WO2003052096A1 - Procede d'analyse de l'expression genique - Google Patents

Procede d'analyse de l'expression genique Download PDF

Info

Publication number
WO2003052096A1
WO2003052096A1 PCT/JP2002/013097 JP0213097W WO03052096A1 WO 2003052096 A1 WO2003052096 A1 WO 2003052096A1 JP 0213097 W JP0213097 W JP 0213097W WO 03052096 A1 WO03052096 A1 WO 03052096A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
cancer
protein
seq
amino acid
acid sequence
Prior art date
Application number
PCT/JP2002/013097
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Shuji Hinuma
Makoto Kobayashi
Toshimitsu Arai
Shoji Fukusumi
Ryo Fujii
Hidetoshi Komatsu
Fumika Matsumura
Yuji Kawamata
Kazuhiro Ogi
Original Assignee
Takeda Chemical Industries, Ltd.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Takeda Chemical Industries, Ltd. filed Critical Takeda Chemical Industries, Ltd.
Priority to AU2002354255A priority Critical patent/AU2002354255A1/en
Priority to US10/498,848 priority patent/US20050153289A1/en
Priority to EP02786101A priority patent/EP1454982A4/en
Publication of WO2003052096A1 publication Critical patent/WO2003052096A1/ja

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/1703—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • A61K38/1709—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4726—Lectins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/566—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor using specific carrier or receptor proteins as ligand binding reagents where possible specific carrier or receptor proteins are classified with their target compounds
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/689—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to pregnancy or the gonads
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/136—Screening for pharmacological compounds
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/72—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants for hormones
    • G01N2333/726—G protein coupled receptor, e.g. TSHR-thyrotropin-receptor, LH/hCG receptor, FSH

