Multifunktionales Reagenz zur Synthese von thiolmodifizierten Oligomeren
Technisches Gebiet
Die Erfindung betrifft ein multifunktionales Reagenz zur Synthese von thiolmodifizierten Oligomeren.
Stand der Technik
Nukleinsäuren können chemisch oder enzymatisch synthetisiert werden. Je nach Art der eingesetzten Nukleotidbausteine und der Reaktionsschritte zur Anknüpfung an das in der Sequenz benachbarte Nukleotid unterscheidet man verschiedene Verfahren: Phosphodiester-, Phosphotriester- und Phosphoramidit-Verfahren (Gait, M.J. et al., Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press Oxford, 1984; Protocols for Oligonucleotides and Analogs, Agrawal, S., Humana Press, New Jersey, 1993). Beim Phosphoramidit-Verfahren werden keine Phosphorsäurederivate, sondern Derivate der phosphorigen Säure, sogenannte Phosphoramidite eingesetzt.
Das Phosphoramidit-Verfahren kann als Festphasenverfahren durchgeführt werden. Dabei ist die wachsende Nukleotidsequenz an einem polymeren Träger gebunden. Die Abtrennung der überschüssigen Synthesereagenzien und -bausteine sowie die Reinigung der Oligonukleotidsequenz wird dadurch stark vereinfacht. Kommerziell erhältliche Nukleinsäure-Syntheseautomaten arbeiten nach diesem Prinzip.
Nukleinsäuren mit bekannter Nukleotidsequenz finden insbesondere Anwendung zum spezifischen Nachweis von DNA in biologischen Proben. In solchen Nachweisverfahren wird die Eigenschaft ausgenutzt, dass einzelsträngige Nukleotidsequenzen mit ihrem komplementären Gegenstrang einen Doppelstrang ausbilden können. Der Vorgang der Doppelstrangbildung wird Hybridisierung genannt (Nucleic Acids in Chemistry and Biology, Blackbum, M.G. und Gait, J.M., Oxford University Press).
Die Bildung eines Doppelstranges kann nachgewiesen werden, wenn zur Hybridisierung mit der einzelsträngigen Nukleinsäure eine modifizierte einzelsträngige komplementäre Nukleinsäure eingesetzt wird oder die einzelsträngige Nukleinsäure selbst eine Modifikation trägt. Modifizierungen können u. a. Fluorophore, Radioisotope oder Elektrolabel sein.
Die Verwendung von markierten Targets zum Nachweis von Hybridisierungsereignissen beinhaltet jedoch einige Nachteile. Zum einen muss die Markierung vor der eigentlichen Messung erfolgen, was einen zusätzlichen Syntheseschritt und damit zusätzlichen Arbeitsaufwand bedeutet. Zudem ist es schwierig, eine homogene Markierung des Probenmaterials zu gewährleisten. Außerdem sind stringente Waschbedingungen notwendig, um im Anschluss an eine Hybridisierung nicht oder unspezifisch gebundenes Material zu entfernen.
Oligonukleotide und im Allgemeinen Polymere können auf Oberflächen durch bekannte Methoden wie z.B. durch nicht kovalente Adsorption oder durch kovalente Kupplungen auf einer Oberfläche immobilisiert werden (WO 00/42217; US 6,312,906). Besonders vorteilhafte Verfahren um Oligonukleotide auf einer SiO2-Oberfläche (Glas) zu immobilisieren, basieren auf der gut etablierten Silicon-Chemie (Parkam et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 1 :1-6, 1978; Lund et al., Nucl. Acids Res. 16 :10861-10880, 1988). So können z.B. epoxid-modifizierte SiO2-Oberflächen mit aminofunktionalisierten Oligonukleotiden belegt werden.
Die Chemisorption an Gold wurde erst nach 1983 näher untersucht. Nuzzo und Allara (J. Am. Chem. Soc. 105, 4481 , 1983) entdeckten, dass Thiole und Disulfide auf Gold in geordneten Monolayern adsorbiert werden. Die entstehende kovalente Bindung zwischen Gold und Schwefel hat eine Bindungsenergie von 30-40 kcal/mol. Bain et al. (J. Am. Chem. Soc. 111 , 321 , 1989; J. Am. Chem. Soc. 111 , 7155, 1989) beschrieben die Bindungsverhältnisse zwischen Organoschwefelverbindungen und Gold. Die starke, koordinative Gold-Schwefel-Bindung treibt die spontane Anlagerung zu Monolayern voran. Bain et al. argumentieren, dass die Bildung dieser Monolayer durch viele Faktoren (wie z.B. Temperatur, Lösungsmittel, Konzentration und Kettenlänge des Adsorbats, Salzkonzentration) beeinflusst wird. Es gibt zwei Phasen der Adsorption. Die Ausbildung einer ersten Monolayerschicht, die etwa 80-90% der Oberfläche belegt, ist in einigen Minuten abgeschlossen. Die restliche Fläche wird in einem Prozess, der sich über mehrere Stunden hinzieht, belegt. Dabei spielen wahrscheinlich Verdrängungsprozesse
auf der Oberfläche (z.B. Lösungsmittel) und laterale Diffusionen eine Rolle. Diese Experimente stellen die Grundlagen für die Anbindung von thiolmodifizierten Oligonukleotiden dar.
An eine Gold-Oberfläche über nur einen Thiol-Anker angebundene Oligonukleotide, vereinfacht ausgedrückt durch den Begriff "Au-S-Oligonukleotid", sind bei mechanischer Beanspruchung (wie z.B. bei Waschschritten) instabil. Die Stabilität des Oligonukleotids auf der Oberfäche wird durch mehrfach ausgebildete Au-S-Bindungen erhöht. Eine solche sehr stabile Anbindung der Oligonukleotide bringt erhebliche Vorteile für die DNA-Chip- Technologie mit sich.
Eine Variante zur Anbindung von DNA an Gold- oder Platin-Oberflächen stellt das von Whitesides und Mitarbeitern entwickelte Verfahren (Lee et al., Pure & Appl. Chem. 63, 821 , 1991) zur Generierung von Thiol-Monoschichten auf Gold-Oberflächen dar. Dabei wird die freie Thiol-Gruppe auf einer mit einem Dithiol (z.B. 1 ,10-Decandithiol) vorbelegten Metalloberfläche mit einem bromacetylmodifizierten Oligonukleotid umgesetzt.
Zur Darstellung von thiolmodifizierten Oligonukleotiden können schwefelhaltige Phosphoramidite oder polymere Trägermaterialien eingesetzt werden. Beispiele von Verbindungen, die zur Ankopplung einer Disulfid-Einheit dienen, sind das Phosphoramidit DMT-0-(CH2)6-S-S-(CH2)6-O-P(OCE)(NiPr2) oder Verbindungen mit der allgemeinen Strukturformel R1-S-S-R2-O-P(OCE)(NiPr2) (siehe EP 523 978). Eine andere Möglichkeit einen Thiol-Anker an ein Oligonukleotid anzukoppeln, ist die Verwendung des Phosphoramidits MMT-S-(CH2)6-O-P(OCE)(NiPr2). Der Nachteil bei Verwendung dieses Phosphoramidits ist die aufwändige Abspaltung der MMT Gruppe mit AgNO3.
Bekannt sind weiterhin auch zwei Thiol-Trägermaterialen mit C-3 und C-6 Spacer für die Oligonukleotid-Synthese (Glen Research).
Trotz des beschriebenen Standes der Technik besteht weiterhin ein Bedarf an multifunktionellen thiolhaltigen Monomeren, die einen polyfunktionalen Thiol-Anker ausbilden, mit dessen Hilfe eine stabile Anbindung von Molekülen oder Polymeren auf Oberflächen oder polymeren Trägern möglich ist.
Darstellung der Erfindung
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher thiolhaltige Monomere zur Verfügung zu stellen, die die Darstellung polyfunktionaler Thiol-Verbindungen erlauben.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß durch die Verbindungen gemäß unabhängigem Anspruch 1 gelöst. Weitere vorteilhafte Details, Aspekte und Ausgestaltungen der vorliegenden Erfindung ergeben sich aus den abhängigen Ansprüchen, der Beschreibung, den Figuren und den Beispielen.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung werden die folgenden Abkürzungen und Begriffe benutzt:
A: Adenin
ACN: Acetonitril
Base: A, G, T, C oder U
C: Cytosin
DC: Dünnschichtchromatographie
DMT: 4,4'-Dimethoxytrityl
DNA: Desoxyribonukleinsäure
E~ : Wechselspannung
El: Electrospray Ionisation
EtOAc: Ethylacetat
Et3N: Triethylamin f : Wechselspannungsfrequenz
Fmoc: 9-Fluorenylmethoxycarbonyl
G: Guanin
HPLC : Hochdruckflüssigkeitschromatographie iPr: Isopropyl
NMR : Kernmagnetische Resonanz
M: Masse
MsCI: Mesylchlorid oder Methansulfonylchlorid
MeOH: Methanol
MS: Massenspektrometrie mV: Millivolt
Cq: quartäre Kohlenstoffe
aromatische Kohlenstoffe
" larom- aromatische Wasserstoffe
OD260: Optische Dichte (bei 260 nm) OCE: Cyanoethoxy Oligomer: Äquivalent zu Nukleinsäure-Oligomer. Oligonukleotid: Ein DNA-, PNA- oder RNA-Fragment nicht näher spezifizierter
Basenlänge.
PNA: Peptidnukleinsäure (-NH-(CH2)2-N(COCH2-Base)-CH2CO; synthetische DNA oder RNA, bei der die Zucker-Phosphat-Einheit durch eine Aminosäure ersetzt ist. PNA kann mit DNA oder RNA hybridisiert werden).
RNA: Ribonukleinsäure .: Retention bei der DC relativ zur Laufmittelfront rms: root mean Square
RP: Reverse-Phase s: Singulett
SPR: Oberflächenplasmonen-Resonanz-Spektroskopie
T: Thymin
U: Uracil v: Vorschubgeschwindigkeit
Sämtliche Strukturformeln sind so zu verstehen, dass auch die entsprechenden chiralen Enantiomere umfasst sind.
