WO2003031322A1 - Procédé permettant de préparer un complexe cobalt-proteine - Google Patents

Procédé permettant de préparer un complexe cobalt-proteine Download PDF

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WO2003031322A1
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apoferritin
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complex
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Ichiro Yamashita
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Matsushita Electric Industrial Co., Ltd.
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    • H01L29/40—Electrodes ; Multistep manufacturing processes therefor
    • H01L29/401—Multistep manufacturing processes
    • H01L29/4011—Multistep manufacturing processes for data storage electrodes
    • H01L29/40117—Multistep manufacturing processes for data storage electrodes the electrodes comprising a charge-trapping insulator

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing microparticles, and more particularly to a method for producing a Cobaltau protein complex containing cobalt microparticles, and related techniques.
  • biosensors such as those using enzymes and other proteins, have already been put into practical use.
  • apoferritin is a protein that exists widely in the living world and plays a role in regulating the amount of iron, an essential trace element in living organisms.
  • the complex of iron or iron compounds with apoferritin is called ferritin.
  • Excess iron is stored in the body in the form of ferritin, since iron is harmful to the body if it is present in the body more than necessary.
  • Furitin releases iron ions as needed and returns to apoferritin.
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing the structure of apofuritin.
  • apoferritin 1 is a globular protein having a molecular weight of about 46,000 in which 24 monomer subunits formed from one polypeptide chain are assembled by non-covalent bonds. It has a diameter of about 12 nm and shows higher thermostability and higher pH stability than ordinary proteins.
  • the iron ions when divalent iron ions are incorporated into apoferritin 1, the iron ions enter through channel 3 and are oxidized in a part called ferrooxidase center (iron oxidation active center) in some subunits. 4 and is concentrated in the negatively charged region on the inner surface of the holding unit 4. Then, the iron atom is 3 0 0 0-4 0 0 to 0 set, Ferihai dry bets (5 F e 2 0 3 ⁇ 9 ⁇ 2 0) is held by the holder 4 in crystalline form.
  • the diameter of the fine particles containing metal atoms held in the holding section 4 is substantially equal to the diameter of the holding section 4, that is, about 6 nm.
  • the diameter of the fine particles composed of these metals or metal compounds is also substantially equal to the diameter of the holding portion 4 of apoferritin, that is, about 6 nm.
  • a negatively charged amino acid is exposed on the surface of channel 3 (see Fig. 1) connecting the outside and inside of apoferritin 1 under conditions of pH 7 to 8, and the positively charged F e 2 + ions are incorporated into channel 3 by electrostatic interaction.
  • a large amount of glutamic acid residue, an amino acid residue with a negative charge at pH 7 to 8 is exposed on the inner surface of holding section 4 of apoferritin 1, and is taken in from channel 3.
  • the Fe 2 + ions thus obtained are oxidized in the ferroxidase center and led to the internal holding unit 4. Then, the iron ions are concentrated by electrostatic interaction, Ferihai dry bets (5 F e 2 0 3 ⁇ 9 H 2 0) nucleation of crystals Oko You.
  • iron ions sequentially taken in adhere to the nuclei of the crystal, and nuclei composed of iron oxide grow, and fine particles having a diameter of 6 nm are formed in the holding section 4.
  • the above is an outline of the uptake of iron ions and the formation of fine particles composed of iron oxide.
  • the present invention has been made in order to solve the above problems, and has as its object to provide a method for obtaining a Connort-protein complex containing cobalt fine particles having a uniform particle size.
  • the Co 2+ associating agent By using the Co 2+ associating agent, the Co 2+ ions are concentrated inside the protein. For this reason, the reaction between the Co 2+ ion and the oxidant occurs preferentially inside the protein. At this time, by adjusting the solution to a desired pH using a pH buffer, the reaction between the Co 2+ ion and the oxidizing agent is prevented from proceeding in the opposite direction, and the cobalt fine particles included in the protein are reduced. Prevents dissolution into solution. Therefore, it is possible to obtain a cobalt-protein complex containing cobalt fine particles having a uniform particle size.
  • the above-mentioned pH buffer and the above-mentioned Co 2+ associating agent are preferably both HEPES.
  • HEPES has a function as a pH buffer and a function as an associative agent for Co 2 + ions. Therefore, there is no need to separately prepare a pH buffer and a Co 2+ associating agent.
  • the protein may be apoferritin.
  • the oxidizing agent may be configured is H 2 ⁇ 2.
  • Cobalt present invention a method for manufacturing a protein complex, and Co 2 + ions, and Apofu Werichin the steps of: (a) preparing a solution containing the HEPES, by adding H 2 0 2 in the solution, (B) encapsulating fine particles containing cobalt in the apoferritin.
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing the structure of apoferritin.
  • FIG. 2 is a flowchart showing a method for producing the cobalt-apoferritin complex of the first embodiment. It is one chart.
  • FIG. 3 is a diagram schematically showing the state of the reaction solution.
  • FIG. 4 is an electron micrograph of the cobalt-apoferritin complex obtained in the first embodiment.
  • FIG. 5 is an electron micrograph of apoferritin obtained by performing the method of Embodiment 1 using a TAP buffer instead of a HEPS buffer.
  • 6A to 6D are process cross-sectional views illustrating a method for manufacturing the nonvolatile memory cell of the present embodiment.
  • FIG. 7 is a process cross-sectional view showing a method of arranging and fixing the dot bodies two-dimensionally on the surface of the substrate.
  • FIG. 8 is a diagram illustrating a method of arranging and fixing the composites two-dimensionally on the surface of the substrate. Best Embodiment
  • the first problem is that the pH is adjusted by dropping NaOH into the apoferritin solution without using a buffer. In the portion of the apoferritin solution to which NaOH was dropped, the NaOH concentration rapidly increased locally and the pH increased. Therefore, the function of adjusting the pH may not be sufficient. Therefore, it is considered that the reaction of the above chemical reaction formula 1 proceeds in the reverse direction, and the conoreto microparticles included in the cobalt-apoferritin complex are dissolved in the solution.
  • the second problem is that NaOH is used.
  • NaOH is a powerful protein denaturant. Therefore, in the portion of the apoferritin solution to which NaOH has been dropped, the NaOH concentration may suddenly increase locally, and apoferritin may be denatured. For this reason, apoferritin may not be able to exhibit its original properties, that is, apoferritin may not be able to sufficiently retain cobalt microparticles.
  • the third problem is that it is difficult to do on an industrial scale.
  • NaOH is added dropwise while adding a very small amount of a cobalt nitrate solution and a hydrogen peroxide solution to an apoferritin solution.
  • the reaction is easy if the total volume of the reaction solution is about 20 to 50 ml.
  • cobalt nitrate, hydrogen peroxide and NaOH are added to the apoferritin solution respectively. The time it takes to do so becomes very long. It is also very difficult to uniformly diffuse cobalt nitrate, hydrogen peroxide and NaOH into large amounts of apoferritin solution. Therefore, it is not practical.
  • FIG. 2 is a flowchart showing a method for producing the cobalt-apofuritin complex of the present embodiment.
  • a reaction solution is prepared by mixing each solution in the order of HEPES buffer, apoferritin solution, and Co2 + ion solution (for example, cobalt nitrate solution). .
  • step St 2 adding an oxidizing agent (for example Eta 2 ⁇ 2) to the reaction solution.
  • an oxidizing agent for example Eta 2 ⁇ 2
  • cobalt hydroxide CoO (OH)
  • OH cobalt hydroxide
  • the pH of the reaction solution is adjusted to a range of about 7.5 to 9.0.