Definitions

  • the present invention relates to a gene expression analysis method for collectively analyzing expression of a plurality of genes, a gene expression analysis kit used for the method, and the like.
  • the present invention also relates to a method for analyzing gene expression and a method for specifying a disease-related gene using the analysis kit.
  • the present invention also relates to a method for diagnosing a specific disease by analyzing the expression level and mutation of a disease-related gene, and a drug containing the specified gene DNA or its gene product.
  • the present invention relates to the use of a human-derived G protein-coupled receptor protein (dj287G14.2 receptor) and a polynucleotide encoding the same.
  • dj287G14.2 receptor human-derived G protein-coupled receptor protein
  • the present invention relates to a novel mouse-derived G protein-coupled receptor protein (dj287G14.2 receptor), a polynucleotide encoding the same, and uses thereof. Further, the present invention relates to a method of screening an EDG-1 receptor gonist or an EDG-2 agonist.
  • dj287G14.2 receptor mouse-derived G protein-coupled receptor protein
  • G protein-coupled receptor proteins are present on the surface of various functional cells in living cells and organs, and are used as physiological targets as molecules that regulate the functions of those cells and organs, such as hormones, neurotransmitters, and bioactive substances. Plays an important role.
  • the receptor transmits a signal into a cell through binding to a physiologically active substance, and this signal causes various reactions such as suppression of activation and activation of the cell.
  • Ion channels are membrane proteins that penetrate cell membranes and regulate cell permeation of ions to carry out cellular responses. Because of their selectivity for ions, they are called Na + , K +, Ca 2 + , C 1 -channels, etc., and depending on the opening and closing mechanism of the channel, voltage-dependent (Na + , K +, Ca 2 + ) And receptor-dependent (nicotinic acetylcholine receptor Yuichi, GABA receptor Yuichi).
  • ion channels have many physiological functions in vivo.
  • the ⁇ + channel a membrane protein that selectively permeates K + ions
  • C 1-channels exhibit various physiological functions such as regulation of neuromuscular excitability, regulation of cell volume, and transport of electrolytes and water across epithelial cell membranes.
  • various ion channels have various physiological functions and are therefore targets for pharmaceuticals.
  • Some receptors in the living body have an enzymatic activity, such as tyrosin-phosphorylating receptor.
  • Tyrosine kinase-type receptors have also been targeted by many pharmaceuticals because their enzymatic activities perform various physiological functions.
  • gene families such as transcription factors, transporters, protein kinases, protein phosphatases, proteases, heat shock proteins, ATPases, and DNA binding proteins, each of which is dozens of It is one of hundreds of families and has become a drug target.
  • a Northern plot method As a method of analyzing genes expressed in a living body, a Northern plot method, a differential display method, an RT-PCR method and the like have been used. However, the number of genes that can be analyzed at one time was limited, and it was difficult to process samples containing many genes. In addition, the sensitivity was low for quantitative performance.
  • the microarray method synthesizes or spots thousands or tens of thousands of pieces of DNA information on a chip such as a slide glass, hybridizes target DNA derived from the RNA to be analyzed, and uses the generated hybrid as an index to identify the gene. Although this method measures the amount of transcript, the sensitivity for quantitativeness was not high.
  • the TaqMan method As a method for quantifying a specific mRNA, the TaqMan method and the like are known. For example, Patent Publication No. 2001-204483 discloses a method for quantifying hTERT mRNA. I have.
  • the TaQMan method is also known as one of the methods for performing SNP analysis.Primers and probes that recognize SNPs are designed and used to analyze not only expression levels but also disease-related mutations. You can also.
  • a protein having the same amino acid sequence as dj287G14.2 receptor used in the present invention and a DNA encoding the same have been described (W (2001/18207). However, the functions of these G protein-coupled receptor proteins and their physiological ligands have not been elucidated.
  • EDG-1 Recept Yuichi Biochem Biophys Res Commun 1997 Nov 26: 240 (3): 737-41
  • EDG-2 Recept Yuichi Biochem Biophys Res Commun 1997 Feb 24; 231 (3): 619- 22
  • EDG-3 receptor Cell 1999 Oct 29; 99 (3): 301-12
  • EDG-5 receptor Yuichi J Biol Chem 1999 Dec
  • EDG-8 Recept Yuichi Biochemistry 2001 Nov 20: 40 (46): 14053-60
  • EDG_4 EDG-6
  • EDG-7 EDG-7
  • the present invention provides the following gene expression analysis methods, diagnostic methods, quantification kits used in those methods, proteins whose functions are clarified by those methods or kits, and uses thereof.
  • a gene expression analysis method characterized by identifying a gene whose expression is specifically enhanced or reduced in a certain cell or tissue by collectively and quantitatively analyzing the expression levels of a plurality of genes. .
  • an mRNA sample that may contain a plurality of target mRNAs, and amplification reagents each containing a pair of primers corresponding to each target mRNA.
  • the specific gene family is a transcription factor, transport protein, protein
  • the method according to the above (2) which is a gene family related to any of kinase, protein phosphatase, protease, heat shock protein, ATPase or DNA binding protein.
  • a medicament comprising a gene characteristically upregulated or reduced in a certain cell or tissue or a gene product thereof, which is specified by the method according to any one of (1) to (8) above.
  • reaction device is a plate having a plurality of holes as reaction sites.
  • the specific gene family is human G protein-coupled receptor receptor (20)
  • the method according to the above (20) which is a protein gene family, and specifies a cancer-related gene by using an mRNA sample derived from a cancer patient.
  • (22) a first primer that is complementary or substantially complementary to one strand of the exon region of the target gene sequence and complementary or substantially complementary to the other strand of the exon region of the target gene sequence
  • a primer pair kit comprising two or more primer pairs consisting of the second primer.
  • the present invention provides a receptor protein or a partial peptide thereof or a salt thereof (dj287G14.2 receptor), a polynucleotide encoding the receptor protein or a partial peptide thereof (DNA, RNA and the like). Derivatives), and novel uses such as antibodies against the receptor protein or its partial peptide or a salt thereof.
  • a novel mouse-derived dj287G14.2 receptor a polynucleotide (DNA, RNA and a derivative thereof) encoding the receptor protein or a partial peptide thereof, the receptor protein or a partial peptide or a salt thereof. And the like.
  • a medicament comprising a receptor protein or a partial peptide thereof or a salt thereof, which comprises the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9;
  • cancer is prostate cancer, non-small cell cancer, ovarian cancer, stomach cancer, bladder cancer, breast cancer, cervical cancer, colon cancer, rectal cancer or colon cancer.
  • a diagnostic agent comprising an antibody
  • a medicament comprising an antibody against a protein having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9 or a partial peptide thereof, or a salt thereof;
  • the above (41) which is an agent for preventing and treating cancer, benign prostatic hyperplasia, male gonad dysfunction, infertility, premature birth, endometriosis, cirrhosis, hepatitis, hepatic failure or calculus, or a labor-inducing agent ) Described medicament,
  • a G protein-coupled receptor protein having an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9, a partial peptide thereof or a salt thereof, and (2) a sugar chain (44) a method for screening a compound or a salt thereof, which changes the binding property between the receptor protein or a salt thereof and a protein having an affinity for a sugar chain, wherein the protein or the salt thereof is characterized by using a protein having an affinity.
  • the screening method according to (43), wherein the protein having an affinity for a chain is a protein having an affinity for an asparagine-linked sugar chain or a serine / threonine-linked sugar chain.
  • a G-protein-coupled receptor protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9, or a polynucleotide containing a polynucleotide encoding a partial peptide thereof
  • nucleotides alters the expression level of the G protein-coupled receptor protein, resulting in cancer, prostatic hypertrophy, male gonad dysfunction, infertility, premature labor, endometriosis, cirrhosis, hepatitis, liver failure Or a compound or a salt thereof for preventing and / or treating calculi, or a method of screening for a labor-inducing drug,
  • a polynucleotide containing a polynucleotide encoding a G protein-coupled receptor protein or a partial peptide thereof containing an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9 Alters the expression level of the G protein-coupled receptor protein to contain cancer, benign prostatic hyperplasia, male gonad dysfunction, infertility, premature birth, endometriosis, cirrhosis, hepatitis, liver failure or calculus
  • a kit for screening for a prophylactic and / or therapeutic compound or salt thereof, or a labor-inducing drug
  • a G protein-coupled receptor containing an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9 comprising a protein having an affinity for a sugar chain Signal transduction enhancer of protein
  • a polynucleotide comprising a polynucleotide encoding a G protein-coupled receptor protein or a partial peptide thereof comprising an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9
  • a prophylactic and / or therapeutic agent for cancer benign prostatic hyperplasia, male gonadal dysfunction, infertility, premature birth, endometriosis, cirrhosis, hepatitis, hepatic failure or calculus, or a birth inducer,
  • (62) a polynucleotide containing a polynucleotide encoding a G protein-coupled receptor protein or a partial peptide thereof containing an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9 Cancer, prostatic hyperplasia, male gonadal dysfunction, infertility, preterm birth, endometriosis, cirrhosis, hepatitis, liver failure or stones diagnostics
  • a polynucleotide comprising a polynucleotide encoding a G protein-coupled receptor protein or a partial peptide thereof comprising an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9 Cancer, prostatic hypertrophy, male gonad dysfunction, infertility, premature birth, endometriosis, liver cirrhosis, hepatitis Diagnostics for liver failure or stones,
  • a receptor protein having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9, a partial peptide thereof, or a salt thereof is administered.
  • Cancer benign prostatic hyperplasia, male gonadal dysfunction, infertility, premature birth, endometriosis, cirrhosis, hepatitis, hepatic insufficiency or calculus prevention or treatment method, or method of inducing labor,
  • an effective amount of an antibody against a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9, a partial peptide thereof, or a salt thereof is administered Cancer, prostatic hyperplasia, male gonadal dysfunction, infertility, premature birth, endometriosis, cirrhosis, hepatitis, hepatic failure or calculus;
  • a G protein-coupled receptor protein which has the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9, relative to a mammal, a partial peptide thereof, or a salt thereof
  • sugar chains that have affinity for sugar chains
  • a compound that alters the expression level of a G protein-coupled receptor protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9 in a mammal Or a method for preventing and / or treating cancer, benign prostatic hyperplasia, male gonad dysfunction, infertility, premature birth, endometriosis, cirrhosis, hepatitis, hepatic insufficiency or calculus, characterized by administering an effective amount of a salt thereof.
  • Or (73) a method characterized by administering to a mammal an effective amount of a protein or a salt thereof having affinity for sugar chains, cancer, benign prostatic hyperplasia, male gonad dysfunction, infertility, How to prevent and / or treat preterm birth, endometriosis, cirrhosis, hepatitis, liver failure or calculus, or to induce labor,
  • prophylactic and / or therapeutic agent for cancer prostatic hyperplasia, male gonadal dysfunction, infertility, premature birth, endometriosis, cirrhosis, hepatitis, hepatic failure or calculus, or a parturition inducer G protein-coupled receptor protein having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9, binding of a partial peptide or a salt thereof to a protein having affinity for a sugar chain Use of a compound or a salt thereof that changes the property,
  • SEQ ID NO: 9 contains a nucleotide sequence complementary to a polynucleotide encoding a protein having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by 9 or a partial peptide thereof, or a part thereof.
  • a prophylactic and / or therapeutic agent for the treatment of cancer benign prostatic hyperplasia, male gonadal dysfunction, infertility, premature birth, endometriosis, cirrhosis, hepatitis, hepatic insufficiency or calculus, or a parturition inducer G protein-coupled receptor protein having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9 or Use of a polynucleotide comprising a polynucleotide encoding a partial peptide of
  • Amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25 or SEQ ID NO: 27 A G protein-coupled receptor protein or a salt thereof, containing the same or substantially the same amino acid sequence as
  • SEQ ID NO: 14 From the base sequence represented by SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26 or SEQ ID NO: 28 DNA that hybridizes under high stringent conditions with DNA
  • EDG-1 receptor was highly expressed in vascular endothelial cells and EDG-2 receptor was highly expressed in vascular smooth muscle cells. Based on this finding, the present invention provides an EDG-1 receptor agonist using vascular endothelial cells or vascular smooth muscle cells or an EDG-2 receptor agonist using vascular smooth muscle cells. A screening method is provided.
  • a kit for screening an EDG-2 receptor agonist or an angiosperm gonist comprising a vascular smooth muscle cell, (101) EDG-2 receptor or gonzo gonist obtained by using the screening method according to (98) or the screening kit according to (100),
  • EDG-1 receptor monoagonist obtained by using the screening method according to (93) or the screening kit according to (95) above, or the screening method according to (98) above, for a mammal. And preventing atherosclerosis, myocardial infarction, cerebral infarction or ischemic disease, characterized by administering an effective amount of EDG-2 receptor, which is obtained using the screening kit described in (100) above. Z or treatment method,
  • FIG. 1 shows the expression of dj287G14.2 in various cell lines.
  • FIG. 2 shows the expression distribution of dj287G14.2 receptor mRNA in various human tissues.
  • FIG. 3 shows the amino acid sequence of dj 287G14.2 receptor. .
  • FIG. 4 shows the amino acid sequence of the dj287G14.2 receptor. It is a continuation of Figure 3.
  • FIG. 5 shows the nucleotide sequence of the DNA encoding dj287G142 receptor.
  • FIG. 6 shows the nucleotide sequence of the DNA encoding dj287G14.2 receptor. This is a continuation of Figure 5.
  • FIG. 7 shows the nucleotide sequence of the DNA encoding the dj287G14.2 receptor. This is a continuation of Figure 6.
  • FIG. 8 shows the nucleotide sequence of the DNA encoding dj287G14.2 receptor. See Figure 7.
  • FIG. 9 shows the results of examining the effect of lectin on cAMP production in CHO cells expressing the dJ287G14.2-GFP fusion protein.
  • the horizontal axis represents lectin concentration, and the vertical axis represents cAMP production.
  • ConA indicates concanapalin A
  • Lenti1 indicates rat bean lectin
  • Pea indicates enduma bean lectin
  • FSK indicates forskolin.
  • Mean standard deviation (n 2).
  • FIG. 10 shows the results of examining the effect of lectin on the amount of cAMP production in mock CH0 cells.
  • ConA indicates concanavalin A
  • Lenti I indicates lentil lectin
  • Pea indicates enduma lectin
  • FSK indicates forskolin.
  • Mean soil standard deviation (n 2).
  • FIG. 11 shows the results of observing the fluorescence image of GFP of the dJ287G14.2-GFP fusion protein expressed in CH ⁇ cells using a confocal microscope (Leica).
  • FIG. 12 shows the results of observing the fluorescence image of GFP when concanapalin A was added to the dJ287G14.2-GFP fusion protein expressed in CHO cells using a confocal microscope (Leica). BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
  • the present invention is characterized by identifying a gene whose expression is characteristically enhanced or decreased in a certain cell or tissue by collectively and quantitatively analyzing the expression level of each of a plurality of genes.
  • genes whose expression is characteristically enhanced or decreased in a certain cell or tissue in the gene family can be expressed. It is characterized by calculating the absolute value of the quantity.
  • “characteristically enhanced or decreased gene expression” means a normal cell or a group. This means that physiological significance is expressed in a relatively large or small amount as compared to the expression of a gene in a tissue.
  • the gene family to be targeted in the present invention is not particularly limited.
  • a G protein-coupled receptor gene family for example, a G protein-coupled receptor gene family, a tyrosine kinase type receptor gene family, an ion channel gene family, or a transcription factor, a transporter , Protein kinases, protein phosphatases, proteinases, heat shock proteins, gene families related to either ATPase or DNA binding proteins.
  • a plurality of genes means two or more genes, and the upper limit is not particularly limited as long as it is practicable, but is usually 20,000 to tens of thousands, preferably 2 to 100, more preferably 10 to 100. 800, more preferably 100 to 300 genes.
  • the expression analysis of the gene of the present invention comprises, at each of a plurality of reaction sites, preferably at each reaction site of a reaction device having a plurality of reaction sites, an mRNA sample that can contain a plurality of target mRNAs;
  • the amplification reaction is carried out by bringing the respective pairs of primers corresponding to the respective target mRNAs into contact with the respective amplification reagents, and the amount of the obtained amplification product is measured.
  • this method will be described.
  • One embodiment of the present invention is a method for analyzing gene expression by quantifying mRNA of a plurality of target genes that can be contained in an mRNA sample.
  • the “mRNA sample” refers to a sample containing mRNA, for which the type and amount of mRNA contained in the sample are to be measured.
  • the mRNA sample of interest in the present invention is a sample for which the expression level of a specific gene in the sample is to be analyzed, for example, human or other mammals (eg, Rat, mouse, egret, sheep, pigeon, pig, cat, cat, dog, monkey, etc.) or their cultured cell lines.
  • human or other mammals eg, Rat, mouse, egret, sheep, pigeon, pig, cat, cat, dog, monkey, etc.
  • Such tissues include, for example, the brain, various parts of the brain (eg, olfactory bulb, acrosomal nucleus, basal sphere, hippocampus, thalamus, hypothalamus, hypothalamic nucleus, cerebral cortex, medulla, cerebellum, occipital lobe, frontal lobe, Temporal lobe, putamen, caudate nucleus, brain stain, substantia nigra), spinal cord, pituitary, stomach, stomach, kidney Gut, liver, gonad, thyroid, gall bladder, bone marrow, adrenal gland, skin, muscle, lung, digestive tract (eg, large intestine, small intestine), blood vessels, heart, thymus, spleen, submandibular gland, peripheral blood, peripheral blood, prostate, Testes, testes, ovaries, placenta, uterus, bones, joints, skeletal muscle, etc.
  • the presence or absence of the target mRNA and the amount thereof can be measured by a single treatment from the mRNA containing a plurality of mRNAs.
  • the use of mRNA samples from patients suffering from a particular disease facilitates the identification of genes (eg, GPCR genes) involved in the disease.
  • genes eg, GPCR genes
  • the present invention According to the method, since the expression level of each gene can be examined by a single quantitative operation, it is easy to specify the involved gene / protein. .
  • the quantification of the gene expression amount or the calculation of the absolute value of the gene expression amount can be performed according to the method for quantifying the target mRNA described below.
  • the plurality of reaction sites is not particularly limited as long as it is two or more reaction sites, but is usually 20,000 to tens of thousands, preferably 2 to 100, more preferably 10 to 800, More preferably, there are 10 to 300 reaction sites.
  • each amplification reagent containing a primer pair corresponding to the target mRNA is reacted at a time.
  • a reaction device having a plurality of reaction sites is preferably used, and the reaction between the mRNA sample and each amplification reagent is performed at each reaction site.
  • the configuration and structure of the reaction device used in the present invention is limited as long as it has two or more reaction sites so that the mRNA sample and each amplification reagent can be reacted at once. Not done.
  • the reaction device used in the present invention and Then, for example, a plate having a plurality of holes, a reaction device including a plurality of slide glasses, a reaction device including a plurality of test tubes, and the like are included.
  • a plate having a plurality of holes can be preferably used. These plates are determined by the number of primer pairs to be used, and commercially available 96-well or 384-well plates are preferably used. However, a reaction apparatus having a desired number of reaction sites according to the number of primer pairs can be used.
  • the method of the present invention can be carried out by using two or more 96-well or 384-well plates commercially available. (Amplification reagent)
  • Each amplification reagent used in the present invention includes, for example, a pair of primers corresponding to the target mRNA, a probe corresponding to the target mRNA, a DNA polymerase, a buffer and the like.
  • the ⁇ pair of primers corresponding to the target mRNA '' used in the present invention refers to a primer which is complementary or substantially complementary to one strand of the exon region of the target gene sequence encoding the target mRNA.
  • a primer pair consisting of one primer and a second primer complementary or substantially complementary to the other strand of the exon region of the target gene sequence.
  • at least two or more of these primer pairs can be used to detect at once the presence or absence and the amount of mRNA transcribed from the target gene in the mRNA sample. Therefore, the efficiency of the quantification method of the present invention increases as the number of primer pairs used increases.
  • the primer pair used is not particularly limited because it may be adjusted according to the number of target mRNAs.
  • the primer pair is composed of 10 to 800 primer pairs.
  • the primer pair group used consists of 10 to 300 primer pairs. If the number of primer pairs is large, a different set of amplification reagents may be set on multiple plates (for example, 2 to 10 plates), and the quantitative reaction may be performed multiple times. it can.
  • the target gene is a G protein-coupled gene.
  • target mRNA is a gene belonging to a family such as G protein-coupled receptor, tyrosine kinase-type receptor, and ion channel.
  • mRNA a gene belonging to a family such as G protein-coupled receptor, tyrosine kinase-type receptor, and ion channel.
  • each amplification reagent comprising a primer pair corresponding to the mRNA belonging to the family 1 such as the target G protein-coupled receptor, the tyrosine phosphatase receptor, the ion channel, etc.
  • the G protein-coupled receptor contained in the mRNA sample was analyzed by contacting it at each reaction site of the reaction device to amplify it and quantifying the mRNA amplification product. It can measure the expression level of genes belonging to families such as phosphorylase receptor and ion channel.
  • all known primer pairs corresponding to gene mRNA belonging to the family 1 such as G protein-coupled receptor, tyrosine kinase type receptor, ion channel, etc.
  • amplification reagents containing the respective primer pairs are set at each reaction site, and only one GMP-coupled receptor, tyrosine phosphorylation oxidase type receptor, and ion It is possible to know how much the mRNA belonging to a family such as a channel was produced.
  • a different set of amplification reagents can be divided and set on a plurality of plates, and the quantitative reaction can be performed multiple times.
  • G protein-coupled receptors or genes
  • Adenosine receptor AA 2A ; A 2B ; A 3
  • Adrenoceptors ⁇ ; ⁇ ; alD; ⁇ 2 ⁇ ; ⁇ 2 ⁇ ;
  • Angiotensin receptor ATI; AT2
  • Keniotactic peptide (Cheniotactic) receptor C3a; C5a; _ fMLP
  • Glycoprotein hormone receptor FSH; LSH; TSH
  • Lysophospholipid receptor edgl; edg2; edg3; edg4
  • Neuropeptide Upsilon receptor ⁇ 1; ⁇ 2; ⁇ 4; ⁇ 5; ⁇ 6
  • P2Y receptor P2Y ,; P2Y 2 ; ⁇ 2 ⁇ P2Y 6 ; P2Y U ; P2Y 12
  • Peroxisome prol iferator activation receptor PPAR-; PPAR-j3; PPAR-r
  • Protease-activated receptor PARI; PAR2; PAR3; PAR4
  • Vasoactive intestinal peptide and pituitary adenylate cyclase activating peptide Receptor VPAC ,; VPAC 2 ; PAC,
  • genes are known as members of a family such as tyrosine kinase type receptor and ion channel gene.
  • Ion channel Na + channel (Type I; Type II / Type IIA; Type III; SCLll / NaG; PNl; NaCh6; NaDRG; SkMl / ⁇ l, SkM2), K + channel (Kv; EAG; KQT; IRK; ROMK; GIRK; K ATP, etc.), C a 2+ channel (H 1G; a IE; a IS: alC; a ID; a IB; alA; IP3; ryanodine receptor etc.); C 1-channel (GABA A ; GABA C; glycine receptors; c1C0; C1C1; etc. CFTR), non-selective cation channel (nACM; 5-HT 3; negation DA; AMPA; P 2X ATP; CNG etc.)
  • Tyrosine kinase enzyme receptor insulin receptor; EGF receptor, etc.
  • a group of G protein-coupled receptors By using a group of primer pairs corresponding to synphosphorylase receptor receptor or mRNA of the gene belonging to the ion channel family, a single quantitative operation enables the group of G protein-coupled receptors and tyrosine phosphorylation.
  • G protein-coupled receptor, tyrosine kinase type receptor, or gene belonging to family one such as ion channel, which is highly expressed in genes belonging to family such as oxidase type receptor or ion channel Can be specified.
  • drug discovery targets include (1) proteins that bind small molecules (GPCR, nuclear receptors, ion channels, etc.), and (2) catalytic activity on small or high molecular substrates. Enzymes and (3) proteins that bind to polymers such as proteins, nucleic acids, and polysaccharides can be classified into three types. Therefore, according to this classification, the following gene grouping can be performed.
  • Adrenergic receptor ; acetylcholine receptor; histamine receptor; dopamine receptor; serotonin receptor; glutamine receptor; endoserine receptor; vasopressin receptor; C a 2+ channel; N a + channel: C 1 _ channel
  • HMG-CoA reductase HMG-CoA reductase
  • angiotensin converting enzyme thromboxane synthase
  • proton pump aldose reductase
  • Protein kinase protein phosphatase
  • HIV reverse transcriptase fungal squalene epoxidase
  • DNA gyrase ⁇ -lactamase
  • Insulin receptor Yuichi Erythropoietin receptor; G-CSF receptor; Growth hormone receptor; Interferon receptor-1; Growth factor receptor Yuichi HER2; Tumor necrosis factor TNF receptor Yuichi; Platelet integrin GP II b / I W
  • a primer pair for amplifying a target mRNA can be easily designed by those skilled in the art based on the sequence of the target GPCR gene (for example, Genome Res. 1996 Oct; 6 (10): 986-94).
  • the method for quantifying mRNA used in the present invention can be used for various uses other than the functional analysis of hGPCR.
  • a specific disease can be diagnosed by using a set of a plurality of amplification reagents each containing a primer pair for detecting mRNA produced by a known disease gene.
  • the expression level of each gene can be accurately measured, there is an advantage that a more accurate diagnosis can be performed as compared with a known method.
  • a probe corresponding to the target mRNA used in the present invention can be easily designed by those skilled in the art according to the target sequence (see, for example, Genome Res. 1996 Oct; 6 (10): 986-94).
  • Suitable oligonucleotide probes for use in the present invention preferably have a length of about 15 to about 50 nucleotides, more preferably about 25 to about 35 nucleotides.
  • Oligonucleotide probes can be labeled by incorporating a chemical or the like that can be detected by biochemical, immunochemical, or chemical means.
  • Useful labels include radioactive isotopes such as 32 P, fluorescent substances such as fluorescamine and fluorescein isothiocyanate, luminescent substances such as luminol and luciferin, jQ-galactosidase, peroxidase, and alkaline phosphatase.
  • Examples of the DNA polymerase used in the present invention include a thermostable DNA polymerase having a reverse transcription activity and a 5 ′ ⁇ 3 ′ exonuclease activity, such as rTth DNA polymerase.
  • a known or commercially available buffer is used (for example, a buffer manufactured by PE Biosystems; see Genome Res. 1996 Oct; 6 (10): 986-94).
  • the target mRNA that can be contained in the mRNA sample is It is amplified using an amplification reagent containing a primer pair for amplifying the target mRNA.
  • amplification of the target mRNA is performed using the known polymerase chain reaction (PCR) (U.S. Pat. Nos. 4,683,195; 4,683,202; , 965, 188, etc.).
  • Amplification of mRNA can be performed by first reverse transcripting the target mRNA using, for example, viral reverse transcriptase, and amplifying the resulting cDNA.
  • the amplification of mRNA is performed using reverse transcription-one polymerase chain reaction (RT-PCR) (US Pat. Nos. 5,310,652; 5,322,770; 5, 561, 058; 5, 641, 864; 5, 693, 517, etc.).
  • mRNA amplification methods other than the polymerase chain reaction are used.
  • amplification methods include, for example, the strand displacement method (see US Pat. No. 5,455,166), transcription-based amplification (TAS) (US Pat. No. 5,437,990; , No. 409,818; No. 5,399,491), and the self-sustained sequence replication method (3SR) (see W092 No. 08800, etc.).
  • reaction conditions for these amplification reactions can be easily set by those skilled in the art according to the type of reagent used and the like. (Quantification method of target mRNA)
  • the amount of the above-mentioned mRNA amplification product is measured.
  • the quantification of the amplification product is preferably performed by a method using a probe.
  • the method is performed by a method using a probe labeled with a fluorescent substance.
  • the quantification of the target mRNA is performed by using the “TaqMan method” or the “5 ′ nuclease assay” (Processings of the National Academy of Sciences). (See Sciences of U.S.A., Vol. 88, pp. 7276-7280 (1991); U.S. Patent Nos. 5,210,015; 5,487,972; 5,804,375, etc.) .
  • T aq M an In the Sai method, a probe labeled at the 5 'end is used. This probe is also modified at the 3 'end to prevent the probe from acting as a primer for DNA synthesis. Examples of this modification include addition of a phosphate group or a fluorescent substance to the terminal.
  • Amplification of the target mRNA is performed using a DNA polymerase having 5 ′ ⁇ 3 ′ exonuclease activity, for example, Tth DNA polymerase.
  • Probes that hybridize to the target mRNA downstream of the primer are degraded by the 5'-3 'exonuclease activity of DNA polymerase during the amplification reaction. Each time a new target region is amplified, the probe is degraded and the label is released. By quantifying the released labeling substance, the amount of target mRNA is indirectly measured.
  • the probe is labeled at the 5 'and 3' ends with two fluorescent substances, one of which can quench the fluorescence of the other substance. While this probe is hybridized to type I DNA, the fluorescence is quenched by the interaction of two fluorescent substances, but the DNA is degraded by the 5 'to 3' exonuclease activity of the DNA polymerase and becomes fluorescent. Will be issued. The fluorescence increases with the progress of the amplification reaction, and the increase in the fluorescence is monitored.
  • the quantification of the sample containing the target mRNA is performed based on a “standard curve” prepared by amplifying and using a sample containing a known amount of the target mRNA.
  • the standard curve is used to calculate the input copy number from the signal generated during amplification.
  • the copy number of an unknown target sequence in a sample is estimated by using the standard curve described above to calculate the copy number determined to produce a signal equal to that previously observed.
  • the concentration of the target sequence in the sample can be calculated from the input copy number and the sample size determined before the reaction (see Patent Publication No. 2001-204483, etc.).
  • the present invention also relates to a primer pair kit and an mRNA quantification kit used for performing the method of the present invention.
  • the primer pair kit of the present invention comprises a first primer that is complementary or substantially complementary to one strand of an exon region of a target gene sequence, and a first primer that is complementary to the other strand of the exon region of the target gene sequence.
  • a kit comprising two or more primer pairs consisting of a substantially complementary second primer. If such a kit is prepared in advance, the quantification method of the present invention can be quickly performed.
  • the preferred primer pair kit of the present invention has a primer pair corresponding to mRNA transcribed from a human G protein-coupled receptor protein gene.
  • the primer pair kit includes a primer pair group consisting of 10 to 800 primer pairs or 10 to 300 primer pairs.
  • an mRNA quantification kit in which each reaction site of a reaction device having a plurality of reaction sites is filled with each amplification reagent containing a primer pair corresponding to a target mRNA.
  • the target gene in the kit is a disease-related gene.
  • the kit further comprises a fluorescent probe, and even more preferably, the kit comprises a Tth DNA polymerase.
  • kits can be used, if necessary, for example, an agent that catalyzes the synthesis of a primer extension product, a nucleoside triphosphate as a substrate, a means for labeling (for example, if the label is biotin, avidin monoenzyme And a buffer suitable for PCR or hybridization reaction, and the like.
  • gene expression analysis is performed using an mRNA sample collected from a patient, and the characteristic expression of a specific disease-related gene is detected, whereby the patient is identified.
  • the affected disease can be diagnosed.
  • the expression of genes belonging to a specific disease-related gene family particularly, a family of specific disease-related GPCR genes
  • the expression of any gene among a plurality of specific disease-related genes is characteristic. Can be identified by a single operation.
  • a medicine containing an agonist, an antagonist or an antibody against the gene product of the gene specified in this way, or a DNA encoding the gene product is particularly effective for the patient to be diagnosed.
  • a plurality of abnormally expressed genes can be specified, and even the expression levels of the genes can be accurately quantified. Therefore, a plurality of agonists, angelic gonists, or antibodies can be selected as a suitable formulation for the patient, and the amount of the formulation can be adjusted according to the expression level of the disease-related gene. That is, according to the present invention, it is possible to prepare a so-called tailor-made medicine prescribed only for the patient.
  • the amount of the receptor protein in the patient's body is increased by transplanting the cells into the patient, and the like. The action can be fully exerted.
  • the medicament of the present invention is effective for the prevention or treatment of a disease associated with the specified gene, and includes, for example, central diseases (eg, Alzheimer's disease, dementia, eating disorders, etc.), endocrine diseases (eg, hypertension, Gonad dysfunction, thyroid dysfunction, pituitary dysfunction, etc.), metabolic disorders (eg, diabetes, lipid metabolism disorders, hyperlipidemia, etc.), cancer (eg, non-small cell lung cancer, ovarian cancer, prostate cancer, gastric cancer, It is useful for prevention and / or treatment of bladder cancer, breast cancer, cervical cancer, colon cancer, rectal cancer, etc.).
  • central diseases eg, Alzheimer's disease, dementia, eating disorders, etc.
  • endocrine diseases eg, hypertension, Gonad dysfunction, thyroid dysfunction, pituitary dysfunction, etc.
  • metabolic disorders eg, diabetes, lipid metabolism disorders, hyperlipidemia, etc.
  • cancer eg, non-small cell lung cancer, ovarian cancer, prostate cancer, gastric cancer, It is useful
  • a gene product eg, a receptor protein of the gene specified in the present invention
  • an agonist, an agonist or an antibody thereof, or a DNA encoding the gene thereof is used as the above-mentioned prophylactic and / or therapeutic agent, it can be formulated according to a conventional method.
  • DNA when DNA (hereinafter sometimes abbreviated as DNA of the present invention) is used as the above-mentioned prophylactic and / or therapeutic agent, the DNA may be used alone or in a retrovirus vector, an adenovirus vector, or an adenovirus vector. After insertion into a suitable vector such as a sheathed virus vector, it can be carried out in a conventional manner.
  • the DNA can be administered as it is or with a supplement such as a gene gun or a hydrogel catheter, together with adjuvants for promoting uptake.
  • the medicament used in the present invention can be orally administered as sugar-coated tablets, capsules, elixirs, microcapsules, etc., as required, or water or other pharmaceutically acceptable. It can be used parenterally in the form of a sterile solution with liquid, or as an injection, such as a suspension.
  • the medicament of the present invention is required for the formulation of a generally accepted physiologically acceptable carrier, flavoring agent, excipient, vehicle, preservative, stabilizer, binder and the like. It can be manufactured by mixing in a unit dosage form. The amount of the active ingredient in these preparations is such that a suitable dosage in the specified range can be obtained.
  • Additives that can be incorporated into tablets, capsules, etc. include, for example, binders such as gelatin, corn starch, tragacanth, gum arabic, excipients such as crystalline cellulose, corn starch, gelatin, alginic acid, etc. Swelling agents such as magnesium stearate, sweeteners such as sucrose, lactose or saccharin, and flavoring agents such as peppermint, cocoa oil or cellulose.
  • the above type of material may further contain a liquid carrier such as oil and fat.
  • Sterile compositions for injection can be formulated according to standard pharmaceutical practice, such as dissolving or suspending the active substance in vehicles such as water for injection, and naturally occurring vegetable oils such as sesame oil and coconut oil. it can.
  • aqueous liquid for injection include physiological saline, isotonic solution containing glucose and other adjuvants (eg, D-sorbitol, D-mannitol, sodium chloride, etc.) and the like.
  • Agent for example, alcohol (eg, It may be used in combination with ethanol), polyalcohol (eg, propylene glycol, polyethylene dalicol), nonionic surfactant (eg, polysorbate 80 TM , HCO-50).
  • the oily liquid for example, sesame oil, soybean oil and the like are used, and may be used in combination with solubilizers such as benzyl benzoate and benzyl alcohol.
  • the prophylactic and Z or therapeutic agents include, for example, buffers (eg, phosphate buffer, sodium acetate buffer), soothing agents (eg, benzalkonium chloride, proforce hydrochloride, etc.), stabilizers (eg, , Human serum albumin, polyethylene glycol, etc.), preservatives (eg, benzyl alcohol, phenol, etc.), antioxidants and the like.
  • buffers eg, phosphate buffer, sodium acetate buffer
  • soothing agents eg, benzalkonium chloride, proforce hydrochloride, etc.
  • stabilizers eg, Human serum albumin, polyethylene glycol, etc.
  • preservatives eg, benzyl alcohol, phenol, etc.
  • the preparations obtained in this way are safe and low toxic, for example, in humans and other mammals (eg, rats, mice, egrets, higgs, bush, pests, cats, dogs, monkeys, etc.). Can be administered.
  • mammals eg, rats, mice, egrets, higgs, bush, pests, cats, dogs, monkeys, etc.
  • the dose of the prophylactic and / or therapeutic agent of the present invention varies depending on the administration subject, target organ, symptoms, administration method, and the like.
  • oral administration in general, for example, in a cancer patient (as 60 kg), About 0.1 mg to 100 mg per day, preferably about 1.0 to 5 Omg, more preferably about 1.0 to 2 Omg.
  • parenteral administration the single dose varies depending on the subject of administration, target organ, symptoms, administration method, etc. ), It is convenient to administer about 0.01 to 30 mg, preferably about 0.1 to 2 Omg, more preferably about 0.1 to 1 Omg per day by intravenous injection. In the case of other animals, the dose can be administered in terms of 60 kg.
  • the dosage of the DNA of the present invention varies depending on the administration subject, the target organ, the condition, the administration method, and the like. However, in the case of oral administration, for example, in a cancer patient (as 6 O kg), one dose is generally used. It is about 0.1 mg to 100 mg per day, preferably about 1.0 to 50 mg, more preferably about 1.0 to 20 mg per day. In the case of parenteral administration, the single dose varies depending on the administration target, target organ, symptoms, administration method, etc.
  • the dose can be administered in terms of 60 kg.
  • the novel use of the receptor protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as that obtained by using the gene expression analysis method of the present invention, for example, the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9 is described below. Will be described.
  • the receptor protein used in the present invention is a receptor protein having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9 (hereinafter, also referred to as the receptor protein of the present invention). It is.
  • the protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9 is a human-derived dj287G14.2 receptor protein.
  • the human-derived dj287G14.2 receptor has the same amino acid sequence as the protein described in WO201 / 187207.
  • the present inventors have proposed proteins that show an affinity for sugar chains such as asparagine-linked sugar chains and serine / threonine-linked sugar chains (eg, ConA (concanapalin A), Lentil lect in (lentil lectin), Pea lect in (endumamelectin), Datura lect in (chiyosenasa agalectin), Maackia Amurensis lect in (innuenji lectin) and lectins such as phytohemagglutinin are one of the ligands of the dj 287G14.2 receptor. I confirmed that for the first time.
  • ConA concanapalin A
  • Lentil lect in lentil lectin
  • Pea lect in endumamelectin
  • Datura lect in chiyosenasa agalectin
  • Maackia Amurensis lect in innuenji lectin
  • lectins such as phytohemagglutin
  • the receptor protein of the present invention includes, for example, all cells of humans and other mammals (for example, guinea pigs, rats, mice, rabbits, pigs, sheep, sheep, monkeys, etc.) (eg, retinal cells, splenocytes, Nerve cells, glial cells, knee 3 cells, bone marrow cells, mesangial cells, Langerhans cells, epidermal cells, epithelial cells, endothelial cells, fibroblasts, fiber cells, muscle cells, fat cells, immune cells (eg, macrophages, T Cells, B cells, natural killer cells, mast cells, neutrophils, basophils, eosinophils, monocytes, leukocytes), megakaryocytes, synovial cells, chondrocytes, bone cells, osteoblasts, osteoclasts , Mammary gland cells, hepatocytes or stromal cells, or their precursors, stem cells or cancer cells (eg, breast cancer cells) Cell line (GI-101),
  • substantially identical amino acid sequence refers to, for example, about 50% or more, preferably about 60% or more, more preferably about 70% or more, more preferably about the amino acid sequence to be compared.
  • the protein containing an amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9 include, for example, a protein containing an amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9; : A protein having substantially the same activity as the protein containing the amino acid sequence represented by 9 is preferred. Examples of substantially the same activity include a ligand binding activity and a signal transduction activity.
  • Substantially the same means that their activities are the same in nature. Therefore, activities such as ligand binding activity and signal transduction activity are equivalent (eg, about 0.01 to 100 times, preferably about 0.5 to 20 times, more preferably about 0.5 to 2 times). Although it is preferable, the quantitative factors such as the degree of these activities and the molecular weight of the protein may be different.
  • the measurement of the activity such as the ligand binding activity and the signal information transmission activity can be performed according to a known method.For example, the measurement can be performed according to a ligand determination method described later, which is a screening method. it can.
  • the receptor protein of the present invention includes (1) SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21 1 or 2 or more (preferably about 1 to 30, more preferably about 1 to 10) in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25 or SEQ ID NO: 27.
  • an amino acid sequence in which several (1 to 5) amino acids have been deleted (2) SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 17 : 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25 or SEQ ID NO: 27 1 or 2 or more (preferably about 1 to 30 or more)
  • (3) SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25 or 1 or 2 or more in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 27 (preferably about 1 to 30, more preferably about 1 to 10, and still more preferably several (1 to 5))
  • a protein containing an amino acid sequence in which the above amino acid is substituted with another amino acid, or (4) an amino acid sequence obtained by combining them is also used.
  • the receptor protein in this specification has an N-terminus (amino terminus) at the left end and a C-terminus (carboxyl terminus) at the right end.
  • the C-terminus of the receptor protein of the present invention may be any one of a carboxylate group (—COOH), a carboxylate (one COO), an amide (one C ⁇ NH 2 ), and an ester (one COOR).
  • R in the ester e.g., methyl, Echiru, n- propyl, alkyl groups such as isopropyl, n- butyl, for example, C 3, such as hexyl Shikurobe pentyl, to consequent opening - 8 cycloalkyl group, for example, phenyl, C 6 _ 12 Ariru group such as a one-naphthyl, for example, benzyl, full Eniru one such phenethyl C] _ 2 alkyl or flight, such as single naphthylmethyl ⁇ - Nafuchiru C ⁇ 2
  • Ararukiru group such as an alkyl group, such as pivaloyl I Ruo carboxymethyl group which is generally used as an oral ester.
  • the receptor protein of the present invention has a carboxyl group (or carboxylate) at a position other than the C-terminus
  • a protein in which the carboxyl group is amidated or esterified is also included in the receptor protein of the present invention.
  • the ester in this case, for example, the above-mentioned C-terminal ester and the like are used.
  • the receptions evening one protein of the present invention is the protein mentioned above, Amino group protecting groups Mechionin residues of N-terminal (e.g., C _ 6 Ashiru such formyl group, which C 2 _ 6 Arukanoiru group of Asechiru Group), the N-terminal is cleaved in vivo, and the daltamyl group formed is pyroglutamine-oxidized, the substituent on the side chain of the amino acid in the molecule (eg, 1 OH, _SH, amino group) , I imidazole group, indole group, etc.
  • Mechionin residues of N-terminal e.g., C _ 6 Ashiru such formyl group, which C 2 _ 6 Arukanoiru group of Asechiru Group
  • the N-terminal is cleaved in vivo
  • the daltamyl group formed is pyroglutamine-oxidized
  • Guanijino group suitable protecting group (e.g., ho mill group, C 2 such Asechiru - C, such as 6 Arukanoiru group; those protected by such _ 6 Ashiru group),
  • a complex protein such as a so-called glycoprotein to which a sugar chain is bound is also included.
  • receptor protein of the present invention include, for example, human-derived dj287G14.2 receptor protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: : 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25 or mouse derived dj287G14.2 receptor protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 27, etc. .
  • the mouse-derived dj287G14.2 receptor protein is a novel protein.
  • the receptor protein of the present invention or a salt thereof can be produced from the above-described human or mammalian cells or tissues by a known method for purifying a receptor protein, or a DNA encoding the receptor protein of the present invention described later can be prepared. It can also be produced by culturing a transformant containing the transformant. Further, the protein can also be produced according to the protein synthesis method described later or according thereto.
  • the human or mammalian tissues or cells are homogenized and then extracted with an acid or the like, and the extract is subjected to reverse phase chromatography, ion exchange chromatography, etc. Purification and isolation can be performed by combining the above chromatography.
  • partial peptide of the present invention may be any peptide as long as it has a partial amino acid sequence of the above-described receptor protein of the present invention.
  • partial peptide may be any peptide as long as it has a partial amino acid sequence of the above-described receptor protein of the present invention.
  • the partial peptide of the receptor protein of the present invention having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9 is an extracellular region (hydrophilic region) in the hydrophobicity plot analysis. It is a peptide containing the part analyzed. Further, a peptide partially containing a hydrophobic (Hydrophobic) site can also be used. A peptide containing individual domains may be used, but a peptide containing a plurality of domains at the same time may be used.
  • the number of amino acids of the partial peptide of the present invention is at least 20 or more, preferably 50 or more, more preferably 100 or more of the above-described constituent amino acid sequences of the receptor protein of the present invention.
  • Peptides having an amino acid sequence are preferred.
  • a substantially identical amino acid sequence refers to an amino acid sequence of about 50% or more, preferably about 60% or more, more preferably about 70% or more, further preferably about 80% or more, and particularly preferably Represents an amino acid sequence having about 90% or more, most preferably about 95% or more homology.
  • substantially the same receptor binding activity has the same meaning as described above. “Substantially the same receptor binding activity” can be measured in the same manner as described above.
  • the partial peptide of the present invention may contain one or more (preferably Preferably, about 1 to 10 amino acids, more preferably several (1 to 5) amino acids are deleted, or the amino acid sequence has one or more or more amino acids (preferably 1 to 20 amino acids). Degree, more preferably about 1 to 10, more preferably several (1 to 5) amino acids, or one or two or more amino acids in the amino acid sequence (preferably, 1 to 10). About 10 amino acids, more preferably several amino acids, and still more preferably about 1 to 5 amino acids may be substituted with other amino acids.
  • the C-terminus force Rupokishiru group (_ COOH), Cal Bokishireto (- COO "), may be in the form of an amide (one CO NH 2) or an ester (one COOR).
  • the partial peptide of the present invention has a N-terminal methionine residue in which the amino group of the methionine residue is protected with a protecting group, and the N-terminal side is cleaved in vivo to produce G1n is pyroglutamine-oxidized, the amino acid in the molecule has a substituent on the side chain protected by an appropriate protecting group, or a complex peptide such as a so-called glycopeptide to which a sugar chain is bound. included.
  • Examples of the salt of the receptor protein of the present invention or its partial peptide include a physiologically acceptable salt with an acid or a base, and a physiologically acceptable acid addition salt is particularly preferable.
  • Such salts include, for example, salts with inorganic acids (eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid) or organic acids (eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid) , Succinic acid, tartaric acid, citric acid, malic acid, oxalic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid) and the like.
  • inorganic acids eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid
  • organic acids eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid
  • Succinic acid tartaric acid, citric acid, malic acid, ox
  • the partial peptide of the present invention or a salt thereof can be produced according to a known peptide synthesis method or by cleaving the GPCR of the present invention with an appropriate peptidase.
  • a method for synthesizing a peptide for example, any of a solid phase synthesis method and a liquid phase synthesis method may be used. That is, the target peptide can be produced by condensing a partial peptide or amino acid capable of constituting the GPCR of the present invention with the remaining portion, and removing the protective group when the product has a protective group.
  • Known methods for condensation and elimination of protecting groups include, for example, the methods described in a) to e) below.
  • the polynucleotide encoding the receptor protein of the present invention may be any polynucleotide containing a base sequence (DNA or RNA, preferably DNA) encoding the above-described receptor protein of the present invention.
  • the polynucleotide is RNA such as DNA or mRNA encoding the receptor protein of the present invention, and may be double-stranded or single-stranded. In the case of double-stranded, it may be double-stranded DNA, double-stranded RNA or DNA: RNA hybrid. If single stranded, it may be the sense strand (ie, the coding strand) or the antisense strand (ie, the non-coding strand).
  • RNA of the receptor protein of the present invention can be quantified.
  • DNA encoding the receptor protein of the present invention examples include genomic DNA, 1, cDNA derived from the above-mentioned cells or tissues, It may be either a cell or tissue-derived cDNA library or synthetic DNA.
  • the vector used for the library may be any of pacteriophage, plasmid, cosmid, phagemid and the like.
  • RT-PCR method Transcriptase Polymerase Chain Reaction
  • the DNA encoding the receptor protein of the present invention for example, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 26 or SEQ ID NO: 28, or SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26 or DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 28 and high stringent conditions
  • a receptor having a DNA that hybridizes under the above, and having substantially the same activity as a receptor protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9 (eg, ligand binding activity, signal transduction action, etc.) D N A can be mentioned that encode protein.
  • SEQ ID NO: 8 SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26 or Examples of the DNA that hybridizes with the DNA having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 28 under high stringent conditions include, for example, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26 or SEQ ID NO: 28 and about 70% or more, preferably about 80% or more, more preferably DNA containing a nucleotide sequence having a homology of about 90% or more, more preferably about 95% or more is used.
  • Hybridization is performed according to a known method or a method analogous thereto, for example, the method described in Molecular Cloning 2nd (J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989). Can be.
  • the procedure can be performed according to the method described in the attached instruction manual. More preferably, it can be performed under high stringent conditions.
  • the “high stringent conditions” include, for example, a sodium concentration of about 19 to 40 mM, preferably about 19 to 20 mM, and a temperature of about 50 to 70, preferably about 60 to 70 mM.
  • the condition of 0 to 65 ° C is shown. In particular, the case where the sodium concentration is about 19 mM and the temperature is about 65 ° C is most preferable.
  • the "part of the nucleotide sequence of the DNA encoding the receptor protein or the polynucleotide comprising a part of the nucleotide sequence complementary to the DNA" of the present invention is a partial peptide of the present invention described below.
  • the term is used to include not only DNA encoding DNA but also RNA.
  • an antisense polynucleotide capable of inhibiting the replication or expression of the receptor protein gene is cloned or the base of the DNA encoding the determined receptor protein is cloned.
  • Such polynucleotides can hybridize to the RNA of the receptor protein gene, inhibit the synthesis or function of the RNA, or interact with the receptor protein-associated RNA. Can regulate and control the expression of the receptor protein gene.
  • Polynucleotides that are complementary to the selected sequence of the receptor protein-related RNA and polynucleotides that can specifically hybridize with the receptor protein-related RNA can enhance expression of the receptor protein gene in vivo and in vitro. It is useful for regulation and control, and is also useful for treating or diagnosing diseases.
  • the term “corresponding” means having homology or being complementary to a specific sequence of nucleotides, base sequences or nucleic acids including genes.
  • the "correspondence" between a nucleotide, base sequence or nucleic acid and a peptide (protein) usually refers to the amino acid of the peptide (protein) as directed by the nucleotide (nucleic acid) sequence or its complement. .
  • the stop codon, the 3 'untranslated region, the 3' palindrome region, and the 3 'end hairpin loop may be selected as preferred regions of interest, but any region within the receptor protein gene may be selected.
  • the partial base of the receptor protein of the present invention is used.
  • the hybridization method can be carried out, for example, according to the method described in Molecular Cloning 2nd (J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989). When a commercially available library is used, it can be performed according to the method described in the attached instruction manual.
  • the relationship between the target nucleic acid and the polynucleotide complementary to at least a part of the target region can be said to be "antisense” if the relationship between the target nucleic acid and the polynucleotide that can hybridize with the target is.
  • Antisense polynucleotides include polynucleotides containing 2-dexoxy D-liposome, polynucleotides containing D-liposome, and other types of polynucleotides that are N-glycosides of purine or pyrimidine bases.
  • Nucleotide or other polymers with non-nucleotide backbones eg, commercially available proteins, nucleic acids and synthetic sequence-specific nucleic acid polymers
  • Other polymers containing special bonds provided that the polymer is DNA And nucleotides having a configuration permitting base pairing and base attachment as found in RNA).
  • They can be double-stranded DNA, single-stranded DNA, double-stranded RNA, single-stranded RNA, and even DNA: RNA hybrids, and can further comprise unmodified polynucleotides (or unmodified oligonucleotides). Nucleotides) and those with known modifications, for example, in the art.
  • uncharged For example, those having methylphosphonate, phosphotriester, phosphoramidate, olebamate, etc .; those having a charged bond or a sulfur-containing bond (eg, phosphorothioate, phosphorodithioate, etc.); Those having side-chain groups such as monosaccharides, nuclease inhibitor
  • nucleic acids eg, monosaccharides
  • Substances eg, acridine, zoralen, etc.
  • chelating compounds eg, For example, those containing metals, radioactive metals, boron, oxidizing metals, etc., those containing alkylating agents, and those with modified bonds (eg, anomeric nucleic acids).
  • the “nucleoside”, “nucleotide” and “nucleic acid” may include not only those containing purine and pyrimidine bases but also those having other modified heterocyclic bases. Such modifications may include methylated purines and pyrimidines, acylated purines and pyrimidines, or other heterocycles.
  • Modified nucleotides and modified nucleotides may also be modified at the sugar moiety, e.g., where one or more hydroxyl groups have been replaced with halogens, aliphatic groups, etc., or functionalities such as ethers, amines, etc. It may be converted to a group.
  • the antisense polynucleotide (nucleic acid) of the present invention is an RNA, a DNA, or a modified nucleic acid (RNA, DNA).
  • modified nucleic acid include, but are not limited to, sulfur derivatives of nucleic acids, thiophosphate derivatives, and those resistant to degradation of polynucleoside amides and oligonucleoside amides.
  • the antisense nucleic acid of the present invention can be preferably designed according to the following policy. That is, to make the antisense nucleic acid more stable in the cell, to increase the cell permeability of the antisense nucleic acid, to have a greater affinity for the target sense strand, and to be more toxic if it is toxic. Make sense nucleic acid less toxic.
  • the antisense nucleic acids of the present invention may contain altered or modified sugars, bases, or bonds, may be provided in special forms such as ribosomes or microspheres, may be applied by gene therapy, It could be given in additional form.
  • additional forms include polycations, such as polylysine, which act to neutralize the charge on the phosphate backbone, and lipids, which enhance interaction with cell membranes and increase nucleic acid uptake (eg, , Phospholipids, cholesterol, etc.).
  • Preferred lipids for addition include cholesterol and its derivatives (eg, cholesteryl chromate form, cholic acid, etc.).
  • nucleic acid can be attached via a base, sugar, or intramolecular nucleoside bond.
  • Other groups include cap groups specifically located at the 3 'or 5' end of nucleic acids that prevent degradation by nucleases such as exonucleases and RNases. .
  • Examples of such a capping group include, but are not limited to, hydroxyl protecting groups known in the art, such as dalicol such as polyethylene glycol and tetraethylene glycol.
  • the inhibitory activity of the antisense nucleic acid can be examined using the transformant of the present invention, the in vivo or in vitro gene expression system of the present invention, or the in vivo or in vitro translation system of the receptor protein.
  • the nucleic acid can be applied to cells by various known methods.
  • the antisense polynucleotide of the present invention can suppress the function of the protein of the present invention or the polynucleotide of the present invention (eg, DNA) in a living body. It can be used as a prophylactic and / or therapeutic agent for diseases associated with dysfunction.
  • the antisense polynucleotide of the present invention can also be used as a diagnostic oligonucleotide probe for examining the presence or expression of the DNA of the present invention in tissues or cells. Diagnosis of diseases associated with dysfunction Can be used. (DNA encoding partial peptide)
  • the DNA encoding the partial peptide of the present invention may be any DNA containing the above-described nucleotide sequence encoding the partial peptide of the present invention.
  • genomic DNA genomic DNA It may be any of library, cDNA derived from the above-mentioned cells or tissues, cDNA library derived from the above-mentioned cells or tissues, and synthetic DNA.
  • the vector used for the library may be any of bacteriophage, plasmid, cosmid, phagemid and the like.
  • an mRNA fraction prepared from the cells or tissues described above can be used and directly amplified by Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction (hereinafter abbreviated as RT-PCR method).
  • the DNA encoding the partial peptide of the present invention for example,
  • SEQ ID NO: 8 SEQ ID NO: 10
  • SEQ ID NO: 14 SEQ ID NO: 16
  • SEQ ID NO: 18 SEQ ID NO: 20
  • SEQ ID NO: 22 SEQ ID NO: 24
  • SEQ ID NO: 8 SEQ ID NO: 10
  • SEQ ID NO: 14 SEQ ID NO: 16
  • SEQ ID NO: 18 SEQ ID NO: 20
  • SEQ ID NO: 22 SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26 or sequence Having DNA that hybridizes under high stringent conditions with DNA containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 28, and having substantially the same quality as the protein peptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9
  • a DNA having a partial nucleotide sequence of a DNA encoding a protein having an activity eg, a ligand binding activity, a signal transduction action, etc.
  • DNAs that hybridize under high stringent conditions to DNA containing the base sequence represented by 28 include, for example, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26 or SEQ ID NO : DNAs that hybridize under high stringent conditions to DNA containing the base sequence represented by 28 include, for example, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 16 No .: 18, SEQ ID NO: 2 0, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26 or SEQ ID NO: 28 and about 70% or more, preferably about 80% or more, more preferably about 9% DNA containing a base sequence having a homology of 0% or more, more preferably about 95% or more is used.
  • the antibody against the receptor protein of the present invention or its partial peptide or a salt thereof recognizes a cell containing the receptor protein of the present invention or its partial peptide or a salt thereof, or the receptor protein of the present invention. Either a polyclonal antibody or a monoclonal antibody may be used as long as the antibody is obtained.
  • An antibody against the receptor protein of the present invention or its partial peptide or a salt thereof (hereinafter sometimes abbreviated as the receptor protein of the present invention) may be obtained by using the receptor protein of the present invention as an antigen, It can be produced according to a known antibody or antiserum production method.
  • the receptor protein of the present invention or the like is administered to a mammal at a site where the antibody can be produced by administration, itself or together with a carrier or a diluent.
  • Freund's complete adjuvant or Freund's incomplete adjuvant may be administered to enhance the antibody-producing ability.
  • the administration is usually performed once every 2 to 6 weeks, for a total of about 2 to 10 times. Examples of mammals to be used include monkeys, egrets, dogs, guinea pigs, mice, rats, sheep, and goats, and mice and rats are preferably used.
  • a warm-blooded animal immunized with the antigen for example, a mouse with an antibody titer is selected from a mouse, and the spleen or lymph node is collected 2 to 5 days after the final immunization.
  • a monoclonal antibody-producing hybridoma can be prepared.
  • the measurement of the antibody titer in the antiserum can be performed, for example, by using the labeled receptor protein described below.
  • the reaction can be carried out by measuring the activity of the labeling agent bound to the antibody after the reaction of the antibody with the antiserum.
  • the fusion operation can be carried out according to a known method, for example, the method of Köller and Mills (Nature, 256, 495 (1975)).
  • the fusion promoter include polyethylene glycol (PEG) and Sendai virus, and PEG is preferably used.
  • myeloma cells examples include NS-1, P3U1, SP2 / 0 and the like, with P3U1 being preferred.
  • the preferred ratio between the number of antibody-producing cells (spleen cells) and the number of myeloma cells used is about 1: 1 to 20: 1, and the concentration of PEG (preferably PEG1000 to PEG6000) is about 10 to 80%.
  • PEG preferably PEG1000 to PEG6000
  • a hybridoma can be used on a solid phase (eg, a microplate) on which an antigen such as a receptor protein is adsorbed directly or together with a carrier.
  • an antigen such as a receptor protein
  • the culture supernatant is added, and then an anti-immunoglobulin antibody labeled with a radioactive substance or an enzyme (if the cells used for cell fusion are mice, an anti-mouse immunoglobulin antibody is used) or protein A is added.
  • a method for detecting monoclonal antibodies bound to a solid phase adding a hybridoma culture supernatant to a solid phase to which anti-immune glopurin antibody or protein A is adsorbed, and adding a receptor protein or the like labeled with radioactive substances, enzymes, etc. And a method for detecting a monoclonal antibody bound to a solid phase.
  • the selection of the monoclonal antibody can be carried out according to a known method or a method analogous thereto. Usually, it can be carried out in a medium for animal cells to which HAT (hypoxanthine, aminopterin, thymidine) is added.
  • HAT hyperxanthine, aminopterin, thymidine
  • any medium can be used as long as it can grow a hybridoma.
  • RPMI 1640 medium containing 1 to 20%, preferably 10 to 20% fetal bovine serum, GIT medium containing 1 to 10% fetal bovine serum (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) or a hybridoma culture medium Serum medium (SFM-101, Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) or the like can be used.
  • the cultivation temperature is usually 20-40 ° (preferably about 37 ° C). ° C.
  • the culture time is generally 5 days to 3 weeks, preferably 1 week to 2 weeks.
  • the culture can be usually performed under 5% carbon dioxide gas.
  • the antibody titer of the hybridoma culture supernatant can be measured in the same manner as the measurement of the antibody titer in the antiserum described above.
  • Monoclonal antibodies can be separated and purified in the same manner as normal polyclonal antibodies. [Examples: salting out, alcohol precipitation, isoelectric focusing, electrophoresis, ion exchangers (ex. , DEAE), ultracentrifugation, gel filtration, antigen-binding solid phase, or specific antibody obtained by collecting only the antibody with an active adsorbent such as protein A or protein G, and dissociating the bond to obtain the antibody. Purification method].
  • the polyclonal antibody of the present invention can be produced according to a known method or a method analogous thereto. For example, a complex of an immunizing antigen (antigen such as the protein of the present invention) and a carrier protein is formed, and a mammal is immunized in the same manner as in the above-described method for producing a monoclonal antibody. It can be produced by collecting an antibody-containing substance against a protein or the like and separating and purifying the antibody.
  • the type of carrier protein and the mixing ratio of carrier and hapten depend on the antibody potential against hapten immunized by cross-linking with carrier. Any efficiency may be used, and any ratio may be used for crosslinking.For example, serum albumin, thyroglobulin, keyhole, lindet, hemocyanin, etc. may be used in a weight ratio. A method of pulling the hapten 1 at a rate of about 0.1 to 20, preferably about 1 to 5 is used.
  • various condensing agents can be used for force coupling between the hapten and the carrier.
  • daltaraldehyde, carbodiimide, a maleimide active ester, an active ester reagent containing a thiol group or a dithiozeridyl group, or the like is used.
  • the condensation product is administered to a warm-blooded animal itself or together with a carrier or diluent at a site where antibody production is possible.
  • the administration can usually be performed once every about 2 to 6 weeks, for a total of about 3 to 10 times.
  • the polyclonal antibody can be collected from blood, ascites, etc., preferably from blood, of the mammal immunized by the above method.
  • the measurement of the polyclonal antibody titer in the antiserum can be performed in the same manner as the measurement of the antibody titer in the serum described above. Separation and purification of the polyclonal antibody can be performed according to the same immunoglobulin separation and purification method as the above-described separation and purification of the monoclonal antibody. [Uses for Recept Yuichi Protein, DNA, etc.]
  • Asparagine-linked glycans Proteins that show affinity for glycans such as serine and threonine-linked glycans (for example, concanapalin A, lentil lectin, endu-male lectin, Korean Asagaorectin, innugen lectin, and phytomagglutinin) Lectins, etc.) are one of the ligands of the receptor protein of the present invention.
  • serine and threonine-linked glycans for example, concanapalin A, lentil lectin, endu-male lectin, Korean Asagaorectin, innugen lectin, and phytomagglutinin) Lectins, etc.
  • the receptor protein of the present invention a polynucleotide encoding the same (hereinafter sometimes abbreviated as the polynucleotide of the present invention), an antibody against the receptor protein of the present invention (hereinafter sometimes abbreviated as the antibody of the present invention). ),
  • the antisense polynucleotide against the DNA of the present invention (hereinafter sometimes abbreviated as the antisense polynucleotide of the present invention) and the like have the following uses.
  • the receptor protein of the present invention is expressed in the prostate (cancer), placenta, and liver, a) the receptor protein of the present invention or b) the polypeptide encoding the receptor protein of the present invention.
  • Nucleotides e.g., DNA
  • a) B) (a) administering to the patient the DNA encoding the receptor protein of the present invention and expressing the same; or (b) (target cell) After inserting and expressing DNA encoding the receptor protein of the present invention into the patient, the amount of the receptor protein in the patient's body is increased by transplanting the cells into the patient, etc.
  • the effect of the ligand can be sufficiently exerted.
  • the polynucleotide encoding the receptor protein of the present invention is a safe and low toxic dysfunction of the receptor protein, particularly prostate cancer, and other cancers (non-small cell cancer, ovarian cancer, stomach cancer, bladder cancer, breast cancer, Cervical cancer, colon cancer, rectal cancer, colorectal cancer, etc.), prostate hypertrophy, male gonadal dysfunction, infertility, preterm birth, endometriosis, liver cirrhosis, hepatitis, hepatic failure, stone prevention and / or treatment, Or it is useful as a labor-inducing agent.
  • prostate cancer and other cancers
  • other cancers non-small cell cancer, ovarian cancer, stomach cancer, bladder cancer, breast cancer, Cervical cancer, colon cancer, rectal cancer, colorectal cancer, etc.
  • prostate hypertrophy male gonadal dysfunction
  • infertility preterm birth
  • endometriosis preterm birth
  • endometriosis preterm birth
  • endometriosis pre
  • the receptor protein of the present invention or a polynucleotide encoding the same is used as the above-mentioned medicine, it can be formulated according to a conventional method.
  • the polynucleotides (eg, DNA) and antisense polynucleotides (eg, antisense DNA) of the present invention can be used as probes to produce human or mammal (eg, rat, mouse, egret, sheep)
  • human or mammal eg, rat, mouse, egret, sheep
  • abnormalities genetic abnormalities
  • the above-described genetic diagnosis using the polynucleotide or the antisense polynucleotide of the present invention can be performed, for example, by the known Northern hybridization or PCR-S. SCP method (Genomics, Vol. 5, pp. 874-8779 (1989), Processings. Ob * The * National. Academy of Sciences ⁇ Proceedings of the National Academy of
  • a decrease or overexpression of the receptor protein of the present invention is detected by Northern hybridization, a disease caused by dysfunction or overexpression of the receptor protein of the present invention, Especially prostate cancer and other cancers (non-small cell cancer, ovarian cancer, stomach cancer, bladder cancer, breast cancer, cervical cancer, colon cancer, rectal cancer, colorectal cancer, etc.), benign prostatic hyperplasia, male gonad function Disability, infertility, premature birth, endometriosis
  • the antisense polynucleotide of the present invention may be used for diseases caused by overexpression of the receptor protein of the present invention (eg, prostate cancer and other cancers (non-small cell cancer, ovarian cancer, stomach cancer, bladder cancer, breast cancer, cervix) Cancer, colon cancer, rectal cancer, colorectal cancer, etc.), prostate hypertrophy, male gonadal dysfunction, infertility, premature birth, endometriosis, cirrhosis, hepatitis, liver failure, calculus, etc. It can be used as an agent or a labor-inducing agent.
  • the receptor protein of the present invention eg, prostate cancer and other cancers (non-small cell cancer, ovarian cancer, stomach cancer, bladder cancer, breast cancer, cervix) Cancer, colon cancer, rectal cancer, colorectal cancer, etc.
  • prostate hypertrophy e.g, male gonadal dysfunction, infertility, premature birth, endometriosis, cirrhosis, hepati
  • the antisense polynucleotide when used, the antisense polynucleotide is used alone or after being inserted into a suitable vector such as a retrovirus vector, an adenovirus vector, an adenovirus associated virus vector, and the like. Can be implemented.
  • the antisense polynucleotide can be administered as it is or in the form of a formulation together with a physiologically acceptable carrier such as an adjuvant for promoting uptake, and administered by a gene gun or a catheter such as a hydrogel catheter.
  • the antisense polynucleotide can also be used as a diagnostic oligonucleotide probe for examining the presence or expression of the DNA of the present invention in tissues or cells.
  • the DNA of the present invention can be used for screening a compound that changes the expression level of the receptor protein of the present invention or a partial peptide thereof.
  • the present invention includes, for example, (i) (1) blood of a non-human mammal, (2) a specific organ, (3) a tissue or cell isolated from an organ, or a U transformant or the like.
  • a method for screening a compound that changes the expression level of the receptor protein of the present invention or its partial peptide by measuring the mRNA amount of the receptor protein of the present invention or its partial peptide is provided.
  • the measurement of the amount of mRNA of the receptor protein or its partial peptide of the present invention is specifically carried out as follows.
  • non-human mammals eg, mice, rats, rabbits, sheep, sheep, stags, horses, cats, dogs, monkeys, etc., more specifically, tumor-bearing mice
  • Drugs eg, anticancer drugs
  • physical stress eg, immersion stress, electric shock, light / dark, low temperature, etc.
  • blood or specific organs eg, brain, lung, colon
  • Prostate, etc. tissues or cells isolated from organs.
  • the mRNA of the receptor protein of the present invention or its partial peptide contained in the obtained cells can be obtained, for example, by extracting mRNA from cells or the like by an ordinary method, for example, using a technique such as TaqMan PCR. It can be quantified by using, and can also be analyzed by performing a Northern plot by known means.
  • a transformant expressing the receptor protein of the present invention or a partial peptide thereof is prepared according to the above method, and the mRNA of the receptor protein of the present invention or the partial peptide thereof contained in the transformant is similarly determined. It can be quantified and analyzed.
  • Drugs or physical drugs against normal or disease model non-human mammals A certain time before giving stress etc. (30 minutes to 24 hours ago, preferably 30 minutes to 12 hours ago, more preferably 1 hour to 6 hours ago) or after a certain time (30 minutes to 3 days later, preferably Is administered 1 hour to 2 days later, more preferably 1 hour to 24 hours later) or a test compound is administered simultaneously with a drug or physical stress, and after a certain period of time after administration (30 minutes to 3 days later, Preferably 1 hour to 2 days, more preferably 1 hour to 24 hours), by quantifying and analyzing the mRNA amount of the receptor protein of the present invention or its partial peptide contained in the cells. It is possible,
  • test compound When culturing the transformant according to a conventional method, the test compound is mixed in a medium and cultured for a certain period of time (1 day to 7 days, preferably 1 day to 3 days, more preferably 2 days to 3 days). (After a day), the amount can be determined by quantifying and analyzing the mRNA amount of the receptor protein of the present invention or its partial peptide contained in the transformant.
  • the compound or a salt thereof obtained by using the screening method of the present invention is a compound having an action of changing the expression level of the receptor protein or the partial peptide thereof of the present invention.
  • a compound that enhances the receptor-mediated cell stimulating activity by increasing the expression level of the receptor protein or a partial peptide thereof, and reduces the expression level of the receptor protein or its partial peptide of the present invention. Is a compound that attenuates the cell stimulating activity.
  • Cell stimulating activities include, for example, (1) arachidonic acid release, (2) acetylcholine release, (3) intracellular Ca 2+ release, (4) intracellular AMP production, (5) intracellular cGMP production, (6) inositol phosphate production, (7) fluctuation of cell membrane potential, (8) phosphorylation of intracellular proteins (eg, MAP kinase), (9) activation of c-fos, (10) lowering of pH, ( 1 1) Activation of low molecular weight G proteins such as Rho, Rac, and Ras, (12) Transcription factors CRE (c AMP responsiveel ement), AP1, NFAT, SRE (ser um res pon siveel ement), etc. Activation of reporter genes (eg, lucipuerase, etc.) linked downstream of Are preferred.
  • Examples of the compound include a peptide, a protein, a non-peptidic compound, a synthetic compound, and a fermentation product. These compounds may be a novel compound or a known compound.
  • the compound that enhances the cell stimulating activity is useful as a safe and low toxic drug for enhancing the physiological activity of the receptor protein or the like of the present invention.
  • the compound that attenuates the cell stimulating activity is useful as a safe and low toxic drug for decreasing the physiological activity of the receptor protein of the present invention.
  • one of the ligands of the receptor protein of the present invention is a protein (eg, lectin, etc.) having an affinity for a sugar chain. Therefore, the compound that alters the expression level of the receptor protein of the present invention obtained by the above-mentioned screening method includes prostate cancer and other cancers (non-small cell cancer, ovarian cancer, stomach cancer, bladder cancer, Breast cancer, cervical cancer, colon cancer, rectal cancer, colon cancer, etc.), prostatic hypertrophy, male gonad dysfunction, infertility, premature birth, endometriosis, cirrhosis, hepatitis, liver failure, stones It can be used as Z or a therapeutic agent, or as a labor-inducing agent.
  • prostate cancer and other cancers non-small cell cancer, ovarian cancer, stomach cancer, bladder cancer, Breast cancer, cervical cancer, colon cancer, rectal cancer, colon cancer, etc.
  • prostatic hypertrophy male gonad dysfunction
  • infertility premature birth
  • endometriosis cir
  • a prophylactic and / or therapeutic agent for various diseases containing a compound that changes the expression level of the receptor protein or its partial peptide of the present invention.
  • the receptor protein of the present invention is considered to play some important role in vivo such as central function. Therefore, the compound that alters the expression level of the receptor protein or its partial peptide of the present invention can be used as an agent for preventing and / or treating a disease associated with dysfunction of the receptor protein of the present invention.
  • the compound when used as a prophylactic and / or therapeutic agent for a disease associated with dysfunction of the receptor protein of the present invention, it can be formulated according to a conventional method.
  • a screening method and a screening kit for a compound that changes the binding property between the receptor protein of the present invention and a ligand.
  • a compound that changes the binding between the ligand and the receptor protein of the present invention for example, Peptides, proteins, non-peptidic compounds, synthetic compounds, fermentation products, etc.
  • salts thereof can be efficiently screened.
  • one of the ligands for the receptor protein of the present invention is a protein (for example, lectin) having an affinity for a sugar chain.
  • a compound or a salt thereof that changes the binding property between a protein exhibiting an affinity for a sugar chain and the receptor protein of the present invention can be used.
  • the compound or a salt thereof that changes the binding between the protein having an affinity for a sugar chain and the receptor protein of the present invention can be prepared by, for example, using a protein having an affinity for a sugar chain as a ligand. It can be obtained by implementing the screening method.
  • a low-molecular-weight synthetic compound As a compound or a salt thereof that changes the binding property between a protein having an affinity for a sugar chain and the receptor protein of the present invention, a low-molecular-weight synthetic compound is preferable, and any new or known compound can be used. Good. In particular, when screening for angonist for the receptor protein of the present invention, it is preferable to use a low-molecular-weight synthetic compound having agonist activity instead of protein having affinity for a sugar chain.
  • Small-molecule synthetic compounds are suitable for screening because they are easier to label than proteins that have an affinity for sugar chains.
  • proteins and low-molecular-weight synthetic compounds exhibiting affinity for these sugar chains are collectively referred to as ligands.
  • Examples of the compound that alters the binding property between the ligand and the receptor protein of the present invention include: (a) a compound having an activity of promoting or suppressing a cell stimulating activity through the receptor (such as an activity of the present invention). (Mouth) a compound that does not have the cell stimulating activity (so-called an agonist against the receptor protein of the present invention), (c) a ligand and a G protein-coupled receptor of the present invention A compound that enhances the binding force to the protein, or (2) a compound that decreases the binding force between the ligand and the receptor protein of the present invention. (In addition, it is preferable that the compound of (a) be screened by the above-described ligand determination method).
  • Cell stimulating activities include, for example, (1) arachidonic acid release, (2) acetylcholine release, (3) intracellular Ca 2+ release, (4) intracellular cAMP generation, (5) intracellular cGMP generation, (6) inositol phosphate production, (7) fluctuation of cell membrane potential, (8) phosphorylation of intracellular proteins (eg, MAP kinase), (9) activation of c-fos, (10) decrease of pH, (11) Activation of low-molecular-weight G proteins such as Rho, Rac, Ras, etc.
  • CRE c AMP response siveel ement
  • API NFAT
  • S RE ser um responsive ement
  • the like such as the activation of a reporter gene (eg, luciferase, etc.) linked downstream, and the activity of promoting the production of intracellular cAMP is particularly preferred.
  • a reporter gene eg, luciferase, etc.
  • the present invention relates to (i) the case where the receptor protein of the present invention or its partial peptide or a salt thereof is contacted with a ligand; and (ii) the receptor protein of the present invention or its partial peptide or a salt thereof. And a compound or a salt thereof that alters the binding property between the ligand and the receptor protein of the present invention or a partial peptide thereof or a salt thereof, which is compared with a case where the ligand and the test compound are brought into contact with each other. Is provided.
  • the screening method of the present invention is characterized in that, in the cases (i) and (ii), for example, the amount of a ligand bound to the receptor protein or the like, the cell stimulating activity, etc. are measured and compared. .
  • the present invention provides
  • a compound for example, ligand
  • a compound that activates the receptor protein of the present invention is brought into contact with a cell containing the receptor protein or the like of the present invention, and a compound that activates the receptor protein or the like of the present invention.
  • a ligand characterized by measuring and comparing receptor-mediated cell stimulating activity when a test compound is brought into contact with a cell containing the receptor protein or the like of the present invention and a receptor protein or the like of the present invention.
  • the receptor protein of the present invention expressed on a cell membrane by culturing a transformant containing the DNA of the present invention with a compound (eg, ligand) that activates the receptor protein or the like of the present invention. And the receptor of the present invention expressed on the cell membrane by culturing a transformant containing the DNA of the present invention with a compound that activates the receptor protein or the like of the present invention and a test compound.
  • a cell or its salt that changes the binding property between the ligand and the receptor protein of the present invention which is characterized by measuring and comparing the cell stimulating activity through the receptor when exposed to the protein and the like.
  • the receptor Yuichi protein of the present invention used in the screening method of the present invention, etc. Any one may be used as long as it contains the above-described receptor protein of the present invention, etc., but it may be any organ of a mammalian animal containing the receptor protein, etc. of the present invention. Cell membrane fractions are preferred. However, since human-derived organs are particularly difficult to obtain, human receptor proteins and the like that are expressed in large amounts using recombinants are suitable for screening.
  • the above method is used to produce the receptor protein of the present invention, but it is preferable to carry out the expression of the DNA of the present invention in mammalian cells or insect cells.
  • the complementary DNA is used for the NA fragment, but is not necessarily limited thereto.
  • a gene fragment or a synthetic DNA may be used.
  • a nuclear polyhedrosis virus belonging to a baculovirus using the DNA fragment as an insect host is required.
  • NPV nuclear polyhedros is virus
  • SV40-derived promoter SV40-derived promoter
  • retrovirus promoter meta-mouth thionine promoter
  • human heat shock promoter cytomegalovirus promoter
  • SR ⁇ SR ⁇ It is preferably incorporated downstream such as a promoter.
  • the amount and quality of the expressed receptor can be examined by a method known per se. For example, the method can be carried out according to the method described in the literature [Nambi, P. et al., The Journal of Biological 'Chemistry (J. Biol. Chem.), 267, 19555-19559, 1992]. .
  • the protein containing the receptor protein of the present invention may be a receptor protein purified according to a known method, or a cell containing the receptor protein or the like. Alternatively, a membrane fraction of cells containing the receptor protein or the like may be used.
