-
Die
Erfindung betrifft ein Verfahren zum Ermitteln eines das Vorliegen
von Endometriose anzeigenden Parameters.
-
Endometriose
ist eine Erkrankung der reproduktiven Lebensphase der Frau. Etwa
10 bis 20% aller Frauen entwickeln in dieser Zeit eine Endometriose.
In Deutschland sind derzeit ungefähr 2.000.000 Frauen von einer
Endometriose betroffen. Etwa 678.000 Frauen sind an Endometriose
erkrankt, d.h. sie weisen Symptome der Endometriose auf. Jedes Jahr
werden klinisch zirka 42.000 Neumanifestationen einer Endometriose registriert.
In 50% der Fälle
muss von einer Progredienz der Erkrankung ausgegangen werden. Die
Endometriose ist daher als chronische Erkrankung zu werten. Ein
besonderes Problem stellt die durch eine Endometriose bedingte Sterilität dar. Etwa
30 bis 40% aller Frauen mit Endometriose sind ungewollt kinder los.
Das häufigste
Symptom der Endometriose ist aber nicht die Sterilität oder Infertilität, sondern
der Schmerz. 63 % der Endometriosepatientinnen leiden unter einer
oft progredienten Dysmenorrhoe, 27 % unter einer Dyspareunie.
-
Die
definitive Diagnose der Endometriose kann nur durch eine Operation
(Laparoskopie bzw. Laparotomie) gestellt werden. Die mittlere Latenzzeit
zwischen ersten Symptomen und der Diagnose Endometriose beträgt 7 bis
9 Jahre. Um diese enorm lange Latenzzeit zu verkürzen, wäre ein diagnostischer Test
für die
Diagnose Endometriose aus peripherem Blut wünschenswert.
-
Aus
der
DE 100 48 633
A1 ist bereits ein Verfahren zur in vitro Diagnostik der
Endometriose bekannt, das sich die Erkenntnis zu nutze macht, dass
einige Gene, beispielsweise Fibronectin, Insulin-like growth factor
binding protein-2 u.a., bei einer Endometriose in ihrer Expression
herunterreguliert sind. Obwohl dieses Verfahren es bereits ermöglicht,
weitgehend auf operative Eingriffe zu verzichten, wird regelmäßig erforderlich sein,
nicht nur ein einzelnes Genprodukt, sondern eine Vielzahl von Genprodukten
zu untersuchen, um ein exakte Diagnose stellen zu können. Zusätzlich müssen dabei
auch noch andere Blutuntersuchungen durchgeführt werden, um andere Krankheiten
auszuschließen.
-
Aufgabe
der Erfindung ist es daher, ein Verfahren zur Ermittlung eines Endometriose
anzeigenden Parameters zu schaffen, wobei nur eine geringe Anzahl
von vergleichenden Untersuchungen nötig ist, um eine exakte Diagnose
stellen zu können.
-
Die
Aufgabe wird gelöst
durch ein Verfahren zum Ermitteln eines das Vorliegen von Endometriose
anzeigenden Parameters, mit den Schritten Bestimmen der mRNA-Konzentration
crec eines RANTES bindenden Rezeptors aus
peripherem Blut einer Spenderin, Bestimmen der mRNA-Konzentration
chkg eines Housekeeping-Gens aus dem peripheren
Blut der Spenderin und Berechnen des Quotienten Q1 =
crec/chkg.
-
Die
Unteransprüche
geben vorteilhafte Ausgestaltungen der Erfindung wieder.
-
Die
Erfindung beruht auf der Beobachtung, dass RANTES, ein Chemokin
der CC-Chemokin-Gruppe mit
einer Größe von 8
kD, ein Chemoattraktant für
Monozyten, natürliche
Killerzellen, T-Gedächtniszellen
und Eosinophile ist (Kameyoshi et al. 1982, Schall et al. 1990).
Alle diese Zellarten sind in der Peritonealflüssigkeit von Frauen mit Endometriose
in erhöhter
Menge zu finden. Die Konzentration von RANTES ist in der Peritonealflüssigkeit
von Frauen mit Endometriose stadienabhängig erhöht (Khorram et al. 1993). RANTES
ist für ca.
