１から６で
あり、さらに好ましくは炭素数１から４である。主鎖の
炭素原子上に存在することができる置換基の種類は特に
限定されないが、炭素数１〜４のアルキル基、炭素数１
〜４のアルケニル基、炭素数１〜４のアルキニル基、水
酸基又はハロゲン原子（例えば、フッ素、原子、塩素原
子、臭素原子、ヨウ素原子など）等を挙げることができ
る。Ｌ1が示すスペーサー基としては、無置換のアルキ
レン基、アルケニレン基、アルキニレン基又はこれらの
組み合わせが好ましく、無置換のアルキレン基がより好
ましく、メチレン基、エチレン基、プロピレン基、ブチ
レン基が特に好ましく、エチレン基が最も好ましい。
【００１６】Ｒ1が示す反応性基としては、標識物質を
結合させるために標識物質が有する反応性基と反応でき
る基であれば、特に限定されない。反応性基としては、
例えば、サクシンイミジルエステル基、ハロゲン置換ト
リアジニル基、ハロゲン置換ピリミジニル基、スルホニ
ルハライド基、α−ハロアセチル基、マレイミジル基、
アジリジニル基、メルカプト基、シアノ基、ニトロ基、
カルボキシル基、リン酸基、スルホ基、ヒドロキシ基、
アミノ基、イソチオシアナート基、イソシアナート基な
どを挙げることができ、これらは保護された基であって
もよい。Ｒ1はアミノ基または保護されたアミノ基であ
ることが特に好ましい。
結合させるために標識物質が有する反応性基と反応でき
る基であれば、特に限定されない。反応性基としては、
例えば、サクシンイミジルエステル基、ハロゲン置換ト
リアジニル基、ハロゲン置換ピリミジニル基、スルホニ
ルハライド基、α−ハロアセチル基、マレイミジル基、
アジリジニル基、メルカプト基、シアノ基、ニトロ基、
カルボキシル基、リン酸基、スルホ基、ヒドロキシ基、
アミノ基、イソチオシアナート基、イソシアナート基な
どを挙げることができ、これらは保護された基であって
もよい。Ｒ1はアミノ基または保護されたアミノ基であ
ることが特に好ましい。
【００１７】Ｎｕが示すピリミジン塩基の残基として
は、シトシン残基、チミン残基又はウラシル残基が挙げ
られ、Ｎｕが示すプリン塩基の残基としては、アデニン
残基又はグアニン残基が挙げられる。Ｎｕはピリミジン
塩基の残基であることが好ましく、シトシン残基である
ことがさらに好ましい。これらの塩基における結合位置
は特には限定されないが、天然の核酸の場合と同様の結
合位置であることが好ましく、シトシン残基の場合は１
位の窒素原子であることが好ましい。
は、シトシン残基、チミン残基又はウラシル残基が挙げ
られ、Ｎｕが示すプリン塩基の残基としては、アデニン
残基又はグアニン残基が挙げられる。Ｎｕはピリミジン
塩基の残基であることが好ましく、シトシン残基である
ことがさらに好ましい。これらの塩基における結合位置
は特には限定されないが、天然の核酸の場合と同様の結
合位置であることが好ましく、シトシン残基の場合は１
位の窒素原子であることが好ましい。
【００１８】式（１）で表される化合物は塩の形態で存
在することができる場合があるが、そのような塩の形態
の式（１）の化合物も本発明の範囲内である。塩の種類
は特に限定されないが、例えば、酸付加塩、金属塩、ア
ンモニウム塩、又は有機アミン付加塩等が包含される。
酸付加塩としては、塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩
等の無機酸塩、酢酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、又
はクエン酸塩等の有機酸塩が挙げられる。金属塩として
は、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩、マ
グネシウム塩、カルシウム塩等のアルカリ土類金属塩、
アルミニウム塩、又は亜鉛塩等が挙げられ、アンモニウ
ム塩としては、アンモニウム又はテトラメチルアンモニ
ウム等の塩が挙げられ、有機アミン付加塩としては、モ
ルホリン又はピペリジン等の付加塩が挙げられる。
在することができる場合があるが、そのような塩の形態
の式（１）の化合物も本発明の範囲内である。塩の種類
は特に限定されないが、例えば、酸付加塩、金属塩、ア
ンモニウム塩、又は有機アミン付加塩等が包含される。
酸付加塩としては、塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩
等の無機酸塩、酢酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、又
はクエン酸塩等の有機酸塩が挙げられる。金属塩として
は、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩、マ
グネシウム塩、カルシウム塩等のアルカリ土類金属塩、
アルミニウム塩、又は亜鉛塩等が挙げられ、アンモニウ
ム塩としては、アンモニウム又はテトラメチルアンモニ
ウム等の塩が挙げられ、有機アミン付加塩としては、モ
ルホリン又はピペリジン等の付加塩が挙げられる。
【００１９】式（１）の化合物には、位置異性体、幾何
異性体、互変異性体、又は光学異性体のような異性体が
存在するが、全ての可能な異性体、並びに２種類以上の
該異性体を任意の比率で含む混合物も本発明の範囲内の
ものである。
異性体、互変異性体、又は光学異性体のような異性体が
存在するが、全ての可能な異性体、並びに２種類以上の
該異性体を任意の比率で含む混合物も本発明の範囲内の
ものである。
【００２０】式（１）の化合物の塩を取得したい場合、
式（１）の化合物が塩の形態で得られる場合にはそのま
ま精製すればよく、また、遊離の形態で得られる場合に
は適当な溶媒に溶解又は懸濁させ、酸又は塩基を加えて
塩を形成させ単離、精製すればよい。また、式（１）の
化合物及びその塩は、水あるいは各種溶媒との付加物
（水和物又は溶媒和物）の形で存在することもあるが、
これらの付加物も本発明の範囲内のものである。また、
式（１）の化合物及びその塩の任意の結晶形も本発明の
範囲内のものである。
式（１）の化合物が塩の形態で得られる場合にはそのま
ま精製すればよく、また、遊離の形態で得られる場合に
は適当な溶媒に溶解又は懸濁させ、酸又は塩基を加えて
塩を形成させ単離、精製すればよい。また、式（１）の
化合物及びその塩は、水あるいは各種溶媒との付加物
（水和物又は溶媒和物）の形で存在することもあるが、
これらの付加物も本発明の範囲内のものである。また、
式（１）の化合物及びその塩の任意の結晶形も本発明の
範囲内のものである。
【００２１】次に、式（１）の化合物の製造方法につい
て説明する。合成ユニットの伸長は固相法、液相法のど
ちらを用いても行うことができる。ピューロマイシンの
アミノ基は伸長サイクルに適した保護基で保護してお
き、5'位に直接ペプチド結合を導入する場合は5'位の水
酸基をアミノ基に変換する。核酸ユニットとしてはＰＮ
Ａ (peptide / polyamide nucleic acids) 合成に用い
られるアミノエチルグリシン誘導体などを用いることが
できるが、主鎖のアミノ基と塩基部分に導入される保護
基は脱保護の際にピューロマイシンの脱プリンなどが生
じないものを選択することが好ましい。スペーサーやビ
オチンなどのユニットもカルボン酸誘導体あるいはその
活性エステルとして導入することができる。
て説明する。合成ユニットの伸長は固相法、液相法のど
ちらを用いても行うことができる。ピューロマイシンの
アミノ基は伸長サイクルに適した保護基で保護してお
き、5'位に直接ペプチド結合を導入する場合は5'位の水
酸基をアミノ基に変換する。核酸ユニットとしてはＰＮ
Ａ (peptide / polyamide nucleic acids) 合成に用い
られるアミノエチルグリシン誘導体などを用いることが
できるが、主鎖のアミノ基と塩基部分に導入される保護
基は脱保護の際にピューロマイシンの脱プリンなどが生
じないものを選択することが好ましい。スペーサーやビ
オチンなどのユニットもカルボン酸誘導体あるいはその
活性エステルとして導入することができる。
【００２２】より具体的な方法の一例（式（１）におい
て、Ｒ1がアミノ基である場合）を以下に述べる。先
ず、ピューロマイシンのNαアミノ基を保護する。具体
的には、ピューロマイシン２塩酸塩を炭酸ナトリウム／
炭酸水素ナトリウム／塩化ナトリウム水溶液と塩化メチ