  • the screening method of the present invention when a cell containing the receptor protein of the present invention or the like is used, the cell may be immobilized with daltaraldehyde, formalin, or the like. The immobilization method can be performed according to a known method.
  • the cell containing the receptor protein or the like of the present invention refers to a host cell that expresses the receptor protein or the like, and the host cell is preferably Escherichia coli, Bacillus subtilis, yeast, insect cells, animal cells, or the like.
  • the cell membrane fraction refers to a cell membrane-rich fraction obtained by disrupting cells and then obtained by a known method. Cells can be crushed by crushing the cells with a Potter-Elvehj em type homogenizer, ⁇ ⁇ ⁇ one ring blender ⁇ crushing using a polytron (manufactured by Khiematica), crushing by ultrasonic waves, pressurizing with a French press, etc. While crushing by ejecting cells from a thin nozzle.
  • fractionation by centrifugal force such as fractionation centrifugation or density gradient centrifugation is mainly used.
  • the cell lysate is centrifuged at a low speed (500 rpm to 300 rpm) for a short time (usually about 1 minute to 10 minutes), and the supernatant is further spun at a high speed (150 rpm to 300 rpm).
  • the mixture is centrifuged usually at 0,000 rpm) for 30 minutes to 2 hours, and the resulting precipitate is used as the membrane fraction.
  • the membrane fraction contains a large amount of expressed receptor proteins and membrane components such as cell-derived phospholipid / membrane proteins.
  • the amount of the receptor protein of the cell or membrane fraction containing the receptions evening Isseki protein, etc. is preferably from 1 0 3 to 1 0 8 molecules per cell, 1 0 5-1 0 7 minutes terminal It is preferred that The higher the expression level, the higher the ligand binding activity (specific activity) per membrane fraction, which not only enables the construction of a highly sensitive screening system, but also enables the measurement of a large number of samples in the same port. Become like
  • the receptor protein fraction a natural receptor protein fraction or a recombinant receptor protein fraction having an activity equivalent thereto is desirable.
  • equivalent activity refers to equivalent ligand binding activity, signal transduction action, and the like.
  • the labeled ligand a labeled ligand, a labeled ligand analog compound and the like are used. For example [3 H], [1 2 5 I], [1 4 C], and the ligand is labeled with a [3 5 S] used.
  • a cell or a membrane fraction of the cell containing the receptor protein of the present invention is used.
  • Buffer suitable for screening A receptor protein standard is prepared by suspending. P in the buffer
  • Any buffer may be used as long as it does not inhibit the binding between the ligand and the receptor protein, such as a phosphate buffer of H4 to 10 (preferably pH 6 to 8) and a buffer of tris monohydrochloride.
  • a surfactant such as CHAPS, Tween-80 TM (Kao-Atlas), digitonin, and dexcholate can be added to the buffer.
  • a protease inhibitor such as PMSF, leptin, E-64 (manufactured by Peptide Research Institute), and pepstatin can be added. 0.
  • the reaction solution is filtered through a glass fiber filter or the like, washed with an appropriate amount of the same buffer, and the radioactivity remaining on the glass fiber filter is measured with a liquid scintillation counter or an counter.
  • the specific binding amount (B—NSB) ifi, For example, a test compound having 50% or less can be selected as a candidate substance having a competitive inhibition ability.
  • the above-mentioned cell stimulating activity through the receptor protein can be measured using a known method or a commercially available measurement kit.
  • cells containing the receptor protein or the like of the present invention are cultured on a multi-well plate or the like.
  • the assay may be performed by adding an inhibitor against the degrading enzyme.
  • an activity such as inhibition of cAMP production can be detected as an activity of inhibiting production of cells whose basal production has been increased by forskolin or the like.
  • Cells expressing an appropriate receptor protein are required.
  • Cells expressing the receptor protein of the present invention and the like are preferably cell lines having the natural receptor protein of the present invention and the like, and cell lines expressing the above-mentioned recombinant receptor protein and the like.
  • test compound for example, peptides, proteins, non-peptidic compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts, animal tissue extracts, etc. are used. Or a known compound.
  • a compound designed to bind to the ligand binding pocket based on the atomic coordinates of the active site of the receptor protein of the present invention and the position of the ligand binding pocket is preferably used.
  • the atomic coordinates of the active site of the receptor protein of the present invention and the position of the ligand binding pocket can be measured by a known method or a method analogous thereto.
  • a screening kit for a compound or a salt thereof that alters the binding between a ligand and the receptor protein of the present invention or the like includes cells containing the receptor protein of the present invention, the receptor protein of the present invention, or the like, or And those containing a membrane fraction of cells containing the receptor protein or the like of the present invention.
  • Examples of the screening kit of the present invention include the following.
  • the solution may be sterilized by filtration through a 0.45 im filter and stored at 4 ° C, or may be prepared at use.
  • G protein conjugated receptor CHO cells expressing the receptor protein of the present invention were subcultured on a 12-well plate at 5 ⁇ 10 5 cells / well and cultured at 37 with 5% CO 2 and 95% air for 2 days.
  • the ligand is dissolved in PBS containing 0.1% ⁇ serum albumin (manufactured by Sigma) so as to be ImM, and stored at 20 ° C.
  • CHO cells expressing the receptor protein of the present invention cultured on a 12-well tissue culture plate were washed twice with 1 ml of the measurement buffer twice, and then 490 1 of the measurement buffer was added to each well. Add to
  • B 0 maximum binding amount Compounds that change the binding between the ligand and the receptor protein of the present invention.
  • a specific method for evaluating whether a salt is an agonist or an antagonist may be according to the following (i) or (ii).
  • test compound is brought into contact with a cell containing the receptor protein of the present invention, and the above-described cell stimulating activity of the receptor protein of the present invention is measured.
  • the compound having a cell stimulating activity or a salt thereof is an agonist.
  • the compound or a salt thereof obtained by using the screening method or the screening kit of the present invention is a compound having an effect of changing the binding property between a ligand and the receptor protein of the present invention.
  • a compound having the above-described cell stimulating activity via the receptor protein of the present invention (a so-called agonist against the receptor protein of the present invention); (2) a compound not having the cell stimulating activity (a so-called receptor of the present invention) (3) a compound that enhances the binding force between the ligand and the receptor protein of the present invention, or (4) a compound that decreases the binding force between the ligand and the receptor protein of the present invention.
  • Such compounds include peptides, proteins, non-peptidic compounds, synthetic compounds And fermentation products. These compounds may be novel compounds or known compounds.
  • the agonist against the receptor protein of the present invention has the same action as the physiological activity of the above-mentioned ligand for the receptor protein of the present invention, the drug is safe and low toxic according to the physiological activity.
  • the antagonist of the present invention for the receptor protein of the present invention can suppress the physiological activity of the ligand for the receptor protein of the present invention, it is a safe and low-toxic drug that suppresses the physiological activity. Useful as
  • the compound that enhances the binding force between the ligand and the receptor protein of the present invention is useful as a safe and low-toxic drug for enhancing the physiological activity of the ligand for the receptor protein of the present invention and the like. .
  • the compound that reduces the binding force between the ligand and the receptor protein of the present invention is useful as a safe and low-toxicity drug for reducing the physiological activity of the ligand for the receptor protein of the present invention and the like.
  • a compound or a salt thereof having an action of changing the binding property between the ligand obtained by using the screening method or the screening kit of the present invention and the receptor protein of the present invention includes, for example, prostate cancer, and Other cancers (non-small cell cancer, ovarian cancer, stomach cancer, bladder cancer, breast cancer, cervical cancer, colon cancer, rectal cancer, colorectal cancer, etc.), benign prostatic hyperplasia, male gonad dysfunction, infertility, preterm birth, intrauterine It is useful as a prophylactic and / or therapeutic agent for diseases such as membrane disease, liver cirrhosis, hepatitis, liver failure, and calculus, or as a labor-inducing agent.
  • diseases such as membrane disease, liver cirrhosis, hepatitis, liver failure, and calculus, or as a labor-inducing agent.
  • a preventive and / or therapeutic agent for various diseases containing a compound (eg, agonist, antagonist, etc.) that alters the binding between the receptor protein and the ligand of the present invention)
  • a compound eg, agonist, antagonist, etc.
  • Compounds that alter the binding between the receptor protein of the present invention and the ligand (7 gonists, antagonists) and the above-mentioned ligands for the receptor protein of the present invention are diseases associated with dysfunction of the receptor protein of the present invention.
  • prostate cancer, and other cancers non-small cell cancer, ovarian cancer, stomach cancer, bladder cancer, breast cancer, cervical cancer, colon cancer, rectal cancer, colorectal cancer, etc.
  • prostatic hyperplasia male Gonadal dysfunction
  • infertility It can be used as a prophylactic and / or therapeutic agent for diseases such as premature birth, endometriosis, cirrhosis, hepatitis, liver failure and calculus, or as a labor-inducing agent.
  • the compound or ligand when used as a preventive and / or therapeutic agent for a disease associated with dysfunction of the receptor protein of the present invention, it can be formulated according to the conventional methods as described above.
  • the antibody of the present invention can specifically recognize the protein of the present invention, such as the receptor protein of the present invention, quantification of the protein of the present invention in a test solution, particularly the sandwich immunoassay method and the competition method It can be used for quantitative determination by an immunometric method or nephelometry.
  • the measuring system for the receptor protein or its salt of the present invention may be constructed by adding ordinary technical considerations to those skilled in the art to the ordinary conditions and procedures in each method. For details of these general technical means, it is possible to refer to reviews and compendiums.
  • Ibid.Vol. 73 (Immunochemical Techniques (Part B))
  • Ibid.Vol. 74 (Immunochemical Techniaues (Part C))
  • Id.Vol. 84 (Immunochemical Techniaues (Part D: Selected Immunoassays)) 3 ⁇ 4
  • Ibid.Vol. 92 (Immunochemical Techniaues (Part E: Monoc) lonal Ant ibodies and General I thigh leakage assay methods)), Ibid.Vol.
  • the receptor protein of the present invention or a salt thereof can be quantified with high sensitivity by using the antibody of the present invention.
  • an increase or decrease in the concentration of the receptor protein is detected by quantifying the concentration of the receptor protein of the present invention using the antibody of the present invention, for example, dysfunction or excess of the receptor protein Expression, especially prostate cancer, and other cancers (non-small cell cancer, ovarian cancer, stomach cancer, bladder cancer, breast cancer, cervical cancer, colon cancer, rectal cancer, colon cancer, etc.), benign prostatic hyperplasia, male gonad dysfunction , Infertility, premature birth, endometriosis, liver cirrhosis, hepatitis, liver failure, calculus, or a high possibility of being diagnosed in the future.
  • dysfunction or excess of the receptor protein Expression especially prostate cancer, and other cancers (non-small cell cancer, ovarian cancer, stomach cancer, bladder cancer, breast cancer, cervical cancer, colon cancer, rectal cancer, colon cancer, etc.), benign prostatic hyperplasia, male gonad dysfunction , Infertility, premature birth, endometriosis, liver cirrhosis, hepatitis,
  • the antibody of the present invention can be used for specifically detecting the receptor protein of the present invention or the like present in a subject such as a body fluid or a tissue. Further, preparation of an antibody column used for purifying the receptor protein of the present invention, detection of the receptor protein of the present invention in each fraction at the time of purification, behavior of the receptor protein of the present invention in test cells It can be used for analysis and the like.
  • the antibody of the present invention can specifically recognize the receptor protein of the present invention or its partial peptide or a salt thereof, it changes the amount of the receptor protein of the present invention or its partial peptide in the cell membrane. It can be used for screening of compounds.
  • Transformants expressing the receptor protein or its partial peptide of the present invention, etc. are sectioned, and then immunostaining is used to quantify the degree of staining of the receptor protein on the cell surface.
  • non-human mammals eg, mice, rats, egrets, higgs, bushus, dogs, cats, dogs, monkeys, etc., more specifically, tumor-bearing mice, etc.
  • Drugs eg, anticancer drugs, etc.
  • physical stress eg, immersion stress, electric shock, light and dark, low temperature, etc.
  • blood or specific organs eg, brain, lung, Obtain tissues or cells isolated from the large intestine, prostate, etc.
  • the obtained organ, tissue or cell is suspended in, for example, an appropriate buffer (for example, Tris-HCl buffer, phosphate buffer, Hess buffer, etc.) to destroy the organ, tissue or cell and surfactants (e.g., Triton X 1 0 0 TM, etc. Tsui Ichin 2 0 TM) using a further centrifugation
  • an appropriate buffer for example, Tris-HCl buffer, phosphate buffer, Hess buffer, etc.
  • surfactants e.g., Triton X 1 0 0 TM, etc. Tsui Ichin 2 0 TM
  • the cell membrane fraction is obtained using techniques such as separation, filtration, and column fractionation.
  • the cell membrane fraction refers to a cell membrane-rich fraction obtained by disrupting cells and then obtained by a known method.
  • the cells can be crushed by crushing the cells with a Potter-Elvehj em-type homogenizer, crushing with a Warlinda blender ⁇ polytron (manufactured by Kinematica), crushing by ultrasonic waves, or pressing the cells while applying pressure with a French press. Crushing by ejecting from a thin nozzle is exemplified.
  • fractionation by centrifugal force such as fractionation centrifugation or density gradient centrifugation is mainly used.
  • the cell lysate is centrifuged at a low speed (500 rpm to 300 rpm) for a short period of time (usually about i minute to 10 minutes), and the supernatant is further spun at a higher speed (150 000-pm). And centrifugation at 300 rpm for 30 minutes to 2 hours, and the resulting precipitate is used as a membrane fraction.
  • the membrane fraction is rich in the expressed receptor protein and the like, and many membrane components such as cell-derived phospholipids and membrane proteins.
  • the receptor protein of the present invention or its partial peptide contained in the cell membrane fraction can be quantified by, for example, a sandwich immunoassay using the antibody of the present invention, Western blot analysis, or the like.
  • Such a sandwich immunoassay can be performed in the same manner as described above, and the Western plot can be performed by known means.
  • a transformant expressing the receptor protein of the present invention or its partial peptide is prepared according to the above-mentioned method, and the receptor protein of the present invention or its partial peptide contained in the cell membrane fraction can be quantified. it can.
  • Screening for a compound that alters the amount of the receptor protein of the present invention or its partial peptide in the cell membrane is performed by:
  • a given time before drug or physical stress is applied to a normal or disease model non-human mammal (30 minutes to 24 hours before, preferably 30 minutes to 12 hours before, Preferably 1 hour to 6 hours before) or after a certain time (30 minutes to 3 days, preferably 1 hour to 2 days, more preferably 1 hour to 24 hours), or drug or physical
  • the test compound is administered at the same time as the target stress, and after a certain period of time after the administration (30 minutes to 3 days, preferably 1 hour to 2 days, more preferably 1 hour to 24 hours), the cell membrane
  • the receptor protein of the present invention in Or by quantifying the amount of the partial peptide,
  • test compound When the transformant is cultured according to a conventional method, the test compound is mixed in a medium and cultured for a certain period of time (1 day to 7 days, preferably 1 day to 3 days, more preferably 2 days to 3 days). After a day), it can be carried out by quantifying the amount of the receptor protein of the present invention or its partial peptide in the cell membrane.
  • non-human mammals e.g., mice, rats, egrets, sheep, pigs, horses, cats, dogs, monkeys, etc., more specifically, dementia rats, obese mice, arteriosclerosis
  • Drugs eg, anti-dementia drugs, antihypertensive drugs, anti-cancer drugs, anti-obesity drugs, etc.
  • physical stress e.g, flooding stress, electric shock, light / dark, low temperature, etc.
  • blood or a specific organ eg, brain, lung, colon, etc.
  • a tissue or cell isolated from the organ is obtained.
  • the obtained organ, tissue or cell is cut into a tissue section according to a conventional method, and immunostained with the antibody of the present invention.
  • the receptor protein of the present invention or its partial peptide can be quantitatively or qualitatively determined on the cell membrane. You can check the amount.
  • the compound or a salt thereof obtained by using the screening method of the present invention is a compound having an action of changing the amount of the receptor protein of the present invention or a partial peptide thereof in a cell membrane.
  • Such compounds include peptides, proteins, non-peptidic compounds, synthetic compounds And fermentation products. These compounds may be novel compounds or known compounds.
  • the compound that enhances the cell stimulating activity is useful as a safe and low toxic drug for enhancing the physiological activity of the receptor protein or the like of the present invention.
  • the compound that reduces the cell stimulating activity is useful as a safe and low-toxic drug for reducing the physiological activity of the receptor protein of the present invention or the like.
  • the receptor protein of the present invention is considered to play an important role in vivo, for example. Therefore, the compound that changes the amount of the receptor protein of the present invention or its partial peptide in the cell membrane can be used as a preventive and / or therapeutic agent for a disease associated with dysfunction of the receptor protein of the present invention. .
  • such a compound may be used for a disease caused by overexpression of the receptor protein (eg, prostate cancer, and other cancers (non-small cell cancer, ovarian cancer, stomach cancer, bladder cancer, breast cancer, cervix) Cancer, colon cancer, rectal cancer, colorectal cancer, etc.), prostate hypertrophy, male gonadal dysfunction, infertility, premature birth, endometriosis, cirrhosis, hepatitis, liver failure, stones, etc.) and / or prevention It can be used as a therapeutic drug or a labor-inducing drug.
  • the receptor protein eg, prostate cancer, and other cancers (non-small cell cancer, ovarian cancer, stomach cancer, bladder cancer, breast cancer, cervix) Cancer, colon cancer, rectal cancer, colorectal cancer, etc.
  • prostate hypertrophy e.g, male gonadal dysfunction, infertility, premature birth, endometriosis, cirrhosis, hepatitis, liver failure, stones,
  • the compound when used as a preventive and / or therapeutic agent for a disease associated with dysfunction of the receptor protein of the present invention, it can be formulated according to the above-mentioned conventional means.
  • the neutralizing activity of an antibody against the receptor protein of the present invention, its partial peptide, or a salt thereof against the receptor protein or the like refers to an activity involving the receptor protein, for example, an activity to inactivate a signal transduction function. means. Therefore, when the antibody has neutralizing activity, signal transduction involving the receptor protein, for example, cell stimulating activity through the receptor protein (E.g., arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular Ca 2+ release, intracellular cAMP production, intracellular cAMP suppression, intracellular cGMP production, inositol phosphate production, cell membrane potential fluctuation, intracellular protein phosphorylation, In particular, it can inactivate the activity of c-fos, the activity of promoting or suppressing the decrease of pH, etc., particularly the activity of promoting intracellular cAMP production.
  • cell stimulating activity through the receptor protein E.g., arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular Ca 2+ release, intracellular
  • an antibody can be used for prevention and / or treatment of a disease caused by overexpression of the receptor protein.
  • a neutralizing antibody against the receptor protein of the present invention can be used for diseases caused by overexpression of the receptor protein (eg, prostate cancer, and other cancers (non-small cell cancer, ovarian cancer, gastric cancer, bladder) Diseases such as cancer, breast cancer, cervical cancer, colon cancer, rectal cancer, colorectal cancer), benign prostatic hyperplasia, male gonad dysfunction, infertility, premature birth, endometriosis, cirrhosis, hepatitis, liver failure, calculus ) Can be used as a prophylactic and / or therapeutic drug or as a labor-inducing drug.
  • diseases caused by overexpression of the receptor protein eg, prostate cancer, and other cancers (non-small cell cancer, ovarian cancer, gastric cancer, bladder)
  • Diseases such as cancer, breast cancer, cervical cancer, colon cancer, rectal cancer, colorectal cancer), benign prostatic
  • the preparation, dosage, administration method and the like of the medicament of the present invention can be the same as those described above (see the section “Diagnosis method of disease and medicament for treating the disease”).
  • the present invention relates to a non-DNA having the exogenous DNA of the present invention (hereinafter abbreviated as the exogenous DNA of the present invention) or its mutant DNA (sometimes abbreviated as the exogenous mutant DNA of the present invention).
  • a human mammal is provided.
  • Non-human mammals having the exogenous DNA of the present invention or the mutant DNA thereof include unfertilized eggs, fertilized eggs, germ cells including spermatozoa and their progenitor cells.
  • the calcium phosphate method, the electric pulse method, and the lipofection method It can be produced by transferring the target DNA by an agglutination method, microinjection method, particle gun method, DEAE-dextran method, or the like.
  • the exogenous DNA of the present invention can be transferred to somatic cells, organs of living organisms, tissue cells, and the like by the DNA transfer method, and can be used for cell culture, tissue culture, and the like. Can be fused with the above-mentioned germ cells by a known cell fusion method to produce the DNA-introduced animal of the present invention.
  • mice for example, porcupines, pigs, sheep, goats, magpies, dogs, cats, guinea pigs, eight-star, mice, rats and the like are used.
  • rodents and biological cycles are relatively short in terms of the creation of disease animal model systems, and rodents that are easy to breed, especially mice (for example, pure strains such as C57 BLZ6 strain, DBA2 strain, and hybrid strains) Preferred are B6C3 strain, BDF, strain, B6D2F, strain, BALBZc strain, ICR strain, etc.) or rat (eg, Wistar, SD, etc.).
  • mammal in the recombinant vector that can be expressed in mammals, human and the like can be mentioned in addition to the above-mentioned non-human mammals.
  • the exogenous DNA of the present invention refers not to the DNA of the present invention originally possessed by a non-human mammal, but to the DNA of the present invention once isolated and extracted from the mammal.
  • mutant DNA of the present invention those having a mutation (for example, mutation) in the base sequence of the original DNA of the present invention, specifically, base addition, deletion, substitution with another base, etc.
  • the resulting DNA is used, and also includes abnormal DNA.
  • the abnormal DNA means a DNA that expresses an abnormal receptor protein of the present invention, and for example, a DNA that expresses a normal receptor protein that suppresses the function of the receptor protein of the present invention is used.
  • the exogenous DNA of the present invention may be derived from a mammal of the same species or a different species as the target animal.
  • the human DNA of the present invention when the human DNA of the present invention is introduced, various mammals having the DNA of the present invention having high homology to the human DNA (eg, egret, dog, cat, guinea pig, hampus, rat, mouse, etc.)
  • the present invention is achieved by microinjecting a DNA construct (eg, a vector, etc.) in which the human DNA of the present invention is bound downstream of various promoters capable of expressing derived DNA into a fertilized egg of a target mammal, for example, a mouse fertilized egg.
  • a DNA-transfected mammal that highly expresses the above DNA can be produced.
  • expression vectors for the receptor protein of the present invention include plasmids derived from Escherichia coli, plasmids derived from Bacillus subtilis, plasmids derived from yeast, bacteriophages such as ⁇ phage, retroviruses such as Moroni leukemia virus, and vaccinia. Animal viruses such as virus or baculovirus are used. Among them, a plasmid derived from Escherichia coli, a plasmid derived from Bacillus subtilis, or a plasmid derived from yeast are preferably used.
  • Examples of the promoters that regulate the expression of DN DN include: (1) a promoter of DNA derived from a virus (eg, simian virus, cytomegalovirus, Moroni leukemia virus, JC virus, 'breast cancer virus, poliovirus, etc.); , 2 Promoters derived from various mammals (humans, egrets, dogs, cats, guinea pigs, hamsters, rats, mice, etc.), for example, albumin, insulin II, ⁇ roplakin II, eras lipase, Endothelin, muscle creatine kinase, glial fibrillary acidic protein, dal thiothion S-transferase, platelet-derived growth factor] 3, keratin K1, 1:10 and 1 ⁇ 14, collagen type I and II Type, cyclic AMP-dependent protein kinase j3 I subunit, dystro Int, tartrate-resistant alkaline phosphatase, at
  • a cytomegalovirus promoter capable of high expression throughout the whole body a human peptide chain elongation factor 1 (EF-1) promoter, a human and a chicken i3 actin promoter, and the like are preferable.
  • EF-1 human peptide chain elongation factor 1
  • the vector preferably has a sequence that terminates the transcription of the target mRNA in the DNA-transfected mammal (generally referred to as terminator).
  • each vector may be derived from a virus or a mammal.
  • the sequence of DNA can be used, and preferably, the SV40 virus of Simian virus or the like is used.
  • the splicing signal of each DNA, the enhancer region, a part of the intron of eukaryotic DNA, etc. are used 5 'upstream of the promoter region, between the promoter region and the translation region, or translation for the purpose of further expressing the target exogenous DNA. It is also possible to connect 3 ′ downstream of the region depending on the purpose.
  • the normal translation region of the receptor protein of the present invention is derived from liver, kidney, thyroid cells, and fibroblasts derived from humans or various mammals (for example, egrets, dogs, cats, guinea pigs, eight musters, rats, mice, etc.).
  • the exogenous abnormal DNA can produce a translation region obtained by mutating the translation region of the normal receptor protein of the present invention obtained from the above cells or tissues by point mutagenesis. .
  • the translation region can be prepared as a DNA construct that can be expressed in a transposed animal by a conventional DNA engineering technique in which it is ligated downstream of the above promoter and, if desired, upstream of the transcription termination site.
  • exogenous DNA of the present invention is provided to be present in all germ cells and somatic cells of the target mammal.
  • the presence of the exogenous DNA of the present invention in the germinal cells of the transgenic animal after the DNA transfer indicates that the progeny of the transgenic animal expresses the exogenous DNA of the present invention to all of its germinal cells and somatic cells. Means to keep.
  • the progeny of such animals that have inherited the exogenous DNA of the present invention have the exogenous DNA of the present invention in all of their germinal and somatic cells.
  • the non-human mammal into which the exogenous normal DNA of the present invention has been introduced can be subcultured in a normal breeding environment as the DNA-carrying animal after confirming that the exogenous DNA is stably maintained by mating. I can do it.
  • exogenous DNA of the present invention is ensured to be present in excess in all germ cells and somatic cells of the target mammal.
  • Excess of the exogenous DNA of the present invention in the germinal cells of the produced animal after the introduction of the DNA indicates that all the offspring of the produced animal transfer the exogenous DNA of the present invention to all of its germ cells and somatic cells. It means having extra.
  • the progeny of this type of animal that inherited the exogenous DNA of the present invention obtained a homozygous animal having the introduced DNA in excess of the exogenous DNA of the present invention in both homologous chromosomes in all of its germ cells and somatic cells. By breeding the male and female animals, it is possible to breed the cells so that all offspring have the DNA in excess.
  • the non-human mammal having the normal DNA of the present invention expresses the normal DNA of the present invention at a high level, and eventually promotes the function of endogenous normal DNA to thereby finally obtain the receptor protein of the present invention. It may develop quality hyperfunction, and can be used as a model animal for the disease.
  • the normal DNA-introduced animal of the present invention is used to elucidate the pathological mechanism of the hyperactivity of the receptor protein of the present invention, the disease associated with the receptor protein of the present invention, and It is possible to examine treatment methods.
  • the mammal into which the exogenous normal DNA of the present invention has been introduced has an increased symptom of the free receptor protein of the present invention
  • a therapeutic drug for a disease associated with the receptor protein of the present invention can also be used for screening tests.
  • non-human mammals having the foreign abnormal DNA of the present invention should be stably reared in a normal breeding environment as an animal having the DNA after confirming that the foreign DNA is stably retained by mating. Can be done.
  • the desired exogenous DNA can be incorporated into the above-mentioned plasmid and used as a raw material.
  • the DNA construct with the promoter can be prepared by a usual DNA engineering technique.
  • the introduction of the abnormal DNA of the present invention at the fertilized egg cell stage can be performed by Ensured to be present in all somatic cells.
  • the presence of the abnormal DNA of the present invention in the germinal cells of the produced animal after DNA transfer means that all the offspring of the produced animal have the abnormal DNA of the present invention in all of the germinal and somatic cells.
  • the progeny of this type of animal that has inherited the exogenous DNA of the present invention has the abnormal DNA of the present invention in all of its germinal and somatic cells.
  • a homozygous animal having the introduced DNA on both homologous chromosomes is obtained, and by crossing the male and female animals, it is possible to breed so that all offspring have the DNA.
  • the non-human mammal having the abnormal DNA of the present invention has a high level of expression of the abnormal DNA of the present invention, and ultimately inhibits the function of endogenous normal DNA, thereby finally achieving the receptor of the present invention.
  • the protein may become functionally inactive refractory, and can be used as a pathological model animal. For example, using the abnormal DNA-introduced animal of the present invention, it is possible to elucidate the pathological mechanism of the function-inactive refractory of the receptor protein of the present invention and to examine a method for treating this disease.
  • the abnormal DNA highly expressing animal of the present invention is useful for inhibiting the function of the normal receptor protein by the abnormal receptor protein of the present invention in the inactive refractory disease of the receptor protein of the present invention. (Dominant negative action).
  • the mammal into which the foreign abnormal DNA of the present invention has been introduced since the mammal into which the foreign abnormal DNA of the present invention has been introduced has an increased symptom of the released receptor protein of the present invention, it can be used for a therapeutic drug screening test for a functionally inactive refractory disease of the receptor protein of the present invention. Is also available. Further, as other possible uses of the above two kinds of DNA-introduced animals of the present invention, for example,
  • the DNA-transfected animal of the present invention it is possible to examine the clinical symptoms of a disease associated with the receptor protein of the present invention, including the inactive type refractory disease of the receptor protein of the present invention, etc.
  • a more detailed pathological finding in each organ of the disease model related to the receptor protein of the present invention can be obtained, a new treatment method can be developed, and further, a secondary disease caused by the disease can be studied and treated.
  • the DNA-transfected animal of the present invention in order to develop a therapeutic drug for a disease associated with the receptor protein of the present invention, including a functionally inactive refractory type of the receptor protein of the present invention, using the DNA-transfected animal of the present invention, It is possible to provide an effective and rapid method for screening for a therapeutic agent for the disease using a quantitative method and the like. Further, using the DNA-introduced animal of the present invention or the exogenous DNA-expressing vector of the present invention, it is possible to examine and develop a method for treating DNA associated with the receptor protein of the present invention.
  • the present invention provides a non-human mammalian embryonic stem cell in which the DNA of the present invention has been inactivated, and a non-human mammal deficient in expression of the DNA of the present invention.
  • a non-human mammal deficient in expression of the DNA in which the DNA of the present invention is inactivated [7] the DNA introduces a reporter gene (eg, a / 3-galactosidase enzyme gene derived from Escherichia coli).
  • a reporter gene eg, a / 3-galactosidase enzyme gene derived from Escherichia coli.
  • the non-human mammal according to the item [6], wherein the reporter gene can be expressed under the control of a promoter for the DNA of the present invention.
  • a non-human mammalian embryonic stem cell in which the DNA of the present invention has been inactivated is a DNA of the present invention possessed by the non-human mammal, which is artificially mutated to suppress the DNA expression ability.
  • the DNA does not substantially have the ability to express the receptor protein of the present invention (
  • the knockout DNA of the present invention may be referred to as a) (Non-human mammal embryonic stem cells (hereinafter abbreviated as ES cells)).
  • the method of artificially mutating the DNA of the present invention can be performed, for example, by deleting a part or all of the DNA sequence or inserting or substituting another DNA sequence by a genetic engineering technique.
  • the knockout DNA of the present invention may be produced by these mutations, for example, by shifting the codon reading frame or disrupting the function of the promoter or exon.
  • Non-human mammalian embryonic stem cells in which the DNA of the present invention has been inactivated include, for example, isolating the DNA of the present invention from the target non-human mammal, and attaching the neomycin resistance gene to the exon portion thereof. Exon function by inserting a drug resistance gene such as a hygromycin resistance gene, or a repo alligenic gene such as lacZ (i3-galactosidase gene) or cat (chloramphenico-l-acetyltransferase gene).
  • a drug resistance gene such as a hygromycin resistance gene
  • a repo alligenic gene such as lacZ (i3-galactosidase gene) or cat (chloramphenico-l-acetyltransferase gene).
  • Chain having a DNA sequence constructed as follows (hereinafter referred to as targeting vector ) Is introduced into the chromosome of the animal by, for example, homologous recombination, and the obtained ES cells are subjected to Southern hybridization analysis or DNA analysis using the DNA sequence on or near the DNA of the present invention as a probe.
  • the DNA sequence on the getter vector and the evening getter vector The DNA sequence in the neighboring region other than the DNA of the present invention used for the production of the evening was analyzed by PCR using primers to select knockout ES cells of the present invention. Can be obtained.
  • ES cells from which the DNA of the present invention is inactivated by the homologous recombination method or the like for example, those already established may be used as described above, or the method described in the known method of Evans and Kaufman may be used. A newly established one may be used.
  • ES cells for example, in the case of mouse ES cells, currently, 129 ES cells are generally used, but since the immunological background is not clear, a pure line of immunogen and genetically modified
  • C57BLZ6 mice or BD mice in which the number of eggs collected by C57BLZ6 has been improved by crossing with DBAZ2 (F57 between C57BL / 6 and DBAZ2) BDF and mice have the advantage of high number of eggs collected and robust eggs, and also have C57BLZ6 mice as a background.
  • the ES cells obtained by the method described above can be advantageously used when creating a disease model mouse, because the genetic background can be replaced with C57BL / 6 mice by backcrossing with C57BLZ6 mice.
  • blastocysts 3.5 days after fertilization are generally used. Many early embryos can be obtained.
  • male ES cells are generally more convenient for producing a germline chimera. It is also desirable to discriminate between males and females as soon as possible in order to reduce the complexity of culturing.
  • An example of a method for determining the sex of ES cells is a method of amplifying and detecting a gene in the sex-determining region on the Y chromosome by PCR.
  • this method conventionally, for example G-banding method, requires about 10 6 cells for karyotype analysis, since suffices ES cell number of about 1 colony (about 50), culture
  • the primary selection of ES cells in the early stage can be performed by discriminating between males and females, and the early stages of culture can be greatly reduced by enabling the selection of male cells at an early stage.
  • Embryonic stem cell lines obtained in this way usually have very good proliferative properties, but they must be carefully subcultured because they tend to lose their ability to generate individuals.
  • a suitable feeder cell such as STO fibroblasts
  • a carbon dioxide incubator preferably 5% carbon dioxide, 95% air or 5%
  • LIF 1-1000 OU / ml
  • trypsin / EDTA solution usually 0.001-0.5% trypsin Z
  • 0.1-5 mM EDTA preferably, about 0.1% trypsin ZlmM'EDTA
  • Such subculture is usually performed every 11 to 13 days.
  • ES cells can be cultured in monolayers at high densities or in suspension cultures to form cell clumps under appropriate conditions to produce various types of cells such as parietal, visceral, and cardiac muscles.
  • DNA expression of the present invention obtained by differentiating the ES cells of the present invention.
  • Defective cells are useful in cell biology studies of the receptor protein of the present invention or the receptor protein of the present invention in the mouth.
  • the non-human mammal deficient in DNA expression of the present invention can be distinguished from a normal animal by measuring the mRNA level of the animal using a known method and indirectly comparing the expression level.
  • non-human mammal those similar to the aforementioned can be used.
  • the targeting vector prepared as described above is introduced into mouse embryonic stem cells or mouse egg cells, and the DNA of the targeting vector of the present invention is inactivated by the introduction.
  • the DNA of the present invention can be knocked out by homologous recombination of the obtained DNA sequence with the DNA of the present invention on the chromosome of mouse embryonic stem cells or mouse egg cells by gene homologous recombination.
  • Cells in which the DNA of the present invention was knocked out were used as a targeting vector and a DNA sequence on a Southern hybridization analysis or a targeting vector using the DNA sequence on or near the DNA of the present invention as a probe.
  • the determination can be made by analysis by PCR using a DNA sequence of a nearby region other than the DNA of the present invention derived from a mouse as a primer.
  • the cell line in which the DNA of the present invention has been inactivated is cloned by gene homologous recombination, and the cell is cultured at an appropriate time, for example, at the 8-cell stage.
  • the animal produced is a chimeric animal composed of both cells having the normal DNA locus of the present invention and cells having the artificially altered DNA locus of the present invention.
  • all tissues are artificially mutated from a population obtained by crossing such a chimeric individual with a normal individual. It can be obtained by selecting individuals composed of cells having the added DNA locus of the present invention, for example, by judging coat color or the like.
  • the individuals obtained in this manner are usually individuals lacking the heterozygous expression of the receptor protein of the present invention, and are crossed with individuals lacking the heterozygous expression of the receptor protein of the present invention.
  • a homozygous expression-deficient individual of the receptor protein of the present invention can be obtained.
  • a transgenic non-human mammal having a chromosome into which the evening-getting vector has been introduced can be obtained by injecting a DNA solution into the nucleus of an egg cell by a microinjection method.
  • transgenic non-human mammals they can be obtained by selecting those having a mutation in the DNA locus of the present invention by homologous recombination of the gene.
  • the individual in which the DNA of the present invention has been knocked out may be subjected to subculture in a normal breeding environment after confirming that the DNA has been knocked out in the animal individual obtained by mating. it can.
  • the germline can be obtained and maintained according to a standard method. That is, by mating male and female animals having the inactivated DNA, homozygous animals having the inactivated DNA on both homologous chromosomes can be obtained.
  • the obtained homozygous animal can be efficiently obtained by rearing the mother animal in such a manner that one normal individual and plural homozygous animals are obtained.
  • homozygous and heterozygous animals having the inactivated DNA are bred and passaged. .
  • the non-human mammalian embryonic stem cells in which the DNA of the present invention has been inactivated are extremely useful for producing the non-human mammal deficient in expression of the DNA of the present invention.
  • non-human mammal deficient in DNA expression of the present invention lacks various biological activities that can be induced by the receptor protein of the present invention. It can be used as a model for diseases caused by inactivation of the biological activity of proteins, and is useful for investigating the causes of these diseases and studying treatment methods.
  • the non-human mammal deficient in expression of the DNA of the present invention can be used for screening for a compound having a therapeutic / preventive effect against diseases caused by the deficiency or damage of the DNA of the present invention.
  • the present invention comprises administering a test compound to a non-human mammal deficient in expression of the DNA of the present invention, and observing and measuring changes in the animal.
  • Examples of the non-human mammal deficient in DNA expression of the present invention used in the screening method include the same as described above.
  • Test compounds include, for example, peptides, proteins, non-peptidic compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts, animal tissue extracts, and plasma.These compounds are novel compounds. Or a known compound.
  • a non-human mammal deficient in expression of the DNA of the present invention is treated with a test compound and compared with an untreated control animal, and the change in each organ, tissue, disease symptoms, etc. of the animal is used as an index.
  • the therapeutic and prophylactic effects of the test compound can be tested.
  • test compound for example, oral administration, intravenous injection and the like are used, and it can be appropriately selected according to the symptoms of the test animal, the properties of the test compound, and the like.
  • the dose of the test compound can be appropriately selected according to the administration method, the properties of the test compound, and the like.
  • the blood glucose level of the test animal decreases by about 10% or more, preferably about 30% or more, more preferably about 50% or more.
  • the test compound can be selected as a compound having a therapeutic / preventive effect on the above-mentioned diseases.
  • Compounds obtained using the screening method are selected from the test compounds described above.
  • Diseases caused by deficiency or damage of the receptor protein of the present invention for example, prostate cancer, and other cancers (non-small cell cancer, ovarian cancer, gastric cancer, bladder cancer, breast cancer, cervical cancer) , Colon cancer, rectal cancer, colorectal cancer, etc.), prostate hypertrophy, male gonadal dysfunction, infertility, premature birth, endometriosis, cirrhosis, hepatitis, liver failure, calculus, etc. , Or birth inducers, etc.
  • a compound derived from the compound obtained by the above screening can be used in the same manner.
  • the compound obtained by the screening method may form a salt.
  • the salt of the compound include physiologically acceptable acids (eg, inorganic acids, organic acids, etc.) and bases (eg,
  • physiologically acceptable acid addition salts examples include salts with inorganic acids (eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, etc.) and organic acids (eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid) Succinic acid, tartaric acid, citric acid, malic acid, oxalic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid, etc.).
  • inorganic acids eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, etc.
  • organic acids eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid
  • Succinic acid tartaric acid, citric acid, malic acid, oxalic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid, etc.
  • a medicament containing the compound or a salt thereof obtained by the screening method can be produced in the same manner as the above-mentioned medicament containing the compound that changes the binding property between the receptor protein of the present invention and a ligand.
  • the preparations obtained in this way are safe and low toxic and can be used, for example, in humans or mammals (eg, rats, mice, guinea pigs, egrets, sheep, pigs, pigs, dogs, cats, dogs, Monkeys).
  • mammals eg, rats, mice, guinea pigs, egrets, sheep, pigs, pigs, dogs, cats, dogs, Monkeys.
  • the dosage of the compound or its salt varies depending on the target disease, the administration subject, the administration route, and the like.
  • a patient with prostate cancer (6 (As 0 kg)
  • the single dose varies depending on the administration target, target organ, symptoms, administration method, etc.
  • About 0.01 to 30 mg per day preferably It is convenient to administer about 0.1 to 2 Omg, more preferably about 0.1 to 1 Omg, by intravenous injection.
  • the dose can be administered in terms of 6 O kg.
  • the present invention provides a test compound administered to a non-human mammal deficient in expression of the DNA of the present invention, and detects or enhances the expression of a reporter gene.
  • the non-human mammal deficient in expression of DNA of the present invention may be one of the above-mentioned non-human mammals deficient in expression of DNA of the present invention, in which the DNA of the present invention is not introduced by introducing a reporter gene. Those which are activated and which can express the reporter gene under the control of the promoter for the DNA of the present invention are used.
  • test compound examples include the same compounds as described above.
  • reporter gene the same one as described above is used, and] 3-galactosidase gene (1 ac Z), a soluble alkaline phosphatase gene, and a luciferase gene are preferable.
  • the reporter gene is coded because the reporter gene is under the control of the promoter for the DNA of the present invention.
  • the activity of the promoter can be detected by tracing the expression of the substance.
  • the receptor protein of the present invention when a part of the DNA region encoding the receptor protein of the present invention is replaced with a 3-galactosidase gene (1 ac Z) derived from Escherichia coli, the receptor protein of the present invention is originally used. / 3-galactosidase is expressed instead of the receptor protein of the present invention in a tissue that expresses. Therefore, for example, by staining with a reagent serving as a substrate for i3-galactosidase, such as 5-promote 4-monocloth-1-indolyl / 3-galactopyranoside (X-gal), In addition, it is possible to observe the expression state of the receptor protein of the present invention in an animal body. Wear.
  • a reagent serving as a substrate for i3-galactosidase such as 5-promote 4-monocloth-1-indolyl / 3-galactopyranoside (X-gal)
  • the receptor protein-deficient mouse of the present invention or a tissue section thereof is fixed with daltaraldehyde or the like, washed with phosphate buffered saline (PBS), and then stained with X-ga1 at room temperature.
  • PBS phosphate buffered saline
  • the / 3-galactosidase reaction is stopped by washing the tissue sample with an ImM EDT AZPBS solution, and the color is developed. Observe it.
  • mRNA encoding 1 ac Z may be detected according to a conventional method.
  • the compound or a salt thereof obtained by using the above-mentioned screening method is a compound selected from the above-mentioned test compounds, and is a compound that promotes or inhibits the DNA promoter activity of the present invention.
  • the compound obtained by the screening method may form a salt.
  • the salt of the compound include physiologically acceptable acids (eg, inorganic acids) and bases (eg, organic acids).
  • a physiologically acceptable acid addition salt is preferred.
  • such salts include salts with inorganic acids (eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, etc.) and organic acids (eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid) Succinic acid, tartaric acid, citric acid, malic acid, oxalic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid, etc.).
  • inorganic acids eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, etc.
  • organic acids eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid
  • Succinic acid tartaric acid, citric acid
  • the compound or its salt that promotes the promoter activity of the DNA of the present invention can promote the expression of the receptor protein of the present invention and promote the function of the receptor protein. It is useful as a medicament such as a preventive and / or therapeutic agent for diseases associated with dysfunction.
  • the compound of the present invention that inhibits the activity of the promoter against DNA or a salt thereof can inhibit the expression of the receptor protein of the present invention and inhibit the function of the receptor protein. It is useful as a medicament such as an agent for preventing and / or treating a disease associated with excessive expression of one protein.
  • the compound of the present invention that promotes or inhibits the activity of a promoter for DNA includes, for example, prostate cancer, and other cancers (non-small cell cancer, ovarian cancer, stomach cancer, bladder cancer, breast cancer, cervical cancer) , Colon cancer, rectal cancer, colorectal cancer, etc.), prostate hypertrophy, male gonad dysfunction, infertility, preterm birth, endometriosis, cirrhosis, hepatitis, liver failure, calculus, etc. Useful as inducer. Further, a compound derived from the compound obtained by the above screening can also be used.
  • a drug containing a compound or a salt thereof obtained by the screening method can be produced in the same manner as the above-mentioned drug containing a compound that alters the binding property between the receptor protein of the present invention or a salt thereof and a ligand. it can.
  • the preparations obtained in this way are safe and have low toxicity, for example, in humans or mammals (for example, rats, mice, guinea pigs, egrets, higgs, bush, horses, cats, cats, cats). And monkeys and monkeys).
  • the dose of the compound or a salt thereof varies depending on the target disease, the subject of administration, the route of administration, and the like. Specifically, for example, in a prostate cancer patient (as 60 kg), the dose is about 0.1 to 10 mg per day, preferably about 1.0 to 50 mg, more preferably about 1.0 to 20 mg. In the case of parenteral administration, the single dose varies depending on the subject of administration, target organ, symptoms, administration method, and the like. ), It is convenient to administer about 0.01 to 3 Omg per day, preferably about 0.1 to 20 mg, more preferably about 0.1 to 1 Omg by intravenous injection. In the case of other animals, the amount converted per 60 kg can be administered.
  • the non-human mammal deficient in expression of the DNA of the present invention is extremely useful for screening a compound or a salt thereof that promotes or inhibits the activity of the promoter for the DNA of the present invention. Can greatly contribute to the investigation or prevention of various diseases caused by insufficient DNA expression and the development of Z or therapeutic agents.
  • genes encoding various proteins are ligated downstream thereof and injected into an egg cell of an animal to produce a so-called transgenic animal ( If a transgenic animal is created, it will be possible to specifically synthesize its receptor protein and examine its action in living organisms.
  • the receptor protein of the present invention can be obtained. It can be used as a search system for low molecular weight compounds that have the action of specifically promoting or suppressing the ability of protein itself to produce in the body.
  • vascular endothelial cells are screened for EDG-1 receptor antagonists or agonite antagonists, especially EDG-1 receptor agonists for the prevention and / or treatment of arteriosclerosis, myocardial infarction, cerebral infarction or ischemic disease.
  • Vascular smooth muscle cells are useful for the prevention and / or treatment of arteriosclerosis, myocardial infarction, cerebral infarction or ischemic disease. It has been found that it is useful for screening go
  • the EDG-1 receptor used in the present invention is a receptor containing an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 38.
  • the EDG-1 receptor having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 38 has the same amino acid sequence as the protein described in (Genbank Accssion Number AAA52336).
  • EDG-2 receptor used in the present invention is a receptor containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 40.
  • the EDG-2 receptor having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 40 has the same amino acid sequence as the protein described in (Genbank accession number U80811).
  • substantially identical amino acid sequence refers to, for example, about 50% or more, preferably about 60% or more, more preferably about 70% or more, and more preferably about 80% or more of the compared amino acid sequence. % Or more, more preferably about 90% or more, most preferably about 95% or more homology.
  • the protein having, for example, an EDG-1 receptor containing an amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 38 and substantially containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 38 Proteins having the same activity are preferred.
  • Examples of the protein having an amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 40 include, for example, a protein having an amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 40; A protein having an activity substantially equivalent to that of the EDG-2 receptor containing the amino acid sequence represented by No. 40 is preferred.
  • substantially the same activity examples include a ligand binding activity and a signal transduction activity. Substantially the same means that their activities are the same in nature. Therefore, the activities such as ligand binding activity and signal transduction activity are equivalent (eg, about 0.01 to 100 times, preferably about 0.5 to 20 times, more preferably about 0.5 to 20 times). However, the quantitative factors such as the degree of activity and the molecular weight of the protein may be different.
  • the activity such as the ligand binding activity and the signal information transmission activity can be measured according to a known method.
  • the activity can be measured according to a ligand determination method ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ screening method described later.
  • the EDG-1 receptor includes: (1) one or two or more amino acids in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 38 (preferably, about 1 to 30, more preferably 1 to 1); About 0, more preferably several (1 to 5) amino acids deleted amino acid sequence, (2) 1 or 2 or more (preferably 1 to 5) amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 38 An amino acid sequence having about 30 amino acids, more preferably about 1 to 10 amino acids, and still more preferably several (1 to 5) amino acids, and (3) an amino acid represented by SEQ ID NO: 38 One or two or more (preferably about 1 to 30, more preferably about 1 to 10, and more preferably several (1 to 5)) amino acids in the sequence are replaced with other amino acids (4) a protein containing an amino acid sequence or (4) an amino acid sequence obtained by combining them; Etc. may also be used.
  • EDG-2 Receptor (1) Amino acid represented by SEQ ID NO: 40 An amino acid sequence in which one or more (preferably about 1 to 30, more preferably about 1 to 10, and more preferably several (1 to 5)) amino acids have been deleted from the sequence, 2) one or more (preferably about 1 to 30, more preferably about 1 to 10, and more preferably several (1 to 5)) amino acids in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 40 (3) one or two or more amino acids in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 40 (preferably about 1 to 30, more preferably about 1 to 10, and more preferably A protein containing an amino acid sequence in which one (1 to 5) amino acids are substituted with another amino acid, or (4) an amino acid sequence obtained by combining them is also used.
  • the EDG-1 receptor and the EDG-2 receptor have the N-terminus (amino terminus) at the left end and the C-terminus (caprolepoxyl terminus) at the right end, according to the convention of peptide labeling.
  • the C-terminus of the receptor protein of the present invention may be any of a carboxyl group (_COOH), carboxylate (1-C ⁇ ), amide (_CONH 2 ) or ester (-COOR).
  • R in the ester e.g., methyl, Echiru, n- propyl, alkyl groups such as isopropyl, n- butyl, Shikurobe pentyl, C 3, such as cyclohexyl - 8 cycloalkyl group, for example, phenyl , 0; - C 6 _ 12 Ariru groups, naphthyl, for example, benzyl, C 7 _ 14 Ararukiru groups, such as single Nafuchiru C DOO 2 alkyl group such as a full Eniru C Bok 2 alkyl or ⁇ - naphthylmethyl such phenethyl
  • a bivaloyloxymethyl group commonly used as an oral ester is used.
  • EDG-1 receptor and EDG-2 receptor have a carboxyl group (or carboxylate) other than the C-terminus
  • those with a amide or esterified carbonyl group are also available.
  • ester included in 2 receptions.
  • the ester for example, the above-mentioned C-terminal ester or the like is used.
  • the EDG-1 receptor and the EDG-2 receptor include, in the above EDG-1 receptor and the EDG-2 receptor, an amino group of the N-terminal methionine residue having a protecting group (for example, formyl group, acetyl, etc.).
  • C 2 _ 6 Alcano of Protected by N-terminal such as C ⁇ e-acyl group
  • Glutamyl group generated by cleavage of N-terminal side in vivo and glutamic acid oxidation
  • Substitution on side chain of amino acid in molecule group e.g., _OH, - SH, amino group, imidazole group, in Dole group, Guanijino group
  • a suitable protecting group e.g., formyl group, etc.
  • 6 Ashiru group such as C 2 6 Arukanoiru group such Asechiru
  • Protected proteins and complex proteins such as so-called glycoproteins with sugar chains bound thereto are also included.
  • EDG-1 receptor examples include, for example, a receptor protein comprising an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 38, and the like.
  • EDG-2 receptor examples include, for example, a receptor protein consisting of an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 40 and the like.
  • the vascular endothelial cell that expresses EDG-1 receptor at a very high level as compared to other cells or tissues is used in the screening method of EDG-1 receptor agonist. It is characterized by.
  • the screening method of EDG-2 receptor agonist is characterized by using vascular smooth muscle cells that express the EDG-2 receptor at a much higher level than other cells or tissues.
  • the ligand for the EDG-1 receptor is not particularly limited as long as it is a compound that binds to the EDG-1 receptor.
  • S1P Sphingosine-1-phosphate
  • EDG-1 compounds that bind to EDG-1 receptor are abbreviated as EDG-1.
  • the ligand for the EDG-2 receptor is not particularly limited as long as it binds to the EDG-2 receptor.
  • lysophosphatidic acid LPA
  • EDG-2 a compound that binds to EDG-2 receptor alone is abbreviated as EDG-2.
  • the screening method of the present invention comprises:
  • EDG characterized by comparing (i) a case where EDG-1 is brought into contact with vascular endothelial cells and (ii) a case where EDG-1 and a test compound are brought into contact with vascular endothelial cells.
  • EDG-2 Provides method B for screening for receptor or gonist.
  • the screening method B of the present invention in the cases U) and (ii), for example, arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular Ca 2+ release, intracellular cAMP generation, intracellular cAMP in vascular smooth muscle cells Inhibition, intracellular c GMP generation, inositol phosphate production, cell membrane potential fluctuation, intracellular protein phosphorylation, activation of c-fos, cell proliferation, carbon monoxide production, migration activity, low molecular weight G protein Rho and R It is characterized by measuring and comparing ac activation, phosphatidylinosyl (PI) 3 kinase activity, and activity promoting or suppressing pH reduction.
  • PI phosphatidylinosyl
  • the screening method A of the present invention comprises:
  • c GMP generation inositol phosphate production, cell membrane potential fluctuation, intracellular protein phosphorylation, activation of c-fos, cell proliferation, carbon monoxide production, migration activity, activation of low molecular weight G proteins Rho and Rac,
  • PI phosphatidylinositol
  • a screening method for an EDG_2 receptor agonist which comprises selecting a test compound having an increase of, for example, 10% or more, preferably 30% or more, particularly preferably 50% or more,
  • EDG-2 receptor agonists for example, selecting a test compound having an increase of 10% or more, preferably 30% or more, particularly preferably 50% or more; or
  • test compounds for example, peptides, proteins, non-peptidic compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts, animal tissue extracts, etc. are used. Or a known compound.
  • test compound of screening method A a compound that changes the binding between EDG-1 and EDG-1 receptor is used, and screening method A of the present invention is used as a secondary evaluation system for the compound. Is preferred.
  • test compound of screening method B it is preferable to use a compound that changes the binding between EDG-2 and EDG-2 receptor, and to use screening method B of the present invention as a secondary evaluation system.
  • Screening for compounds that alter the binding between EDG-1 and EDG-1 receptor or compounds that alter the binding between EDG-2 and EDG-2 receptor can be carried out according to the above-described screening method for a compound that changes the binding property between the dj287G14.2 receptor protein and its ligand.
  • Vascular endothelial cells or vascular smooth muscle cells are prepared from blood vessels of humans and other mammals (eg, guinea pigs, rats, mice, mouse egrets, pigs, sheep, horsetails, monkeys, etc.) according to methods known per se. can do.
  • mammals eg, guinea pigs, rats, mice, mouse egrets, pigs, sheep, horsetails, monkeys, etc.
  • the vascular endothelial cells can be cultured, for example, according to the method described in (Cell 1999 Oct 29; 99 (3): 301-12) or a method analogous thereto.
  • the vascular smooth muscle cell can be cultured, for example, according to the method described in (Cardiovasc Res 1996 Sep; 32 (3): 516-23) or a method analogous thereto.
  • Arakidon acid release of vascular endothelial cells or vascular smooth muscle cells Arakidon acid release of vascular endothelial cells or vascular smooth muscle cells, Asechirukorin release, intracellular C a 2 + release, intracellular CAM P production, intracellular cAM A method known or known to promote or suppress P-suppression, intracellular cGMP production, inositol phosphate production, cell membrane potential fluctuation, intracellular protein phosphorylation, activation of c_fos, decrease in pH, etc.
  • the measurement can be performed using a commercially available measurement kit.
  • vascular endothelial cells or vascular smooth muscle cells are cultured in a multiwell plate or the like. Before performing screening, replace the cells with fresh medium or an appropriate buffer that is not toxic to cells, add test compounds, etc., incubate for a certain period of time, and then extract cells or collect supernatant. The products generated are quantified according to the respective methods. If the production of a substance (for example, arachidonic acid) as an indicator of cell stimulating activity is difficult to be assayed by a degrading enzyme contained in a cell, an inhibitor for the degrading enzyme may be added to perform the assay. In addition, activities such as cAMP production suppression can be detected as a production suppression effect on cells whose basic production amount has been increased by forskolin or the like.
  • a substance for example, arachidonic acid
  • an inhibitor for the degrading enzyme may be added to perform the assay.
  • activities such as cAMP production suppression can be detected as a production suppression effect on cells whose basic production amount has been increased by for
  • EDG-1 Reception Evening Agonist is a screening kit for the agonist and the gonist.
  • the screening kit for the agonist and the gonist contains vascular endothelial cells or vascular smooth muscle cells.
  • Examples of the screening kit of the present invention include the following.
  • Vascular endothelial cells or vascular smooth muscle cells were subcultured on a 12-well plate at 5 ⁇ 10 5 cells / well and cultured at 37 ° C, 5% CO 2 , and 95% air for 2 days.
  • EDG-1 or EDG-2 Dissolve EDG-1 or EDG-2 in ImM with PBS containing 0.1% ⁇ serum albumin (Sigma), and store at 120 ° C.
  • the EDG-1 receptor agonist obtained by using the screening method A or the screening kit of the present invention has the same action as the physiological activity of EDG-1.
  • EDG-1 Receptor Yuichi Angogonist obtained using the screening method A or the screening kit of the present invention which is useful as a safe and low toxic drug, can suppress the physiological activity of EDG-1 Therefore, it is useful as a safe and low toxic pharmaceutical that suppresses the physiological activity.
  • the EDG-2 receptor agonist obtained using the screening method A or the screening kit of the present invention has the same action as the physiological activity of EDG-2, it is safe according to the physiological activity.
  • the EDG-2 receptor antagonist obtained by using the screening method B or the screening kit of the present invention suppresses the physiological activity of EDG-2. Therefore, it is useful as a safe and low toxic drug for suppressing the physiological activity.
  • EDG-1 receptor agonist and EDG-2 receptor antagonist obtained by using the screening method or screening kit of the present invention include, for example, atherosclerosis, myocardial infarction, cerebral infarction, It is useful as a prophylactic and / or therapeutic agent for diseases such as blood heart disease.
  • agonist / anginaist When agonist / anginaist is used as a prophylactic and / or therapeutic agent for the above-mentioned diseases, use the same method as for a drug containing a compound that alters the binding between the dj287G14.2 receptor and the ligand described above. It can be formulated.
  • the preparations obtained in this way are safe and low toxic and can be used, for example, in humans or mammals (eg, rats, mice, guinea pigs, egrets, sheep, pigs, pigs, dogs, cats, dogs, Monkeys).
  • mammals eg, rats, mice, guinea pigs, egrets, sheep, pigs, pigs, dogs, cats, dogs, Monkeys.
  • EDG-1 receptor agonist or EDG-2 receptor is different depending on the target disease, administration subject, administration route, and the like.
  • EDG-1 receptor agonist or EDG-1 Oral administration of 2-receptor antagonist is generally, for example, in patients with arteriosclerosis (as 60 kg), about 0.1 to 100 mg per day, preferably about 1.0 to 50 mg, more preferably Is about 1.0-20 mg.
  • arteriosclerosis as 60 kg
  • the single dose varies depending on the administration target, target organ, symptoms, administration method, etc. It is convenient to administer about 0.01 to 30 mg, preferably about 0.1 to 20 mg, more preferably about 0.1 to 1 Omg per day by intravenous injection.
  • the dose can be administered in terms of 60 kg.
  • bases, amino acids, compounds, and the like are indicated by abbreviations, they are indicated based on the abbreviations by the IUPAC- IUB Commission on Biochemical Nomenclature or commonly used abbreviations in the field, and examples thereof are described below. Amino acids are also light When the isomers can be taken, L-form is indicated unless otherwise specified.
  • H is histidine P he feniralanin
  • SEQ ID NO: 4 This shows the nucleotide sequence of probe M-658T used in Example 1.
  • SEQ ID NO: 8 This shows the nucleotide sequence of DNA encoding human dj287G14.2 receptor.
  • [SEQ ID NO: 14] encodes mouse dj287G14.2 receptor A
  • SEQ ID NO: 15 This represents the amino acid sequence of mouse d287G142 receptor B.
  • SEQ ID NO: 16 This shows the nucleotide sequence of DNA encoding mouse d287G14.2 receptor B.
  • SEQ ID NO: 18 This shows the nucleotide sequence of DNA encoding mouse d287G14.2 receptor C.
  • SEQ ID NO: 20 This shows the nucleotide sequence of DNA encoding mouse d287G14.2 receptor D.
  • [SEQ ID NO: 22] encodes mouse type d287G14.2 receptor E
  • SEQ ID NO: 24 This shows the nucleotide sequence of DNA encoding mouse d287G14.2 receptor F.
  • SEQ ID NO: 26 This shows the nucleotide sequence of DNA encoding mouse type d287G14.2 receptor G.
  • SEQ ID NO: 28 This shows the nucleotide sequence of DNA encoding mouse d287G14.2 receptor H.
  • [SEQ ID NO: 40 represents the amino acid sequence of human EDG-2 receptor.
  • Sequence number: 42 represents the amino acid sequence of human EDG-3 receptor.
  • [SEQ ID NO: 44 represents the amino acid sequence of human EDG-4 receptor.
  • [SEQ ID NO: 45 represents the nucleotide sequence of cDNA encoding the amino acid sequence of human EDG-4 receptor.
  • [SEQ ID NO: 46 represents the amino acid sequence of human EDG-5 receptor.
  • [SEQ ID NO: 48 represents the amino acid sequence of human EDG-6 receptor.
  • [SEQ ID NO: 49 shows the nucleotide sequence of cDNA encoding the amino acid sequence of human EDG-6 receptor.
  • [SEQ ID NO: ' represents the amino acid sequence of the 50-hour EDG-7 receptor.
  • [SEQ ID NO: 52 represents the amino acid sequence of human EDG-8 receptor.
  • [SEQ ID NO: 53 represents the nucleotide sequence of cDNA encoding the amino acid sequence of human EDG-8 receptor.
  • [SEQ ID NO: 54 This shows the base sequence of the primer for human EDG-1 receptor used in EXAMPLE 7.
  • [SEQ ID NO: 55 This shows the base sequence of the primer for human EDG-1 receptor used in EXAMPLE 7.
  • [SEQ ID NO: 56 shows the nucleotide sequence of the probe for human EDG-1 receptor used in Example 7.
  • [SEQ ID NO: 57 This shows the base sequence of the primer for human EDG-2 receptor used in EXAMPLE 7.
  • [SEQ ID NO: 58 This shows the base sequence of the primer for human EDG-2 receptor used in EXAMPLE 7.
  • [SEQ ID NO: 59 This shows the nucleotide sequence of human EDG-2 receptor probe used in Example 7.
  • [SEQ ID NO: 60 This shows the nucleotide sequence of human EDG-3 receptor primer used in Example 7.
  • [SEQ ID NO: 61 shows the nucleotide sequence of the primer for human EDG-3 receptor used in Example 7.
  • [SEQ ID NO: 62 This shows the base sequence of human EDG-3 receptor probe used in Example 7.
  • [SEQ ID NO: 63 represents a nucleotide sequence of a primer for human EDG-4 receptor used in Example 7.
  • [SEQ ID NO: 64 represents the nucleotide sequence of the primer for human EDG-4 receptor used in Example 7.
  • [SEQ ID NO: 65 represents the nucleotide sequence of the probe for human EDG-4 receptor used in Example 7.
  • SEQ ID NO: 70 This shows the base sequence of human EDG-6 receptor primer 1 used in Example 7.
  • an mRNA sample derived from a human adult normal brain was used, and TaQM
  • the presence of mRNA derived from genes belonging to family 1 such as target G protein-coupled receptor, tyrosine kinase type receptor, ion channel, etc. in this sample was quantified by the an Analyze the expression levels of genes belonging to the family, such as protein-coupled receptor, tyrosine kinase receptor, and ion channel.
  • family 1 such as target G protein-coupled receptor, tyrosine kinase type receptor, ion channel, etc.
  • the expression of genes belonging to the 192-type target G protein-coupled receptor, tyrosine kinase type receptor, ion channel, and other families is analyzed.
  • GPCR genes for example ORL; MM 2; M 3; M 4; M 5; A "A 2A; A 2B; A" ⁇ ; a IB; a ID; a2A; o; 2B; a2C;; 81; / 32; / 33; ATI; AT2; BB1;
  • Amplification is performed using the following samples. First, preparation of a sample for hORLl mRNA (SEQ ID NO: 1: a kind of hGPCR mRNA, GenBank accession number X77130) is described.
  • the human adult normal brain in this case is known to express hORLl mRNA.
  • the hORL1 mRNA region was amplified using the upstream primer M-572F (SEQ ID NO: 2) and the downstream primer M-714R (SEQ ID NO: 3).
  • the upstream primer M-572F hybridizes to the complementary sequence at positions 749-771 in hORLl mRNA
  • the downstream primer M-714R hybridizes to the sequence at positions 869-891 in hORLl mRNA.
  • Detection is performed using M-658T (SEQ ID NO: 4). This probe hybridizes to the complementary sequence at positions 835-860 in hORL1 mRNA.
  • the probe M-658T has a 5 'end with a fluorescein-type fluorescent dye (FAM: reporter) and a 3' end with a mouth-type fluorescent dye (FAM: reporter).
  • FAMRA Quencher
  • the fluorescence of the reporter is suppressed by the movement phenomenon of the fluorescence resonance energy.
  • the 3 'end of the probe is synthesized with a phosphoric acid block to prevent extension of the probe by DNA polymerase during amplification.
  • Each PCR amplification is carried out using TaqMan (trademark) EZ TPCR Kit (Applied Biosystems Japan KK) in a total reaction volume of 201.
  • Final reagent concentrations are as follows: sample gene, 5 OmM Bicine, pH 8.2, 115 mM K ⁇ Ac, 0.01 mM EDTA, 60 nM ROX, 8% (W / V) glycerol, 3 mM Mn (OAc ) 2 , 300 d ATP, dGTP, dCTP, 600 iM dUTP, 900 nM each primer, 250 nM probe, 0.5 unit Amp Erase UNG, 5 unit rT th DNA polymerase.
  • the amplification reaction is carried out using an AB IPRIZM (trademark) 7900 HT sequence detection system (Applied Biosystems Japan Co., Ltd.) using the following temperature cycle profile.
  • the probe that hybridizes to the target sequence is hydrolyzed from the 5 ′ end by the 5, ⁇ 3 ′ exonuclease activity of the DNA polymerase. As a result, the reporter fluorescent dye is released and the fluorescence intensity increases.
  • Amplification product accumulation is measured by measuring the increase in fluorescence intensity of the reporter fluorescent dye in the reaction. At the same time, measure the fluorescence intensity of the fluorescent reference (fluorescent dye: ROX) for correcting the experimental error of the reaction solution.
  • the reporter fluorescent dye and the reference fluorescent dye are excited with light at a wavelength close to their maximum excitation, and the emission of the reporter fluorescent dye and the reference fluorescent color is measured near its emission maximum Is done. These frequencies are predetermined by the AB I PR I ZM TM 7900HT sequence detection system and are If an instrument is used, an appropriate frequency should be selected.
  • Fluorescence measurements were analyzed using 7900HT SDS software (Applied Biosystems Japan). First, the fluorescence intensity of the reporter fluorescent dye was standardized by the fluorescence intensity of the reference fluorescent dye, and the standardized reporter signal (R n) was calculated. Further, the value obtained by subtracting the average value (baseline) of Rn from Rn during the cycle of the initial PCR cycle is defined as ARn. On the amplification curve plotting ARn against the number of cycles, the number of cycles at which the analysis algorithm first detected an increase in the fluorescent signal (ARn), which corresponds to the exponential amplification of the amplification product, was determined by the number of cycles. (C T ).
  • PCR initial cycles considered not yet been exponential amplification of the amplification product (3 15 cycles) as a baseline, standard average ARn in the cycle The deviation was calculated. Then define a value 10 times the standard deviation as Th resho 1 d, the number of cycles corresponding to the value of the Th resho 1 d on each amplification curve and C T.
  • C T is that proportional to the initial target copy number logarithmic. Accumulation of amplification products in late cycles inhibits the reaction and eventually leads to a reaction.
  • Ru C T values such as the following are obtained.
  • Each C T value represents the average value obtained from the reaction of a plurality of times (e.g. 4 times).
  • Total RNA 27. 2 calibration curve from 25 ng of human adult normal brain is derived from C T values obtained from the amplification of known quantities of hORL l cDN A positive control ⁇ (standard sample). Specifically by plotting the C T against initial known amount of standard samples (logarithmic value), a calibration curve is prepared.
  • the calculation of the copy number at the time of inputting the sample derived from a human adult normal brain is performed using a calibration curve prepared from a known control type ⁇ . mRNA concentration is obtained by dividing the calculated copy number by the sample size.
  • RNA from human adult normal brain 1.04 * 10 3 or less genes belonging to one of the family, such as other target G protein-coupled receptors, tyrosine kinase enzymes, and ion channels The amount of mRNA produced is quantified. And all target G protein-coupled receptors, lipoprotein synthase type receptor Yuichi, and members belonging to families such as ion channels. By comparing gene mRNA production levels, we analyze the expression levels of genes belonging to families such as target G protein-coupled receptor, tyrosine kinase receptor, and ion channel in the normal human adult brain.
  • Example 2 Expression analysis of dj287G14.2 in prostate cancer cells
  • Pr EC was purchased from Takara Shuzo.
  • LNC aP—FGC was purchased from Dainippon Pharma.
  • PC-3 and Du145 cells were purchased from ATCC.
  • Pr EC was cultured using a prostate epithelial cell culture medium kit (Takara Shuzo).
  • LNCaP—FCC is RPMI-1640 (Invitrogen) containing 10% FCS
  • PC-3 and Dul45 cells are Hams F12K (Invitrogen) containing 10% FCS, 10% FCS, 2 mM L, respectively.
  • Glutamine, Eagle BSS cultured in Minimum essential medium Eagle which contains calories of non-essential amino acids.
  • the synthesized cDNA was dissolved in TE so as to be equivalent to 1 OmgZm1 RNA, and then diluted to 6.67 ng // l in TE containing 50 g / ml yeast tRNA.
  • amplification reaction reagents were TadMan TM Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems Japan, Inc.) and TaQMan TM Probe Kit (Applied (Biosystems Japan Co., Ltd.) to adjust the total reaction volume to 15 ⁇ 1.
  • the primers and probes used were designed from the nucleotide sequence of the human dj287G14.2 receptor using the software Primer Express (Applied Biosystems).
  • TaaMan TM PCR was performed with the ABI PRISM TM 7900HT Sequence Detection System (Applied Biosystems Japan, Inc.) and the temperature cycle used was TaqMan (trademark) Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems, Japan) According to the manual.
  • Quantitative TaQMan analysis of the amplification product was performed using 7900HT SDS software (Applied Biosystems Japan). The copy number was determined using the cDNA represented by SEQ ID NO: 10 containing the primer-amplified region designed based on the nucleotide sequence of human dj287G 14.2 receptor (SEQ ID NO: 8) as a standard. .
  • FIG. 1 shows the expression of dj287G14.2 in each cell line.
  • Example 3 dj 287 G 14.2 Expression of mRNA of Receptor in Human Tissue ABI PRISM 7900HT (Applied Biosystems) was used for quantification of mRNA expression.
  • the same primers and probes as those used in Example 2 were used for quantification from the nucleotide sequence of the human dj287G14.2 receptor.
  • the cDNA used as a sample was subjected to reverse transcription from 1 g of polyA + RNA (Clontech) derived from various human tissues using a random primer.
  • the reaction was carried out using reverse transcriptase SuperScriptll (GIBCO BRL) according to the attached protocol, and ethanol was precipitated and dissolved in 100 1 TE.
  • the reaction solution for the quantification follows the protocol of TadMan Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems), and the primer (0.9 M), probe (0.25 M), and sample cDNA 0.51 In addition to the above, it was prepared as 20 1 per well.
  • ABI PRISM 7900HT 40 cycles of 50 ° C (2 minutes), 95 ° C (10 minutes), 95 ° C (15 seconds) and 6 O: (1 minute) were performed.
  • Figure 2 shows the distribution of dj287G14.2 receptor mRNA expression in various human tissues. Shown in High expression levels were observed in placenta and liver.
  • Reference Example 1 Acquisition of dj287G14.2 receptor gene from human prostate cancer-derived cell line LNCAP cDNA by PCR
  • amplification was performed by PCR using the following two types of synthetic DNA.
  • R 1 5'-GCTAGCTCAGCATGGGCCAGTTTTGACAAGGAC-3 '(SEQ ID NO: 12)
  • the PCR reaction mixture was cDNA solution 1 X 1, 0.5 1 F 1 (10 ⁇ ⁇ ), 0.5 il Rl (10 / M), 2. 10 X reaction mixture, 2.5 1 d ⁇
  • TP 10 mM
  • 0.51 ExTaq 0.51 ExTaq (treasure)
  • 17.51 Otsuka distilled water were added to make a total of 251.
  • the reaction solution was subjected to PCR using ThermalCycler960P. ?
  • the conditions of ⁇ 1 were 95: after 2 minutes denaturation, a cycle of 98 ° C for 10 seconds, 63 ° C for 20 seconds, 72 ° C for 180 seconds was repeated 35 times.
  • the PCR product was purified using the QIAGEN PCR purification Kit and subcloned into the TA vector (pCR2.1T0P0).
  • CH0_dJ287G14.2-GFP a CH0 cell line that stably expresses a fusion protein of 1J287G142 and GFP, obtained in Reference Example 1 was used for the experiment.
  • CH0_dJ287G14.2-GFP cells or pAKKO-111H After transfection of mock CHO cells at a concentration of 2 x 10 cells on a 96-well plate, the cells were cultured overnight and used for measurement of cAMP production. 's balanced salt solution, Gibco) supplemented with 0.1% serum albumin and 0.2 mM 3-Isobutyl-l-methylxanthine (IBMX, Sigma) Wash the cells twice with Atssey buffer And pre-incubated at 37 for 30 minutes.
  • IBMX 3-Isobutyl-l-methylxanthine
  • Example 5 A concentration-dependent increase in cAMP production was observed, whereas no increase in cAMP production was observed in the control mock CHO cells as shown in Fig. 10.
  • Example 5 CHO cells Of dJ287G14.2-GFP fusion protein expressed in Escherichia coli by addition of concanavalin A
  • the plasmid of the dJ287G14.2-GFP expression vector was introduced into CH Odh fr- cells using gene transfer (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). Finger GFP expression Cells were selected as a standard, and a CHO cell line expressing the fusion protein of 3J287G14.2 and GFP, CHO-dJ287G14.2-GFP, was established.
  • Example 6 Cloning of Mouse dj287G14.2 Counter One Part An exon encoding mouse dj287G14.2 was searched using the Celera II mouse genome database, and a translation region was determined based on this sequence. Primers to be amplified, 5 'RACE, 3 and RACE primers were prepared The amplification of the translation region was performed using primer (SEQ ID NOs: 29, 30, 31, and 32) and mouse spleen, lung, day 14 PCR was performed using fetal cDNA (Ma rat hon- ary cDNA, Clontech) and PyroBEST DNA po1ymerase (TA KARA) 3.
  • Primers to be amplified 5 'RACE, 3 and RACE primers were prepared The amplification of the translation region was performed using primer (SEQ ID NOs: 29, 30, 31, and 32) and mouse spleen, lung, day 14 PCR was performed using fetal cDNA (Ma rat hon- ary cDNA, Clontech) and Pyro
  • mouse dj 287 G14.2 shows two types of N-terminal sequences that differ depending on how the donor site of the first exon is linked to the acceptor site of the second exon.
  • mice dj287G 14.2 consisting of a total of 1165 to 1258 amino acid residues (SEQ ID NO: 13, 15, 17, 19, 2) ORFs (SEQ ID NOs: 14, 16, 18, 20, 22, 22, 24, 26, 28) encoding 1, 23, 25, 27) were obtained.
  • Example 7 Expression of mRNA of G protein-coupled receptor EDG family in vascular cells
  • RNA Quantified human normal coronary artery vascular endothelial cells, human normal coronary artery vascular smooth muscle cells, human normal aortic vascular endothelial cells, human normal aortic vascular smooth muscle cells (purchased from Asahi Techno Glass Co.)
  • the total RNA was prepared according to the manual described in (2). Using Super Script II reverse transcriptase (GI BCO BRL) as a reverse transcriptase from 1 g of RNA, the reaction was carried out at 42 ° C according to the attached manual. After the reaction was completed, ethanol was precipitated and dissolved in TE. (Equivalent to 100 ng / l RNA).
  • the mRNA expression level of the EDG family was quantified using a Sequence Detection System PRISM 7900 HT system (Applied Biosystems).
  • PRISM 7900 HT system Applied Biosystems
  • Ta QMan probes and primers specifically recognizing each receptor were purified using Primer Express (PE App 1 ied Biosystems software 1). Designed and synthesized.
  • the reaction solution for quantification was prepared according to the manual of TaqM anniversal PGR Master Mix (Applied Biosystems, Inc.). Each G protein-coupled receptor primer (0.9 LtM), probe (0. 25 ⁇ , ⁇ ), and cDNA was prepared by adding 25 ng of total RNA. The PCR reaction was repeated at 50 ° C for 2 minutes and 95 ° C for 10 minutes, followed by 40 cycles of 95 ° C for 15 seconds and 60 ° C for 1 minute.
  • EDG-2 was 148 and 922 copies / 25118 in human normal coronary vascular smooth muscle cells and human normal aortic vascular smooth muscle cells, respectively.
  • Tota 1 RNA, 310,544 copyno 25 ng tota 1 RNA showed the highest expression level among the 354 G protein-coupled receptors also quantified.
  • ADVANTAGE OF THE INVENTION According to the analysis method and the quantification kit of the present invention, it is possible to provide a system that can detect the presence or absence of a target mRNA and the transcription amount thereof with high sensitivity in a single process for a sample containing various types of mRNA. . Therefore, according to the present invention, it is possible to provide a system capable of quickly and highly sensitively analyzing the expression of a target gene.
  • G protein-coupled receptor tyrosine oxidase receptor
  • ion channel mRNAs belonging to families such as G protein-coupled receptor, tyrosine oxidase receptor, and ion channel
  • G protein-coupled receptor, tyrosine phosphorylation Disease genes related to genes belonging to families such as oxidase type receptors and ion channels can be quickly and highly sensitively identified.
  • a disease affected by a patient can be diagnosed with high accuracy using an mRNA sample collected from the patient.
  • the DNA encoding the receptor protein of the present invention, its partial peptide or its salt, or the receptor protein of the present invention or its partial peptide may be used for prostate cancer and other cancers (non-small cell cancer, ovarian cancer, gastric cancer , Bladder cancer, breast cancer, cervical cancer, colon cancer, rectal cancer, colorectal cancer, etc.), benign prostatic hyperplasia, male gonad dysfunction, infertility, premature birth, birth inducer, endometriosis, liver cirrhosis, hepatitis, liver failure It is useful as a prophylactic and / or therapeutic agent for calculi.
  • the receptor protein of the present invention its partial peptide or a salt thereof, and a protein (eg, lectin) having an affinity for a sugar chain as one of the ligands, the ligand and dJ287G14.
  • a protein eg, lectin
  • Compounds that change the binding to the receptor, its partial peptide or its salt can be efficiently screened.
  • EDG-1 receptor agonists By using vascular smooth muscle cells for EDG 2 receptors, it is possible to efficiently screen for EDG 2 receptors.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pregnancy & Childbirth (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Gynecology & Obstetrics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Marine Sciences & Fisheries (AREA)
  • Epidemiology (AREA)

