JPH1171392A - ピューロマイシンを３′−リン酸末端にもつ核酸化合物及びその合成方法 - Google Patents
ピューロマイシンを３′−リン酸末端にもつ核酸化合物及びその合成方法Info
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- JPH1171392A JPH1171392A JP23583497A JP23583497A JPH1171392A JP H1171392 A JPH1171392 A JP H1171392A JP 23583497 A JP23583497 A JP 23583497A JP 23583497 A JP23583497 A JP 23583497A JP H1171392 A JPH1171392 A JP H1171392A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 ピューロマイシンは官能基が多いため選択的
な反応を行うことが難しく、自動合成機によりピューロ
マイシンを３′−リン酸末端にもつ任意の配列をもつＤ
ＮＡ、ＲＮＡの合成はできなかった。 【解決手段】 ピューロマイシンの第一アミン、５′位
の水酸基をブロックした後、３′位の水酸基を琥珀酸で
ブロックしその琥珀酸に長鎖アルキルアミン−ＣＰＧを
反応させる工程により得られたＮ−フルオレニルメトキ
シカルボニル−５′−Ｏ−ジメトキシトリチル−ピュー
ロマイシン３′−Ｏ−スクシネートＣＰＧ−サポートを
通常のホスホロアミダイト法に付し、次いでピューロマ
イシン誘導体を３′−末端にもつ核酸化合物をサポート
から切り出し、更にデブロックおよび精製を行う。
な反応を行うことが難しく、自動合成機によりピューロ
マイシンを３′−リン酸末端にもつ任意の配列をもつＤ
ＮＡ、ＲＮＡの合成はできなかった。 【解決手段】 ピューロマイシンの第一アミン、５′位
の水酸基をブロックした後、３′位の水酸基を琥珀酸で
ブロックしその琥珀酸に長鎖アルキルアミン−ＣＰＧを
反応させる工程により得られたＮ−フルオレニルメトキ
シカルボニル−５′−Ｏ−ジメトキシトリチル−ピュー
ロマイシン３′−Ｏ−スクシネートＣＰＧ−サポートを
通常のホスホロアミダイト法に付し、次いでピューロマ
イシン誘導体を３′−末端にもつ核酸化合物をサポート
から切り出し、更にデブロックおよび精製を行う。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、ピューロマイシン
の活性を生かした誘導体、特にピューロマイシンを末端
に持った核酸誘導体の合成に関する。
の活性を生かした誘導体、特にピューロマイシンを末端
に持った核酸誘導体の合成に関する。
【０００２】
【従来の技術】ピューロマイシンは蛋白合成を阻害する
抗生物質である。その作用機構は、アミノ酸を担持した
ｔＲＮＡの代わりにリボソームに取り込まれ、合成され
伸長してきたペプチドと反応しそれ以上伸長できなくさ
せることによりペプチドの合成を止めるというものであ
る。このように特異な作用機構を持つものの、ピューロ
マイシンの活性を生かした誘導体、特にピューロマイシ
ンを末端に持った核酸化合物はこれまで合成されなかっ
た。その理由はピューロマイシンは官能基が多いため選
択的な反応を行うことが難しく、また核酸の末端に結合
させる収率の良い方法が皆無であったためである。
抗生物質である。その作用機構は、アミノ酸を担持した
ｔＲＮＡの代わりにリボソームに取り込まれ、合成され
伸長してきたペプチドと反応しそれ以上伸長できなくさ
せることによりペプチドの合成を止めるというものであ
る。このように特異な作用機構を持つものの、ピューロ
マイシンの活性を生かした誘導体、特にピューロマイシ
ンを末端に持った核酸化合物はこれまで合成されなかっ
た。その理由はピューロマイシンは官能基が多いため選
択的な反応を行うことが難しく、また核酸の末端に結合
させる収率の良い方法が皆無であったためである。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】現在ＤＮＡやＲＮＡの
化学合成は非常に進歩し、自動合成機により容易に合成
できるようになっている。本発明ではこの技術に組み込
めるようピューロマイシンを化学修飾してＤＮＡ、ＲＮ
Ａ固相自動合成用の固相担体とし、ピューロマイシンを
３′−リン酸末端にもつ任意の配列をもつＤＮＡ、ＲＮ
Ａの化学合成を可能にするものである。
化学合成は非常に進歩し、自動合成機により容易に合成
できるようになっている。本発明ではこの技術に組み込
めるようピューロマイシンを化学修飾してＤＮＡ、ＲＮ
Ａ固相自動合成用の固相担体とし、ピューロマイシンを
３′−リン酸末端にもつ任意の配列をもつＤＮＡ、ＲＮ
Ａの化学合成を可能にするものである。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明は、（１）ピュー
ロマイシンの第一アミンをＮ−フルオレニルメトキシカ
ルボニル基でブロックする工程、（２）その５′位の水
酸基をジメトキシトリチル基でブロックする工程、
（３）その３′位の水酸基を琥珀酸でブロックする工