  • the pH of the reaction solution is in the range of about pH 8.0 to 8.8, a large amount of negatively charged amino acid residues are exposed on the inner surface of the holding section 4 of apoferritin 1, so that C o 2+ ions Is led to the holding unit 4. Therefore, fine particles made of cobalt hydroxide (CoO (OH)) are likely to be formed on the holding portion 4 of the apoferritin 1.
  • Table 1 below shows the formation state of the cobalt fine particles at each pH.
  • the HEPE S concentration in the reaction solution may be any concentration as long as the change in pH is sufficiently small even if cobalt hydroxide (CoO (OH)) precipitates.
  • a HEPES buffer having a concentration of 9 OmM or more may be used.
  • the concentration of apoferritin in the reaction solution is adjusted to be in the range of 0.1 to 1 mg / ml (about 0.2 to 2 / M). In particular, about 0.5 mgZml (1 ⁇ M) is preferable.
  • the concentration of Co 2+ ions is adjusted according to the apoferritin concentration.
  • the concentration of Co 2+ ion is preferably about 1,000 to 5,000 times the apoferritin concentration, and particularly preferably about 2,000 to 3,000 times.
  • the Co 2+ ion may be added at a higher concentration than the above concentration.However, when the Co 2+ ion is added at a higher concentration, the formation of CoO (OH) outside the apoferritin holding portion becomes severe, and this precipitate The cobalt-apoferritin complex may be involved and the recovery rate may be reduced.
  • the apoferritin concentration is 0.5 mgZml (approximately 1 zM)
  • a concentration of 2-3 mM Co 2+ ions is added.
  • any compound may be used to add the Co 2 + ion, ammonium cobalt sulfate or cobalt nitrate is particularly preferred.
  • ammonium cobalt sulfate or cobalt nitrate is used, a Co 2 + — HE PES aggregate described later is easily formed, and the reaction does not proceed rapidly (does not react explosively).
  • Step St1 the final concentration of HEPE S is 3 OmM (pH 8.8), the final concentration of apoferritin is 0.5 mg / ml (1 ⁇ . ⁇ ), and C ⁇ 2 +
  • the reaction solution is prepared so that the final ion concentration is 5 mM.
  • step St2 0.01 to 3% of hydrogen peroxide solution is added in an amount of about 1 to 2 equivalents of cobalt ion. For example, when the Co 2+ ion is 2 mM, the H 2 O 2 is added so that the final concentration is in the range of 1 mM to 2 mM.
  • Apoferritin may be denatured by the addition of aqueous hydrogen peroxide. For this reason, it is effective to add a salt to stabilize apoferritin. It is a salt, for example, Na 2 S_ ⁇ 4 but like, may be other than a salt. In the case of producing a cobalt-apofuritin complex, the presence of C 1-ions is an obstacle (C 1-ions stabilize Co 2 + ions and inhibit the formation of CoO (OH). Therefore, it is preferable to use a salt containing no C1.
  • the salt concentration may be added at 1 OmM or more, but in the case of Na 2 SO 4 , experimental results show that about 30 mM to 15 OmM is sufficient for stabilization.
  • reaction solution is a pink solution represented by Co z + ions.
  • step St 2 when Co 0 (OH) is generated by the addition of the hydrogen peroxide solution, the color changes to an intermediate color between brown and green exhibited by the Co 3+ ion.
  • the reaction solution may be heated to about 40 ° C to 70 ° C in order to proceed the reaction promptly. This allows the reaction to be completed in several hours to overnight.
  • apoferritin particles become unstable at 70 ° C. or higher, it is preferable to heat to room temperature to about 70 ° C. In particular, it is preferable to heat the reaction solution to about 50 to 60 ° C.
  • the temperature may be raised to about 80 to 100 ° C. This is because the crystallinity of the generated CoO (OH) is improved under the above temperature conditions.
  • step St 2 to a final concentration 2 mM of H 2 0 2, adding the reaction solution to a final concentration of Na 2 S 0 4 is 75 mM, the reaction solution 50 ° C It is heating up.
  • buffers do not affect chemicals in solution.
  • HEPES buffer used in this embodiment it is considered that HEPES interacts with Co 2+ ion to form a Co 2+ — HEPES aggregate.
  • the state in the reaction solution at this time is considered to be an equilibrium state shown in the following chemical reaction formula 2.
  • FIG. 3 schematically shows the state of the reaction solution at this time.
  • step St 1 when a reaction solution using water is used instead of the HEPES buffer solution, when hydrogen peroxide water is added, as shown in the above chemical reaction formula 1, Co 2 + The ions react immediately, forming the Co 3+ ion compound CoO (OH). CoO (OH) is insoluble and precipitates immediately, resulting in all Co 2 + ions being CoO (OH) precipitates.
  • H 2 0 2 is, Co 2 + is a state where the C o 2 + ions and HEP ES in association - to acid the HE PES aggregate Is considered impossible. Therefore, outside of apoferritin, C 0 2 + ions in the aqueous solution are slightly oxidized by H 2 0 2 to precipitate CoO ( ⁇ H).
  • Co 2 + ions are supplied from the Co 2 + — HEPES aggregate, and are concentrated by the negative charge of the holding unit 4 of apofuritin 1.
  • the formation of CoO (OH) proceeds in the holding section 4, and a conopretotoapoferritin complex is formed.
  • step St2 Next, the operation after step St2 will be described.
  • Step St 2 the reaction solution obtained in Step St 2 is placed in a container, and centrifuged at 3,000 rpm for 15 to 30 minutes using a centrifuge to remove the precipitate. Subsequently, the supernatant liquid after removing the precipitate is further centrifuged at 10,000 rpm for 30 minutes to precipitate and remove unnecessary aggregates in which the cobalt-apoferritin complex has aggregated. At this time, the conoreto-apoferritin complex is present in the supernatant in a dispersed state.
  • the cobalt-apoferritin complex solution is centrifuged at 3,000 rpm for 20 minutes to precipitate ferritin aggregates in the solution. Then, the buffer component of the solution is replaced by dialysis with a Tris buffer solution (pH 8.0, 10 to 50 mM, containing 15 OmM NaCl).
  • the cobalt-apoferritin complex solution is filtered through a gel filtration column to obtain a cobalt-apofritin complex solution.
  • An erythin complex is obtained.
  • the cobalt-apofuritin complex is stored in a suitable solution.
  • the pH of the apoferritin solution can be adjusted to a desired pH by adjusting the pH using a buffer solution. Therefore, the reaction of the above chemical reaction formula 1 can be prevented from proceeding in the reverse direction, and the cobalt fine particles included in the cobalt-apoferritin complex are prevented from being dissolved in the solution. Therefore, according to the present embodiment, a cobalt-apoferritin complex containing cobalt fine particles having a uniform particle size can be obtained.
  • the oxidizing agent in this embodiment, the cobalt-apoferritin complex can be added simply by adding the oxidizing agent without paying special attention to uniformly diffuse EO). Therefore, the method for producing the cobalt-apoferritin complex of the present embodiment is relatively easy to carry out on an industrial scale.
  • FIG. 4 is an electron micrograph of the cobalt-apoferritin complex obtained according to the present embodiment.
  • FIG. 4 shows that CoO (OH) is taken into the inside (holding part) of apoferritin, as typically indicated by arrows.