Die vorliegende Erfindung umfasst Verbindungen der Formel (I)
worin Z ein Kohlenwasserstoff mit 2 bis 28 C-Atomen ist, wobei Z auch die Elemente N, O, P, S, Si und Halogen als Heteroatome umfassen kann, R1 und R2 sind gleiche oder verschiedene H oder Schwefel-Schutzgruppen, wobei die beiden S-Atome auch eine Disulfid-Brücke ausbilden können und in diesem Fall R1, R2 nicht vorhanden sind, Schutzgruppe-Y1 ist Schutzgruppe-NH, Schutzgruppe-NR4, Schutzgruppe-O, CONH- Schutzgruppe, Schutzgruppe-OOC, Schutzgruppe-S-S, -CH(Schutzgruppe-O)2, oder
-CR5(SchutzgruppeO)2 oder Schutzgruppe-S, Y2 ist -OH, -NH2, -NHR3 , -NR3R4, -COOH, -COCI, -COOCO-R6, -CONH2, -CONHR3, -COOR3, -SO3H, -SO3CI, -SH, -S-SR3, -CHO, -COR3, -C2H3O, Halogen, -N3, -NH-NH2, -NCO, -NCS, wobei R3 Alkyl, Heteroalkyl, Aryl, Cycloalkyl oder eine Schutzgruppe ist, wobei R3 in den Gruppen Y1 und Y2 gleich oder verschieden vorliegen kann, R4 eine Schutzgruppe ist, wobei R4 in den Gruppen Y1 und Y2 gleich oder verschieden vorliegen kann, und wobei R4 und R3 gleich oder verschieden sein können, R5 Alkyl, Aryl, Cycloalkyl ist, wobei R5 in den Gruppen Y1 und Y2 gleich oder verschieden vorliegen kann, und R6 Alkyl, Heteroalkyl, Aryl oder Cycloalkyl ist, wobei R6 in den Gruppen Y1 und Y2 gleich oder verschieden vorliegen kann, wobei Y2 auch eine Gruppe der Formel (II) oder (III) sein kann,
X3
-O-
x4 (in)
wobei X1 ein Halogen oder ein substituiertes Amin ist, X2 ein Alkyl-, Alkoxy-, Aryloxy-Rest oder ein Cyanoderivat eines Alkyl-, Alkoxy-, Aryloxy-Restes ist, X3 ein Halogen, eine Aminofunktion oder Sauerstoff ist und X4 ein Alkyl-, Alkoxy-, Aryloxy-Rest ist oder X4 gleich H ist für den Fall, dass X3 = Sauerstoff ist.
Bei den erfindungsgemäßen Verbindungen handelt es sich also um Substanzen mit mindestens vier funktioneilen Gruppen, von denen zwei Thiole (R1, R2 = H), Thioether oder Disulfide sind, wobei die beiden Schwefelatome auch mit sich selbst eine Disulfidbrücke ausbilden können und dabei die Reste R1, R2 entfallen. Y1 ist eine funktionelle Gruppe mit einer Schutzgruppe. Y2 ist eine funktionelle Gruppe, die u.a. zur Aktivierung der erfindungsgemäßen Verbindungen für chemische Reaktionen dient. Bei diesen chemischen Reaktionen handelt es sich z.B. um eine Polymerisierung oder um die Anbindung an ein polymeres Trägermaterial. Dabei kann Y2 bereits eine aktivierte funktionelle Gruppe oder eine zu aktivierende funktionelle Gruppe darstellen. Der
Grundkörper Z ist eine Kohlenwasserstoffstruktur bestehend aus 2 bis 28 C Atomen, wobei Z auch die Elemente N, O, P, S, Si und Halogen als Heteroatome umfassen kann. Die Verbindungen der Formel (I) enthalten mindestens eine Schutzgruppe.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können für den gezielten und definierten Aufbau von Oligomeren bzw. Polymeren mit einer exakt definierten Anzahl von Schwefelatomen verwendet werden. Dazu ist die selektive Abspaltung einer Schutzgruppe eine notwendige Bedingung. Die chemische Umsetzung der Monomere darf die Integrität der Schutzgruppe nicht beeinflussen. Die vorhandenen Reste R1, R2 am Schwefel müssen während der Polymerisation, also während der Aktivierung der funktioneilen Gruppe und der Abspaltung der Schutzgruppe, chemisch stabil bleiben, d.h. die Schutzgruppe an Y1 muss orthogonal bzw. selektiv zu den Resten R1, R2 am Schwefel abspaltbar sein.
Sind die Reste R1 und R2 nicht vorhanden und bilden die beiden Schwefelatome aus diesem Grund eine Disulfidbrücke aus, so stellt die Tatsache einen besonderen Vorteil dar, dass die Disulfideinheiten nicht im Rückgrat der Polymere angeordnet sind, wodurch ein Spalten der Disulfidbrücke/n keinen Abbau der Polymere verursacht.
Schutzgruppen können u.a. Triphenylmethyl-, t-Butoxycarbonyl-, Benzyl-, 2,4- Dinitrophenyl-, 9-Fluorenylmethoxycarbonyl-, Allyloxycarbonyl-, Benzyloxymethyl-, Acetyl-, 4-Azidobenzyloxycarbonyl-, Acetamidomethyl-, 1-Adamantyl-, 1- Adamantyloxycarbonyl-, Anisyl-, Benzamidomethyl-, Biphenyldimethylsilyl-, 2,4- Dimethylthiophenoxycarbonyl-, 1 -Methyl-1 -(4-biphenyl)ethoxycarbonyl-, Benzothiazole-2- sulfonyl-, t-Butoxymethyl-, Benzoyl-, Benzyloxycarbonyl-, Cyclohexan-1 ,2-diacetal-, Cyclohexyl-, 2-(4,4-Dimethyl-2,6-Dioxocyclohexyliden)ethyl-, 1-Methyl-1-(3,5-
Dimethoxyphenyl)ethoxycarbonyl-, Diethylisopropylsilyl-, 1 ,3-Dithianyl-2-methyl-, 2,4- Dimethoxybenzyl-, Dithianylmethoxycarbonyl-, Dimethoxytrityl-, p,p'-Dinitrobenzhydryl-, 2,4-Dinitrophenyl-, 2,4-Dimethylpent-3-yloxycarbonyl-, 2-(Diphenylphosphino)ethyl-, 9- Fluorenylmethyl-, Levulinoyl-, p-Methoxybenzensulfonyl-, 2,6-Dimethoxy-4- methoxybenzensulfonyl-, Monomethoxytrityl-, Methoxyphenylsulfonyl-, Mesitylensulfonyl-, o-Nitrobenzyl-, 2-[2-(Benzyloxy)ethyl]benzoyl-, 3-(3-Pyridyl)allyloxycarbonyl-, 2,2,5,7,8- Pentamethylchroman-6-sulfonyl-, Pivaloyloxy ethyl-, t-Butyldimethylsilyl-, t-Butyldiphenylsilyl-, 2,2,2-Trichloro-1 ,1-Dimethylethyl-, Trifluoroacetyl-, Triisobutylsilyl-, 2,4,6-Thmethylbenzyl-, Trimethoxybenzyl-, p-Toluensulfonyl- oder Benzyloxycarbonyl- sein. Weitere Schutzgruppen kann man in Greene, T. W., Protective Groups in Organic Synthesis, Wiley-Interscience, 1999 finden.
R1 und R2 sind gleiche oder verschiedene Schwefel-Schutzgruppen, die u.a. Benzylderivate, Triphenylmethylderivate, substituierte Methylderivate, Benzoyl-, Trifluoracetyl- oder t-Butoxycarbonylgruppen sein können. Weiterhin können die Thiole als Disulfide wie z.B. S-Ethyldisulfide, S-Phenyldisulfide oder als Thiocarbamate geschützt sein. Weitere Schwefel-Schutzgruppen kann man in Greene, T. W., Protective Groups in Organic Synthesis, Wiley-Interscience, 1999 finden.
Sämtliche erfindungsgemäßen Verbindungen können als monomere Einheit in Oligomere eingebaut werden.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können unabhängig von der Position an Nukleotid- Oligomeren, Peptid-Oligomeren oder anderen Molekülen ein- oder mehrfach angebracht werden. Dadurch wird z.B. die Anbindung von beliebigen Molekülen und auch Polymeren über einen Polythiol-Anker an Oberflächen oder an polymere Träger ermöglicht. Durch Aktivierung des polyfunktionalen Thiol-Ankers entsteht eine mehrfache Anbindung des Moleküls an Oberflächen (z.B. an eine Gold-Oberfläche) oder an polymere Träger. Dazu können speziell voraktivierte Oberflächen (z.B. mit Aldehyd oder Maleinimid aktivierte Oberflächen) oder spezielle polymere Verbindungen wie z.B. Peptide, Proteine, PNA, RNA, LNA (Locked Nucleic Acids) verwendet werden, die gegenüber Thiolen reaktive Gruppen enthalten. Die an Molekülen, insbesondere an Polymeren angebrachten erfindungsgemäßen Verbindungen können auch zum Anbinden von Markierungen (Labein) oder anderen Funktionalitäten an die Moleküle, insbesondere an die Polymere verwendet werden.
Ein Vorteil der erfindungsgemäßen Verbindungen ist die Möglichkeit, mehrfache SH- Gruppen in ein Oligomer einzuführen und dadurch höhere Stabilität bei Immobilisierung des Oligomers auf einer Oberfläche zu bekommen. Einen weiteren Vorteil stellt die Möglichkeit dar, durch mehrfache SH-Gruppen an einem Polymer verschiedene Moleküle wie z.B. Polymere, Peptide, Proteine oder Oligonukleotide anzukoppeln.
Y2 kann auch direkt oder über einen Linker an einem festen Trägermaterial angekoppelt sein, wie z.B. CPG (Controlled Pore Glass), Microbeads, Polymere (z.B. Polystyrene) oder Membranen. Um Nukleinsäuren synthetisch herzustellen werden die erfindungsgemäßen Verbindungen normalerweise mittels eines Aminoalkyrestes (LCAA = Long Chain Alkyl Amine) an einen festen Träger angebunden.
Die im Rahmen der vorliegenden Erfindung bevorzugten reaktiven Phosphorintermediate können am 3'-Ende, in der Mitte und am 5'-Ende an/in ein Oligonukleotid ein- oder mehrfach eingebaut werden. Durch Aktivierung kann ein mehrfach polyfunktioneller Thiolanker freigesetzt werden, der für eine mehrfache Anbindung z.B. eines Oligonukleotids an Oberflächen, an voraktivierte Oberflächen (z.B. Aldehyd, Maleinimid) oder an anderen polymeren Verbindungen (z.B. Proteine, PNA, RNA, LNA), die gegenüber Thiolen reaktive Gruppen enthalten, eingesetzt werden kann. Ebenso kann dieser polyfunktionelle Thiolanker zur gezielten mehrfachen Anbindung von Markierungen und Liganden an Molekülen oder Polymeren verwendet werden. Markierungen und Liganden sind z.B. enzymatische, chromogene, fluorogene, radioaktive, chemiluminiscente Label, in Nukleinsäureoligomere interkalierende Agentien, Metalle, Metallionen, Drugs, Hormone, Proteine, Peptide, nukleolytische und proteolytische Agentien, insbesondere bindende Agentien (wie z.B. Biotin, Antigene, Haptene, Antikörper, Rezeptoren) und andere Verbindungen von biologischem Interesse, die z.B. den Transport durch biologische Membranen beeinflussen oder die Löslichkeit von Oligonukleotiden verändern. Es gibt bekannte Verfahren, die es ermöglichen diese Liganden und Markierungen an Thiol-Gruppen anzukoppeln wie z.B. über Maleinimide, Aldehyde und Halogenacetylverbindungen (Means, G.M. und R.E. Feeney, Chemical Modification of Proteins, Holden-Day Inc., 1971 ; Feeney, R.E., Int. J. Peptide Protein Res., 29: 145-161 , 1987; Eritja, R. et al., Tetrahedron, 47, 4113-4120, 1991).
Die Bindung zwischen der Oberfläche und dem Oligonukleotid mittels eines Thiolankers, vereinfacht als Oberfläche-S-Oligonukleotid ausgedrückt, ist bei mechanischer Beanspruchung, wie zum Beispiel bei Waschschritten, instabil. Einer der Vorteile der vorliegenden Erfindung ist die Möglichkeit, an einem Oligonukleotid einen Polyanker anzukoppeln, um damit die Anbindung des Oligonukleotids an Gold durch mehrere Au-S Bindungen zu optimieren. Dabei sind die Bedingungen zur Anbindung auf der Oberfläche wie z.B. die verwendete Salzkonzentration, das an der Oberfläche angelegte Potential oder die Art der vormodifizierten Oberfläche entscheidend. Weiterhin können Thiole, die bereits auf die Oberfläche aufgebracht wurden, mit diesem Polythiolanker verdrängt werden.