程、及び（４）その琥珀酸に長鎖アルキルアミン−ＣＰ
Ｇを反応させる工程によりＮ−フルオレニルメトキシカ
ルボニル−５′−Ｏ−ジメトキシトリチル−ピューロマ
イシン３′−Ｏ−スクシネートＣＰＧ−サポートを生成
し、その生成物を通常のホスホロアミダイト法に付し、
次いでピューロマイシン誘導体を３′−リン酸末端に持
つ核酸化合物をサポートから切り出し、更にデブロック
および精製を行うことによってピューロマイシンを３′
−リン酸末端に持つ核酸化合物を合成する方法である。
ロマイシンの第一アミンをＮ−フルオレニルメトキシカ
ルボニル基でブロックする工程、（２）その５′位の水
酸基をジメトキシトリチル基でブロックする工程、
（３）その３′位の水酸基を琥珀酸でブロックする工
程、及び（４）その琥珀酸に長鎖アルキルアミン−ＣＰ
Ｇを反応させる工程によりＮ−フルオレニルメトキシカ
ルボニル−５′−Ｏ−ジメトキシトリチル−ピューロマ
イシン３′−Ｏ−スクシネートＣＰＧ−サポートを生成
し、その生成物を通常のホスホロアミダイト法に付し、
次いでピューロマイシン誘導体を３′−リン酸末端に持
つ核酸化合物をサポートから切り出し、更にデブロック
および精製を行うことによってピューロマイシンを３′
−リン酸末端に持つ核酸化合物を合成する方法である。
【０００５】
【発明の実施の形態】本発明の出発物質であるピューロ
マイシンは次式の化学構造式を有する。
マイシンは次式の化学構造式を有する。
【化１】
【０００６】上記ピューロマイシンを化学修飾して得ら
れるＮ−フルオレニルメトキシカルボニル−５′−Ｏ−
ジメトキシトリチル−ピューロマイシン３′−Ｏ−スク
シネートＣＰＧ−サポートは、次式の化学構造式を有す
る。
れるＮ−フルオレニルメトキシカルボニル−５′−Ｏ−
ジメトキシトリチル−ピューロマイシン３′−Ｏ−スク
シネートＣＰＧ−サポートは、次式の化学構造式を有す
る。
【化２】
【０００７】上記化学構造式のサポートは、市販されて
いる自動合成機に装着し、通常のＤＮＡ、ＲＮＡ合成を
行った後、アンモニア水でサポートを切り離し、得られ
た３′−リン酸末端にピューロマイシン誘導体を持つ核
酸化合物を通常の方法によりデブロック（脱保護）、精
製して本発明の化合物を得る。このような自動合成はこ
れまで不可能であった。
いる自動合成機に装着し、通常のＤＮＡ、ＲＮＡ合成を
行った後、アンモニア水でサポートを切り離し、得られ
た３′−リン酸末端にピューロマイシン誘導体を持つ核
酸化合物を通常の方法によりデブロック（脱保護）、精
製して本発明の化合物を得る。このような自動合成はこ
れまで不可能であった。
【０００８】
【実施例】以下、本発明を実施例について説明する。試薬・機器 ピューロマイシンとＬＣＡＡ−ＣＰＧ（ｌｏｎｇ ｃｈ
ａｉｎ ａｌｋｙｌａｍｉｎｅ−ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ
ｐｏｒｅ ｇｌａｓｓ）はシグマ社より購入した。Ｄ
ＮＡ合成用試薬はグレン・リサーチ（Ｇｌｅｎ ｒｅｓ
ｅａｒｃｈ）より購入した。反応には乾燥溶媒を用い
た。溶媒の乾燥剤として、ピリジンには水酸化バリウ
ム、アセトニトリルには水素化カルシウムを用いた。シ
リカゲルはＷａｋｏｇｅｌ Ｃ−２００、ＮＭＲはＪＥ
ＯＬ−ＪＮＭ−ＧＸ４００スペクトロメーター、ＦＡＢ
ｍａｓｓはＪＥＯＬ ＪＭＳ−ＳＸ１０２Ａ、ＤＮＡ
合成機はＡＢＩ３８１Ａ ＤＮＡシンセサイザーを用い
た。
ａｉｎ ａｌｋｙｌａｍｉｎｅ−ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ
ｐｏｒｅ ｇｌａｓｓ）はシグマ社より購入した。Ｄ
ＮＡ合成用試薬はグレン・リサーチ（Ｇｌｅｎ ｒｅｓ
ｅａｒｃｈ）より購入した。反応には乾燥溶媒を用い
た。溶媒の乾燥剤として、ピリジンには水酸化バリウ
ム、アセトニトリルには水素化カルシウムを用いた。シ
リカゲルはＷａｋｏｇｅｌ Ｃ−２００、ＮＭＲはＪＥ
ＯＬ−ＪＮＭ−ＧＸ４００スペクトロメーター、ＦＡＢ
ｍａｓｓはＪＥＯＬ ＪＭＳ−ＳＸ１０２Ａ、ＤＮＡ
合成機はＡＢＩ３８１Ａ ＤＮＡシンセサイザーを用い
た。
【０００９】（実施例１）スキーム
【化３】 ａ：Ｆｍｏｃ−ＯＳｕ、Ｅｔ3 Ｎ／ＣＨ3 ＣＮ ｂ：ＤＭＴｒＣｌ、Ｅｔ3 Ｎ／ピリジン ｃ：無水琥珀酸、ＤＭＡＰ／ピリジン ｄ：ＬＣＡＡ−ＣＰＧ，ＤＥＣ，ＤＭＡＰ，ＤｈｂｔＯ
Ｈ／ピリジン 上記スキームに沿って、各工程段階の反応を以下のよう
に行った。
Ｈ／ピリジン 上記スキームに沿って、各工程段階の反応を以下のよう
に行った。
【００１０】Ｎ−フルオレニルメトキシカルボニル−ピ
ューロマイシン（１）の合成 ピューロマイシン２塩酸塩・１水和物２００ｍｇ（０．
３５５ｍｍｏｌ）をアセトニトリル１０ｍｌで３回共沸
させ乾燥した。そこへアセトニトリル１０ｍｌ、トリエ
チルアミン９９μｌ（０．７１ｍｍｏｌ）、そしてＮ−
（９−フルオレニルメトキシカルボニロキシ）スクシン
イミド２４０ｍｇ（０．７１２ｍｍｏｌ）を加え、室温
下２４時間攪拌した。生成した沈殿を濾別し、アセトニ
トリルでよく洗浄し、沈殿を真空ポンプで乾燥した。収
量２４２ｍｇ（０．３４９ｍｍｏｌ，９８．２％）であ
った。