Description

遺伝子発現解析方法 技術分野
本発明は、 複数の遺伝子の発現解析をまとめて行う遺伝子発現解析方法、 その ために用いられる遺伝子発現解析キット等に関する。 また、 本発明は、 その遺伝 子発現解析方法およびその解析キットを用いた疾患関連遺伝子の特定方法に関す る。 さらに、 本発明は疾患関連遺伝子の発現量と変異の解析による特定疾患の診 断方法、 及びその特定された遺伝子 D N Aまたはその遺伝子産物を含む医薬品に も関する。 さらに、 本発明は、 ヒト由来の Gタンパク質共役型レセプタータンパ ク質 （dj 287G14. 2レセプ夕一） およびそれをコードするポリヌクレオチドの用途 に関する。 さらに、 本発明は、 マウス由来の新規な Gタンパク質共役型レセプ夕 —タンパク質 （dj 287G14. 2レセプター） 、 それをコードするポリヌクレオチドお よびそれらの用途に関する。 さらに、 本発明は E D G— 1レセプ夕一ァゴニスト ·アン夕ゴニストまたは E D G— 2ァゴニスト ·アンタゴニス卜のスクリ一ニン グ方法に関する。 背景技術
Gタンパク質共役型レセプタータンパク質は生体の細胞や臓器の各機能細胞表 面に存在し、 それら細胞や臓器の機能を調節する分子、 例えばホルモン、 神経伝 達物質および生理活性物質等の標的として生理的に重要な役割を担っている。 レ セプターは生理活性物質との結合を介してシグナルを細胞内に伝達し、 このシグ ナルにより細胞の賦活ゃ抑制といった種々の反応が惹起される。 各種生体の細胞 や臓器の内の複雑な機能を調節する物質と、 特異的レセプタータンパク質、 G夕 ンパク質共役型レセプ夕一タンパク質との関係を明らかにすることは、 各種生体 の細胞や臓器の機能と密接に関連した医薬品開発に非常に重要な手段を提供する ものであり既存の医薬品の約 4 5 %が細胞膜上のレセプタータンパク質に作用し 、 その中で Gタンパク質共役型レセプタータンパク質が大きな割合を占めている ことも知られている (Drews, J. , Sc i ence 287, 1960 (2000) ) 。 一方、 イオンチャネルは細胞膜を貫通する膜タンパク質で、 イオンの膜透過を 調節して細胞応答を担っている。 イオンに対する選択性があるために、 N a +、 K+、 C a 2 +、 C 1—チャネル等と呼ばれ、 チャネルの開閉機構によって、 電位 依存型 （N a +、 K +、 C a 2 +) と、 レセプター依存型 （ニコチン性ァセチルコ リンレセプ夕一、 GA B Aレセプ夕一） に分類される。 これらのイオンチャネル は、 生体内において多くの生理的機能を有する。 例えば、 K+イオンを選択的に 透過させる膜タンパクである Κ+チャネルは、 生体内で、 細胞の静止膜電位形成 、 再分極、 活動電位発生頻度の調節など重要な生理機能に密接に関わっている。 また、 C 1—チャネルは神経筋の興奮性調節、 細胞容積調節、 上皮細胞膜におけ る電解質 ·水分の輸送など多様な生理機能を示す。 このように、 各種イオンチヤ ネルは、 種々の生理機能を有するので医薬品の標的となる。
また、 生体のレセプ夕一には酵素活性を有するものも存在し、 例えば、 チロシ ンリン酸化酵素型レセプターなどが挙げられる。 その酵素活性が種々の生理的機 能を奏するために、 チロシンリン酸化酵素型レセプターも多くの医薬品の標的と なっている。 さらに、 その他にも、 転写因子、 トランスポーター、 プロテインキ ナーゼ、 プロティンフォスファタ一ゼ、 プロテアーゼ、 熱ショックプロテイン、 A T P a s eまたは D N A結合プロテイン等の遺伝子ファミリ一が存在し、 それ ぞれが数十から数百種類のファミリ一をなし医薬の標的となっている。
現在までにそれぞれ多種類の遺伝子 （Gタンパク質共役型レセプター約 4 0 0 種、 チロシンリン酸化酵素型レセプター約 1 0 0種、 イオンチャネルのファミリ 一約 1 5 0種） が同定、 クローニングされている。 しかし、 それら全ての遺伝子 についてその機能が明らかとなったわけではなく、 機能不明のタンパク質が多数 存在している。 これらのタンパク質の機能を解明すること力 新規医薬品の開発 への第一段階となる。
生体内で発現している遺伝子を解析する方法として、 ノーザンプロット法、 デ ィファレンシャルディスプレイ法、 R T— P C R法などが用いられてきた。 しか し、 一度に解析できる遺伝子数は限られ、 多くの遺伝子を含む試料の処理は困難 であった。 また定量性についても、 その感度は低いものであった。
近年、 生体内で発現している全ての遺伝子を解析する手段として開発されたマ イクロアレイ法は、 スライドガラスなどのチップ上に数千ないし数万個の DNA 情報を合成またはスポッ卜し、 解析する RNAに由来する標的 DNAをハイプリ ダイズし、 生成されたハイブリッドを指標として、 遺伝子の転写量を測定する方 法であるが、 定量性についての感度は高いものではなかつた。
一方、 特定の mRNAを定量する方法としては、 T a qMa n法等が知られて おり、 例えば、 特許公開第 200 1— 204483号公報には、 h T E R T m RNAを定量する方法が開示されている。 さらに T a QMa n法は、 SNP解析 を行う方法の一つとしても知られており S N Pを認識するプライマーとプローブ を設計し、 それを用いることにより発現量だけでなく疾患に関連する変異を解析 することもできる。
本発明で用いられる dj 287G14.2レセプ夕一と同一のアミノ酸配列を有するタン パク質およびそれをコードする DNAが記載されている （W〇2001/182 07) 。 しかしながら、 これらの Gタンパク質共役型レセプタータンパク質の機 能およびその生理的リガンドは解明されていなかった。
また、 EDG— 1レセプ夕一 （Biochem Biophys Res Commun 1997 Nov 26:240 (3) :737-41) 、 EDG—2レセプ夕一 (Biochem Biop ys Res Commun 1997 Feb 24 ;231 (3) :619-22) 、 EDG— 3レセプター (Cell 1999 Oct 29;99 (3) :301-12) 、 EDG— 5レセプ夕一 (J Biol Chem 1999 Dec
10;274 (50) :35343-50) 、 EDG— 8レセプ夕一 (Biochemistry 2001 Nov 20:40(46) :14053- 60) が記載されており、 これらレセプターが血管組織に発現し ていることが記載されている。 しかし、 各レセプターが血管のどの細胞にどの程 度発現しているか解明されていなかった。 EDG_4、 EDG— 6、 EDG- 7 については血管組織での明確な発現は知られていない。
しかしながら、 ある特定のファミリーに属する多くの遺伝子の発現を高感度に 、 しかも一度に定量するという思想およびそれを実現するための定量システムは これまでには全く知られていなかった。 したがって、 ある特定のファミリーに属 する多くの遺伝子の発現を高感度に、 かつ一度に定量できるシステムがあれば、 ある疾患細胞等で特異的に高発現している遺伝子を相対的かつ定量的に同定する ことができるので、 疾患遺伝子の特定、 特定疾患の診断、 その疾患の治療等の分 野で有用である。 発明の開示
すなわち本発明は、 以下に示す、 遺伝子発現解析方法、 診断方法、 それらの方 法に用いられる定量キット、 それらの方法又はキットによって機能が解明される タンパク質もしくはその用途などを提供する。
(1) 複数の遺伝子個々の発現量をまとめて定量解析することにより、 ある細胞 または組織においてその発現が特徵的に亢進または減少している遺伝子を同定す ることを特徴とする遺伝子発現解析方法。
(2) 特定の遺伝子ファミリーに属する複数の遺伝子の発現解析をまとめて行う ことにより、 その遺伝子ファミリ一の中で、 ある細胞または組織においてその発 現が特徴的に亢進または減少している遺伝子をその発現量の絶対値を算出するこ とで同定する上記 （1) 記載の方法。
(3) 複数の各反応場所で、 複数の標的 mRNAを含み得る mRNA試料と、 そ れぞれの標的 m RNAに対応するプラィマ一対をそれぞれ含んでなる各増幅試薬 とを接触させることにより、 増幅反応を行い、 得られた増幅生成物の生成量を測 定することによって遺伝子の発現解析を行う上記 （1) 記載の方法。
(4) 複数の反応場所を有する反応器具の各反応場所で、 複数の標的 mRNAを 含み得る m R N A試料と、 それぞれの標的 m RNAに対応するプライマ一対をそ れぞれ含んでなる各増幅試薬とを接触させることにより、 増幅反応を行い、 得ら れた増幅生成物の生成量を測定することによって遺伝子の発現解析を行う上記 （ 1) 記載の方法。
( 5 ) 前記特定の遺伝子ファミリ一が Gタンパク質共役型レセプター遺伝子ファ ミリ一である上記 （2) 記載の方法。
(6) 前記特定の遺伝子ファミリーがチロシンリン酸化酵素型レセプ夕一遺伝子 ファミリーである上記 （2) 記載の方法。
(7) 前記特定の遺伝子ファミリーがイオンチャネル遺伝子ファミリーである上 記 （2) 記載の方法。
(8) 前記特定の遺伝子ファミリーが転写因子、 トランスポー夕一、 プロテイン キナーゼ、 プロテインフォスファタ一ゼ、 プロテア一ゼ、 ヒートショックプロテ イン、 ATP a s eまたは DN A結合プロテインのいずれかに関連する遺伝子フ アミリーである上記 （2) 記載の方法。
(9) 上記 （1) 〜 （8) のいずれかに記載の方法によって特定される、 ある細 胞ゃ組織において特徴的に発現が亢進または減少している遺伝子またはその遺伝 子産物を含む医薬。
(10) 前記反応器具が反応場所としての複数の穴を有するプレートである上記 (3) または （4) 記載の方法。
(1 1) 前記プレートが 96穴または 384穴プレートである上記 （10) 記載 の方法。
(12) 10〜800個のプライマ一対を用いる上記 （3) または （4) 記載の 方法。
(13) 10〜300個のプライマ一対を用いる上記 （3) または （4) 記載の 方法。
(14) 前記増幅反応がポリメラーゼ連鎖反応である上記 （3) 、 （4) 、 (1 2) または （13) 記載の方法。
(15) SNPの解析を行う前記 （14) 記載の方法。
(16) 増幅生成物の生成量の測定が、 該増幅生成物に相補的又は実質的に相補 的であるプローブを用いて行われる上記 （3) または （4) 記載の方法。
(17) 前記プローブが、 mRNAにハイブリダィズするプローブである上記 （ 16) 記載の方法。
(18) 前記プローブが蛍光標識されたプローブである上記 （17) 記載の方法
(19) 前記 mRNA試料として、 正常ヒト由来の mRNA試料および特定の疾 患患者由来の mRNA試料とを用いる上記 （3) または （4) 記載の方法。
(20) 前記疾患患者由来の mRNA試料中で発現が亢進または減少している m RNAを特定し、 該 mRNAをコードする遺伝子を該疾患関連遺伝子であると特 定する上記 （19) 記載の方法。
(21) 前記特定の遺伝子ファミリーがヒト Gタンパク質共役型レセプ夕一タン パク質遺伝子フアミリーであり、 癌患者由来の m R N A試料を用いることによつ て癌関連遺伝子を特定する上記 （20) 記載の方法。
(22) 標的遺伝子配列のェクソン領域の一方の鎖に相補的又は実質的に相補的 である第 1のプライマーおよび該標的遺伝子配列のェクソン領域の他方の鎖に相 補的又は実質的に相補的である第 2のプライマーから成るプライマー対を 2対以 上含んでなるプライマー対キット。
(23) 前記標的遺伝子がヒト Gタンパク質共役型レセプタータンパク質遺伝子 、 チロシンリン酸化酵素型レセプ夕一遺伝子またはイオンチャネル遺伝子である 上記 （22) 記載のプライマー対キット。
(24) 10〜800個のプライマ一対で構成される上記 （23) 記載のプライ マー対キット。
(25) 10〜300個のプライマー対で構成される上記 （23) 記載のプライ マー対キット。
(26) 疾患関連遺伝子を特定するための上記 （23) 記載のプライマ一対キッ 卜の使用。
(27) 複数の反応場所を有する反応器具の各反応場所に、 標的 mRNAに対応 するプライマー対をそれぞれ含む各増幅試薬を充填してなる mRNA定量キット
(28) さらに蛍光プローブを含んでなる上記 （27) 記載のキット。
(29) さらに T t h DN Aポリメラーゼを含んでなる上記 （28) 記載のキ V卜。
(30) 上記 （1) 〜 （4) のいずれかの方法または上記 （27) の定量キット を用いて、 患者から採取した m R N A試料に含まれ得る複数の標的疾患遺伝子の mRNAを定量することにより、 あるいはその mRNAの変異量を測定すること によりその患者の疾患を診断する方法。
(31) 癌関連ヒト Gタンパク質共役型レセプタータンパク質遺伝子を同定する ことによって癌を診断する上記 （30) 記載の診断方法。
(32) 上記 （30) 記載の診断方法によって同定された遺伝子の遺伝子産物に 対するァゴニスト、 アン夕ゴニストもしくは抗体、 またはその遺伝子産物をコー ドする DN Aを含んでなる医薬。
(33) 癌治療剤である上記 （32) 記載の医薬。
(34) 上記 （30) に記載の診断方法によって同定された遺伝子の遺伝子産物 に対するァゴニスト、 アン夕ゴニストもしくは抗体、 またはその遺伝子産物をコ —ドする D N Aを投与することによってその遺伝子が関与する疾患を治療する方 法。
(35) 前記疾患が癌である上記 （34) 記載の治療方法。 また、 本発明の遺伝子発現解析方法を用いた結果、 dj287G142レセプターが前 立腺癌細胞において高発現していること分かった。 本発明は、 この知見に基づい て、 レセプタータンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩 （dj287G14.2 レセプ夕一） 、 該レセプタ一タンパク質またはその部分ペプチドをコードするポ リヌクレオチド （DNA、 RN Aおよびそれらの誘導体） 、 該レセプタータンパ ク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体などの新規用途を提供 する。 さらに、 新規なマウス由来の dj287G14.2レセプター、 該レセプタータンパ ク質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチド （DNA、 RNAお よびそれらの誘導体） 、 該レセプ夕ータンパク質もしくはその部分ペプチドまた はその塩に対する抗体などを提供する。
すなわち、 本発明は
(36) 配列番号： 9で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァ ミノ酸配列を含有するレセプ夕一夕ンパク質もしくはその部分べプチドまたはそ の塩を含有してなる医薬、
(37) 癌、 前立腺肥大症、 男性性腺機能障害、 不妊、 早産、 子宮内膜症、 肝硬 変、 肝炎、 肝不全または結石の予防および/または治療剤、 または分娩誘発剤で ある上記 （36) 記載の医薬、
(38) 癌が前立腺癌、 非小細胞癌、 卵巣癌、 胃癌、 膀胱癌、 乳癌、 子宮頸部癌 、 結腸癌、 直腸癌または大腸癌である上記 （37) 記載の医薬、
(39) 配列番号： 9で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァ ミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩に対す る抗体を含有してなる診断薬、
(40) 癌、 前立腺肥大症、 男性性腺機能障害、 不妊、 早産、 子宮内膜症、 肝硬 変、 肝炎、 肝不全または結石の診断薬である上記 （39) 記載の診断薬、
(41) 配列番号： 9で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァ ミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩に対す る抗体を含有してなる医薬、
(42) 癌、 前立腺肥大症、 男性性腺機能障害、 不妊、 早産、 子宮内膜症、 肝硬 変、 肝炎、 肝不全または結石の予防およびノまたは治療剤、 または分娩誘発剤で ある上記 （41) 記載の医薬、
(43) (1) 配列番号： 9で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に 同一のアミノ酸配列を含有する Gタンパク質共役型レセプ夕一タンパク質、 その 部分ペプチドまたはその塩および （2) 糖鎖に親和性を示すタンパク質を用いる ことを特徵とする該レセプタータンパク質またはその塩と糖鎖に親和性を示す夕 ンパク質との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリ一ニング方法、 (44) 糖鎖に親和性を示すタンパク質がァスパラギン結合型糖鎖またはセリン •スレオニン結合型糖鎖に親和性を示すタンパク質である上記 （43) 記載のス クリーニング方法、
(45) 糖鎖に親和性を示すタンパク質がレクチンである上記 （43) 記載のス クリーニング方法、
(46) 糖鎖に親和性を示すタンパク質がコンカナバリン 、 レンズマメレクチ ン、 エンドゥマメレクチン、 チョウセンアサガオレクチン、 ィヌェンジユレクチ ンまたはフイ トへマグルチニンである上記 （43) 記載のスクリーニング方法、 (47) (1) 配列番号： 9で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に 同一のアミノ酸配列を含有する Gタンパク質共役型レセプ夕一タンパク質、 その 部分ペプチドまたはその塩および （2) 糖鎖に親和性を示すタンパク質を含有す ることを特徴とする該レセプタータンパク質またはその塩と糖鎖に親和性を示す タンパク質との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング用キッ 卜、
(48) 上記 （46) 記載のスクリーニング方法または上記 （47) 記載のスク リ一ニング用キットを用いて得られうる、 糖鎖に親和性を示すタンパク質と配列 番号： 9で表わされるァミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァミノ酸配列 を含有する Gタンパク質共役型レセプ夕一タンパク質またはその塩との結合性を 変化させる化合物またはその塩、
( 4 9 ) 上記 （4 8 ) 記載の化合物またはその塩を含有してなる医薬、
( 5 0 ) 癌、 前立腺肥大症、 男性性腺機能障害、 不妊、 早産、 子宮内膜症、 肝硬 変、 肝炎、 肝不全または結石の予防及び/又は治療剤、 または分娩誘発剤である 上記 （4 9 ) 記載の医薬、
( 5 1 ) 癌が前立腺癌、 非小細胞癌、 卵巣癌、 胃癌、 膀胱癌、 乳癌、 子宮頸部癌 、 結腸癌、 直腸癌または大腸癌である上記 （5 0 ) 記載の医薬、
( 5 2 ) 配列番号： 9で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァ ミノ酸配列を含有する Gタンパク質共役型レセプ夕一タンパク質またはその部分 ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドを用いるこ とを特徴とする、 当該 Gタンパク質共役型レセプタータンパク質の発現量を変化 させ、 癌、 前立腺肥大症、 男性性腺機能障害、 不妊、 早産、 子宮内膜症、 肝硬変 、 肝炎、 肝不全または結石を予防及び/又は治療する化合物またはその塩、 また は分娩誘発薬のスクリ一二ング方法、
( 5 3 ) 配列番号： 9で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァ ミノ酸配列を含有する Gタンパク質共役型レセプタータンパク質またはその部分 ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドを含有して なる、 当該 Gタンパク質共役型レセプ夕一タンパク質の発現量を変化させ、 癌、 前立腺肥大症、 男性性腺機能障害、 不妊、 早産、 子宮内膜症、 肝硬変、 肝炎、 肝 不全または結石を予防及び Z又は治療する化合物またはその塩、 または分娩誘発 薬のスクリーニング用キット、
( 5 4 ) 上記 （5 2 ) 記載のスクリーニング方法または上記 （5 3 ) 記載のスク リ一ニング用キットを用いて得られうる、 配列番号： 9で表されるアミノ酸配列 と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する Gタンパク質共役型レセ プ夕ータンパク質またはその部分ペプチドの発現量を変化させ、 癌、 前立腺肥大 症、 男性性腺機能障害、 不妊、 早産、 子宮内膜症、 肝硬変、 肝炎、 肝不全または 結石を予防及び/又は治療する化合物またはその塩、 または分娩誘発薬、
(55) 上記 （54) 記載の化合物またはその塩を含有してなる癌、 前立腺肥大 症、 男性性腺機能障害、 不妊、 早産、 子宮内膜症、 肝硬変、 肝炎、 肝不全または 結石の予防及び/又は治療剤、 または分娩誘発剤、
(56) 癌が前立腺癌、 非小細胞癌、 卵巣癌、 胃癌、 膀胱癌、 乳癌、 子宮頸部癌 、 結腸癌、 直腸癌または大腸癌である上記 （55) 記載の剤、
(57) 糖鎖に親和性を示すタンパク質を含有してなる配列番号： 9で表される ァミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を含有する G夕ンパク 質共役型レセプ夕一タンパク質のシグナル伝達作用増強剤、
( 58 ) 癌、 前立腺肥大症、 男性性腺機能障害、 不妊、 早産、 子宮内膜症、 肝硬 変、 肝炎、 肝不全または結石の予防及び/又は治療剤、 または分娩誘発剤である 上記 （57) 記載の剤、
(59) 癌が前立腺癌、 非小細胞癌、 卵巣癌、 胃癌、 膀胱癌、 乳癌、 子宮頸部癌 、 結腸癌、 直腸癌または大腸癌である上記 （58) 記載の剤、
(60) 配列番号： 9で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァ ミノ酸配列を含有する Gタンパク質共役型レセプタ一タンパク質またはその部分 ぺプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドを含有して なる癌、 前立腺肥大症、 男性性腺機能障害、 不妊、 早産、 子宮内膜症、 肝硬変、 肝炎、 肝不全または結石の予防及び/又は治療剤、 または分娩誘発剤、
(61) 癌が前立腺癌、 非小細胞癌、 卵巣癌、 胃癌、 膀胱癌、 乳癌、 子宮頸部癌 、 結腸癌、 直腸癌または大腸癌である上記 （60) 記載の剤、
(62) 配列番号： 9で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァ ミノ酸配列を含有する Gタンパク質共役型レセプタータンパク質またはその部分 ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドを含有して なる癌、 前立腺肥大症、 男性性腺機能障害、 不妊、 早産、 子宮内膜症、 肝硬変、 肝炎、 肝不全または結石の診断薬、
(63) 癌が前立腺癌、 非小細胞癌、 卵巣癌、 胃癌、 膀胱癌、 乳癌、 子宮頸部癌 、 結腸癌、 直腸癌または大腸癌である上記 （62) 記載の診断薬、
(64) 配列番号： 9で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァ ミノ酸配列を含有する Gタンパク質共役型レセプ夕一タンパク質またはその部分 ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドと相補的な 塩基配列またはその一部を含有してなるアンチセンス ·ポリヌクレオチドを含有 してなる癌、 前立腺肥大症、 男性性腺機能障害、 不妊、 早産、 子宮内膜症、 肝硬 変、 肝炎、 肝不全または結石の予防及び/又は治療剤、 または分娩誘発剤、
( 6 5 ) 癌が前立腺癌、 非小細胞癌、 卵巣癌、 胃癌、 膀胱癌、 乳癌、 子宮頸部癌 、 結腸癌、 直腸癌または大腸癌である上記 （6 4 ) 記載の剤、
( 6 6 ) 配列番号： 9で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァ ミノ酸配列を含有する Gタンパク質共役型レセプタータンパク質またはその部分 ぺプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドと相補的な 塩基配列またはその一部を含有してなるアンチセンス ·ポリヌクレオチドを含有 してなる癌、 前立腺肥大症、 男性性腺機能障害、 不妊、 早産、 子宮内膜症、 肝硬 変、 肝炎、 肝不全または結石の診断薬、
( 6 7 ) 癌の診断薬である上記 （6 6 ) 記載の診断薬、
( 6 8 ) 癌が前立腺癌、 非小細胞癌、 卵巣癌、 胃癌、 膀胱癌、 乳癌、 子宮頸部癌 、 結腸癌、 直腸癌または大腸癌である上記 （6 7 ) 記載の診断薬、
( 6 9 ) 哺乳動物に対して、 配列番号： 9で表されるアミノ酸配列と同一もしく は実質的に同一のアミノ酸配列を含有するレセプタータンパク質もしくはその部 分ペプチドまたはその塩の有効量を投与することを特徴とする癌、 前立腺肥大症 、 男性性腺機能障害、 不妊、 早産、 子宮内膜症、'肝硬変、 肝炎、 肝不全または結 石の予防および Zまたは治療方法、 または分娩誘発方法、
( 7 0 ) 哺乳動物に対して、 配列番号： 9で表されるアミノ酸配列と同一もしく は実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチド またはその塩に対する抗体の有効量を投与することを特徴とする癌、 前立腺肥大 症、 男性性腺機能障害、 不妊、 早産、 子宮内膜症、 肝硬変、 肝炎、 肝不全または 結石の予防および Zまたは治療方法、 または分娩誘発方法、
( 7 1 ) 哺乳動物に対して、 配列番号： 9で表わされるアミノ酸配列と同一もし くは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する Gタンパク質共役型レセプタータン パク質、 その部分べプチドまたはその塩と糖鎖に親和性を示す夕ンパク質との結 合性を変化させる化合物またはその塩の有効量を投与することを特徴とする癌、 前立腺肥大症、 男性性腺機能障害、 不妊、 早産、 子宮内膜症、 肝硬変、 肝炎、 肝 不全または結石の予防及び/又は治療方法、 または分娩誘発方法、
( 7 2 ) 哺乳動物に対して、 配列番号： 9で表されるアミノ酸配列と同一もしく は実質的に同一のアミノ酸配列を含有する Gタンパク質共役型レセプタータンパ ク質の発現量を変化させる化合物またはその塩の有効量を投与することを特徴と する癌、 前立腺肥大症、 男性性腺機能障害、 不妊、 早産、 子宮内膜症、 肝硬変、 肝炎、 肝不全または結石の予防および/または治療方法、 または分娩誘発方法、 ( 7 3 ) 哺乳動物に対して、 糖鎖に親和性を示すタンパク質またはその塩の有効 量を投与することを特徴とする癌、 前立腺肥大症、 男性性腺機能障害、 不妊、 早 産、 子宮内膜症、 肝硬変、 肝炎、 肝不全または結石の予防および/または治療方 法、 または分娩誘発方法、
( 7 4 ) 哺乳動物に対して、 配列番号： 9で表されるアミノ酸配列と同一もしく は実質的に同一のァミノ酸配列を含有する夕ンパク質またはその部分べプチドを コードするポリヌクレオチドと相補的な塩基配列またはその一部を含有してなる アンチセンス ·ポリヌクレオチドの有効量を投与することを特徴とする癌、 前立 腺肥大症、 男性性腺機能障害、 不妊、 早産、 子宮内膜症、 肝硬変、 肝炎、 肝不全 または結石の予防および Zまたは治療方法、 または分娩誘発方法、
( 7 5 ) 哺乳動物に対して、 配列番号： 9で表されるアミノ酸配列と同一もしく は実質的に同一のアミノ酸配列を含有する Gタンパク質共役型レセプタータンパ ク質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌク レオチドの有効量を投与することを特徴とする癌、 前立腺肥大症、 男性性腺機能 障害、 不妊、 早産、 子宮内膜症、 肝硬変、 肝炎、 肝不全または結石の予防および /または治療方法、 または分娩誘発方法、
( 7 6 ) 癌、 前立腺肥大症、 男性性腺機能障害、 不妊、 早産、 子宮内膜症、 肝硬 変、 肝炎、 肝不全または結石の予防および/または治療剤、 または分娩誘発剤を 製造するための配列番号： 9で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同 一のアミノ酸配列を含有するレセプタータンパク質もしくはその部分ペプチドま たはその塩の使用、 ( 7 7 ) 癌、 前立腺肥大症、 男性性腺機能障害、 不妊、 早産、 子宮内膜症、 肝硬 変、 肝炎、 肝不全または結石の予防および/または治療剤、 または分娩誘発剤を 製造するための配列番号： 9で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同 一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩 に対する抗体の使用、
( 7 8 ) 癌、 前立腺肥大症、 男性性腺機能障害、 不妊、 早産、 子宮内膜症、 肝硬 変、 肝炎、 肝不全または結石の予防および/または治療剤、 または分娩誘発剤を 製造するための配列番号： 9で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に 同一のアミノ酸配列を含有する Gタンパク質共役型レセプ夕一タンパク質、 その 部分ペプチドまたはその塩と糖鎖に親和性を示すタンパク質との結合性を変化さ せる化合物またはその塩の使用、
( 7 9 ) 癌、 前立腺肥大症、 男性性腺機能障害、 不妊、 早産、 子宮内膜症、 肝硬 変、 肝炎、 肝不全または結石の予防および/または治療剤、 または分娩誘発剤を 製造するための配列番号： 9で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同 —のアミノ酸配列を含有する Gタンパク質共役型レセプ夕一タンパク質の発現量 を変化させる化合物またはその塩の使用、
( 8 0 ) 癌、 前立腺肥大症、 男性性腺機能障害、 不妊、 早産、 子宮内膜症、 ^:硬 変、 肝炎、 肝不全または結石の予防および Zまたは治療剤、 または分娩誘発剤を 製造するための糖鎖に親和性を示すタンパク質またはその塩の使用、
( 8 1 ) 癌、 前立腺肥大症、 男性性腺機能障害、 不妊、 早産、 子宮内膜症、 ffF硬 変、 肝炎、 肝不全または結石の予防および Zまたは治療剤、 または分娩誘発剤を 製造するための配列番号： 9で表されるァミノ酸配列と同一もしくは実質的に同 一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドをコードするポ リヌクレオチドと相補的な塩基配列またはその一部を含有してなるアンチセンス ·ポリヌクレオチドの使用、
( 8 2 ) 癌、 前立腺肥大症、 男性性腺機能障害、 不妊、 早産、 子宮内膜症、 肝硬 変、 肝炎、 肝不全または結石の予防および/または治療剤、 または分娩誘発剤を 製造するための配列番号： 9で表されるァミノ酸配列と同一もしくは実質的に同 一のアミノ酸配列を含有する Gタンパク質共役型レセプ夕一タンパク質またはそ の部分べプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドの使 用、
(83) 配列番号： 13、 配列番号： 15、 配列番号： 17、 配列番号： 19、 配列番号： 21、 配列番号： 23、 配列番号： 25または配列番号： 27で表わ されるァミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を含有する G夕 ンパク質共役型レセプタータンパク質またはその塩、
(84) 配列番号： 13、 配列番号： 15、 配列番号： 17、 配列番号： 19、 配列番号： 21、 配列番号： 23、 配列番号： 25または配列番号： 27で表わ されるァミノ酸配列からなる Gタンパク質共役型レセプタ一タンパク質またはそ の塩、
(85) 上記 （81) 記載の Gタンパク質共役型レセプタータンパク質をコード するポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、
(86) 配列番号： 14、 配列番号： 16、 配列番号： 18、 配列番号： 20、 配列番号： 22、 配列番号： 24、 配列番号： 26または配列番号： 28で表わ される塩基配列からなる DNA、
(87) 上記 （83) 記載のポリヌクレオチドを含有する組換えベクター、 (88) 上記 （87) 記載の組換えベクターで形質転換させた形質転換体、 (89) 上記 （88) 記載の形質転換体を培養し、 上記 （83) 記載の Gタンパ ク質共役型レセプタータンパク質を生成せしめることを特徴とする上記 (83) 記載の Gタンパク質共役型レセプ夕一夕ンパク質またはその塩の製造法、
(90) 上記 （83) 記載の Gタンパク質共役型レセプタータンパク質またはそ の塩に対する抗体、
(91) 配列番号： 14、 配列番号： 16、 配列番号： 18、 配列番号： 20、 配列番号： 22、 配列番号： 24、 配列番号： 26または配列番号： 28で表わ される塩基配列からなる DN Aとハイストリンジェントな条件下でハイプリダイ ズする DNA、
(92) 上記 （85) 記載のポリヌクレオチドと相補的な塩基配列またはその一 部を含有してなるポリヌクレ才チド、 また、 本発明の遺伝子発現解析方法を用いた結果、 EDG— 1受容体が血管内 皮細胞において、 EDG— 2受容体が血管平滑筋細胞において高発現しているこ と分かった。 本発明は、 この知見に基づいて、 血管内皮細胞または血管平滑筋細 胞を用いる EDG— 1受容体ァゴニスト ·アン夕ゴニストまたは血管平滑筋細胞 を用いる EDG— 2受容体ァゴニス卜 ·アン夕ゴニス卜のスクリーニング方法を 提供する。
(93) 血管内皮細胞を用いることを特徵とする EDG— 1レセプ夕一ァゴニス 卜またはアンタゴニス卜のスクリーニング方法、
(94) EDG- 1レセプターが配列番号： 38で表わされるァミノ酸配列と同 —もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を含有する G夕ンパク質共役型レセプ夕 一タンパク質、 その部分ペプチドまたはその塩である上記 （93) 記載のスクリ 一二ング方法、
(95) 血管内皮細胞を含有することを特徴とする EDG— 1レセプ夕一ァゴニ ス卜またはアン夕ゴニストのスクリーニング用キット、
(96) 上記 （93) 記載のスクリーニング方法または上記 （95) 記載のスク リーニング用キットを用いて得られる EDG— 1レセプ夕一ァゴニストまたはァ ン夕ゴニス卜、
(97) 上記 （93) 記載のスクリーニング方法または上記 （85) 記載のスク リーニング用キットを用いて得られる EDG— 1レセプ夕一ァゴニストを含有し てなる動脈硬化症、 心筋梗塞、 脳梗塞または虚血性疾患の予防及びノ又は治療剤
(98) 血管平滑筋細胞を用いることを特徴とする EDG— 2レセプターァゴニ ストまたはアン夕ゴニス卜のスクリーニング方法、
(99) EDG— 2レセプ夕一が配列番号： 40で表わされるアミノ酸配列と同 一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する Gタンパク質共役型レセプタ 一タンパク質、 その部分ペプチドまたはその塩である上記 （98) 記載のスクリ 一二ング方法、
(100) 血管平滑筋細胞を含有することを特徴とする EDG— 2レセプターァ ゴニス卜またはアン夕ゴニス卜のスクリーニング用キッ卜、 (101) 上記 （98) 記載のスクリーニング方法または上記 （100) 記載の スクリーニング用キットを用いて得られる EDG— 2レセプ夕一ァゴニストまた はアン夕ゴニスト、
(102) 上記 （98) 記載のスクリーニング方法または上記 （100) 記載の スクリーニング用キットを用いて得られる EDG— 2レセプターァゴニストまた はアン夕ゴニストを含有してなる動脈硬化症、 心筋梗塞、 脳梗塞または虚血性疾 患の予防及び/又は治療剤、
(103) 哺乳動物に対して、 上記 （93) 記載のスクリーニング方法または上 記 （95) 記載のスクリーニング用キットを用いて得られる EDG— 1レセプタ 一ァゴニスト、 または上記 （98) 記載のスクリーニング方法または上記 （10 0) 記載のスクリーニング用キットを用いて得られる EDG— 2レセプ夕一アン タゴニストの有効量を投与することを特徴とする動脈硬化症、 心筋梗塞、 脳梗塞 または虚血性疾患の予防および Zまたは治療方法、
(104) 動脈硬化症、 心筋梗塞、 脳梗塞または虚血性疾患の予防及び Z又は治 療剤を製造するための上記 （93) 記載のスクリーニング方法または上記 （95 ) 記載のスクリーニング用キットを用いて得られる EDG— 1レセプターァゴニ スト、 または上記 （98) 記載のスクリーニング方法または上記 （100) 記載 のスクリーニング用キッ卜を用いて得られる EDG— 2レセプターアン夕ゴニス 卜の使用等を提供する。 図面の簡単な説明
図 1は、 各種細胞株における d j 287G14. 2の発現を示す。
図 2は、 ヒト各種組織での d j 287 G 14. 2レセプター mRNAの発現分 布を示す。
図 3は、 dj 287G14.2レセプ夕一のアミノ酸配列を示す。 .
図 4は、 dj 287G14.2レセプターのアミノ酸配列を示す。 図 3の続きである。 図 5は、 dj 287G142レセプ夕一をコードする DNAの塩基配列を示す。
図 6は、 dj 287G14.2レセプ夕一をコードする DNAの塩基配列を示す。 図 5の 続きである。 図 7は、 dj287G14.2レセプタ一をコードする DNAの塩基配列を示す。 図 6の 続きである。
図 8は、 dj 287G14.2レセプ夕一をコードする DNAの塩基配列を示す。 図 7の き ある。
図 9は、 dJ287G14.2-GFP融合タンパク質を発現した CHO細胞内の c AMP産 生量に対するレクチンの影響を調べた結果を示す。 横軸はレクチン濃度を、 縦軸 は c AMP産生量を表す。 C o n Aはコンカナパリン Aを、 L e n t i 1はレン ズマメレクチンを、 P e aはエンドゥマメレクチンを、 FSKはホルスコリンを 示す。 平均値士標準偏差（n= 2)。
図 10は、 mock CH0細胞内の cAMP産生量に対するレクチンの影響を調べた 結果を示す。 横軸はレクチン濃度を、 縦軸は c AMP産生量を表す。 n=2の平均 値である。 C o n Aはコンカナバリン Aを、 Len t i Iはレンズマメレクチン を、 P e aはエンドゥマメレクチンを、 F SKはホルスコリンを示す。 平均値土 標準偏差（n = 2)。
図 11は、 CH〇細胞に発現させた dJ287G14.2- GFP融合タンパクの GFPの蛍 光像を共焦点顕微鏡 （ライカ社） で観察した結果を示す。
図 12は、 CHO細胞に発現させた dJ287G14.2— GFP融合タンパク質にコンカ ナパリン Aを添加した時の GFPの蛍光像を共焦点顕微鏡 （ライカ社） で観察し た結果を示す。 . 発明を実施するための最良の形態
以下、 本発明について詳細に説明する。
本発明においては、 複数の遺伝子個々の発現量をまとめて定量解析することに より、 ある細胞または組織においてその発現が特徴的に亢進または減少している 遺伝子を同定することを特徴とし、 さらには特定の遺伝子ファミリーに属する複 数の遺伝子の発現解析をまとめて行うことにより、 その遺伝子フアミリーの中で 、 ある細胞または組織においてその発現が特徴的に亢進または減少している遺伝 子を、 その発現量の絶対値を算出することで同定することを特徴とする。 ここで 、. 「遺伝子の発現が特徴的に亢進または減少している」 とは、 正常細胞または組 織における遺伝子の発現と比較して、 生理学的有為さがある程度に大量にまたは 少量に発現していることをいう。 本発明において標的とする遺伝子ファミリ一は 、 特に限定されないが、 例えば、 Gタンパク質共役型レセプター遺伝子ファミリ ―、 チロシンリン酸化酵素型レセプター遺伝子ファミリー、 イオンチャネル遺伝 子ファミリ一、 または転写因子、 卜ランスポーター、 プロテインキナーゼ、 プロ ティンフォスファターゼ、 プロテア一ゼ、 ヒートショックプロテイン、 A T P a s eもしくは D NA結合プロテインのいずれかに関連する遺伝子ファミリーなど から選択される。
複数の遺伝子とは、 2個以上の遺伝子を意味し、 上限は実施可能な限り、 特に 限定されないが、 通常 2〜数万個、 好ましくは 2〜1 0 0 0個、 より好ましくは 1 0〜8 0 0個、 さらに好ましくは 1 0〜3 0 0個の遺伝子である。
より具体的には、 本発明の遺伝子の発現解析は、 複数の各反応場所、 好ましく は複数の反応場所を有する反応器具の各反応場所で、 複数の標的 m R N Aを含み 得る mR NA試料と、 それぞれの標的 m R N Aに対応するプライマー対をそれぞ れ含んでなる各増幅試薬とを接触させることにより、 増幅反応を行い、 得られた 増幅生成物の生成量を測定することによって行う。 以下、 この方法について説明 する。
(mR N A試料）
本発明の一態様は、 m R N A試料に含まれ得る複数の標的遺伝子の m R N Aを 定量すことによって遺伝子の発現解析を行う方法である。 ここで、 「mR NA試 料」 とは、 mR NAを含有する試料であって、 その試料中に含まれる mR NAの 種類や量を測定する対象となる試料のことをいう。
より具体的には、 本発明において対象となる mR N A試料は、 その試料中の特 定遺伝子の発現レベルを解析する対象となる試料であり、 例えば、 ヒトまたはそ の他の哺乳動物 （例えば、 ラット、 マウス、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブタ、 ゥシ、 ネコ 、 ィヌ、 サルなど） の組織あるいはその培養細胞株から採取した mR NA試料、 である。 このような組織として、 例えば、 脳、 脳の各部位 （例、 嗅球、 扁頭核、 大脳基底球、 海馬、 視床、 視床下部、 視床下核、 大脳皮質、 延髄、 小脳、 後頭葉 、 前頭葉、 側頭葉、 被殻、 尾状核、 脳染、 黒質） 、 脊髄、 下垂体、 胃、 臈臓、 腎 臓、 肝臓、 生殖腺、 甲状腺、 胆のう、 骨髄、 副腎、 皮膚、 筋肉、 肺、 消化管 （例 、 大腸、 小腸） 、 血管、 心臓、 胸腺、 脾臓、 顎下腺、 末梢血、 末梢血球、 前立腺 、 睾丸、 精巣、 卵巣、 胎盤、 子宮、 骨、 関節、 骨格筋などが挙げられる。 このよ うな m R NA試料を用いて、 その試料中に含まれる標的 m R NAを定量すること によって、 mR NA試料を採取した部位における標的遺伝子の発現レベルを解析 することができる。
すなわち、 本発明においては、 複数の mR NAを含有する m R NA試料から、 一度の処理で、 標的 m R NAの産生の有無及びその産生量を測定することができ る。 特に、 ある特定の疾患を罹患している患者由来の m R NA試料を用いれば、 その疾患に関与している遺伝子 （例えば、 G P C R遺伝子） の特定が容易となる 。 特に、 複数の遺伝子が関与しているといわれる癌などの多遺伝子関与疾患に関 与する Gタンパク質共役型レセプ夕一、 チロシンリン酸化酵素型レセプター、 ィ オンチャンネル遺伝子を特定する場合は、 本発明によれば、 各遺伝子の発現レべ ルを一度の定量操作で調べることができるので、 関与遺伝子 ·タンパク質の特定 が容易となる。 .
遺伝子発現量の定量または遺伝子発現量の絶対値の算出は、 後述する標的 m R NAの定量法に従って行うことが出来る。
(複数の反応場所を有する反応器具）
複数の反応場所とは、 2つ以上の反応場所であれば特に限定さればいが、 通常 2〜数万個、 好ましくは 2〜1 0 0 0個、 より好ましくは 1 0〜8 0 0個、 さら に好ましくは 1 0〜3 0 0個の反応場所である。
本発明においては、 m R N A試料中に含まれ得る標的 m R N Aを増幅するため に、 その標的 mR N Aに対応するプライマー対をそれぞれ含む各増幅試薬とを一 度に反応させる。 このために、 本発明では、 好ましくは複数の反応場所を有する 反応器具が用いられ、 mR NA試料と各増幅試薬との反応は、 各反応場所で行わ れる。 本発明で用いる反応器具は、 mR NA試料と各増幅試薬とを一度に反応さ せることができるように、 2つ以上の反応場所を有している限り、 反応器具の構 成及び構造は限定されない。 好ましくは、 本発明において用いられる反応器具と して、 例えば、 複数の穴を有するプレート、 複数のスライドグラスを備えてなる 反応器具、 複数の試験管を備えてなる反応器具などが挙げられる。 実験スペース 、 操作性等を考慮した場合は、 複数の穴を有するプレートを好ましく用いること ができる。 これらのプレートは、 使用するプライマ一対の数によって決められる が、 市販されている 9 6穴または 3 8 4穴プレートが好ましく用いられる。 しか し、 プライマー対の数に応じて所望の数の反応場所を設けた反応器具を使うこと ができる。 また、 市販されている 9 6穴または 3 8 4穴プレートを 2個以上使用 することにより、 本発明の方法を実施することもできる。 (増幅試薬）
本発明において用いられる各増幅試薬は、 例えば、 標的 mR N Aに対応する一 対のプライマ一対、 標的 mR N Aに対応するプローブ、 D N Aポリメラーゼ、 緩 衝液等を含む。
ここで、 本発明において用いられる 「標的 mR NAに対応するプライマ一対」 とは、 標的 mR NAをコードする標的遺伝子配列のェクソン領域の一方の鎖に相 補的又は実質的に相補的である第 1のプライマーおよび該標的遺伝子配列のェク ソン領域の他方の鎖に相補的又は実質的に相補的である第 2のプライマーから成 るプライマーの一対をいう。 本発明においては、 これらのプライマー対を少なく とも 2対以上使って、 一度に、 mR NA試料中の標的遺伝子から転写される mR N Aの有無及びその転写量を検出できる。 したがって、 使用するプライマー対の 数は、 多ければ多いほど、 本発明の定量方法の効率が上がることになる。
本発明の定量方法において、 使用されるプライマ一対群は、 標的 mR N Aの数 に応じて調整すればよいので特に限定されないが、 例えば、 1 0〜8 0 0個のプ ライマー対から構成される。 本発明の他の態様によれば、 使用されるプライマー 対群は、 1 0〜3 0 0個のプライマー対から構成される。 プライマ一対の数が多 い場合は、 異なるセットの増幅試薬を複数枚のプレート （例えば、 2〜1 0枚の プレート） に分けてセットしておき、 定量反応を複数回に分けて行うこともでき る。
本発明における好ましい態様によれば、 標的遺伝子は、 Gタンパク質共役型レ セプ夕一、 チロシンリン酸化酵素型レセプタ一、 イオンチャネルなどをコードす る遺伝子であり、 ゆえに標的 mRN Aは Gタンパク質共役型レセプター、 チロシ ンリン酸化酵素型レセプター、 イオンチヤンネルなどのファミリーに属する遺伝 子 mRNAである。 この場合、 標的 Gタンパク質共役型レセプ夕一、 チロシンリ ン酸化酵素型レセプ夕一、 イオンチャンネルなどのファミリ一に属する遺伝子 m RN Aに対応するプライマー対を含んでなる各増幅試薬と mRN A試料とを、 反 応器具の各反応場所において接触させることにより、 増幅反応させ、 mRNA増 幅生成物を定量することによって、 その mRNA試料中に含まれていた Gタンパ ク質共役型レセプ夕一、 チロシンリン酸化酵素型レセプター、 イオンチャンネル などのフアミリーに属する遺伝子の発現量を測定する とができる。
本発明のより好ましい態様によれば、 全ての公知の G夕ンパク質共役型レセプ ター、 チロシンリン酸化酵素型レセプ夕一、 イオンチャンネルなどのファミリ一 に属する遺伝子 m RNAに対応するプライマー対を全て準備し、 そのプライマー 対をそれぞれ含む増幅試薬を各反応場所にセットしておけば、 一度の定量作業で 、 mRNA試料中において、 どの Gタンパク質共役型レセプター、 チロシンリン 酸化酵素型レセプ夕一、 イオンチャンネルなどのファミリーに属する遺伝子 mR N Aがどの程度産生していたかを知ることができる。 勿論、 必要に応じて、 異な るセッ卜の増幅試薬を複数枚のプレートに分けてセットしておき、 定量反応を複 数回に分けて行うこともできる。
なお、 現在、 Gタンパク質共役型レセプ夕一 （または遺伝子） として次のもの が公知である。
(1) アセチルコリンレセプター： Μ,; Μ2; Μ3; Μ4; Μ5
(2) アデノシンレセプター： A A2A； A2B; A3
(3) アドレノセプ夕ー （Adrenoceptors) ： αΙΑ; αΙΒ; alD; α2Α; α2Β;
Figure imgf000023_0001
(4) アンギオテンシンレセプター： ATI; AT2
(5) ボンべシン （Bombesin) レセプ夕一： BB1; BB2; bb3
(6) ブラジキニンレセプ夕一： B】； B2
(7) カルシトニン ·アイ二リン ' CGRP及びァドレノメヅリン ( adrenomedullin) レセプ夕一：
(8) カンナピノイドレセプ夕一： CB1;CB2
(9) ケモカインレセプ夕一： CCR1; CCR2; CCR3; CCR4; CCR5; CCR6; CCR7; CCR8; CCR9; CCRIO; CXCRl; CXCR2; CXCR3; CXCR4; CXCR5; CX3CR1； XCR1;
(10) ケニオタクチックペプチド (Cheniotactic) レセプター： C3a; C5a;_ fMLP
(11) コレシストキニン及びガストリン (Cholecystokinin and gastrin) レ セプター： CCK CCK2
(12) コ一チコトロピン放出因子 （Corticotropin-releasing factor) レセプ 夕一： CRF,; CRF2
(13) ド一パミンレセプ夕一： Dl; D2; D3; M; D5
(14) エンドセリンレセプター： ETA; ETB
(15) ガラニンレセプター （Galanin receptors) ： GAL1; GAL 2; GAL3
(16) クリレ夕メートレセフ夕一： mglU mglu2; mglu3; mglu4; iglu5;
iglu6; mglu7; mglu8
(17) グリコプロテインホルモン (Glycoprotein hormone) レセプター： FSH; LSH; TSH
(18) ヒスタミンレセプ夕一： Η,; Η2; Η3;
(19) 5— ΗΤレセプ夕一： 5 - ΗΤ1Α; 5 - HT】B; 5-HT1D; 5- t1B; 5- t1F;5-HT2A; 5-HT2F; 5-HT2C; 5 - HT3; 5-HT 5-ht5A; 5-ht5B; 5- HT6; 5-HT7
(20) ロイコ卜リエンレセプ夕一： BLT; CysLT,； CysLT2
(21) リソフォスフオリピッド （Lysophospholipid) レセプター： edgl; edg2; edg3; edg4
(22) メラノコ一リン (Melanocorlin) レセプ夕一： MC,; MC2; MC3; MC MC5 ズ 23) メラトニンレセプター： ΜΤ,; Τ2; ΜΤ3
(24) ニューロペプチド Υレセプター： Υ1; Υ2; Υ4; Υ5; Υ6
(25) ニューロテンション （Neurotension) レセプ夕一： NTS1; NTS2
(26) ォピオイド： DOP; KOP; MOP; NOP
(27) P2Y レセプター： P2Y,; P2Y2; Ρ2Υ P2Y6; P2YU; P2Y12 (28) パーォキシゾームプロリフェレ一夕 （Peroxisome prol iferator) 活性 化レセプタ―： PPAR- ； PPAR- j3； PPAR- r
(29) プロスタノイド （Prostanoid) レセプター： DP; FP; IP; TP; ΕΡ,; ΕΡ2; ΕΡ3; ΕΡ4
(30) プロテアーゼ活性化 （Protease- activated) レセプター： PARI; PAR2; PAR3; PAR4
(3 1) ソマトス夕チン （Somatotatin) レセプ夕一： sst!; sst2; sst3;
sstd, S S t
(32) 夕チキニン （Tachykinin) レセプター： ΝΚ ΝΚ2; ΝΚ3
(33) チロ卜口ピン放出ホルモン （Tliyrotrop in-releasing hormone) レセプ 夕一： TRH TRH2
(34) ゥロテンシン - II (Urotensin-II) レセプ夕一：
(35) バソァクティブインテスティナルぺプナド (Vasoactive intestinal peptide) 及びピチュイタリアデニレートサイクラーゼ活性ペプチド （pituitary adenylate cyclase activating peptide) レセプター： VPAC,; VPAC2; PAC,
(36) バソプレシン (Vasopressin) 及び ォキシ卜シン (oxytocin) レセプ夕
―： la； V]b； V,; 0T
また、 現在、 チロシンリン酸化酵素型レセプター、 イオンチャンネル遺伝子な どのファミリ一に属する遺伝子として、 次のものが公知である。
(37) イオンチャネル： Na+チャネル （タイプ I； タイプ II /タイプ IIA; タイプ III; SCLll/NaG; PNl; NaCh6; NaDRG; SkMl/^l, SkM2) 、 K+チャネル (Kv; EAG; KQT; IRK; ROMK; GIRK; KATP等） 、 C a2+チャネル (ひ 1G; a IE; a IS: alC; a ID; a IB; alA; IP3; リアノジンレセプターなど） 、 C 1ーチ ャネル （GABAA; GABAC; グリシンレセプター； C1C0; C1C1; CFTRなど） 、 非選択 性カチオンチャネル （nACM; 5-HT3; 匪 DA; AMPA; P2XATP; CNGなど） など
(38) チロシンリン酸化酵素レセプ夕一：インスリンレセプ夕ー； EGFレセプ ターなど 本発明の他の態様によれば、 ある一群の Gタンパク質共役型レセプ夕一、 チロ シンリン酸化酵素型レセプ夕一、 またはイオンチャネルのファミリーに属する遺 伝子の mRN Aに対応する一群のプライマ一対を用いることにより、 一度の定量 操作で、 その一群の Gタンパク質共役型レセプター、 チロシンリン酸化酵素型レ セプ夕一、 またはイオンチャネルなどのファミリーに属する遺伝子のなかで高発 現している Gタンパク質共役型レセプ夕一、 チロシンリン酸化酵素型レセプター 、 またはイオンチャネルなどのファミリ一に属する遺伝子を特定することができ る。
例えば、 創薬のターゲットは、 （1) 低分子物質を結合するタンパク質 （GP CR、 核内レセプ夕一、 イオンチャネルなど) 、 (2) 低分子あるいは高分子の 基質に対して触媒活性をもつ酵素、 （3) タンパク質や核酸や多糖類などの高分 子に結合するタンパク質の 3種類に分類することができる。 したがって、 この分 類にしたがつて、 以下のような遺伝子のグルーピングをすることもできる。
(1) 低分子物質を結合する下記タンパク質関連遺伝子
ァドレナリンレセプター；ァセチルコリンレセプ夕ー； ヒスタミンレセプター ； ドーパミンレセプ夕一；セロトニンレセプター；グルタミンレセプター；ェン ドセリンレセプター；バソプレシンレセプタ一；セロトニン卜ランスポーター； ダルココルチコィドレセプ夕一；エストロゲンレセプター； C a2+チャネル； N a+チャネル： C 1 _チャネル
(2) 低分子あるいは高分子の基質に対して触媒活性をもつ下記酵素関連遺伝子 HMG— Co A還元酵素；アンジォテンシン転換酵素； トロンボキサン合成酵 素； プロトンポンプ；アルド一ス還元酵素； シクロォキシゲナ一ゼ；ホスホジェ ステラ一ゼ；タンパク質リン酸化酵素；タンパク質脱リン酸化酵素； H I V逆転 写酵素；真菌スクワレンエポキシダーゼ； DNAジャィレース ； β—ラクタマー ゼ
(3) タンパク質や核酸や多糖類などの高分子に結合する下記タンパク質関連遺 伝子
ィンスリンレセプ夕一：エリスロポエチンレセプター； G— CSFレセプター ；成長ホルモンレセプター；ィンターフェロンレセプタ一；増殖因子レセプ夕一 HER 2 ；腫瘍壊死因子 TNFレセプ夕一；血小板インテグリン GP I I b/I W
25
I I a
なお、 標的 mRNAを増幅させるためのプライマー対は、 その標的 GPCR遺 伝子の配列に基づいて当業者であれば容易に設計することができる （例えば、 Genome Res. 1996 Oct ;6 (10) :986- 94参照） 。
本発明において用いられる mRNAの定量方法は、 hGPCRの機能解析以外 にも種々の用途に用いることができる。 例えば、 判明している疾患遺伝子が産生 する mRNAを検出するプライマー対を含んでなる複数の増幅試薬のセットを用 いることにより、 特定疾患の診断をすることができる。 本発明によれば、 各遺伝 子の発現レベルを正確に測定することができるので、 公知の方法と比較して、 よ り正確な診断ができるという利点がある。 次に、 本発明において用いられる標的 mRNAに対応するプローブは、 標的配 列に応じて当業者に容易に設計できる （例えば、 Genome Res. 1996 Oct; 6 (10)： 986-94参照） 。 本発明において用いられる適当なオリゴヌクレオチドプローブは 、 好ましくは約 1 5〜約 50ヌクレオチドの長さを有し、 より好ましくは約 25 〜約 35ヌクレオチドの長さを有する。 オリゴヌクレオチドプローブは、 生化学 的、 免疫化学的、 又は化学的な手段によって検出可能な化学物質等を組込むこと によって標識することができる。 有用な標識としては、 32P等の放射性同位元 素、 フルォレスカミン、 フルォレツセンイソチオシァネート等の蛍光物質、 ルミ ノール、 ルシフェリン等の発光物質、 jQ—ガラクトシダーゼ、 パーォキシダ一ゼ 、 アルカリフォスファタ一ゼ等の酵素、 ピオチン、 及び抗体等があげられる。 本発明において用いられる D N Aポリメラーゼとしては、 逆転写活性および 5 ' →3 ' ェキソヌクレァ一ゼ活性を有する耐熱性 DN Aポリメラーゼ、 例えば、 r T t h DNAポリメラーゼなどが挙げられる。
本発明においては、 公知のあるいは市販されている緩衝液が用いられる （例え ば、 PE Biosystems社製緩衝液； Genome Res. 1996 Oct ;6 (10) :986- 94参照） 。
(mRNAの増幅）
本発明の解析法において、 mRNA試料中に含まれ得る標的 mRNAは、 その 標的 mRNAを増幅させるためのプライマー対を含む増幅試薬を用いて増幅され る。 本発明の好ましい態様によれば、 標的 mRNAの増幅は公知のポリメラ一ゼ 連鎖反応 （PCR) を用いて行われる （米国特許第 4， 683, 195号；第 4 , 683, 202号；第 4， 965, 188号など参照） 。
mRNAの増幅は、 最初に、 例えばウィルスの逆転写酵素を用いて、 標的 mR NAを逆転写し、 生じた cDNAを増幅することによって行うことができる。 さ らに好ましい態様において、 mRNAの増幅は、 逆転写一ポリメラーゼ連鎖反応 (RT-PCR) を用いて行われる （米国特許第 5， 310, 652号；第 5, 322, 770号；第 5， 561, 058号；第 5, 641, 864号； 5， 6 93, 517号等参照） 。
なお、 本発明においては、 前記ポリメラーゼ連鎖反応以外にも種々の mRNA 増幅法が用いられる。 そのような増幅法として、 例えば、 鎖置換アツセィ法 （米 国特許第 5, 455, 166号など参照） 、 転写に基づく増幅法 （TAS) (米 国特許第 5， 437, 990号；第 5, 409, 818号；第 5, 399, 49 1号等参照） 、 自立配列複製法 （3 SR) (W092ノ08800等参照）などが 挙げられる。
これらの増幅反応の反応条件は、 使用する試薬の種類等に応じて、 当業者によ つて容易に設定することができる。 (標的 mRNAの定量法）
次に、 本発明の解析方法においては、 前記の mRNA増幅生成物の生成量を定 量する。 増幅生成物の定量は、 好ましくはプローブを使用する方法によって行わ れる。 好ましい態様によれば、 蛍光物質により標識したプローブを用いた方法に よって行われる。
本発明のより好ましい態様によれば、 標的 mRNAの定量は 「TaqMan法 」 又は 「5' ヌクレアーゼアツセィ法」 を用いて行われる （プロシージングズ · ォブ ·ザ.ナショナル ·アカデミー ·ォブ ·サイェンシィズ ·ォブ ·ユーエスェ 一、 第 88巻、 第 7276- 7280頁 （1991年） ； 米国特許第 5, 210， 015号；第 5, 487, 972号；第 5, 804, 375号など参照） 。 T a q M a nアツ セィ法において、 5' 末端を標識したプローブが用いられる。 また、 このブロー ブは、 プローブが DNA合成のためのプライマ一として働くことを防ぐために 3 ' 末端が修飾される。 この修飾として、 リン酸基、 蛍光物質等の末端への付加が あげられる。 標的 mRNAの増幅は、 5' →3' ェキソヌクレア一ゼ活性を有す る DNAポリメラ一ゼ、 例えば T t h DNAポリメラ一ゼを用いて行われる。 前記プライマ一の下流の標的 m R N Aにハイブリダィズするプロ一ブは、 増幅反 応の間、 DN Aポリメラーゼの 5' —3' ェキソヌクレア一ゼ活性によって分解 される。 新規に標的領域が増幅されるたびに、 プローブが分解され、 標識物質が 遊離される。 この遊離される標識物質を定量することにより、 標的 mRNA量が 間接的に測定される。
遊離される標識物質を定量的に検出するためには公知の方法が用いられる。 好 ましい方法において、 前記プローブは、 2つの蛍光物質で 5' および 3 ' 末端が 標識され、 このうちの一方が、 他方の物質の蛍光を消光することができる。 この プロ一ブは錶型 D N Aにハイブリダィズしている間は 2つの蛍光物質の相互作用 により蛍光が消光されているが、 DNAポリメラーゼが有する 5 ' →3' ェキソ ヌクレアーゼ活性により分解されることにより蛍光を発するようになる。 増幅反 応の進行に伴い蛍光が増大し、 この蛍光の増大がモニタ一される。
標的 mRNAを含む試料の定量は、 予め知られている量の標的 mRNAを含む 試料を用い、 これを増幅させて作製した 「標準曲線」 に基づいて行われる。 標準 曲線は、 増幅の間に生じたシグナル由来の、 投入したコピー数を計算するために 使用される。 従って、 試料中の、 未知の標的配列のコピー数は、 前記の標準曲線 を用いて、 あらかじめ観察されるものに等しいシグナルを生じることが決定され たコピー数を計算することによって推計される。 次に、 前記試料中の標的配列の 濃度を、 反応前に決定する投入コピー数及び試料のサイズから計算することがで きる （特許公開第 2001— 204483号公報など参照） 。
実験上の誤差を排除するために内部標準を用いることができる。 内部標準を用 いる、 増幅を基にした定量法は、 米国特許第 5， 2 19， 717号、 第 5, 47 6， 774号などに記載されている。 増幅反応の特異性を増大させるための種々 の方法が知られており、 例えば、 欧州特許出願第 0 866, 071号などに記 載されている。 (プライマー対キット及び定量キッ卜）
また、 本発明は、 本発明の方法を実施するために用いられる、 プライマー対キ ット及び m R NA定量キットに関する。
本発明のプライマ一対キットは、 標的遺伝子配列のェクソン領域の一方の鎖に 相補的又は実質的に相補的である第 1のプライマーおよび該標的遺伝子配列のェ クソン領域の他方の鎖に相補的又は実質的に相補的である第 2のプライマーから 成るプライマー対を 2対以上含んでなるキットである。 このようなキッ卜が事前 に準備されていれば、 本発明の定量方法を迅速に行うことができる。 本発明の好 ましいプライマー対キットは、 ヒト Gタンパク質共役型レセプタータンパク質遺 伝子から転写される m R N Aに対応するプライマー対を有する。 本発明の一態様 によれば、 プライマー対キットは、 1 0〜8 0 0個のプライマー対あるいは 1 0 〜3 0 0個のプライマ一対で構成されるプラマー対群を含む。
本発明のより好ましい態様によれば、 複数の反応場所を有する反応器具の各反 応場所に、 標的 mR NAに対応するプライマー対をそれぞれ含む各増幅試薬を充 填してなる m R N A定量キットが提供される。 好ましくは、 そのキットにおける 標的遺伝子は疾患関連遺伝子である。 より好ましくは、 そのキットは、 さらに蛍 光プローブを含んでなり、 またさらに好ましくは、 T t h D NAポリメラーゼ を含んでなる。 · これらのキットは、 必要に応じて、 例えば、 プライマー伸長生成 物の合成を触媒する薬剤、 基質のヌクレオシド三リン酸塩、 標識に使用する手段 (例えば、 標識がピオチンならば、 アビジン一酵素抱合体及び酵素の基質及び色 素原） 、 P C R又はハイブリダィゼ一シヨン反応に適した緩衝液などを含むこと ができる。
(疾患の診断方法およびその疾患を治療する医薬）
次に、 本発明の上記 （3 0 ) による方法によれば、 患者から採取した mR NA 試料を用いて遺伝子発現解析を行い、 特定疾患関連遺伝子の特徴的発現を検知す ることによってその患者が罹患している疾患を診断することができる。 本発明に よれば、 特定疾患関連遺伝子ファミリー （特に、 特定疾患関連 G P C R遺伝子フ アミリー） に属する遺伝子の発現をまとめて解析することにより、 複数の特定疾 患関連遺伝子のなかで、 どの遺伝子の発現が特徴的であるかを一度の操作で特定 することができる。
したがって、 このようにして特定された遺伝子の遺伝子産物に対するァゴニス ト、 アン夕ゴニストもしくは抗体、 またはその遺伝子産物をコードする D N Aを 含む医薬は、 その診断対象の患者に対して特に有効である。 本発明においては、 複数の異常発現遺伝子を特定することができ、 かつその遺伝子の発現レベルまで をも正確に定量することができる。 したがって、 その患者に適当な処方として、 複数のァゴニスト、 アン夕ゴニストまたは抗体を選択し、 その処方量についても 、 疾患関連遺伝子の発現レベルに応じて調製することができる。 すなわち、 本発 明によれば、 その患者のみに処方される、 いわゆるテーラーメード医薬の調製が 可能となる。
より詳細に述べると、 例えば、 生体内においてあるレセプタータンパク質が減 少しているためにリガンドの生理作用が期待できない （該レセプタータンパク質 の欠乏症） 患者がいる場合に、 （1 ) そのレセプタータンパク質を該患者に投与 し該レセプタータンパク質の量を補充したり、 （2 ) (ィ） 本発明のレセプ夕一 タンパク質をコードする D NAを該患者に投与し発現させることによって、 ある いは （口） 対象となる細胞に本発明のレセプタ一タンパク質をコードする D NA を揷入し発現させた後に、 該細胞を該患者に移植することなどによって、 患者の 体内におけるレセプタ一タンパク質の量を増加させ、 リガンドの作用を充分に発 揮させることができる。
本発明の医薬は、 特定された遺伝子が関与する疾患の予防または治療に有効で あり、 例えば、 中枢疾患 (例えば、 アルツハイマー病、 痴呆、 摂食障害など）、 内 分泌疾患 (例えば、 高血圧症、 性腺機能異常、 甲状腺機能異常、 下垂体機能異常 など）、 代謝疾患 (例えば、 糖尿病、 脂質代謝異常、 高脂血症など）、 癌 （例えば 、 非小細胞肺癌、 卵巣癌、 前立腺癌、 胃癌、 膀胱癌、 乳癌、 子宮頸部癌、 結腸癌 、 直腸癌等） などの予防および/または治療に有用である。
本発明で特定された遺伝子の遺伝子産物 （例えば、 レセプタータンパク質） 、 それに対するァゴニスト、 アン夕ゴニス卜もしくはその抗体、 またはその遺伝子 をコードする D NAを上記予防及び 又は治療剤として使用する場合は、 常套手 段に従って製剤化することができる。