Weiterhin wird die Abspaltung der Schwefel-Schutzgruppe mit AgN03 durch die Anwendung von DMT als Schutzgruppe vermieden. Die DMT Schutzgruppe kann durch eine milde Säurebehandlung, die mit der Oligonukleotidchemie kompatibel ist,
abgespalten werden. Die erfindungsgemäßen Verbindungen können mit den üblichen Standardbedingungen der Oligonukleotidchemie eingesetzt werden.
Die Phosphor-enthaltenden Verbindungen beinhalten Intermediate, die in der H-Phosphonat-, Phosphotriester-, Chlorophosphit- und Phosphoramidit-Methode zur Synthese von Oligonukleotiden eingesetzt werden können. Weiterhin können diese Intermediate, die Phosphodiester-Analoga wie Methylphosphonate, Methylphosphate, Phosphorthioate und Phosphoramidite einschließen (EP 0 523 978), für Modifikationen am 5'-, 3'-Ende und/oder in der Sequenz verwendet werden.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung entspricht Y2 der Formel II oder III, wobei X1 ein Halogen und X2 Methyl oder R7O- ist, wobei R7 ein Alkyl-, Cycloalkyl-, Aryl-Rest oder ein Cyanoderivat eines Alkyl-, Aryl-Rest ist, oder X2 gleich R7O- und X1 gleich -NR8R9 ist, wobei R8 und R9 unabhängig voneinander Alkyl-, Heteroalkyl, Cycloalkyl-, Aryl-Reste sind oder R8 und R9 miteinander verbunden sind, sodass sie mit dem N-Atom eine zyklische Struktur mit 4 bis 7 C-Atomen bilden, wobei ein C-Atom der zyklischen Struktur durch O oder S ersetzt sein kann, oder X3 = O" und X4 = H oder R 0O- ist, wobei R10 eine Schutzgruppe darstellt.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können auch an einem Trägermaterial (Solid Support) angebunden werden, wenn Z eine freie oder geschützte OH-Funktion aufweist. Es kann eine große Auswahl von Trägermaterialen benutzt werden wie z.B. Silika, Porasil C, Polystyrene, Controlled Pore Glass (CPG), Kieselgur, Poly(dimethylacrylamid), Poly(acrylmorpholid), Cellulose, Fractosil 500. Abhängig von der Art des Trägermaterials werden verschiedene Funktionalitäten als Anker verwendet. Substituierte Alkyl- oder Aryl- Silylverbindungen werden für Silicon-Trägermaterialien, wie Silika und Glas, verwendet, um einen Siloxan- oder Siloximin-Anker auszubilden. Ether, Ester, Amine, Amide, Sulfide, Sulfone und Phosphate können bei organischen Polymeren benutzt werden.
Für den Fall, dass Y2 eine Gruppe der Formel (III) ist, wobei X3 gleich O" und X4 gleich H sind, stellen die obigen Verbindungen H-Phosphonate dar und werden in der H- Phosphonat Methode für die Oligonukleotid Synthese verwendet (Sinha und Cook, Nucleic Acids Research (1988) 16:2659-2669). H-Phosphonate können zu Phosphitdiester, Phosphorthioaten, oder Phosphoramidaten umgesetzt werden, sobald sie am 5'-Ende des Oligonukleotids eingebaut sind (Miller et al., Nucleic Acids Res. (1983) 11 :5189-5204, Eckstein, Ann. Rev. Biochem. (1985) 54:367-402).
Dementsprechend können die obigen Verbindungen, worin Y2 eine Gruppe der Formel (III) ist mit X3 gleich O" und X4 gleich R10O-, in der Phosphotriester Methode für die Oligonukleotid Synthese verwendet werden (Garegg, et al., Chemica Scripta (1985) 26:5).
Die Verbindungen, worin Y2 eine Gruppe der Formel (II) darstellt, wobei X1 gleich Chlor und X2 gleich R7O- sind, ist ein Chlorophosphit und wird in der Chlorophosphit Technik für die Oligonukleotid Synthese verwendet (Wada et al., J. Org. Chem. (1991) 56:1243- 1250).
Die Phosphoramidite mit Y2 gleich der obigen Formel (II) werden im Rahmen der vorliegenden Erfindung besonders bevorzugt.
R1 und R2 sind gleiche oder verschiedene H oder Schwefel-Schutzgruppen. Bevorzugte Schwefel-Schutzgruppen sind beispielsweise Trityl, 4,4'-Dimethoxytrityl, 4- Monomethoxytrityl, 9-Fluorenylmethyl (Ponsati, B., et al., Tetrahedron, 46, 8255-8266, 1990), 9-Fluorenylmethoxycarbonyl, 2,4-Dinitrophenylethyl, 2,4,6-Trimethoxybenzyl (Munson, M.C. et al., J. Org. Chem., 57, 3013-3018, 1992), 4-Methoxybenzyl und Allyloxycarbonylaminomethyl (Kimbonguila, A.M., et al., Tetrahedron 55, 6931-6944, 1999). Besonders bevorzugt ist 4,4'-Dimethoxytrityl. Weitere Schutzgruppen kann man in Lloyd-Williams, P. et al., Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides and Proteins, New York, CRC Press, 1997 finden. Die Schwefel-Schutzgruppen Trityl und Acetamidomethyl können mittels lod Oxidation abgespalten werden (Kamber et al., Helvetica Chimica Acta, Vol. 63, No. 96, 899-915, 1980). Die Schwefel-Schutzgruppen 4,4'-Dimethoxytrityl und 4-Monomethoxytrityl können mittels AgNO3 in MeOH abgespalten werden (Huang, Z. und Benner, S.A., Synlett, 83-84, 1993). Die 4,4'-Dimethoxytrityl Schwefel-Schutzgruppe kann auch unter milden Säurebedingungen (z.B. 2% Dichloressigsäure in Dichlormethan), die kompatibel mit der Oligonukleotidsynthese sind, abgespalten werden. Die große Auswahl an Schwefel-Schutzgruppen bietet die Möglichkeit orthogonale Schutzgruppen auszuwählen, deren Abspaltungsbedingungen kompatibel mit der Oligonukleotidsynthese sind, um verschiedene Labels einzuführen.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung stellt der Rest R7 eine basenlabile Schutzgruppe dar.
Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei R7 um eine basenlabile Schutzgruppe ausgewählt aus ß-Cyanoethyl, ß-Nitroethyl, 2,2,2-Trichlorethyl, Methyl, 1 ,1-Dimethyl-2,2,2-thrichlorethyl, 2,2,2-Tribromethyl, Benzyl, o-Chlorphenyl, p- Nitrophenylethyl, 2-Methylsulfonylethyl und 1 ,1-Dimethyl-2-cyanoethyl.
Gemäß ganz besonders bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung stellen R8 und R9 in dem Fall, dass R7 eine basenlabile Schutzgruppe ist, individuelle Alkyl-Reste bestehend aus 1-16 C-Atomen, Cycloalkyl-Reste bestehend aus 3-8 C- Atomen, Aryl-Reste bestehend aus 6-20 C-Atomen dar oder R8 und R9 sind miteinander verbunden, sodass sie mit dem N-Atom eine zyklische Struktur mit 4 bis 7 C-Atomen bilden, wobei ein C-Atom der zyklischen Struktur durch O oder S ersetzt sein kann. Dabei ist es besonders bevorzugt, wenn R8 und R9 unabhängig voneinander Alkylreste bestehend aus 1-6 C Atomen sind. Besonders bevorzugt ist es auch, wenn R8 und R9 Isopropyl, Butyl, Hexyl, Nonyl, Dodecyl, Hexadecyl, Cyclopropyl, Cyclobutyl, Cyclohexyl, Cyclooctyl, Phenyl, Tolyl, Benzyl, Xylyl, Naphthyl, Morpholino, Piperidinyl oder Thiomorpholino sind.
Weitere Schutzgruppen R8 und R9 sind in Green, T.W., Protective Groups in Organic Chemistry, New York: Wiley & Sons, 1981 ausgeführt.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist Z eine Kohlenwasserstoffstruktur bestehend aus 2 bis 28 C Atomen, wobei Z auch die Elemente N, O, P und S als Heteroatome umfassen kann.
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist Z eine Kohlenwasserstoffstruktur bestehend aus 2 bis 28 C Atomen, wobei Z auch die Elemente N, O und P als Heteroatome umfassen kann.
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist Z eine Kohlenwasserstoffstruktur bestehend aus 2 bis 28 C Atomen, wobei Z auch die Elemente N und O als Heteroatome umfassen kann.
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist Z eine Kohlenwasserstoffstruktur bestehend aus 2 bis 28 C Atomen, wobei Z auch die Elemente N und O als Heteroatome umfassen kann, wobei die Elemente N und O ausschließlich als Bestandteil einer Amidbindung vorhanden sind.
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist Z eine Kohlenwasserstoffstruktur bestehend aus 2 bis 28 C Atomen, wobei Z auch die Elemente P und O als Heteroatome umfassen kann.
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist Z eine Kohlenwasserstoffstruktur bestehend aus 2 bis 28 C Atomen, wobei Z auch die Elemente P und O als Heteroatome umfassen kann, wobei die Elemente P und O ausschließlich als Bestandteil einer Phosphordiesterbindung vorhanden sind.
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist Z eine Kohlenwasserstoffstruktur bestehend aus 2 bis 8 C Atomen.
Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform vorliegenden Erfindung ist Z eine Kohlenwasserstoffstruktur bestehend aus 4 C-Atomen und 6 H-Atomen.
Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindungen werden Verbindungen der Formel
bereitgestellt, wobei A1, A2, A3, A4, A5, A6 gleiche oder verschiedene Alkylreste mit 1-22 C- Atomen, Heteroalkylreste mit 1-22 C-Atomen, Cycloalkylreste mit 1-22 C-Atomen, H, Schutzgruppe-Y1 oder die Gruppe Y2 sind, wobei Schutzgruppe-Y1 und die Gruppe Y2 auch von A1, A2, A3, A4, A5, A6 umfasst sein können, und wobei sowohl Schutzgruppe-Y1 als auch die Gruppe Y2 wenigstens einmal anwesend sind.
Die Verbindungen gemäß Formel (IV) besitzen also neben den beiden Schwefel-Atomen mindestens zwei weitere funktionelle Gruppen. Dabei können die Substituenten A1, A2, A3, A4, A5 und A6 eine funktionelle Gruppe sein. A1, A2, A3, A4, A5 und A6 können auch
Alkylreste mit 1-22 C Atomen, Heteroalkylreste mit 1-22 C Atomen oder Cycloalkylreste mit 1-22 C Atomen oder H sein, wobei in dem Fall, dass von den sechs Substituenten A1, A2, A3, A4, A5 und A6 nicht mindestens zwei Substituenten funktionelle Gruppen sind, mindestens die fehlende/n funktionelle/n Gruppe/n an den/die oben definierten Heteroalkylrest/e angebunden sein muss/müssen. Mindestens eine dieser funktioneilen Gruppen ist mit einer Schutzgruppe geschützt.