ューロマイシン（１）の合成 ピューロマイシン２塩酸塩・１水和物２００ｍｇ（０．
３５５ｍｍｏｌ）をアセトニトリル１０ｍｌで３回共沸
させ乾燥した。そこへアセトニトリル１０ｍｌ、トリエ
チルアミン９９μｌ（０．７１ｍｍｏｌ）、そしてＮ−
（９−フルオレニルメトキシカルボニロキシ）スクシン
イミド２４０ｍｇ（０．７１２ｍｍｏｌ）を加え、室温
下２４時間攪拌した。生成した沈殿を濾別し、アセトニ
トリルでよく洗浄し、沈殿を真空ポンプで乾燥した。収
量２４２ｍｇ（０．３４９ｍｍｏｌ，９８．２％）であ
った。
【００１１】1 ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ
６）δ２．７５（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１０．１，１３．６
Ｈｚ，Ｔｙｒ−ＣＨ2 ），２．９３（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝
４．４，１２．９Ｈｚ，Ｔｙｒ−ＣＨ2 ），３．３６−
３．５６（ｍ，８Ｈ，５′，Ｎ−ＣＨ3 ），３．６７
（ｓ，３Ｈ，Ｔｙｒ−ＯＣＨ3 ），３．９４（ｍ，１
Ｈ，４′），４．１０−４．１８（ｍ，３Ｈ，Ｆｍｏｃ
−ＣＨ，Ｆｍｏｃ−ＣＨ2），４．３２（ｄｄｄ，１
Ｈ，Ｊ＝４．８，９．０，９．０Ｈｚ，Ｔｙｒ−Ｃ
Ｈ），４．４２−４．５２（ｍ，２Ｈ，２′，３′），
５．１３（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝５．４Ｈｚ，５′−ＯＨ），
５．９９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．６Ｈｚ，１′），６．０
６（ｂｒ，１Ｈ，２′−ＯＨ），６．７９（ｄ，２Ｈ，
Ｊ＝８．４Ｈｚ，Ｔｙｒ−ａｒｏｍａｔｉｃ），７．２
３（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，Ｔｙｒ−ａｒｏｍａｔ
ｉｃ），７．２９（ｍ，２Ｈ，Ｆｍｏｃ−ａｒｏｍａｔ
ｉｃ），７．３９（ｍ，２Ｈ，Ｆｍｏｃ−ａｒｏｍａｔ
ｉｃ），７．５３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，Ｔｙｒ
−ＮＨ），７．６３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，Ｆｍ
ｏｃ−ａｒｏｍａｔｉｃ），７．６４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝
７．３Ｈｚ，Ｆｍｏｃ−ａｒｏｍａｔｉｃ），７．８６
（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，Ｆｍｏｃ−ａｒｏｍａｔ
ｉｃ），８．０６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，３′−
ＮＨ），８．２２（ｓ，１Ｈ，２），８．４２（ｓ，１
Ｈ，８）；ＨＲＭＳ（ＦＡＢＭＳ） 理論値 Ｃ 37Ｈ40
Ｎ7 Ｏ7 ［（Ｍ＋Ｈ）+ ］６９４．２９８９，測定値
６９４．３０１２．
６）δ２．７５（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１０．１，１３．６
Ｈｚ，Ｔｙｒ−ＣＨ2 ），２．９３（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝
４．４，１２．９Ｈｚ，Ｔｙｒ−ＣＨ2 ），３．３６−
３．５６（ｍ，８Ｈ，５′，Ｎ−ＣＨ3 ），３．６７
（ｓ，３Ｈ，Ｔｙｒ−ＯＣＨ3 ），３．９４（ｍ，１
Ｈ，４′），４．１０−４．１８（ｍ，３Ｈ，Ｆｍｏｃ
−ＣＨ，Ｆｍｏｃ−ＣＨ2），４．３２（ｄｄｄ，１
Ｈ，Ｊ＝４．８，９．０，９．０Ｈｚ，Ｔｙｒ−Ｃ
Ｈ），４．４２−４．５２（ｍ，２Ｈ，２′，３′），
５．１３（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝５．４Ｈｚ，５′−ＯＨ），
５．９９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．６Ｈｚ，１′），６．０
６（ｂｒ，１Ｈ，２′−ＯＨ），６．７９（ｄ，２Ｈ，
Ｊ＝８．４Ｈｚ，Ｔｙｒ−ａｒｏｍａｔｉｃ），７．２
３（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，Ｔｙｒ−ａｒｏｍａｔ
ｉｃ），７．２９（ｍ，２Ｈ，Ｆｍｏｃ−ａｒｏｍａｔ
ｉｃ），７．３９（ｍ，２Ｈ，Ｆｍｏｃ−ａｒｏｍａｔ
ｉｃ），７．５３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，Ｔｙｒ
−ＮＨ），７．６３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，Ｆｍ
ｏｃ−ａｒｏｍａｔｉｃ），７．６４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝
７．３Ｈｚ，Ｆｍｏｃ−ａｒｏｍａｔｉｃ），７．８６