レンに溶かし、有機層を分離する。有機層をエバポレー
ターで濃縮して得た固体をアセトニトリルとピリジン等
の溶媒に溶解し、無水トリフルオロ酢酸を加えて室温で
撹拌する。反応後、水と炭酸ナトリウム／炭酸水素ナト
リウム／塩化ナトリウム水溶液を加えて、塩化メチレン
で抽出する。得られた有機層を濃縮することにより、粗
Nα-トリフルオロアセチルピューロマイシンを得ること
ができる。
て、Ｒ1がアミノ基である場合）を以下に述べる。先
ず、ピューロマイシンのNαアミノ基を保護する。具体
的には、ピューロマイシン２塩酸塩を炭酸ナトリウム／
炭酸水素ナトリウム／塩化ナトリウム水溶液と塩化メチ
レンに溶かし、有機層を分離する。有機層をエバポレー
ターで濃縮して得た固体をアセトニトリルとピリジン等
の溶媒に溶解し、無水トリフルオロ酢酸を加えて室温で
撹拌する。反応後、水と炭酸ナトリウム／炭酸水素ナト
リウム／塩化ナトリウム水溶液を加えて、塩化メチレン
で抽出する。得られた有機層を濃縮することにより、粗
Nα-トリフルオロアセチルピューロマイシンを得ること
ができる。
【００２３】次に、ピューロマイシンの5'位の水酸基を
トルエンスルホニル基に変換する。粗Nα-トリフルオロ
アセチルピューロマイシンをピリジン等の溶媒にに溶か
した溶液に塩化トシルを溶媒に溶かした溶液を加えて反
応させる。冷却後、水を加えて撹拌し、さらに酢酸エチ
ルと炭酸水素ナトリウム水溶液を加えて分液操作をして
得られた有機層を洗浄、濃縮し、精製することにより、
Nα-トリフルオロアセチル-5'-トルエンスルホニルピュ
ーロマイシンを得ることができる。
トルエンスルホニル基に変換する。粗Nα-トリフルオロ
アセチルピューロマイシンをピリジン等の溶媒にに溶か
した溶液に塩化トシルを溶媒に溶かした溶液を加えて反
応させる。冷却後、水を加えて撹拌し、さらに酢酸エチ
ルと炭酸水素ナトリウム水溶液を加えて分液操作をして
得られた有機層を洗浄、濃縮し、精製することにより、
Nα-トリフルオロアセチル-5'-トルエンスルホニルピュ
ーロマイシンを得ることができる。
【００２４】次に、ピューロマイシンの5'位のトルエン
スルホニル基をアジド基に変換する。Nα-トリフルオロ
アセチル-5'-トルエンスルホニルピューロマイシンをジ
メチルスルホキシド等の溶媒に溶解し、アジ化ナトリウ
ムを加えて室温で反応させる。酢酸エチルと3%炭酸水素
ナトリウム水溶液を加えて分液し、有機層を洗浄及び乾
燥し、塩類をグラスフィルターで濾去して酢酸エチルで
洗浄し、洗液と濾液を合わせて濃縮することにより、粗
Nα-トリフルオロアセチル-5'-アジド-5'-デオキシピュ
ーロマイシンを得ることができる。
スルホニル基をアジド基に変換する。Nα-トリフルオロ
アセチル-5'-トルエンスルホニルピューロマイシンをジ
メチルスルホキシド等の溶媒に溶解し、アジ化ナトリウ
ムを加えて室温で反応させる。酢酸エチルと3%炭酸水素
ナトリウム水溶液を加えて分液し、有機層を洗浄及び乾
燥し、塩類をグラスフィルターで濾去して酢酸エチルで
洗浄し、洗液と濾液を合わせて濃縮することにより、粗
Nα-トリフルオロアセチル-5'-アジド-5'-デオキシピュ
ーロマイシンを得ることができる。
【００２５】次に、ピューロマイシンの5'位のアジド基
をアミノ基に変換する。粗Nα-トリフルオロアセチル-
5'-アジド-5'-デオキシピューロマイシンをピリジン等
の溶媒に溶解し、トリフェニルホスフィンを加えて室温
で２時間撹拌し、さらに水を加えてさらに室温で反応さ
せる。酢酸エチル、ヘキサン、5%酢酸水溶液を加えて分
液し、水層を凍結乾燥して粗Nα-トリフルオロアセチル
-5'-アミノ-5'-デオキシピューロマイシンを得ることが
できる。この化合物は逆相高速液体クロマトグラフィー
（HPLC）等で精製してから次の反応に用いることができ
る。
をアミノ基に変換する。粗Nα-トリフルオロアセチル-
5'-アジド-5'-デオキシピューロマイシンをピリジン等
の溶媒に溶解し、トリフェニルホスフィンを加えて室温
で２時間撹拌し、さらに水を加えてさらに室温で反応さ
せる。酢酸エチル、ヘキサン、5%酢酸水溶液を加えて分
液し、水層を凍結乾燥して粗Nα-トリフルオロアセチル
-5'-アミノ-5'-デオキシピューロマイシンを得ることが
できる。この化合物は逆相高速液体クロマトグラフィー
（HPLC）等で精製してから次の反応に用いることができ
る。
【００２６】シトシンのユニットは、N-[2-((4-メトキ
シフェニル)-ジフェニルメチルアミノ)エチル]-N-[(N4-
(4-tert-ブチルベンゾイル)-シトシン-1-イル-アセチ
ル) グリシンをWillらの方法（Tetrahedron 51, 12069-
12082, 1995）に従って合成し、これをジメチルホルム
アミド中ピリジン1等量存在下でペンタフルオロフェニ
ルトリフルオロ酢酸1等量と反応させることで活性エス
テルとすることができる。活性エステル溶液をNα-トリ
フルオロアセチル-5'-アミノ-5'-デオキシピューロマイ
シンに加え、炭酸緩衝液を加えて室温で撹拌する。エタ
ノールと濃アンモニア水を加え室温で２時間５０℃で反
応させたあと、濃縮、精製を行なうことにより、目的物
であるＰＮＡ化シトシン-ピューロマイシンを得ること
ができる。
シフェニル)-ジフェニルメチルアミノ)エチル]-N-[(N4-
(4-tert-ブチルベンゾイル)-シトシン-1-イル-アセチ
ル) グリシンをWillらの方法（Tetrahedron 51, 12069-
12082, 1995）に従って合成し、これをジメチルホルム
アミド中ピリジン1等量存在下でペンタフルオロフェニ
ルトリフルオロ酢酸1等量と反応させることで活性エス
テルとすることができる。活性エステル溶液をNα-トリ
フルオロアセチル-5'-アミノ-5'-デオキシピューロマイ
シンに加え、炭酸緩衝液を加えて室温で撹拌する。エタ
ノールと濃アンモニア水を加え室温で２時間５０℃で反
応させたあと、濃縮、精製を行なうことにより、目的物
であるＰＮＡ化シトシン-ピューロマイシンを得ること
ができる。
【００２７】上記製造法における目的化合物の精製は、
有機合成化学で常用される方法、例えば濾過、抽出、洗
浄、乾燥、濃縮、結晶化、各種クロマトグラフィー等を
適宜組み合わせて行うことができる。また、中間体にお
いては、精製してもよいし、精製することなく次の反応
に供することも可能である。
有機合成化学で常用される方法、例えば濾過、抽出、洗
浄、乾燥、濃縮、結晶化、各種クロマトグラフィー等を
適宜組み合わせて行うことができる。また、中間体にお
いては、精製してもよいし、精製することなく次の反応
に供することも可能である。
【００２８】（ＩＩ） 式（３）で表される化合物 Ｃ末端１分子ラベル法に用いられるＰＮＡ化ピューロマ
イシン誘導体には、ピューロマイシン部分の他にラベル
効率を高めるためのシトシン誘導体、スペーサー部分、
および目的の標識物質が導入されている。標識物質が導
入されているＰＮＡ化ピューロマイシン誘導体は、具体
的には、式（３）で表される化合物又はその塩である。
イシン誘導体には、ピューロマイシン部分の他にラベル
効率を高めるためのシトシン誘導体、スペーサー部分、
および目的の標識物質が導入されている。標識物質が導
入されているＰＮＡ化ピューロマイシン誘導体は、具体
的には、式（３）で表される化合物又はその塩である。
【００２９】
【化１４】
【００３０】式（３）において、Ｌ1及びＬ3は各々独立
にスペーサー基を示し、Ｌ2は連結基を示し、Ｎｕはピ
リミジン塩基又はプリン塩基の残基を示し、Ｘは標識物
質の残基を示す。） 式（３）におけるＬ1及びＬ3が示すスペーサー基は、式
（１）におけるＬ1が示すスペーサー基と同義である。
Ｌ3が示すスペーサー基の主鎖の炭素数の数は特に限定
されないが、好ましくは炭素数１から１０であり、より
好ましくは炭素数３から８であり、さらに好ましくは炭
素数４から６である。Ｌ2が示す連結基は、式（１）に
おけるＲ1が示す反応性基と、標識物質が有する反応性
基とが反応して形成される基であり、例えば、アミド結
合（−ＣＯ−ＮＨ−基）、エステル結合（−ＣＯＯ−
基）、チオウレア結合（−ＮＨ−ＣＳ−ＮＨ−基）、ス
ルホンアミド基（−ＳＯ2−ＮＨ−）、リン酸ジエステ
ル結合（−Ｏ−Ｐ（Ｏ）ＯＨ−Ｏ−）などが挙げられ
る。好ましくは、Ｌ2は−ＣＯ−ＮＨ−基であり、窒素