一方、 D NA (以下、 本発明の D N Aと略記する場合がある） を上記予防及び /又は治療剤として使用する場合は、 その D NAを単独あるいはレトロウイルス ベクター、 アデノウイルスベクター、 アデノウイルスァソシェ一テツドウィルス ベクタ一などの適当なベクタ一に挿入した後、 常套手段に従って実施することが できる。 その D NAは、 そのままで、 あるいは摂取促進のための補助剤とともに 、 遺伝子銃やハイドロゲルカテーテルのようなカテーテルによって投与できる。 例えば、 本発明で用いられる医薬は、 必要に応じて糖衣を施した錠剤、 カプセ ル剤、 エリキシル剤、 マイクロカプセル剤などとして経口的に、 あるいは水もし くはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、 または懸濁液剤などの注 射剤の形で非経口的に使用できる。 例えば、 本発明の医薬を、 生理学的に認めら れる公知の担体、 香味剤、 賦形剤、 べヒクル、 防腐剤、 安定剤、 結合剤などとと もに一般に認められた製剤実施に要求される単位用量形態で混和することによつ て製造することができる。 これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適 当な用量が得られるようにするものである。
錠剤、 カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、 例えば、 ゼラ チン、 コーンスターチ、 トラガント、 アラビアゴムのような結合剤、 結晶性セル ロースのような賦形剤、 コーンスターチ、 ゼラチン、 アルギン酸などのような膨 化剤、 ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、 ショ糖、 乳糖またはサッカリ ンのような甘味剤、 ペパーミント、 ァカモノ油またはチェリ一のような香味剤な どが用いられる。 調剤単位形態が力プセルである場合には、 上記タイプの材料に さらに油脂のような液状担体を含有することができる。 注射のための無菌組成物 は注射用水のようなべヒクル中の活性物質、 胡麻油、 椰子油などのような天然産 出植物油などを溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施に従って処方するこ とができる。 注射用の水性液としては、 例えば、 生理食塩水、 ブドウ糖やその他 の補助薬を含む等張液 （例えば、 D—ソルビトール、 D—マンニトール、 塩化ナ トリウムなど） などが用いられ、 適当な溶解補助剤、 例えば、 アルコール （例、 エタノール） 、 ポリアルコール （例、 プロピレングリコール、 ポリエチレンダリ コール） 、 非イオン性界面活性剤 （例、 ポリソルベート 80TM、 HCO-50 ) などと併用してもよい。 油性液としては、 例えば、 ゴマ油、 大豆油などが用い られ、 溶解補助剤である安息香酸ベンジル、 ベンジルアルコールなどと併用して もよい。
また、 上記予防および Zまたは治療剤は、 例えば、 緩衝剤 （例えば、 リン酸塩 緩衝液、 酢酸ナトリウム緩衝液） 、 無痛化剤 （例えば、 塩化ベンザルコニゥム、 塩酸プロ力インなど） 、 安定剤 （例えば、 ヒト血清アルブミン、 ポリエチレング リコールなど） 、 保存剤 （例えば、 ベンジルアルコール、 フエノールなど） 、 酸 化防止剤などと配合してもよい。 調製された注射液は通常、 適当なアンプルに充 填される。
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、 例えば、 ヒトやその 他の哺乳動物 （例えば、 ラット、 マウス、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブ夕、 ゥシ、 ネコ、 ィヌ、 サルなど) に対して投与することができる。
本発明の予防および/または治療剤の投与量は、 投与対象、 対象臓器、 症状、 投与方法などにより差異はあるが、 経口投与の場合、 一般的に例えば、 癌患者 （ 60k gとして） においては、 一日につき約 0. lmg〜l 00mg、 好ましく は約 1. 0〜5 Omg、 より好ましくは約 1. 0〜2 Omgである。 非経口的に 投与する場合は、 その 1回投与量は投与対象、 対象臓器、 症状、 投与方法などに よっても異なるが、 例えば、 注射剤の形では通常例えば、 癌患者 （6 O kgとし て） においては、 一日につき約 0. 01〜30mg程度、 好ましくは約 0. 1〜 2 Omg程度、 より好ましくは約 0. 1〜1 Omg程度を静脈注射により投与す るのが好都合である。 他の動物の場合も、 60 k g当たりに換算した量を投与す ることができる。
本発明の DNAの投与量は、 投与対象、 対象臓器、 症状、 投与方法などにより 差異はあるが、 経口投与の場合、 一般的に例えば、 癌患者 （6 O kgとして） に おいては、 一日につき約 0. lmg〜l 0 Omg、 好ましくは約 1. 0〜50m g、 より好ましくは約 1. 0〜20mgである。 非経口的に投与する場合は、 そ の 1回投与量は投与対象、 対象臓器、 症状、 投与方法などによっても異なるが、 例えば、 注射剤の形では通常例えば、 癌患者 （6 0 k gとして） においては、 一 日につき約 0 . 0 1〜3 O m g程度、 好ましくは約 0 . l〜2 0 m g程度、 より 好ましくは約 0 . 1〜1 O m g程度を静脈注射により投与するのが好都合である 。 他の動物の場合も、 6 0 k g当たりに換算した量を投与することができる。 上記の本発明の遺伝子発現解析方法を用いた結果得られる、 例えば配列番号： 9で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有する レセプ夕一タンパク質の新規用途について、 以下に説明する。
(レセプタ一タンパク質）
本発明で用いられるレセプタータンパク質は、 配列番号： 9で表わされるアミ ノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するレセプ夕一タン パク質 （以下、 本発明のレセプタータンパク質ともいう） である。 なお、 配列番 号： 9で表わされるアミノ酸配列を有するタンパク質は、 ヒト由来 dj287G14. 2レ セプ夕一タンパク質である。 ヒト由来 dj 287G14. 2レセプ夕一は、 WO 2 0 0 1 / 1 8 2 0 7に記載されているタンパク質と同一のアミノ酸配列を有する。
本発明者らは、 ァスパラギン結合型糖鎖ゃセリン ·スレオニン結合型糖鎖など の糖鎖に親和性を示すタンパク質 （例えば、 、 ConA (コンカナパリン A)、 Lent i l lect in (レンズマメレクチン）、 Pea lect in (エンドゥマメレクチン）、 Datura lect in (チヨゥセンアサガオレクチン）、 Maackia Amurensis lect in (ィヌェンジ ユレクチン）、 フイ トへマグルチニンなどのレクチン） が、 dj 287G14. 2レセプタ 一のリガンドの 1つであることを初めて確認した。 本発明のレセプタ一タンパク 質は、 例えば、 ヒトやその他の哺乳動物 （例えば、 モルモット、 ラット、 マウス 、 ゥサギ、 ブタ、 ヒッジ、 ゥシ、 サルなど） のあらゆる細胞 〔例えば、 網膜細胞 、 脾細胞、 神経細胞、 グリア細胞、 膝臓 3細胞、 骨髄細胞、 メサンギゥム細胞、 ランゲルハンス細胞、 表皮細胞、 上皮細胞、 内皮細胞、 繊維芽細胞、 繊維細胞、 筋細胞、 脂肪細胞、 免疫細胞 （例、 マクロファージ、 T細胞、 B細胞、 ナチユラ ルキラー細胞、 肥満細胞、 好中球、 好塩基球、 好酸球、 単球、 白血球） 、 巨核球 、 滑膜細胞、 軟骨細胞、 骨細胞、 骨芽細胞、 破骨細胞、 乳腺細胞、 肝細胞もしく は間質細胞、 またはこれら細胞の前駆細胞、 幹細胞もしくは癌細胞 （例、 乳癌細 胞株 （G I— 101) 、 結腸癌細胞株 （CX— 1、 G I - 1 12) 、 肺癌細胞株 (LX— 1、 G I - 1 17) 、 卵巣癌細胞株 （G I— 102) 、 前立腺癌細胞株 など） など〕 、 またはそれらの細胞が存在するあらゆる組織、 例えば、 脳、 脳の 各部位 （例、 嗅球、 扁頭核、 大脳基底球、 海馬、 視床、 視床下部、 視床下核、 大 脳皮質、 延髄、 小脳、 後頭葉、 前頭葉、 側頭葉、 被殻、 尾状核、 脳染、 黒質） 、 脊髄、 下垂体、 胃、 膝臓、 腎臓、 肝臓、 生殖腺、 甲状腺、 胆のう、 骨髄、 副腎、 皮膚、 筋肉、 肺、 消化管 （例、 大腸、 小腸） 、 血管、 心臓、 胸腺、 脾臓、 顎下腺 、 末梢血、 末梢血球、 前立腺、 睾丸、 精巣、 卵巣、 胎盤、 子宮、 骨、 関節、 骨格 筋など、 または血球系の細胞もしくはその培養細胞 （例えば、 MEL， Ml, C TLL- 2, HT- 2, WEH I - 3, HL- 60, J OSK— 1， K 562 , ML- 1 , MOLT- 3 , MOLT-4, MOLT— 10, CCRF— CEM, TALL- 1, J u r k a t, CCRT-HS B- 2, KE - 37, SKW- 3 ， HUT- 78, HUT- 102, H9, U 937 , THP - 1, HEL, J K — 1， CMK， KO- 812, MEG— 01など） に由来するタンパク質であつ てもよく、 また合成タンパク質であってもよい。
本明細書において、 「実質的に同一のアミノ酸配列」 とは、 比較するアミノ酸 配列に対して、 例えば、 約 50%以上、 好ましくは約 60%以上、 より好ましく は約 70%以上、 さらに好ましくは約 80%以上、 なかでも好ましくは約 90 % 以上、 最も好ましくは約 95%以上の相同性を有するアミノ酸配列をいう。 配列番号： 9で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有 するタンパク質としては、 例えば、 配列番号： 9で表わされるアミノ酸配列と実 質的に同一のアミノ酸配列を含有し、 配列番号： 9で表わされるアミノ酸配列を 含有するタンパク質と実質的に同質の活性を有するタンパク質などが好ましい。 実質的に同質の活性としては、 例えば、 リガンド結合活性、 シグナル情報伝達 作用などが挙げられる。 実質的に同質とは、 それらの活性が性質的に同質である ことを示す。 したがって、 リガンド結合活性やシグナル情報伝達作用などの活性 が同等 （例、 約 0. 01〜100倍、 好ましくは約 0. 5〜20倍、 より好まし くは約 0. 5〜2倍） であることが好ましいが、 これらの活性の程度やタンパク 質の分子量などの量的要素は異なっていてもよい。 リガンド結合活性やシグナル情報伝達作用などの活性の測定は、 公知の方法に 準じて行なうことができるが、 例えば、 後に記載するリガンドの決定方法ゃスク リ一二ング方法に従つて測定することができる。
また、 本発明のレセプ夕一タンパク質としては、 （1) 配列番号： 9、 配列番 号： 1 3、 配列番号： 1 5、 配列番号： 1 7、 配列番号： 1 9、 配列番号： 2 1 、 配列番号： 2 3、 配列番号： 2 5または配列番号： 2 7で表わされるアミノ酸 配列中の 1または 2個以上 （好ましくは、 1〜30個程度、 より好ましくは 1〜 1 0個程度、 さらに好ましくは数個 （1〜5個） ） のアミノ酸が欠失したァミノ 酸配列、 （ 2 ) 配列番号： 9、 配列番号： 1 3、 配列番号： 1 5、 配列番号： 1 7、 配列番号： 1 9、 配列番号： 2 1、 配列番号： 2 3、 配列番号： 2 5または 配列番号： 2 7で表わされるアミノ酸配列に 1または 2個以上 （好ましくは、 1 〜3 0個程度、 より好ましくは 1〜1 0個程度、 さらに好ましくは数個 （1〜5 個） ） のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、 （3) 配列番号： 9、 配列番号： 1 3、 配列番号： 1 5、 配列番号： 1 7、 配列番号： 1 9、 配列番号： 2 1、 配列 番号： 2 3、 配列番号： 2 5または配列番号： 2 7で表わされるアミノ酸配列中 の 1または 2個以上 （好ましくは、 1〜3 0個程度、 より好ましくは 1〜 1 0個 程度、 さらに好ましくは数個 （1〜5個） ） のアミノ酸が他のアミノ酸で置換さ れたアミノ酸配列、 または （4) それらを組み合わせたアミノ酸配列を含有する タンパク質なども用いられる。
本明細書におけるレセプ夕一タンパク質は、 ペプチド標記の慣例に従って、 左 端が N末端 (ァミノ末端) 、 右端が C末端 (カルボキシル末端) である。 本発明 のレセプタータンパク質は、 C末端が力ルポキシル基 (-COOH) 、 カルボキ シレート （一COO一） 、 アミド （一C〇NH2) またはエステル （一 COOR ) の何れであってもよい。
ここでエステルにおける Rとしては、 例えば、 メチル、 ェチル、 n—プロピル 、 イソプロピルもしくは n—ブチルなどの アルキル基、 例えば、 シクロべ ンチル、 シク口へキシルなどの C 3— 8シクロアルキル基、 例えば、 フエニル、 a 一ナフチルなどの C6_12ァリール基、 例えば、 ベンジル、 フエネチルなどのフ ェニル一 C】 _ 2アルキル基もしくはひ一ナフチルメチルなどの α—ナフチルー C ^ 2アルキル基などの C 7— 14ァラルキル基のほか、 経口用エステルとして汎用 されるピバロィルォキシメチル基などが用いられる。
本発明のレセプ夕一タンパク質が C末端以外にカルボキシル基 (またはカルボ キシレート） を有している場合、 カルボキシル基がアミド化またはエステル化さ れているものも本発明のレセプタータンパク質に含まれる。 この場合のエステル としては、 例えば上記した C末端のエステルなどが用いられる。
さらに、 本発明のレセプ夕一タンパク質には、 上記したタンパク質において、 N末端のメチォニン残基のァミノ基が保護基 （例えば、 ホルミル基、 ァセチルな どの C 2 _ 6アルカノィル基などの C _ 6ァシル基など） で保護されているもの、 N端側が生体内で切断され生成したダルタミル基がピログルタミン酸化したもの 、 分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基 （例えば、 一 OH、 _SH、 アミノ基、 ィ ミダゾール基、 インドール基、 グァニジノ基など） が適当な保護基 （例えば、 ホ ルミル基、 ァセチルなどの C 2— 6アルカノィル基などの C； _ 6ァシル基など) で 保護されているもの、 あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖タンパク質などの複合 タンパク質なども含まれる。
本発明のレセプタータンパク質の具体例としては、 例えば、 配列番号： 9で表 わされるアミノ酸配列からなるヒト由来 dj287G14.2レセプ夕一タンパク質、 配列 番号： 1 3、 配列番号： 1 5、 配列番号： 1 7、 配列番号： 1 9、 配列番号： 2 1、 配列番号： 23、 配列番号： 25または配列番号： 27で表わされるァミノ 酸配列からなるマウス由来 dj287G14.2レセプタ一タンパク質などが挙げられる。 なお、 配列番号： 13、 配列番号： 1 5、 配列番号： 17、 配列番号： 19、 配列番号： 2 1、 配列番号： 23、 配列番号： 25または配列番号： 27で表わ されるアミノ酸配列からなるマウス由来 dj 287G14.2レセプタータンパク質は新規 なタンパク質である。
本発明のレセプタータンパク質またはその塩は、 上記したヒトゃ哺乳動物の細 胞または組織から公知のレセプタータンパク質の精製方法によって製造すること もできるし、 後に記載する本発明のレセプタータンパク質をコードする DNAを 含有する形質転換体を培養することによつても製造することができる。 また、 後 に記載するタンパク質合成法またはこれに準じて製造することもできる。 ヒトゃ哺乳動物の組織または細胞から製造する場合、 ヒトゃ哺乳動物の組織ま たは細胞をホモジナイズした後、 酸などで抽出を行ない、 該抽出液を逆相クロマ トグラフィー、 イオン交換クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィーを組み 合わせることにより精製単離することができる。
(レセプタータンパク質の部分ペプチド）
本発明の部分ペプチド （以下、 単に 「部分ペプチド」 と略記する場合がある） としては、 上記した本発明のレセプタータンパク質の部分アミノ酸配列を有する ペプチドであれば何れのものであってもよいが、 例えば、 本発明のレセプ夕一夕 ンパク質の分子のうち、 細胞膜の外に露出している部位であって、 本発明のレセ プタ一タンパク質と実質的に同質のレセプター結合活性を有するものなどが用い られる。
具体的には、 配列番号： 9で表わされるアミノ酸配列を有する本発明のレセプ 夕一タンパク質の部分ペプチドとしては、 疎水性プロット解析において細胞外領 域 （親水性 （Hydrophi l ic) 部位） であると分析された部分を含むペプチドであ る。 また、 疎水性 （Hydrophobic) 部位を一部に含むペプチドも同様に用いるこ とができる。 個々のドメインを個別に含むペプチドも用い得るが、 複数のドメイ ンを同時に含む部分のぺプチドでも良い。
本発明の部分べプチドのアミノ酸の数は、 上記した本発明のレセプタ一タンパ ク質の構成アミノ酸配列のうち少なくとも 2 0個以上、 好ましくは 5 0個以上、 より好ましくは 1 0 0個以上のアミノ酸配列を有するペプチドなどが好ましい。 実質的に同一のアミノ酸配列とは、 これらアミノ酸配列と約 5 0 %以上、 好ま しくは約 6 0 %以上、 より好ましくは約 7 0 %以上、 さらに好ましくは約 8 0 % 以上、 なかでも好ましくは約 9 0 %以上、 最も好ましくは約 9 5 %以上の相同性 を有するアミノ酸配列を示す。
ここで、 「実質的に同質のレセプター結合活性」 とは、 上記と同意義を示す。 「実質的に同質のレセプター結合活性」 の測定は上記と同様に行なうことができ る。
また、 本発明の部分ペプチドは、 上記アミノ酸配列中の 1または 2個以上 （好 ましくは、 1〜1 0個程度、 さらに好ましくは数個 （1〜5個） ） のアミノ酸が 欠失し、 または、 そのアミノ酸配列に 1または 2個以上 （好ましくは、 1〜2 0 個程度、 より好ましくは 1〜1 0個程度、 さらに好ましくは数個 （1〜5個） ） のアミノ酸が付加し、 または、 そのアミノ酸配列中の 1または 2個以上 （好まし くは、 1〜1 0個程度、 より好ましくは数個、 さらに好ましくは 1〜5個程度） のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されていてもよい。
また、 本発明の部分ペプチドは C末端が力ルポキシル基 （_ C O O H) 、 カル ボキシレート (- C O O") 、 アミド （一 C O NH 2) またはエステル (一 C O O R) であってもよい。
さらに、 本発明の部分ペプチドには、 上記した本発明のレセプタータンパク質 と同様に、 N末端のメチォニン残基のァミノ基が'保護基で保護されているもの、 N端側が生体内で切断され生成した G 1 nがピログルタミン酸化したもの、 .分子 内のアミノ酸の側鎖上の置換基が適当な保護基で保護されているもの、 あるいは 糖鎖が結合したいわゆる糖ペプチドなどの複合ペプチドなども含まれる。
本発明のレセプタータンパク質またはその部分ペプチドの塩としては、 酸また は塩基との生理学的に許容される塩が挙げられ、 とりわけ生理学的に許容される 酸付加塩が好ましい。 この様な塩としては、 例えば、 無機酸 （例えば、 塩酸、 リ ン酸、 臭化水素酸、 硫酸） との塩、 あるいは有機酸 （例えば、 酢酸、 ギ酸、 プロ ピオン酸、 フマル酸、 マレイン酸、 コハク酸、 酒石酸、 クェン酸、 リンゴ酸、 蓚 酸、 安息香酸、 メタンスルホン酸、 ベンゼンスルホン酸） との塩などが用いられ る。
本発明の部分ペプチドまたはその塩は、 公知のペプチドの合成法に従って、 あ るいは本発明の G P C Rを適当なぺプチダーゼで切断することによって製造する ことができる。 ペプチドの合成法としては、 例えば、 固相合成法、 液相合成法の いずれによっても良い。 すなわち、 本発明の G P C Rを構成し得る部分ペプチド もしくはアミノ酸と残余部分とを縮合させ、 生成物が保護基を有する場合は保護 基を脱離することにより目的のぺプチドを製造することができる。 公知の縮合方 法や保護基の脱離としては、 例えば、 以下の a ) 〜e ) に記載された方法が挙げ られる。 a) M. Bodanszkyおよび M.A. Ondetti, ペプチド シンセシス （Peptide Synthesis) , Interscience Publishers, New York (1966年）
b) Schroederおよび Luebke、 ザ ペプチド（The Peptide) , Academic Press, New York (1965年）
c) 泉屋信夫他、 ペプチド合成の基礎と実験、 丸善 (株） （1975年） d) 矢島治明 および榊原俊平、 生化学実験講座 1、 タンパク質の化学 IV、 205、 （1977年）
e) 矢島治明監修、 続医薬品の開発 第 14巻 ペプチド合成 広川書店 また、 反応後は通常の精製法、 例えば、 溶媒抽出 ·蒸留 ·カラムクロマトダラ フィー ·液体クロマトグラフィー ·再結晶などを組み合わせて本発明の部分ぺプ チドを精製単離することができる。 上記方法で得られる部分べプチドが遊離体で ある場合は、 公知の方法によって適当な塩に変換することができるし、 逆に塩で 得られた場合は、 公知の方法によつて遊離体に変換することができる。 (ポリヌクレオチド)
本発明のレセプ夕一タンパク質をコードするポリヌクレオチドとしては、 上記 した本発明のレセプタータンパク質をコードする塩基配列 （DNAまたは RNA 、 好ましくは DNA) を含有するものであればいかなるものであってもよい。 該 ポリヌクレオチドとしては、 本発明のレセプ夕一タンパク質をコードする DNA 、 mRNA等の RNAであり、 二本鎖であっても、 一本鎖であってもよい。 二本 鎖の場合は、 二本鎖 DNA、 二本鎖 RNAまたは DNA： RNAのハイブリツド でもよい。 一本鎖の場合は、 センス鎖 （すなわち、 コード鎖） であっても、 アン チセンス鎖 （すなわち、 非コード鎖） であってもよい。
本発明のレセプ夕一タンパク質をコ一ドするポリヌクレオチドを用いて、 例え ば、 実験医学増刊 「新 PC Rとその応用」 15(7)、 1997記載の公知の方法または それに準じた方法により、 本発明のレセプ夕一タンパク質の mRNAを定量する ことができる。
本発明のレセプ夕一タンパク質をコ一ドする DNAとしては、 ゲノム DNA、 一、 上記した細胞または組織由来の cDNA、 上記した 細胞または組織由来の cDNAライブラリー、 合成 DNAのいずれでもよい。 ラ イブラリーに使用するベクターは、 パクテリオファージ、 プラスミド、 コスミド 、 ファージミドなどいずれであってもよい。 また、 上記した細胞または組織より total RN Aまたは mRN A画分を調製したものを用いて直接 Reverse
Transcriptase Polymerase Chain Reaction (以下、 RT— PCR法と略称する ) によって増幅することもできる。
具体的には、 本発明のレセプタ一タンパク質をコードする DN Aとしては、 例 えば、 配列番号： 8、 配列番号： 10、 配列番号： 14、 配列番号： 16、 配列 番号： 1 8、 配列番号： 20、 配列番号： 22、 配列番号： 24、 配列番号： 2 6または配列番号： 28で表わされる塩基配列を含有する DNA、 または配列番 号： 8、 配列番号： 10、 配列番号： 14、 配列番号： 16、 配列番号： 18、 配列番号： 20、 配列番号： 22、 配列番号： 24、 配列番号： 26または配列 番号： 28で表わされる塩基配列を含有する DNAとハイストリンジェントな条 件下でハイブリダィズする DNAを有し、 配列番号： 9で表わされるアミノ酸配 列を含有するレセプタータンパク質と実質的に同質の活性 （例、 リガンド結合活 性、 シグナル情報伝達作用など） を有するレセプ夕一タンパク質をコードする D N Aが挙げられる。
配列番号： 8、 配列番号： 1 0、 配列番号： 14、 配列番号： 1 6、 配列番号 : 1 8、 配列番号： 20、 配列番号： 22、 配列番号： 24、 配列番号： 26ま たは配列番号： 28で表わされる塩基配列を有する DNAとハイストリンジェン 卜な条件下でハイブリダィズする DNAとしては、 例えば、 配列番号： 8、 配列 番号： 1 0、 配列番号： 14、 配列番号： 16、 配列番号： 18、 配列番号： 2 0、 配列番号： 22、 配列番号： 24、 配列番号： 26または配列番号： 28で 表わされる塩基配列と約 70%以上、 好ましくは約 80%以上、 より好ましくは 約 90 %以上、 さらに好ましくは約 95 %以上の相同性を有する塩基配列を含有 する D N Aなどが用いられる。
ハイブリダィゼ一シヨンは、 公知の方法あるいはそれに準じる方法、 例えば、 モレキュラー ·クローニンク (Molecular Cloning) 2nd (J. Sambrook et al. , Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989) に記載の方法などに従って行なうこと ができる。 また、 市販のライブラリーを使用する場合、 添付の使用説明書に記載 の方法に従って行なうことができる。 より好ましくは、 ハイストリンジェン卜な 条件に従って行なうことができる。
「該ハイストリンジェン卜な条件」 とは、 例えば、 ナトリウム濃度が約 1 9〜 4 0 mM、 好ましくは約 1 9〜 2 0 mMで、 温度が約 5 0〜 7 0で、 好ましくは 約 6 0〜6 5 °Cの条件を示す。 特に、 ナトリウム濃度が約 1 9 mMで温度が約 6 5 °Cの場合が最も好ましい。
本発明の 「レセプ夕一タンパク質をコードする D N Aの塩基配列の一部、 また は該 D N Aと相補的な塩基配列の一部を含有してなるポリヌクレオチド」 とは、 下記の本発明の部分ペプチドをコードする D NAを包含するだけではなく、 R N Aをも包含する意味で用いられる。
本発明に従えば、 レセプ夕一タンパク質遺伝子の複製または発現を阻害するこ とのできるアンチセンス ·ポリヌクレオチド (核酸) を、 クローン化した、 ある いは決定されたレセプタータンパク質をコードする D N Aの塩基配列情報に基づ き設計し、 合成しうる。 そうしたポリヌクレオチド (核酸) は、 レセプタータン パク質遺伝子の R N Aとハイブリダィズすることができ、 該 R N Aの合成または 機能を阻害することができるか、 あるいはレセプ夕一タンパク質関連 R NAとの 相互作用を介してレセプ夕一タンパク質遺伝子の発現を調節 ·制御することがで きる。 レセプタータンパク質関連 R NAの選択された配列に相補的なポリヌクレ ォチド、 およびレセプ夕一タンパク質関連 R NAと特異的にハイブリダィズする ことができるポリヌクレオチドは、 生体内および生体外でレセプタータンパク質 遺伝子の発現を調節 ·制御するのに有用であり、 また病気などの治療または診断 に有用である。 用語 「対応する」 とは、 遺伝子を含めたヌクレオチド、 塩基配列 または核酸の特定の配列に相同性を有するあるいは相補的であることを意味する 。 ヌクレオチド、 塩基配列または核酸とペプチド （タンパク質） との間で 「対応 する」 とは、 ヌクレオチド （核酸） の配列またはその相補体から誘導される指令 にあるペプチド （タンパク質） のアミノ酸を通常指している。 レセプ夕一タンパ ク質遺伝子の 5， 端ヘアピンループ、 5， 端 6—ベースペア ' リピート、 5， 端 非翻訳領域、 ポリペプチド翻訳開始コドン、 タンパク質コード領域、 O R F翻訳 終止コドン、 3 ' 端非翻訳領域、 3 ' 端パリンドローム領域、 および 3 ' 端ヘア ピンループは好ましい対象領域として選択しうるが、 レセプタータンパク質遺伝 子内の如何なる領域も対象として選択しうる。
本発明のレセプタータンパク質またはその部分ペプチド （以下、 包括的に本発 明のレセプタータンパク質と略記する場合がある） を完全にコードする D NAの クローニングの手段としては、 本発明のレセプタータンパク質の部分塩基配列を 有する合成 D NAプライマーを用いて P C R法によって増幅するか、 または適当 なべクタ一に組み込んだ D N Aを本発明のレセプタータンパク質の一部あるいは 全領域をコードする D NA断片もしくは合成 D NAを用いて標識したものとのハ イブリダィゼーシヨンによって選別することができる。 ハイブリダィゼ一シヨン の方法は、 例えば、 モレキュラー ·クロ一ニング （Molecular Cloning) 2 nd ( J. Sambrook et al. , Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989) に記載の方法な どに従って行なうことができる。 また、 市販のライブラリーを使用する場合、 添 付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。
(アンチセンス ·ポリヌクレオチド）
目的核酸と、 対象領域の少なくとも一部に相補的なポリヌクレオチドとの関係 は、 対象物とハイブリダィズすることができるポリヌクレオチドとの関係は、 「 アンチセンス」 であるということができる。 アンチセンス ·ポリヌクレオチドは 、 2—デォキシー D—リポ一スを含有しているポリヌクレオチド、 D—リポース を含有しているポリヌクレオチド、 プリンまたはピリミジン塩基の N—グリコシ ドであるその他のタイプのポリヌクレオチド、 あるいは非ヌクレオチド骨格を有 するその他のポリマー （例えば、 市販のタンパク質、 核酸および合成配列特異的 な核酸ポリマ一） または特殊な結合を含有するその他のポリマー （但し、 該ポリ マ一は D NAや R NA中に見出されるような塩基のペアリングや塩基の付着を許 容する配置をもつヌクレオチドを含有する） などが挙げられる。 それらは、 二本 鎖 D NA、 一本鎖 D NA、 二本鎖 R NA、 一本鎖 R NA、 さらに D NA : R NA ハイブリッドであることができ、 さらに非修飾ポリヌクレオチド （または非修飾 オリゴヌクレオチド） 、 さらには公知の修飾の付加されたもの、 例えば当該分野 で知られた標識のあるもの、 キャップの付いたもの、 メチル化されたもの、 1個 以上の天然のヌクレオチドを類縁物で置換したもの、 分子内ヌクレオチド修飾の されたもの、 例えば非荷電結合 （例えば、 メチルホスホネート、 ホスホトリエス テル、 ホスホルアミデート、 力ルバメートなど） を持つもの、 電荷を有する結合 または硫黄含有結合 （例えば、 ホスホロチォェ一ト、 ホスホロジチォエートなど ) を持つもの、 例えばタンパク質 (ヌクレア一ゼ、 ヌクレアーゼ ·インヒビ夕一 、 トキシン、 抗体、 シグナルペプチド、 ポリ一 L—リジンなど） や糖 （例えば、 モノサッカライドなど） などの側鎖基を有しているもの、 イン夕一力レート化合 物 （例えば、 ァクリジン、 ゾラレンなど） を持つもの、 キレート化合物 （例えば 、 金属、 放射活性をもつ金属、 ホウ素、 酸化性の金属など） を含有するもの、 ァ ルキル化剤を含有するもの、 修飾された結合を持つもの （例えば、 ひァノマー型 の核酸など） であってもよい。 ここで 「ヌクレオシド」 、 「ヌクレオチド」 およ び 「核酸」 とは、 プリンおよびピリミジン塩基を含有するのみでなく、 修飾され たその他の複素環型塩基をもつようなものを含んでいて良い。 こうした修飾物は 、 メチル化されたプリンおよびピリミジン、 ァシル化されたプリンおよびピリミ ジン、 あるいはその他の複素環を含むものであってよい。 修飾されたヌクレオチ ドおよび修飾されたヌクレオチドはまた糖部分が修飾されていてよく、 例えば、 1個以上の水酸基がハロゲンとか、 脂肪族基などで置換されていたり、 あるいは エー ル、 ァミンなどの官能基に変換されていてよい。
本発明のアンチセンス ·ポリヌクレオチド （核酸） は、 R NA、 D NA、 ある いは修飾された核酸 （R NA、 D NA) である。 修飾された核酸の具体例として は核酸の硫黄誘導体ゃチォホスフェート誘導体、 そしてポリヌクレオシドアミド やオリゴヌクレオシドアミドの分解に抵抗性のものが挙げられるが、 それに限定 されるものではない。 本発明のアンチセンス核酸は次のような方針で好ましく設 計されうる。 すなわち、 細胞内でのアンチセンス核酸をより安定なものにする、 アンチセンス核酸の細胞透過性をより高める、 目標とするセンス鎖に対する親和 性をより大きなものにする、 そしてもし毒性があるならアンチセンス核酸の毒性 をより小さなものにする。
こうした修飾は当該分野で数多く知られており、 例えば J. Kawakami et al.， P arm Tech Japan, Vol. 8, pp. 247, 1992 ; Vol. 8, pp. 395, 1992 ; S. T. Crooke et al. ed. , Ant isense Research and Appl icat ions, CRC Press, 1993 などに開示がある。
本発明のアンチセンス核酸は、 変化せしめられたり、 修飾された糖、 塩基、 結 合を含有していて良く、 リボゾーム、 ミクロスフエアのような特殊な形態で供与 されたり、 遺伝子治療により適用されたり、 付加された形態で与えられることが できうる。 こうして付加形態で用いられるものとしては、 リン酸基骨格の電荷を 中和するように働くポリリジンのようなポリカチォン体、 細胞膜との相互作用を 高めたり、 核酸の取込みを増大せしめるような脂質 （例えば、 ホスホリピド、 コ レステロールなど） といった疎水性のものが挙げられる。 付加するに好ましい脂 質としては、 コレステロールやその誘導体 (例えば、 コレステリルクロ口ホルメ 一卜、 コール酸など） が挙げられる。 こうしたものは、 核酸の 3 ' 端あるいは 5 ' 端に付着させることができ、 塩基、 糖、 分子内ヌクレオシド結合を介して付着 させることができうる。 その他の基としては、 核酸の 3 ' 端あるいは 5 ' 端に特 異的に配置されたキャップ用の基で、 ェキソヌクレア一ゼ、 R N a s eなどのヌ クレアーゼによる分解を阻止するためのものが挙げられる。 こうしたキヤップ用 の基としては、 ポリエチレングリコール、 テトラエチレングリコールなどのダリ コールをはじめとした当該分野で知られた水酸基の保護基が挙げられるが、 それ に限定されるものではない。
アンチセンス核酸の阻害活性は、 本発明の形質転換体、 本発明の生体内や生体 外の遺伝子発現系、 あるいはレセプ夕一タンパク質の生体内や生体外の翻訳系を 用いて調べることができる。 該核酸は公知の各種の方法で細胞に適用できる。 本発明のアンチセンス ·ポリヌクレオチドは、 生体内における本発明のタンパ ク質または本発明のポリヌクレオチド （例、 D NA) の機能を抑制することがで きるので、 例えば、 本発明のレセプタータンパク質の機能不全に関連する疾患の 予防および Zまたは治療剤として用いることができる。 さらに、 本発明のアンチ センス ·ポリヌクレオチドは、 組織や細胞における本発明の D NAの存在やその 発現状況を調べるための診断用オリゴヌクレオチドプローブとして使用すること もできるので、 本発明のレセプタータンパク質の機能不全に関連する疾患の診断 に用いることができる。 (部分ペプチドをコードする DNA)
本発明の部分ペプチドをコードする DNAとしては、 上記した本発明の部分べ プチドをコ一ドする塩基配列を含有するものであればいかなるものであってもよ レ^ また、 ゲノム DNA、 ゲノム DNAライブラリ一、 上記した細胞または組織 由来の cDNA、 上記した細胞または組織由来の c DNAライブラリー、 合成 D NAのいずれでもよい。 ライブラリ一に使用するベクターは、 バクテリオファー ジ、 プラスミド、 コスミド、 ファージミドなどいずれであってもよい。 また、 上 記した細胞または組織より mRNA画分を調製したものを用レ ^て直接 Reve r s e Transcriptase Polymerase Chain Reaction (以下、 RT— PCR法と略称する ) によって増幅することもできる。
具体的には、 本発明の部分ペプチドをコードする DNAとしては、 例えば、
(1) 配列番号： 8、 配列番号： 1 0、 配列番号： 14、 配列番号： 1 6、 配列 番号： 18、 配列番号： 20、 配列番号： 22、 配列番号： 24、 配列番号： 2
6または配列番号： 28で表わされる塩基配列を含有する DNAの部分塩基配列 を有する DNA、
(2) 配列番号： 8、 配列番号： 10、 配列番号： 14、 配列番号： 16、 配列 番号： 18、 配列番号： 20、 配列番号： 22、 配列番号： 24、 配列番号： 2 6または配列番号： 28で表わされる塩基配列を含有する DN Aとハイストリン ジェントな条件下でハイプリダイズする DNAを有し、 配列番号： 9で表わされ るアミノ酸配列を含有するタンパク質ペプチドと実質的に同質の活性 （例、 リガ ンド結合活性、 シグナル情報伝達作用など） を有するタンパク質をコードする D N Aの部分塩基配列を有する D N Aなどが用いられる。
配列番号： 8、 配列番号： 10、 配列番号： 14、 配列番号： 16、 配列番号 : 1 8、 配列番号： 20、 配列番号： 22、 配列番号： 24、 配列番号： 26ま たは配列番号： 28で表わされる塩基配列を含有する DN Aとハイストリンジェ ントな条件でハイブリダィズする DNAとしては、 例えば、 配列番号： 8、 配列 番号： 10、 配列番号： 14、 配列番号： 1 6、 配列番号： 1 8、 配列番号： 2 0、 配列番号： 2 2、 配列番号： 2 4、 配列番号： 2 6または配列番号： 2 8で 表わされる塩基配列と約 7 0 %以上、 好ましくは約 8 0 %以上、 より好ましくは 約 9 0 %以上、 さらに好ましくは約 9 5 %以上の相同性を有する塩基配列を含有 する D N Aなどが用いられる。
(抗体）
本発明のレセプ夕一タンパク質もしくはその部分べプチドまたはその塩に対す る抗体は、 本発明のレセプタータンパク質もしくはその部分べプチドまたはその 塩、 あるいは本発明のレセプ夕一タンパク質を含有する細胞を認識し得る抗体で あれば、 ポリクローナル抗体、 モノクローナル抗体の何れであってもよい。 本発明のレセプ夕一タンパク質もしくはその部分べプチドまたはその塩 （以下 、 本発明のレセプ夕一タンパク質等と略記する場合がある） に対する抗体は、 本 発明のレセプ夕一タンパク質等を抗原として用い、 公知の抗体または抗血清の製 造法に従って製造することができる。
〔モノクローナル抗体の作製〕
( a ) モノクローナルモノクローナル抗体産生細胞の作製
本発明のレセプ夕一タンパク質等は、 哺乳動物に対して投与により抗体産生が 可能な部位にそれ自体あるいは担体、 希釈剤とともに投与される。 投与に際して 抗体産生能を高めるため、 完全フロイン卜アジュバントや不完全フロイントアジ ュバントを投与してもよい。 投与は通常 2〜 6週毎に 1回ずつ、 計 2〜 1 0回程 度行なわれる。 用いられる哺乳動物としては、 例えば、 サル、 ゥサギ、 ィヌ、 モ ルモット、 マウス、 ラット、 ヒッジ、 ャギが挙げられるが、 マウスおよびラット が好ましく用いられる。
モノクローナル抗体産生細胞の作製に際しては、 抗原を免疫された温血動物、 例えば、 マウスから抗体価の認められた個体を選択し最終免疫の 2〜5日後に脾 臓またはリンパ節を採取し、 それらに含まれる抗体産生細胞を骨髄腫細胞と融合 させることにより、 モノクローナル抗体産生ハイプリドーマを調製することがで きる。 抗血清中の抗体価の測定は、 例えば、 後記の標識化レセプタータンパク質 等と抗血清とを反応させたのち、 抗体に結合した標識剤の活性を測定することに より行なうことができる。 融合操作は既知の方法、 例えば、 ケ一ラーとミルス夕 インの方法 〔ネィチヤ一 （Nature) 、 256卷、 495頁 （ 1975年） 〕 に従 い実施することができる。 融合促進剤としては、 例えば、 ポリエチレングリコ一 ル （PEG) やセンダイウィルスなどが挙げられるが、 好ましくは PEGが用い られる。
骨髄腫細胞としては、 例えば、 N S— 1、 P 3 U 1、 S P 2 / 0などが挙げら れるが、 P 3 U 1が好ましく用いられる。 用いられる抗体産生細胞 （脾臓細胞） 数と骨髄腫細胞数との好ましい比率は 1 ： 1〜20 ： 1程度であり、 PEG (好 ましくは、 PEG1000〜PEG6000) が 10〜80 %程度の濃度で添加 され、 約 20〜 40 °C、 好ましくは約 30〜 37 °Cで約 1〜 10分間ィンキュベ —トすることにより効率よく細胞融合を実施できる。
モノク口一ナル抗体産生ハイプリドーマのスクリーニングには種々の方法が使 用できるが、 例えば、 レセプタータンパク質等の抗原を直接あるいは担体ととも に吸着させた固相 （例、 マイクロプレート） にハイブリド一マ培養上清を添加し 、 次に放射性物質や酵素などで標識した抗免疫グロブリン抗体 （細胞融合に用い られる細胞がマウスの場合、 抗マゥス免疫グ口ブリン抗体が用いられる) または プロテイン Aを加え、 固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法、 抗免 疫グロプリン抗体またはプロティン Aを吸着させた固相にハイプリドーマ培養上 清を添加し、 放射性物質や酵素などで標識したレセプタ一タンパク質等を加え、 固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法などが挙げられる。
モノクローナル抗体の選別は、 公知あるいはそれに準じる方法に従って行なう ことができるが、 通常は HAT (ヒポキサンチン、 アミノプテリン、 チミジン） を添加した動物細胞用培地などで行なうことができる。 選別および育種用培地と しては、 ハイプリドーマが生育できるものならばどのような培地を用いても良い 。 例えば、 1〜20%、 好ましくは 10〜20%の牛胎児血清を含む RPMI 1640培地、 1〜 10 %の牛胎児血清を含む G I T培地 （和光純薬工業 （株） ) またはハイプリドーマ培養用無血清培地 （SFM— 101、 日水製薬 （株） ) などを用いることができる。 培養温度は、 通常 20〜40° (：、 好ましくは約 37 °Cである。 培養時間は、 通常 5日〜 3週間、 好ましくは 1週間〜 2週間である。 培養は、 通常 5 %炭酸ガス下で行なうことができる。 ハイプリドーマ培養上清の 抗体価は、 上記の抗血清中の抗体価の測定と同様にして測定できる。
( b ) モノクローナル抗体の精製
モノクローナル抗体の分離精製は、 通常のポリクローナル抗体の分離精製と同 様に免疫グロブリンの分離精製法 〔例、 塩析法、 アルコール沈殿法、 等電点沈殿 法、 電気泳動法、 イオン交換体 （例、 D E A E ) による吸脱着法、 超遠心法、 ゲ ルろ過法、 抗原結合固相またはプロテイン Aあるいはプロテイン Gなどの活性吸 着剤により抗体のみを採取し、 結合を解離させて抗体を得る特異的精製法〕 に従 つて行なうことができる。
〔ポリクローナル抗体の作製〕
本発明のポリクローナル抗体は、 公知あるいはそれに準じる方法にしたがって 製造することができる。 例えば、 免疫抗原 （本発明のタンパク質等の抗原） とキ ャリア一タンパク質との複合体をつくり、 上記のモノクローナル抗体の製造法と 同様に哺乳動物に免疫を行ない、 該免疫動物から本発明のレセプタータンパク質 等に対する抗体含有物を採取して、 抗体の分離精製を行なうことにより製造でき る。
哺乳動物を免疫するために用いられる免疫抗原とキャリアータンパク質との複 合体に関し、 キヤリア一タンパク質の種類およびキヤリア一とハプテンとの混合 比は、 キヤリア一に架橋させて免疫したハプテンに対して抗体力効率良くできれ ば、 どの様なものをどの様な比率で架橋させてもよいが、 例えば、 ゥシ血清アル ブミン、 ゥシサイログロブリン、 キーホール · リンぺット ·へモシァニン等を重 量比でハプテン 1に対し、 約 0. 1〜 2 0、 好ましくは約 1〜 5の割合で力プル させる方法が用いられる。
また、 ハプテンとキャリアーの力プリングには、 種々の縮合剤を用いることが できるが、 ダルタルアルデヒドやカルポジイミド、 マレイミド活性エステル、 チ オール基、 ジチォゼリジル基を含有する活性エステル試薬等が用いられる。 縮合生成物は、 温血動物に対して、 .抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは 担体、 希釈剤とともに投与される。 投与に際して抗体産生能を高めるため、 完全 フロイントアジュバントゃ不完全フロイントアジュバン卜を投与してもよい。 投 与は、 通常約 2〜 6週毎に 1回ずつ、 計約 3〜1 0回程度行なうことができる。 ポリクローナル抗体は、 上記の方法で免疫された哺乳動物の血液、 腹水など、 好ましくは血液から採取することができる。
抗血清中のポリクロ一ナル抗体価の測定は、 上記の血清中の抗体価の測定と同 様にして測定できる。 ポリクローナル抗体の分離精製は、 上記のモノクローナル 抗体の分離精製と同様の免疫グロプリンの分離精製法に従って行なうことができ る。 [レセプ夕一タンパク質、 D NAなどの用途]
ァスパラギン結合型糖鎖ゃセリン ·スレオニン結合型糖鎖などの糖鎖に親和性 を示すタンパク質 （例えば、 コンカナパリン A、 レンズマメレクチン、 エンドゥ マメレクチン、 チョウセンアサガオレクチン、 ィヌェンジユレクチン、 フイトへ マグルチ二ンなどのレクチンなど） は本発明のレセプタータンパク質のリガンド の 1つである。
従って、 本発明のレセプタータンパク質、 それをコードするポリヌクレオチド (以下、 本発明のポリヌクレオチドと略記する場合がある） 、 本発明のレセプタ —タンパク質に対する抗体 (以下、 本発明の抗体と略記する場合がある) 、 本発 明の D NAに対するアンチセンスポリヌクレオチド （以下、 本発明のアンチセン スポリヌクレオチドと略記する場合がある） などは、 以下の用途を有している。
( 1 ) 本発明のレセプタータンパク質の機能不全に関連する疾患の予防および/ または治療剤
本発明のレセプ夕一タンパク質は前立腺 (癌）、 胎盤、 肝臓で発現が見られるこ とから、 a ) 本発明のレセプ夕一タンパク質または b ) 本発明のレセプ夕一タン パク質をコードするポリヌクレオチド （例、 D NA) を、 本発明のレセプタ一タ ンパク質の機能不全、 特に前立腺癌、 およびその他の癌 (非小細胞癌、 卵巣癌、 胃癌、 膀胱癌、 乳癌、 子宮頸部癌、 結腸癌、 直腸癌、 大腸癌等)、 前立腺肥大症 、 男性性腺機能障害、 不妊、 早産、 子宮内膜症、 肝硬変、 肝炎、 肝不全、 結石の 予防および Zまたは治療剤、 または分娩誘発剤などの医薬として使用することが できる。
例えば、 生体内において本発明のレセプタータンパク質が減少しているために 、 リガンドの生理作用が期待できない （本発明のレセプタータンパク質の欠乏症 ) 患者がいる場合に、 a ) 本発明のレセプタータンパク質を該患者に投与し該レ セプタータンパク質の量を補充したり、 b ) (ィ） 本発明のレセプタ一タンパク 質をコードする D NAを該患者に投与し発現させることによって、 あるいは （口 ) 対象となる細胞に本発明のレセプ夕一タンパク質をコードする D NAを挿入し 発現させた後に、 該細胞を該患者に移植することなどによって、 患者の体内にお ける該レセプ夕一タンパク質の量を増加させ、 リガンドの作用を充分に発揮させ ることができる。 すなわち、 本発明のレセプタータンパク質をコードするポリヌ クレオチドは、 安全で低毒性な該レセプタータンパク質の機能不全、 特に前立腺 癌、 およびその他の癌 （非小細胞癌、 卵巣癌、 胃癌、 膀胱癌、 乳癌、 子宮頸部癌 、 結腸癌、 直腸癌、 大腸癌等） 、 前立腺肥大症、 男性性腺機能障害、 不妊、 早産 、 子宮内膜症、 肝硬変、 肝炎、 肝不全、 結石の予防および/または治療剤、 また は分娩誘発剤として有用である。
本発明のレセプタ一タンパク質またはそれをコードするポリヌクレオチドを上 記医薬として使用する場合は、 常套手段に従って製剤化することができる。
( 2 ) 本発明のポリヌクレオチドまたはアンチセンスポリヌクレオチドを用いる 診断剤及び診断方法
本発明のポリヌクレオチド （例、 D NA) およびアンチセンスポリヌクレオチ ド （例、 アンチセンス D NA) は、 プローブとして使用することにより、 ヒトま たは哺乳動物 （例えば、 ラット、 マウス、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブ夕、 ゥシ、 ネコ、 ィヌ、 サルなど） における本発明のレセプタータンパク質またはその部分べプチ ドをコードする D NAまたは mR NAの異常 （遺伝子異常） を検出することがで きるので、 例えば、 該 D NAまたは mR NAの損傷、 突然変異あるいは発現低下 や、 該 D N Aまたは m R N Aの増加あるいは発現過多などの遺伝子診断剤として 有用である。
本発明のポリヌクレオチドまたはアンチセンスポリヌクレオチドを用いる上記 の遺伝子診断は、 例えば、 公知のノーザンハイブリダィゼーシヨンや P C R—S S C P法 （ゲノミックス （Genomics) ， 第 5巻， 8 7 4〜 8 7 9頁 （1 9 8 9年 ) 、 プロシージングズ.ォブ *ザ*ナショナル .アカデミー ·ォブ ·サイェンシ ィズ ·ォブ ·ユーエスェ一 (Proceed ings of the Nat ional Academy of
Sci ences of the Uni t ed Stat es of Ameri ca) ， 第 8 6巻， 2 7 6 6〜2 7 7 0 頁 （1 9 8 9年） ） などにより実施することができる。
例えば、 ノーザンハイブリダイゼ一シヨンにより本発明のレセプ夕一タンパク 質の発現低下または発現過多が検出された場合は、 例えば、 本発明のレセプ夕一 タンパク質の機能不全または過剰発現に起因する疾患、 特に前立腺癌、 およびそ の他の癌 （非小細胞癌、 卵巣癌、 胃癌、 膀胱癌、 乳癌、 子宮頸部癌、 結腸癌、 直 腸癌、 大腸癌等） 、 前立腺肥大症、 男性性腺機能障害、 不妊、 早産、 子宮内膜症
、 肝硬変、 肝炎、 肝不全、 結石に罹患している可能性が高いまたは将来罹患する 可能性が高いと診断することができる。
( 3 ) 本発明のアンチセンスポリヌクレオチドを含有してなる医薬
本発明のアンチセンスポリヌクレオチドは、 本発明のレセプタータンパク質の 過剰発現などに起因する疾患 （例えば、 前立腺癌、 およびその他の癌 （非小細胞 癌、 卵巣癌、 胃癌、 膀胱癌、 乳癌、 子宮頸部癌、 結腸癌、 直腸癌、 大腸癌等） 、 前立腺肥大症、 男性性腺機能障害、 不妊、 早産、 子宮内膜症、 肝硬変、 肝炎、 肝 不全、 結石などの疾患） の予防及び Z又は治療剤、 または分娩誘発剤として用い ることができる。
例えば、 該アンチセンスポリヌクレオチドを用いる場合、 該アンチセンスポリ ヌクレオチドを単独あるいはレトロウイルスベクター、 アデノウイルスベクター 、 アデノウイルスァソシエーテツドウィルスベクターなどの適当なベクターに掙 入した後、 常套手段に従つて実施することができる。 該アンチセンスポリヌクレ ォチドは、 そのままで、 あるいは摂取促進のために補助剤などの生理学的に認め られる担体とともに製剤化し、 遺伝子銃やハイド口ゲルカテーテルのようなカテ 一テルによって投与できる。
さらに、 該アンチセンスポリヌクレオチドは、 組織や細胞における本発明の D N Aの存在やその発現状況を調べるための診断用オリゴヌクレオチドプローブと して使用することもできる。 ( 4 ) 本発明のレセプタータンパク質またはその部分ペプチドの発現量を変化さ せる化合物のスクリ一ニング方法
本発明の D NAは、 プローブとして用いることにより、 本発明のレセプター夕 ンパク質またはその部分ペプチドの発現量を変化させる化合物のスクリーニング に用いることができる。
すなわち、 本発明は、 例えば、 （i ) 非ヒト哺乳動物の （1 ) 血液、 （2 ) 特 定の臓器、 （3 ) 臓器から単離した組織もしくは細胞、 または U 形質転換 体等に含まれる本発明のレセプ夕一タンパク質またはその部分ペプチドの mR N A量を測定することによる、 本発明のレセプ夕一タンパク質またはその部分ぺプ チドの発現量を変化させる化合物のスクリーニング方法を提供する。
本発明のレセプ夕一夕ンパク質またはその部分べプチドの m R N A量の測定は 具体的には以下のようにして行なう。
( i ) 正常あるいは疾患モデル非ヒト哺乳動物 （例えば、 マウス、 ラット、 ゥ サギ、 ヒッジ、 プタ、 ゥシ、 ネコ、 ィヌ、 サルなど、 より具体的には担癌マウス など） に対して、 薬剤 （例えば、 抗癌剤など） あるいは物理的ストレス （例えば 、 浸水ストレス、 電気ショック、 明暗、 低温など） などを与え、 一定時間経過し た後に、 血液、 あるいは特定の臓器 （例えば、 脳、 肺、 大腸、 前立腺など） 、 ま たは臓器から単離した組織、 あるいは細胞を得る。
得られた細胞に含まれる本発明のレセプタータンパク質またはその部分べプチ ドの m R NAは、 例えば、 通常の方法により細胞等から mR NAを抽出し、 例え ば、 T a q M a n P C Rなどの手法を用いることにより定量することができ、 公 知の手段によりノザンプロットを行うことにより解析することもできる。
( i i ) 本発明のレセプタータンパク質もしくはその部分ペプチドを発現する 形質転換体を上記の方法に従い作製し、 該形質転換体に含まれる本発明のレセプ タータンパク質またはその部分ペプチドの mR NAを同様にして定量、 解析する ことができる。
本発明のレセプタータンパク質またはその部分ペプチドの発現量を変化させる 化合物のスクリーニングは、
( i ) 正常あるいは疾患モデル非ヒト哺乳動物に対して、 薬剤あるいは物理的 ストレスなどを与える一定時間前 （30分前〜 24時間前、 好ましくは 30分前 〜 12時間前、 より好ましくは 1時間前〜 6時間前） もしくは一定時間後 （30 分後〜 3日後、 好ましくは 1時間後〜 2日後、 より好ましくは 1時間後〜 24時 間後） 、 または薬剤あるいは物理的ストレスと同時に被検化合物を投与し、 投与 後一定時間経過後 （30分後〜 3日後、 好ましくは 1時間後〜 2日後、 より好ま しくは 1時間後〜 24時間後） 、 細胞に含まれる本発明のレセプ夕一タンパク質 またはその部分べプチドの m R N A量を定量、 解析することにより行なうことが でき、
( i i) 形質転換体を常法に従い培養する際に被検化合物を培地中に混合させ 、 一定時間培養後 （1日後〜 7日後、 好ましくは 1日後〜 3日後、 より好ましく は 2日後〜 3日後） 、 該形質転換体に含まれる本発明のレセプタータンパク質ま たはその部分べプチドの mRNA量を定量、 解析することにより行なうことがで ぎる。
本発明のスクリーニング方法を用いて得られる化合物またはその塩は、 本発明 のレセプタータンパク質またはその部分べプチドの発現量を変化させる作用を有 する化合物であり、 具体的には、 （ィ） 本発明のレセプタータンパク質またはそ の部分べプチドの発現量を増加させることにより、 レセプ夕一を介する細胞刺激 活性を増強させる化合物、 （口） 本発明のレセプ夕一タンパク質またはその部分 ペプチドの発現量を減少させることにより、 該細胞刺激活性を減弱させる化合物 である。
細胞刺激活性としては、 例えば、 （1) ァラキドン酸遊離、 （2) ァセチルコ リン遊離、 （3) 細胞内 Ca2+遊離、 （4) 細胞内 CAM P生成、 （5) 細胞 内 c GMP生成、 （6) イノシトールリン酸産生、 （7) 細胞膜電位変動、 （8 ) 細胞内タンパク質 （例、 MAPキナーゼ） のリン酸化、 （9) c— f o sの活 性化、 （10) pHの低下、 （1 1) Rho， R a c, R a sなどの低分子量 G タンパク質の活性化、 （12) 転写因子 CRE (c AMP r e s p o n s i v e e l eme n t) 、 AP 1、 NFAT、 SRE (s e r um r e s pon s i v e e l eme n t) などの下流につないだレポーター遺伝子 （例、 ルシ プエラ一ゼなど） の活性化などが挙げられ、 特に細胞内 cAMP生成の促進活性 などが好ましい。
該化合物としては、 ペプチド、 タンパク質、 非ペプチド性化合物、 合成化合物 、 発酵生産物などが挙げられ、 これら化合物は新規な化合物であってもよいし、 公知の化合物であってもよい。
該細胞刺激活性を増強させる化合物は、 本発明のレセプタータンパク質等の生 理活性を増強するための安全で低毒性な医薬として有用である。
該細胞刺激活性を減弱させる化合物は、 本発明のレセプタ一タンパク質等の生 理活性を減少させるための安全で低毒性な医薬として有用である。
上記したとおり、 本発明のレセプタータンパク質のリガンドの 1つは、 糖鎖に 親和性を示すタンパク質 （例、 レクチンなど） である。 したがって、 上記スクリ 一二ング方法で得られる本発明のレセプ夕一タンパク質の発現量を変化させる化 合物は、 前立腺癌、 およびその他の癌 （非小細胞癌、 卵巣癌、 胃癌、 膀胱癌、 乳 癌、 子宮頸部癌、 結腸癌、 直腸癌、 大腸癌等） 、 前立腺肥大症、 男性性腺機能障 害、 不妊、 早産、 子宮内膜症、 肝硬変、 肝炎、 肝不全、 結石などの予防および Z または治療剤、 または分娩誘発剤として用いることができる。
( 5 ) 本発明のレセプ夕一夕ンパク質またはその部分べプチドの発現量を変化さ せる化合物を含有する各種疾病の予防およびノまたは治療剤
本発明のレセプ夕一タンパク質は上記のとおり、 例えば、 中枢機能など生体内 で何らかの重要な役割を果たしていると考えられる。 したがって、 本発明のレセ プタータンパク質またはその部分ペプチドの発現量を変化させる化合物は、 本発 明のレセプタータンパク質の機能不全に関連する疾患の予防および/または治療 剤として用いることができる。
該化合物を本発明のレセプタータンパク質の機能不全に関連する疾患の予防お よび/または治療剤として使用する場合は、 常套手段に従って製剤化することが できる。
( 6 ) 本発明のレセプ夕一タンパク質とリガンドとの結合性を変化させる化合物 (ァゴ二スト、 アン夕ゴニストなど） のスクリーニング方法及びスクリーニング キッ卜
本発明のレセプ夕一タンパク質等を用いるか、 または組換え型レセプタ一タン パク質等の発現系を構築し、 該発現系を用いたレセプ夕一結合アツセィ系を用い ることによって、 リガンドと本発明のレセプタ一夕ンパク質等との結合性を変化 させる化合物 （例えば、 ペプチド、 タンパク質、 非ペプチド性化合物、 合成化合 物、 発酵生産物など） またはその塩を効率よくスクリ一二ングすることができる 。
上記したとおり、 本発明のレセプ夕一タンパク質に対するリガンドの 1つとし て、 糖鎖に親和性を示すタンパク質 （例えば、 レクチン） が挙げられる。
さらに、 リガンドとしては、 糖鎖に親和性を示すタンパク質と本発明のレセプ 夕一夕ンパク質との結合性を変化させる化合物またはその塩を用いることもでき る。 この糖鎖に親和性を示すタンパク質と本発明のレセプ夕一タンパク質との結 合性を変化させる化合物またはその塩は、 例えば、 リガンドとして糖鎖に親和性 を示すタンパク質を用いて、 本発明のスクーニング方法を実施することによって 得ることができる。
糖鎖に親和性を示すタンパク質と本発明のレセプ夕一タンパク質との結合性を 変化させる化合物またはその塩としては、 低分子合成化合物が好ましく、 新規ま たは公知の何れの化合物であってもよい。 特に、 本発明のレセプタータンパク質 に対するアン夕ゴニストをスクリーニングする場合には、 糖鎖に親和性を示す夕 ンパク質に代えて、 ァゴニスト活性を有する低分子合成化合物を用いるのが好ま しい。
低分子合成化合物は、 糖鎖に親和性を示す夕ンパク質に比べて標識が容易であ るため、 スクリーニングに適している。 以下、 これらの糖鎖に親和性を示すタン パク質や低分子合成化合物をまとめてリガンドと記載する。
リガンドと本発明のレセプタータンパク質との結合性を変化させる化合物には 、 （ィ） レセプ夕一を介する細胞刺激活性などを促進する活性または抑制する活 性など） を有する化合物 （いわゆる、 本発明のレセプ夕一タンパク質に対するァ ゴニスト） 、 （口） 該細胞刺激活性を有しない化合物 （いわゆる、 本発明のレセ プタータンパク質に対するアン夕ゴニスト） 、 （ハ） リガンドと本発明の Gタン パク質共役型レセプタータンパク質との結合力を増強する化合物、 あるいは （二 ) リガンドと本発明のレセプタータンパク質との結合力を減少させる化合物など が含まれる （なお、 上記 （ィ） の化合物は、 上記したリガンド決定方法によって スクリーニングすることが好ましい） 。
細胞刺激活性としては、 例えば、 （1) ァラキドン酸遊離、 （2) ァセチルコ リン遊離、 （3) 細胞内 C a 2+遊離、 （4) 細胞内 cAM P生成、 （5) 細胞 内 cGMP生成、 （6) イノシトールリン酸産生、 （7) 細胞膜電位変動、 （8 ) 細胞内タンパク質 （例、 MAPキナーゼ） のリン酸化、 （9) c一 f o sの活 性化、 （ 10 ) p Hの低下、 （11) Rho, R a c, Ra sなどの低分子量 G タンパク質の活性化、 （12) 転写因子 CRE (c AMP r e s pon s i v e e l emen t) 、 AP I, NFAT、 S RE (s e r um r e s p o n s i v e e 1 eme n t) などの下流につないだレポ一タ一遺伝子 （例、 ルシ フェラーゼなど） の活性化などが挙げられ、 特に細胞内 cAM P生成の促進活性 などが好ましい。
すなわち、 本発明は、 （ i) 本発明のレセプタ一タンパク質もしくはその部分 ペプチドまたはその塩と、 リガンドとを接触させた場合と （i i) 本発明のレセ プ夕一タンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩と、 リガンドおよび試 験化合物とを接触させた場合との比較を行なうことを特徴とするリガンドと本発 明のレセプタータンパク質もしくはその部分べプチドまたはその塩との結合性を 変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。
本発明のスクリーニング方法においては、 （ i) と （i i) の場合における、 例えば、 該レセプ夕一タンパク質等に対するリガンドの結合量、 細胞刺激活性な どを測定して、 比較することを特徴とする。
より具体的には、 本発明は、
( i ) 標識したリガンドを、 本発明のレセプ夕一夕ンパク質等に接触させた場 合と、 標識したリガンドおよび試験化合物を本発明のレセプ夕一タンパク質等に 接触させた場合における、 標識したリガンドの該レセプター夕ンパク質等に対す る結合量を測定し、 比較することを特徴とするリガンドと本発明のレセプター夕 ンパク質等との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、
( i i) 標識したリガンドを、 本発明のレセプ夕一タンパク質等を含有する細 胞または該細胞の膜画分に接触させた場合と、 標識したリガンドおよび試験化合 物を本発明のレセプタータンパク質等を含有する細胞または該細胞の膜画分に接 触させた場合における、 標識したリガンドの該細胞または該膜画分に対する結合 量を測定し、 比較することを特徴とするリガンドと本発明のレセプタータンパク 質等との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、
( i i i ) 標識したリガンドを、 本発明の D NAを含有する形質転換体を培養 することによって細胞膜上に発現したレセプ夕一タンパク質等に接触させた場合 と、 標識したリガンドおよび試験化合物を本発明の D NAを含有する形質転換体 を培養することによって細胞膜上に発現した本発明のレセプタータンパク質等に 接触させた場合における、 標識したリガンドの該レセプ夕一タンパク質等に対す る結合量を測定し、 比較することを特徴とするリガンドと本発明のレセプタ一タ ンパク質等との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、
( i v ) 本発明のレセプタータンパク質等を活性化する化合物 （例えば、 リガ ンドなど） を本発明のレセプタータンパク質等を含有する細胞に接触させた場合 と、 本発明のレセプタータンパク質等を活性化する化合物および試験化合物を本 発明のレセプタータンパク質等を含有する細胞に接触させた場合における、 レセ プターを介した細胞刺激活性を測定し、 比較することを特徴とするリガンドと本 発明のレセプタ一タンパク質等との結合性を変化させる化合物またはその塩のス クリーニング方法、 および
( V ) 本発明のレセプタータンパク質等を活性化する化合物 （例えば、 リガン ドなど） を本発明の D N Aを含有する形質転換体を培養することによって細胞膜 上に発現した本発明のレセプ夕一タンパク質等に接触させた場合と、 本発明のレ セプタータンパク質等を活性化する化合物および試験化合物を本発明の D NAを 含有する形質転換体を培養することによつて細胞膜上に発現した本発明のレセプ 夕一タンパク質等に接触させた場合における、 レセプ夕一を介する細胞刺激活性 を測定し、 比較することを特徴とするリガンドと本発明のレセプタータンパク質 等との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する 本発明のスクリーニング方法の具体的な説明を以下にする。
まず、 本発明のスクリーニング方法に用いる本発明のレセプ夕一タンパク質等 としては、 上記した本発明のレセプ夕一タンパク質等を含有するものであれば何 れのものであってもよいが、 本発明のレセプ夕一夕ンパク質等を含有する哺乳動 物の臓器の細胞膜画分が好適である。 しかし、 特にヒト由来の臓器は入手が極め て困難なことから、 スクリーニングに用いられるものとしては、 組換え体を用い て大量発現させたヒト由来のレセプタータンパク質等などが適している。
本発明のリセプタータンパク質を製造するには、 上記の方法が用いられるが、 本発明の D N Aを哺乳細胞や昆虫細胞で発現することにより行なうことが好まし レ^ 目的とするタンパク質部分をコードする D NA断片には相補 D NAが用いら れるが、 必ずしもこれに制約されるものではない。 例えば、 遺伝子断片や合成 D NAを用いてもよい。 本発明のレセプ夕一タンパク質をコードする D NA断片を 宿主動物細胞に導入し、 それらを効率よく発現させるためには、 該 D NA断片を 昆虫を宿主とするバキュロウィルスに属する核多角体病ウィルス （nuclear polyhedros is virus； N P V) のポリヘドリンプロモータ一、 S V 4 0由来のプ 口モー夕—、 レトロウイルスのプロモーター、 メタ口チォネインプロモーター、 ヒドヒートショックプロモーター、 サイトメガロウィルスプロモータ一、 S R α プロモーターなどの下流に組み込むのが好ましい。 発現したレセプターの量と質 の検査はそれ自体公知の方法で行うことができる。 例えば、 文献 〔Nambi, P. ら 、 ザ ·ジャーナル ·ォブ'バイオロジカル 'ケミストリー (J. Biol. Chem. ) , 267卷， 19555〜19559頁， 1992年〕 に記載の方法に従って行なうことができる。 なお、 本発明のスクリーニング方法において、 本発明のレセプタータンパク質 等を含有するものとしては、 公知の方法に従って精製したレセプタータンパク質 等であってもよいし、 該レセプ夕一夕ンパク質等を含有する細胞を用いてもよく 、 また該レセプ夕一タンパク質等を含有する細胞の膜画分を用いてもよい。 本発明のスクリーニング方法において、 本発明のレセプ夕一タンパク質等を含 有する細胞を用いる場合、 該細胞をダルタルアルデヒド、 ホルマリンなどで固定 化してもよい。 固定化方法は公知の方法に従って行なうことができる。