（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，Ｆｍｏｃ−ａｒｏｍａｔ
ｉｃ），８．０６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，３′−
ＮＨ），８．２２（ｓ，１Ｈ，２），８．４２（ｓ，１
Ｈ，８）；ＨＲＭＳ（ＦＡＢＭＳ） 理論値 Ｃ 37Ｈ40
Ｎ7 Ｏ7 ［（Ｍ＋Ｈ）+ ］６９４．２９８９，測定値
６９４．３０１２．
【００１２】Ｎ−フルオレニルメトキシカルボニル−
５′−Ｏ−ジメトキシトリチル−ピューロマイシン
（２）の合成 Ｎ−フルオレニルメトキシカルボニル−ピューロマイシ
ン（１）２４２ｍｇ（０．３４８ｍｍｏｌ）をピリジン
１０ｍｌで３回共沸させ乾燥した。そこへピリジン１０
ｍｌ、トリエチルアミン７３μｌ（０．５３ｍｍｏ
ｌ）、そしてジメトキシトリチルクロライド２３６ｍｇ
（０．６９６ｍｍｏｌ）を加え、室温下攪拌した。３時
間後、少量のメタノールを加えて余分のジメトキシトリ
チルクロライドをつぶし、溶媒をエバポレーターで減圧
留去した。シリカゲルカラムで精製し（展開溶媒：塩化
メチレン−３％メタノール／塩化メチレン）、目的物質
２９３ｍｇ（０．２９４ｍｍｏｌ，８４．４％）を得
た。
５′−Ｏ−ジメトキシトリチル−ピューロマイシン
（２）の合成 Ｎ−フルオレニルメトキシカルボニル−ピューロマイシ
ン（１）２４２ｍｇ（０．３４８ｍｍｏｌ）をピリジン
１０ｍｌで３回共沸させ乾燥した。そこへピリジン１０
ｍｌ、トリエチルアミン７３μｌ（０．５３ｍｍｏ
ｌ）、そしてジメトキシトリチルクロライド２３６ｍｇ
（０．６９６ｍｍｏｌ）を加え、室温下攪拌した。３時
間後、少量のメタノールを加えて余分のジメトキシトリ
チルクロライドをつぶし、溶媒をエバポレーターで減圧
留去した。シリカゲルカラムで精製し（展開溶媒：塩化
メチレン−３％メタノール／塩化メチレン）、目的物質
２９３ｍｇ（０．２９４ｍｍｏｌ，８４．４％）を得
た。
【００１３】1 ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3 ）
δ２．８２（ｂｒ，１Ｈ，Ｔｙｒ−ＣＨ2 ），３．００
（ｂｒ，１Ｈ，Ｔｙｒ−ＣＨ2 ），３．３０（ｄｄ，１
ＨＡ，Ｊ＝３．８，１０．８Ｈｚ，５′），３．４３
（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．０，１０．７Ｈｚ，５′），
３．２０−３．８０（ｂｒ，６Ｈ，Ｎ−ＣＨ3 ），３．
６７（ｓ，３Ｈ，Ｔｙｒ−ＯＣＨ3 ），３．７４（ｓ，
６Ｈ，ジメトキシトリチル−ＯＣＨ3 ），４．１３−
４．２１（ｍ，２Ｈ，４′，Ｆｍｏｃ−ＣＨ），４．２
７−４．３８（ｂｒ，ｍ，３Ｈ，Ｔｙｒ−ＣＨ，Ｆｍｏ
ｃ−ＣＨ2 ），４．４３（ｂｒ，１Ｈ，３′），４．６
２（ｂｒ，ｔ，１Ｈ，Ｊ＝５．２Ｈｚ，２′），５．４
３（ｂｒ，ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，Ｔｙｒ−Ｎ
Ｈ），５．６３（ｂｒ，１Ｈ，１′），６．４２（ｂ
ｒ，１Ｈ，３′−ＮＨ），６．７５（ｍ，６Ｈ，Ｔｙｒ
−ａｒｏｍａｔｉｃ，ジメトキシトリチル−ａｒｏｍａ
ｔｉｃ），６．９８（ｍ，２Ｈ，Ｔｙｒ−ａｒｏｍａｔ
ｉｃ），７．１３−７．３９（ｍ，１３Ｈ，Ｆｍｏｃ−
ａｒｏｍａｔｉｃ，ジメトキシトリチル−ａｒｏｍａｔ
ｉｃ），７．５１（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，Ｆｍｏ
ｃ−ａｒｏｍａｔｉｃ），７．７２（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝
７．５Ｈｚ，Ｆｍｏｃ−ａｒｏｍａｔｉｃ），７．９９
（ｓ，１Ｈ，２），８．１９（ｓ，１Ｈ，８）；ＦＡＢ
ＭＳ 理論値 Ｃ58Ｈ58Ｎ7Ｏ9 ９９６［（Ｍ＋
Ｈ）+ ］ 測定値 ９９６．
δ２．８２（ｂｒ，１Ｈ，Ｔｙｒ−ＣＨ2 ），３．００
（ｂｒ，１Ｈ，Ｔｙｒ−ＣＨ2 ），３．３０（ｄｄ，１
ＨＡ，Ｊ＝３．８，１０．８Ｈｚ，５′），３．４３
（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．０，１０．７Ｈｚ，５′），
３．２０−３．８０（ｂｒ，６Ｈ，Ｎ−ＣＨ3 ），３．
６７（ｓ，３Ｈ，Ｔｙｒ−ＯＣＨ3 ），３．７４（ｓ，
６Ｈ，ジメトキシトリチル−ＯＣＨ3 ），４．１３−
４．２１（ｍ，２Ｈ，４′，Ｆｍｏｃ−ＣＨ），４．２
７−４．３８（ｂｒ，ｍ，３Ｈ，Ｔｙｒ−ＣＨ，Ｆｍｏ
ｃ−ＣＨ2 ），４．４３（ｂｒ，１Ｈ，３′），４．６
２（ｂｒ，ｔ，１Ｈ，Ｊ＝５．２Ｈｚ，２′），５．４
３（ｂｒ，ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，Ｔｙｒ−Ｎ
Ｈ），５．６３（ｂｒ，１Ｈ，１′），６．４２（ｂ
ｒ，１Ｈ，３′−ＮＨ），６．７５（ｍ，６Ｈ，Ｔｙｒ
−ａｒｏｍａｔｉｃ，ジメトキシトリチル−ａｒｏｍａ
ｔｉｃ），６．９８（ｍ，２Ｈ，Ｔｙｒ−ａｒｏｍａｔ
ｉｃ），７．１３−７．３９（ｍ，１３Ｈ，Ｆｍｏｃ−
ａｒｏｍａｔｉｃ，ジメトキシトリチル−ａｒｏｍａｔ