Bevorzugt werden Verbindungen, wobei A2 und A4 gleich Schutzgruppe-Y1 oder Y2 sind, wobei Schutzgruppe-Y1 und die Gruppe Y2 auch von A2, A4 umfasst sein können, und wobei sowohl Schutzgruppe-Y1 als auch die Gruppe Y2 wenigstens einmal anwesend sind. In diesem Fall liegen also Verbindungen der Struktur (IV) vor, wobei A1, A3, A5 und A6 Alkylreste mit 1-22 C-Atomen, Heteroalkylreste mit 1-22 C-Atomen, Cycloalkylreste mit 1-22 C-Atomen oder H sind. A2 und A4 sind funktionelle Gruppen oder umfassen eine funktionelle Gruppe. Der Substituent, der keine funktionelle Gruppe ist, ist ein Heteroalkylrest mit 1-22 C-Atomen oder ein Cycloheteroalkylrest mit 1-22 C-Atomen mit mindestens einer funktionellen Gruppe. Mindestens eine dieser funktioneilen Gruppen ist mit einer Schutzgruppe geschützt. Sollte A2 oder A4 zwei funktionelle Gruppen umfassen, so kann der Substituent, der keine funktionelle Gruppe umfasst, ein Alkylrest mit 1-22 C- Atomen, Heteroalkylrest mit 1-22 C-Atomen, Cycloalkylrest mit 1-22 C-Atomen oder H sein.
Besonders bevorzugt werden Verbindungen, worin A2, A4 gleich Schutzgruppe-Y1, Y2 sind, wobei A2 nicht gleich A4 ist. In diesem Fall liegen also Verbindungen der Struktur (IV) vor, wobei A1, A3, A5 und A6 Alkylreste mit 1-22 C-Atomen, Heteroalkylreste mit 1-22 C- Atomen, Cycloalkylreste mit 1-22 C-Atomen oder H sind. A2 und A4 sind funktionelle Gruppen. Mindestens eine dieser funktioneilen Gruppen ist mit einer Schutzgruppe geschützt.
Besonders bevorzugt werden Verbindungen, worin A1, A3, A5 und A6 gleich H sind. In diesem Fall liegen also Verbindungen der Struktur (IV) vor, wobei A1, A3, A5 und A6 H sind und A2 und A4 eine funktionelle Gruppe sind. Mindestens eine dieser funktionellen Gruppen ist mit einer Schutzgruppe geschützt.
Ebenfalls bevorzugt werden Verbindungen der Struktur (IV), wobei Schutzgruppe-Y1 gleich Schutzgruppe-OOC, Schutzgruppe-O, Schutzgruppe-S, Schutzgruppe-NH oder
Schutzgruppe-NRy ist und Y2 gleich COOH, COORx, OH, ORx, SH, SRX, NH2, NHRX,
NRxRy ist, wobei R eine Schutzgruppe ist und Ry ein Alkylrest mit 1-15 C-Atomen, ein Arylrest mit 1-14 C-Atomen, ein Cycloalkylrest mit 1-15 C-Atomen, ein Heteroalkylrest mit 1-15 C-Atomen, eine Schutzgruppe oder eine Gruppe der Formel (II) oder (III) ist.
Ganz besonders bevorzugt werden Verbindungen der Struktur (IV), wobei A2 gleich Schutzgruppe-O, Schutzgruppe-OOC oder Schutzgruppe-NH ist, wobei A4 gleich COOH, eine Gruppe der Formel (II) oder (III) oder Schutzgruppe-NH ist, und R1 = R2 = DMT ist oder die beiden S-Atome eine Disulfid-Brücke ausbilden und in diesem Fall R1, R2 nicht vorhanden sind.
Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindungen werden Verbindungen der Formel
bereitgestellt, wobei D1, D2, D3, D4, D5, D6 gleiche oder verschiedene Alkylreste mit 1-22 C-Atomen, Heteroalkylreste mit 1-22 C-Atomen, Cycloalkylreste mit 1-22 C-Atomen, H, Schutzgruppe-Y1 oder die Gruppe Y2 sind, wobei Schutzgruppe-Y1 und die Gruppe Y2 auch von D1, D2, D3, D4, Ds, D6 umfasst sein können, und wobei sowohl Schutzgruppe-Y1 als auch die Gruppe Y2 wenigstens einmal anwesend sind.
Die Verbindungen gemäß Formel (V) besitzen also neben den beiden Schwefel- Gruppierungen mindestens zwei weitere funktionelle Gruppen. Dabei können die Substituenten D1, D2, D3, D4, D5 und D6 eine funktionelle Gruppe sein. D1, D2, D3, D4, D5 und D6 können auch Alkylreste mit 1-22 C-Atomen, Heteroalkylreste mit 1-22 C-Atomen Cycloalkylreste mit 1-22 C-Atomen oder H sein, wobei in dem Fall, dass von den sechs Substituenten D1, D2, D3, D4, D5 und D6 nicht mindestens zwei Substituenten funktionelle Gruppen sind, mindestens die fehlende/n funktionelle/n Gruppe/n an den/die oben definierten Heteroalkylrest/e angebunden sein muss/müssen. Mindestens eine dieser
funktionellen Gruppen ist mit einer Schutzgruppe geschützt. R1 und R2 sind wie oben definiert.
Bevorzugt werden auch Verbindungen der Struktur (V), worin D1, D3 und D5 Alkylreste mit 1-22 C-Atomen, Heteroalkylreste mit 1-22 C-Atomen, Cycloalkylreste mit 1-22 C-Atomen oder H sind. Die Substituenten D2, D4, D6 können eine funktionelle Gruppe sein. D2, D4 und D6 können auch Alkylreste mit 1-22 C-Atomen, Heteroalkylreste mit 1-22 C-Atomen oder Cycloalkylreste mit 1-22 C-Atomen oder H sein, wobei in dem Fall, dass von den drei Substituenten D2, D4 und D6 nicht mindestens zwei Substituenten funktionelle Gruppen sind, mindestens die fehlende/n funktionelle/n Gruppe/n an einen/die oben definierten Heteroalkylrest/e angebunden sein muss/müssen. Mindestens eine dieser funktionellen Gruppen ist mit einer Schutzgruppe geschützt.
Bevorzugt werden auch Verbindungen der Struktur (V), worin D2 oder D4 oder D6 gleich Schutzgruppe-Y1 oder Y2 ist und D2 oder D4 oder D6 die Gruppen Schutzgruppe-Y1 oder Y2 umfasst, wobei sowohl Schutzgruppe-Y1 als auch die Gruppe Y2 wenigstens einmal anwesend sind.
Bevorzugt werden auch Verbindungen der Struktur (V), worin D1, D2, D3 und D5 gleich H sind und D4 und D6 die Gruppen Schutzgruppe-Y1 und Y2 umfassen.
Bevorzugt werden auch Verbindungen der Struktur (V), worin Schutzgruppe-Y1 gleich Schutzgruppe-OOC, Schutzgruppe-O, Schutzgruppe-S, Schutzgruppe-NH oder Schutzgruppe-NRy ist und Y2 gleich COOH, COORx, OH, ORx, SH, SRX, NH2, NHRX oder NRxRy ist, wobei Rx eine Schutzgruppe ist und Ry ein Alkylrest mit 1-15 C-Atomen, ein Arylrest mit 1-14 C-Atomen, ein Cycloalkylrest mit 1-15 C-Atomen, ein Heteroalkylrest mit 1-15 C-Atomen, eine Schutzgruppe oder eine Gruppe der Formel (II) oder (III) ist.
Bevorzugt werden auch Verbindungen der Struktur (V), worin D1, D2, D3 und D5 gleich H sind und D4 und D6 gleich Schutzgruppe-Y1, Y2 sind.
Bevorzugt werden auch Verbindungen der Struktur (V), worin D1, D2, D3, D4 und D5 gleich H sind und D6 ein Heteroalkylrest mit 1-22 C-Atomen oder ein Cycloheteroalkylrest mit 1- 22 C-Atomen ist, wobei D6 die Gruppen Schutzgruppe-Y1 und Y2 umfasst, wobei R1 = R2 = DMT ist oder die beiden S-Atome eine Disulfid-Brücke ausbilden und in diesem Fall R1, R2 nicht vorhanden sind.
Besonders bevorzugt werden auch Verbindungen der Struktur (V), worin D1, D2, D3 und D5 H sind. D4 oder D6 sind eine funktionelle Gruppe. Der Substituent, der keine funktionelle Gruppe ist, ist ein Heteroalkylrest mit 1-22 C Atomen oder ein Cycloheteroalkylrest mit 1- 22 C-Atomen mit mindestens einer funktionellen Gruppe. Mindestens eine dieser funktionellen Gruppen ist mit einer Schutzgruppe geschützt.
Besonders bevorzugt werden auch Verbindungen der Struktur (V), worin D1, D2, D3 und D5 H sind. Die Substituenten D4 und D6 sind Alkylreste mit 1-22 C-Atomen, Heteroalkylreste mit 1-22 C-Atomen, Cycloalkylreste mit 1-22 C-Atomen oder H, mit der Einschränkung, dass mindestens zwei funktionelle Gruppen verteilt über D4 und D6 angebunden sind. Mindestens eine dieser funktionellen Gruppen ist mit einer Schutzgruppe geschützt.
Besonders bevorzugt werden die funktionellen Gruppen COOH, COORx, OH, ORx, SH, SRX, NH2, NHRX und NRxRy, wobei Rx eine Schutzgruppe repräsentiert und Ry Alkylreste mit 1-15 C Atomen, Heteroalkylreste mit 1-15 C-Atomen, Arylreste mit 1-14 C Atomen, Cycloalkylreste mit 1-15 C Atomen, oder eine Schutzgruppe ist, die unabhängig von Rx3 entfernt werden kann oder eine Gruppe der Formel (II) oder (III).
Ganz besonders bevorzugt sind Verbindungen der Struktur (V), worin D1, D2, D3, D4 und D5 H sind. D6 ist ein Heteroalkylrest mit 1-22 C Atomen oder ein Cycloheteroalkylrest mit 1-22 C-Atomen mit insgesamt mindestens zwei funktionellen Gruppen, von denen mindestens eine mit einer Schutzgruppe geschützt ist. Die funktionellen Gruppen sind eine Gruppe der Formel (II) oder ORx, COORx, COOH oder NHRX, wobei Rx eine DMT, Fmoc oder ein Alkylrest mit 1-22 C Atomen ist. R1 = R2 = DMT oder R und R2 entfallen, wenn die beiden S Atome mit sich selbst eine Disulfidbrücke bilden.
Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindungen werden Verbindungen der Formel
bereitgestellt, wobei B
1, B
2, B
3 und B
4 gleiche oder verschiedene Alkylreste mit 1-22 C- Atomen, Heteroalkylreste mit 1-22 C-Atomen, Cycloalkylreste mit 1-22 C-Atomen, H, Schutzgruppe-Y
1 oder die Gruppe Y
2 sind, wobei Schutzgruppe-Y
1 und die Gruppe Y
2 auch von B\ B
2, B
3 und B
4 umfasst sein können, und wobei sowohl Schutzgruppe-Y
1 als auch die Gruppe Y
2 wenigstens einmal anwesend sind.