  • FIG. 5 is an electron micrograph of apoferritin obtained by performing the method of the present embodiment using a phosphate buffer or a TAPS buffer instead of the HEPES buffer. Comparing Fig. 5 and Fig. 4, Fig. 5 shows that CoO (OH) is not incorporated into the inside of apoferritin (retention part), as typically shown by the arrow. I understand. In other words, when using a phosphate buffer, the apoferritin holding part
  • HEPES used in the present embodiment is a buffer and also functions as an associating agent that associates with Co 2+ ions. Therefore, if different reagents are used as the buffer and the associating agent instead of the HE PES buffer used in the present embodiment, the cobalt containing the fine particles of cobalt having a uniform particle size can be obtained as in the present embodiment. One apoferritin complex is obtained.
  • the buffer is, for example, a TAPS buffer, a Tris buffer, a phosphate buffer, or the like, and the associating agent is cyclodextran, crown ether, elixir, etc., the same as in the present embodiment. The effect of is obtained.
  • apofuritin is used as the protein into which cobalt is introduced, but other proteins capable of retaining metal particles inside (for example, Dps protein, CCMV protein, etc.) may be used instead. .
  • H 2 0 2 as the oxidizing agent may be used in place of other conventional oxidation agents.
  • it can be used for KMn0 4, K 2 Cr 2 0 7, HN_ ⁇ 3, instead of the HC 10, NaC H 2 0 2 10 or the like as an oxidizing agent.
  • nonvolatile memory cell including a dot body formed using the cobalt-apofrichtin composite manufactured in Embodiment 1 as a floating gate will be described.
  • FIGS. 6A to 6D show a method of manufacturing the nonvolatile memory cell of the present embodiment.
  • an element isolation oxide film 102 surrounding an active region is formed on a p-type Si substrate 101 by a LOCOS method, and then functions as a tunnel insulating film on the substrate.
  • Gate oxide film 103 is formed by a thermal oxidation method.
  • a dot body 104 made of metal or semiconductor fine particles having a particle size of about 6 nm is formed on the substrate. The method of forming the dot body 104 on the substrate will be described later.
  • an SiO 2 film for filling the doping body 104 is deposited on the substrate by a sputtering method or a CVD method.
  • an A1 film is deposited on the substrate.
  • a photoresist mask P r 1 the S i 0 2 film and A 1 film A 1 electrodes 106 made of a silicon oxide film 105 and the control gate electrode patterning a row of connexion inter-electrode insulating film Form.
  • the dot body 104 thereon is also removed at the same time.
  • impurity ions are implanted using the photoresist mask and the A1 electrode 106 as masks to form first and second n-type diffusion layers 107a and 107b.
  • the formation of the interlayer insulating film 108, the contact hole 109 opening in the interlayer insulating film 108, and the implantation of tungsten into the contact hole 109 are performed by a known method.
  • the formation of the tungsten plug 110 by embedding and the formation of the first and second aluminum wirings 111a and 111b are performed.
  • the p-type Si substrate is used as the substrate.
  • an n-type Si substrate may be used, and a substrate made of a compound semiconductor such as GaAs or other semiconductors may be used. Good.
  • the cobalt-apofuritin complex 150 (hereinafter abbreviated as a complex in the present specification) 150 obtained in the first embodiment is prepared. Coalescing 150 is placed on the surface of substrate 130. Thus, a composite film in which the composite 150 is arranged on the surface of the substrate 130 with high density and high precision is formed. Note that the substrate 130 is a process shown in FIG.
  • a gate oxide film 103 functioning as a tunnel insulating film is formed on a substrate by a thermal oxidation method after an element isolation oxide film 102 surrounding an active region is formed by a COS method. The same applies to the following description.
  • the dot molecules 104 are formed on the substrate 130 by removing the protein molecules 140 of the complex 150 and leaving only the conjugate fine particles 104a. I do.
  • JP-A-45990 The method described in JP-A-45990 will be described with reference to FIG.
  • a liquid 160 in which the complex 150 is dispersed (in this embodiment, an equivalent volume of a phosphate buffer solution having a concentration of 40 mM and H5.3 and an aqueous solution of sodium chloride having a concentration of 40 mM) is used.
  • a liquid 160 in which the complex 150 is dispersed in this embodiment, an equivalent volume of a phosphate buffer solution having a concentration of 40 mM and H5.3 and an aqueous solution of sodium chloride having a concentration of 40 mM.
  • PBLH Poly-1-Benzil-L—Histidine
  • a polypeptide film 100 made of PBLH is formed on the surface of the liquid 160.
  • the pH of the liquid 160 is adjusted.
  • the composite 150 adheres to the polypeptide film 170 over time, and a two-dimensional crystal of the composite 150 is formed. This is because the composite film 150 has a negative charge while the polypeptide film 100 has a positive charge.
  • the substrate 130 is placed (floated) on the polypeptide film 170, and the polypeptide film 170 is attached to the substrate 130.
  • the substrate 130 to which the two-dimensional crystal of the complex 150 has adhered can be obtained via the polypeptide film 170. Cut.
  • protein molecules are generally vulnerable to heat
  • removal of protein molecules 140 of complex 150 is performed by heat treatment. For example, when the mixture is allowed to stand at 400 to 500 ° C. for about 1 hour in an inert gas such as nitrogen, the protein molecules 140 and the polypeptide membrane 17 in the case of method 1 are obtained. 0 is burned off, and fine cobalt particles 104 a remain two-dimensionally on the substrate 130 as a dot body 104 that is regularly arranged with high density and high precision.
  • the cobalt fine particles 104a held by the composite 150 are caused to appear two-dimensionally on the substrate 130, and the density is high. Dots 104 arranged with high precision can be formed.
  • the memory cell 100 of the present embodiment has an A 1 electrode 106 functioning as a control gate, and first and second n-type diffusion layers functioning as a source or a drain. It has a MOS transistor (memory cell transistor) consisting of 107a and 107b, and the threshold voltage of the memory transistor is determined by the amount of charge stored in the dot body 104 functioning as a floating gate. It is a non-volatile memory cell that utilizes the change.
  • MOS transistor memory cell transistor
  • This non-volatile memory cell can function as a memory for storing binary values, but by controlling not only the presence / absence of charges stored in the dot body 104 but also the amount of stored charges, it is A multi-valued memory can also be realized.
  • an FN (Fowler-Nordheim) current through an oxide film or a direct tunneling current is used.
  • FN current For writing data, FN current, direct tunneling current or channel hot electron (CHE) injection through an oxide film is used.
  • CHE channel hot electron
  • the floating gate is made of cobalt fine particles having a small particle size that can function as a quantum dot, the amount of accumulated charge is small. Therefore, the amount of current at the time of writing and erasing can be reduced, and a low power consumption nonvolatile memory cell can be configured.
  • a floating gate is formed. Since the size of the cobalt fine particles is uniform, the characteristics at the time of charge injection and extraction are uniform among the cobalt fine particles, and control can be easily performed in these operations.
  • a cobalt-protein complex containing cobalt fine particles having a uniform particle size can be obtained.
  • the method for producing a cobalt-protein complex of the present invention is used for producing an apparatus requiring an ultrafine pattern, particularly for producing an ultrafine electronic device such as a nonvolatile memory cell including a dot body as a floating gate.