ｉｃ），７．５１（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，Ｆｍｏ
ｃ−ａｒｏｍａｔｉｃ），７．７２（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝
７．５Ｈｚ，Ｆｍｏｃ−ａｒｏｍａｔｉｃ），７．９９
（ｓ，１Ｈ，２），８．１９（ｓ，１Ｈ，８）；ＦＡＢ
ＭＳ 理論値 Ｃ58Ｈ58Ｎ7Ｏ9 ９９６［（Ｍ＋
Ｈ）+ ］ 測定値 ９９６．
【００１４】Ｎ−フルオレニルメトキシカルボニル−
５′−Ｏ−ジメトキシトリチル−ピューロマイシン３′
−Ｏ−スクシネート（３）の合成 Ｎ−フルオレニルメトキシカルボニル−５′−Ｏ−ジメ
トキシトリチル−ピューロマイシン（２）２９３ｍｇ
（０．２９４ｍｍｏｌ）をピリジン１０ｍｌで３回共沸
させ乾燥した。そこへピリジン１０ｍｌ、無水琥珀酸２
９４ｍｇ（２．９４ｍｍｏｌ）、そしてジメチルアミノ
ピリジン１０ｍｇ（ｃａｔ．）を加え２４時間攪拌し
た。溶媒をエバポレーターで減圧留去した後、残さを少
量のメタノールに溶解させ、１００ｍｌの蒸留水を加え
た。生じた沈殿を濾過し、よく蒸留水で洗浄した後、乾
燥した。ここに塩化メチレンを加え、溶けないものを濾
別し、溶液中の塩化メチレンを減圧留去し、乾燥した。
目的物質３１４ｍｇ（０．２８６ｍｍｏｌ，９７．４
％）を得た。
５′−Ｏ−ジメトキシトリチル−ピューロマイシン３′
−Ｏ−スクシネート（３）の合成 Ｎ−フルオレニルメトキシカルボニル−５′−Ｏ−ジメ
トキシトリチル−ピューロマイシン（２）２９３ｍｇ
（０．２９４ｍｍｏｌ）をピリジン１０ｍｌで３回共沸
させ乾燥した。そこへピリジン１０ｍｌ、無水琥珀酸２
９４ｍｇ（２．９４ｍｍｏｌ）、そしてジメチルアミノ
ピリジン１０ｍｇ（ｃａｔ．）を加え２４時間攪拌し
た。溶媒をエバポレーターで減圧留去した後、残さを少
量のメタノールに溶解させ、１００ｍｌの蒸留水を加え
た。生じた沈殿を濾過し、よく蒸留水で洗浄した後、乾
燥した。ここに塩化メチレンを加え、溶けないものを濾
別し、溶液中の塩化メチレンを減圧留去し、乾燥した。
目的物質３１４ｍｇ（０．２８６ｍｍｏｌ，９７．４
％）を得た。
【００１５】1 ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3 ）
δ２．５４−２．７５（ｍ，６Ｈ，Ｔｙｒ−ＣＨ2 ，ｓ
ｕｃｃｉｎｉｃ ｅｓｔｅｒ−ＣＨ2 ），３．３０−
３．４０（ｍ，２Ｈ，５′），３．４８（ｂｒ，ｓ，６
Ｈ，Ｎ−ＣＨ3 ），３．６７（ｓ，３Ｈ，Ｔｙｒ−ＯＣ
Ｈ3 ），３．７１（ｓ，６Ｈ，ジメトキシトリチル−Ｏ
ＣＨ3 ），３．８９（ｂｒ，１Ｈ，４′），４．０５
（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，Ｆｍｏｃ−ＣＨ），４．
１２−４．２５（ｍ，２Ｈ，Ｆｍｏｃ−ＣＨ2 ），４．
７３（ｍ，１Ｈ，Ｔｙｒ−ＣＨ），５．１５（ｍ，１
Ｈ，３′），５．７７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．７Ｈｚ，
２′），５．８２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，Ｔｙｒ
−ＮＨ），６．０８（ｓ，１Ｈ，１′），６．６２−
６．７０（ｍ，３Ｈ，３′−ＮＨ，Ｔｙｒ−ａｒｏｍａ
ｔｉｃ），６．７６（ｄ，４Ｈ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，ジメ
トキシトリチル−ａｒｏｍａｔｉｃ），６．９０（ｄ，
２Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，Ｔｙｒ−ａｒｏｍａｔｉｃ），
７．１０−７．５０（ｍ，１５Ｈ，Ｆｍｏｃ−ａｒｏｍ
ａｔｉｃ，ジメトキシトリチル−ａｒｏｍａｔｉｃ），
７．７０（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，Ｆｍｏｃ−ａｒ
ｏｍａｔｉｃ），７．９１（ｓ，１Ｈ，２），８．２６
（ｓ，１Ｈ，８）； ＦＡＢＭＳ 理論値 Ｃ62Ｈ62Ｎ
7 Ｏ12 １０９６［（Ｍ＋Ｈ）+ ］、Ｃ62Ｈ60Ｎ7 Ｏ12
１０９４［（Ｍ−Ｈ）］ 測定値 １０９６［（Ｍ＋
Ｈ）+ ］，１０９４［（Ｍ−Ｈ）］．
δ２．５４−２．７５（ｍ，６Ｈ，Ｔｙｒ−ＣＨ2 ，ｓ
ｕｃｃｉｎｉｃ ｅｓｔｅｒ−ＣＨ2 ），３．３０−
３．４０（ｍ，２Ｈ，５′），３．４８（ｂｒ，ｓ，６
Ｈ，Ｎ−ＣＨ3 ），３．６７（ｓ，３Ｈ，Ｔｙｒ−ＯＣ
Ｈ3 ），３．７１（ｓ，６Ｈ，ジメトキシトリチル−Ｏ
ＣＨ3 ），３．８９（ｂｒ，１Ｈ，４′），４．０５
（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，Ｆｍｏｃ−ＣＨ），４．
１２−４．２５（ｍ，２Ｈ，Ｆｍｏｃ−ＣＨ2 ），４．
７３（ｍ，１Ｈ，Ｔｙｒ−ＣＨ），５．１５（ｍ，１
Ｈ，３′），５．７７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．７Ｈｚ，