Die Verbindungen der Formel (VI) besitzen also neben den beiden Schwefel- Gruppierungen mindestens zwei weitere funktionelle Gruppen. Dabei können die Substituenten B1, B2, B3, B4 eine funktionelle Gruppe sein. B1, B2, B3 und B4 können auch Alkylreste mit 1-22 C-Atomen, Heteroalkylreste mit 1-22 C-Atomen, Cycloalkylreste mit 1- 22 C-Atomen oder H sein, wobei in dem Fall, dass von den vier Substituenten B1, B2, B3, B4 nicht mindestens zwei Substituenten funktionelle Gruppen sind, mindestens die fehlende/n funktionelle/n Gruppe/n an den/die oben definierten Heteroalkylrest/e angebunden sein muss/müssen. Mindestens eine dieser funktionellen Gruppen ist mit einer Schutzgruppe geschützt.
Besonders bevorzugt werden Verbindungen der Struktur (VI), worin B2 oder B4 gleich Schutzgruppe-Y1 oder Y2 ist und B2 oder B4 die Gruppen Schutzgruppe-Y1 oder Y2 umfasst, wobei sowohl Schutzgruppe-Y1 als auch die Gruppe Y2 wenigstens einmal anwesend sind.
Besonders bevorzugt werden auch Verbindungen der Struktur (VI), worin B1, B2 und B3 gleich H sind und B4 die Gruppen Schutzgruppe-Y1 und Y2 umfasst.
Besonders bevorzugt werden auch Verbindungen der Struktur (VI), worin B4 ein Heteroalkylrest mit 1-22 C-Atomen oder ein Cycloheteroalkylrest mit 1-22 C-Atomen ist, wobei B4 die Gruppen Schutzgruppe-Y1 und Y2 umfasst, wobei Schutzgruppe-Y1 gleich Schutzgruppe-OOC, Schutzgruppe-O oder Schutzgruppe-NH ist und Y2 gleich COOH, COORx, OR , NHRX oder eine Gruppe der Formel (II) ist, wobei Rx gleich DMT oder Fmoc ist und R1 = R2 = DMT ist oder die beiden S-Atome eine Disulfid-Brücke ausbilden und in diesem Fall R1, R2 nicht vorhanden sind.
Besonders bevorzugt werden auch Verbindungen der Struktur (VI), worin B1 und B3 Alkylreste mit 1-22 C-Atomen, Heteroalkylreste mit 1-22 C-Atomen, Cycloalkylreste mit 1- 22 C-Atomen oder H sind. B2 und B4 sind eine funktionelle Gruppe. Mindestens eine dieser funktionellen Gruppen ist mit einer Schutzgruppe geschützt.
Besonders bevorzugt werden auch Verbindungen der Struktur (VI), worin B1 und B3 Alkylreste mit 1-22 C-Atomen, Heteroalkylreste mit 1-22 C-Atomen, Cycloalkylreste mit 1- 22 C-Atomen oder H sind. B2 oder B4 sind funktionelle Gruppen. Der Substituent, der keine funktionelle Gruppe ist, ist ein Heteroalkylrest mit 1-22 C-Atomen oder ein Cycloheteroalkylrest mit 1-22 C-Atomen mit mindestens einer funktionellen Gruppe. Mindestens eine dieser funktionellen Gruppen ist mit einer Schutzgruppe geschützt.
Besonders bevorzugt werden auch Verbindungen der Struktur (VI), worin B1 und B3 Alkylreste mit 1-22 C-Atomen, Heteroalkylreste mit 1-22 C-Atomen, Cycloalkylreste mit 1- 22 C-Atomen oder H sind. Die Substituenten B2 und B4 sind Alkylreste mit 1-22 C- Atomen, Heteroalkylreste mit 1-22 C-Atomen, Cycloalkylreste mit 1-22 C-Atomen oder H, mit der Einschränkung, dass mindestens zwei funktionelle Gruppen verteilt über B2 und B4 angebunden sind. Mindestens eine dieser funktionellen Gruppen ist mit einer Schutzgruppe geschützt.
Besonders bevorzugt werden auch Verbindungen der Struktur (VI), worin B1, B2, B3 H sind. B4 ist ein Heteroalkylrest mit 1-22 C-Atomen oder ein Cycloheteroalkylreste mit 1-22 C-Atomen mit insgesamt mindestens zwei funktionellen Gruppen, von denen mindestens eine mit einer Schutzgruppe geschützt ist. Die funktionellen Gruppen sind COOH, COORx, OH, ORx, SH, SRX, NH2, NHRX, NR Ry, wobei Rxeine Schutzgruppe repräsentiert und Ry Alkylreste mit 1-15 C-Atomen, Heteroalkylreste mit 1-15 C-Atomen, Arylreste mit 1- 14 C-Atomen, Cycloalkylreste mit 1-15 C-Atomen oder eine Schutzgruppe ist, die unabhängig von Rx entfernt werden kann oder eine Gruppe der Formel (II).
Besonders bevorzugt werden auch Verbindungen der Struktur (VI), worin B , B2, B3 H sind. B4 ist ein Heteroalkylrest mit 1-22 C-Atomen oder ein Cycloheteroalkylrest mit 1-22 C-Atomen mit insgesamt mindestens zwei funktionellen Gruppen, von denen mindestens eine mit einer Schutzgruppe geschützt ist. Die funktionellen Gruppen sind eine Gruppe der Formel (II) oder ORx, COORx, COOH oder NHR , wobei R eine DMT, Fmoc oder ein Alkylrest mit 1-22 C-Atomen ist. R1 = R2 = DMT oder R1 und R2 entfallen, wenn die beiden S-Atome mit sich selbst eine Disulfidbrücke bilden.
Die vorliegende Erfindung umfasst auch die Verwendung der erfindungsgemäßen Verbindungen zur Modifikation von Oligomeren. Daneben umfasst die vorliegende
Erfindung auch die Verwendung der erfindungsgemäßen Verbindungen zur
Immobilisierung von modifizierten Oligomeren auf Oberflächen. Außerdem umfasst die vorliegende Erfindung auch die Verwendung der erfindungsgemäßen Verbindungen zur Anbindung von enzymatischen, chromogenen, fluorogenen, radioaktiven oder chemiluminiscenten Labein, von in Nukleinsäureoligomere interkalierenden Substanzen, von Metallen, von Metallionen, Hormonen, Proteinen, Peptiden, nukleolytischen und proteolytischen Agentien, Biotin, Antigenen, Haptenen, Antikörpern oder Rezeptoren an Moleküle oder Oligomere. Schließlich umfasst die vorliegende Erfindung auch die Verwendung der erfindungsgemäßen Verbindungen bei der automatischen Synthese von Oligomeren.
Im Rahmen der genannten Verwendungen der erfindungsgemäßen Verbindungen wird es besonders bevorzugt, dass es sich bei den Oligomeren um Oligonukleotide, Polypeptide, PNA oder LNA (Locked Nucleic Acid) handelt.
Die Synthese von Oligonukleotiden, die mit den erfindungsgemäßen Verbindungen modifiziert werden, erfolgt in Lösung oder vorzugsweise an fester Phase, gegebenenfalls unter Zuhilfenahme eines automatischen Synthesegeräts.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
Es zeigen
Wege zur Ausführung der Erfindung
Beispiel 1 : Herstellung von 3-O-(4,4'-Dimethoxytrityl)-1 ,4-bis-(4,4'-dimethoxitrityl)- sulfanyl-butan-2-ol
Unter Argonatmosphäre werden in einem 250 ml Rundkolben 2.0 g (12.9 mmol) 1 ,4- Dithio-butan-2,3-diol unter Rühren in 35 ml wasserfreiem Pyridin gelöst. Zu der klaren Lösung werden 15.3 g (45.15 mmol) DMT-CI (4,4'-Dimethoxytrityl Chlorid) gegeben. Nach 2 Stunden unter Rühren bei Raumtemperatur wird das Reaktionsgemisch auf 50°C erhitzt und über Nacht gerührt. Danach wird MeOH (2 ml) zugesetzt und 10 min gerührt. Anschließend wird im Hochvakuum eingeengt, der Rückstand in 200 ml DCM aufgenommen und je einmal mit 1 mol/l NaHCO3-Lösung und NaCI-Lösung ausgeschüttelt. Die organische Phase wird über Na2SO wasserfrei getrocknet, abfiltriert und abgezogen. Zur Aufreinigung des Rohproduktes wird an Kieselgel 60 chromatographiert (Laufmittel: Ethylacetat/n-Heptan/1%Et3N). Die produktenthaltenden Fraktionen werden gesammelt und das Lösungsmittel restlos im Vakuum abgezogen. DC (Kieselgel, EtOAc/n-Heptan = 1 :2, +1% Et3N): Rf = 0.20.
Man erhält 5.90 g (43.2% der Theorie) eines gelblichen, schaumigen Rückstandes.
13C-NMR (CD3CI) δ (ppm): 33.21 (C-4), 35.82 (C-1), 55.17 (OCH3), 65.50 und 65.82 (C-2 und C-3), 71.52 und 75.02 (S-Cq DMT), 87.03 (O-Cq DMT), 113.01 , 126.32, 127.71 , 129.30, 131.03, 136.21 , 137.13, 145.25, 145.76, 146.10, 157.72, 158.61 (Carom DMT).
1H-NMR (CD3CI) δ (ppm): 2.05-2.21 (m, 4H, CH2-1 und CH2-4), 3.17 (m, 1H, H-3), 3.65 (m, 1H, H-2), 6.72-7.38 (m, 39Harom DMT).
Beispiel 2: Herstellung von 3-O-(4,4'-Dimethoxytrityl)-1 ,4-bis-(4,4'-dimethoxitrityl)- sulfanyl-butan-2-O-(2-cyanoethyl)-N,N'-diisopropylphosphoramidit
Unter Argonatmosphäre werden 503 mg (0.47 mmol) 3-O-(4,4'-Dimethoxytrityl)-1 ,4-bis- (4,4'-dimethoxitrityl)sulfanyl-butan-2-ol in 4 ml wasserfreiem ACN gelöst. Die Lösung wird mit Eis gekühlt und unter Rühren werden 753.2 μl (4.4 mmol) N,N'-Diisopropylethylamin tropfenweise gegeben. Dazu werden mit einer Spritze 295 μl (1.32 mmol) Chlor-(2- cyanoethoxy)(diisopropylamino)-phosphin getropft. Nach 1 ,5 Stunden unter Rühren bei
Raumtemperatur wird das Reaktionsgemisch mit 30 ml DCM verdünnt und je einmal mit einer 1 mol/l NaHCO3-Lösung und einer gesättigten Natriumchloridlösung ausgeschüttelt.
Die organische Phase wird über Na2SO4 wasserfrei getrocknet, abfiltriert und eingeengt.
Zur Reinigung des Rohprodukts wird über Kieselgel chromatographiert (Laufmittel:
Gradient Ethlyacetat/n-Heptan 3:1 bis 2:1 in Gegenwart von 1% Et3N). Die beiden
Diastereomere können sowohl im DC als auch im 31P-NMR unterschieden werden: DC (Kieselgel, EtOAc/n-Heptan = 1 :2, +1% Et3N): Rf (2 Diastereomere) = 0.20; 0.27
Man erhält 331.3 mg (55.4% der Theorie) eines weißen, schaumigen Rückstands.