70 % der chemotaktischen Aktivität
für Monozyten
verantwortlich (Hornung et al. 2001). RANTES – wie auch viele andere Zytokine,
die in der Peritonealflüssigkeit
von Frauen mit Endometriose erhöht
sind – sind jedoch
nicht in peripherem Blut erhöht.
-
Als
erster CC-Chemokinrezeptor wurde der CCR1-Rezeptor entdeckt (Gao
et al. 1993, Neote et al. 1993), der auch der Rezeptor mit der höchsten Affinität für RANTES
ist. Die Expression von CCR1 ist in Peritonealmakrophagen nach Behandlung
mit TNF-α und
IFN-γ signifikant
erhöht
(Hornung et al. 2001). Daneben wird RANTES, wenn auch mit geringerer
Affinität,
vom CCRS-Rezeptor gebunden.
-
Obwohl
nun Schwankungen von RANTES in peripherem Blut von Endometriosepatientinnen
nicht auf eine Endometriose zurückzuführen sind,
hat die Erfinderin der vorliegenden Erfindung überraschenderweise gefunden,
dass in Blutproben von Endometriosepatientinnen eine erhöhte CCR1-Expression
festzustellen ist, die direkt mit dem Auftreten von Endometriose
korreliert. Dieser Befund kann also unmittelbar zum Nachweis von
Endometriose verwendet werden, wobei auf weitere Untersuchungen
zur Expression anderer Gene oder gar einem operativen Eingriff zur
Diagnosesicherung verzichtet werden kann.
-
Die
Erfindung wird im Folgenden anhand eines bevorzugten Ausführungsbeispiels,
dessen Ergebnis in der einzigen 1 dargestellt
ist, näher
beschrieben.
-
Im
bevorzugten Ausführungsbeispiel
wurde die Expression des CCR1-Rezeptors anhand der mRNA-Konzentration
der Blutprobe im Verhältnis
zur Expression der Hypoxanthin-Phosphoribosyl-Transferase
(HPRT) anhand deren mRNA-Konzentration gemessen. Die Relativmessung
ist notwendig, um eine Referenzgröße zur mRNA-Konzentration des
CCR1-Rezeptors zu
erhalten. Dafür
bedient man sich regelmäßig der Expression
sogenannter Housekeeping-Gene, die grundlegende physiologische Prozesse
steuern und regelmäßig nicht
von mit der Krankheit verbundenen regulatorischen Vorgängen betroffen
sind.
-
Neben
der hier verwendeten HPRT ist nach einem bevorzugten Ausführungsbeispiel
der Erfindung vorgesehen auch andere Housekeeping-Gene zu verwenden,
beispielsweise die Gene für
Cytochrom-C-Oxidase-VIIa-L (COX7AL), Aktin oder Glycerinaldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase (GAPDH).
Weiterhin bietet es sich auch an, statt der Expression des CCR1-Rezeptors die Expression
des CCRS-Rezeptor zu messen.
-
1 zeigt
die Auswertung des erfindungsgemäßen Verfahrens
zur Ermittlung eines das Vorliegen von Endometriose anzeigenden
Parameters. Die Ergebnisse sind dargestellt als Mittelwerte ± Standardabweichung,
wobei die statistischen Analysen mit dem SPSS 10.0 Statistikprogramm
(SPSS Inc., Chicago, USA) wurden. Die Korrelationen zwischen den
Gruppen wurden mit ANOVA mit Kruskal-Wallis-Statistik berechnet, wobei
die statistische Signifikanz angenommen wurde, wenn P < 0,05 war.
-
1 zeigt
deutlich, dass das Verhältnis
von CCR1-mRNA zu HPRT-mRNA bei Frauen mit Endometriose im Vergleich
zu Frauen ohne Endometriose statistisch signifikant erhöht war (30,9 ± 14,3
versus 6,1 ± 4,8;
P < 0,0001). Das
Housekeeping-Gen HPRT wies dagegen keinen statistisch signifikanten
Unterschied auf (1425 ± 684
versus 1109 ± 599;
P > 0,05).