原子がＬ1と連結し、炭素原子がＬ3と連結している。式
（３）におけるＮｕは、式（１）におけるＮｕと同義で
ある。
にスペーサー基を示し、Ｌ2は連結基を示し、Ｎｕはピ
リミジン塩基又はプリン塩基の残基を示し、Ｘは標識物
質の残基を示す。） 式（３）におけるＬ1及びＬ3が示すスペーサー基は、式
（１）におけるＬ1が示すスペーサー基と同義である。
Ｌ3が示すスペーサー基の主鎖の炭素数の数は特に限定
されないが、好ましくは炭素数１から１０であり、より
好ましくは炭素数３から８であり、さらに好ましくは炭
素数４から６である。Ｌ2が示す連結基は、式（１）に
おけるＲ1が示す反応性基と、標識物質が有する反応性
基とが反応して形成される基であり、例えば、アミド結
合（−ＣＯ−ＮＨ−基）、エステル結合（−ＣＯＯ−
基）、チオウレア結合（−ＮＨ−ＣＳ−ＮＨ−基）、ス
ルホンアミド基（−ＳＯ2−ＮＨ−）、リン酸ジエステ
ル結合（−Ｏ−Ｐ（Ｏ）ＯＨ−Ｏ−）などが挙げられ
る。好ましくは、Ｌ2は−ＣＯ−ＮＨ−基であり、窒素
原子がＬ1と連結し、炭素原子がＬ3と連結している。式
（３）におけるＮｕは、式（１）におけるＮｕと同義で
ある。
【００３１】Ｘは標識物質の残基を示す。標識物質の種
類は、特に限定されないが、蛍光物質（例えば、Cy5(ア
マシャム)、Cy3(アマシャム)、ＩＣ５、ＩＣ３（同仁化
学）、フルオレセイン、テトラメチルローダミン、テキ
サスレッド、アクリジンオレンジ等）、化学発光物質
（例えば、ルミノール、アクリジニウム−Ｉ等）、親和
性物質（例えば、ビオチン、２，４−ジニトロフェニル
基、コレステロール等）が挙げられる。
類は、特に限定されないが、蛍光物質（例えば、Cy5(ア
マシャム)、Cy3(アマシャム)、ＩＣ５、ＩＣ３（同仁化
学）、フルオレセイン、テトラメチルローダミン、テキ
サスレッド、アクリジンオレンジ等）、化学発光物質
（例えば、ルミノール、アクリジニウム−Ｉ等）、親和
性物質（例えば、ビオチン、２，４−ジニトロフェニル
基、コレステロール等）が挙げられる。
【００３２】式（３）の化合物は、Ｒ1として反応性基
を有する式（１）の化合物と、Ｒ1で表される反応性基
と反応して結合することができる反応性基を有するか導
入されている標識物質とを常法に従って反応させること
により合成することができる。
を有する式（１）の化合物と、Ｒ1で表される反応性基
と反応して結合することができる反応性基を有するか導
入されている標識物質とを常法に従って反応させること
により合成することができる。
【００３３】式（３）で表される化合物は塩の形態で存
在することができる場合があるが、そのような塩の形態
の式（３）の化合物も本発明の範囲内である。塩の種類
としては、式（１）で表される化合物について上述した
通りである。式（３）の化合物には、位置異性体、幾何
異性体、互変異性体、又は光学異性体のような異性体が
存在するが、全ての可能な異性体、並びに２種類以上の
該異性体を任意の比率で含む混合物も本発明の範囲内の
ものである。
在することができる場合があるが、そのような塩の形態
の式（３）の化合物も本発明の範囲内である。塩の種類
としては、式（１）で表される化合物について上述した
通りである。式（３）の化合物には、位置異性体、幾何
異性体、互変異性体、又は光学異性体のような異性体が
存在するが、全ての可能な異性体、並びに２種類以上の
該異性体を任意の比率で含む混合物も本発明の範囲内の
ものである。
【００３４】式（３）の化合物の塩を取得したい場合、
式（３）の化合物が塩の形態で得られる場合にはそのま
ま精製すればよく、また、遊離の形態で得られる場合に
は適当な溶媒に溶解又は懸濁させ、酸又は塩基を加えて
塩を形成させ単離、精製すればよい。また、式（３）の
化合物及びその塩は、水あるいは各種溶媒との付加物
（水和物又は溶媒和物）の形で存在することもあるが、
これらの付加物も本発明の範囲内のものである。また、
式（３）の化合物及びその塩の任意の結晶形も本発明の
範囲内のものである。
式（３）の化合物が塩の形態で得られる場合にはそのま
ま精製すればよく、また、遊離の形態で得られる場合に
は適当な溶媒に溶解又は懸濁させ、酸又は塩基を加えて
塩を形成させ単離、精製すればよい。また、式（３）の
化合物及びその塩は、水あるいは各種溶媒との付加物
（水和物又は溶媒和物）の形で存在することもあるが、
これらの付加物も本発明の範囲内のものである。また、
式（３）の化合物及びその塩の任意の結晶形も本発明の
範囲内のものである。
【００３５】（ＩＩＩ) 式（５）で表される化合物 複数の標識物質を導入したPNA化ピューロマイシン誘導
体を用いることによりC末端１分子ラベル法の応用性を
より高めることができる。標識物質の数や種類は特に限
定されないが、例えば蛍光色素と親和性物質の組合せが
挙げられる。２つの標識物質が導入されたPNA化ピュー
ロマイシン誘導体は、具体的には、式（５）で表される
化合物又はその塩である。
体を用いることによりC末端１分子ラベル法の応用性を
より高めることができる。標識物質の数や種類は特に限
定されないが、例えば蛍光色素と親和性物質の組合せが
挙げられる。２つの標識物質が導入されたPNA化ピュー
ロマイシン誘導体は、具体的には、式（５）で表される
化合物又はその塩である。
【００３６】
【化１５】
【００３７】（式中、Ｌ1、Ｌ3、Ｌ6、Ｌ8、Ｌ9、Ｌ11
及びＬ13は各々独立にスペーサー基を示し、Ｌ2、Ｌ4、
Ｌ5、Ｌ7、Ｌ10、Ｌ12は各々独立に連結基を示し、Ｎｕ
はピリミジン塩基又はプリン塩基の残基を示し、Ｘ1及
びＸ2は各々独立に標識物質の残基を示す。）
及びＬ13は各々独立にスペーサー基を示し、Ｌ2、Ｌ4、
Ｌ5、Ｌ7、Ｌ10、Ｌ12は各々独立に連結基を示し、Ｎｕ
はピリミジン塩基又はプリン塩基の残基を示し、Ｘ1及
びＸ2は各々独立に標識物質の残基を示す。）
【００３８】式（５）におけるＬ1、Ｌ3、Ｌ6、Ｌ8、Ｌ
9、Ｌ11及びＬ13が示すスペーサー基は、式（１）又は
式（３）におけるＬ1が示すスペーサー基と同義であ
る。ここで言うスペーサー基の主鎖の炭素数の数は特に
限定されないが、好ましくは炭素数１から１０であり、
より好ましくは炭素数１から６であり、さらに好ましく
は炭素数１から４である。該スペーサー基中には、1又
は複数の−Ｏ−基が介在していてもよい。
9、Ｌ11及びＬ13が示すスペーサー基は、式（１）又は
式（３）におけるＬ1が示すスペーサー基と同義であ
る。ここで言うスペーサー基の主鎖の炭素数の数は特に
限定されないが、好ましくは炭素数１から１０であり、
より好ましくは炭素数１から６であり、さらに好ましく
は炭素数１から４である。該スペーサー基中には、1又
は複数の−Ｏ−基が介在していてもよい。
【００３９】式（５）におけるＬ2、Ｌ4、Ｌ5、Ｌ7、Ｌ
10、Ｌ12が示す連結基は、例えば、アミド結合（−ＣＯ
−ＮＨ−基）、エステル結合（−ＣＯＯ−基）、チオウ
レア結合（−ＮＨ−ＣＳ−ＮＨ−基）、スルホンアミド
基（−ＳＯ2−ＮＨ−）、リン酸ジエステル結合（−Ｏ
−Ｐ（Ｏ）ＯＨ−Ｏ−）などが挙げられ、好ましくは−
ＣＯ−ＮＨ−基である。式（５）におけるＮｕは、式
（１）におけるＮｕと同義である。
10、Ｌ12が示す連結基は、例えば、アミド結合（−ＣＯ
−ＮＨ−基）、エステル結合（−ＣＯＯ−基）、チオウ
レア結合（−ＮＨ−ＣＳ−ＮＨ−基）、スルホンアミド
基（−ＳＯ2−ＮＨ−）、リン酸ジエステル結合（−Ｏ
−Ｐ（Ｏ）ＯＨ−Ｏ−）などが挙げられ、好ましくは−
ＣＯ−ＮＨ−基である。式（５）におけるＮｕは、式
（１）におけるＮｕと同義である。
【００４０】Ｘ1及びＸ2は各々独立に標識物質の残基を
示す。標識物質の種類は、特に限定されないが、蛍光物
質（例えば、Cy5(アマシャム)、Cy3(アマシャム)、ＩＣ
５、ＩＣ３（同仁化学）、フルオレセイン、テトラメチ
ルローダミン、テキサスレッド、アクリジンオレンジ
等）、化学発光物質（例えば、ルミノール、アクリジニ
ウム−Ｉ等）、親和性物質（例えば、ビオチン、２，４
−ジニトロフェニル基、コレステロール等）が挙げら
れ、好ましくは、Ｘ1及びＸ2の片方が蛍光物質又は化学
発光物質であり、他方が親和性物質である。
示す。標識物質の種類は、特に限定されないが、蛍光物
質（例えば、Cy5(アマシャム)、Cy3(アマシャム)、ＩＣ
５、ＩＣ３（同仁化学）、フルオレセイン、テトラメチ