31P-NMR (CD3CI) δ (ppm): 149.65, 148.59
MS (El): 303 (DMT+), 1003.1 (M+Na+)
Beispiel 3: Herstellung von 5-O-(4,4'-Dimethoxytrityl)-(1 ,2)-dithian-4-ol
Zu einer Lösung von 2 g (1.88 mmol) 3-O-(4,4'-Dimethoxytrityl)-1 ,4-bis-(4,4'- dimethoxitrityl)sulfanyl-butan-2-ol und 5 ml Pyridin in 100 ml DCM wird bei Raumtemperatur eine Lösung von l2 in DCM (9.4 mmol l2 in 120 ml DCM) gegeben. Nach 10 min. Rühren werden 200 ml einer 0.5 N Na2S2O3 Lösung zugegeben. Die Phasen werden getrennt, die organische Phase dreimal mit H2O extrahiert und die vereinigten organischen Phasen über Na2SO getrocknet. Das Lösungsmittel wird abgedampft und der verbleibende Schaum an Kieselgel chromatographiert (Laufmittel: Gradient von 10- 30% EtOAc in n-Heptan in Gegenwart von 1% Et3N). DC (Kieselgel, EtOAc/n-Heptan = 1 :2, +1% Et3N): Rf (2 Diasteromere) = 0.31 ; 0.40.
Man erhält 710.7 mg entsprechend 83.6% der Theorie eines gelblichen Öls.
3C-NMR (CD3CI) δ (ppm): 32.76 (C-6), 41.83 (C-3), 55.24 (OCH3), 67.21 (C-5), 72.32 (C- 4), 87.25 (Cq DMT), 113.16, 126.64, 127.89, 129.39, 130.61 , 136.94, 145.14, 158.09
(Carom DMT).
1H-NMR (CD3CI) δ (ppm): 2.75 (m, 2H, CH2-6), 3.03 (m, 2H, CH2-3), 3.69 (m. 2H, H-4, H- 5), 3.79 (s, 3H, OCH3), 6.83-7.52 (m, 13Ha.om DMT).
MS (Electrospray ionisation in MeOH): 303 (DMT+), 477 (M+Na+).
Beispiel 4: Herstellung von 5-O-(4,4'-Dimethoxytrityl)-(1 ,2)-dithian-4-O-(2-cyanoethyl)- N,N'-diisopropylphosphoramidit
Eine schematische Synthese-Übersicht ist in der Figur 1 dargestellt.
Unter Argonatmosphäre werden 500 mg (1.1 mol) 5-O-(4,4'-Dimethoxytrityl)-(1 ,2)-dithian- 4-ol in 8 ml wasserfreiem DCM gelöst. Die Lösung wird mit Eis gekühlt und unter Rühren werden 753.2 μl (4.4 mmol) N,N'-Diisopropylethylamin tropfenweise zugegeben. Dazu werden mit einer Spritze 295 μl (1.32 mmol) Chlor-(2-cyanoethoxy)(diisopropylamino)- phosphin getropft. Nach 1 Stunde unter Rühren bei Raumtemperatur wird das Reaktionsgemisch mit 50 ml DCM verdünnt und je einmal mit 1 mol/l NaHCO3-Lösung und gesättigter Natriumchloridlösung ausgeschüttelt. Die organische Phase wird über Na2SO4 wasserfrei getrocknet, abfiltriert und eingeengt. Zur Reinigung des Rohprodukts wird über Kieselgel chromatographiert (Laufmittel: Gradient von 5-15% EtOAc in n-Heptan in Gegenwart von 1% Et3N). Die beide Diastereomere können sowohl im DC als auch im 31P-NMR unterschieden werden: DC (Kieselgel, EtOAc/n-Heptan = 1 :2, +1% Et3N): Rf (2 Diastereomere) = 0.31 ; 0.40.
Man erhält 459.6 mg (63.8% der Theorie) des gewünschten Produkts als gelbliches öl.
31P-NMR (CD3CI) δ (ppm): 148.33, 150.19.
MS (El): 303 (DMT+), 655 (M), 677 (M+Na+)
Beispiel 5: Herstellung von 1 ,4-bis-(4,4'-Dimethoxitrityl)sulfanyl-butan-2,3-diol
Unter Argonatmosphäre werden in einem 250 ml Rundkolben 2.2 g (14.3 mmol) 1 ,4- Dithio-butan-2,3-diol unter Rühren in 40 ml wasserfreiem Pyridin gelöst. Zu der klaren Lösung werden 9.93 g (29.3 mmol) DMT-CI (4,4'-Dimethoxytrityl Chlorid) gegeben. Nach 2 Stunden unter Rühren bei Raumtemperatur werden 2 ml MeOH zugegeben und 5 min nachgerührt. Das Lösungsmittel wird abgedampft und der Rückstand in 50 ml DCM gelöst und je einmal mit einer NaHCO3-Lösung und einer NaCI-Lösung extrahiert. Die organische Phase wird über Na2SO getrocknet, abfiltriert und eingeengt. Der verbleibende Schaum wird an Kieselgel chromatographiert (Laufmittel: Gradient von 10- 30% Ethylacetat/n-Heptan in Gegenwart von 1%Et3N). Die produktenthaltenden Fraktionen werden gesammelt und das Lösungsmittel restlos im Vakuum abgezogen. DC (Kieselgel, EtOAc/n-Heptan = 1 :2, +1 % Et3N): R, = 0.35.
Man erhält 8.66 g (79.8% der Theorie) eines weißen, schaumigen Rückstands.
13C-NMR (CD3CI) δ (ppm): 34.83 (C-1 , C-4), 55.20 (OCH3 DMT), 65.94 (C-2, C-3), 71.70 (Cq DMT), 1 13.23, 126.61 , 127.95, 129.40, 130.62, 136.96, 145.14, 158.09 (Carom DMT). 1H-NMR (CD3CI) δ (ppm): 2.01 (m, 2H, OH-2, OH-3), 2.35 (m, 4H, C-1 , C-4), 3.05 (m, 2H, C-2, C-3), 3.73 (s, 12H, OCH3), 6.78-7.45 (m, 26Harom DMT).
Beispiel 6: Herstellung von 3-O-(9-Fluorenylmethoxycarbonyl)-1 ,4-bis-(4,4' dimethoxitrityl)sulfanyl-butan-2-ol
Unter Argonatmosphäre werden zu einer Lösung von 1 g (1.32 mmol) 1 ,4-bis-(4,4
'- Dimethoxitrityl)sulfanyl-butan-2,3-diol in 10 ml wasserfreiem Pyridin bei Raumtemperatur 407 mg (1.58 mmol) 9-Fluorenylmethylchloroformat gegeben. Das Reaktionsgemisch wird über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Danach werden 500 μl MeOH zugegeben und für 10 min gerührt. Nach Einengen des Lösungsmittels wird der Rückstand in 30 ml DCM aufgenommen und einmal mit einer NaCI-Lösung extrahiert. Nach Trocknen der organischen Phase über Na
2SO
4 und Abdampfen des Lösungsmittels wird das Rohprodukt an Kieselgel Chromatographie.! (Laufmittel: Ethylacetat/n-Heptan = 3:1). DC (Kieselgel, EtOAc/n-Heptan = 1 :2): R
f = 0.25.
Man erhält 303 mg (23.4% der Theorie) eines weißen, schaumigen Rückstands.
13C-NMR (CD3CI) δ (ppm): 31.68 (C-4), 35.06 (C-1), 55.20 (OCH3 DMT), 50.36 (CH- Fmoc), 65.31 und 65.45 (C-2 und C-3), 66.77 (CH2-Fmoc), 70.38 (2S-C-DMT), 113.23, 120.05, 124.70, 127.06, 127.6, 128.08, 129.22, 136.24, 136.82, 141.51 , 143.31 , 144.35, 145.01 , 154.36, 158.10, 158.3 (Carom DMT und Fmoc).
1H-NMR (CD3CI) δ (ppm): 2.10-2.45 (m, 4H, CH2-1 , CH2-4), 3.73 (d, 12H, OCH3 DMT), 3.98-4.35 (m, 2H, H-3, H-2), 6.78-7.82 (m, 34H, Har0m DMT und Fmoc).
MS (Electrospray ionisation): 303.2 (DMT+), 1283.3 (M+Na+)
Beispiel 7: Herstellung von 5-0-(9-Fluorenylmethoxycarbonyl)-(1 ,2)-dithian-4-ol
Zu einer Lösung von 1.23 g (1.25 mmol) 3-O-(9-Fluorenylmethyloxycarbonyl)-1 ,4-S,S'- bis-(4,4'-dimethoxitrityl)-butan-2-ol in 50 ml DCM wird bei Raumtemperatur eine Lösung von l2 in DCM (6.25 mmol l2 in 60 ml DCM) gegeben. Nach 10 min werden unter starkem Rühren 100 ml einer 0.5 N Na2S2ö3-Lösung zugegeben. Die Phasen werden getrennt, die organische Phase dreimal mit H2O extrahiert und die vereinigten organischen Phasen
über Na2SO4 getrocknet. Das Lösungsmittel wird abgedampft und der verbleibende Schaum an Kieselgel chromatographiert (Laufmittel: Gradient von 10-30% EtOAc in n- Heptan). DC (Kieselgel, EtOAc/n-Heptan = 1 :2): Rf = 0.20.
Man erhält 212 mg (45.3% der Theorie) eines gelblichen Öls.
3C-NMR (CD3CI) δ (ppm): 34.51 (C-6), 41.86 (C-3), 46.74 (CH-Fmoc), 65.18 (CH2-Fmoc), 70.11 (C-5), 72.21 (C-4), 120.06, 125.07, 127.59, 127.98, 141.33, 143.18 (Car0m Fmoc)
1H-NMR (CD3CI) δ (ppm): 2.98 (m, 2H, CH2-6), 3.09 (m, 2H, CH2-3), 3.72 (m, 2H, H-4, H- 5), 7.28-7.80 (m, 8Ha.om Fmoc).
Beispiel 8: Herstellung von 3-O-(9-Fluorenylmethoxycarbonyl)-1 ,4-bis-(4,4' dimethoxitrityl)sulfanyl-butan-2-O-(2-cyanoethyl)-N,N'-diisopropylphosphoramidit
Unter Argonatmosphäre werden 460 mg (0.47 mmol) 3-O-(9-Fluorenylmethoxycarbonyl)- 1 ,4-bis-(4,4'-dimethoxitrityl)sulfanyl-butan-2-ol in 5 ml wasserfreiem DCM gelöst. Zur eisgekühlten Lösung werden unter Rühren 322 μl (1.88 mmol) N,N'-Diisopropylethylamin tropfenweise gegeben. Dazu werden mit einer Spritze 136.5 μl (0.61 mmol) Chlor-(2- cyanoethoxy)(diisopropylamino)-phosphin getropft. Nach einer Stunde unter Rühren bei
Raumtemperatur wird das Reaktionsgemisch mit 50 ml DCM verdünnt und je einmal mit 1 mol/l NaHCO3-Lösung und gesättigter Natriumchloridlösung ausgeschüttelt. Die organische Phase wird über Na2SO wasserfrei getrocknet, abfiltriert und eingeengt. Zur
Reinigung des Rohprodukts wird über Kieselgel chromatographiert (Laufmittel: Gradient von 5-20% EtOAc in n-Heptan in Gegenwart von 1% Et3N). Die beiden Diastereomere können sowohl im DC als auch im 31P-NMR unterschieden werden: DC (Kieselgel, EtOAc/n-Heptan = 1 :2, +1 % Et3N): Rf (2 Diastereomere) = 0.26; 0.29
Man erhält 270 mg entsprechend 48.7% der Theorie eines weißen, schaumigen Rückstands.