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Description

曰月糸田 β コバルトータンパク質複合体の作製方法 技術分野
本発明は、 微粒子の作製方法に関し、 特に、 コバルト微粒子を内包するコバル トータンパク質複合体の作製方法、 およびその関連技術に関する。 背景技術
近年、 バイオテクノロジーとエレクトロ二クスを融合させたバイオエレクト口 二クスの研究が活発に行なわれ、 酵素等のタンパク質を用いたバイオセンサー等、 すでに実用化されているものもある。
バイオテクノロジーを他分野に応用する試みの 1つとして、 金属化合物を保持 する機能を有するタンパク質であるアポフェリチンに金属または金属化合物から なる微粒子を取り込ませ、 ナノオーダ一の均一なサイズの微粒子を作製しようと いう研究がある。 微粒子の用途に応じて種々の金属あるいは金属化合物等をアポ フェリ ンに導入すべく研究が進められている。
ここで、 アポフェリチンについて説明する。 アポフェリチンは、 生物界に広く 存在するタンパク質であり、 生体内では必須微量元素である鉄の量を調節する役 割を担っている。 鉄または鉄化合物とアポフェリチンとの複合体はフェリチンと 呼ばれる。 鉄は必要以上に体内に存在すると生体にとって有害であるため、 余剰 の鉄分はフヱリチンの形で体内に貯蔵される。 そして、 フヱリチンは必要に応じ て鉄イオンを放出し、 アポフェリチンに戻る。
図 1は、 アポフヱリチンの構造を示す模式図である。 図 1に示すように、 アポ フェリチン 1は、 1本のポリぺプチド鎖から形成されるモノマーサブュニヅ卜が 非共有結合により 2 4個集合した分子量約 4 6万の球状タンパク質であり、 その 直径は約 1 2 n mで、 通常のタンパク質に比べ高い熱安定性と高い p H安定性を 示す。 アポフェリチン 1の中心には直径約 6 n mの空洞状の保持部 4があり， 外 部と保持部 4とはチャネル 3を介してつながっている。 例えば、 アポフェリチン 1に 2価の鉄イオンが取り込まれる際、 鉄イオンはチャネル 3から入り、 一部の サブュニット内にある ferrooxidase center (鉄酸化活性中心）と呼ばれる場所で 酸化された後、 保持部 4に到達し、 保持部 4の内表面の負電荷領域で濃縮される。 そして、 鉄原子は 3 0 0 0〜4 0 0 0個集合し、 フェリハイ ドライ ト （ 5 F e 2 0 3 · 9 Η 2 0 ) 結晶の形で保持部 4に保持される。 保持部 4に保持された金属 原子を含む微粒子の直径は、 保持部 4の直径とほぼ等しく、 約 6 n mとなってい る。
このアポフェリチンを用いて、 人工的に鉄以外の金属や金属化合物を担持させ た微粒子一アポフェリチン複合体が作製されている。
現在までに、 マンガン（P.Mackle, 1993， J. Amer. Chem. Soc. 115, 8471-847 2 ; F . C. Meldrumら， 1995, J. Inorg. Biochem. 58, 59- 68) ウラン（J.F.Hainfeld， 1992， Proc. Natl . Acad. Sci. USA 89, 11064- 11068)，ベリリウム（D. J. Price, 19 83， J. Biol . Chem. 258, 10873-10880) , アルミニウム（J. Fleming， 1987， Proc • Natl . Acad. Sci. USA, 84， 7866-7870), 亜鉛（D.Price and J. G.Joshi, Proc . Natl. Acad. Sci . USA, 1982, 79, 3116-3119)といった金属あるいは金属化合 物のアポフェリチンへの導入が報告されている。 これらの金属あるいは金属化合 物からなる微粒子の直径も、 アポフェリチンの保持部 4の直径とほぼ等しく、 約 6 nmとなる。
自然界において、 鉄原子を含む微粒子がアポフェリチン内に形成される過程の 概略は次の通りである。
アポフェリチン 1の外部と内部とを結ぶチャネル 3 (図 1参照） の表面には、 p H 7〜 8の条件下でマイナス電荷を持つアミノ酸が露出しており、 プラス電荷 を持っている F e 2 +イオンは静電相互作用によりチャネル 3に取り込まれる。 アポフェリチン 1の保持部 4の内表面には、 チャネル 3の内表面と同じく， p H 7〜 8でマイナス電荷を持つアミノ酸残基であるグルタミン酸残基が多く露出 しており、 チャネル 3から取り込まれた F e 2 +イオンは ferroxidase centerで酸 化され、 内部の保持部 4へと導かれる。 そして、 静電相互作用により鉄イオンは 濃縮されて、 フェリハイ ドライ ト （5 F e 2 0 3 · 9 H 2 0 ) 結晶の核形成が起こ る。
その後、 順次取り込まれる鉄イオンがこの結晶の核に付着して酸化鉄からなる 核が成長し、 直径 6 n mの微粒子が保持部 4内に形成される。 以上が、 鉄イオン の取り込みと酸化鉄からなる微粒子形成の概略である。
なお、 ここまで鉄イオンのアポフェリチンへの取り込みメカニズムについて述 ベたが、 これまでに導入が報告されている他の金属イオンは、 いずれもプラスィ オンであることから、 これらの金属イオンのアポフェリチンへの取り込みは、 鉄 イオンとほぼ同じメカニズムで進むと考えられる。 解決課題
これまでに、 コバルトの導入に関しては、 Douglasらによる水酸化コバルト ( C o 0 ( O H ) ) の導入の報告がある （T.Douglas and V. T. Stark, " Nanopha se Cobalt Oxyhydroxide Mineral Synthesizer within the Protein Cage of Fe rritin"， Inorg. Chem. , 39， 2000， 1828-1830) 。 上記 Douglasらの方法により コバルト微粒子を内包するコバルト一アポフェリチン複合体を作製することがで ぎる。
しかしながら、 上記 Douglasらの方法では緩衝液を用いていないため、 コバル ト微粒子を内包するコバルトーアポフエリチン複合体が形成された溶液の p Hが 変化 （低下） し、 その溶液を数日間放置すると、 内包されているコバルト微粒子 が溶液中に溶け出してしまう。 このため、 コバルト一アポフェリチン複合体に内 包されるコバルト微粒子の粒怪を維持することが難しい。 従って、 均一な粒径を 有するコバルト微粒子を内包するコバルト一アポフヱリチン複合体を得ることが 困難であるという不具合がある。 発明の開示
本発明は、 上記不具合を解決するためになされたものであり、 均一な粒径を有 するコバルト微粒子を内包するコノ ルト一タンパク質複合体を得るための方法を 提供することを目的とする。
本発明のコバルト一タンパク質複合体の作製方法は、 C o 2 +イオンと、 タンパ ク質と、 pH緩衝剤と、 Co2+会合剤とを含む溶液を調製するステップ （a) と、 上記溶液中に酸化剤を加えることによって、 上記タンパク質にコバルトを含む微 粒子を内包させるステップ （b) とを含む。
C o2+会合剤を用いることによって、 C o2+イオンがタンパク質内部に濃縮さ れる。 このため、 C o2+イオンと酸化剤との反応がタンパク質内部で優先的に生 じる。 このとき、 pH緩衝剤を用いて溶液を所望の pHに調整することによって、 C o2+イオンと酸化剤との反応が逆方向に進行することを防止し、 タンパク質に 内包されるコバルト微粒子が溶液中に溶け出すことを防止する。 従って、 均一な 粒径を有するコバルト微粒子を内包するコバルト一タンパク質複合体を得ること ができる。