２′），５．８２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，Ｔｙｒ
−ＮＨ），６．０８（ｓ，１Ｈ，１′），６．６２−
６．７０（ｍ，３Ｈ，３′−ＮＨ，Ｔｙｒ−ａｒｏｍａ
ｔｉｃ），６．７６（ｄ，４Ｈ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，ジメ
トキシトリチル−ａｒｏｍａｔｉｃ），６．９０（ｄ，
２Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，Ｔｙｒ−ａｒｏｍａｔｉｃ），
７．１０−７．５０（ｍ，１５Ｈ，Ｆｍｏｃ−ａｒｏｍ
ａｔｉｃ，ジメトキシトリチル−ａｒｏｍａｔｉｃ），
７．７０（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，Ｆｍｏｃ−ａｒ
ｏｍａｔｉｃ），７．９１（ｓ，１Ｈ，２），８．２６
（ｓ，１Ｈ，８）； ＦＡＢＭＳ 理論値 Ｃ62Ｈ62Ｎ
7 Ｏ12 １０９６［（Ｍ＋Ｈ）+ ］、Ｃ62Ｈ60Ｎ7 Ｏ12
１０９４［（Ｍ−Ｈ）］ 測定値 １０９６［（Ｍ＋
Ｈ）+ ］，１０９４［（Ｍ−Ｈ）］．
【００１６】Ｎ−フルオレニルメトキシカルボニル−
５′−Ｏ−ジメトキシトリチル−ピューロマイシン３′
−Ｏ−スクシネートＣＰＧ−サポート（４）の合成 Ｎ−フルオレニルメトキシカルボニル−５′−Ｏ−ジメ
トキシトリチル−ピューロマイシン３′−Ｏ−スクシネ
ート（３）をピリジン１０ｍｌで３回共沸させ乾燥し
た。シールドボトルに活性化した1 ＬＣＡＡ−ＣＰＧ２
００ｍｇ、１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−
エチルカルボジイミド８９ｍｇ（０．４６４ｍｍｏ
ｌ）、ジメチルアミノピリジン１５ｍｇ（０．１２３ｍ
ｍｏｌ）、そして３，４−ジヒドロ−３−ヒドロキシ４
−オキソ−１，２，３−ベンゾトリアジン７５ｍｇ
（０．４６０ｍｍｏｌ）を入れて窒素置換した。そこへ
Ｎ−フルオレニルメトキシカルボニル−５′−Ｏ−ジメ
トキシトリチル−ピューロマイシン３′−Ｏ−スクシネ
ート（３）１１１ｍｇ（０．０９２７ｍｍｏｌ）を４ｍ
ｌのピリジンに溶解させ加えた。振とう機を使って４日
間攪拌した後、ＬＣＡＡ−ＣＰＧを濾別し、ドライアセ
トニトリルで洗浄した。３％トリクロロ酢酸−塩化メチ
レンにより生成するジメトキシトリチルカチオンをＵＶ
で定量する（ε＝７００００，４９８ｎｍ）ことによ
り、サポートは２１μｍｏｌ／ｇでビューロマイシンを
担持していることが判った。
５′−Ｏ−ジメトキシトリチル−ピューロマイシン３′
−Ｏ−スクシネートＣＰＧ−サポート（４）の合成 Ｎ−フルオレニルメトキシカルボニル−５′−Ｏ−ジメ
トキシトリチル−ピューロマイシン３′−Ｏ−スクシネ
ート（３）をピリジン１０ｍｌで３回共沸させ乾燥し
た。シールドボトルに活性化した1 ＬＣＡＡ−ＣＰＧ２
００ｍｇ、１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−
エチルカルボジイミド８９ｍｇ（０．４６４ｍｍｏ
ｌ）、ジメチルアミノピリジン１５ｍｇ（０．１２３ｍ
ｍｏｌ）、そして３，４−ジヒドロ−３−ヒドロキシ４
−オキソ−１，２，３−ベンゾトリアジン７５ｍｇ
（０．４６０ｍｍｏｌ）を入れて窒素置換した。そこへ
Ｎ−フルオレニルメトキシカルボニル−５′−Ｏ−ジメ
トキシトリチル−ピューロマイシン３′−Ｏ−スクシネ
ート（３）１１１ｍｇ（０．０９２７ｍｍｏｌ）を４ｍ
ｌのピリジンに溶解させ加えた。振とう機を使って４日
間攪拌した後、ＬＣＡＡ−ＣＰＧを濾別し、ドライアセ
トニトリルで洗浄した。３％トリクロロ酢酸−塩化メチ
レンにより生成するジメトキシトリチルカチオンをＵＶ
で定量する（ε＝７００００，４９８ｎｍ）ことによ
り、サポートは２１μｍｏｌ／ｇでビューロマイシンを
担持していることが判った。
【００１７】次いで、上記実施例１によって得られたＮ
−フルオレニルメトキシカルボニル−５′−Ｏ−ジメト
キシトリチル−ピューロマイシン３′−Ｏ−スクシネー
トＣＰＧ−サポート（４）より３′−リン酸末端にピュ
ーロマイシンをもつ核酸誘導体を合成する方法について
述べる。
−フルオレニルメトキシカルボニル−５′−Ｏ−ジメト
キシトリチル−ピューロマイシン３′−Ｏ−スクシネー
トＣＰＧ−サポート（４）より３′−リン酸末端にピュ
ーロマイシンをもつ核酸誘導体を合成する方法について
述べる。
【００１８】（実施例２）５′−ｄ（ＧＣＡＴ）−ピューロマイシンの合成 前記実施例１により合成したサポート２５ｍｇ（０．５
３μｍｏｌ）を用いて通常のホスホロアミダイト法によ
って（ただし、カップリング時間は５分とした）、５′
−ｄ（ＧＣＡＴ）−ピューロマイシンを合成した。合成
後、２８％アンモニア水でサポートからの切り出し、５
５℃、８時間で塩基の保護基のデブロックを行った。ア
ンモニアを減圧留去し、蒸留水で約５００μｌとなるよ
うに希釈した。これをＨＰＬＣで分析し、メインピーク
を分取・精製した。分取後、アセトニトリルを減圧留去
し凍結乾燥によりギ酸アンモニウムをとばした。蒸留水
５００μｌを加えて水溶液とし、２０μｌを酵素溶液