本発明のレセプタータンパク質等を含有する細胞としては、 該レセプタータン パク質等を発現した宿主細胞をいうが、 該宿主細胞としては、 大腸菌、 枯草菌、 酵母、 昆虫細胞、 動物細胞などが好ましい。 細胞膜画分としては、 細胞を破砕した後、 公知の方法で得られる細胞膜が多く 含まれる画分のことをいう。 細胞の破碎方法としては、 Potter—Elvehj em型ホモ ジナイザーで細胞を押し潰す方法、 ヮ一リングプレンダーゃポリ トロン （ Khiemat ica社製） のよる破砕、 超音波による破砕、 フレンチプレスなどで加圧し ながら細胞を細いノズルから噴出させることによる破砕などが挙げられる。 細胞 膜の分画には、 分画遠心分離法や密度勾配遠心分離法などの遠心力による分画法 が主として用いられる。 例えば、 細胞破砕液を低速 （5 0 0 r p m〜3 0 0 0 r p m) で短時間 （通常、 約 1分〜 1 0分) 遠心し、 上清をさらに高速 （1 5 0 0 0 r p m〜3 0 0 0 0 r p m) で通常 3 0分〜 2時間遠心し、 得られる沈澱 ¾膜 画分とする。 該膜画分中には、 発現したレセプタータンパク質等と細胞由来のリ ン脂質ゃ膜タンパク質などの膜成分が多く含まれる。
該レセプ夕一夕ンパク質等を含有する細胞や膜画分中のレセプタータンパク質 の量は、 1細胞当たり 1 0 3〜1 0 8分子であるのが好ましく、 1 0 5〜1 0 7分 子であるのが好適である。 なお、 発現量が多いほど膜画分当たりのリガンド結合 活性 （比活性） が高くなり、 高感度なスクリーニング系の構築が可能になるばか りでなく、 同一口ットで大量の試料を測定できるようになる。
リガンドと本発明のレセプタータンパク質等との結合性を変化させる化合物を スクリーニングする上記の （1 ) 〜 （3 ) を実施するためには、 例えば、 適当な レセプ夕一夕ンパク質画分と、 標識したリガンドが必要である。
レセプタータンパク質画分としては、 天然型のレセプタータンパク質画分か、 またはそれと同等の活性を有する組換え型レセプ夕一タンパク質画分などが望ま しい。 ここで、 同等の活性とは、 同等のリガンド結合活性、 シグナル情報伝達作 用などを示す。 , 標識したリガンドとしては、 標識したリガンド、 標識したリガンドアナログ化 合物などが用いられる。 例えば 〔3 H〕 、 〔1 2 5 I〕 、 〔1 4 C〕 、 〔3 5 S〕 など で標識されたリガンドなどが用いられる。
具体的には、 リガンドと本発明のレセプ夕一タンパク質等との結合性を変化さ せる化合物のスクリーニングを行なうには、 まず本発明のレセプタータンパク質 等を含有する細胞または細胞の膜画分を、 スクリーニングに適したバッファーに 懸濁することによりレセプタータンパク質標品を調製する。 バッファ一には、 P
H4〜10 (望ましくは pH6〜8) のリン酸バッファー、 トリス一塩酸バッフ ァ一などのリガンドとレセプタ一タンパク質との結合を阻害しなぃバッファ一で あればいずれでもよい。 また、 非特異的結合を低減させる目的で、 CHAPS、 Tween-80™ (花王—アトラス社） 、 ジギ卜ニン、 デォキシコレートなどの 界面活性剤をバッファーに加えることもできる。 さらに、 プロテア一ゼによるレ セプ夕一やリガンドの分解を抑える目的で PMSF、 ロイぺプチン、 E— 64 ( ペプチド研究所製） 、 ぺプスタチンなどのプロテア一ゼ阻害剤を添加することも できる。 0. 01m l〜； L Om lの該レセプタ一溶液に、 一定量 （5000 c p m〜500000 c pm) の標識したリガンドを添加し、 同時に 10— 4M〜1 0一 1 QMの試験化合物を共存させる。 非特異的結合量 （NSB) を知るために大 過剰の未標識のリガンドを加えた反応チューブも用意する。 反応は約 0°Cから 5 0°C、 望ましくは約 4°Cから 37°Cで、 約 20分から 24時間、 望ましくは約 3 0分から 3時間行う。 反応後、 ガラス繊維濾紙等で濾過し、 適量の同バッファ一 で洗浄した後、 ガラス繊維濾紙に残存する放射活性を液体シンチレ一ションカウ ン夕ーまたはァ—カウンタ一で計測する。 拮抗する物質がない場合のカウント （ B0) から非特異的結合量 （NSB) を引いたカウント （BQ— NSB) を 10 0%とした時、 特異的結合量 （B— NSB) ifi、 例えば、 50%以下になる試験 化合物を拮抗阻害能力のある候補物質として選択することができる。
リガンドと本発明のレセプタータンパク質等との結合性を変化させる化合物を スクリーニングする上記の (4) 〜 （5) の方法を実施するためには、 例えば、 上記したレセプター夕ンパク質を介する細胞刺激活性を公知の方法または市販の 測定用キットを用いて測定することができる。
具体的には、 まず、 本発明のレセプタータンパク質等を含有する細胞をマルチ ゥエルプレート等に培養する。 スクリーニングを行なうにあたっては前もって新 鮮な培地あるいは細胞に毒性を示さない適当なバッファーに交換し、 試験化合物 などを添加して一定時間インキュベートした後、 細胞を抽出あるいは上清液を回 収して、 生成した産物をそれぞれの方法に従って定量する。 細胞刺激活性の指標 とする物質 （例えば、 ァラキドン酸など） の生成が、 細胞が含有する分解酵素に よって検定困難な場合は、 該分解酵素に対する阻害剤を添加してアツセィを行な つてもよい。 また、 c AM P産生抑制などの活性については、 フオルスコリンな どで細胞の基礎的産生量を増大させておいた細胞に対する産生抑制作用として検 出することができる。
細胞刺激活性を測定してスクリーニングを行なうには、 適当なレセプ夕一タン パク質を発現した細胞が必要である。 本発明のレセプ夕一タンパク質等を発現し た細胞としては、 天然型の本発明のレセプタータンパク質等を有する細胞株、 上 記の組換え型レセプタータンパク質等を発現した細胞株などが望ましい。
試験化合物としては、 例えば、 ペプチド、 タンパク質、 非ペプチド性化合物、 合成化合物、 発酵生産物、 細胞抽出液、 植物抽出液、 動物組織抽出液などが用い られ、 これら化合物は新規な化合物であつてもよいし、 公知の化合物であっても よい。
また、 試験化合物としては、 本発明のレセプタ一タンパク質の活性部位の原子 座標およびリガンド結合ポケッ卜の位置に基づいて、 リガンド結合ポケットに結 合するように設計された化合物が好ましく用いられる。 本発明のレセプ夕一タン パク質の活性部位の原子座標およびリガンド結合ポケッ卜の位置の測定は、 公知 の方法あるいはそれに準じる方法を用いて行うことができる。
リガンドと本発明のレセプタ一タンパク質等との結合性を変化させる化合物ま たはその塩のスクリーニング用キットは、 本発明のレセプタータンパク質等、 本 発明のレセプ夕一タンパク質等を含有する細胞、 または本発明のレセプタータン パク質等を含有する細胞の膜画分を含有するものなどである。
本発明のスクリーニング用キッ卜の例としては、 次のものが挙げられる。
1 . スクリーニング用試薬
(1)測定用緩衝液および洗浄用緩衝液
Hanks' Bal anced Sal t Solut ion (ギブコ社製） に、 0. 0 5 %のゥシ血清アル ブミン (シグマ社製) を加えたもの。
孔径 0. 4 5 i mのフィルターで濾過滅菌し、 4 °Cで保存するか、 あるいは用 時調製しても良い。
(2) Gタンパク質共役型レセプ夕ー標品 本発明のレセプ夕一タンパク質を発現させた CHO細胞を、 12穴プレートに 5 X 105個/穴で継代し、 37で、 5%C02、 95 % a i rで 2日間培養し たもの。
(3)標識リガンド
市販の 〔3H〕 、 〔125I〕 、 〔14C〕 、 〔35S〕 などで標識したリガンド 水溶液の状態のものを 4°Cあるいは一 20°Cにて保存し、 用時に測定用緩衝液 にて 1 Mに希釈する。
(4)リガンド標準液
リガンドを 0. 1%ゥシ血清アルブミン (シグマ社製) を含む PBSで ImM となるように溶解し、 一 20°Cで保存する。
2. 測定法
(1) 12穴組織培養用プレートにて培養した本発明のレセプ夕一タンパク質発 現 CHO細胞を、 測定用緩衝液 1 m 1で 2回洗浄した後、 490 1の測定用緩 衝液を各穴に加える。
(2) 10一3〜 10— 1GMの試験化合物溶液を 5 /i 1加えた後、 標識リガンドを 5 1加え、 室温にて 1時間反応させる。 非特異的結合量を知るためには試験化 合物の代わりに 10一3 Mのリガンドを 5 21加えておく。
(3)反応液を除去し、 1 m 1の洗浄用緩衝液で 3回洗浄する。 細胞に結合した 標識リガンドを 0.2 N NaOH— 1 %SDSで溶解し、 4 m 1の液体シンチ レーター A (和光純薬製） と混合する。
(4)液体シンチレーションカウンター (ベックマン社製) を用いて放射活性を 測定し、 Percent Maximum Binding (PMB) を次の式で求める。
PMB= [ (B-NS B) / (B„-NS B) ] X 100
PMB： Percent Maximum Binding
B ：検体を加えた時の値
NSB： Non-specific Binding (非特異的結合量)
B0 ：最大結合量 リガンドと本発明のレセプタータンパク質等との結合性を変化させる化合物ま たはその塩がァゴニス卜であるかアンタゴニストであるかの具体的な評価方法は 以下の （ i ) または （i i) に従えばよい。
( i ) 前記 （1 ) 〜 （3 ) のスクリーニング方法で示されるバインディング'ァ ッセィを行い、 リガンドと本発明のレセプ夕一タンパク質等との結合性を変化さ せる （特に、 結合を阻害する） 化合物を得た後、 該化合物が上記した本発明のレ セプ夕一タンパク質を介する細胞刺激活性を有しているか否かを測定する。 細胞 刺激活性を有する化合物またはその塩はァゴニストであり、 該活性を有しない化 合物またはその塩はアンタゴニストである。
(i i) (a)試験化合物を本発明のレセプタ一タンパク質を含有する細胞に接触さ せ、 上記した本発明のレセプタ一タンパク質を介する細胞刺激活性を測定する。 細胞刺激活性を有する化合物またはその塩はァゴニストである。
(b)本発明のレセプ夕一タンパク質を活性化する化合物 （例えば、 リガンドまた は本発明のレセプタータンパク質に対するァゴニストなど） を本発明のレセプタ 一タンパク質を含有する細胞に接触させた場合と、 本発明のレセプタ一タンパク 質を活性化する化合物および試験化合物を本発明のレセプタータンパク質を含有 する細胞に接触させた場合における、 上記した本発明のレセプタータンパク質を 介する細胞刺激活性を測定し、 比較する。 本発明のレセプタ一タンパク質を活性 化する化合物による細胞刺激活性を減少させ得る化合物またはその塩はァンタゴ ニストである。
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる 化合物またはその塩は、 リガンドと本発明のレセプタータンパク質等との結合性 を変化させる作用を有する化合物であり、 具体的には、 （1 ) 上記した本発明の レセプタータンパク質を介する細胞刺激活性を有する化合物 （いわゆる、 本発明 のレセプタータンパク質に対するァゴニスト） 、 （2 ) 該細胞刺激活性を有しな い化合物 （いわゆる、 本発明のレセプ夕一夕ンパク質に対するアンタゴニスト) 、 ( 3 ) リガンドと本発明のレセプタータンパク質との結合力を増強する化合物 、 あるいは （4 ) リガンドと本発明のレセプ夕一タンパク質との結合力を減少さ せる化合物である。
該化合物としては、 ペプチド、 タンパク質、 非ペプチド性化合物、 合成化合物 、 発酵生産物などが挙げられ、 これら化合物は新規な化合物であってもよいし、 公知の化合物であってもよい。
本発明のレセプ夕一タンパク質等に対するァゴニストは、 本発明のレセプ夕一 タンパク質等に対する上記リガンドが有する生理活性と同様の作用を有している ので、 該生理活性に応じて安全で低毒性な医薬として有用である。
本発明のレセプ夕一タンパク質等に対するアン夕ゴニストは、 本発明のレセプ 夕一タンパク質等に対する上記リガンドが有する生理活性を抑制することができ るので、 該生理活性を抑制する安全で低毒性な医薬として有用である。
リガンドと本発明のレセプ夕一タンパク質との結合力を増強する化合物は、 本 発明のレセプ夕一タンパク質等に対する上記リガンドが有する生理活性を増強す るための安全で低毒性な医薬として有用である。
リガンドと本発明のレセプタータンパク質との結合力を減少させる化合物は、 本発明のレセプ夕一タンパク質等に対する上記リガンドが有する生理活性を減少 させるための安全で低毒性な医薬として有用である。
具体的には、 本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用 いて得られるリガンドと本発明のリセプ夕一タンパク質との結合性を変化させる 作用を有する化合物またはその塩は、 例えば、 前立腺癌、 およびその他の癌 （非 小細胞癌、 卵巣癌、 胃癌、 膀胱癌、 乳癌、 子宮頸部癌、 結腸癌、 直腸癌、 大腸癌 等） 、 前立腺肥大症、 男性性腺機能障害、 不妊、 早産、 子宮内膜症、 肝硬変、 肝 炎、 肝不全、 結石などの疾患に対する予防及び/又は治療薬、 または分娩誘発薬 として有用である。
( 7 ) 本発明のレセプター夕ンパク質とリガンドとの結合性を変化させる化合物 (ァゴ二スト、 アンタゴニストなど） を含有する各種疾病の予防および Zまたは 治療剤）
本発明のレセプ夕一タンパク質とリガンドとの結合性を変化させる化合物 (7 ゴニスト、 アン夕ゴニス卜) や本発明のレセプタータンパク質に対する上記リガ ンドは、 本発明のレセプタータンパク質の機能不全に関連する疾患、 例えば、 前 立腺癌、 およびその他の癌 （非小細胞癌、 卵巣癌、 胃癌、 膀胱癌、 乳癌、 子宮頸 部癌、.結腸癌、 直腸癌、 大腸癌等） 、 前立腺肥大症、 男性性腺機能障害、 不妊、 早産、 子宮内膜症、 肝硬変、 肝炎、 肝不全、 結石などの疾患に対する予防および /または治療剤、 または分娩誘発剤として用いることができる。
該化合物やリガンドを本発明のレセプ夕一タンパク質の機能不全に関連する疾 患の予防および/または治療剤として使用する場合は、 上述したような常套手段 に従って製剤化することができる。
( 8 ) 本発明の抗体を用いるタンパク質などの定量、 本発明の抗体を含有する診 断薬およびそれを用いる診断方法
本発明の抗体は、 本発明のレセブタ一タンパク質等を特異的に認識することが できるので、 被検液中の本発明のレセプ夕一タンパク質等の定量、 特にサンドィ ッチ免疫測定法、 競合法、 ィムノメトリック法あるいはネフロメトリーなどによ る定量などに使用することができる。
これら個々の免疫学的測定法を本発明の測定方法に適用するにあたっては、 特 別の条件、 操作等の設定は必要とされない。 それぞれの方法における通常の条件 、 操作法に当業者の通常の技術的配慮を加えて本発明のレセプタ一タンパク質ま たはその塩の測定系を構築すればよい。 これらの一般的な技術手段の詳細につい ては、 総説、 成書などを参照することができる 〔例えば、 入江 寛編 「ラジオィ ムノアツセィ」 （講談社、 昭和 4 9年発行） 、 入江 寛編 「続ラジオィムノアツ セィ」 （講談社、 昭和 5 4年発行） 、 石川栄治ら編 「酵素免疫測定法」 （医学書 院、 昭和 5 3年発行） 、 石川栄治ら編 「酵素免疫測定法」 （第 2版） （医学書院 、 昭和 5 7年発行） 、 石川栄治ら編 「酵素免疫測定法」 （第 3版） （医学書院、 昭和 6 2年発行） 、 「メソッズ ·イン ·ェンジモノジ一 （Methods in
ENZYMOLOGY) Vol. 70 (Immunochemical Techni ues (Part A) )、 同書 Vol.
73 (Immunochemical Techniques (Part B) ) 同書 Vol. 74 (Immunochemical Techniaues (Part C) )、 同書 Vol. 84 (Immunochemical Techniaues (Part D : Selected Immunoassays) ) ¾ 同書 Vol. 92 (Immunochemical Techniaues (Part E: Monoc lonal Ant ibodies and General I腿漏 assay Methods) )、 同書 Vol. 121 (Immunochemical Techniques (Part I :Hybridoia Technology and Monoclonal Ant ibodies) ) (以上、 アカデミックプレス社発行)、 WO 0 0 / 1 4 2 2 7号公報 第 39頁第 25行〜第 42頁第 8行、 E P 1 1 1 1 0 4 7 A 2号公報段落 [G115]第 19頁 第 35行〜第 20頁第 47行など参照」 。
以上のように、 本発明の抗体を用いることによって、 本発明のレセプタータン パク質またはその塩を感度良く定量することができる。
さらに、 本発明の抗体を用いて、 生体内での本発明のレセプ夕一タンパク質ま たその塩を定量することによって、 本発明のレセプ夕一タンパク質の機能不全に 関連する各種疾患の診断をすることができる。
例えば、 本発明の抗体を用いて本発明のレセプタータンパク質の濃度を定量す ることによって、 該レセプ夕ータンパク質の濃度の増加または減少が検出された 場合、 例えば、 該レセプタータンパク質の機能不全または過剰発現、 特に前立腺 癌、 およびその他の癌 （非小細胞癌、 卵巣癌、 胃癌、 膀胱癌、 乳癌、 子宮頸部癌 、 結腸癌、 直腸癌、 大腸癌等） 、 前立腺肥大症、 男性性腺機能障害、 不妊、 早産 、 子宮内膜症、 肝硬変、 肝炎、 肝不全、 結石に罹患している可能性が高い、 また は将来罹患する可能性が高いと診断することができる。
また、 本発明の抗体は、 体液や組織などの被検体中に存在する本発明のレセプ タータンパク質等を特異的に検出するために使用することができる。 また、 本発 明のレセプタータンパク質等を精製するために使用する抗体カラムの作製、 精製 時の各分画中の本発明のレセプタータンパク質等の検出、 被検細胞内における本 発明のレセプタータンパク質の挙動の分析などのために使用することができる。
( 9 ) 細胞膜における本発明のレセプ夕一タンパク質またはその部分べプチドの 量を変化させる化合物のスクリーニング方法
本発明の抗体は、 本発明のレセプタータンパク質もしくはその部分べプチドま たはその塩を特異的に認識することができるので、 細胞膜における本発明のレセ プタ一タンパク質またはその部分ペプチドの量を変化させる化合物のスクリー二 ングに用いることができる。
すなわち本発明は、 例えば、
( i ) 非ヒト哺乳動物の a ) 血液、 b ) 特定の臓器、 c ) 臓器から単離した組 織もしくは細胞等を破壊した後、 細胞膜画分を単離し、 細胞膜画分に含まれる本 発明のレセプタータンパク質またはその部分ペプチドを定量することによる、 細 胞膜における本発明のレセプタータンパ々質またはその部分ペプチドの量を変化 させる化合物のスクリーニング方法、
( i i ) 本発明のレセプタ一タンパク質もしくはその部分ペプチドを発現する 形質転換体等を破壊した後、 細胞膜画分を単離し、 細胞膜画分に含まれる本発明 のレセプタータンパク質またはその部分ペプチドを定量することによる、 細胞膜 における本発明のレセプ夕一タンパク質またはその部分ペプチドの量を変化させ る化合物のスクリーニング方法、
( i i i ) 非ヒト哺乳動物の a ) 血液、 b ) 特定の臓器、 c ) 臓器から単離し た組織もしくは細胞等を切片とした後、 免疫染色法を用いることにより、 細胞表 層での該レセプタータンパク質の染色度合いを定量化することにより、 細胞膜上 の該タンパク質を確認することによる、 細胞膜における本発明のレセプタータン パク質またはその部分ペプチドの量を変化させる化合物のスクリーニング方法を 提供する。
( i v ) 本発明のレセプタータンパク質もしくはその部分ペプチドを発現する 形質転換体等を切片とした後、 免疫染色法を用いることにより、 細胞表層での該 レセプタータンパク質の染色度合いを定量化することにより、 細胞膜上の該夕ン パク質を確認することによる、 細胞膜における本発明のレセプ夕一タンパク質ま たはその部分ペプチドの量を変化させる化合物のスクリーニング方法を提供する 細胞膜画分に含まれる本発明のレセプタータンパク質またはその部分ペプチド の定量は具体的には以下のようにして行なう。
( i ) 正常あるいは疾患モデル非ヒト哺乳動物 （例えば、 マウス、 ラット、 ゥ サギ、 ヒッジ、 ブ夕、 ゥシ、 ネコ、 ィヌ、 サルなど、 より具体的には担癌マウス など） に対して、 薬剤 （例えば、 抗癌剤など） あるいは物理的ストレス （例えば 、 浸水ストレス、 電気ショック、 明暗、 低温など） などを与え、 一定時間経過し た後に、 血液、 あるいは特定の臓器 （例えば、 脳、 肺、 大腸、 前立腺など） 、 ま たは臓器から単離した組織、 あるいは細胞を得る。 得られた臓器、 組織または細 胞等を、 例えば、 適当な緩衝液 （例えば、 トリス塩酸緩衝液、 リン酸緩衝液、 へ ぺス緩衝液など） 等に懸濁し、 臓器、 組織あるいは細胞を破壊し、 界面活性剤 （ 例えば、 トリトン X 1 0 0 TM、 ツイ一ン 2 0 TMなど） などを用い、 さらに遠心 分離や濾過、 カラム分画などの手法を用いて細胞膜画分を得る。
細胞膜画分としては、 細胞を破砕した後、 公知の方法で得られる細胞膜が多く 含まれる画分のことをいう。 細胞の破砕方法としては、 Potter— Elvehj em型ホモ ジナイザーで細胞を押し潰す方法、 ワーリンダブレンダーゃポリトロン （ Kinemat ica社製） のよる破砕、 超音波による破砕、 フレンチプレスなどで加圧し ながら細胞を細いノズルから噴出させることによる破砕などが挙げられる。 細胞 膜の分画には、 分画遠心分離法や密度勾配遠心分離法などの遠心力による分画法 が主として用いられる。 例えば、 細胞破砕液を低速 （5 0 0 r p m〜3 0 0 0 r p m) で短時間 （通常、 約 i分〜 1 0分） 遠心し、 上清をさらに高速 （1 5 0 0 0 1- p m〜3 0 0 0 0 r p m) で通常 3 0分〜 2時間遠心し、 得られる沈澱を膜 画分とする。 該膜画分中には、 発現したレセプタ一タンパク質等と細胞由来のリ ン脂質や膜タンパク質などの膜成分が多く含まれる。
細胞膜画分に含まれる本発明のレセプ夕一タンパク質またはその部分ペプチド は、 例えば、 本発明の抗体を用いたサンドイッチ免疫測定法、 ウェスタンブロッ ト解析などにより定量することができる。
かかるサンドィツチ免疫測定法は上記の方法と同様にして行なうことができ、 ウエスタンプロットは公知の手段により行なうことができる。
( i i ) 本発明のレセプ夕一タンパク質もしくはその部分ペプチドを発現する 形質転換体を上記の方法に従い作製し、 細胞膜画分に含まれる本発明のレセプタ 一タンパク質またはその部分べプチドを定量することができる。
細胞膜における本発明のレセプタータンパク質またはその部分ペプチドの量を 変化させる化合物のスクリーニングは、
( i ) 正常あるいは疾患モデル非ヒト哺乳動物に対して、 薬剤あるいは物理的 ストレスなどを与える一定時間前 （3 0分前〜 2 4時間前、 好ましくは 3 0分前 〜 1 2時間前、 より好ましくは 1時間前〜 6時間前） もしくは一定時間後 （3 0 分後〜 3日後、 好ましくは 1時間後〜 2日後、 より好ましくは 1時間後〜 2 4時 間後） 、 または薬剤あるいは物理的ストレスと同時に被検化合物を投与し、 投与 後一定時間経過後 （ 3 0分後〜 3日後、 好ましくは 1時間後〜 2日後、 より好ま しくは 1時間後〜 2 4時間後） 、 細胞膜における本発明のレセプタータンパク質 またはその部分ペプチドの量を定量することにより行なうことができ、
( i i ) 形質転換体を常法に従い培養する際に被検化合物を培地中に混合させ 、 一定時間培養後 （1日後〜 7日後、 好ましくは 1日後〜 3日後、 より好ましく は 2日後〜 3日後） 、 細胞膜における本発明のレセプタ一タンパク質またはその 部分べプチドの量を定量することにより行なうことができる。
細胞膜画分に含まれる本発明のレセプタ一タンパク質またはその部分ペプチド の確認は具体的には以下のようにして行なう。
( i i i ) 正常あるいは疾患モデル非ヒト哺乳動物 （例えば、 マウス、 ラット 、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブタ、 ゥシ、 ネコ、 ィヌ、 サルなど、 より具体的には痴呆ラ ット、 肥満マウス、 動脈硬化ゥサギ、 担癌マウスなど） に対して、 薬剤 （例えば 、 抗痴呆薬、 血圧低下薬、 抗癌剤、 抗肥満薬など） あるいは物理的ストレス （例 えば、 浸水ストレス、 電気ショック、 明暗、 低温など） などを与え、 一定時間経 過した後に、 血液、 あるいは特定の臓器 （例えば、 脳、 肺、 大腸など） 、 または 臓器から単離した組織、 あるいは細胞を得る。 得られた臓器、 組織または細胞等 を、 常法に従い組織切片とし、 本発明の抗体を用いて免疫染色を行う。 細胞表層 での該レセプタ一夕ンパク質の染色度合いを定量化することにより、 細胞膜上の 該タンパク質を確認することにより、 定量的または定性的に、 細胞膜における本 発明のレセプタータンパク質またはその部分ペプチドの量を確認することができ る。
( i v) 本発明のレセプ夕一タンパク質もしくはその部分ペプチドを発現する 形質転換体等を用いて同様の手段をとることにより確認することもできる。 本発明のスクリーニング方法を用いて得られる化合物またはその塩は、 細胞膜 における本発明のレセプタータンパク質またはその部分ペプチドの量を変化させ る作用を有する化合物であり、 具体的には、 （ィ） 細胞膜における本発明のレセ プ夕一タンパク質またはその部分ペプチドの量を増加させることにより、 レセプ ターを介する細胞刺激活性を増強させる化合物、 （口） 細胞膜における本発明の レセプター夕ンパク質またはその部分べプチドの量を減少させることにより、 該 細胞刺激活性を減弱させる化合物である。
該化合物としては、 ペプチド、 タンパク質、 非ペプチド性化合物、 合成化合物 、 発酵生産物などが挙げられ、 これら化合物は新規な化合物であってもよいし、 公知の化合物であってもよい。
該細胞刺激活性を増強させる化合物は、 本発明のレセプタータンパク質等の生 理活性を増強するための安全で低毒性な医薬として有用である。
該細胞刺激活性を減弱させる化合物は、 本発明のレセプ夕一タンパク質等の生 理活性を減少させるための安全で低毒性な医薬として有用である。
( 1 0 ) 細胞膜における本発明のレセプタ一タンパク質またはその部分ペプチド の量を変化させる化合物、 及びその化合物を含有する各種疾病の予防および/ま たは治療剤
本発明のレセプタータンパク質は上記のとおり、 例えば、 生体内で重要な役割 を果たしていると考えられる。 したがって、 細胞膜における本発明のレセプ夕一 タンパク質またはその部分ペプチドの量を変化させる化合物は、 本発明のレセプ 夕一タンパク質の機能不全に関連する疾患の予防および zまたは治療剤として用 いることができる。 例えば、 このような化合物は、 該レセプタ一タンパク質の過 剰発現などに起因する疾患 （例えば、 前立腺癌、 およびその他の癌 （非小細胞癌 、 卵巣癌、 胃癌、 膀胱癌、 乳癌、 子宮頸部癌、 結腸癌、 直腸癌、 大腸癌等） 、 前 立腺肥大症、 男性性腺機能障害、 不妊、 早産、 子宮内膜症、 肝硬変、 肝炎、 肝不 全、 結石などの疾患） の予防及び 又は治療薬、 または分娩誘発薬として用いる ことができる。
該化合物を本発明のレセプ夕一タンパク質の機能不全に関連する疾患の予防お よび Zまたは治療剤として使用する場合は、 上述した常套手段に従って製剤化す ることができる。
( 1 1 ) 本発明のレセプ夕一タンパク質、 その部分ペプチドまたはそれらの塩に 対する抗体を含有する医薬
本発明のレセプタータンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩に対す る抗体の、 それらレセプタ一タンパク質などに対する中和活性とは、 該レセプタ 一タンパク質の関与する活性、 例えばシグナル伝達機能を不活性化する活性を意 味する。 従って、 該抗体が中和活性を有する場合は、 該レセプ夕ータンパク質の 関与するシグナル伝達、 例えば、 該レセプタータンパク質を介する細胞刺激活性 (例えば、 ァラキドン酸遊離、 アセチルコリン遊離、 細胞内 Ca2+遊離、 細胞 内 c AMP生成、 細胞内 c AMP抑制、 細胞内 cGMP生成、 イノシトールリン 酸産生、 細胞膜電位変動、 細胞内タンパク質のリン酸化、 c一 f o sの活性化、 pHの低下などを促進する活性または抑制する活性など、 特に細胞内 c AMP生 成の促進活性） を不活性化することができる。 したがって、 このような抗体は、 該レセプ夕一タンパク質の過剰発現などに起因する疾患の予防および/または治 療に用いることができる。 例えば、 本発明のレセプタータンパク質に対する中和 抗体は、 該レセプ夕ータンパク質の過剰発現などに起因する疾患 （例えば、 前立 腺癌、 およびその他の癌 （非小細胞癌、 卵巣癌、 胃癌、 膀胱癌、 乳癌、 子宮頸部 癌、 結腸癌、 直腸癌、 大腸癌等） 、 前立腺肥大症、 男性性腺機能障害、 不妊、 早 産、 子宮内膜症、 肝硬変、 肝炎、 肝不全、 結石などの疾患） の予防及び/又は治 療薬、 または分娩誘発薬として用いることができる。
本発明の医薬の製剤化、 投与量、 投与方法等は前述のものが採用できる （ 「疾 患の診断方法およびその疾患を治療する医薬」 の項参照） 。
(12) 本発明の DN A導入動物の作製
本発明は、 外来性の本発明の DN A (以下、 本発明の外来性 DN Aと略記する ) またはその変異 DN A (本発明の外来性変異 DN Aと略記する場合がある） を 有する非ヒト哺乳動物を提供する。
すなわち、 本発明は、
〔1〕 本発明の外来性 DNAまたはその変異 DNAを有する非ヒト哺乳動物、 〔2〕 非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である第 〔1〕 記載の動物、
〔3〕 ゲッ歯動物がマウスまたはラットである第 〔2〕 記載の動物、 および 〔4〕 本発明の外来性 DNAまたはその変異 DNAを含有し、 哺乳動物において 発現しうる組換えベクターを提供するものである。
本発明の外来性 DNAまたはその変異 DNAを有する非ヒト哺乳動物 （以下、 本発明の DNA転移動物と略記する） は、 未受精卵、 受精卵、 精子およびその始 原細胞を含む胚芽細胞などに対して、 好ましくは、 非ヒト哺乳動物の発生におけ る胚発生の段階 （さらに好ましくは、 単細胞または受精卵細胞の段階でかつ一般 に 8細胞期以前） に、 リン酸カルシウム法、 電気パルス法、 リポフエクシヨン法 、 凝集法、 マイクロインジェクション法、 パーティクルガン法、 DEAE—デキ ストラン法などにより目的とする DNAを転移することによって作出することが できる。 また、 該 DNA転移方法により、 体細胞、 生体の臓器、 組織細胞などに 目的とする本発明の外来性 DN Aを転移し、 細胞培養、 組織培養などに利用する こともでき、 さらに、 これら細胞を上述の胚芽細胞と公知の細胞融合法により融 合させることにより本発明の DN A導入動物を作出することもできる。
非ヒト哺乳動物としては、 例えば、 ゥシ、 ブタ、 ヒッジ、 ャギ、 ゥサギ、 ィヌ 、 ネコ、 モルモット、 八ムスター、 マウス、 ラットなどが用いられる。 なかでも 、 病体動物モデル系の作成の面から個体発生および生物サイクルが比較的短く、 また、 繁殖が容易なゲッ歯動物、 とりわけマウス （例えば、 純系として、 C57 BLZ6系統， DBA2系統など、 交雑系として、 B 6 C 3 系統， BDF,系 統， B6D2F,系統， BALBZc系統， I CR系統など) またはラット （例 えば、 Wi s t a r, SDなど） などが好ましい。
哺乳動物において発現しうる組換えベクターにおける 「哺乳動物」 としては、 上記の非ヒト哺乳動物の他にヒトなどがあげられる。
本発明の外来性 DN Aとは、 非ヒ卜哺乳動物が本来有している本発明の DN A ではなく、 いったん哺乳動物から単離 ·抽出された本発明の DNAをいう。
本発明の変異 DNAとしては、 元の本発明の DNAの塩基配列に変異 （例えば 、 突然変異など） が生じたもの、 具体的には、 塩基の付加、 欠損、 他の塩基への 置換などが生じた DNAなどが用いられ、 また、 異常 DNAも含まれる。
該異常 D N Aとしては、 異常な本発明のレセプタータンパク質を発現させる D N Aを意味し、 例えば、 正常な本発明のレセプ夕一タンパク質の機能を抑制する レセプタータンパク質を発現させる D N Aなどが用いられる。
本発明の外来性 DNAは、 対象とする動物と同種あるいは異種のどちらの哺乳 動物由来のものであってもよい。 本発明の DNAを対象動物に導入するにあたつ ては、 該 D N Aを動物細胞で発現させうるプロモーターの下流に結合した D N A コンストラクトとして用いるのが一般に有利である。 例えば、 本発明のヒト DN Aを導入する場合、 これと相同性が高い本発明の DN Aを有する各種哺乳動物 （ 例えば、 ゥサギ、 ィヌ、 ネコ、 モルモット、 ハムス夕一、 ラット、 マウスなど） 由来の DNAを発現させうる各種プロモーターの下流に、 本発明のヒト DNAを 結合した DNAコンストラクト （例、 ベクターなど） を対象哺乳動物の受精卵、 例えば、 マウス受精卵へマイクロインジェクションすることによって本発明の D N Aを高発現する D N A導入哺乳動物を作出することができる。
本発明のレセプ夕一タンパク質の発現べクタ一としては、 大腸菌由来のプラス ミド、 枯草菌由来のプラスミド、 酵母由来のプラスミド、 λファージなどのバク テリオファージ、 モロニ一白血病ウィルスなどのレトロウイルス、 ワクシニアゥ ィルスまたはバキュロウィルスなどの動物ウィルスなどが用いられる。 なかでも 、 大腸菌由来のプラスミド、 枯草菌由来のプラスミドまたは酵母由来のプラスミ ドなどが好ましく用いられる。
上記の DN Α発現調節を行なうプロモーターとしては、 例えば、 ①ウィルス （ 例、 シミアンウィルス、 サイトメガロウィルス、 モロニ一白血病ウィルス、 J C ウィルス、 '乳癌ウィルス、 ポリオウイルスなど) に由来する DN Aのプロモータ 一、 ②各種哺乳動物 （ヒト、 ゥサギ、 ィヌ、 ネコ、 モルモット、 ハムスター、 ラ ット、 マウスなど） 由来のプロモ一夕一、 例えば、 アルブミン、 インスリン I I 、 ゥロプラキン I I、 エラス夕一ゼ、 エリスロポエチン、 エンドセリン、 筋クレ ァチンキナーゼ、 グリア線維性酸性タンパク質、 ダル夕チオン S—トランスフエ ラーゼ、 血小板由来成長因子 ]3、 ケラチン K 1 , 1：1 0ぉょび1^ 1 4、 コラーゲ ン I型および I I型、 サイクリック AMP依存タンパク質キナーゼ j3 Iサブュニ ット、 ジストロフィン、 酒石酸抵抗性アルカリフォスファタ一ゼ、 心房ナトリウ ム利尿性因子、 内皮レセプターチ口シンキナーゼ （一般に T i e 2と略される） 、 ナトリウムカリウムアデノシン 3リン酸化酵素 （Na, K-ATP a s e) 、 ニューロフィラメント軽鎖、 メタ口チォネイン Iおよび I I A、 メタ口プロティ ナーゼ 1組織インヒビ夕一、 MHCクラス I抗原 (H- 2 L) 、 H_ r a s、 レ ニン、 ドーパミン] 3—水酸化酵素、 甲状腺ペルォキシダ一ゼ （TPO) 、 ぺプチ ド鎖延長因子 1ひ (EF- 1 ) 、 /3ァクチン、 aおよび jSミオシン重鎖、 ミオ シン軽鎖 1および 2、 ミエリン基礎タンパク質、 チログロブリン、 Thy_ l、 免疫グロブリン、 H鎖可変部 （VNP) 、 血清アミロイド Pコンポーネント、 ミ オダロビン、 トロポニン（：、 平滑筋 aァクチン、 プレブ口エンケフアリン A、 ) ソプレシンなどのプロモータ一などが用いられる。 なかでも、 全身で高発現する ことが可能なサイトメガロウィルスプロモーター、 ヒトペプチド鎖延長因子 1ひ (EF- 1 ) のプロモーター、 ヒトおよびニヮトリ i3ァクチンプロモーターな どが好適である。
上記べクタ一は、 DNA導入哺乳動物において目的とする mRNAの転写を終 結する配列 （一般にターミネタ一と呼ばれる） を有していることが好ましく、 例 えば、 ウィルス由来および各種哺乳動物由来の各 DN Aの配列を用いることがで き、 好ましくは、 シミアンウィルスの SV40夕一ミネタ一などが用いられる。 その他、 目的とする外来性 DNAをさらに高発現させる目的で各 DNAのスプ ライシングシグナル、 ェンハンサー領域、 真核 DNAのイントロンの一部などを プロモーター領域の 5 ' 上流、 プロモーター領域と翻訳領域間あるいは翻訳領域 の 3 ' 下流に連結することも目的により可能である。
正常な本発明のレセプタータンパク質の翻訳領域は、 ヒトまたは各種哺乳動物 (例えば、 ゥサギ、 ィヌ、 ネコ、 モルモット、 八ムスター、 ラット、 マウスなど ) 由来の肝臓、 腎臓、 甲状腺細胞、 線維芽細胞由来 DN Aおよび市販の各種ゲノ ム DN Aライブラリーよりゲノム DNAの全てあるいは一部として、 または肝臓 、 腎臓、 甲状腺細胞、 線維芽細胞由来 RNAより公知の方法により調製された相 補 DN Aを原料として取得することが出来る。 また、 外来性の異常 DN Aは、 上 記の細胞または組織より得られた正常な本発明のレセプ夕一タンパク質の翻訳領 域を点突然変異誘発法により変異した翻訳領域を作製することができる。
該翻訳領域は転移動物において発現しうる DNAコンストラクトとして、 前記 のプロモーターの下流および所望により転写終結部位の上流に連結させる通常の DN A工学的手法により作製することができる。
受精卵細胞段階における本発明の外来性 DN Aの導入は、 対象哺乳動物の胚芽 細胞および体細胞のすべてに存在するように確保される。 DNA導入後の作出動 物の胚芽細胞において、 本発明の外来性 DN Aが存在することは、 作出動物の後 代がすべて、 その胚芽細胞および体細胞のすべてに本発明の外来性 DN Aを保持 することを意味する。 本発明の外来性 DNAを受け継いだこの種の動物の子孫は その胚芽細胞および体細胞のすべてに本発明の外来性 DN Aを有する。 本発明の外来性正常 D NAを導入した非ヒト哺乳動物は、 交配により外来性 D NAを安定に保持することを確認して、 該 D N A保有動物として通常の飼育環境 で継代飼育することが出来る。
受精卵細胞段階における本発明の外来性 D NAの導入は、 対象哺乳動物の胚芽 細胞および体細胞の全てに過剰に存在するように確保される。 D NA導入後の作 出動物の胚芽細胞において本発明の外来性 D NAが過剰に存在することは、 作出 動物の子孫が全てその胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の外来性 D N Aを過 剰に有することを意味する。 本発明の外来性 D NAを受け継いだこの種の動物の 子孫はその胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の外来性 D N Aを過剰に有する 導入 D N Aを相同染色体の両方に持つホモザィゴート動物を取得し、 この雌雄 の動物を交配することによりすべての子孫が該 D N Aを過剰に有するように繁殖 継代することができる。
本発明の正常 D NAを有する非ヒト哺乳動物は、 本発明の正常 D NAが高発現 させられており、 内在性の正常 D N Aの機能を促進することにより最終的に本発 明のレセプター夕ンパク質の機能亢進症を発症することがあり、 その病態モデル 動物として利用することができる。 例えば、 本発明の正常 D NA導入動物を用い て、 本発明のレセプ夕一タンパク質の機能亢進症や、 本発明のレセプタ一タンパ ク質が関連する疾患の病態機序の解明およびこれらの疾患の治療方法の検討を行 なうことが可能である。
また、 本発明の外来性正常 D NAを導入した哺乳動物は、 遊離した本発明のレ セプ夕一夕ンパク質の増加症状を有することから、 本発明のレセプタータンパク 質に関連する疾患に対する治療薬のスクリーニング試験にも利用可能である。 一方、 本発明の外来性異常 D NAを有する非ヒト哺乳動物は、 交配により外来 性 D N Aを安定に保持することを確認して該 D NA保有動物として通常の飼育環 境で継代飼育することが出来る。 さらに、 目的とする外来 D NAを前述のプラス ミドに組み込んで原科として用いることができる。 プロモーターとの D NAコン ストラク卜は、 通常の D NA工学的手法によって作製することができる。 受精卵 細胞段階における本発明の異常 D N Aの導入は、 対象哺乳動物の胚芽細胞および 体細胞の全てに存在するように確保される。 D N A転移後の作出動物の胚芽細胞 において本発明の異常 D NAが存在することは、 作出動物の子孫が全てその胚芽 細胞および体細胞の全てに本発明の異常 D N Aを有することを意味する。 本発明 の外来性 D N Aを受け継いだこの種の動物の子孫は、 その胚芽細胞および体細胞 の全てに本発明の異常 D NAを有する。 導入 D NAを相同染色体の両方に持つホ モザィゴ一ト動物を取得し、 この雌雄の動物を交配することによりすべての子孫 が該 D N Aを有するように繁殖継代することができる。
本発明の異常 D NAを有する非ヒト哺乳動物は、 本発明の異常 D NAが高発現 させられており、 内在性の正常 D N Aの機能を阻害することにより最終的に本発 明のレセプ夕一夕ンパク質の機能不活性型不応症となることがあり、 その病態モ デル動物として利用することができる。 例えば、 本発明の異常 D N A導入動物を 用いて、 本発明のレセプタータンパク質の機能不活性型不応症の病態機序の解明 およびこの疾患を治療方法の検討を行なうことが可能である。
また、 具体的な利用可能性としては、 本発明の異常 D N A高発現動物は、 本発 明のレセプタータンパク質の機能不活性型不応症における本発明の異常レセプ夕 —タンパク質による正常レセプタータンパク質の機能阻害 （dominant negat ive 作用） を解明するモデルとなる。
また、 本発明の外来異常 D N Aを導入した哺乳動物は、 遊離した本発明のレセ プタ一タンパク質の増加症状を有することから、 本発明のレセプタータンパク質 の機能不活性型不応症に対する治療薬スクリーニング試験にも利用可能である。 また、 上記 2種類の本発明の D N A導入動物のその他の利用可能性として、 例 えば、
①組織培養のための細胞源としての使用、
②本発明の D N A転移動物の組織中の D N Aもしくは R N Aを直接分析するか、 または D N Aにより発現された本発明のレセプタータンパク質を分析することに よる、 本発明のレセプタータンパク質により特異的に発現あるいは活性化する本 発明のレセプタータンパク質との関連性についての解析、
③ D N Aを有する組織の細胞を標準組織培養技術により培養し、 これらを使用し て、 一般に培養困難な組織からの細胞の機能の研究、 ④上記③記載の細胞を用いることによる細胞の機能を高めるような薬剤のスクリ 一二ング、 および
⑤本発明の変異レセプタータンパク質を単離精製およびその抗体作製などが考え られる。
さらに、 本発明の D N A導入動物を用いて、 本発明のレセプ夕一タンパク質の 機能不活性型不応症などを含む、 本発明のレセプ夕一タンパク質に関連する疾患 の臨床症状を調べることができ、 また、 本発明のレセプタ一タンパク質に関連す る疾患モデルの各臓器におけるより詳細な病理学的所見が得られ、 新しい治療方 法の開発、 さらには、 該疾患による二次的疾患の研究および治療に貢献すること ができる。
また、 本発明の D NA導入動物から各臓器を取り出し、 細切後、 トリプシンな どのタンパク質分解酵素により、 遊離した D NA導入細胞の取得、 その培養また はその培養細胞の系統化を行なうことが可能である。 さらに、 本発明のレセプ夕 一タンパク質産生細胞の特定化、 アポトーシス、 分化あるいは増殖との関連性、 またはそれらにおけるシグナル伝達機構を調べ、 それらの異常を調べることなど ができ、 本発明のレセプター夕ンパク質およびその作用解明のための有効な研究 材料となる。
さらに、 本発明の D N A導入動物を用いて、 本発明のレセプタータンパク質の 機能不活性型不応症を含む、 本発明のレセプタータンパク質に関連する疾患の治 療薬の開発を行なうために、 上述の検査法および定量法などを用いて、 有効で迅 速な該疾患治療薬のスクリーニング法を提供することが可能となる。 また、 本発 明の D N A導入動物または本発明の外来性 D N A発現ベクターを用いて、 本発明 のレセプ夕一夕ンパク質が関連する疾患の D N A治療法を検討、 開発することが 可能である。
( 1 3 ) ノックァゥト動物
本発明は、 本発明の D NAが不活性化された非ヒ卜哺乳動物胚幹細胞および本 発明の D NA発現不全非ヒト哺乳動物を提供する。
すなわち、 本発明は、
〔1〕 本発明の D NAが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞、 〔2〕 該 D NAがレポ一夕一遺伝子 （例、 大腸菌由来の ;8 —ガラクトシダーゼ遺 伝子） を導入することにより不活性化された第 〔1〕 項記載の胚幹細胞、 〔3〕 ネオマイシン耐性である第 〔1〕 項記載の胚幹細胞、
〔4〕 非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である第 〔1〕 項記載の胚幹細胞、 〔5〕 ゲッ歯動物がマウスである第 〔4〕 項記載の胚幹細胞、
〔6〕 本発明の D N Aが不活性化された該 D N A発現不全非ヒ卜哺乳動物、 〔7〕 該 D NAがレポーター遺伝子 （例、 大腸菌由来の /3—ガラクトシダ一ゼ遺 伝子） を導入することにより不活性化され、 該レポ一ター遺伝子が本発明の D N Aに対するプロモーターの制御下で発現しうる第 〔6〕 項記載の非ヒト哺乳動物
〔8〕 非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である第 〔6〕 項記載の非ヒト哺乳動物、 〔9〕 ゲッ歯動物がマウスである第 〔8〕 項記載の非ヒト哺乳動物、 および 〔1 0〕 第 〔7〕 項記載の動物に、 試験化合物を投与し、 レポーター遺伝子の発 現を検出することを特徴とする本発明の D N Aに対するプロモータ一活性を促進 または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。
本発明の D NAが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞とは、 該非ヒ卜哺乳 動物が有する本発明の D NAに人為的に変異を加えることにより、 D NAの発現 能を抑制するか、 もしくは該 D NAがコードしている本発明のレセプタ一タンパ ク質の活性を実質的に喪失させることにより、 D N Aが実質的に本発明のレセプ タ一タンパク質の発現能を有さない （以下、 本発明のノックアウト D NAと称す ることがある) 非ヒト哺乳動物の胚幹細胞 （以下、 E S細胞と略記する） をいう 非ヒト哺乳動物としては、 前記と同様のものが用いられる。
本発明の D NAに人為的に変異を加える方法としては、 例えば、 遺伝子工学的 手法により該 D NA配列の一部又は全部の削除、 他 D NAを挿入または置換させ ることによって行なうことができる。 これらの変異により、 例えば、 コドンの読 み取り枠をずらしたり、 プロモータ一あるいはェクソンの機能を破壊することに より本発明のノックアウト D NAを作製すればよい。
本発明の D N Aが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞 （以下、 本発明の D NA不活性化 E S細胞または本発明のノックアウト E S細胞と略記する） の具体 例としては、 例えば、 目的とする非ヒト哺乳動物が有する本発明の DNAを単離 し、 そのェクソン部分にネオマイシン耐性遺伝子、 ハイグロマイシン耐性遺伝子 を代表とする薬剤耐性遺伝子、 あるいは l a c Z (i3—ガラクトシダーゼ遺伝子 ) , c a t (クロラムフエニコ一ルァセチルトランスフェラーゼ遺伝子） を代表 とするレポ一夕一遺伝子等を挿入することによりェクソンの機能を破壊するか、 あるいはェクソン間のイントロン部分に遺伝子の転写を終結させる DNA配列 （ 例えば、 polyA付加シグナルなど） を挿入し、 完全な mRNAを合成できなくす ることによって、 結果的に遺伝子を破壊するように構築した DN A配列を有する DNA鎖 （以下、 ターゲッティングベクターと略記する） を、 例えば相同組換え 法により該動物の染色体に導入し、 得られた ES細胞について本発明の DNA上 あるいはその近傍の D N A配列をプローブとしたサザンハイブリダイゼ一シヨン 解析あるいは夕ーゲッティングベクター上の DNA配列と夕ーゲッティングべク 夕一作製に使用した本発明の DN A以外の近傍領域の DN A配列をプライマーと した PCR法により解析し、 本発明のノックアウト ES細胞を選別することによ り得ることができる。
また、 相同組換え法等により本発明の DNAを不活化させる元の ES細胞とし ては、 例えば、 前述のような既に樹立されたものを用いてもよく、 また公知の Evansと Kaufmanの方法に準じて新しく樹立したものでもよい。 例えば、 マウスの ES細胞の場合、 現在、 一般的には 129系の ES細胞が使用されているが、 免 疫学的背景がはっきりしていないので、 これに代わる純系で免疫学的に遺伝的背 景が明らかな ES細胞を取得するなどの目的で例えば、 C 57 BLZ6マウスや C 57 BLZ6の採卵数の少なさを DBAZ2との交雑により改善した BD マウス （C 57 BL/6と DBAZ2との F を用いて樹立したものなども良 好に用いうる。 BDF,マウスは、 採卵数が多く、 かつ、 卵が丈夫であるという 利点に加えて、 C 57 BLZ6マウスを背景に持つので、 これを用いて得られた ES細胞は病態モデルマウスを作出したとき、 C 57 BLZ6マウスとバックク ロスすることでその遺伝的背景を C 57 BL/ 6マウスに代えることが可能であ る点で有利に用い得る。 また、 ES細胞を樹立する場合、 一般には受精後 3. 5日目の胚盤胞を使用す るが、 これ以外に 8細胞期胚を採卵し胚盤胞まで培養して用いることにより効率 よく多数の初期胚を取得することができる。
また、 雌雄いずれの ES細胞を用いてもよいが、 通常雄の ES細胞の方が生殖 系列キメラを作出するのに都合が良い。 また、 煩雑な培養の手間を削減するため にもできるだけ早く雌雄の判別を行なうことが望ましい。
ES細胞の雌雄の判定方法としては、 例えば、 PCR法により Y染色体上の性 決定領域の遺伝子を増幅、 検出する方法が、 その 1例としてあげることができる 。 この方法を使用すれば、 従来、 核型分析をするのに約 106個の細胞数を要し ていたのに対して、 1コロニー程度の E S細胞数 （約 50個） で済むので、 培養 初期における E S細胞の第一次セレクションを雌雄の判別で行なうことが可能で あり、 早期に雄細胞の選定を可能にしたことにより培養初期の手間は大幅に削減 できる。
また、 第二次セレクションとしては、 例えば、 G—バンディング法による染色 体数の確認等により行うことができる。 得られる ES細胞の染色体数は正常数の 100%が望ましいが、 樹立の際の物理的操作等の関係上困難な場合は、 ES細 胞の遺伝子をノックアウトした後、 正常細胞 （例えば、 マウスでは染色体数が 2 n = 40である細胞） に再びクローニングすることが望ましい。
このようにして得られた胚幹細胞株は、 通常その増殖性は大変良いが、 個体発 生できる能力を失いやすいので、 注意深く継代培養することが必要である。 例え ば、 S TO繊維芽細胞のような適当なフィーダ一細胞上で L I F (1- 1000 OU/ml) 存在下に炭酸ガス培養器内 （好ましくは、 5%炭酸ガス、 95%空 気または 5%酸素、 5%炭酸ガス、 90%空気） で約 37 °Cで培養するなどの方 法で培養し、 継代時には、 例えば、 トリプシン/ EDTA溶液 （通常 0. 001 一 0. 5 %トリプシン Z 0. 1— 5 mM EDTA, 好ましくは約 0. 1 %トリプシ ン ZlmM' EDTA) 処理により単細胞化し、 新たに用意したフィーダ一細胞 上に播種する方法などがとられる。 このような継代は、 通常 1一 3日毎に行なう が、 この際に細胞の観察を行い、 形態的に異常な細胞が見受けられた場合はその 培養細胞は放棄することが望まれる。 E S細胞は、 適当な条件により、 高密度に至るまで単層培養するか、 または細 胞集塊を形成するまで浮遊培養することにより、 頭頂筋、 内臓筋、 心筋などの種 々のタイプの細胞に分化させることが可能であり 〔M. J. Evans及び M. H.
Kaufman, ネイチヤー （Nature) 第 292巻、 154頁、 1981年； G. R. Mart in プロ シーディングス ·オフ、、 ·ナショナル ·アカデミー ·ォブ ·サイエンス ·ユーエス エー （Pro Nat l. Acad. Sci. U. S. A. ) 第 78巻、 7634頁、 1981年； T. C.
Doetschman ら、 ジャーナル ·ォブ ·ェンブリオロジ一 ·アンド ·ェクスぺリメ ンタル ·モルフォロジ一、 第 87巻、 27頁、 1985年〕 、 本発明の E S細胞を分化さ せて得られる本発明の D NA発現不全細胞は、 インビト口における本発明のレセ プ夕一タンパク質または本発明のレセプタータンパク質の細胞生物学的検討にお いて有用である。
本発明の D N A発現不全非ヒト哺乳動物は、 該動物の mR N A量を公知方法を 用いて測定して間接的にその発現量を比較することにより、 正常動物と区別する ことが可能である。
該非ヒト哺乳動物としては、 前記と同様のものが用いられる。
本発明の D NA発現不全非ヒト哺乳動物は、 例えば、 前述のようにして作製し たターゲッティングベクターをマウス胚幹細胞またはマウス卵細胞に導入し、 導 入によりターゲッティングベクターの本発明の D N Aが不活性化された D N A配 列が遺伝子相同組換えにより、 マウス胚幹細胞またはマウス卵細胞の染色体上の 本発明の D NAと入れ換わる相同組換えをさせることにより、 本発明の D NAを ノックアウトさせることができる。
本発明の D NAがノックアウトされた細胞は、 本発明の D NA上またはその近 傍の D N A配列をプローブとしたサザンハイブリダイゼーション解析またはター ゲッティングベクター上の D NA配列と、 ターゲッティングベクターに使用した マウス由来の本発明の D N A以外の近傍領域の D NA配列とをプライマーとした P C R法による解析で判定することができる。 非ヒト哺乳動物胚幹細胞を用いた 場合は、 遺伝子相同組換えにより、 本発明の D NAが不活性化された細胞株をク ローニングし、 その細胞を適当な時期、 例えば、 8細胞期の非ヒト哺乳動物胚ま たは胚盤胞に注入し、 作製したキメラ胚を偽妊娠させた該非ヒト哺乳動物の子宮 に移植する。 作出された動物は正常な本発明の D NA座をもつ細胞と人為的に変 異した本発明の D N A座をもつ細胞との両者から構成されるキメラ動物である。 該キメラ動物の生殖細胞の一部が変異した本発明の D N A座をもつ場合、 この ようなキメラ個体と正常個体を交配することにより得られた個体群より、 全ての 組織が人為的に変異を加えた本発明の D N A座をもつ細胞で構成された個体を、 例えば、 コートカラーの判定等により選別することにより得られる。 このように して得られた個体は、 通常、 本発明のレセプタータンパク質のヘテロ発現不全個 体であり、 本発明のレセプ夕一タンパク質のヘテロ発現不全個体同志を交配し、 それらの産仔から本発明のレセプ夕一夕ンパク質のホモ発現不全個体を得ること ができる。
卵細胞を使用する場合は、 例えば、 卵細胞核内にマイクロインジェクション法 で D N A溶液を注入することにより夕ーゲッティングベクターを染色体内に導入 したトランスジエニック非ヒト哺乳動物を得ることができ、 これらのトランスジ エニック非ヒト哺乳動物に比べて、 遺伝子相同組換えにより本発明の D NA座に 変異のあるものを選択することにより得られる。
このようにして本発明の D N Aがノックアウトされている個体は、 交配により 得られた動物個体も該 D NAがノックアウトされていることを確認して通常の飼 育環境で飼育継代を行なうことができる。
さらに、 生殖系列の取得および保持についても常法に従えばよい。 すなわち、 該不活化 D N Aの保有する雌雄の動物を交配することにより、 該不活化 D N Aを 相同染色体の両方に持つホモザィゴート動物を取得しうる。 得られたホモザィゴ ート動物は、 母親動物に対して、 正常個体 1， ホモザィゴート複数になるような 状態で飼育することにより効率的に得ることができる。 ヘテロザィゴート動物の 雌雄を交配することにより、 該不活化 D N Aを有するホモザィゴートおよびへテ ロザィゴート動物を繁殖継代する。 .
本発明の D N Aが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞は、 本発明の D NA 発現不全非ヒト哺乳動物を作出する上で、 非常に有用である。
また、 本発明の D NA発現不全非ヒト哺乳動物は、 本発明のレセプ夕一タンパ ク質により誘導され得る種々の生物活性を欠失するため、 本発明のレセプター夕 ンパク質の生物活性の不活性化を原因とする疾病のモデルとなり得るので、 これ らの疾病の原因究明及び治療法の検討に有用である。
( 1 4 a ) 本発明の D NAの欠損や損傷などに起因する疾病に対して治療 ·予防 効果を有する化合物のスクリ一二ング方法
本発明の D NA発現不全非ヒト哺乳動物は、 本発明の D NAの欠損や損傷など に起因する疾病に対して治療 ·予防効果を有する化合物のスクリーニングに用い ることができる。
すなわち、 本発明は、 本発明の D NA発現不全非ヒト哺乳動物に試験化合物を 投与し、 該動物の変化を観察 ·測定することを特徴とする、 本発明の D NAの欠 損や損傷などに起因する疾病に対して治療 ·予防効果を有する化合物またはその 塩のスクリーニング方法を提供する。
該スクリーニング方法において用いられる本発明の D NA発現'不全非ヒト哺乳 動物としては、 前記と同様のものがあげられる。
試験化合物としては、 例えば、 ペプチド、 タンパク、 非ペプチド性化合物、 合 成化合物、 発酵生産物、 細胞抽出液、 植物抽出液、 動物組織抽出液、 血漿などが あげられ、 これら化合物は新規な化合物であってもよいし、 公知の化合物であつ てもよい。
具体的には、 本発明の D NA発現不全非ヒ卜哺乳動物を、 試験化合物で処理し 、 無処理の対照動物と比較し、 該動物の各器官、 組織、 疾病の症状などの変化を 指標として試験化合物の治療 ·予防効果を試験することができる。
試験動物を試験化合物で処理する方法としては、 例えば、 経口投与、 静脈注射 などが用いられ、 試験動物の症状、 試験化合物の性質などにあわせて適宜選択す ることができる。 また、 試験化合物の投与量は、 投与方法、 試験化合物の性質な どにあわせて適宜選択することができる。
該スクリーニング方法において、 試験動物に試験化合物を投与した場合、 該試 験動物の血糖値が約 1 0 %以上、 好ましくは約 3 0 %以上、 より好ましくは約 5 0 %以上低下した場合、 該試験化合物を上記の疾患に対して治療 ·予防効果を有 する化合物として選択することができる。
該スクリ一二ング方法を用いて得られる化合物は、 上記した試験化合物から選 ばれた化合物であり、 本発明のレセプタータンパク質の欠損や損傷などによって 引き起こされる疾患 （例えば、 前立腺癌、 およびその他の癌 （非小細胞癌、 卵巣 癌、 胃癌、 膀胱癌、 乳癌、 子宮頸部癌、 結腸癌、 直腸癌、 大腸癌等） 、 前立腺肥 大症、 男性性腺機能障害、 不妊、 早産、 子宮内膜症、 肝硬変、 肝炎、 肝不全、 結 石などの疾患に対する予防及び Z又は治療薬、 または分娩誘発薬など） に対する 安全で低毒性な治療 ·予防剤などの医薬として使用することができる。 さらに、 上記スクリ一ニングで得られた化合物から誘導される化合物も同様に用いること ができる。
該スクリーニング方法で得られた化合物は塩を形成していてもよく、 該化合物 の塩としては、 生理学的に許容される酸 （例、 無機酸、 有機酸など） や塩基 （例
、 アルカリ金属など） などとの塩が用いられ、 とりわけ生理学的に許容される酸 付加塩が好ましい。 この様な塩としては、 例えば、 無機酸 （例えば、 塩酸、 リン 酸、 臭化水素酸、 硫酸など） との塩、 あるいは有機酸 （例えば、 酢酸、 ギ酸、 プ ロピオン酸、 フマル酸、 マレイン酸、 コハク酸、 酒石酸、 クェン酸、 リンゴ酸、 蓚酸、 安息香酸、 メタンスルホン酸、 ベンゼンスルホン酸など） との塩などが用 いられる。
該スクリーニング方法で得られた化合物またはその塩を含有する医薬は、 前記 した本発明のレセプ夕一タンパク質とリガンドとの結合性を変化させる化合物を 含有する医薬と同様にして製造することができる。
このようにして得られる製剤は、 安全で低毒性であるので、 例えば、 ヒトまた は哺乳動物 （例えば、 ラット、 マウス、 モルモット、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブタ、 ゥ シ、 ゥマ、 ネコ、 ィヌ、 サルなど） に対して投与することができる。
該化合物またほその塩の投与量は、 対象疾患、 投与対象、 投与ルートなどによ り差異はあるが、 例えば、 該化合物を経口投与する場合、 一般的に例えば、 前立 腺癌患者 （6 0 k gとして） においては、 一日につき約 0 · l〜1 0 0 m g、 好 ましくは約 1 . 0〜5 O m g、 より好ましくは約 1 . 0〜2 0 m gである。 非経 口的に投与する場合は、 その 1回投与量は投与対象、 対象臓器、 症状、 投与方法 などによっても異なるが、 例えば、 注射剤の形では通常例えば、 前立腺癌患者 （ 6 O k gとして） においては、 一日につき約 0 . 0 1 ~ 3 0 m g程度、 好ましく は約 0. 1〜2 Omg程度、 より好ましくは約 0. 1〜1 Omg程度を静脈注射 により投与するのが好都合である。 他の動物の場合も、 6 O kg当たりに換算し た量を投与することができる。
(14 b) 本発明の DNAに対するプロモーターの活性を促進または阻害する化 合物をスクリーニング方法
本発明は、 本発明の DNA発現不全非ヒト哺乳動物に、 試験化合物を投与し、 レポ一ター遺伝子の発現を検出することを特徴とする本発明の DNAに対するプ 口モーターの活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方 法を提供する。
上記スクリーニング方法において、 本発明の DNA発現不全非ヒト哺乳動物と しては、 前記した本発明の DNA発現不全非ヒ卜哺乳動物の中でも、 本発明の D NAがレポーター遺伝子を導入することにより不活性化され、 該レポーター遺伝 子が本発明の D N Aに対するプロモーターの制御下で発現しうるものが用いられ る。
試験化合物としては、 前記と同様のものがあげられる。
レポーター遺伝子としては、 前記と同様のものが用いられ、 ]3—ガラクトシダ —ゼ遺伝子 （1 ac Z) 、 可溶性アルカリフォスファターゼ遺伝子まだはルシフ ェラーゼ遺伝子などが好適である。
本発明の D N Aをレポ一夕一遺伝子で置換された本発明の D N A発現不全非ヒ ト哺乳動物では、 レポーター遺伝子が本発明の DNAに対するプロモーターの支 配下に存在するので、 レポ一ター遺伝子がコードする物質の発現をトレースする ことにより、 プロモータ一の活性を検出することができる。
例えば、 本発明のレセプ夕一タンパク質をコードする D N A領域の一部を大腸 菌由来の ;3—ガラクトシダ一ゼ遺伝子 （1 a c Z) で置換している場合、 本来、 本発明のレセプ夕一タンパク質の発現する組織で、 本発明のレセプタータンパク 質の代わりに /3—ガラクトシダーゼが発現する。 従って、 例えば、 5—プロモー 4一クロ口一 3—インドリル一 /3—ガラクトピラノシド （X— g a l) のような i3—ガラクトシダ一ゼの基質となる試薬を用いて染色することにより、 簡便に本 発明のレセプ夕一タンパク質の動物生体内における発現状態を観察することがで きる。 具体的には、 本発明のレセプタータンパク質欠損マウスまたはその組織切 片をダルタルアルデヒドなどで固定し、 リン酸緩衝生理食塩液 （P B S ) で洗浄 後、 X— g a 1を含む染色液で、 室温または 3 7 付近で、 約 3 0分ないし 1時 間反応させた後、 組織標本を I mM E D T AZP B S溶液で洗浄することによ つて、 /3—ガラクトシダ一ゼ反応を停止させ、 呈色を観察すればよい。 また、 常 法に従い、 1 a c Zをコードする mR NAを検出してもよい。
上記スクリーニング方法を用いて得られる化合物またはその塩は、 上記した試 験化合物から選ばれた化合物であり、 本発明の D N Aに対するプロモーター活性 を促進または阻害する化合物である。
該スクリーニング方法で得られた化合物は塩を形成していてもよく、 該化合物 の塩としては、 生理学的に許容される酸 （例、 無機酸など） や塩基 （例、 有機酸 など） などとの塩が用いられ、 とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好まし レ。 この様な塩としては、 例えば、 無機酸 （例えば、 塩酸、 リン酸、 臭化水素酸 、 硫酸など） との塩、 あるいは有機酸 （例えば、 酢酸、 ギ酸、 プロピオン酸、 フ マル酸、 マレイン酸、 コハク酸、 酒石酸、 クェン酸、 リンゴ酸、 蓚酸、 安息香酸 、 メタンスルホン酸、 ベンゼンスルホン酸など） との塩などが用いられる。 本発明の D N Aに対するプロモーター活性を促進する化合物またはその塩は、 本発明のレセプタータンパク質の発現を促進し、 該レセプタータンパク質の機能 を促進することができるので、 例えば、 本発明のレセプ夕一タンパク質の機能不 全に関連する疾患などの予防及び Z又は治療薬などの医薬として有用である。 本発明の D N Aに対するプロモータ一活性を阻害する化合物またはその塩は、 本発明のレセプ夕一タンパク質の発現を阻害し、 該レセプタ一タンパク質の機能 を阻害することができるので、 例えば、 本発明のレセプタ一タンパク質の発現過 多に関連する疾患などの予防及び/又は治療薬などの医薬として有用である。 具体的には、 本発明の D N Aに対するプロモータ一活性を促進または阻害する 化合物は、 例えば、 前立腺癌、 およびその他の癌 （非小細胞癌、 卵巣癌、 胃癌、 膀胱癌、 乳癌、 子宮頸部癌、 結腸癌、 直腸癌、 大腸癌等） 、 前立腺肥大症、 男性 性腺機能障害、 不妊、 早産、 子宮内膜症、 肝硬変、 肝炎、 肝不全、 結石などの予 防及び/又は治療薬、 または分娩誘発薬として有用である。 さらに、 上記スクリ一ニングで得られた化合物から誘導される化合物も同様に 用いることができる。
該スクリーニング方法で得られた化合物またはその塩を含有する医薬は、 前記 した本発明のレセプタータンパク質またはその塩とリガンドとの結合性を変化さ せる化合物を含有する医薬と同様にして製造することができる。
このようにして得られる製剤は、 安全で低毒性であるので、 例えば、 ヒ卜また は哺乳動物 （例えば、 ラット、 マウス、 モルモット、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブ夕、 ゥ シ、 ゥマ、 ネコ、 ィヌ、 サルなど） に対して投与することができる。