上記 p H緩衝剤と上記 C o 2 +会合剤とは、 共に H E P E Sであることが好まし い o
HEPESは、 pH緩衝剤としての機能と、 Co2 +イオンの会合剤としての機 能とを備える。 このため、 pH緩衝剤と C o2+会合剤とを別々に準備する必要が ない。
上記タンパク質は、 アポフェリチンである構成としてもよい。
上記酸化剤は、 H2〇2である構成としてもよい。
本発明のコバルト—タンパク質複合体の作製方法は、 Co2 +イオンと、 アポフ ヱリチンと、 HEPESとを含む溶液を調製するステップ （a) と、 上記溶液中 に H202を加えることによって、 上記アポフェリチンにコバルトを含む微粒子を 内包させるステップ （b) とを含む。
本発明によれば、 C o 2 +イオンと H 202との反応が H E P E S緩衝液中で行な われるため、 pHが一定となり、 アポフェリチンに内包されるコバルト微粒子が 溶液中に溶け出すことが防止される。 従って、 均一な粒径を有するコバルト微粒 子を内包するコノ ノレト一タンパク質複合体を得ることができる。 図面の簡単な説明
図 1は、 アポフェリチンの構造を示す模式図である。
図 2は、 実施形態 1のコバルトーアポフェリチン複合体の作製方法を表すフロ 一チャートである。
図 3は、 反応溶液の状態を模式的に表す図である。
図 4は、 実施形態 1により得られたコバルト一アポフェリチン複合体の電子顕 微鏡写真である。
図 5は、 H E P E S緩衝液の代わりに T A P S緩衝液を用いて実施形態 1の方 法を実施して得られたアポフェリチンの電子顕微鏡写真である。
図 6 ( a ) 〜図 6 ( d ) は、 本実施形態の不揮発性メモリセルの製造方法を示 す工程断面図である。
図 7は、 ドット体を基板の表面上に 2次元状に配列および固定する方法を示す 工程断面図である。
図 8は、 複合体を基板の表面上に 2次元状に配列および固定する方法について 説明する図である。 最良の実施形態
上記 Douglasらの方法では、 下記化学反応式 1に示す反応を利用する。
Co2++H202 Co0 (0H) +H+ -…（"
上記化学反応式 1からわかるように、 反応が進行するほど反応溶液が酸性にな る。 反応溶液の p Hが 8付近では、 図 1に示すアポフェリチン 1の保持部 4の内 表面にはマイナス電荷を持つアミノ酸残基が多く露出しているので、 C o 2 +ィォ ンは保持部 4へと導かれる。 このため、 アポフェリチン 1の保持部 4に水酸化コ バルトからなる微粒子が形成されやすい。 従って、 反応溶液の p Hを 8付近に維 持しながら、 反応の進行に伴って生成する H +を中和する。 このため、 上記 Dougl asらの方法では、 具体的には、 アポフェリチン溶液に、 硝酸コバルト溶液と過酸 化水素水とを極微量ずつ加え、 p H調整のためにアポフェリチン溶液をス夕一ラ —で激しく攪拌しながら N a 0 Hを滴下する。 上述したように、 上記 Douglasらの方法では、 コバルト—アポフェリチン複合 体の形成において、 コバルト微粒子の粒径を維持することが難しい。 そこで本発 明者は、 上記 Douglasらの方法の見直しを行ない、 上記 Douglasらの方法には次の 問題点があると考えた。
第 1の問題点は、 緩衝液を用いずに、 アポフェリチン溶液に NaOHを滴下す ることによって、 pH調整を行なっている点である。 アポフェリチン溶液の Na OHが滴下された部分は、 局所的に NaOH濃度が急上昇し、 pHが増大する。 このため、 pHを調整する働きが十分ではない可能性がある。 従って、 上記化学 反応式 1の反応が逆方向に進行し、 コバルトーアポフェリチン複合体に内包され るコノ レト微粒子が溶液中に溶け出すと考えられる。
第 2の問題点は、 NaOHを用いている点である。 NaOHは強力なタンパク 質変性剤である。 従って、 アポフェリチン溶液の NaOHが滴下された部分は、 局所的に N a 0 H濃度が急上昇し、 アポフエリチンが変性してしまうおそれがあ る。 このため、 アポフェリチンが本来の性質を発揮できない状態、 つまり、 アポ フェリチンがコバルト微粒子を十分に保持できない状態になり得る。
第 3の問題点は、 工業的規模で行なうことが難しい点である。 上記 Douglasら の方法では、 アポフェリチン溶液に硝酸コバルト溶液と過酸化水素水とを極微量 ずつ加えながら NaOHを滴下する。 この方法では、 反応溶液の全容量が 20〜 50ml程度ならば反応させることは容易であるが、 反応スケールを工業的規模 まで大きくすると、 硝酸コバルト、 過酸化水素および NaOHをそれぞれアポフ エリチン溶液に添加するために要する時間が非常に大きくなる。 また、 硝酸コバ ルト、 過酸化水素および NaOHを、 大量のアポフェリチン溶液中にそれぞれ均 一に拡散させることは非常に困難である。 従って、 実用的ではない。
(実施形態 1 )
以下に記載する本発明の実施形態は、 上記考察に基づいて実施したものである。 以下、 図 1〜図 3を参照しながら本実施形態のコバルト一アポフェリチン複合体 の作製方法を説明する。
図 2は、 本実施形態のコバルト一アポフヱリチン複合体の作製方法を表すフロ 一チャートである。 まず、 図 2に示すように、 ステップ St 1において、 HEPES緩衝液、 アポ フェリチン溶液および C o2+イオン溶液 （例えば、 硝酸コバルト溶液） の順に各 溶液を混合することによって、 反応溶液を調製する。
次に、 図 2に示すように、 ステップ St 2において、 反応溶液に酸化剤 （例え ば Η2〇2) を添加する。 この操作によって、 アポフェリチン 1の保持部 4に水酸 化コバルト （CoO (OH) ) が導入され、 コバルト—アポフェリチン複合体が 生成される。
なお、 以上に説明したコバルト一アポフェリチン複合体を作製するための操作 は、 すべて室温、 もしくはタンパク質が変性しない温度範囲にて、 ス夕一ラーで 攪拌しながら行なう。
次に、 各ステップについて詳細に説明する。
まず、 ステップ St 1では、 反応溶液の pHを 7. 5〜9. 0程度の範囲に調 製しておく。 特に、 反応溶液の pHを pH8. 0〜8. 8程度の範囲に調製して おくことが好ましい。 反応溶液の pHが pH8. 0〜8. 8程度の範囲では、 ァ ポフェリチン 1の保持部 4の内表面にはマイナス電荷を持つァミノ酸残基が多く 露出しているので、 C o2 +イオンは保持部 4へと導かれる。 このため、 アポフエ リチン 1の保持部 4に水酸化コバルト （CoO (OH) ) からなる微粒子が形成 されやすい。 各 pHにおけるコバルト微粒子の形成状態を以下の表 1に示す。
【表 1 】
Figure imgf000009_0001
(" ◎" は特に良好、 " 〇" は良好" 、 " △" は可能、 " X" は不適当、 " 一" は、 未検査を表す。 ） なお、 pHが 8. 0〜8. 8の範囲では、 HE PE Sの緩衝能力が高い範囲を 外れているが、 HEPE S濃度を高くしておけばよい。 反応溶液中の HEPE S 濃度は、 水酸化コバルト （CoO (OH) ) の沈殿が生じても pH変化が十分小 さければどのような濃度でも良い。 例えば、 反応溶液中のコバルトイオンの濃度 が 3mMの場合は、 9 OmM以上の濃度の HEPE S緩衝液を用いればよい。 アポフェリチンの反応溶液中での濃度は、 0. l〜lmg/ml (約 0. 2〜 2 /M) の範囲内となるように調製する。 特に、 0. 5mgZml ( 1〃M) 程 度が好ましい。