-
Aufgrund
dieses Befundes ist es möglich
durch Ermittlung eines einzelnen Parameters, nämlich dem Quotienten aus CCR1-mRNA
und HPRT-mRNA, eine sichere Aussage darüber zu machen, ob die Patientin an
Endometriose leidet und zwar ohne einen operativen Eingriff vornehmen
zu müssen.
Die Messung des Verhältnisses
von CCR1-mRNA zu HPRT-mRNA aus peripherem Blut kann also als diagnostischer
Test für
die Erkrankung Endometriose verwendet werden, wobei das Verhältnis bei
Vorliegen einer Endometriose wenigstens zweifach höher als
der mittlere Kontrollwert sein sollte. So könnte den Frauen mit Endometriose
ein suffiziente Therapie früher
angeboten werden, während
bei Frauen ohne Endometriose eine gegebenenfalls unnötige Operation
vermieden werden würde.
-
Andere
entzündliche
Erkrankungen wie z.B. Adnexitis, Endometritis o.ä. müssten dabei – wie bisher – mit Hilfe
von anderen Blutuntersuchungen (Leukozyten-, CRP-Erhöhung) ebenso
ausgeschlossen werden, wobei nach dem erfindungsgemäßen Verfahren
dieselbe Blutprobe verwendet werden kann.
-
Schließlich soll
im Folgenden eine bevorzugte beispielhafte Ausgestaltung der methodischen
Vorgehensweise des Verfahrens nach der Erfindung, bei der zunächst Gesamt-RNA
isoliert, in cDNA transkribiert und der Gehalt an CCR1- und HPRT-cDNA
schließlich
mit RT-PCR quantifiziert wird, vorgestellt werden:
Frauen mit
und ohne Endometriose wurde vor einer Operation 2,5 ml Blut mit
Hilfe des Safety-LokTM Blood Collection
Sets (Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes, N.J., USA) entnommen
und mit Hilfe des paxgeneTM Blood RNA Kits® (PreAnalytiXTM, Qiagen, Plymouth, UK) weiterverarbeitet.
Alle Frauen hatten zuvor eine Einverständniserklärung hier für unterschrieben. Diese Studie
ist von der Ethikkommission der Universität Schleswig-Holstein, Campus Lübeck genehmigt worden. Bei
der nachfolgenden Laparoskopie wurden die Patientinnen dann intraoperativ
in die Gruppe der Frauen mit (n = 25) oder ohne (n = 23) Endometriose
eingeteilt.
-
RNA-Gewinnung
-
Die
Blutproben wurden zentrifugiert, RNase freies Wasser (5ml) zu dem
Pellet gegeben, gemischt, nochmals zentrifugiert und das Pellet
in 360 μl
Puffer BR1 gelöst.
Nach Zugabe von 300 μl
Puffer BR2 und 40 μl
Proteinase K wurde die Probe für
10 min in 55 °C
inkubiert. Nach erneuter Zentrifugation wurde der Überstand
mit 350 μl
Ethanol gemischt und in der Paxgene® Säule erneut
zentrifugiert. Dieser Schritt wurde einmal wiederholt, bevor 700 μl Puffer
BR3 zugegeben und erneut zentrifugiert wurde. Der Puffer BR4 (je
500 μl)
wurde zweimal auf die Säule
gegeben und erneut zentrifugiert. Die Säule wurde mit 40 μl BRS Puffer
zweimal ausgespült,
die gewonnene RNA für
5 Min bei 65 °C
inkubiert und die RNA-Menge
photometrisch bestimmt. Die Proben wurden bei –70 °C bis zu weiteren Untersuchung
gelagert (Alle Reagenzien stammen von paxgeneTM Blood
RNA Kits®,
PreAnalytiXTM, Qiagen, Plymouth, UK).