該化合物またはその塩の投与量は、 対象疾患、 投与対象、 投与ルートなどによ り差異はあるが、 例えば、 本発明の DNAに対するプロモーター活性を促進また は阻害する化合物を経口投与する場合、 一般的に例えば、 前立腺癌患者 （60 k gとして） においては、 一日につき約 0. 1〜10 Omg、 好ましくは約 1. 0 〜50mg、 より好ましくは約 1. 0〜20mgである。 非経口的に投与する場 合は、 その 1回投与量は投与対象、 対象臓器、 症状、 投与方法などによっても異 なるが、 例えば、 注射剤の形では通常例えば、 前立腺癌患者 （60 kgとして） においては、 一日につき約 0. 01〜3 Omg程度、 好ましくは約 0. 1〜20 mg程度、 より好ましくは約 0. 1~1 Omg程度を静脈注射により投与するの が好都合である。 他の動物の場合も、 60 k g当たりに換算した量を投与するこ とができる。
このように、 本発明の DNA発現不全非ヒト哺乳動物は、 本発明の DNAに対 するプロモーターの活性を促進または阻害する化合物またはその塩をスクリ一二 ングする上で極めて有用であり、 本発明の DN A発現不全に起因する各種疾患の 原因究明または予防及び Z又は治療薬の開発に大きく貢献することができる。 また、 本発明のレセプタータンパク質のプロモー夕一領域を含有する DN Aを 使って、 その下流に種々のタンパクをコードする遺伝子を連結し、 これを動物の 卵細胞に注入していわゆるトランスジエニック動物 （遺伝子導入動物） を作成す れば、 特異的にそのレセプタータンパク質を合成させ、 その生体での作用を検討 することも可能となる。 さらに上記プロモーター部分に適当なレポ一夕遺伝子を 結合させ、 これが発現するような細胞株を樹立すれば、 本発明のレセプタータン パク質そのものの体内での産生能力を特異的に促進もしくは抑制する作用を持つ 低分子化合物の探索系として使用できる。
さらに、 上記の本発明の遺伝子発現解析方法を用いた結果、 EDG— 1レセプ ターが血管内皮細胞で高発現していること、 および EDG— 2レセプ夕一が血管 平滑筋細胞で高発現していることが明らかになった。 したがって、 血管内皮細胞 は EDG— 1レセプ夕一ァゴニストまたはアン夕ゴニスト、 特に動脈硬化症、 心 筋梗塞、 脳梗塞または虚血性疾患の予防及び 又は治療薬となる EDG— 1レセ プ夕ーァゴニストのスクリーニングに有用であり、 血管平滑筋細胞は EDG— 2 レセプ夕一ァゴニス卜またはアンタゴニスト、 特に動脈硬化症、 心筋梗塞、 脳梗 塞または虚血性疾患の予防及び/又は治療薬となる EDG— 2レセプ夕一アン夕 ゴニス卜のスクリーニングに有用であることが分かつた。
以下に、 本発明の EDG— 1レセプタ一ァゴニスト ·アンタゴニストまたは E DG- 2レセプターァゴニスト ·アン夕ゴニス卜のスクリーニング方法について 説明する。
本発明で用いられる EDG— 1レセプ夕一は、 配列番号： 38で表わされるァ ミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するレセプ夕一で ある。 なお、 配列番号： 38で表わされるアミノ酸配列を有する EDG— 1レセ プタ一は、 （Ge nb ank a c c e s s i on 番号 AAA52336) に記載されているタンパク質と同一のアミノ酸配列を有する。
本発明で用いられる EDG— 2レセプ夕一は、 配列番号： 40で表わされるァ ミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するレセプターで ある。 なお、 配列番号： 40で表わされるアミノ酸配列を有する EDG— 2レセ プ夕一は、 （Ge nb ank a c c e s s i on 番号 U80811) に記 載されているタンパク質と同一のアミノ酸配列を有する。
「実質的に同一のアミノ酸配列」 とは、 比較するアミノ酸配列に対して、 例え ば、 約 50%以上、 好ましくは約 60%以上、 より好ましくは約 70%以上、 さ らに好ましくは約 80%以上、 なかでも好ましくは約 90%以上、 最も好ましく は約 95 %以上の相同性を有するアミノ酸配列をいう。
配列番号： 38で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含 有するタンパク質としては、 例えば、 配列番号： 3 8で表わされるアミノ酸配列 と実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、 配列番号： 3 8で表わされるアミノ酸 配列を含有する E D G— 1レセプターと実質的に同質の活性を有するタンパク質 などが好ましい。
配列番号： 4 0で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含 有するタンパク質としては、 例えば、 配列番号： 4 0で表わされるアミノ酸配列 と実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、 配列番号： 4 0で表わされるアミノ酸 配列を含有する E D G— 2レセプターと実質的に同質の活性を有するタンパク質 などが好ましい。
実質的に同質の活性としては、 例えば、 リガンド結合活性、 シグナル情報伝達 作用などが挙げられる。 実質的に同質とは、 それらの活性が性質的に同質である ことを示す。 したがって、 リガンド結合活性やシグナル情報伝達作用などの活性 が同等 （例、 約 0 . 0 1〜1 0 0倍、 好ましくは約 0 . 5〜2 0倍、 より好まし くは約 0 . 5〜2倍） であることが好ましいが、 これらの活性の程度やタンパク 質の分子量などの量的要素は異なっていてもよい。
リガンド結合活性やシグナル情報伝達作用などの活性の測定は、 公知の方法に 準じて行なうことができるが、 例えば、 後に記載するリガンドの決定方法ゃスク リーニング方法に従つて測定することができる。
また、 E D G— 1レセプ夕一としては、 （1 ) 配列番号： 3 8で表わされるァ ミノ酸配列中の 1または 2個以上 （好ましくは、 1〜3 0個程度、 より好ましく は 1〜1 0個程度、 さらに好ましくは数個 （1〜5個） ) のアミノ酸が欠失した アミノ酸配列、 （2 ) 配列番号： 3 8で表わされるアミノ酸配列に 1または 2個 以上 （好ましくは、 1〜3 0個程度、 より好ましくは 1〜1 0個程度、 さらに好 ましくは数個 （1〜5個） ） のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、 （3 ) 配列番 号： 3 8で表わされるアミノ酸配列中の 1または 2個以上 （好ましくは、 1〜3 0個程度、 より好ましくは 1〜1 0個程度、 さらに好ましくは数個 （1〜5個） ) のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、 または （4 ) それらを 組み合わせたァミノ酸配列を含有する夕ンパク質なども用いられる。
E D G— 2レセプ夕一としては、 （1 ) 配列番号： 4 0で表わされるアミノ酸 配列中の 1または 2個以上 （好ましくは、 1〜30個程度、 より好ましくは 1〜 10個程度、 さらに好ましくは数個 （1〜5個） ) のアミノ酸が欠失したァミノ 酸配列、 （2) 配列番号： 40で表わされるアミノ酸配列に 1または 2個以上 （ 好ましくは、 1〜30個程度、 より好ましくは 1〜10個程度、 さらに好ましく は数個 （1〜5個） ） のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、 （3) 配列番号： 4 0で表わされるアミノ酸配列中の 1または 2個以上 （好ましくは、 1〜30個程 度、 より好ましくは 1〜10個程度、 さらに好ましくは数個 （1〜5個） ） のァ ミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、 または （4) それらを組み合 わせたアミノ酸配列を含有するタンパク質なども用いられる。
EDG— 1レセプターおよび EDG— 2レセプ夕一は、 ペプチド標記の慣例に 従って、 左端が N末端 （ァミノ末端） 、 右端が C末端 （力ルポキシル末端） であ る。 本発明のレセプタータンパク質は、 C末端がカルボキシル基 （_COOH) 、 カルボキシレート (一 C〇〇— ) 、 アミド （_CONH2) またはエステル ( -COOR) の何れであってもよい。
ここでエステルにおける Rとしては、 例えば、 メチル、 ェチル、 n—プロピル 、 イソプロピルもしくは n—ブチルなどの アルキル基、 例えば、 シクロべ ンチル、 シクロへキシルなどの C3— 8シクロアルキル基、 例えば、 フエニル、 0； —ナフチルなどの C6_12ァリール基、 例えば、 ベンジル、 フエネチルなどのフ ェニルー C卜 2アルキル基もしくは α—ナフチルメチルなどの 一ナフチルー C ト 2アルキル基などの C7_14ァラルキル基のほか、 経口用エステルとして汎用 されるビバロイルォキシメチル基などが用いられる。
EDG- 1レセプターおよび EDG— 2レセプターが C末端以外にカルボキシ ル基 （またはカルポキシレート） を有している場合、 力ルポキシル基がアミド化 またはエステル化されているものも EDG— 1レセプターおよび EDG— 2レセ プ夕一に含まれる。 この場合のエステルとしては、 例えば上記した C末端のエス テルなどが用いられる。
さらに、 EDG— 1レセプターおよび EDG— 2レセプターには、 上記した E DG— 1レセプ夕一および EDG— 2レセプターにおいて、 N末端のメチォニン 残基のァミノ基が保護基 （例えば、 ホルミル基、 ァセチルなどの C2_ 6アルカノ ィル基などの C^ eァシル基など） で保護されているもの、 N端側が生体内で切 断され生成したグルタミル基がピ口グルタミン酸化したもの、 分子内のアミノ酸 の側鎖上の置換基 （例えば、 _OH、 — SH、 アミノ基、 イミダゾール基、 イン ドール基、 グァニジノ基など） が適当な保護基 （例えば、 ホルミル基、 ァセチル などの C2 6アルカノィル基などの 6ァシル基など） で保護されているもの 、 あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖タンパク質などの複合タンパク質なども含 まれる。
EDG- 1レセプターの具体例としては、 例えば、 配列番号： 38で表わされ るァミノ酸配列からなるレセプター夕ンパク質などが挙げられる。
EDG- 2レセプターの具体例としては、 例えば、 配列番号： 40で表わされ るァミノ酸配列からなるレセプ夕一夕ンパク質などが挙げられる。
本発明の EDG— 1レセプ夕ーァゴニスト ·アン夕ゴニス卜のスクリーング方 法では、 他の細胞または組織と比較して、 EDG— 1レセプ夕一を極めて高発現 している血管内皮細胞を用いることを特徴とする。
一方、 EDG— 2レセプ夕ーァゴニスト ·アンタゴニス卜のスクリーング方法 では、 他の細胞または組織と比較して、 EDG— 2レセプターを極めて高発現し ている血管平滑筋細胞を用いることを特徴とする。
EDG- 1レセプターに対するリガンドとしては、 EDG— 1レセプターに結 合する化合物であれば特に限定されないが、 例えば、 Sphingosine-1-phosphate (S 1 P) などが用いられる。 以下、 EDG— 1レセプ夕一に結合する化合物を 単に EDG— 1と略載する。
EDG- 2レセプ夕一に対するリガンドとしては、 EDG- 2レセプターに結 合する化合物であれば特に限定されないが、 例えば、 lysophosphatidic acid ( LPA) などが用いられる。 以下、 EDG— 2レセプ夕一に結合する化合物を単 に EDG— 2と略載する。
具体的には、 本発明のスクリーニング方法は、
(1) (i) EDG— 1と血管内皮細胞を接触させた場合と （ii) EDG— 1と 試験化合物を血管内皮細胞とを接触させた場合との比較を行なうことを特徴とす る EDG— 1レセプターァゴニス卜またはアンタゴニス卜のスクリーニング方法 A、 および
(2) (i) EDG— 2と血管平滑筋細胞を接触させた場合と （ii) EDG-2 と試験化合物を血管平滑筋細胞とを接触させた場合との比較を行なうことを特徴 とする EDG— 2レセプ夕一ァゴニストまたはアン夕ゴニス卜のスクリーニング 方法 Bを提供する。
本発明のスクリーニング方法 Aにおいては、 （i) と （ii) の場合における、 例えば、 血管内皮細胞のァラキドン酸遊離、 アセチルコリン遊離、 細胞内 C a2 +遊離、 細胞内 cAM P生成、 細胞内 cAMP抑制、 細胞内 c GMP生成、 イノ シトールリン酸産生、 細胞膜電位変動、 細胞内タンパク質のリン酸化、 c一 f o sの活性化、 細胞増殖、 一酸化炭素産生、 遊走活性、 低分子量 Gタンパク質 Rh oや Ra cの活性化、 ホスファチジルイノシトール (P I ) 3キナーゼ活性、 p Hの低下などを促進する活性または抑制する活性などを測定して、 比較すること を特徴とする。
本発明のスクリーニング方法 Bにおいては、 U) と （ii) の場合における、 例えば、 血管平滑筋細胞のァラキドン酸遊離、 ァセチルコリン遊離、 細胞内 Ca 2+遊離、 細胞内 c AMP生成、 細胞内 c AMP抑制、 細胞内 c GMP生成、 ィ ノシトールリン酸産生、 細胞膜電位変動、 細胞内タンパク質のリン酸化、 c一 f o sの活性化、 細胞増殖、 一酸化炭素産生、 遊走活性、 低分子量 Gタンパク質 R h oや R a cの活性化、 ホスファチジルイノシ 1 ル (P I) 3キナーゼ活性、 pHの低下などを促進する活性または抑制する活性などを測定して、 比較するこ とを特徴とする。
より具体的には、 本発明のスクリーング方法 Aは、
(1 a) 試験化合物を血管内皮細胞に接触させた場合における血管内皮細胞の細 胞内 cAMP抑制、 細胞内 cGMP生成、 イノシトールリン酸産生、 細胞膜電位 変動、 細胞内タンパク質のリン酸化、 c一 f o sの活性化、 細胞増殖、 一酸化炭 素産生、 遊走活性、 低^^子量 Gタンパク質 R hoや R a cの活性化、 ホスファチ ジルイノシトール （P I) 3キナーゼ活性、 pHの低下を測定し、 上記活性が例 えば 10%以上、 好ましくは 30%以上、 特に好ましくは 50%以上上昇してい る試験化合物を選択することを特徴とする EDG— 1レセプタ一ァゴニストのス クリーニング方法、
(l b) ED G— 1を血管内皮細胞に接触させた場合に比べて、 EDG— 1およ び試験化合物を血管内皮細胞に接触させた場合における血管内皮細胞の細胞内 c AMP抑制、 細胞内 c GMP生成、 イノシトールリン酸産生、 細胞膜電位変動、 細胞内タンパク質のリン酸化、 c一 f o sの活性化、 細胞増殖、 一酸化炭素産生 、 遊走活性、 低分子量 Gタンパク質 Rhoや Racの活性化、 ホスファチジルイ ノシトール （P I) 3キナーゼ活性、 pHの低下を測定し、 上記活性が例えば 1 0%以上、 好ましくは 30%以上、 特に好ましくは 50%以上上昇している試験 化合物を選択することを特徵とする E D G— 1レセプターァゴニス卜のスクリー ニング方法、 または
(1 c) EDG— 1を血管内皮細胞に接触させた場合に比べて、 EDG— 1およ び試験化合物を血管内皮細胞に接触させた場合における血管内皮細胞の細胞内 c AMP抑制、 細胞内 c GMP生成、 イノシトールリン酸産生、 細胞膜電位変動、 細胞内タンパク質のリン酸化、 c一 f o sの活性化、 細胞増殖、 一酸化炭素産生 、 遊走活性、 低分子量 Gタンパク質 Rhoや R a cの活性化、 ホスファチジルイ ノシトール （P I) 3キナーゼ活性、 pHの低下を測定し、 上記活性が例えば 1 0%以上、 好ましくは 30%以上、 特に好ましくは 50%以上減少している試験 化合物を選択することを特徴とする EDG— 1レセプターアンタゴニス卜のスク リーニング方法である。
—方、 本発明のスクリーング方法 Bは、
(2 a) 試験化合物を血管平滑筋細胞に接触させた場合における血管平滑筋細胞 の細胞内 cAM P抑制、 細胞内 cGMP生成、 イノシトールリン酸産生、 細胞膜 電位変動、 細胞内タンパク質のリン酸化、 c— f o sの活性化、 細胞増殖、 一酸 化炭素産生、 遊走活性、 低分子量 Gタンパク質 Rhoや Racの活性化、 ホスフ ァチジルイノシトール (P I) 3キナーゼ活性、 pHの低下を測定し、 上記活性 が例えば 10%以上、 好ましくは 30%以上、 特に好ましくは 50 %以上上昇し ている試験化合物を選択することを特徵とする EDG_ 2レセプターァゴニスト のスクリーニング方法、
(2 b) EDG— 1を血管平滑筋細胞に接触させた場合に比べて、 EDG— 1お よび試験化合物を血管平滑筋細胞に接触させた場合における血管平滑筋細胞の細 胞内 c AMP抑制、 細胞内 c GMP生成、 イノシトールリン酸産生、 細胞膜電位 変動、 細胞内タンパク質のリン酸化、 c一 f o sの活性化、 細胞増殖、 一酸化炭 素産生、 遊走活性、 低分子量 Gタンパク質 R hoや R a cの活性化、 ホスファチ ジルイノシトール （P I) 3キナーゼ活性、 pHの低下を測定し、 上記活性が例 えば 10%以上、 好ましくは 30%以上、 特に好ましくは 50 %以上上昇してい る試験化合物を選択することを特徴とする EDG— 2レセプターァゴニストのス クリーニング方法、 または
(2 c) EDG— 2を血管平滑筋細胞に接触させた場合に比べて、 EDG— 2お よび試験化合物を血管平滑筋細胞に接触させた場合における血管平滑筋細胞のァ ラキドン酸遊離、 細胞内 C a2+遊離、 細胞内 cAMP抑制、 細胞内 cGMP生 成、 イノシトールリン酸産生、 細胞膜電位変動、 細胞内タンパク質のリン酸化、 c一 f o sの活性化、 細胞増殖、 遊走活性、 低分子量 Gタンパク質 Rh oや R a cの活性化、 ホスファチジルイノシトール (P I ) 3キナーゼ活性、 p Hの低下 を測定し、 上記活性が例えば 10%以上、 好ましくは 30%以上、 特に好ましく は 50%以上減少している試験化合物を選択することを特徴とする EDG— 2レ セプ夕一アンタゴニス卜のスクリーニング方法である。
試験化合物としては、 例えば、 ペプチド、 タンパク質、 非ペプチド性化合物、 合成化合物、 発酵生産物、 細胞抽出液、 植物抽出液、 動物組織抽出液などが用い られ、 これら化合物は新規な化合物であってもよいし、 公知の化合物であっても よい。
また、 スクリーニング方法 Aの試験化合物としては、 EDG— 1と EDG— 1 レセプ夕一との結合性を変化させる化合物を用い、 本発明のスクリーニング方法 Aを該化合物の 2次評価系として使用するのが好ましい。
一方のスクリーニング方法 Bの試験化合物としては、 EDG— 2と EDG— 2 レセプターとの結合性を変化させる化合物を用い、 本発明のスクリーニング方法 Bを 2次評価系として使用するのが好ましい。
EDG- 1と EDG— 1レセプ夕一との結合性を変化させる化合物または ED G— 2と EDG— 2レセプ夕一との結合性を変化させる化合物のスクリーニング は、 前述した dj287G14.2レセプタータンパク質とそのリガンドとの結合性を変化 させる化合物のスクリ一二ング方法に準じて実施することができる。
本発明のスクリーニング方法の具体的な説明を以下にする。
血管内皮細胞または血管平滑筋細胞は、 ヒトやその他の哺乳動物 （例えば、 モ ルモット、 ラット、 マウス、 ゥサギ、 ブタ、 ヒッジ、 ゥシ、 サルなど） の血管か ら自体公知の方法に準じて調製することができる。
血管内皮細胞の培養は、 例えば、 （Ce l l 1999 Oc t 29 ； 99 (3) : 301-12) に記載の方法あるいはそれに準じる方法に従って行うこ とができる。
または血管平滑筋細胞の培養は、 例えば、 （Ca r d i ov a s c Re s 1996 S e p ； 32 (3) ： 516— 23 ) に記載の方法あるいはそれに準 じる方法に従って行うことができる。
具体的には、 本発明のスクリーニング方法を実施するためには、 血管内皮細胞 または血管平滑筋細胞のァラキドン酸遊離、 ァセチルコリン遊離、 細胞内 C a 2 +遊離、 細胞内 CAM P生成、 細胞内 cAM P抑制、 細胞内 cGMP生成、 イノ シトールリン酸産生、 細胞膜電位変動、 細胞内タンパク質のリン酸化、 c _ f o sの活性化、 pHの低下などを促進する活性または抑制する活性などを公知の方 法または市販の測定用キットを用いて測定することができる。
具体的には、 まず、 血管内皮細胞または血管平滑筋細胞をマルチウエルプレー ト等に培養する。 スクリーニングを行なうにあたっては前もって新鮮な培地ある いは細胞に毒性を示さない適当なバッファ一に交換し、 試験化合物などを添加し て一定時間インキュベートした後、 細胞を抽出あるいは上清液を回収して、 生成 した産物をそれぞれの方法に従って定量する。 細胞刺激活性の指標とする物質 （ 例えば、 ァラキドン酸など） の生成が、 細胞が含有する分解酵素によって検定困 難な場合は、 該分解酵素に対する阻害剤を添加してアツセィを行なってもよい。 また、 c AMP産生抑制などの活性については、 フオルスコリンなどで細胞の基 礎的産生量を増大させておいた細胞に対する産生抑制作用として検出することが できる。
EDG- 1レセプ夕一ァゴニスト .アン夕ゴニストまたは EDG— 2レセプ夕 ーァゴニス卜 ·アン夕ゴニス卜のスクリーニング用キットは、 血管内皮細胞また は血管平滑筋細胞を含有するものである。
本発明のスクリーニング用キットの例としては、 次のものが挙げられる。
1. スクリーニング用試薬
(1)測定用緩衝液および洗浄用緩衝液
Hanks' Balanced Salt Solution (ギブコ社製） に、 0.05%のゥシ血清アル ブミン （シグマ社製） を加えたもの。
孔径 0.45 /xmのフィルタ一で濾過滅菌し、 4°Cで保存するか、 あるいは用 時調製しても良い。
(2)血管内皮細胞または血管平滑筋細胞
血管内皮細胞または血管平滑筋細胞を 12穴プレートに 5X 105個/穴で継 代し、 37°C、 5%C02、 95 % a i rで 2日間培養したもの。
(3)リガンド標準液
EDG— 1または EDG— 2を 0. 1 %ゥシ血清アルブミン （シグマ社製） を 含む PBSで ImMとなるように溶解し、 一 20°Cで保存する。
本発明のスクリーニング方法 Aまたはスクリーニング用キットを用いて得られ る EDG— 1レセプ夕一ァゴニストは、 EDG— 1が有する生理活性と同様の作 用を有しているので、 該生理活性に応じて安全で低毒性な医薬として有用である 本発明のスクリーニング方法 Aまたはスクリーニング用キットを用いて得られ る E D G— 1レセプ夕一アン夕ゴニストは、 E D G— 1が有する生理活性を抑制 することができるので、 該生理活性を抑制する安全で低毒性な医薬として有用で' ある。
本発明のスクリーニング方法 Aまたはスクリーニング用キットを用いて得られ る EDG— 2レセプターァゴニストは、 EDG— 2が有する生理活性と同様の作 用を有しているので、 該生理活性に応じて安全で低毒性な医薬として有用である 本発明のスクリーニング方法 Bまたはスクリーニング用キットを用いて得られ る EDG— 2レセプ夕一アンタゴニストは、 EDG— 2が有する生理活性を抑制 することができるので、 該生理活性を抑制する安全で低毒性な医薬として有用で ある。
具体的には、 本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用 いて得られる EDG— 1レセプ夕一ァゴニストと EDG— 2レセプターアン夕ゴ 二ストは、 例えば、 動脈硬化、 心筋梗塞、 脳梗塞、 虚血性心疾患などの疾患に対 する予防及び/又は治療薬として有用である。
EDG- 1レセプ夕ーァゴニスト .アン夕ゴニス卜または EDG— 2レセプ夕
—ァゴニスト ·アン夕ゴニストを上記疾患の予防および zまたは治療剤として使 用する場合は、 前記した dj287G14.2レセプ夕一タンパク質とリガンドとの結合性 を変化させる化合物を含有する医薬と同様にして製剤化することができる。
このようにして得られる製剤は、 安全で低毒性であるので、 例えば、 ヒトまた は哺乳動物 （例えば、 ラット、 マウス、 モルモット、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブタ、 ゥ シ、 ゥマ、 ネコ、 ィヌ、 サルなど） に対して投与することができる。
EDG— 1レセプターァゴニス卜または EDG— 2レセプ夕一アン夕ゴニス卜 の投与量は、 対象疾患、 投与対象、 投与ルートなどにより差異はあるが、 例えば 、 EDG- 1レセプ夕ーァゴニス卜または EDG— 2レセプタ一アンタゴニス卜 を経口投与する場合、 一般的に例えば、 動脈硬化患者 （60 k gとして） におい ては、 一日につき約 0. l〜100mg、 好ましくは約 1. 0〜50mg、 より 好ましくは約 1. 0〜20mgである。 非経口的に投与する場合は、 その 1回投 与量は投与対象、 対象臓器、 症状、 投与方法などによっても異なるが、 例えば、 注射剤の形では通常例えば、 動脈硬化患者 （60 kgとして） においては、 一日 にっき約 0. 01〜30mg程度、 好ましくは約 0. l〜20mg程度、 より好 ましくは約 0. 1〜1 Omg程度を静脈注射により投与するのが好都合である。 他の動物の場合も、 60 kg当たりに換算した量を投与することができる。
(略号の表示）
本明細書において、 塩基、 アミノ酸、 化合物等を略号で表示する場合、 IUPAC- IUB Commission on Biochemical Nomenclatureによる略号あるいは当該分野にお ける慣用略号に基づき表示を行い、 その例を以下に記載する。 またアミノ酸が光 学異性体を取りうる場合、 特に明示しなければ L体を表す。
DNA デォキシリポ核酸
cDNA 相補的デォキシリポ核酸
aまたは A アデニン
tまたは T チミン
gまたは G グァニン
cまたは C
uまたは U ゥラシル
RNA リポ核酸
mRNA —リポ核酸
dATP '三リン酸
dTTP デォキシチミジン三リン酸
dGTP デォキシグァノシン三リン酸
d CTP デォキシシチジン三リン酸
ATP アデノシン三リン酸
G 1 y
A 1 a ァラニン
Va 1 バリン
L e u
l i e
S e r セリン
Th r スレオニン
Cy s
Me t メチォニン
G 1 u ダル夕ミン酸
As ァスパラギン酸
L y s リジン
A r g アルギニン
H i s ヒスチジン P h e フエ二ルァラニン
Ty r チロシン
T r p トリプ卜ファン
P r o プロリン
A s n ァスパラギン
G 1 n ダル夕ミン
p G 1 u ピログルタミン酸 本明細書の配列表記載の配列は以下のとおりである。
[配列番号： 1] h OR L 1の塩基配列を表す。
[配列番号 2] 実施例 1で用いた上流プライマ一 M— 572 Fの塩基配列を 表す。
[配列番号 3] 実施例 1で用いた下流プライマー M_ 714 Rの塩基配列を 表す。
[配列番号 4] 実施例 1で用いたプローブ M— 658 Tの塩基配列を表す。
[配列番号 5 ] 実施例 2および 3で用いたプライマーの塩基配列を表す。
[配列番号 6 ] 実施例 2および 3で用いたプライマーの塩基配列を表す。
[配列番号 7 ] 実施例 2および 3で用いたプロ一ブの塩基配列を表す。
[配列番号 8] ヒ卜型 d j 287 G 14. 2レセプターをコードする DNA の塩基配列を表す。
[配列番号 9] ヒト型€1〗 287014. 2レセプターのアミノ酸配列を表 す。
[配列番号 10] 実施例 2で得られた cDNAの塩基配列を表す。
[配列番号 1 1] 参考例 1の PC Rに用いたプライマーの塩基配列を示す。
[配列番号 12] 参考例 1の PC Rに用いたプライマーの塩基配列を示す。
[配列番号 13] マウス型 d j 287 G 14. 2レセプター Aのアミノ酸配 列を表す。
[配列番号 14] マウス型 d j 287 G 14. 2レセプター Aをコードする
DN Aの塩基配列を表す。 ほ己列番号： 15] マウス型 d 287 G 14 2レセプター Bのアミノ酸配 列を表す。
[配列番号： 16] マウス型 d 287 G 14. 2レセプ夕一 Bをコードする DN Aの塩基配列を表す。
[配列番号： 1 7] マウス型 d 287 G 14. 2レセプ夕一 Cのアミノ酸配 列を表す。
[配列番号： 1 8] マウス型 d 287 G 14. 2レセプ夕一 Cをコードする DN Aの塩基配列を表す。
[配列番号： 19] マウス型 d 287 G 14. 2レセプター Dのアミノ酸配 列を表す。
[配列番号： 20] マウス型 d 287 G 14. 2レセプ夕一 Dをコードする DN Aの塩基配列を表す。
己列番号： 21] マウス型 d 287 G 14. 2レセプ夕一 Eのアミノ酸配 列を表す。
[配列番号： 22] マウス型 d 287 G 14. 2レセプター Eをコードする
DN Aの塩基配列を表す。
[配列番号： 23] マウス型 d 287 G 14. 2レセプ夕一 Fのアミノ酸配 列を表す。
[配列番号： 24] マウス型 d 287 G 14. 2レセプター Fをコードする DN Aの塩基配列を表す。
[配列番号： 25] マウス型 d 287 G 14. 2レセプター Gのアミノ酸配 列を表す。
[配列番号： 26] マウス型 d 287 G 14. 2レセプ夕一 Gをコードする DN Aの塩基配列を表す。
[配列番号： 27] マウス型 d 287 G 14. 2レセプタ一 Hのアミノ酸配 列を表す。
[配列番号： 28] マウス型 d 287 G 14. 2レセプター Hをコードする DN Aの塩基配列を表す。
[配列番号： 29] 実施例 6で用いたプライマ一の塩基配列を表す。 [配列番号 30] 実施例 6で用いたプライマ一の塩基配列を表す。
[配列番号 31] 実施例 6で用いたプライマ一の塩基配列を表す。
[配列番号 32] 実施例 6で用いたプライマ —の塩基配列を表す。
[配列番号 33] 実施例 6で用いたプライマ一の塩基配列を表す。
[配列番号 34] 実施例 6で用いたプライマ一の塩基配列を表す。
[配列番号 35] 実施例 6で用いたプライマ —の塩基配列を表す。
[配列番号 36] 実施例 6で用いたプライマ一の塩基配列を表す。
[配列番号 37] 実施例 6で用いたプライマ —の塩基配列を表す。
己列番号 38] ヒト EDG— 1レセプ夕一のアミノ酸配列を表す。
[配列番号 39] ヒト EDG— 1レセプ夕一のアミノ酸配列をコ一ドする c
DN Aの塩基配列を表す
[配列番号： 40 ヒト EDG— 2レセプターのアミノ酸配列を表す。
[配列番号： 41 ヒト EDG— 2レセプターのアミノ酸配列をコードする c
DN Aの塩基配列を表す。
己列番号： 42 ヒト EDG— 3レセプターのアミノ酸配列を表す。
[配列番号： 43 ヒト EDG— 3レセプターのアミノ酸配列をコードする c
DN Aの塩基配列を表す。
[配列番号： 44 ヒト EDG— 4レセプターのアミノ酸配列を表す。
[配列番号： 45 ヒト EDG— 4レセプターのアミノ酸配列をコードする c DN Aの塩基配列を表す。
[配列番号： 46 ヒト EDG— 5レセプターのアミノ酸配列を表す。
[配列番号： 47 ヒト EDG— 5レセプ夕一のアミノ酸配列をコードする c
DN Aの塩基配列を表す
[配列番号： 48 ヒト EDG— 6レセプターのアミノ酸配列を表す。
[配列番号： 49 ヒト EDG— 6レセプ夕一のアミノ酸配列をコードする c DN Aの塩基配列を表す。
[配列番号：' 50 ヒ卜 EDG— 7レセプターのアミノ酸配列を表す。
[配列番号： 51 ヒト EDG— 7レセプ夕一のアミノ酸配列をコードする c
DN Aの塩基配列を表す。 [配列番号： 52 ヒト EDG— 8レセプターのアミノ酸配列を表す。
[配列番号： 53 ヒト EDG— 8レセプ夕一のアミノ酸配列をコードする c DN Aの塩基配列を表す。
[配列番号： 54 実施例 7で用いたヒト EDG— 1レセプター用プライマー の塩基配列を表す。
[配列番号： 55 実施例 7で用いたヒト EDG— 1レセプター用プライマー の塩基配列を表す。
[配列番号： 56 実施例 7で用いたヒト EDG— 1レセプター用プローブの 塩基配列を表す。
[配列番号： 57 実施例 7で用いたヒト EDG— 2レセプター用プライマー の塩基配列を表す。
[配列番号： 58 実施例 7で用いたヒ卜 EDG— 2レセプター用プライマー の塩基配列を表す。
[配列番号： 59 実施例 7で用いたヒト EDG— 2レセプ夕一用プローブの 塩基配列を表す。
[配列番号： 60 実施例 7で用いたヒト EDG— 3レセプ夕一用プライマー の塩基配列を表す。
[配列番号： 61 実施例 7で用いたヒト EDG— 3レセプ夕一用プライマー の塩基配列を表す。
[配列番号： 62 実施例 7で用いたヒト EDG— 3レセプ夕一用プローブの 塩基配列を表す。
[配列番号： 63 実施例 7で用いたヒト E D G— 4レセプター用プライマー の塩基配列を表す。
[配列番号： 64 実施例 7で用いたヒト E D G— 4レセプター用プライマー の塩基配列を表す。
[配列番号： 65 実施例 7で用いたヒト EDG— 4レセプター用プローブの 塩基配列を表す。
[配列番号： 66 実施例 7で用いたヒト EDG— 5レセプ夕一用プライマー の塩基配列を表す。 [配列番号： 67] 実施例 7で用いたヒト ED G— 5レセプター用プライマー の塩基配列を表す。
[配列番号： 68] 実施例 7で用いたヒト E D G— 5レセプター用プローブの 塩基配列を表す。
[配列番号： 69] 実施例 7で用いたヒト EDG— 6レセプター用プライマー の塩基配列を表す。
[配列番号： 70] 実施例 7で用いたヒト EDG— 6レセプ夕一用プライマ一 の塩基配列を表す。
[配列番号： 71] 実施例 7で用いたヒト EDG— 6レセプター用プローブの 塩基配列を表す。
[配列番号： 72] 実施例 7で用いたヒト EDG— 7レセプター用プライマー の塩基配列を表す。
[配列番号： 73] 実施例 7で用いたヒト EDG— 7レセプ夕一用プライマ一 の塩基配列を表す。
[配列番号： 74] 実施例 7で用いたヒト EDG— 7レセプター用プローブの 塩基配列を表す。
[配列番号： 75] 実施例 7で用いたヒト EDG— 8レセプター用プライマ一 の塩基配列を表す。
[配列番号： 76] 実施例 7で用いたヒト EDG— 8レセプター用プライマー の塩基配列を表す。
[配列番号： 77] 実施例 7で用いたヒト EDG— 8レセプ夕一用プローブの 塩基配列を表す。 実施例
以下に実施例を示して本発明をより詳細に説明するが、 これは本発明の範囲を 限定するものではない。 実施例 1
この実施例においては、 ヒト成人正常脳由来の mRNA試料を用い、 TaQM an法によって、 この試料中の、 標的 Gタンパク質共役型レセプ夕一、 チロシン リン酸化酵素型レセプター、 イオンチャネルなどのファミリ一に属する遺伝子由 来 m R N Aの有無及びその産生量を定量し、 標的 G夕ンパク質共役型レセプ夕一 、 チロシンリン酸化酵素型レセプター、 イオンチャネルなどのファミリ一に属す る遺伝子の発現レベルを解析する。 本例においては、 384穴プレートを用いて 、 1 9 2種の標的 Gタンパク質共役型レセプター、 チロシンリン酸化酵素型レセ プター、 イオンチャネルなどのファミリーに属する遺伝子の発現を解析する。 標 的 GPCR遺伝子として、 例えば ORL; M M2; M3; M4; M5; A" A2A； A2B； A" αΙΑ; a IB; a ID; a2A; o;2B; a2C; ;81; /32； /33 ; ATI; AT2； BB1;
BB2;bb3； Β,; B2； CB1;CB2； CCR1; CCR2; CCR3; CCR4; CCR5; CCR6; CCR7;
CCR8; CCR9; CCRIO; CXCRl； CXCR2; CXCR3； CXCR4; CXCR5； CX3CR1； XCR1; C3a; C5a; fMLP； GCK,； CCK2； CRF,; CRF2； Dl; D2; D3; D4; D5； ETA; ETB； GAL1; GAL2; GAL3； mglu,; mglu2; mglu3; mglu mglu5; mglu6; mglu7; mglu8； FSH; LSH; TSH； Hj; ¾; H3; H4； 5-HT1A; 5-HT1B; 5-HT1D; 5-ht]B; 5-ht1F;5-HT2A; 5- HT2F; 5- HT2C; 5 - HT3; 5- HT4; 5-ht5A; 5 - ht5B; 5-HT6; 5-HT7; BLT: CysLT,; CysLT2 ； edgl; edg2; edg3; edg4; MC,; MC2; MC3; MC4; MC5； MT^ MT2; MT3 ;Y Y2; Y4; Y5; Y6； NTS1; NTS2； DOP; KOP; MOP; NOP； P2Y,; P2Y2; P2Y4; P2Y6; P2Y„; P2Y12； PPAR- ； PPAR-/3； PPAR-r ； DP; FP; IP; TP; EP!; EP2; EP3; EP4； PARI; PAR2; PAR3; PAR4 ; sst sst2; sst3; sst4; sst5 ;魔 NK2; NK3； TRH,; TRH2； VPAC,; VPAC2; PAC,； Vla； Vlb； V2; OT； Na+チャネル （タイプ I; タイプ 11/タイプ IIA; タイプ III; SCLll/NaG; PN1; NaC 6; NaDRG; SkMl/^l, SkM2) ； K+チャネル (Kv; EAG; KQT; IRK; ROMK; GIRK; KATP等) ； Ca2+チャネル ( alG; a IE; alS: alC; a ID; a IB; alA; IP3; リアノジンレセプ夕一など ) ； C 1—チャネル （GABAA; GABAc; グリシンレセプター； CICO; C1C1; CFTRな ど） ；非選択性カチオンチャネル （ ChR; 5-HT3; NMDA; AMPA; P2XATP; CNGなど ) などから選択される。 '
(1 ) 試料
増幅は、 以下の試料を用いて行う。 まず、 hORLl mRNA (配列番号 1 ： hGPCR mRNAの一種、 G e nB ankァクセッション番号 X77130) 用試料の調製について記載す る。
(hORLl mRNA定量用試料）
hORL 1ポジティブコントロール cDN Aの連続希釈溶液。
25 n gのヒト成人正常脳由来の全 RNA。
本件のヒト成人正常脳は、 hORLl mRNAを発現することが知られてい る。
(hORL 1 mRNA定量用増幅プライマーおよび検出プローブ）
hORL 1 mRNAの領域の増幅は、 上流プライマー M— 572 F (配列番 号： 2) および下流プライマー M— 714R (配列番号： 3) を用いて行った。 上流プライマー M— 572 Fは、 hORLl mRNA内の 749— 771位の 相補配列にハイブリダィズし、 下流プライマ一 M— 714Rは、 hORLl m RNA内の 869 - 891位の配列にハイブリダィズする。 これらのプライマー により、 完全長の hORL 1 mRNA配列の一部を含む、 143塩基対の生成 物が増幅される。
検出は、 M— 658 T (配列番号： 4) を用いて行う。 このプローブは、 hO RL 1 mRNA内の 835— 860位の相補配列にハイブリダィズする。
T a QM a n形式での検出を可能にするために、 前記プローブ M— 658 Tは 、 5' 端をフルォレセイン型の蛍光色素 （FAM:リポーター） で、 3' 端を口 ーダミン型の蛍光色素 （TAMRA：クェンチヤ一） で標識する。
標識したプローブは、 ハイブリダィズしない状態の場合には、 蛍光共鳴エネル ギ一の移動現象により、 リポーターの蛍光は抑制される。 DNAポリメラーゼに よる前記プローブの伸長を、 増幅の間防ぐために、 前記プローブの 3' 末端はリ ン酸ブロックで合成する。
(hORL 1 mRNA以外の標的 mRNA定量用試料）
上記 hORLl mRNAの場合と同様にして、 残りの 191種の標的 mRN A定量用試料を調製する。 (2) 増幅
各々の PCR増幅は、 TaqMan (商標） EZ T-P CR K i t (ァ プライドバイオシステムズジャパン株式会社） を用いて、 20 1の合計反応液 量で行う。 最終試薬濃度を以下の様にする：試料遺伝子、 5 OmM B i c i n e、 pH8. 2、 115mM K〇Ac、 0. 01mM EDTA、 60 nM R OX、 8 % (W/V) グリセロール、 3mM Mn (OAc) 2、 300 d ATP, dGTP, dCTP、 600 iM dUTP、 900 nM 各プライマ一 、 250 nM プローブ、 0. 5ユニット Amp E r a s e UNG、 5ュニッ ト rT t h DNAポリメラーゼ。
増幅反応は、 AB I PR I ZM (商標） 7900 HT配列検出システム （ァ プライドバイオシステムズジャパン株式会社） を用い、 下記のような温度周期プ ロフアイルで増幅反応を行う。
サーマルサイクリングの時間及び温度
反応前のインキュベーション： 50°Cで 2分間、 逆転写： 6 Ot:で 30分間、 不 活性化： 95 で 5分間、 変性 ·ァニール/伸長： 40サイクル： 94°Cで 20 秒間、 62でで1分間。
(3) 定量的 TaQ Man解析
T a QMa n反応において、 増幅の間に、 前記 D N Aポリメラーゼの 5， →3 ' ェキソヌクレア一ゼ活性により、 前記標的配列にハイブリダィズするプローブ は 5' 末端から加水分解される。 その結果、 リポーター蛍光色素は遊離し、 蛍光 強度が増加する。
増幅生成物の蓄積は、 反応液中のリポーター蛍光色素の蛍光強度の増加を測定 することによって測定する。 また同時に、 反応液の実験誤差補正用の蛍光リファ レンス （蛍光色素： ROX) の蛍光強度も測定する。 各々の増幅サイクルの間、 前記リポーター蛍光色素およびリファレンス蛍光色素は、 その最大の励起に近い 波長の光で励起し、 そして前記リポーター蛍光色素およびリファレンス蛍光色の 発光は、 その発光の最大付近で測定される。 これらの周波数は、 AB I PR I ZM (商標） 7900HT配列検出システムであらかじめ決定され、 別の検出機 器を使用したならば、 適当な周波数を選択すべきである。
蛍光測定値は、 7900HT SDSソフトウェア （アプライドバイオシステ ムズジャパン株式会社） により解析した。 まず、 リポーター蛍光色素の蛍光強度 をリファレンス蛍光色素の蛍光強度で標準化し、 標準化リポーターシグナル （R n) を算出した。 更に、 Rnから PCR初期サイクルのサイクルの間で比較的一 定な Rnの平均値 （ベースライン） を差し引いた値を ARnとする。 サイクル数 に対して ARnをプロットした増幅曲線上で、 増幅産物の指数関数的増幅に相当 する蛍光シグナル （ARn) の増加を解析アルゴリズムが初めて検出したサイク ル数を丁11 € 3110 1 1 Cyc l e (CT) とする。 具体的には、 この CTを 決定するために、 増幅産物の指数関数的増幅に至っていないと考えられる PCR 初期サイクル （3— 15サイクル） をベースラインとして、 このサイクル内の平 均 ARnの標準偏差を計算した。 次にこの標準偏差を 10倍した値を Th r e s h o 1 dと定義し、 各増幅曲線上でこの Th r e s h o 1 dの値に相当するサイ クル数を CTとする。
増幅産物の指数関数的増幅期の間、 CTは最初の標的コピー数の対数に比例す る。 後期のサイクルにおける増幅生成物の蓄積は反応を阻害し、 そしてついには 反応のプラ 1 ^一をもたらす。
(5) 結果
hORL lmRNA定量用の各試料から、 例えば、 次のような CT値が得られ る。 各 CT値は、 複数回 （例えば 4回） の反応から得られる平均値を表わす。
(コントロール試料） （CT値）
106コピーの h OR L 1ポジティブコントロール 2 1. 1、
105コピ一の h OR L 1ポジティブコントロール 24. 4、
104コピーの h OR L 1ポジティブコントロール 27. 5、
103コピーの h OR L 1ポジティブコントロール 30. 8、
102コピーの h〇RL 1ポジティブコントロール 33. 9、
0 コピーの hORL 1ポジティブコントロール 40. 0。 (ヒト成人正常脳由来の試料） (CT値)
25 n gのヒト成人正常脳由来の全 RNA 27. 2 検量線は、 既知量の hORL l cDN Aポジティブコントロールの鎳型 （標 準サンプル） の増幅から得た CT値から導かれる。 具体的には標準サンプルの初 期既知量 （対数値） に対して CTをプロットし、 検量線を作成する。 近似曲線に は CT= (Lo [DNA] τ一 Log [DNA] 0) /Lo g (1 + e) (ここで 、 [DNA] 。は標的テンプレートの初期濃度であり、 [DNA] τは CTサイクル 時の増幅産物の濃度であり、 eは平均増幅効率であり、 そして Lo g (X) は X が 10の底を表す対数である） の一次方程式を用い、 7900HT SDSソフ 卜ウェアにより、 パラメーターを定める。
前記のコントロール試料から得た CT値から、 以下の検量線が得られる： CT=40. 83 -3. 307 * L o g [DNA] 。
前記ヒト成人正常脳由来の試料の投入時のコピー数の計算は、 既知のコント口 一ルの錶型から作製した検量線を用いて行う。 mRNAの濃度は、 計算したコピ —数を試料のサイズで割ることで得られる。
上述した標準曲線を用いて、 hORL l mRNAの濃度 （全 RNAの ng当 たりの hORL l mRNAのコピー数） を、 前記の組織試料に対して計算する と、 次の結果が得られる。 計算した hORL l濃度 （コピー数ノ ng)
(試料) hORL 1濃度
25 n gのヒ卜成人正常脳由来の全 RNA 1. 04 * 103 以下、 同様にして、 他の標的 Gタンパク質共役型レセプター、 チロシンリン酸 化酵素型レセプター、 イオンチャネルなどのファミリ一に属する遺伝子 mRNA の産生量が定量される。 そして、 全ての標的 Gタンパク質共役型レセプター、 チ 口シンリン酸化酵素型レセプ夕一、 イオンチャネルなどのファミリーに属する遺 伝子 mRNAの産生量を比較することによって、 ヒト成人正常脳における各標的 Gタンパク質共役型レセプ夕一、 チロシンリン酸化酵素型レセプター、 イオンチ ャネルなどのファミリーに属する遺伝子の発現量を解析する。 実施例 2 前立腺癌細胞における d j 287 G 14. 2の発現解析
(細胞および培地）
P r ECは宝酒造から購入した。 LNC aP— FGCは大日本製薬から購入し た。 PC— 3および Du 145細胞は AT CCから購入した。 Pr ECは前立腺 上皮細胞培地キット （宝酒造） を用いて培養した。 LNCaP— FGCは 10% FC Sを含む RPM I— 1640 (Invitrogen社） で、 PC— 3および Dul 4 5細胞はそれぞれ 10% FCSを含む Hams F 12 K (Invitrogen社） 、 10% FCS、 2mM L一グルタミン、 Eag l e BSS、 非必須アミノ酸 をカロえた Mini mum essential medium Eagle (レずれも Invitrogen社） で培養した
(RNAの抽出および c DNA合成）
それぞれの細胞をプレコンフルェントになるまで培養した。 細胞を 0. 25% トリプシン— ImM EDTA (Invitrogen社） ではがし細胞数を測定した後、 RNeasy mini KIT (QIAGEN社） のマニュアルに従って全 RNAを抽出精製した。 抽出した RNAは Superscript II (Invitrogen社） のマニュアルに従って first strand cDNAを合成し、 エタノール沈殿後下記のように溶解して用いた。
(T a qMa nを用いた定量）
合成した c DNAは 1 OmgZm 1 RNA相当になるように TEに溶解した 後、 50 g/m 1の酵母 t RNAを含む TEに 6. 67ng// lになるよう に希釈した。 希釈した cDNA溶液 3. 75^ 1 (25 n gの RNAに相当） に 対し、 増幅反応試薬は、 TadMan (商標） Universal PCR Master Mix (アプライド バイオシステムズジャパン株式会社） 、 TaQMan (商標） Probe Kit (アプライドバ ィォシステムズジャパン株式会社） を用い、 15 ^ 1の合計反応液量に調製した 。 各プライマー、 プローブはヒト型 d j 287G14. 2レセプターの塩基配列 からソフトウェア Primer Express (アプライドバイオシステムズ社） を使用して デザインした配列番号： 5— 7で表されるものを用い、 最終濃度はマニュアルに 従った。
TaaMan (商標） PCRは、 ABI PRISM (商標） 7900HT配列検出システム （アプライ ドバイオシステムズジャパン株式会社） で行い、 使用した温度周期は TaqMan (商 標） Universal PCR Master Mix (アプライドバイオシステムズジャパン株式会社 ) のマニュアルに従った。
増幅生成物の定量的 T a QM an解析は、 7900HT SDSソフトウェア （アプライ ドバイオシステムズジャパン株式会社） を用いて行った。 コピー数はヒト型 d j 287 G 14. 2レセプ夕一の塩基配列 （配列番号： 8) をもとに設計したブラ イマ一増幅領域を含む配列番号： 10で表される cDNAを standardとして求め た。
図 1にそれぞれの細胞株における d j 287G14. 2の発現を示す。 実施例 3 d j 287 G 14. 2レセプターの mRNAのヒト組織での発現量 mRNAの発現量の定量には ABI PRISM 7900HT (アプライドバイオシステムズ 社） を使用した。 ヒト型 d j 287G14. 2レセプターの塩基配列から定量に 用いるプライマーとプローブは、 実施例 2と同じものを使用した。 サンプルとし て使用する cDNAは、 ヒト各種組織由来の polyA+RNA (クロンテック社） 1 gからランダムプライマ一を用いて逆転写反応した。 逆転写酵素 SuperScriptll (GIBCO BRL社） を使用し、 添付のプロトコ一ルにしたがって反応させ、 ェタノ —ル沈殿して 100 1の TEに溶解した。 定量のための反応液は TadMan Universal PCR Master Mix (アプライドバイオシステムズ社） のプロトコールに したがって、 プライマー （0. 9 M) 、 プローブ （0. 2 5 M) 、 サンプル cDNAを 0. 5 1を反応液に加えて 1ゥエルあたり 20 1として調製した 。 ABI PRISM 7900HTでの反応は、 50°C (2分） 、 95°C (10分） 後、 95°C (15秒） 、 6 O : (1分） のサイクルを 40回行なった。
ヒト各種組織での d j 287 G 14. 2レセプター mRNAの発現分布を図 2 に示す。 胎盤、 肝臓などで高い発現量が観察された。 参考例 1 ヒト前立腺ガン由来細胞株 LNCAPの cDNAからの PCR法によ る d j 287G14. 2レセプター遺伝子の取得
ヒト前立腺ガン由来細胞株 LNCAPの cDNAを铸型として、 以下の 2種類 の合成 DNAを用いて、 PCRによる増幅を行った。
F 1： 5'-CTCGAGATGATGTTTCGCTCAGATCGAATGTGG-3' (配列番号： 11)
R 1： 5'-GCTAGCTCAGCATGGGCCAGTTTTGACAAGGAC-3' (配列番号： 12)
PCRの反応液は cDNA溶液 1 X 1、 0. 5 1 F 1 (10 ^Μ) , 0. 5 i l Rl (10 / M) , 2. 添付の 10 X反応液、 2. 5 1 d Ν
TP (10 mM) 、 0. 5 1 ExT a q (宝） 、 17. 5 1 大塚蒸留水を 加えて合計 25 1にした。 反応液を、 ThermalCycler960Pを用いて PCR反応 にかけた。 ？〇1 の条件は95 ：、 2分の変性の後、 98°C ' 10秒、 63°C · 20秒、 72°C · 180秒のサイクルを 35回繰り返した。 PCR産物の一部を 用いて電気泳動で約 3700 b pの P CR産物の増幅を確認した後、 P CR産物 を QIAGEN PCR purification Kitを用いて精製し、 T Aベクター (pCR2.1T0P0) にサブクローニングした後、 配列決定を行ったところ図 3〜4で示す配列 （配列 番号： 8) が得られた。 図 3〜4の DNA配列から予測されるアミノ酸配列は図 5〜8 (配列番号： 9) に示すものであった。 実施例 4 植物レクチンによる、 d j ZGFP発現 CHO細胞の c AMP産生上 昇活性
参考例 1で得た (1J287G142と GFPの融合タンパク質を安定的に発現する CH 0細胞株である CHO- dJ287G14.2-GFPを実験に用いた。 CH0_dJ287G14.2-GFP細胞ま たは pAKKO- 111Hをトランスフエクシヨンした mock CHO細胞を 2 X 10ゾ w e 1 1の濃度で 96ゥエルプレートに徴いて一晩培養後、 c AMP産生量の測定に用 いた。 アツセィ用バッファ一として HB S S (Hank' s balanced salt solution, Gibco) に 0. 1%ゥシ血清アルブミン、 0.2mM 3-Isobutyl-l-methylxanthine ( IBMX, Sigma) を添加したものを用いた。 アツセィバッファーで細胞を 2回洗浄 し、 37 で 30分プレインキュベーションした。 細胞を 2回洗浄した後、 アツ セィバッファ一に希釈したレクチンなどのサンプルを細胞に添加して 30分間ィ ンキュベ一シヨンした。 培養上清を捨てて、 cAMP Screen System (AB I) によ つて c AMP産生量を測定した。 その結果、 図 9に示す通り CHO- (1J287G14.2- GFP において Co nA (コンカナパリン A, Wako) 、 Lentil Lectin (レンズマメレ クチン， Wako) 、 Pea Lectin (エンドゥマメレクチン， Wako) を添加することに より濃度依存的な cAM P産生上昇が認められた。 一方、 図 10に示す通り、 コ ントロールとなる mock CHO細胞においては上記のレクチン添加によって c AMP 産生上昇は認められなかった。 実施例 5 CHO細胞に発現させた dJ287G14.2— GFP融合タンパク質のコンカナ バリン A添加による細胞内への移行
(3J287G14.2の C末端に翻訳のフレーム合わせてォワンクラゲより単離された Green Fluorescent Protein (GFP) c DNAをつないだ融合タンパクを発現 させるための発現プラスミドを構築した。 その際 GFP cDNAには GFPの 発現ベクター PQB I 25 (宝酒造） から切り出した断片を用いた。 （3J287G14.2 は PCR法によりその終止コドンを制限酵素 Xb a Iの認識配列に修正し、 ここ に GFP断片を連結して、 実施例 1に記載の発現べクタ一 pAKKO— 111H に挿入した。 その結果、 （1J287G14.2と GFPの融合タンパク（以下、 dJ287G14.2 - GFP)発現ベクターのプラスミド が構築できた。 次にこの dJ287G14.2-GFP 発現べクタ一のプラスミドを、 ジ一ントランスファー （和光純薬） を用いて CH Odh f r—細胞に導入した。 その 2日後に選択培地に置き換えて増殖してきた 形質転換体から G F Pの発現を指標として細胞を選別し、 （3J287G14.2と G F Pの 融合夕ンパク発現 C H O細胞株 C H 0-dJ287G14.2-GFPを樹立した。
(3J287G14.2— GFP融合タンパク質の細胞内での発現局在は、 この CHO—
(1J287G14.2— GFPを L ab— Te kllカバ一グラスチェンバー （N a 1 g e n Nun c社） にまき、 37° (：、 5 %C02条件下で一晩培養した後に、 共焦点顕 微鏡観察用培地 [Hank s' B a l an c e d S a l t S o l u t i on ( G I BCO BRL社） ] に置き換え、 共焦点顕微鏡 （ライカ社） で GFPの蛍 光像を観察した。 また共焦点顕微鏡観察用培地にナタマメ由来のレクチン、 コン カナパリン A (Con A, 和光純薬） を 6 Ο g/mlの濃度で添加した培地に 置き換え 37 °C条件下で 2時間反応させた細胞も観察した。 その際、 GFPの励 起は 488 nMで行った。
その結果、 dJ287G14.2— GFP融合タンパクが細胞膜に発現していることが観察 された （図 11) 。 この細胞を Co nAを添加した培地で 2時間培養すると、 G FPの蛍光が細胞膜ではなく、 細胞質に移動していることが見出された （図 12 ) 。 これらのことは (1J287G14.2が細胞膜に発現する Gタンパク質共役型のレセプ ターであるとともに、 287614.2が( 011八に反応して細胞質へ移行、 すなわち C o n Aによりインタナリゼ一シヨンしたことを示していた。 実施例 6 マウス d j 287G14. 2 カウンタ一パートのクローニング セレラ■マウスゲノムデータベースを用いて、 マウス d j 287 G 14. 2を コードしているェクソンを探しだし、 この配列を元にして翻訳領域を増幅するプ ライマ一、 5' RACE用、 3， RACE用プライマーを作製した。 翻訳領域の 増幅はプライマ一 （配列番号 29, 30， 31， 32) と铸型としてマウス脾臓 、 肺、 14日目胎児 cDNA (Ma r a t hon- r e ady cDNA, C l on t e c h社） 、 Py r oBEST DNA p o 1 yme r a s e (TA KARA) を用いて PC Rを行った。 3， RACEの増幅は遺伝子特異的プライ マー （配列番号 33， 34) と鐯型としてマウス脾臓 c DNA (M a r a t h o n— r e ady c DNA; 、 Adv an t ag e— 2 p o l yme r a s e mi x (C 1 o n t e c h社） を用いて行った。 5 ' RACEの増幅は o 1 i g o— c a p法を用いて遺伝子特異的プライマー （配列番号 35， 36, 37) と 鍩型としてマウス胎盤 cDNA (Cap s i t e cDNA dT Mou s e P l a c en t a, NI PPON GENE 社） 、 Ge ne T a q NT (N I PPON GENE社） を用いて行った。 これらの結果から、 マウ ス d j 287 G14. 2は第 1ェクソンのドナー部位からから第二ェクソンのァ クセプター部位へのつながり方によって N末端の配列が異なる二種類が存在し、 さらに第六ェクソンをスキップしているもの、 第 2 末端のアミノ酸配列が変化しているものが存在し、 総アミノ酸残基数 1 1 65〜 1258アミノ酸残基からなるマウス d j 287 G 14. 2 (配列番号： 13、 15、 17、 1 9、 2 1、 23、 25、 27) をコードする OR F (配列番号： 14、 16、 1 8、 20、 22、 24、 26、 28) が得られた。 実施例 7 血管細胞における Gタンパク質共役型レセプター E D Gファミリーの mRNAの発現
定量のヒト正常冠状動脈血管内皮細胞、 ヒト正常冠状動脈血管平滑筋細胞、 ヒ ト正常大動脈血管内皮細胞、 ヒト正常大動脈血管平滑筋細胞 (旭テクノグラス社 より購入） から、 I s o g e n (二ツボンジーン社） のマニュアルにしたがって t o t a l RNAを調製した。 RNA1 gから逆転写酵素として S u p e r S c r i p t I I逆転写酵素 （G I BCO BRL社） を用い、 添付のマ二ユア ルに従って 42°Cで反応を行い、 反応終了後にエタノール沈殿して TEに溶解し た （RNA 100 n g/ l相当） 。 ED Gファミリ一の mRNA発現量は S e q u e n c e De t e c t i on Sy s t em P r i sm 7900 H Tシステム （アプライドバイオシステムズ社） を用いて定量した。 それぞれのレ セプター発現量定量のために、 それぞれのレセプ夕一を特異的認識する T a QM a nプローブおよびプライマーを P r i me r Exp r e s s (PE App 1 i e d B i o s y s t e m s社製ソフトウェア一） を用いて設計し合成した 。 EDG— 1の検出用には 5'- CCACCGACCCATGTACTATTTT -3' (配列番号： 54) , 5'-TGTAGGCTACTCCTGCCAACAG -3' (配列番号： 55 ) および TadMan probeとし T5' - (Fam) - TTGGCAATCTGGCCCTCTCAGA - (Tanira) -3' (配列番号： 56) を、 ED G— 2検出用には 5'- ACTGTCAGCACATGGCTCCTT -3' (配列番号 : 57) , 5'- ACCGTAATGTGCCTCTCGATT -3' (配列番号： 58 ) および TatiMan probeとして 5' - (Fam) - ATTGACACCAGCCTGACGGCAT -(Tamra) -3' (配列番号： 59) を、 EDG- 3検出用には 5'- CCGTGCTCTTCTTGGTCAT - 3' (配列番号 60) , 5'- CCAGATGGCAATCAAAACC -3' (配列番号： 6 1) および TaqMan probeとして 5' - (Fam) - TGCAGCTTCATCGTCTTGGAGAACCT - (Tamra) -3' (配列番号： 62) を、 ED G— 4検出用には 5'- CCTGGTCAAGACTGTTGTCATC-3' (配列番号： 63) ， 5' - CAGGACATTGCAGGACTCA -3' (配列番号： 64) および TaaMan probeとして 5' - (Fam)- TGGTACTGCTCCTGGATGGTTTAGGCT - (Tamra) -3' (配列番号： 65) を、 ED G— 5検出用には 5'- CCAACMGGTCCAGGAACA - 3' (配列番号： 66) , 5'- AGGTTTTCCACCACAATGG -3' (配列番号： 67 ) および TaaMan probeとして 5' - (Fam) - AATTATACCAAGGAGACGCTGGAAACGC - (Tamra) -3 ' (配列番号： 68) を、 E DG— 6検出用には 5'- GAACTGCCTGTGCGCCTTT-3' (配列番号： 69 ) ， 5'- CCATAGAGGCCCATGATGGT -3' (配列番号： 70 ) および TaaMan probeとして 5' - (Fam) - TCTGCCCCTCTACTCCAAGCGCTACATC- (Tamra) -3' (配列番号： 71) を、 ED G— 7検出用には 5'- TGACTGCTTCCCTCACCAA - 3' (配列番号： 72) ， 5'- GCATCCTCATGATTGACATGTG -3' (配列番号： 73 ) および TaqMan probeとして 5' - (Fam) - TTGCTGGTTATCGCCGTGGAGA- (Tamra) -3' (配列番号： 74) を、 また EDG 一 8検出用には 5'- CTTGCTCCACTGTCTTGCC-3' (配列番号： 75) , 5'- TAGAGTGCACAGATCGCGG -3' (配列番号： 76 ) および Ta an probeとして 5' - (Fam) - CTCTACGCCAAGGCCTACGTGCTCTTCT- (Tamra) -3' (配列番号： 77) をそれぞ れ使用した。
定量のための反応液は T a qM a n Un i ve r s a l PGR Ma s t e r M i x (アプライドバイオシステムズ社) のマニュアルに従い、 それぞれ の Gタンパク質共役型レセプターのプライマー （0. 9 LtM) 、 プローブ （0. 25 μ,Μ) 、 cDNAを t o t a l RNA25 n g相当加えて調製した。 PCR 反応は 50°C · 2分、 95 °C · 10分の後、 95°C · 15秒、 60°C · 1分のサ イクルを 40回繰り返した。 その結果、 ヒト正常冠状動脈血管内皮細胞、 ヒト正 常大動脈血管内皮細胞では E D G一 1がそれぞれ 1， 676， 305コピー Z 2 5 n g t o t a l RNA, 1 , 0 17， 396コピー/ " 25 n g t o t a 1 R NAと定量した 354種の Gタンパク質共役型レセプターのうちで最も高い発現 量を示した。 一方ヒト正常冠状動脈血管平滑筋細胞トヒト正常大動脈血管平滑筋 細胞では EDG— 2がそれぞれ 148， 922コピー/25118 t o t a 1 R NA、 310, 544コピーノ 25 ng t o t a 1 RNAとやはり定量した 3 54種の Gタンパク質共役型レセプターのうちで最も高い発現量を示した。 ED G— 3， 4, 5, 6， 7および 8は EDG— 1あるいは EDG— 2に比べるとか なり発現量が少なかった。 これらの結果は E D G— 1に対するァゴニスト， アン 夕ゴニス卜のスクリーニングには血管内皮細胞を、 また E D G— 2に対するァゴ ニスト， アン夕ゴニス卜のスクリーニングには血管平滑筋細胞を用いるのが適し ていることを示すものであった。 産業上の利用可能性
本発明の解析方法及び定量キットによれば、 多種類の mR NAを含む試料につ いて、 標的 mR NAの有無及びその転写量を一度の処理で高感度で検出すること ができるシステムが提供できる。 したがって、 本発明によれば、 標的遺伝子の発 現解析を高感度で迅速に行うことができるシステムを提供することができる。 また、 標的 mR NAとして複数の Gタンパク質共役型レセプ夕一、 チロシンリ ン酸化酵素型レセプター、 イオンチャンネルなどのファミリーに属する遺伝子 m R NAを選択することによって、 Gタンパク質共役型レセプ夕一、 チロシンリン 酸化酵素型レセプター、 イオンチヤンネルなどのファミリーに属する遺伝子等に 関連する疾病遺伝子の特定を迅速かつ高感度に行うことができる。
また、 本発明の診断方法によれば、 患者から採取した mR NA試料を用いて、 患者が罹患している疾患を高精度に診断することができる。
本発明のレセプタ一タンパク質、 その部分ペプチドまたはその塩、 または本発 明のレセプタータンパク質もしくはその部分ペプチドをコードする D N Aは、 前 立腺癌、 およびその他の癌 （非小細胞癌、 卵巣癌、 胃癌、 膀胱癌、 乳癌、 子宮頸 部癌、 結腸癌、 直腸癌、 大腸癌等） 、 前立腺肥大症、 男性性腺機能障害、 不妊、 早産、 分娩誘発剤、 子宮内膜症、 肝硬変、 肝炎、 肝不全、 結石などの予防及び z 又は治療薬として有用である。
また、 本発明のレセプタータンパク質、 その部分ペプチドまたはその塩とリガ ンドの 1つである糖鎖に親和性を示すタンパク質 （例、 レクチン) とを用いるこ とによって、 該リガンドと本発明の dJ287G14. 2レセプター、 その部分ペプチドま たはその塩との結合性を変化させる化合物を効率良くスクリーニングすることが できる。
さらに、 血管内皮細胞を用いることにより E D G 1レセプターァゴニスト ·ァ ン夕ゴ二ストを、 血管平滑筋細胞を用いることにより EDG 2レセプ夕一ァゴニ スト ·アン夕ゴニストを効率良くスクリーニングすることができる。