Co2+イオンの濃度は、 アポフェリチン濃度に応じて調節する。 Co2+イオン の濃度は、 アポフェリチン濃度の 1000倍〜 5000倍程度がよいが、 特に 2 000〜3000倍程度が好ましい。 なお、 Co2+イオンを上記濃度よりも高濃 度で加えてもかまわないが、 高濃度で添加した場合、 アポフェリチンの保持部外 での CoO (OH) の形成が激しくなり、 この沈殿にコバルト一アポフェリチン 複合体が巻き込まれる可能性があり、 回収率が低下するおそれがある。
例えば、 アポフェリチン濃度が 0. 5mgZml (約 1 zM) の場合では、 2 〜3mMの濃度の C o2 +イオンを加える。 C o2 +イオンを加えるためにはどのよ うな化合物を用いてもよいが、 硫酸アンモニゥムコバルトまたは硝酸コバルトが 特によい。 硫酸アンモニゥムコバルトまたは硝酸コバルトを用いると、 後述する Co2 +— HE PES会合体を形成しやすく、 反応が急速に進行しない （爆発的に 反応しない） からである。
なお、 本実施形態では、 ステップ St 1において、 HEPE Sの最終濃度が 3 OmM (pH8. 8) に、 アポフェリチンの最終濃度が 0. 5mg/ml ( 1 μ. Μ) に、 C ο2 +イオンの最終濃度が 5mMになるように反応溶液を調製している。 次に、 ステップ St 2では、 0. 01〜 3%の過酸化水素水を、 コバルトィォ ンの 1Z2〜 1等量程度加える。 例えば、 C o2+イオンが 2mMの場合、 H202 の最終濃度が 1 mM〜 2 mMの範囲内になるように添加する。
なお、 過酸化水素水の添加によってアポフェリチンが変性することがある。 こ のため、 アポフヱリチンを安定化するために塩を加えることが有効である。 塩と しては、 例えば Na2S〇4などが挙げられるが、 それ以外の塩であっても良い。 なお、 コバルトーアポフヱリチン複合体を作製する場合には C 1—イオンの存在 が障害となる （C1—イオンは、 C o2 +イオンを安定化し、 CoO (OH) の形 成を阻害する） ため、 C 1を含まない塩を用いることが好ましい。
塩濃度は、 1 OmM以上で加えても良いが、 Na2S04の場合では、 実験結果 から 30mM〜 15 OmM程度で安定化するためには十分である。
以上の溶液条件をまとめた結果を表 2に示す。
【表 2】
Figure imgf000011_0001
また、 これまでの溶液調整中に C 1—イオンが入らないようにする。 さらに望 ましくは窒素をバブリングするなどの手段で溶液中の酸素を抜いておくのが良い。 以上の条件において、 ステップ St 1では、 反応溶液は、 Coz+イオンが呈す るピンク色の溶液となっている。
ステップ St 2において、 過酸化水素水の添加により C o 0 (OH) が生成す ると、 C o3+イオンが呈する茶色と緑色との中間色に変化する。 分光光度計で計 測したところ、 350 nm付近に吸収のピークがある水酸化物となっている。 通常、 上記の条件において、 室温で反応させると、 数時間から数日かかる。 し かしながら、 反応を速やかに進めるために、 反応溶液を 40°Cから 70°C程度に 加温してもよい。 このことによって、 数時間から一晩で反応を終了させることが できる。 70°C以上ではアポフェリチン粒子が不安定になるので、 室温〜 70°C 程度に加温することが好ましい。 特に、 反応溶液を 50〜60°C程度に加温する ことが好ましい。 あるいは、 好熱菌のアポフェリチンを用いれば、 80〜100 °C程度に加温してもよい。 これは、 上記の温度条件において、 生成する CoO (OH) の結晶性が良くなるからである。
なお、 本実施形態では、 ステップ St 2において、 H202の最終濃度が 2 mM に、 Na2S 04の最終濃度が 75mMになるように反応溶液を添加 、 反応溶液 を 50°Cに加温している。 一般に、 緩衝液は溶液中の化学物質に影響を及ぼさない。 しかしながら、 本実 施形態で使用する H EPE S緩衝液の場合、 H E P E Sと C o 2+イオンとの間で 相互作用して、 Co2 +— HEPES会合体を形成すると考えられる。 このときの 反応溶液中の状態は、 下記化学反応式 2に示す平衡状態であると考えられる。
Figure imgf000012_0001
Figure imgf000012_0002
このときの反応溶液の状態を図 3に模式的に表す。
上記化学反応式 2および図 3に示すように、 Co2 +— HEPES会合体と、 H E PE S単体と、 C o2+イオン単体とが平衡状態で存在するようになっている。 上記ステップ St 1において、 HE PE S緩衝液の代わりに水を用いた反応溶 液を用いる場合、 過酸化水素水の添加が行なわれると、 上記化学反応式 1に示す ように、 C o 2 +イオンは直ちに反応し、 Co3+イオンの化合物 CoO (OH) が 形成される。 CoO (OH) は不溶性なので直ちに沈殿し、 その結果すベての C o2 +イオンは CoO (OH) 沈殿となる。
しかしながら、 本実施形態の場合、 過酸化水素水を添加すると、 H202は、 C o2 +イオンと HEP E Sとが会合した状態である Co2 +— HE PES会合体を酸 化することができないと考えられる。 従って、 アポフェリチンの外部では、 わず かに水溶液中にある C 02 +イオンが H 202により酸化されて、 CoO (〇H) の 沈殿となっていく。
それに対してアポフェリチン 1の保持部 4は、 pHが 8付近ではマイナスとな つているので、 図 3に示すように、 アポフェリチン 1の外部に比べて C o2+ィォ ンの濃度が高くなつている。 この結果、 アポフヱリチン 1の保持部 4内で CoO (OH) が優先的に形成されるようになる。 さらに、 CoO (OH) の表面が触 媒作用を有するので、 反応は保持部 4内で急速に加速される。
溶液全体にある C o2 +イオンは、 H202の添加により C 00 (ΟΗ) 沈殿とな つて量が減少するが、 上記化学反応式 2の反応は化学平衡であるので、 Co2 +— HEPE S会合体が解離して C o2 +イオンは供給される。 従って、 反応溶液中の C o2+イオンの濃度は、 低濃度であるがほぼ一定に維持される。
このようなメカニズムの結果、 C o2 +— HEPE S会合体から C o2 +イオンが 供給され、 アポフヱリチン 1の保持部 4のマイナス電荷により濃縮される。 この ことによって、 保持部 4で CoO (OH) の形成が進行し、 コノヽっレトーアポフエ リチン複合体が形成される。
次に、 ステップ St 2以降の操作について説明する。
まず、 ステップ S t 2で得られた反応溶液を容器に入れ、 遠心分離機を用いて 毎分 3， 000回転、 15〜30分の条件で遠心分離し、 沈殿を除去する。 続い て、 沈殿を除去した後の上澄み液をさらに毎分 10, 000回転、 30分の条件 で遠心分離し、 コバルト—アポフエリチン複合体が凝集した不要な集合体を沈殿 させてから除去する。 このとき、 上澄み液中には、 コノ レト一アポフェリチン複 合体が分散された状態で存在している。