-
Reverse Transkription
-
cDNA
wurde durch reverse Transkription gewonnen. Gesamt RNA wurde als
Template genutzt und spezielle antisense Oligonukleotide benutzt
(Oligo (dT), SuperscriptTMII RT, RNaseOUTTM, dNTP Mix, 0.1 M DTT, 5X First-Strand-Puffer,
alle von Invitrogen Life Technology, Karlsruhe). 1 μg gesamt
RNA wurde mit HPLC Wasser auf 10 μl
aufgefüllt
und 1 μl
Oligo dT, 500 μg/ml
wurde hinzugefügt.
Die Röhrchen
wurden für
10 min auf 70 °C
erhitzt und 8 μl
RT-Mixtur hinzu gegeben (4 μl
5X First Strand Puffer, 2 μl
0.1 M DTT, 1 μl
10 mM dNTP-Mix und 1 μl
40 units/μl
RNaseOUTTM). 1 μl 200 units SuperscriptTMII RT wurden hinzugefügt und die Proben bei 50 °C für 30 min
inkubiert.
-
Real Time PCR
-
Die
cDNA wurde als Template für
die PCR (Polymerase Chain Reaction) verwendet. Die Primer für CCR1 stammen
von R&D Systems,
Wiesbaden, Genbank Accession Nummer NM_001295, cDNA Produktgröße 201 Basenpaare.
Die Primer für
HPRT (Hypoxanthin-Phosphoribosyl-Transferase,
Housekeeping-Gen) stammen von Metabion, Martinsried. Die verwendeten
Sequenzen lauten:
-
Die
folgenden Komponenten wurden als Mastermix für die CCR1 und für die HPRT
PCR verwendet:
1 μl
cDNA Pool
5 μl
10X PCR Puffer
5 μl
2 mM dNTP
0,2 μl
Taq DNA Polymerase
2 μl
CCR1 Primerpaare 7,5 pmol/μl
bzw. 10 μl
4 μM HPRT
Primerpaare HPLC Wasser auf 50 μl
Gesamtvolumen
-
Diese
Mixturen wurden für
CCR 1 zu folgenden Bedingungen amplifiziert:
94 °C/45 s, 55 °C/45 s, 72 °C/45 s für 35 Zyklen
-
Für HPRT:
95 °C/1 min,
94 °C/15
s, 60 °C/15
s, 72 °C/15
s für 39
Zyklen
-
Danach
folgte eine abschließende
Erhitzung für
beide Produkte auf 72 °C
für 10
bzw. 5 Minuten.
-
Literatur
-
- Gao JL, Kuhns DB, Tiffany HL, McDermott D, Li X, Francke
U, Murphy PM. (1993) Structure and functional expression of the
human macrophage inflammatory protein 1 alpha/RANTES receptor. J
Exp Med. 177: 1421-1427.
- Hornung D, Bentzien F, Wallwiener D, Kiesel L, Taylor RN. (2001)
Chemokine bioactivity of RANTES in endometriotic and normal endometrial
stromal cells and peritoneal fluid. Mol Hum Reprod. 7: 163-168.
- Kameyoshi Y, Dorschner A, Mallet AI, Christophers E, Schröder JM.
(1992) Cytokine RANTES released by thrombin-stimulated platelets
is a potent attractant for human eosinophils. J Exp Med. 176: 587-592.
- Khorram O, Taylor RN, Ryan IP, Schall TJ, Landers DV. (1993)
Peritoneal fluid concentrations of the cytokine RANTES correlate
with the severity of endometriosis. Am J Obstet Gynecol. 169: 1545-1549.
- Neote K, DiGregorio D, Mak JY, Horuk R, Schall TJ. (1993). Molecular
cloning, functional expression, and signaling characteristics of
a C-C chemokine receptor. Cell. 72: 415-425.
- Schall T J, Bacon K, Toy KJ, Goeddel DV. (1990) Selective attraction
of monocytes and T lymphocytes of the memory phenotype by cytokine
RANTES. Nature. 347: 669-671.
-
Es
folgt ein Sequenzprotokoll nach WIPO St. 25.
Dieses kann
von der amtlichen Veröffentlichungsplattform
des DPMA heruntergeladen werden.