31P-NMR (CD3CI) δ (ppm): 149.35, 150.29.
Beispiel 9: Herstellung von 5-O-(9-Fluorenylmethoxycarbonyl)-(1 ,2)-dithianyl-4-O-(2- cyanoethyl)-N,N'-diisopropylphosphoramidit
Unter Argonatmosphäre werden 500 mg (1.33 mmol) 5-O-(9-Fluorenylmethoxycarbonyl)- (1 ,2)-dithianyl-4-ol in 5 ml wasserfreiem DCM gelöst. Zur eisgekühlten Lösung werden unter Rühren 914 μl (5.32 mmol) N,N'-Diisopropylethylamin tropfenweise gegeben. Dazu werden mit einer Spritze 387 μl (1.73 mmol) Chlor-(2-cyanoethoxy)(diisopropylamino)- phosphin getropft. Nach 1.5 Stunden unter Rühren bei Raumtemperatur wird das Reaktionsgemisch mit 50 ml DCM verdünnt und je einmal mit 1 mol/l NaHC03-Lösung und gesättigter Natriumchloridlösung ausgeschüttelt. Die organische Phase wird über Na2S04 wasserfrei getrocknet, abfiltriert und eingeengt. Zur Reinigung des Rohprodukts wird über Kieselgel chromatographiert (Laufmittel: Gradient von 5-20% EtOAc in n-Heptan in Gegenwart von 1% Et3N). Die beiden Diastereomere können sowohl im DC als auch im 31P-NMR unterschieden werden: DC (Kieselgel, EtOAc/n-Heptan = 1 :2, +1% Et3N): R, (2 Diastereomere) = 0.22; 0.3
Man erhält 295 mg entsprechend 38.7% der Theorie eines weißen, schaumigen Rückstands.
31P-NMR (CD3CI) δ (ppm): 149.04, 150.32
Beispiel 10: Festphasensynthese thiol-modifizierter Oligonukleotide mit Hilfe der Verbindung gemäß Beispiel 4 nach der Phosphoramidit-Methode
Die Oligodesoxyribonukleotidsynthesen wurden im 1 μmol Maßstab mittels der Festphasen-Phosphoramidit-Technik an einem automatisierten DNA/RNA-Synthesizer Modell 384 B (Applied Biosystems) mit Hilfe von ®CPG (Controlled Pore Glass), das die erste Nukleosid-Einheit über das 3'-Ende gebunden enthält, durchgeführt. Hierzu wird das Synthese-Gerät z.B. mit einer Reaktionssäule bestückt, die mit einem mit Nukleobasen vorbelegten Trägermaterial beschickt wurde und in einem ersten Reaktionsschritt die 5'- OH-Schutzgruppe (4,4'-Dimethoxytrityl) durch Behandlung mit einer 2%igen Dichloressigsäure-Lösung in Dichlormethan abgespalten. Nach Waschen der Säule mit Acetonitril erfolgt die Kupplung des nächsten Bausteins, der auch das modifzierte Amidit aus Beispiel 4 sein kann, durch Aktivierung mit Tetrazol in ACN an die freie 5 -OH- Funktion. Zum Einbau des modifizierten Amidits wurde ein jeweils 10 minütiger Doppelkupplungsschritt verwendet. Das noch trivalent vorliegende P-Atom wird nach erneutem Waschen durch Oxidation mit einer Lösung von lod in THF/Lutidin/H20 in das natürliche pentavalente Phosphat überführt. Der nachfolgende Capping-Schritt mit Essigsäureanhydrid/1-Methylimidazol blockiert durch Acetylierung freie 5'-OH Gruppen. Dadurch wird die Bildung von Fehlsequenzen unterdrückt. Nach dem Waschen beginnt mit erneuter Abspaltung der 5'-0-Dimethoxytrityl-Schutzgruppe der Synthesezyklus von vorne. In dieser Weise wird das modifizierte Oligonukleotid aufgebaut. Die letzte DMT- Gruppe wurde nicht abgespalten. Nach beendeter Synthese wurde durch Behandlung mit konzentrierter wässriger Ammoniaklösung das am Träger gebundene Oligonukleotid freigesetzt. Die Schutzgruppen an den Heterozyklen wurden im gleichen Medium innerhalb von 16 h bei 37°C entfernt. Die Proben wurden im Vakuum auf etwa 200 μl eingeengt und mittels HPLC aufgereinigt.
Beispiel 11 : Festphasensynthese thiol-modifizierter Oligonukleotide mit Hilfe der Verbindung gemäß Beispiel 9 nach der Phosphoramidit-Methode
Die Oligomer-Synthese erfolgt wie in Beispiel 10 beschrieben. Zur Abspaltung der Fmoc Gruppe wird das Oligonukleotid am Träger mit einer 0.5 mol/l DBU Lösung in Acetonitril behandelt (4 x 1 ml 0.5 mol/l DBU/ACN in 2 min). Die Aufarbeitung erfolgt analog Beispiel 10.
Beispiel 12: Festphasensynthese thiol-modifizierter Oligonukleotide mit Hilfe der Verbindung gemäß Beispiel 2 nach der Phosphoramidit-Methode
Der Oxidationsschritt bei der Oligomer-Synthese wurde mit einer 0.1 mol/l lod-Lösung und mit verlängerten Reaktionszeiten (1 min) durchgeführt. Der weitere Synthese-Zyklus und die Aufarbeitung der Oligonukleotide erfolgt analog Beispiel 10.
Beispiel 13: HPLC-Aufreinigung der tritylgeschützten Oligonukleotide
Im ersten Reinigungsschritt wurden die DMT-geschützten Oligomere über HPLC an einer RP-C18-Kieselgel-Säule aufgereinigt (Laufmittel: 0.1 mol/l Triethylammoniumacetat- Puffer, Acetonitril). Die Oligomere wurden mit 100 μl einer 80% Essigsäure Lösung versetzt und bei Raumtemperatur 20 min geschüttelt. Zu dieser Lösung werden 100 μl H20 und 60 μl 3 mol/l NaAc-Lösung gegeben. Die Oligonukleotide wurden mit 1.5 ml EtOH versetzt und vollständig bei -20 °C (20 min) gefällt. Nach Abzentrifugieren und Abdekantieren des Ethanols wird das Pellet in Vakuum getrocknet. Die Charakterisierung der Oligomere erfolgt mittels MALDI-TOF MS. Tabelle 1 zeigt die HPLC-Retentionszeiten der synthetisierten Oligonukleotide.
Tabelle 1
Oligomer (5'->3'-Richtung) Retentionszeiten (min)
(Sequenz) mit DMT
Oligonukleotid 1 :
5'-XAGG TGA CTG TGT TAT CCG CA-3' 10.05
Oligonukleotid 2:
5'-XXAGG TGA CTG TGT TAT CCG CA-3' 11.30 Oligonukleotid 3:
5'-XXXAGG TGA CTG TGT TAT CCG CA-3' 11.72 wobei X der Verbindung 4 entspricht
5'-XT10-3' 21.12 5VXXT10-3' 21.52 wobei X der Verbindung 2 entspricht
Beispiel 14: Immobilisierungsexperimente mit den Oligonukleotiden 1 , 2 und 3 gemäß Beispiel 13
Präparation der Einzelstrang-DNA-Monoschicht:
a) Reinigung der Au-Elektroden:
Zur Reinigung der Goldelektroden wurden die goldbedampften Glas-Objektträger 30 Sekunden in eine Mischung (3:1) aus konzentrierter Schwefelsäure und 30%iger wässriger Wasserstoffperoxidlösung getaucht, gründlich mit Reinstwasser abgespült und anschließend 15 Minuten in Ethanol aufbewahrt.
b) Immobilisierung der Oligonukleotide 1 , 2 und 3 auf der Au-Oberfläche :
Die Immobilisierung der Oligonukleotide auf der Au-Oberfläche erfolgte durch Selbstassemblierung aus einer 30 μmol/l Lösung der Oligonukleotide in Kaliumphosphatpuffer (500 mmol/l, pH 7) über Nacht, gefolgt von gründlichem Spülen mit Kaliumphosphatpuffer.
Zur Überprüfung der Immobilisierungseffektivität wurde die Oberflächen-plasmonen- Resonanz-Spektroskopie (SPR) eingesetzt, welche sehr sensitiv auf die mit Adsorptionsund Desorptionsvorgängen verbundenen Änderungen des Brechungsindex in Oberflächennähe reagiert. Die Änderung des Resonanzwinkels ΔΘ ist dabei proportional zum Massenzuwachs bzw. -verlust auf der Oberfläche. Die Experimente wurden auf einem Biosuplar II von Analytical μ-Systems (Regensburg) durchgeführt.
Die Figur 2 zeigt die SPR-Kinetiken zur Immobilisierung von Oligo 1 (■), Oligo 2 (A) und Oligo 3 (•) auf einer Au-Oberfläche (c = 30 μM in 500 mM Kaliumphosphatpuffer, pH 7). Aus der Auftragung ist zu ersehen, dass die Oligonukleotide 1 , 2 und 3 alle mit annähernd identischer Kinetik an die Oberfläche anbinden. Die adsorbierte Stoffmenge liegt für alle Oligonukleotide unter der von vergleichbaren Einzelanker-Oligonukleotiden (α) (H2N-C6- TCG TCA CTG TCA GTG TCA GA-[C3-S-S-C3-OH] mit C3 = (CH2)3 und C6 = (CH2)6) und spiegelt somit den erhöhten Grundflächenbedarf pro DNA-Strang wider.
c) Nachbelegung mit Alkanthiolen:
Die Oligonukleotid-modifizierte Au-Oberfläche wurde zur Aufrichtung der DNA und zur Passivierung der Zwischenräume mit kurzkettigen Alkanthiolen nachbelegt. Die 30- minütige Nachbelegung erfolgte aus einer 1 mM Lösung des Alkanthiols (Propanthiol oder Hydroxypropanthiol) in obigem Kaliumphosphatpuffer mit 1% Ethanol, gefolgt von gründlichem Spülen mit Kaliumphosphatpuffer.
Stabilitätstests:
Die Überprüfung der Stabilität der Anbindung erfolgte durch Inkubation der Oberfläche mit Phosphatpuffer (pH 9) und durch Einstellen der Dehybridisierungsbedinungen (2 mol/l NaOH) unter SPR-Kontrolle. Die Figur 3 zeigt einen Stabilitätstest für eine mit Propanthiol nachbelegte Monoschicht des Oligonukleotids 1. Zur Zeit t = 0 liegt der mit Propanthiol nachbelegte Oligonukleotidmonolayer in 500 m mol/l P-Puffer bei pH 7 vor. Bei t = 1h wurde ein Pufferwechsel zu 500 mmol/l P-Puffer mit pH 9 vorgenommen. Der Resonanzwinkel ändert sich hierbei aufgrund des höheren Brechungsindex des Puffers. Nachfolgend wurde bei t = 2 h zu dem ursprünglichen 500 mmol/l P-Puffer, pH 7 gewechselt, wobei der Resonanzwinkel auf seinen Ursprungswert zurückgeht. Die Stoffmenge auf der Oberfläche hat sich dementsprechend durch die Behandlung bei pH 9 nicht verändert. Bei t = 5 h wurde der Puffer durch 2 mol/l NaOH ersetzt und abschließend bei t = 5.5 h wieder zu 500 mmol/l P-Puffer, pH 7 gewechselt. Auch unter diesen Bedingungen bleibt der Monolayer stabil und es tritt kein Materialverlust auf.