ルローダミン、テキサスレッド、アクリジンオレンジ
等）、化学発光物質（例えば、ルミノール、アクリジニ
ウム−Ｉ等）、親和性物質（例えば、ビオチン、２，４
−ジニトロフェニル基、コレステロール等）が挙げら
れ、好ましくは、Ｘ1及びＸ2の片方が蛍光物質又は化学
発光物質であり、他方が親和性物質である。
【００４１】式（５）の化合物は、Ｒ1として反応性基
を有する式（１）の保護基が導入された誘導体と、Ｒ1
で表される反応性基と反応して結合することができる反
応性基、及び標識物質の反応性基と反応して結合するこ
とができる反応性基２つ以上を有する化合物を常法にし
たがって反応させ、さらに得られた生成物と２種以上の
標識物質を常法にしたがって反応させることにより合成
することができる。あるいは、Ｒ1として反応性基を有
する式（１）の保護基が導入された誘導体と、Ｒ1で表
される反応性基と反応して結合することができる反応性
基、標識物質の反応性基と反応して結合することができ
る反応性基１つ以上、及び標識物質の残基を有する化合
物を常法にしたがって反応させ、さらに得られた生成物
と１種以上の標識物質を常法にしたがって反応させるこ
とにより合成することができる。
を有する式（１）の保護基が導入された誘導体と、Ｒ1
で表される反応性基と反応して結合することができる反
応性基、及び標識物質の反応性基と反応して結合するこ
とができる反応性基２つ以上を有する化合物を常法にし
たがって反応させ、さらに得られた生成物と２種以上の
標識物質を常法にしたがって反応させることにより合成
することができる。あるいは、Ｒ1として反応性基を有
する式（１）の保護基が導入された誘導体と、Ｒ1で表
される反応性基と反応して結合することができる反応性
基、標識物質の反応性基と反応して結合することができ
る反応性基１つ以上、及び標識物質の残基を有する化合
物を常法にしたがって反応させ、さらに得られた生成物
と１種以上の標識物質を常法にしたがって反応させるこ
とにより合成することができる。
【００４２】式（５）で表される化合物は塩の形態で存
在することができる場合があるが、そのような塩の形態
の式（５）の化合物も本発明の範囲内である。塩の種類
としては、式（１）で表される化合物について上述した
通りである。式（５）の化合物には、位置異性体、幾何
異性体、互変異性体、又は光学異性体のような異性体が
存在するが、全ての可能な異性体、並びに２種類以上の
該異性体を任意の比率で含む混合物も本発明の範囲内の
ものである。
在することができる場合があるが、そのような塩の形態
の式（５）の化合物も本発明の範囲内である。塩の種類
としては、式（１）で表される化合物について上述した
通りである。式（５）の化合物には、位置異性体、幾何
異性体、互変異性体、又は光学異性体のような異性体が
存在するが、全ての可能な異性体、並びに２種類以上の
該異性体を任意の比率で含む混合物も本発明の範囲内の
ものである。
【００４３】式（５）の化合物の塩を取得したい場合、
式（５）の化合物が塩の形態で得られる場合にはそのま
ま精製すればよく、また、遊離の形態で得られる場合に
は適当な溶媒に溶解又は懸濁させ、酸又は塩基を加えて
塩を形成させ単離、精製すればよい。また、式（５）の
化合物及びその塩は、水あるいは各種溶媒との付加物
（水和物又は溶媒和物）の形で存在することもあるが、
これらの付加物も本発明の範囲内のものである。また、
式（５）の化合物及びその塩の任意の結晶形も本発明の
範囲内のものである。
式（５）の化合物が塩の形態で得られる場合にはそのま
ま精製すればよく、また、遊離の形態で得られる場合に
は適当な溶媒に溶解又は懸濁させ、酸又は塩基を加えて
塩を形成させ単離、精製すればよい。また、式（５）の
化合物及びその塩は、水あるいは各種溶媒との付加物
（水和物又は溶媒和物）の形で存在することもあるが、
これらの付加物も本発明の範囲内のものである。また、
式（５）の化合物及びその塩の任意の結晶形も本発明の
範囲内のものである。
【００４４】（ＩＶ） 本発明のＰＮＡ化ピューロマイ
シン誘導体の利用 さらに本発明は、当該ＰＮＡ化ピューロマイシン誘導体
を利用したＣ末端１分子ラベル法やIn Vitro Virus法に
関するものである。即ち、本発明によれば、式（１）、
式（３）又は式（５）で表される化合物又はその塩を構
成成分として含む、タンパク質又はその誘導体並びに核
酸又はその誘導体が提供される。さらに、式（１）、式
（３）又は式（５）で表される化合物又はその塩をタン
パク質中に取り込ませる工程を含む、修飾タンパク質の
製造方法、並びに式（１）、式（３）又は式（５）で表
される化合物又はその塩を核酸中に取り込ませる工程を
含む、修飾核酸の製造方法が提供される。
シン誘導体の利用 さらに本発明は、当該ＰＮＡ化ピューロマイシン誘導体
を利用したＣ末端１分子ラベル法やIn Vitro Virus法に
関するものである。即ち、本発明によれば、式（１）、
式（３）又は式（５）で表される化合物又はその塩を構
成成分として含む、タンパク質又はその誘導体並びに核
酸又はその誘導体が提供される。さらに、式（１）、式
（３）又は式（５）で表される化合物又はその塩をタン
パク質中に取り込ませる工程を含む、修飾タンパク質の
製造方法、並びに式（１）、式（３）又は式（５）で表
される化合物又はその塩を核酸中に取り込ませる工程を
含む、修飾核酸の製造方法が提供される。
【００４５】本明細書で言う「タンパク質又はその誘導
体」における誘導体とは、天然のタンパク質のみなら
ず、タンパク質と他の成分（例えば、糖や核酸など）と
の複合物やタンパク質の修飾物などを意味する。本明細
書で言う「核酸又はその誘導体」における誘導体とは、
天然の核酸のみならず、核酸と他の成分（例えば、糖や
タンパク質など）との複合物や核酸の修飾物などを意味
する。
体」における誘導体とは、天然のタンパク質のみなら
ず、タンパク質と他の成分（例えば、糖や核酸など）と
の複合物やタンパク質の修飾物などを意味する。本明細
書で言う「核酸又はその誘導体」における誘導体とは、
天然の核酸のみならず、核酸と他の成分（例えば、糖や
タンパク質など）との複合物や核酸の修飾物などを意味
する。
【００４６】In Vitro Virus法においては翻訳の対象と
なるｍＲＮＡをピューロマイシン誘導体と効率よく融合
させることが必要であり、従来の方法ではｍＲＮＡと相
補鎖をつくるＤＮＡの導入が行われている。相補鎖の形
成はＰＮＡの塩基部分でも可能であり、むしろ塩基対の
特異性や安定性の点でＰＮＡの方がＤＮＡよりも優れて
いることが多い。ピューロマイシン誘導体とｍＲＮＡを
共有結合させるためのライゲーションやｍＲＮＡの逆転
写のために用いられる配列はＤＮＡであることが必要で
あるが、ＤＮＡとＰＮＡを融合した誘導体を作る方法も
ほぼ確立されており、両者の利点を生かしたIn Vitro V
irus法のためのピューロマイシン誘導体の合成が可能で
ある。ＰＮＡ化ピューロマイシン誘導体はユニットの複
雑な構築に適しているだけでなく、効率のよい大量合成
にも向いており、核酸合成法をベースとして作られたピ
ューロマイシン誘導体とともにＣ末端１分子ラベル法や
In Vitro Virus法の応用展開の可能性を広げることが期
待される。
なるｍＲＮＡをピューロマイシン誘導体と効率よく融合
させることが必要であり、従来の方法ではｍＲＮＡと相
補鎖をつくるＤＮＡの導入が行われている。相補鎖の形
成はＰＮＡの塩基部分でも可能であり、むしろ塩基対の
特異性や安定性の点でＰＮＡの方がＤＮＡよりも優れて
いることが多い。ピューロマイシン誘導体とｍＲＮＡを
共有結合させるためのライゲーションやｍＲＮＡの逆転
写のために用いられる配列はＤＮＡであることが必要で
あるが、ＤＮＡとＰＮＡを融合した誘導体を作る方法も
ほぼ確立されており、両者の利点を生かしたIn Vitro V
irus法のためのピューロマイシン誘導体の合成が可能で
ある。ＰＮＡ化ピューロマイシン誘導体はユニットの複
雑な構築に適しているだけでなく、効率のよい大量合成
にも向いており、核酸合成法をベースとして作られたピ
ューロマイシン誘導体とともにＣ末端１分子ラベル法や
In Vitro Virus法の応用展開の可能性を広げることが期
待される。
【００４７】式（１）、式（３）又は式（５）の化合物
をタンパク質中に取り込ませる場合には、タンパク質を