（ＳＶＰ．Ｄ．Ｅ．，ＡＰ，ＰＩを含む）１０μｌと混
合し、３７℃、３時間でヌクレオチドへ酵素分解した。
酵素分解後の溶液をＨＰＬＣで分析したところ、ｄＣ：
ｄＧ：Ｔ：ｄＡが１：１：１：１で、そしてピューロマ
イシンが生成していた。このことから分取したメインピ
ークは５′−ｄ（ＧＣＡＴ）−ピューロマイシンである
ことが確認できた。またエレクトロスプレーマスにより
分子量が確認できた。
３μｍｏｌ）を用いて通常のホスホロアミダイト法によ
って（ただし、カップリング時間は５分とした）、５′
−ｄ（ＧＣＡＴ）−ピューロマイシンを合成した。合成
後、２８％アンモニア水でサポートからの切り出し、５
５℃、８時間で塩基の保護基のデブロックを行った。ア
ンモニアを減圧留去し、蒸留水で約５００μｌとなるよ
うに希釈した。これをＨＰＬＣで分析し、メインピーク
を分取・精製した。分取後、アセトニトリルを減圧留去
し凍結乾燥によりギ酸アンモニウムをとばした。蒸留水
５００μｌを加えて水溶液とし、２０μｌを酵素溶液
（ＳＶＰ．Ｄ．Ｅ．，ＡＰ，ＰＩを含む）１０μｌと混
合し、３７℃、３時間でヌクレオチドへ酵素分解した。
酵素分解後の溶液をＨＰＬＣで分析したところ、ｄＣ：
ｄＧ：Ｔ：ｄＡが１：１：１：１で、そしてピューロマ
イシンが生成していた。このことから分取したメインピ
ークは５′−ｄ（ＧＣＡＴ）−ピューロマイシンである
ことが確認できた。またエレクトロスプレーマスにより
分子量が確認できた。
【００１９】ＥＳＩ ＭＳ 理論値 ５′−ｄ（ＧＣＡ
Ｔ）−ピューロマイシン ［（Ｍ−２Ｈ）2-］８５２、
［（Ｍ−３Ｈ）3-］５６７ 測定値 ８５２，５６８。
Ｔ）−ピューロマイシン ［（Ｍ−２Ｈ）2-］８５２、
［（Ｍ−３Ｈ）3-］５６７ 測定値 ８５２，５６８。
【００２０】（実施例３）５′−ｄ（ＣＡＧＧＡＴＧＧＣＴＴＧＡＡＧＡＴＧＴ
Ａ）−ピューロマイシンの合成 実施例１により合成したサポート２５ｍｇ（０．５３μ
ｍｏｌ）を用いて通常のホスホロアミダイト法によって
５′−ｄ（ＣＡＧＧＡＴＧＧＣＴＴＧＡＡＧＡＴＧＴ
Ａ）−ピューロマイシンを合成した（ＤＭＴｒ：Ｏ
Ｎ）。合成後、２８％アンモニア水でサポートからの切
り出し、５５℃、８時間で塩基の保護基の脱保護を行っ
た。アンモニアを減圧留去し、蒸留水で約５００μｌと
なるように希釈した。これをＨＰＣＬで分析し、メイン
ピークを分取・精製した。分取後、アセトニトリルを減
圧留去し凍結乾燥した。８０％酢酸水溶液を１００μｌ
加え室温で３０分攪拌しジメトキシトリチル基をはずし
た。ジエチルエーテルで分液し、酢酸水溶液を約半量に
減圧留去した。蒸留水で約５００μｌとなるように希釈
した。これをＨＰＬＣで分析し、メインピークを分取・
精製した。エレクトロスプレーマスにより分子量を確認
し、目的生成物であることが判明した。
Ａ）−ピューロマイシンの合成 実施例１により合成したサポート２５ｍｇ（０．５３μ
ｍｏｌ）を用いて通常のホスホロアミダイト法によって
５′−ｄ（ＣＡＧＧＡＴＧＧＣＴＴＧＡＡＧＡＴＧＴ
Ａ）−ピューロマイシンを合成した（ＤＭＴｒ：Ｏ
Ｎ）。合成後、２８％アンモニア水でサポートからの切
り出し、５５℃、８時間で塩基の保護基の脱保護を行っ
た。アンモニアを減圧留去し、蒸留水で約５００μｌと
なるように希釈した。これをＨＰＣＬで分析し、メイン
ピークを分取・精製した。分取後、アセトニトリルを減
圧留去し凍結乾燥した。８０％酢酸水溶液を１００μｌ
加え室温で３０分攪拌しジメトキシトリチル基をはずし
た。ジエチルエーテルで分液し、酢酸水溶液を約半量に
減圧留去した。蒸留水で約５００μｌとなるように希釈
した。これをＨＰＬＣで分析し、メインピークを分取・
精製した。エレクトロスプレーマスにより分子量を確認
し、目的生成物であることが判明した。
【００２１】ＥＳＩ ＭＳ 理論値 ５′−ｄ（ＣＡＧ
ＧＡＴＧＧＣＴＴＧＡＡＧＡＴＧＴＡ）−ピューロマイ
シン ［（Ｍ−４Ｈ）4-］１６８７、［（Ｍ−５
Ｈ）5-］１３４９、［（Ｍ−６Ｈ）6-］１１２４、
［（Ｍ−７Ｈ）7-］９６３、［（Ｍ−８Ｈ）8-］８４
３、［（Ｍ−９Ｈ）9-］７４９、測定値 １６８８，１
３５１，１１２５，９６４，８４２，７５０。
ＧＡＴＧＧＣＴＴＧＡＡＧＡＴＧＴＡ）−ピューロマイ
シン ［（Ｍ−４Ｈ）4-］１６８７、［（Ｍ−５
Ｈ）5-］１３４９、［（Ｍ−６Ｈ）6-］１１２４、
［（Ｍ−７Ｈ）7-］９６３、［（Ｍ−８Ｈ）8-］８４
３、［（Ｍ−９Ｈ）9-］７４９、測定値 １６８８，１
３５１，１１２５，９６４，８４２，７５０。
【００２２】
【発明の効果】現在、ＤＮＡやＲＮＡの化学合成は非常
に進歩し自動合成機により容易に合成できるようになっ
ている。本発明ではこの技術に組み込めるようピューロ
マイシンを化学修飾し、ピューロマイシンを３′−リン
酸末端にもつ任意の配列を有するＤＮＡ、ＲＮＡの化学
合成を可能にしたものである。
に進歩し自動合成機により容易に合成できるようになっ
ている。本発明ではこの技術に組み込めるようピューロ
マイシンを化学修飾し、ピューロマイシンを３′−リン
酸末端にもつ任意の配列を有するＤＮＡ、ＲＮＡの化学
合成を可能にしたものである。