Überprüfung der Hybridisierbarkeit:
Zur Überprüfung der Hybridisierbarkeit wurden die obigen Oligonukleotid-Monoschichten mit einem zweifach 5'-Ferrocenessigsäure-gelabelten Gegenstrang ([FcAc-Y]2-C GGA TAA CAC AGT CAC CT; Y= Amino Introducing Reagent mit C3-Spacer; Chemgene) hybridisiert. Die Hybridisierung erfolgte durch Inkubation der Monoschicht mit einer auf 95°C temperierten 1 μmol/l Lösung des Gegenstrangs in 100 mmol Natriumsulfat-Lösung und anschließendes Abkühlen über einen Zeitraum von mindestens 2 Stunden.
Zur elektrochemischen Charakterisierung wurden als voltammetrische Methoden Square- Wave-Voltammetrie und zyklische Voltammetrie eingesetzt. Beide Methoden können zur
Detektion von oberflächengebundenen Redoxlabeln (hier der Ferrocenessigsäure) eingesetzt werden.
In der Square-Wave-Voltammetrie wird einer linearen Spannungsrampe eine Rechteckspannung mit Frequenz f und Amplitude E~ überlagert (im Bsp. f = 10 Hz, E~ = 20 mV rms) und der Strom erst gegen Ende eines jeden Pulses detektiert. Hierdurch werden kapazitive Ladeströme nahezu eliminiert, was in einem voltammetrischen Peak resultiert. Ein relativer Vergleich der Peakströme ist sehr leicht möglich, wohingegen die absolute Quantifizierung der beteiligten Ladungen nicht trivial ist.
In der zyklischen Voltammetrie werden Dreieck-Spannungsrampen gefahren und der resultierende Strom detektiert. Ausgeprägte kapazitive Ladeströme können hier die Bestimmung der faradayischen Ströme erschweren. Durch Integration der Peakflächen lassen sich allerdings die Anzahl der transferierten Ladungen und somit auch die Anzahl der Redoxlabel bestimmen.
Mittels der oben beschriebenen Square-Wave-Voltammetrie wurde überprüft, ob die Redox-Label des hybridisierten Gegenstrangs detektiert werden können. Die Figuren 4.1 und 4.2 zeigen die Square-Wave-Voltammogramme (f = 10 Hz, E" = 20 mV rms) für die mit Propanthiol (Fig. 4.1) und Hydroxypropanthiol (Fig 4.2) nachbelegten und mit dem redoxmarkierten Gegenstrang hybridisierten Oligonukleotidmonolayer 1-3. Man erkennt bei allen Monolayern einen deutlichen Peak bei +0.23 V (vs Ag/AgCI/3M KCI), welcher von der Oxidation der Ferrocenessigsäure am Gegenstrang herrührt und für die erfolgreiche Hybridisierung der Monolayer spricht. Die Peakströme und somit die Hybridisierungseffizienz unterscheiden sich allerdings in Abhängigkeit von der Nachbelegung und dem verwendeten Oligonukleotid.
Zur Quantifizierung wurde die zyklische Voltammetrie herangezogen. Durch Integration der zyklischen Voltammogramme (v = 500 mV/s) in Figur 4.3 und 4.4 wurde die Anzahl der Redoxlabel und somit die jeweilige Oberflächenkonzentration V des Gegenstrangs (Rauhigkeitsfaktor = 2, Anzahl der Label pro Target = 2) bestimmt und in Figur 5 aufgetragen. Die Oberflächenkonzentration r ist ein direktes Maß für die Hybridisierbarkeit der Oligonukleotidmonolayer.
Von den drei Oligonukleotiden des Beispiels 13 zeigt das Oligonukleotid 2 die beste Hybridisierbarkeit. Die Hybridisierbarkeit der Hydroxypropanthiol-nachbelegten ssDNA-
Monoschichten ist dabei deutlich größer als die der entsprechenden Propanthiol- nachbelegten Monoschichten. Die Oberflächenbelegungen liegen zwischen MO"12 - 7-10' 12 mol/cm2 und somit in einem Bereich der zuvor auch von anderen Gruppen gefunden wurde (Herne T.M., Tarlov M.J. J. Am. Chem. Soc. 1997, 119, 8916-8920)
Alle obigen elektrochemischen Experimente wurden in einem 3-Elektroden-Setup mit der zu untersuchenden Gold-Arbeitselektrode, einer Pt-Gegenelektrode sowie einer Referenzelektrode (Ag/AgCI/3M KCI) an einem Potentiostaten Autolab12 der Firma Ecochemie ((Niederlande) durchgeführt.
Beispiel 15
Zu einer Lösung von 2 mmol trans-1 ,2-Dithian-4,5-diol in wasserfreiem Pyridin werden 2 mmol p-Tosylchlorid gegeben. Nach 2 Stunden Rühren bei Raumtemperatur wird das Lösungsmittel abgedampft. 0.5 eq Ethylendiamin in DMF in Gegenwart von NaH werden 10 min bei Raumtemperatur gerührt. Das Produkt 10 (siehe Fig. 6) wird in DMF gelöst und zu der obigen Ethylendiamin Lösung hinzugefügt. Unter Rückfluss wird die Reaktionsmischung 6 Stunden gerührt. Das gewünschte Produkt 11 (siehe Fig. 6) wird mittels Kieselgel Säulenchromatographie isoliert und mit 1 eq DMT-CI in Pyridin zu Produkt 12 (siehe Fig. 6) umgesetzt. Das DMT-geschützte Produkt wird über Kieselgel mit einer Mischung von Ethylacetat/n-Heptan mit 1% Et3N als Laufmittel chromatographiert. Unter Argon-Atmosphäre wird 1 mmol von Produkt 12 (siehe Fig. 6) in 10 ml wasserfreiem DCM gelöst. Die Lösung wird im Eisbad gekühlt und unter Rühren werden 4 eq N,N'- Diisopropylethylamin tropfenweise zugegeben. Dazu werden mit einer Spritze 1.2 eq Chlor-(2-cyanoethoxy)(diisopropylamino)-phosphin getropft. Nach 1.5 Stunden unter Rühren bei Raumtemperatur wird das Reaktionsgemisch mit DCM verdünnt und mit Standardmethoden aufgearbeitet. Zur Reinigung des Produktes 13 (siehe Fig. 6) wird über Kieselgel chromatographiert (Laufmittel: Ethylacetat /n-Heptan in Gegenwart von 1 % Et3N).
Beispiel 16
1 g (8 mmol) von 2,3-Dimercapto-1-propanol wird in ACN gelöst und mit Luft (Sauerstoff) oxidiert. Die entsprechende zyklische Verbindung 14 (siehe Fig. 7) wird mit MsCI
(Mesylchlorid) in Gegenwart von Et3N umgesetzt. Nach 2 h Rühren bei Raumtemperatur wird das Lösungsmittel einrotiert. Eine Lösung von 1 eq MMT-Ethylendiamin wird mit NaH in DMF behandelt. Nach 30 min Rühren bei Raumtemperatur wird 1 eq von Verbindung 14 (siehe Fig. 7) in DMF zu der obigen MMT-Ethylendiamin Lösung gegeben. Die Reaktionsmischung wird unter Rückfluss 4 Stunden gerührt. Das Lösungsmittel wird am Rotationsverdampfer eingeengt, der Rückstand mit Standardmethoden aufgearbeitet und mittels Kieselgel-Säulen-Chromatographie aufgereinigt.
Die MMT Gruppe der Verbindung 16 (siehe Fig. 7) wird mit einer säurehaltigen Lösung 2% DCA DCM abgespalten. 1 eq von Verbindung 17 (siehe Fig. 7) wird in DMF aufgenommen und mit N-α-Fmoc-N-ε-1-(4,4-dimethyl-2,6-dioxocyclohex-1-ylidene)ethyl-L- Lysin (Produkt 18 (siehe Fig. 7)) in Gegenwart von HOBt und DCC umgesetzt. Die Reaktion wird über Nacht bei Raumtemperatur durchgeführt. Das Lösungsmittel wird abgezogen und der Rückstand mit Standardmethoden aufgearbeitet und mittels Kieselgel- Säulenchromatographie mit Ethylacetat/n-Heptan als Laufmittel aufgereinigt.
Die Fmoc Gruppe der Verbindung 19 (siehe Fig. 7) wird selektiv mit einer Lösung von 0.5 M DBU in ACN abgespalten. Die freie Amino Gruppe des Produkts 20 (siehe Fig. 7) wird mit BrCH2CH2COOH umgesetzt, um das Produkt 21 (siehe Fig. 7) als Hauptprodukt zu liefern. Das Rohprodukt wird mittels Kieselgel Säulenchromatographie mit Ethylacetat/n- Heptan als Laufmittel aufgereinigt.
Beispiel 17
Zu einer Lösung von 1 g (4.7 mmol) 1 ,3,5-Benzoltricarbonsäure in wasserfreiem DMF werden jeweils 1 eq von Verbindung 22 (siehe Fig. 8), DCC und HOBt gegeben. Die Reaktionsmischung wird über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Das Lösungsmittel wird eingeengt und das gewünschte Produkt 23 (siehe Fig. 8) wird mittels Kieselgel Chromatographie isoliert. Die Verbindung 23 (siehe Fig. 8) wird in DMF aufgenommen und mit Fmoc-Ethylendiamin in Gegenwart von DCC und HOBt eingesetzt. Nach dem Einengen des Lösungsmittels wird das Rohprodukt über Kieselgel mit einer Mischung von Ethylacetat/n-Heptan als Laufmittel chromatographiert.
Beispiel 18
Zu einer Lösung von 2 g (13 mmol) 3,5-Diaminobenzoesäure in 40 ml wasserfreiem Pyridin werden 1.2 eq Fmoc-Cl ((9-Flurorenylmethyl)-chloroformiat) hinzugefügt. Nach 2 Stunden Rühren bei Raumtemperatur wird das Lösungsmittel abgedampft und das Rohprodukt mittels Kieselgel-Säulenchromatographie mit Ethylacetat/n-Heptan als Laufmittel aufgereinigt. Die Verbindung 25 (siehe Fig. 9) wird in einer Mischung ACN/Dioxan gelöst und mit dem N-Hydroxysuccinimid Aktivester der Liponsäure umgesetzt. Die Reaktionsmischung wird über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Das Lösungsmittel wird einrotiert und der Rückstand wird in DCM aufgenommen und mit Standardmethoden aufgearbeitet. Das Rohprodukt wird über Kieselgel mit Ethylacetat/n- Heptan als Laufmittel chromatographiert, um das gewünschte Produkt 27 (siehe Fig. 9) zu isolieren.