コードする核酸（好ましくはｍＲＮＡ）と、取り込ませ
るべき式（１）、式（３）又は式（５）の化合物とを転
写翻訳系に導入することにより行なうことができる。核
酸からそれがコードするタンパク質を人工的に生成させ
るための転写翻訳系は当業者に公知である。具体的に
は、適当な細胞よりタンパク質合成能を有する成分を抽
出し、その抽出液を用いて目的の蛋白質を合成させる無
細胞蛋白質合成系が挙げられる。このような無細胞蛋白
質合成系には、リボゾ−ム、開始因子、伸長因子及びｔ
ＲＮＡ等の転写・翻訳系に必要な要素が含まれている。
をタンパク質中に取り込ませる場合には、タンパク質を
コードする核酸（好ましくはｍＲＮＡ）と、取り込ませ
るべき式（１）、式（３）又は式（５）の化合物とを転
写翻訳系に導入することにより行なうことができる。核
酸からそれがコードするタンパク質を人工的に生成させ
るための転写翻訳系は当業者に公知である。具体的に
は、適当な細胞よりタンパク質合成能を有する成分を抽
出し、その抽出液を用いて目的の蛋白質を合成させる無
細胞蛋白質合成系が挙げられる。このような無細胞蛋白
質合成系には、リボゾ−ム、開始因子、伸長因子及びｔ
ＲＮＡ等の転写・翻訳系に必要な要素が含まれている。
【００４８】このような無細胞蛋白質合成系（細胞溶解
物由来の系）としては、原核又は真核生物の抽出物によ
り構成される無細胞翻訳系が挙げられ、例えば大腸菌、
ウサギ網状赤血球抽出液、小麦胚芽抽出液などが使用で
きるが、ＤＮＡ又はＲＮＡから目的とする蛋白質を産生
するものであればいずれでもよい。また、無細胞翻訳系
はキットとして市販されているものを使用することがで
き、例えば、ウサギ網状赤血球抽出液 (Rabbit Reticul
ocyte Lysate Systems, Nuclease Treated, Promega)や
小麦胚芽抽出液 (Wheat Germ Extract, Promega)などが
挙げられる。転写翻訳系としては、生細胞を使用しても
よく、具体的には、原核又は真核生物、例えば大腸菌の
細胞などが使用できる。無細胞翻訳系又は生細胞など
は、その中にタンパク質をコードする核酸を添加又は導
入することによってタンパク質合成が行われるものであ
る限り制限されない。
物由来の系）としては、原核又は真核生物の抽出物によ
り構成される無細胞翻訳系が挙げられ、例えば大腸菌、
ウサギ網状赤血球抽出液、小麦胚芽抽出液などが使用で
きるが、ＤＮＡ又はＲＮＡから目的とする蛋白質を産生
するものであればいずれでもよい。また、無細胞翻訳系
はキットとして市販されているものを使用することがで
き、例えば、ウサギ網状赤血球抽出液 (Rabbit Reticul
ocyte Lysate Systems, Nuclease Treated, Promega)や
小麦胚芽抽出液 (Wheat Germ Extract, Promega)などが
挙げられる。転写翻訳系としては、生細胞を使用しても
よく、具体的には、原核又は真核生物、例えば大腸菌の
細胞などが使用できる。無細胞翻訳系又は生細胞など
は、その中にタンパク質をコードする核酸を添加又は導
入することによってタンパク質合成が行われるものであ
る限り制限されない。
【００４９】本発明では、タンパク質をコードするＲＮ
Ａと、該タンパク質中に取り込ませるべき式（１）、式
（３）又は式（５）の化合物とを、上記したような転写
翻訳系に導入してＲＮＡをタンパク質に翻訳することに
より、該化合物が導入されたタンパク質を作成すること
ができる。以下の実施例により本発明をさらに具体的に
説明するが、本発明は実施例によって限定されることは
ない。
Ａと、該タンパク質中に取り込ませるべき式（１）、式
（３）又は式（５）の化合物とを、上記したような転写
翻訳系に導入してＲＮＡをタンパク質に翻訳することに
より、該化合物が導入されたタンパク質を作成すること
ができる。以下の実施例により本発明をさらに具体的に
説明するが、本発明は実施例によって限定されることは
ない。
【００５０】
【実施例】実施例１：Ｃ末端１分子ラベルのためのＰＮ
Ａ化ピューロマイシン誘導体の合成ピューロマイシン２
塩酸塩（和光純薬工業）272 mgを30 mlの0.3 M炭酸ナト
リウム-0.2 M炭酸水素ナトリウム-2.0 M塩化ナトリウム
水溶液（水溶液Ａ）と20 mlの塩化メチレンに溶かし、
撹拌したのち有機層を分離した。水層に塩化メチレン
（20 ml）を加えて再度分液し、有機層を合わせてエバ
ポレーターで濃縮したのち、少量のピリジンを加えて濃
縮する操作を２回繰り返し、得られた固体をアセトニト
リル（5 ml）とピリジン（2.5 ml）に溶解した。無水ト
リフルオロ酢酸1.0 gを加えて室温で30分撹拌したのち
氷冷して水5 mlを加え、さらに20 mlの水溶液Ａを徐々
に加えた。塩化メチレン（20 ml）で２回抽出し、得ら
れた有機層を濃縮してからピリジンを加えて濃縮する操
作を２回繰り返し、粗Nα-トリフルオロアセチル−ピュ
ーロマイシン（約280 mg）を得た。
Ａ化ピューロマイシン誘導体の合成ピューロマイシン２
塩酸塩（和光純薬工業）272 mgを30 mlの0.3 M炭酸ナト
リウム-0.2 M炭酸水素ナトリウム-2.0 M塩化ナトリウム
水溶液（水溶液Ａ）と20 mlの塩化メチレンに溶かし、
撹拌したのち有機層を分離した。水層に塩化メチレン
（20 ml）を加えて再度分液し、有機層を合わせてエバ
ポレーターで濃縮したのち、少量のピリジンを加えて濃
縮する操作を２回繰り返し、得られた固体をアセトニト
リル（5 ml）とピリジン（2.5 ml）に溶解した。無水ト
リフルオロ酢酸1.0 gを加えて室温で30分撹拌したのち
氷冷して水5 mlを加え、さらに20 mlの水溶液Ａを徐々
に加えた。塩化メチレン（20 ml）で２回抽出し、得ら
れた有機層を濃縮してからピリジンを加えて濃縮する操
作を２回繰り返し、粗Nα-トリフルオロアセチル−ピュ
ーロマイシン（約280 mg）を得た。
【００５１】粗Nα-トリフルオロアセチル−ピューロマ
イシン（約280 mg）をピリジン2.5mlに溶かした溶液に2
35 mgの塩化トシルをピリジン2.5 mlに溶かした溶液を
室温で加え１時間撹拌した。氷浴で冷却してから0.2 ml
の水を加えて５分間撹拌し、さらに酢酸エチルと5%炭酸
水素ナトリウム水溶液を加えて分液操作をして得られた
有機層を5%炭酸水素ナトリウム水溶液、水、飽和食塩水
で洗浄した。有機層を濃縮し、酢酸エチルを展開溶媒と
してシリカゲルクロマトグラフィーで精製してNα-トリ
フルオロアセチル-5'-トルエンスルホニルピューロマイ
シンを290 mg得た。
イシン（約280 mg）をピリジン2.5mlに溶かした溶液に2
35 mgの塩化トシルをピリジン2.5 mlに溶かした溶液を
室温で加え１時間撹拌した。氷浴で冷却してから0.2 ml
の水を加えて５分間撹拌し、さらに酢酸エチルと5%炭酸
水素ナトリウム水溶液を加えて分液操作をして得られた
有機層を5%炭酸水素ナトリウム水溶液、水、飽和食塩水
で洗浄した。有機層を濃縮し、酢酸エチルを展開溶媒と
してシリカゲルクロマトグラフィーで精製してNα-トリ
フルオロアセチル-5'-トルエンスルホニルピューロマイ
シンを290 mg得た。
【００５２】Nα-トリフルオロアセチル-5'-トルエンス
ルホニルピューロマイシン（290 mg）をジメチルスルホ
キシド（10 ml）に溶解し、アジ化ナトリウム（130 m
g）を加えて室温で３日間撹拌した。酢酸エチルと3%炭
酸水素ナトリウム水溶液を加えて分液し、有機層を3%炭
酸水素ナトリウム水溶液で２回、2.0 M塩化ナトリウム
水溶液で３回洗浄した。有機層を硫酸マグネシウムで乾
燥し、塩類をグラスフィルターで濾去して酢酸エチルで
洗い、洗液と濾液を合わせて濃縮し、粗Nα-トリフルオ
ロアセチル-5'-アジド-5'-デオキシピューロマイシンを
220 mg得た。
ルホニルピューロマイシン（290 mg）をジメチルスルホ
キシド（10 ml）に溶解し、アジ化ナトリウム（130 m
g）を加えて室温で３日間撹拌した。酢酸エチルと3%炭
酸水素ナトリウム水溶液を加えて分液し、有機層を3%炭
酸水素ナトリウム水溶液で２回、2.0 M塩化ナトリウム
水溶液で３回洗浄した。有機層を硫酸マグネシウムで乾
燥し、塩類をグラスフィルターで濾去して酢酸エチルで