Claims

請求の範囲
1 . 複数の遺伝子個々の発現量をまとめて定量解析することにより、 ある細胞ま たは組織においてその発現が特徴的に亢進または減少している遺伝子を同定する ことを特徴とする遺伝子発現解析方法。
2 . 特定の遺伝子ファミリ一に属する複数の遺伝子の発現解析をまとめて行うこ とにより、 その遺伝子ファミリ一の中で、 ある細胞または組織においてその発現 が特徴的に亢進または減少している遺伝子をその発現量の絶対値を算出すること で同定する請求項 1記載の方法。
3 . 複数の各反応場所で、 複数の標的 m R N Aを含み得る mR NA試料と、 それ ぞれの標的 mR NAに対応するプライマ一対をそれぞれ含んでなる各増幅試薬と を接触させることにより、 増幅反応を行い、 得られた増幅生成物の生成量を測定 することによつて遺伝子の発現解析を行う請求項 1記載の方法。
4 . 複数の反応場所を有する反応器具の各反応場所で、 複数の標的 mR NAを含 み得る m R N A試料と、 それぞれの標的 m R N Aに対応するプライマー対をそれ ぞれ含んでなる各増幅試薬とを接触させることにより、 増幅反応を行い、 得られ た増幅生成物の生成量を測定することによって遺伝子の発現解析を行う請求項 1 記載の方法。
5 . 前記特定の遺伝子ファミリ一が Gタンパク質共役型レセプター遺伝子ファミ リ一である請求項 2記載の方法。
6 . 前記特定の遺伝子ファミリ一がチロシンリン酸化酵素型レセプ夕一遺伝子フ ァミリ一である請求項 2記載の方法。
7 . 前記特定の遺伝子ファミリ一がイオンチャネル遺伝子ファミリ一である請求 項 2記載の方法。
8 . 前記特定の遺伝子ファミリーが転写因子、 トランスポーター、 プロテインキ ナーゼ、 プロティンフォスファターゼ、 プロテアーゼ、 ヒートショックプロティ ン、 A T P a s eまたは D N A結合プロテインのいずれかに関連する遺伝子ファ ミリ一である請求項 2記載の方法。
9 . 請求項 1〜8のいずれかに記載の方法によって特定される、 ある細胞や組織 において特徴的に発現が亢進または減少している遺伝子またはその遺伝子産物を 含む医薬。
10. 前記反応器具が反応場所としての複数の穴を有するプレートである請求項 3または 4記載の方法。
11. 前記プレートが 96穴または 384穴プレートである請求項 10記載の方 法。
― 12. 10〜800個のプライマー対を用いる請求項 3または 4記載の方法。
13. 10〜300個のプライマー対を用いる請求項 3または 4記載の方法。
14. 前記増幅反応がポリメラーゼ連鎖反応である請求項 3、 4、 12または 1 3記載の方法。
15. SNPの解析を行う前記請求項 14記載の方法。
16. 増幅生成物の生成量の測定が、 該増幅生成物に相補的又は実質的に相補的 であるプローブを用いて行われる請求項 3または 4記載の方法。
17. 前記プローブが、 mRNAにハイブリダィズするプローブである請求項 1 6記載の方法。
18. 前記プローブが蛍光標識されたプローブである請求項 17記載の方法。
19. 前記 mRNA試料として、 正常ヒト由来の mRNA試料および特定の疾患 患者由来の mRNA試料とを用いる請求項 3または 4記載の方法。
20. 前記疾患患者由来の mRNA試料中で発現が亢進または減少している mR N Aを特定し、 該 m R N Aをコードする遺伝子を該疾患関連遺伝子であると特定 する請求項 19記載の方法。
21. 前記特定の遺伝子ファミリ一がヒト Gタンパク質共役型レセプ夕一タンパ ク質遺伝子ファミリーであり、 癌患者由来の mRNA試料を用いることによって 癌関連遺伝子を特定する請求項 20記載の方法。
22. 標的遺伝子配列のェクソン領域の一方の鎖に相補的又は実質的に相補的で ある第 1のプライマーおよび該標的遺伝子配列のェクソン領域の他方の鎖に相補 的又は実質的に相補的である第 2のプライマーから成るプライマー対を 2対以上 含んでなるプライマー対キット。
23. 前記標的遺伝子がヒト Gタンパク質共役型レセプタータンパク質遺伝子、 チロシンリン酸化酵素型レセプター遺伝子またはイオンチャネル遺伝子である請 求項 22記載のプライマー対キット。
24. 10〜800個のプライマー対で構成される請求項 23記載のプライマー 対キット。
25. 10〜300個のプライマー対で構成される請求項 23記載のプライマー 対キット。
26. 疾患関連遺伝子を特定するための請求項 23記載のプライマー対キットの 使用。
27. 複数の反応場所を有する反応器具の各反応場所に、 標的 mRNAに対応す るプライマ一対をそれぞれ含む各増幅試薬を充填してなる mRN A定量キット。
28. さらに蛍光プローブを含んでなる請求項 27記載のキット。
29. さらに T t h DN Aポリメラ一ゼを含んでなる請求項 28記載のキット
30. 請求項 1〜4のいずれかの方法または請求項 27の定量キットを用いて、 患者から採取した m R N A試料に含まれ得る複数の標的疾患遺伝子の m R N Aを 定量することにより、 あるいはその mRNAの変異量を測定することによりその 患者の疾患を診断する方法。
31. 癌関連ヒト Gタンパク質共役型レセプ夕一タンパク質遺伝子を同定するこ とによって癌を診断する請求項 30記載の診断方法。
32. 請求項 30記載の診断方法によって同定された遺伝子の遺伝子産物に対す るァゴニスト、 アン夕ゴニス卜もしくは抗体、 またはその遺伝子産物をコードす る DN Aを含んでなる医薬。
33. 癌治療剤である請求項 32記載の医薬。
34. 請求項 30に記載の診断方法によって同定された遺伝子の遺伝子産物に.対 するァゴニスト、 アンタゴニストもしくは抗体、 またはその遺伝子産物をコード する DN Aを投与することによってその遺伝子が関与する疾患を治療する方法。
35. 前記疾患が癌である請求項 34記載の治療方法。
36. 配列番号： 9で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミ ノ酸配列を含有するレセプター夕ンパク質もしくはその部分べプチドまたはその 塩を含有してなる医薬。
3 7 . 癌、 前立腺肥大症、 男性性腺機能障害、 不妊、 早産、 子宮内膜症、 肝硬変 、 肝炎、 肝不全または結石の予防および/または治療剤、 または分娩誘発剤であ る請求項 3 6記載の医薬。
3 8 . 癌が前立腺癌、 非小細胞癌、 卵巣癌、 胃癌、 膀胱癌、 乳癌、 子宮頸部癌、 結腸癌、 直腸癌または大腸癌である請求項 3 7記載の医薬。
3 9 . 配列番号： 9で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミ ノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩に対する 抗体を含有してなる診断薬。
4 0 . 癌、 前立腺肥大症、 男性性腺機能障害、 不妊、 早産、 子宮内膜症、 肝硬変 、 肝炎、 肝不全または結石の診断薬である請求項 3 9記載の診断薬。
4 1 . 配列番号： 9で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミ ノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分べプチドまたはその塩に対する 抗体を含有してなる医薬。
4 2 . 癌、 前立腺肥大症、 男性性腺機能障害、 不妊、 早産、 子宮内膜症、 肝硬変 、 肝炎、 肝不全または結石の予防および/または治療剤、 または分娩誘発剤であ る請求項 4 1記載の医薬。
4 3 . ( 1 ) 配列番号： 9で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同 一のアミノ酸配列を含有する Gタンパク質共役型レセプタータンパク質、 その部 分ペプチドまたはその塩および （2 ) 糖鎖に親和性を示すタンパク質を用いるこ とを特徴とする該レセプタータンパク質またはその塩と糖鎖に親和性を示すタン パク質との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法。
4 4 . 糖鎖に親和性を示すタンパク質がァスパラギン結合型糖鎖またはセリン · スレオニン結合型糖鎖に親和性を示すタンパク質である請求項 4 3記載のスクリ 一二ング方法。
4 5 . 糖鎖に親和性を示すタンパク質がレクチンである請求項 4 3記載のスクリ 一二ング方法。
4 6 . 糖鎖に親和性を示すタンパク質がコンカナバリン八、 レンズマメレクチン 、 エンドゥマメレクチン、 チヨゥセンアサガオレクチン、 ィヌェンジユレクチン またはフィ卜へマグルチニンである請求項 4 3記載のスクリーニング方法。
4 7 . ( 1 ) 配列番号： 9で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同 一のアミノ酸配列を含有する Gタンパク質共役型レセプタータンパク質、 その部 分ペプチドまたはその塩および （2 ) 糖鎖に親和性を示すタンパク質を含有する ことを特徴とする該レセプタータンパク質またはその塩と糖鎖に親和性を示す夕 ンパク質との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング用キット
4 8 . 請求項 4 6記載のスクリーニング方法または請求項 4 7記載のスクリー二 ング用キットを用いて得られうる、 糖鎖に親和性を示すタンパク質と配列番号： 9で表わされるァミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を含有 する G夕ンパク質共役型レセプタータンパク質またはその塩との結合性を変化さ せる化合物またはその塩。
4 9 . 請求項 4 8記載の化合物またはその塩を含有してなる医薬。
5 0 . 癌、 前立腺肥大症、 男性性腺機能障害、 不妊、 早産、 子宮内膜症、 肝硬変 、 肝炎、 肝不全または結石の予防及び/又は治療剤、 または分娩誘発剤である請 求項 4 9記載の医薬。
5 1 . 癌が前立腺癌、 非小細胞癌、 卵巣癌、 胃癌、 膀胱癌、 乳癌、 子宮頸部癌、 結腸癌、 直腸癌または大腸癌である請求項 5 0記載の医薬。
5 2 . 配列番号： 9で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミ ノ酸配列を含有する Gタンパク質共役型レセプタータンパク質またはその部分べ プチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドを用いること を特徴とする、 当該 Gタンパク質共役型レセプタ一タンパク質の発現量を変化さ せ、 癌、 前立腺肥大症、 男性性腺機能障害、 不妊、 早産、 子宮内膜症、 肝硬変、 肝炎、 肝不全または結石を予防及び/又は治療する化合物またはその塩、 または 分娩誘発薬のスクリーニング方法。
5 3 . 配列番号： 9で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミ ノ酸配列を含有する Gタンパク質共役型レセプタ一タンパク質またはその部分べ プチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドを含有してな る、 当該 Gタンパク質共役型レセプタータンパク質の発現量を変化させ、 癌、 前 立腺肥大症、 男性性腺機能障害、 不妊、 早産、 子宮内膜症、 肝硬変、 肝炎、 肝不 全または結石を予防及び 又は治療する化合物またはその塩、 または分娩誘発薬 のスクリーニング用キッ卜。
5 4. 請求項 5 2記載のスクリーニング方法または請求項 5 3記載のスクリー二 ング用キットを用いて得られうる、 配列番号： 9で表されるアミノ酸配列と同一 もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を含有する G夕ンパク質共役型レセプター タンパク質またはその部分ペプチドの発現量を変化させ、 癌、 前立腺肥大症、 男 性性腺機能障害、 不妊、 早産、 子宮内膜症、 肝硬変、 肝炎、 肝不全または結石を 予防及び/又は治療する化合物またはその塩、 または分娩誘発薬。
5 5 . 請求項 5 4記載の化合物またはその塩を含有してなる癌、 前立腺肥大症、 男性性腺機能障害、 不妊、 早産、 子宮内膜症、 肝硬変、 肝炎、 肝不全または結石 の予防及び Z又は治療剤、 または分娩誘発剤。
5 6 . 癌が前立腺癌、 非小細胞癌、 卵巣癌、 胃癌、 膀胱癌、 乳癌、 子宮頸部癌、 結腸癌、 直腸癌または大腸癌である請求項 5 5記載の剤。
5 7 . 糖鎖に親和性を示すタンパク質を含有してなる配列番号： 9で表されるァ ミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する Gタンパク質 共役型レセプ夕一夕ンパク質のシグナル伝達作用増強剤。
5 8 . 癌、 前立腺肥大症、 男性性腺機能障害、 不妊、 早産、 子宮内膜症、 肝硬変 、 肝炎、 肝不全または結石の予防及び Z又は治療剤、 または分娩誘発剤である請 求項 5 7記載の剤。
5 9 . 癌が前立腺癌、 非小細胞癌、 卵巣癌、 胃癌、 膀胱癌、 乳癌、 子宮頸部癌、 結腸癌、 直腸癌または大腸癌である請求項 5 8記載の剤。
6 0 . 配列番号： 9で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミ ノ酸配列を含有する Gタンパク質共役型レセプタータンパク質またはその部分べ プチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドを含有してな る癌、 前立腺肥大症、 男性性腺機能障害、 不妊、 早産、 子宮内膜症、 肝硬変、 肝 炎、 肝不全または結石の予防及び Z又は治療剤、 または分娩誘発剤。
6 1 . 癌が前立腺癌、 非小細胞癌、 卵巣癌、 胃癌、 膀胱癌、 乳癌、 子宮頸部癌、 結腸癌、 直腸癌または大腸癌である請求項 6 0記載の剤。
6 2 . 配列番号： 9で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミ ノ酸配列を含有する Gタンパク質共役型レセプタータンパク質またはその部分べ プチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドを含有してな る癌、 前立腺肥大症、 男性性腺機能障害、 不妊、 早産、 子宮内膜症、 肝硬変、 肝 炎、 肝不全または結石の診断薬。
6 3 . 癌が前立腺癌、 非小細胞癌、 卵巣癌、 胃癌、 膀胱癌、 乳癌、 子宮頸部癌、 結腸癌、 直腸癌または大腸癌である請求項 6 2記載の診断薬。
6 4 . 配列番号： 9で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミ ノ酸配列を含有する Gタンパク質共役型レセプ夕一タンパク質またはその部分べ プチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドと相補的な塩 基配列またはその一部を含有してなるアンチセンス ·ポリヌクレオチドを含有し てなる癌、 前立腺肥大症、 男性性腺機能障害、 不妊、 早産、 子宮内膜症、 肝硬変 、 肝炎、 肝不全または結石の予防及び 又は治療剤、 または分娩誘発剤。
6 5 . 癌が前立腺癌、 非小細胞癌、 卵巣癌、 胃癌、 膀胱癌、 乳癌、 子宮頸部癌、 結腸癌、 直腸癌または大腸癌である請求項 6 4記載の剤。
6 6 . 配列番号： 9で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミ ノ酸配列を含有する Gタンパク質共役型レセプ夕一タンパク質またはその部分べ プチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドと相補的な塩 基配列またはその一部を含有してなるアンチセンス ·ポリヌクレオチドを含有し てなる癌、 前立腺肥大症、 男性性腺機能障害、 不妊、 早産、 子宮内膜症、 肝硬変 、 肝炎、 肝不全または結石の診断薬。
6 7 . 癌の診断薬である請求項 6 6記載の診断薬。
6 8 . 癌が前立腺癌、 非小細胞癌、 卵巣癌、 胃癌、 膀胱癌、 乳癌、 子宮頸部癌、 結腸癌、 直腸癌または大腸癌である請求項 6 7記載の診断薬。
6 9 . 哺乳動物に対して、 配列番号： 9で表されるアミノ酸配列と同一もしくは 実質的に同一のアミノ酸配列を含有するレセプ夕一タンパク質もしくはその部分 ぺプチドまたはその塩の有効量を投与することを特徴とする癌、 前立腺肥大症、 男性性腺機能障害、 不妊、 早産、 子宮内膜症、 肝硬変、 肝炎、 肝不全または結石 の予防および または治療方法、 または分娩誘発方法。
7 0 . 哺乳動物に対して、 配列番号： 9で表されるアミノ酸配列と同一もしくは 実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドま たはその塩に対する抗体の有効量を投与することを特徴とする癌、 前立腺肥大症 、 男性性腺機能障害、 不妊、 早産、 子宮内膜症、 肝硬変、 肝炎、 肝不全または結 石の予防および または治療方法、 または分娩誘発方法。
7 1 . 哺乳動物に対して、 配列番号： 9で表わされるアミノ酸配列と同一もしく は実質的に同一のアミノ酸配列を含有する Gタンパク質共役型レセプタ一タンパ ク質、 その部分ペプチドまたはその塩と糖鎖に親和性を示すタンパク質との結合 性を変化させる化合物またはその塩の有効量を投与することを特徴とする癌、 前 立腺肥大症、 男性性腺機能障害、 不妊、 早産、 子宮内膜症、 肝硬変、 肝炎、 肝不 全または結石の予防及びノ又は治療方法、 または分娩誘発方法。
7 2 . 哺乳動物に対して、 配列番号： 9で表されるアミノ酸配列と同一もしくは 実質的に同一のァミノ酸配列を含有する G夕ンパク質共役型レセプタ一夕ンパク 質の発現量を変化させる化合物またはその塩の有効量を投与することを特徴とす る癌、 前立腺肥大症、 男性性腺機能障害、 不妊、 早産、 子宮内膜症、 肝硬変、 肝 炎、 肝不全または結石の予防および/または治療方法、 または分娩誘発方法。
7 3 . 哺乳動物に対して、 糖鎖に親和性を示すタンパク質またはその塩の有効量 を投与することを特徴とする癌、 前立腺肥大症、 男性性腺機能障害、 不妊、 早産 、 子宮内膜症、 肝硬変、 肝炎、 肝不全または結石の予防および/または治療方法 、 または分娩誘発方法。
7 4 . 哺乳動物に対して、 配列番号： 9で表されるアミノ酸配列と同一もしくは 実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドをコ 一ドするポリヌクレオチドと相補的な塩基配列またはその一部を含有してなるァ ンチセンス ·ポリヌクレオチドの有効量を投与することを特徴とする癌、 前立腺 肥大症、 男性性腺機能障害、 不妊、 早産、 子宮内膜症、 肝硬変、 肝炎、 肝不全ま たは結石の予防および Zまたは治療方法、 または分娩誘発方法。
7 5 . 哺乳動物に対して、 配列番号： 9で表されるアミノ酸配列と同一もしくは 実質的に同一のアミノ酸配列を含有する Gタンパク質共役型レセプ夕一夕ンパク 質またはその部分べプチドをコ一ドするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレ ォチドの有効量を投与することを特徴とする癌、 前立腺肥大症、 男性性腺機能障 害、 不妊、 早産、 子宮内膜症、 肝硬変、 肝炎、 肝不全または結石の予防および/ または治療方法、 または分娩誘発方法。
7 6 . 癌、 前立腺肥大症、 男性性腺機能障害、 不妊、 早産、 子宮内膜症、 肝硬変 、 肝炎、 肝不全または結石の予防および Zまたは治療剤、 または分娩誘発剤を製 造するための配列番号： 9で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一 のアミノ酸配列を含有するレセプ夕一タンパク質もしくはその部分ペプチドまた はその塩の使用。
7 7 . 癌、 前立腺肥大症、 男性性腺機能障害、 不妊、 早産、 子宮内膜症、 肝硬変 、 肝炎、 肝不全または結石の予防および Zまたは治療剤、 または分娩誘発剤を製 造するための配列番号： 9で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一 のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩に 対する抗体の使用。
7 8 . 癌、 前立腺肥大症、 男性性腺機能障害、 不妊、 早産、 子宮内膜症、 肝硬変 、 肝炎、 肝不全または結石の予防およびノまたは治療剤、 または分娩誘発剤を製 造するための配列番号： 9で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同 一のアミノ酸配列を含有する Gタンパク質共役型レセプタータンパク質、 その部 分ペプチドまたはその塩と糖鎖に親和性を示すタンパク質との結合性を変化させ る化合物またはその塩の使用。
7 9 . 癌、 前立腺肥大症、 男性性腺機能障害、 不妊、 早産、 子宮内膜症、 肝硬変 、 肝炎、 肝不全または結石の予防およびノまたは治療剤、 または分娩誘発剤を製 造するための配列番号： 9で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一 のァミノ酸配列を含有する Gタンパク質共役型レセプ夕一夕ンパク質の発現量を 変化させる化合物またはその塩の使用。
8 0 . 癌、 前立腺肥大症、 男性性腺機能障害、 不妊、 早産、 子宮内膜症、 肝硬変 、 肝炎、 肝不全または結石の予防および/または治療剤、 または分娩誘発剤を製 造するための糖鎖に親和性を示すタンパク質またはその塩の使用。
8 1 . 癌、 前立腺肥大症、 男性性腺機能障害、 不妊、 早産、 子宮内膜症、 肝硬変 、 肝炎、 肝不全または結石の予防およびノまたは治療剤、 または分娩誘発剤を製 造するための配列番号： 9で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一 のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドをコードするポリ ヌクレオチドと相補的な塩基配列またはその一部を含有してなるアンチセンス · ポリヌクレオチドの使用。
82. 癌、 前立腺肥大症、 男性性腺機能障害、 不妊、 早産、 子宮内膜症、 肝硬変 、 肝炎、 肝不全または結石の予防および または治療剤、 または分娩誘発剤を製 造するための配列番号： 9で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一 ' のアミノ酸配列を含有する Gタンパク質共役型レセプタ一タンパク質またはその 部分べプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドの使用
83. 配列番号： 13、 配列番号： 15、 配列番号： 17、 配列番号： 19、 配 列番号： 21、 配列番号： 23、 配列番号： 25または配列番号： 27で表わさ れるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する Gタン パク質共役型レセプタ一タンパク質またはその塩。
84. 配列番号： 13、 配列番号： 15、 配列番号： 17、 配列番号： 19、 配 列番号： 21、 配列番号： 23、 配列番号： 25または配列番号： 27で表わさ れるァミノ酸配列からなる G夕ンパク質共役型レセプ夕一タンパク質またはその
85. 請求項 81記載の Gタンパク質共役型レセプ夕一タンパク質をコードする ポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド。
86. 配列番号： 14、 配列番号： 16、 配列番号： 18、 配列番号： 20、 配 列番号： 22、 配列番号： 24、 配列番号： 26または配列番号： 28で表わさ れる塩基配列からなる DNA。
87. 請求項 83記載のポリヌクレオチドを含有する組換えベクター。
88. 請求項 87記載の組換えベクターで形質転換させた形質転換体。
89. 請求項 88記載の形質転換体を培養し、 請求項 83記載の Gタンパク質共 役型レセプタータンパク質を生成せしめることを特徴とする請求項 83記載の G タンパク質共役型レセプ夕一タンパク質またはその塩の製造法。
90. 請求項 83記載の Gタンパク質共役型レセプタータンパク質またはその塩 に対する抗体。
9 1. 配列番号： 14、 配列番号： 16、 配列番号： 18、 配列番号： 20、 配 列番号： 22、 配列番号： 24、 配列番号： 26または配列番号： 28で表わさ れる塩基配列からなる D N Aとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズ する DNA。
92. 請求項 85記載のポリヌクレオチドと相補的な塩基配列またはその一部を 含有してなるポリヌクレオチド。
93. 血管内皮細胞を用いることを特徴とする EDG_ 1レセプ夕一ァゴニスト またはアン夕ゴニス卜のスクリーニング方法。
94. EDG- 1レセプ夕一が配列番号： 38で表わされるアミノ酸配列と同一 もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する Gタンパク質共役型レセプ夕一 タンパク質、 その部分ペプチドまたはその塩である請求項 93記載のスクリ一二 ング方法。
95. 血管内皮細胞を含有することを特徴とする EDG— 1レセプターァゴニス 卜またはアンタゴニス卜のスクリーニング用キッ卜。
96. 請求項 93記載のスクリーニング方法または請求項 95記載のスクリー二 ング用キットを用いて得られる EDG— 1レセプ夕一ァゴニストまたはアン夕ゴ 二スト。
97. 請求項 93記載のスクリーニング方法または請求項 85記載のスクリー二 ング用キットを用いて得られる EDG— 1レセプ夕一ァゴニストを含有してなる 動脈硬化症、 心筋梗塞、 脳梗塞または虚血性疾患の予防及び 又は治療剤。
98. 血管平滑筋細胞を用いることを特徴とする EDG— 2レセプ夕ーァゴニス 卜またはアン夕ゴニストのスクリーニング方法。
99. EDG— 2レセプターが配列番号： 40で表わされるアミノ酸配列と同一 もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を含有する Gタンパク質共役型レセプ夕一 タンパク質、 その部分ペプチドまたはその塩である請求項 98記載のスクリ一二 ング方法。
100. 血管平滑筋細胞を含有することを特徴とする EDG— 2レセプターァゴ ニス卜またはアンタゴニス卜のスクリーニング用キッ卜。
10 1. 請求項 98記載のスクリーニング方法または請求項 100記載のスクリ 一二ング用キットを用いて得られる EDG— 2レセプターァゴニストまたはアン 夕ゴニス卜。
102. 請求項 98記載のスクリーニング方法または請求項 100記載のスクリ 一二ング用キットを用いて得られる EDG— 2レセプターァゴニストまたはアン 夕ゴニストを含有してなる動脈硬化症、 心筋梗塞、 脳梗塞または虚血性疾患の予 防及び //又は治療剤。
103. 哺乳動物に対して、 請求項 93記載のスクリーニング方法または請求項
95記載のスクリーニング用キットを用いて得られる EDG— 1レセブターァゴ 二スト、 または請求項 98記載のスクリーニング方法または請求項 100記載の スクリーニング用キットを用いて得られる EDG— 2レセプ夕一アン夕ゴニスト の有効量を投与することを特徴とする動脈硬化症、 心筋梗塞、 脳梗塞または虚血 性疾患の予防および/または治療方法。
104. 動脈硬化症、 心筋梗塞、 脳梗塞または虚血性疾患の予防及び/又は治療 剤を製造するための請求項 93記載のスクリーニング方法または請求項 95記載 のスクリーニング用キットを用いて得られる EDG— 1レセプターァゴニスト、 または請求項 98記載のスクリーニング方法または請求項 100記載のスクリー ニング用キットを用いて得られる EDG— 2レセプ夕一アン夕ゴニストの使用。
PCT/JP2002/013097 2001-12-14 2002-12-13 Procede d'analyse de l'expression genique WO2003052096A1 (fr)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
AU2002354255A AU2002354255A1 (en) 2001-12-14 2002-12-13 Mtehod of analyzing gene expression
US10/498,848 US20050153289A1 (en) 2001-12-14 2002-12-13 Method of analyzing gene expression
EP02786101A EP1454982A4 (en) 2001-12-14 2002-12-13 PROCESS FOR ANALYZING GENE EXPRESSION

Applications Claiming Priority (8)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2001382053 2001-12-14
JP2001/382053 2001-12-14
JP2002/45104 2002-02-21
JP2002045104 2002-02-21
JP2002140111 2002-05-15
JP2002/140111 2002-05-15
JP2002333769 2002-11-18
JP2002/333769 2002-11-18

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2003052096A1 true WO2003052096A1 (fr) 2003-06-26

Family

ID=27482734

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2002/013097 WO2003052096A1 (fr) 2001-12-14 2002-12-13 Procede d'analyse de l'expression genique

Country Status (4)

Country Link
US (1) US20050153289A1 (ja)
EP (1) EP1454982A4 (ja)
AU (1) AU2002354255A1 (ja)
WO (1) WO2003052096A1 (ja)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE102005028436A1 (de) * 2005-06-17 2007-01-04 Universitätsklinikum Schleswig-Holstein Verfahren zum Ermitteln eines das Vorliegen von Endometriose anzeigenden Parameters
US20070207467A1 (en) * 2006-03-01 2007-09-06 Ming Xu Detection of lymph node metastasis from gastric carcinoma
US20070281305A1 (en) * 2006-06-05 2007-12-06 Sean Wuxiong Cao Detection of lymph node metastasis from gastric carcinoma
CN101021388B (zh) * 2007-03-20 2012-07-04 株洲市兴民科技有限公司 一种双源吸风冷却方法及其装置

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1108789A2 (en) * 1999-12-16 2001-06-20 F. Hoffmann-La Roche Ag Quantitation of hTERT mRNA Expression

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1402030A2 (en) * 2000-03-24 2004-03-31 Millennium Pharmaceuticals, Inc. 43238, a g protein-coupled receptor and uses therefor
WO2001083523A2 (en) * 2000-04-28 2001-11-08 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Stmst protein and nucleic acid molecules and uses therefor
WO2001090150A2 (en) * 2000-05-22 2001-11-29 Millennium Pharmaceuticals, Inc. G protein-coupled receptors from human clone '26908' and uses thereof

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1108789A2 (en) * 1999-12-16 2001-06-20 F. Hoffmann-La Roche Ag Quantitation of hTERT mRNA Expression

Non-Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BLOOD, vol. 96, no. 11 PART 2, November 2001 (2001-11-01), pages 39B *
BLOOD, vol. 98, no. 11 PART 2, November 2001 (2001-11-01), pages 78B *
DATABASE BIOSIS [online] XP002966318, Database accession no. 200200151652 *
DATABASE BIOSIS [online] XP002966319, Database accession no. 200100311314 *
MANAMI NAGANO ET AL.: "TagMan chemistry ni yoru teiryoteki PCR to SNP no kaiseki", CELL TECHNOLOGY, 2000, pages 113 - 123, XP002966898 *
See also references of EP1454982A4 *
TAKAYUKI MATSUMOTO: "IBD no byohen keisei ni okeru cytokine mRNA teiryo no igi", NANJISEI ENSHOSEI CHOKAN SHOGAI NI KANSURU CHOSA KENKYUHAN BUNTAN KENKYU HOKOKUSHO, 2000, pages 73 - 74, XP002966897 *
TAO WANG ET AL.: "Influence of beta1-adrenoceptor blockade on the gene expression of adenylate cyclase subtypes abd beta-adrenoceptor kinase in human atrium", CLINICAL SCIENCE, vol. 101, September 2001 (2001-09-01), pages 211 - 217, XP002966317 *

Also Published As

Publication number Publication date
EP1454982A1 (en) 2004-09-08
AU2002354255A1 (en) 2003-06-30
US20050153289A1 (en) 2005-07-14
EP1454982A4 (en) 2005-12-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2005103291A1 (ja) Ｇタンパク質共役型レセプタータンパク質の新規リガンドとその用途
WO2003099331A1 (fr) Agents renforçateurs de la résistance à l'insuline
JP5317318B2 (ja) 新規ポリペプチドおよびその用途
WO2003052096A1 (fr) Procede d'analyse de l'expression genique
WO2004048565A1 (ja) アポトーシス関連蛋白質およびその用途
US8222383B2 (en) DNA encoding polypeptide capable of modulating muscle-specific tyrosine kinase activity
JP4928260B2 (ja) 新規スクリーニング方法
US20040248208A1 (en) Screening method
JP2002320496A (ja) 新規マウス型ＫｉＳＳ−１レセプタータンパク質およびそのＤＮＡ
WO2004097411A1 (ja) 新規スクリーニング方法
JP2004215503A (ja) 遺伝子発現解析方法
WO2006025551A1 (ja) スクリーニング方法
WO2005100987A1 (ja) Ｇタンパク質共役型レセプタータンパク質の新規リガンドとその用途
WO2004028558A1 (ja) 神経変性疾患の予防・治療剤
JP2004075569A (ja) Ｉｌ２０受容体およびｉｌ２０の新規用途
JP2003315332A (ja) スクリーニング方法
JP2004203868A (ja) Ｅｄｇ受容体の新規用途
JP2004198202A (ja) 新規スクリーニング方法
WO2004052391A1 (ja) Ｅｄｇ受容体の新規用途
WO2004095023A1 (ja) 新規スクリーニング方法
WO2003088992A1 (fr) Nouvelle methode de criblage
JP2003177127A (ja) Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質の用途
JP2004083564A (ja) 新規スクリーニング方法
WO2004081039A1 (ja) 新規タンパク質およびそのｄｎａ
WO2002103020A1 (en) Novel disease-associated gene and use thereof

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AE AG AL AM AT AU AZ BA BB BG BR BY BZ CA CH CN CO CR CU CZ DE DK DM DZ EC EE ES FI GB GD GE GH GM HR HU ID IL IN IS JP KE KG KR KZ LC LK LR LS LT LU LV MA MD MG MK MN MW MX MZ NO NZ OM PH PL PT RO RU SC SD SE SG SK SL TJ TM TN TR TT TZ UA UG US UZ VC VN YU ZA ZM ZW

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): GH GM KE LS MW MZ SD SL SZ TZ UG ZM ZW AM AZ BY KG KZ MD RU TJ TM AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR IE IT LU MC NL PT SE SI SK TR BF BJ CF CG CI CM GA GN GQ GW ML MR NE SN TD TG

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2002786101

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 10498848

Country of ref document: US

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 2002786101

Country of ref document: EP

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: JP