次に、 この上澄み液の溶媒を pH 7. 0、 10 OmMの HE PE S緩衝液から 150111]\1の &〇 1溶液へと透析により置換して、 新たなコバルト—アポフエ リチン複合体溶液を作製する。 ここでの pH調整は、 特に行なわなくてよい。 続いて、 コバルト—アポフヱリチン複合体溶液を 1〜 10mg/mlの任意の 濃度に透析により濃縮した後、 この溶液に最終濃度が 1 OmMとなるように Cd s 04を加え、 コバルト—アポフヱリチン複合体を凝集させる。
次に、 コバルト—アポフェリチン複合体溶液を毎分 3, 000回転、 20分の 条件で遠心分離し、 溶液中のフェリチン凝集体を沈殿させる。 その後、 溶液の緩 衝成分を 15 OmMの NaClが入った pH8. 0、 10 ~ 50 mMの T r i s 緩衝液へと透析により置換する。
次に、 コバルト—アポフヱリチン複合体溶液を濃縮後、 ゲルろ過カラムにより コバルト一アポフェリチン複合体溶液をろ過することにより、 コバル卜一アポフ エリチン複合体が得られる。 この後、 コバルト—アポフヱリチン複合体は、 適切 な溶液中で保存される。
以上に示したように、 本実施形態では、 緩衝液を用いて pH調整を行なうこと によって、 アポフェリチン溶液を所望の pHに調整することができる。 従って、 上記化学反応式 1の反応が逆方向に進行することを防止でき、 コバルトーアポフ ェリチン複合体に内包されるコバルト微粒子が溶液中に溶け出すことが防止され る。 従って、 本実施形態によれば、 均一な粒径を有するコバルト微粒子を内包す るコバルト一アポフェリチン複合体を得ることができる。
特に本実施形態では N a OHを用いないので、 アポフェリチンが変性してしま うおそれがない。 このため、 アポフヱリチンが本来の性質を発揮できる状態、 つ まり、 アポフヱリチンがコバルト微粒子を十分に保持できる状態に維持すること ができる。
また、 本実施形態のコバルト一アポフェリチン複合体の作製方法では、 溶液全 体にある C o2+イオンは、 H202の添加により C o 0 (OH) 沈殿となって量が 減少するが、 上記化学反応式 2の平行反応により、 Co2 +— HEPES会合体が 解離して C o2 +イオンは供給される。 Co2 +イオンは、 アポフェリチン 1の保持 部 4のマイナス電荷により濃縮され、 保持部 4で CoO (OH) の形成が進行し、 コバルト一アポフェリチン複合体が形成される。 このため、 反応スケールを工業 的規模まで大きくした場合に、 酸化剤 （本実施形態では E O を均一に拡散さ せることに特別注意を払わなくとも、 酸化剤を添加するだけでコバルト—アポフ エリチン複合体が形成される。 従って、 本実施形態のコバルト—アポフェリチン 複合体の作製方法では、 工業的規模で行なうことが比較的容易である。
図 4は、 本実施形態により得られたコバルト一アポフェリチン複合体の電子顕 微鏡写真である。 図 4には、 代表的に矢印で示すように、 アポフェリチンの内部 (保持部） に CoO (OH) が取り込まれている様子が示されている。
一方、 図 5は、 HEPES緩衝液の代わりにリン酸緩衝液または TAPS緩衝 液を用いて本実施形態の方法を実施して得られたアポフェリチンの電子顕微鏡写 真である。 図 5と図 4とを比較してみると、 図 5では、 代表的に矢印で示すよう にアポフェリチンの内部 （保持部） に CoO (OH) が取り込まれていないこと がわかる。 つまり、 リン酸緩衝液を用いた場合には、 アポフェリチンの保持部で
CoO (OH) の形成が起こらない。 本発明者は、 他の緩衝液 （例えば、 Tr i s緩衝液、 TAPS緩衝液、 酢酸緩衝液など） でも、 アポフヱリチンの保持部で CoO (OH) の形成が起こらないことも確認している。 この結果から、 Co2 + ィオンは、 アポフエリチンの保持部に濃縮される前にすベてアポフヱリチンの外 部の溶液中で CoO (OH) の沈殿となっているものと考えられる。 つまり、 T APS緩衝液、 Tr i s緩衝液、 リン酸緩衝液、 酢酸緩衝液などの場合には、 C o2+イオンとリン酸、 酢酸、 または Tr i sとの間では、 上記化学反応式 2およ び図 3のような平行状態が成り立っていないと考えられる。
以上のことから、 本実施形態では用いている HEPE Sは、 緩衝剤であり、 且 つ、 Co2+イオンと会合する会合剤として機能していると考えられる。 従って、 本実施形態で用いる HE P E S緩衝液の代わりに、 緩衝液および会合剤としてそ れそれ別の試薬を用いれば、 本実施形態と同様に、 均一な粒径を有するコバルト 微粒子を内包するコバルト一アポフェリチン複合体が得られる。 つまり、 緩衝液 として、 例えば、 TAPS緩衝液、 Tr i s緩衝液、 リン酸緩衝液などを、 会合 剤としては、 シクロデキストラン、 クラウンエーテル、 力リックスアーレンなど をそれそれ用いれば、 本実施形態と同様の効果が得られる。
また、 本実施形態では、 コバルトを導入するタンパク質としてアポフヱリチン を用いたが、 内部に金属粒子を保持することが可能な他のタンパク質 （例えば、 Dpsタンパク質、 CCMVタンパク質など） を代わりに用いてもよい。
またさらに、 本実施形態では、 酸化剤として H 202を用いたが、 他の公知の酸 化剤を代わりに用いてもよい。 例えば、 KMn04、 K2Cr207、 HN〇3、 H C 10、 NaC 10などを酸化剤として H 202の代わりに用いることができる。
(実施形態 2)
本実施形態では、 上記実施形態 1において作製されたコバルト—アポフヱリチ ン複合体を利用して形成されるドット体をフローティングゲートとして含む不揮 発メモリセルについて説明する。
図 6 (a) 〜図 6 (d) は、 本実施形態の不揮発性メモリセルの製造方法を示 す工程断面図である。
まず、 図 6 (a) に示す工程で、 p型 S i基板 101上に、 LOCOS法によ り、 活性領域を取り囲む素子分離酸化膜 102を形成した後、 基板上にトンネル 絶縁膜として機能するゲート酸化膜 103を熱酸化法によって形成する。 その後、 6 nm程度の粒径を有する金属または半導体の微粒子からなるドット体 104を 基板上に形成する。 なお、 ドット体 104を基板上に形成する方法については、 後述する。
次に、 図 6 (b) に示す工程で、 基板上に、 スパヅ夕法または CVD法により、 ドヅト体 104を埋める S i 02膜を堆積する。
次に、 図 6 (c) に示す工程で、 基板上に A 1膜を堆積する。 続いて、 フォト レジストマスク P r 1を用いて、 S i 02膜および A 1膜のパターニングを行な つて電極間絶縁膜となるシリコン酸化膜 105及び制御ゲート電極となる A 1電 極 106を形成する。 このとき、 ゲート酸化膜 103のうちフォトレジストマス ク P r 1で覆われていない部分は除去されるので、 その上のドット体 104も同 時に除去される。 その後、 フォトレジストマスク及び A 1電極 106をマスクと して不純物イオンの注入を行なって、 第 1、 第 2n型拡散層 107a、 107b を形成する。
その後、 図 6 (d) に示す工程で、 周知の方法により、 層間絶縁膜 108の形 成と、 層間絶縁膜 108へのコンタクトホール 109の閧口と、 コンタクトホ一 ル 109内へのタングステンの埋め込みによるタングステンプラグ 110の形成 と、 第 1、 第 2アルミニウム配線 111 a、 111 bの形成とを行なう。