洗い、洗液と濾液を合わせて濃縮し、粗Nα-トリフルオ
ロアセチル-5'-アジド-5'-デオキシピューロマイシンを
220 mg得た。
【００５３】粗Nα-トリフルオロアセチル-5'-アジド-
5'-デオキシピューロマイシン約220mgをピリジン1.5 ml
に溶かし、トリフェニルホスフィン150 mgを加えて室温
で２時間撹拌したのち水2.0 mlを加えてさらに室温で１
６時間撹拌した。酢酸エチル（約30 ml）、ヘキサン
（約15 ml）、5%酢酸水溶液（約40 ml）を加えて分液
し、水層を凍結乾燥して粗Nα-トリフルオロアセチル-
5'-アミノ-5'-デオキシピューロマイシン（以下、化合
物１）を145 mg得た。化合物１は逆相高速液体クロマト
グラフィー（HPLC）で精製してから次の反応に用いた。
5'-デオキシピューロマイシン約220mgをピリジン1.5 ml
に溶かし、トリフェニルホスフィン150 mgを加えて室温
で２時間撹拌したのち水2.0 mlを加えてさらに室温で１
６時間撹拌した。酢酸エチル（約30 ml）、ヘキサン
（約15 ml）、5%酢酸水溶液（約40 ml）を加えて分液
し、水層を凍結乾燥して粗Nα-トリフルオロアセチル-
5'-アミノ-5'-デオキシピューロマイシン（以下、化合
物１）を145 mg得た。化合物１は逆相高速液体クロマト
グラフィー（HPLC）で精製してから次の反応に用いた。
【００５４】シトシンのユニットは脱保護に強酸を用い
ないＰＮＡ合成のために開発されたユニットであるN-[2
-((4-メトキシフェニル)-ジフェニルメチルアミノ)エチ
ル]-N-[(N4-(4-tert-ブチルベンゾイル)-シトシン-1-イ
ル-アセチル)グリシンをWillらの方法（Tetrahedron 5
1, 12069-12082, 1995）に従って合成し、これをジメチ
ルホルムアミド中ピリジン1等量存在下でペンタフルオ
ロフェニルトリフルオロ酢酸1等量と反応させることで
活性エステルとした。活性エステル溶液（約25mM）を活
性エステルが化合物１に対し３等量となるように加え、
さらに３分の１容量の0.15 M炭酸緩衝液（炭酸ナトリウ
ム1に対し炭酸水素ナトリウム20）を加えて室温で撹拌
した。約５倍量のエタノールと１０倍量の濃アンモニア
水を加え室温で２時間、５０℃で３０分反応させたあと
ほぼもとの容量となるまで濃縮し、氷浴で冷却しつつ３
倍量の75％酢酸を加えた。室温に戻してから1％トリフ
ルオロ酢酸水溶液をほぼ等量加え、６時間放置したのち
水で約２倍に希釈し、濾過をしたのち逆相HPLCで目的物
であるＰＮＡ化シトシン-ピューロマイシンを精製し
た。精製したＰＮＡ化シトシン-ピューロマイシンの物
性データを以下に示す。
ないＰＮＡ合成のために開発されたユニットであるN-[2
-((4-メトキシフェニル)-ジフェニルメチルアミノ)エチ
ル]-N-[(N4-(4-tert-ブチルベンゾイル)-シトシン-1-イ
ル-アセチル)グリシンをWillらの方法（Tetrahedron 5
1, 12069-12082, 1995）に従って合成し、これをジメチ
ルホルムアミド中ピリジン1等量存在下でペンタフルオ
ロフェニルトリフルオロ酢酸1等量と反応させることで
活性エステルとした。活性エステル溶液（約25mM）を活
性エステルが化合物１に対し３等量となるように加え、
さらに３分の１容量の0.15 M炭酸緩衝液（炭酸ナトリウ
ム1に対し炭酸水素ナトリウム20）を加えて室温で撹拌
した。約５倍量のエタノールと１０倍量の濃アンモニア
水を加え室温で２時間、５０℃で３０分反応させたあと
ほぼもとの容量となるまで濃縮し、氷浴で冷却しつつ３
倍量の75％酢酸を加えた。室温に戻してから1％トリフ
ルオロ酢酸水溶液をほぼ等量加え、６時間放置したのち
水で約２倍に希釈し、濾過をしたのち逆相HPLCで目的物
であるＰＮＡ化シトシン-ピューロマイシンを精製し
た。精製したＰＮＡ化シトシン-ピューロマイシンの物
性データを以下に示す。
【００５５】MS (MALDI) 722.5 [M+H]+; H1 NMR (270 M
Hz, d6-DMSO) 8.50 (1H, d); 8.36 (1H, t); 8.26 (1H,
s); 8.12 (2H, br); 7.96 (1H, br); 7.72 (1H, br);
7.23(2H, q); 6.92 (2H, q); 6.06 (1H, t); 5.96 (1H,
s); 4.85 (1H, s); 4.7-4.5(2H, m); 4.53 (1H, s);
4.3-3.8 (10H); 3.74 (3H, s); 3.46 (6H, br); 3.35(2
H, m); 3.09 (2H, q); 2.94 (2H, d)
Hz, d6-DMSO) 8.50 (1H, d); 8.36 (1H, t); 8.26 (1H,
s); 8.12 (2H, br); 7.96 (1H, br); 7.72 (1H, br);
7.23(2H, q); 6.92 (2H, q); 6.06 (1H, t); 5.96 (1H,
s); 4.85 (1H, s); 4.7-4.5(2H, m); 4.53 (1H, s);
4.3-3.8 (10H); 3.74 (3H, s); 3.46 (6H, br); 3.35(2
H, m); 3.09 (2H, q); 2.94 (2H, d)
【００５６】ＰＮＡ化シトシン-ピューロマイシンをCy5
Monofunctional Dye（アマシャムファルマシアバイオ
テク）で蛍光ラベルし、逆相HPLCで目的物のCy5-c-amPu
ro（図１）を精製した。ラベル剤はNαアミノ基とはほ
とんど反応せず、5'アミノ基で蛍光ラベルが優先的に行
われた。MS (MALDI) 1360.56 [M]+実施例１の合成を示
す化学反応式を以下に示す。
Monofunctional Dye（アマシャムファルマシアバイオ
テク）で蛍光ラベルし、逆相HPLCで目的物のCy5-c-amPu
ro（図１）を精製した。ラベル剤はNαアミノ基とはほ
とんど反応せず、5'アミノ基で蛍光ラベルが優先的に行
われた。MS (MALDI) 1360.56 [M]+実施例１の合成を示
す化学反応式を以下に示す。
【００５７】
【化１６】
【００５８】実施例２：２つの標識物質が導入されたPN
A化ピューロマイシン誘導体の合成 実施例１で用いたシトシンユニットの活性エステル溶液
（約25 mM）を活性エステルが化合物１に対し３等量と
なるように加え、さらに３分の１容量の0.15 M炭酸緩衝
液（炭酸ナトリウム1に対し炭酸水素ナトリウム20、以
下、水溶液B）を加えて室温で撹拌した。１時間後、氷
浴で冷却しつつ３倍量の75％酢酸を加え、１時間放置し
たのち0.1％トリフルオロ酢酸水溶液を2.5倍量加えた。
室温に戻して濾過をしたのち逆相HPLCで精製してN-(2-
アミノエチル)-N-[N4-(4-tert-ブチルベンゾイル)-シト
シン-1-イル-アセチル] グリシル-Nα-トリフルオロア
セチル-5'-アミノ-5'-デオキシピューロマイシンを得
た。
A化ピューロマイシン誘導体の合成 実施例１で用いたシトシンユニットの活性エステル溶液
（約25 mM）を活性エステルが化合物１に対し３等量と
なるように加え、さらに３分の１容量の0.15 M炭酸緩衝
液（炭酸ナトリウム1に対し炭酸水素ナトリウム20、以
下、水溶液B）を加えて室温で撹拌した。１時間後、氷
浴で冷却しつつ３倍量の75％酢酸を加え、１時間放置し
たのち0.1％トリフルオロ酢酸水溶液を2.5倍量加えた。
室温に戻して濾過をしたのち逆相HPLCで精製してN-(2-
アミノエチル)-N-[N4-(4-tert-ブチルベンゾイル)-シト
シン-1-イル-アセチル] グリシル-Nα-トリフルオロア
セチル-5'-アミノ-5'-デオキシピューロマイシンを得
た。
【００５９】N-[(4-メトキシフェニル)-ジフェニルメチ
ル]-β-アラニル-Nε-t-ブトキシカルボニル-L-リシル-
β-アラニン330 mgを5 mlのDMFに溶かし、ピリジン1等
量及びペンタフルオロフェニルトリフルオロ酢酸1等量
を加えて１５分撹拌した。この溶液0.5 mlを、前項で得
られた化合物20 mgを2 mlのDMFに溶かした溶液に加え、
さらに水溶液B0.8 mlを加えて１時間撹拌した。氷冷し
たのち２倍量の75％酢酸を加え、１時間放置したのち0.