【００２３】ピューロマイシンを末端にもつ任意の配列
を持つＤＮＡ、ＲＮＡは配列選択性を付与できるため、
蛋白合成を効率よく阻害する可能性を持っている。これ
らの機能分子の合成は配列の異なった多種の分子を合成
する必要があり、自動合成機を用いる化学合成は必須で
ある。
を持つＤＮＡ、ＲＮＡは配列選択性を付与できるため、
蛋白合成を効率よく阻害する可能性を持っている。これ
らの機能分子の合成は配列の異なった多種の分子を合成
する必要があり、自動合成機を用いる化学合成は必須で
ある。
【００２４】また、ｍＲＮＡの３′−末端にピューロマ
イシンをもつ化合物では、伸長ペプチドとｍＲＮＡを共
有結合させることができる可能性があり、この技術が確
立すれば蛋白を用いた分子進化法が利用可能となり、分
子生物学におけるブレークスルーとなる可能性がある。
イシンをもつ化合物では、伸長ペプチドとｍＲＮＡを共
有結合させることができる可能性があり、この技術が確
立すれば蛋白を用いた分子進化法が利用可能となり、分
子生物学におけるブレークスルーとなる可能性がある。
Claims (4)
- 【請求項１】 Ｎ−フルオレニルメトキシカルボニル−
５′−Ｏ−ジメトキシトリチル−ピューロマイシン３′
−Ｏ−スクシネートＣＰＧ−サポート。 - 【請求項２】 （１）ピューロマイシンの第一アミンを
Ｎ−フルオレニルメトキシカルボニル基でブロックする
工程、（２）その５′位の水酸基をジメトキシトリチル
基でブロックする工程、（３）その３′位の水酸基に琥
珀酸を結合する工程、及び（４）その琥珀酸に長鎖アル
キルアミン−ＣＰＧを反応させる工程よりなることを特
徴とするＮ−フルオレニルメトキシカルボニル−５′−
Ｏ−ジメトキシトリチル−ピューロマイシン３′−Ｏ−
スクシネートＣＰＧ−サポートを生成する方法。 - 【請求項３】 ピューロマイシンを３′−リン酸末端に
もつ核酸化合物。 - 【請求項４】 （１）ピューロマイシンの第一アミンを
Ｎ−フルオレニルメトキシカルボニル基でブロックする
工程、（２）その５′位の水酸基をジメトキシトリチル
基でブロックする工程、（３）その３′位の水酸基を琥
珀酸でブロックする工程、及び（４）その琥珀酸に長鎖
アルキルアミン−ＣＰＧを反応させる工程により得られ
たＮ−フルオレニルメトキシカルボニル−５′−Ｏ−ジ
メトキシトリチル−ピューロマイシン３′−Ｏ−スクシ
ネートＣＰＧ−サポートを通常のホスホロアミダイト法
に付し、次いでピューロマイシン誘導体を３′−リン酸
末端にもつ核酸化合物をサポートから切り出し、更にデ
ブロックおよび精製を行うことを特徴とするピューロマ
イシンを３′−リン酸末端に持つ核酸化合物を合成する
方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP23583497A JPH1171392A (ja) | 1997-09-01 | 1997-09-01 | ピューロマイシンを３′−リン酸末端にもつ核酸化合物及びその合成方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP23583497A JPH1171392A (ja) | 1997-09-01 | 1997-09-01 | ピューロマイシンを３′−リン酸末端にもつ核酸化合物及びその合成方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH1171392A true JPH1171392A (ja) | 1999-03-16 |
Family
ID=16991961
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP23583497A Pending JPH1171392A (ja) | 1997-09-01 | 1997-09-01 | ピューロマイシンを３′−リン酸末端にもつ核酸化合物及びその合成方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH1171392A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2003062417A1 (fr) * | 2002-01-22 | 2003-07-31 | Mitsubishi Chemical Corporation | Produit de ligation arn-adn, et utilisation correspondante |
-
1997
- 1997-09-01 JP JP23583497A patent/JPH1171392A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2003062417A1 (fr) * | 2002-01-22 | 2003-07-31 | Mitsubishi Chemical Corporation | Produit de ligation arn-adn, et utilisation correspondante |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20000307 |