1％トリフルオロ酢酸水溶液を２倍量加えた。室温に戻
して濾過をしたのち逆相HPLCで精製してβ-アラニル-N
ε-t-ブトキシカルボニル-L-リシル-β-アラニル-N-(2-
アミノエチル)-N-[N4-(4-tert-ブチルベンゾイル)-シト
シン-1-イル-アセチル] グリシル-Nα-トリフルオロア
セチル-5'-アミノ-5'-デオキシピューロマイシンを得
た。
ル]-β-アラニル-Nε-t-ブトキシカルボニル-L-リシル-
β-アラニン330 mgを5 mlのDMFに溶かし、ピリジン1等
量及びペンタフルオロフェニルトリフルオロ酢酸1等量
を加えて１５分撹拌した。この溶液0.5 mlを、前項で得
られた化合物20 mgを2 mlのDMFに溶かした溶液に加え、
さらに水溶液B0.8 mlを加えて１時間撹拌した。氷冷し
たのち２倍量の75％酢酸を加え、１時間放置したのち0.
1％トリフルオロ酢酸水溶液を２倍量加えた。室温に戻
して濾過をしたのち逆相HPLCで精製してβ-アラニル-N
ε-t-ブトキシカルボニル-L-リシル-β-アラニル-N-(2-
アミノエチル)-N-[N4-(4-tert-ブチルベンゾイル)-シト
シン-1-イル-アセチル] グリシル-Nα-トリフルオロア
セチル-5'-アミノ-5'-デオキシピューロマイシンを得
た。
【００６０】上記で得られた化合物約5 mgを定法に従っ
て(+)-Biotin-PEO4-NHS-Propionate（フナコシ）で修飾
したのち、生成物を単離せずに約５倍量のエタノールと
１０倍量の濃アンモニア水を加え室温で２時間、５０℃
で３０分反応させた。溶液を濃縮したのち酢酸で酸性に
して逆相HPLCでビオチンラベル体を精製した。凍結乾燥
して得られた固体を氷浴中80%トリフルオロ酢酸水溶液
で１時間処理し、水で希釈してから再び凍結乾燥した。
β-アラニルのアミノ基が前記のビオチン修飾剤でラベ
ルされたβ-アラニル-L-リシル-β-アラニル-N-(2-アミ
ノエチル)-N-(N4-シトシン-1-イル-アセチル) グリシル
-5'-アミノ-5'-デオキシピューロマイシン誘導体が約4
mg得られた。MS (MALDI) 1466.7 [M+H]+
て(+)-Biotin-PEO4-NHS-Propionate（フナコシ）で修飾
したのち、生成物を単離せずに約５倍量のエタノールと
１０倍量の濃アンモニア水を加え室温で２時間、５０℃
で３０分反応させた。溶液を濃縮したのち酢酸で酸性に
して逆相HPLCでビオチンラベル体を精製した。凍結乾燥
して得られた固体を氷浴中80%トリフルオロ酢酸水溶液
で１時間処理し、水で希釈してから再び凍結乾燥した。
β-アラニルのアミノ基が前記のビオチン修飾剤でラベ
ルされたβ-アラニル-L-リシル-β-アラニル-N-(2-アミ
ノエチル)-N-(N4-シトシン-1-イル-アセチル) グリシル
-5'-アミノ-5'-デオキシピューロマイシン誘導体が約4
mg得られた。MS (MALDI) 1466.7 [M+H]+
【００６１】上記で得られた化合物を定法に従ってCy5
Monofunctional Dye（アマシャムファルマシアバイオテ
ク）で蛍光ラベルし、逆相HPLCで目的物（以下に示す式
（６）の化合物）を精製した。
Monofunctional Dye（アマシャムファルマシアバイオテ
ク）で蛍光ラベルし、逆相HPLCで目的物（以下に示す式
（６）の化合物）を精製した。
【００６２】
【化１７】
【００６３】実施例３：Cy5-c-amPuro（図１）によるGF
PのＣ末端１分子ラベル 合成したCy5-c-amPuroが無細胞翻訳系において実際にタ
ンパク質に取り込まれるかどうかを確認した。 活性を
比較する対象としてピューロマイシンにリン酸ジエステ
ル結合でdC、5'-アミノ修飾5（グレンリサーチ）を結合
させCy5でラベルしたCy5-dC-Puroを用いた。タンパク質
は分子量約27,000のGreen FluorescentProtein (GFP)を
選んだ。GFPは伊藤らが見い出したもの（名称：GFPuv
4）（Ito,Y. et al., Biochemical and Biophysical Re
search Communication 264, 556-560, (1999)）を用
い、488nmのレーザー光でも容易に励起されてイメージ
アナライザーで確認できるようにした。このGFPの上流
にT'7プロモーター領域及びKozak配列をもったDNAコン
ストラクトを作成するために次のようなやり方をした。
PのＣ末端１分子ラベル 合成したCy5-c-amPuroが無細胞翻訳系において実際にタ
ンパク質に取り込まれるかどうかを確認した。 活性を
比較する対象としてピューロマイシンにリン酸ジエステ
ル結合でdC、5'-アミノ修飾5（グレンリサーチ）を結合
させCy5でラベルしたCy5-dC-Puroを用いた。タンパク質
は分子量約27,000のGreen FluorescentProtein (GFP)を
選んだ。GFPは伊藤らが見い出したもの（名称：GFPuv
4）（Ito,Y. et al., Biochemical and Biophysical Re
search Communication 264, 556-560, (1999)）を用
い、488nmのレーザー光でも容易に励起されてイメージ
アナライザーで確認できるようにした。このGFPの上流
にT'7プロモーター領域及びKozak配列をもったDNAコン
ストラクトを作成するために次のようなやり方をした。
【００６４】T'7プロモーター領域及びKozak配列をもっ
たDNA（配列番号１）を鋳型DNAとする．この鋳型の5'側
の配列を含むプライマー（配列番号２）と３’側の相補
鎖の一部とGFPの５’側の相補鎖配列を含むプライマー
（配列番号３）でPCRを行った。PCR条件は，95℃20秒，
68℃20秒，72℃２０秒を２５回，EX Taqポリメラーゼ
（Takara）を用いて行った．次にGFPuv4をコードしたプ
ラスミドを鋳型として、配列番号４及び配列番号５のプ
ライマーでPCRした。ＰＣＲの条件は95℃で20秒，68℃
で20秒，72℃で30秒を30サイクル、EX Taqポリメラーゼ
（Takara）を用いて行った。
たDNA（配列番号１）を鋳型DNAとする．この鋳型の5'側
の配列を含むプライマー（配列番号２）と３’側の相補
鎖の一部とGFPの５’側の相補鎖配列を含むプライマー
（配列番号３）でPCRを行った。PCR条件は，95℃20秒，
68℃20秒，72℃２０秒を２５回，EX Taqポリメラーゼ
（Takara）を用いて行った．次にGFPuv4をコードしたプ
ラスミドを鋳型として、配列番号４及び配列番号５のプ
ライマーでPCRした。ＰＣＲの条件は95℃で20秒，68℃
で20秒，72℃で30秒を30サイクル、EX Taqポリメラーゼ
（Takara）を用いて行った。
【００６５】これらのPCR産物はフェノール抽出後、プ
ライマーリムーバー（Edge Biosystem）を用いてエタノ
ール沈澱を行い精製した。これらのDNAテンプレートを
各々等モル加えて、配列番号２及び配列番号５のプライ
マーでPCRした。PCR条件は95℃で20秒，68℃で20秒，72
℃で40秒を30サイクル、EX Taqポリメラーゼ（Takara）
を用いて行った。これらのPCR産物はフェノール抽出
後、プライマーリムーバー（Edge Biosystem）を用いて
エタノール沈澱を行い精製した。精製したＤＮＡはRibo
MAX（Promega）を用いて転写し翻訳用のｍＲＮＡとし
た。このｍＲＮＡ１μgとCy5-dC-Puro、Cy5-c-amPuroを
各々最終濃度が20μM,40μMになるように50μlの小麦胚
芽無細胞翻訳系（Promega）に加え、26℃で1時間反応さ
せた。サンプルは反応液１０μlをサンプルバッファー
１０μlに混ぜ、15%SDS-ポリアクリルアミド電気泳動に
よって分離した。確認はイメージアナライザーFX Mole
cularImager (Bio-Lad社)でGFPの蛍光およびCy5の蛍光
を検出した。いずれの翻訳反応でもGFPは合成されてお
り、ラベル化の効率はCy5-c-amPuroの方が Cy5-dC-Puro
より優れていることがわかった（図２）。
ライマーリムーバー（Edge Biosystem）を用いてエタノ
ール沈澱を行い精製した。これらのDNAテンプレートを
各々等モル加えて、配列番号２及び配列番号５のプライ
マーでPCRした。PCR条件は95℃で20秒，68℃で20秒，72
℃で40秒を30サイクル、EX Taqポリメラーゼ（Takara）
を用いて行った。これらのPCR産物はフェノール抽出
後、プライマーリムーバー（Edge Biosystem）を用いて
エタノール沈澱を行い精製した。精製したＤＮＡはRibo
MAX（Promega）を用いて転写し翻訳用のｍＲＮＡとし
た。このｍＲＮＡ１μgとCy5-dC-Puro、Cy5-c-amPuroを
各々最終濃度が20μM,40μMになるように50μlの小麦胚
芽無細胞翻訳系（Promega）に加え、26℃で1時間反応さ
せた。サンプルは反応液１０μlをサンプルバッファー
１０μlに混ぜ、15%SDS-ポリアクリルアミド電気泳動に
よって分離した。確認はイメージアナライザーFX Mole
cularImager (Bio-Lad社)でGFPの蛍光およびCy5の蛍光
を検出した。いずれの翻訳反応でもGFPは合成されてお
り、ラベル化の効率はCy5-c-amPuroの方が Cy5-dC-Puro
より優れていることがわかった（図２）。
【００６６】
【発明の効果】本発明により、タンパク質の効率のよい
Ｃ末端ラベルを行なうために使用することができるピュ
ーロマイシン誘導体が提供されることになった。
Ｃ末端ラベルを行なうために使用することができるピュ
ーロマイシン誘導体が提供されることになった。
【００６７】
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> GenCom <120> Puromycin derivatives and use thereof <130> A01556MA <160> 5
【００６８】 <210> 1 <211> 110 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA <400> 1 gatcccgcga aattaatacg actcactata gggagaccac aacggtttcc ctctagaaat 60 aattttgttt aactttaaga aggagatgcc accatggttg agccccgcat 110
【００６９】 <210> 2 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA <400> 2 gatcccgcga aattaatacg actcactata ggg 33
【００７０】 <210> 3 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA <400> 3 agatccgccg ccacccatct ccttcttaaa gttaaacaaa att 43
【００７１】 <210> 4 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA <400> 4 ggtggcggcg gatctatgag taaaggagaa gaacttttca 40
【００７２】 <210> 5 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA <400> 5 tttgtagagc tcatccatgc catgtgtaat cc 32
【図１】図１は、実施例１で合成したCy5-c-amPuroの化
学構造を示す図である。
学構造を示す図である。
【図２】図２は、Cy5-dC-Puro（比較用）及びCy5-c-amP
uro（本発明）を用いてGFPのＣ末端１分子ラベルを行な
った結果を示す図である。
uro（本発明）を用いてGFPのＣ末端１分子ラベルを行な
った結果を示す図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き Ｆターム(参考） 4B024 AA11 AA20 CA12 HA11 4B064 AG01 CA21 CC03 CC24 CD09 CD15 DA13 4C057 BB02 CC03 DD03 LL31 LL41 MM01 4H045 AA10 AA20 BA10 BA11 CA50 EA50 FA30 FA33 FA70 GA31
Claims (25)
- 【請求項１】 下記式（１）で表される化合物又はその
塩。 【化１】 （式中、Ｌ1はスペーサー基を示し、Ｒ1は反応性基を示
し、Ｎｕはピリミジン塩基又はプリン塩基の残基を示
す。） - 【請求項２】 Ｌ1が炭素数１〜６のアルキレン基を示
す、請求項１に記載の化合物又はその塩。 - 【請求項３】 Ｌ1がエチレン基である、請求項１又は
２に記載の化合物又はその塩。 - 【請求項４】 Ｒ1がアミノ基または保護されたアミノ
基である、請求項１から３の何れかに記載の化合物又は
その塩。 - 【請求項５】 Ｎｕがピリミジン塩基の残基である、請
求項１から４の何れかに記載の化合物又はその塩。 - 【請求項６】 Ｎｕがシトシンの残基である、請求項１
から５の何れかに記載の化合物又はその塩。 - 【請求項７】 下記式（２）で表される化合物又はその
塩。 【化２】 - 【請求項８】 下記式（３）で表される化合物又はその
塩。 【化３】 （式中、Ｌ1及びＬ3は各々独立にスペーサー基を示し、
Ｌ2は連結基を示し、Ｎｕはピリミジン塩基又はプリン
塩基の残基を示し、Ｘは標識物質の残基を示す。） - 【請求項９】 Ｌ1及びＬ3が各々独立に炭素数１〜６の
アルキレン基を示す、請求項８に記載の化合物又はその
塩。 - 【請求項１０】 Ｌ2が−ＣＯ−ＮＨ−基であり、窒素
原子がＬ1と連結し、炭素原子がＬ3と連結している、請
求項８又は９に記載の化合物又はその塩。 - 【請求項１１】 Ｎｕがピリミジン塩基の残基である、
請求項８から１０の何れかに記載の化合物又はその塩。 - 【請求項１２】 Ｎｕがシトシンの残基である、請求項
８から１１の何れかに記載の化合物又はその塩。 - 【請求項１３】 Ｘが蛍光物質の残基を示す、請求項８
から１２の何れかに記載の化合物又はその塩。 - 【請求項１４】 下記式（４）で表される化合物又はそ
の塩。 【化４】 - 【請求項１５】 下記式（５）で表される化合物又はそ
の塩。 【化５】 （式中、Ｌ1、Ｌ3、Ｌ6、Ｌ8、Ｌ9、Ｌ11及びＬ13は各
々独立にスペーサー基を示し、Ｌ2、Ｌ4、Ｌ5、Ｌ7、Ｌ
10、Ｌ12は各々独立に連結基を示し、Ｎｕはピリミジン
塩基又はプリン塩基の残基を示し、Ｘ1及びＸ2は各々独
立に標識物質の残基を示す。） - 【請求項１６】 Ｌ1、Ｌ3、Ｌ6、Ｌ8、Ｌ9、Ｌ11及び
Ｌ13が各々独立に各々独立に炭素数１〜６のアルキレン
基を示す、請求項１５に記載の化合物又はその塩。 - 【請求項１７】 Ｌ2、Ｌ4、Ｌ5、Ｌ7、Ｌ10、Ｌ12が各
々独立に−ＣＯ−ＮＨ−基である、請求項１５又は１６
に記載の化合物又はその塩。 - 【請求項１８】 Ｎｕがピリミジン塩基の残基である、
請求項１５から１７の何れかに記載の化合物又はその
塩。 - 【請求項１９】 Ｎｕがシトシンの残基である、請求項
１５から１８の何れかに記載の化合物又はその塩。 - 【請求項２０】 Ｘが蛍光物質の残基を示す、請求項１
５から１９の何れかに記載の化合物又はその塩。 - 【請求項２１】 下記式（６）で表される化合物又はそ
の塩。 【化６】 - 【請求項２２】 請求項１から２１の何れかに記載の化
合物又はその塩を構成成分として含むタンパク質又はそ
の誘導体。 - 【請求項２３】 請求項１から２１の何れかに記載の化
合物又はその塩を構成成分として含む核酸又はその誘導
体。 - 【請求項２４】 請求項１から２１の何れかに記載の化
合物又はその塩をタンパク質中に取り込ませる工程を含
む、修飾タンパク質の製造方法。 - 【請求項２５】 請求項１から２１の何れかに記載の化
合物又はその塩を核酸中に取り込ませる工程を含む、修
飾核酸の製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001065257A JP2002265492A (ja) | 2001-03-08 | 2001-03-08 | ピューロマイシン誘導体及びその利用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001065257A JP2002265492A (ja) | 2001-03-08 | 2001-03-08 | ピューロマイシン誘導体及びその利用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2002265492A true JP2002265492A (ja) | 2002-09-18 |
Family
ID=18923943
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2001065257A Pending JP2002265492A (ja) | 2001-03-08 | 2001-03-08 | ピューロマイシン誘導体及びその利用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2002265492A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2003062417A1 (fr) * | 2002-01-22 | 2003-07-31 | Mitsubishi Chemical Corporation | Produit de ligation arn-adn, et utilisation correspondante |
-
2001
- 2001-03-08 JP JP2001065257A patent/JP2002265492A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2003062417A1 (fr) * | 2002-01-22 | 2003-07-31 | Mitsubishi Chemical Corporation | Produit de ligation arn-adn, et utilisation correspondante |
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