本実施形態では、 基板として p型 S i基板を用いたが、 n型 S i基板を用いて もよく、 さらに、 GaAsをはじめとする化合物半導体その他の半導体により構 成される基板を用いてもよい。
次に、 図 6 (a) に示す工程において、 ドット体 104を基板上に形成する方 法を、 図 7および図 8を参照しながら以下に説明する。 なお、 本発明は、 以下に 説明する方法には限定されず、 他の公知の方法を適用することも可能である。
まず、 図 7 (a) に示す工程で、 上記実施形態 1で得られたコバルト一アポフ ヱリチン複合体 （以下、 本明細書中では複合体と略す） 150を用意し、 この複 合体 1 50を基板 130の表面上に配置する。 このことによって、 複合体 15 0 が基板 130の表面上に高密度、 且つ高精度で配置された複合体膜が形成される。 なお、 基板 1 30とは、 図 6 (a) に示す工程で、 p型 S i基板 101上に、 L
0 CO S法により、 活性領域を取り囲む素子分離酸化膜 102を形成した後、 基 板上にトンネル絶縁膜として機能するゲート酸化膜 103が熱酸化法によって形 成されたものを指す。 以下の説明においても同様である。
次に、 図 7 (b) に示す工程で、 複合体 150のうちのタンパク質分子 140 を除去して、 コノ レト微粒子 104 aのみを残存させることによって、 基板 1 3 0上にドット体 104を形成する。
ここで、 図 7 (a) に示す工程において、 複合体 150を基板 130の表面上 に高密度、 且つ高精度で配置する、 すなわち、 基板 130の表面上に 2次元状に 配列および固定する方法について説明する。 本実施形態では、 以下に、 特開平 1
1 -45990号公報に記載の方法を図 8を参照しながら説明する。
まず、 図 8 (a) に示すように、 複合体 150を分散した液体 160 (本実施 形態では、 濃度 40mM、 H 5. 3のリン酸バッファ溶液と、 濃度 40mMの 塩化ナトリウム水溶液との等量混合溶液にコバルト—アポフェリチン複合体を分 散したもの） を用意する。
続いて、 図 8 (b) に示すように、 PBLH (P o l y- 1 -B en z i l - L— H i s t i d i ne) を注射器などで静かに液体 160の表面に展開する。 このことによって、 液体 1 60の表面に PBLHからなるポリペプチド膜 1 Ί 0 0が形成される。 この後、 液体 160の pHを調節しておく。
次に、 図 8 (c) に示すように、 時間の経過に伴って複合体 150がポリぺプ チド膜 170に付着し、 複合体 150の 2次元結晶ができる。 これは、 ポリぺプ チド膜 1 Ί 0が正電荷を帯びているのに対し、 複合体 150は負電荷を帯びてい るからである。
次に、 図 8 (d) に示すように、 ポリペプチド膜 170上に基板 130を載置 して （浮かべて） 、 ポリペプチド膜 170を基板 130に付着させる。
次に、 図 8 (e) に示すように、 基板 130を取り出せば、 ポリペプチド膜 1 70を介して、 複合体 150の 2次元結晶が付着した基板 130を得ることがで ぎる。
次に、 図 7 ( b ) に示す工程をさらに詳細に説明する。
タンパク質分子は一般に熱に弱いため、 複合体 1 5 0のうちのタンパク質分子 1 4 0の除去は、 熱処理によって行なう。 例えば、 窒素等の不活性ガス中におい て、 4 0 0〜5 0 0 °Cにて、 約 1時間静置すると、 タンパク質分子 1 4 0、 およ び方法 1の場合のポリペプチド膜 1 7 0が焼失し、 基板 1 3 0上にはコバルト微 粒子 1 0 4 aが 2次元状に、 高密度で、 且つ高精度で規則正しく配列したドット 体 1 0 4として残存する。
以上のようにして、 図 7 ( b ) に示すように、 複合体 1 5 0に保持させたコバ ルト微粒子 1 0 4 aを、 基板 1 3 0上に 2次元状に出現させ、 高密度且つ高精度 に配列したドッ ト体 1 0 4を形成することができる。
図 6 ( d ) に示すように、 本実施形態のメモリセル 1 0 0は、 制御ゲートとし て機能する A 1電極 1 0 6と、 ソースまたはドレインとして機能する第 1、 第 2 n型拡散層 1 0 7 a、 1 0 7 bとからなる M O S トランジスタ （メモリセルトラ ンジス夕） を備え、 フローティングゲートとして機能するドット体 1 0 4に蓄え られた電荷の量で上記メモリ トランジス夕の閾値電圧が変化することを利用した 不揮発性メモリセルである。
この不揮発性メモリセルは、 二値を記憶するメモリとしての機能が得られるが、 ドット体 1 0 4に蓄えられる電荷の有無のみだけでなく電荷の蓄積量を制御する ことで、 三値以上の多値メモリを実現することもできる。
デ一夕の消去の際には、 酸化膜を介した F N (Fowler-Nordheim) 電流や直接 トンネリング電流を利用する。
また、 データの書き込みには、 酸化膜を介した F N電流や直接トンネリング電 流あるいはチャネルホットエレクトロン （C H E ) 注入を用いる。
本実施形態の不揮発性メモリセルでは、 フローティングゲートが量子ドットと して機能できる程度に粒径の小さいコバルト微粒子により構成されているので、 電荷の蓄積量がわずかである。 したがって、 書き込み、 消去の際の電流量を小さ くでき、 低消費電力の不揮発性メモリセルを構成することができる。
また、 本実施形態の不揮発性メモリセルでは、 フローティングゲートを構成す るコバルト微粒子のサイズが均一であるため、 電荷の注入、 引き抜きの際の特性 が各コバルト微粒子間で揃っており、 これらの操作において制御が容易に行なえ る。
本発明によれば、 均一な粒径を有するコバルト微粒子を内包するコバルトー夕 ンパク質複合体を得ることができる。 産業上の利用可能性
本発明のコバルトータンパク質複合体の作製方法は、 超微細なパターンを必要 とする装置の製造、 特に、 ドット体をフローティングゲートとして含む不揮発メ モリセル等の超微細電子デバイスの製造に利用される。

Claims

言青求の範囲
1. Co2 +イオンと、 タンパク質と、 pH緩衝剤と、 Co2+会合剤とを含む溶 液を調製するステップ （a) と、
上記溶液中に酸化剤を加えることによって、 上記タンパク質にコバルトを含む 微粒子を内包させるステップ （b) と、
を含むコバルト—タンパク質複合体の作製方法。
2. 請求項 1に記載のコバルト—タンパク質複合体の作製方法において、 上記 p H緩衝剤と上記 C o 2 +会合剤とは、 共に HEPESであることを特徴と するコノ レト一タンパク質複合体の作製方法。
3. 請求項 1または 2に記載のコバルトータンパク質複合体の作製方法におい て、
上記タンパク質は、 アポフェリチンであることを特徴とするコバルト一タンパ ク質複合体の作製方法。
4. 請求項 1 ~ 3のいずれか 1つに記載のコバルトータンパク質複合体の作製 方法において、
上記酸化剤は、 H202であることを特徴とするコバルト—タンパク質複合体の 作製方法。
5. Co2 +イオンと、 アポフェリチンと、 HEPESとを含む溶液を調製する ステップ （a) と、
上記溶液中に H202を加えることによって、 上記アポフヱリチンにコバルトを 含む微粒子を内包させるステップ （b) と、
を含むコバルト一タンパク質複合体の作製方法。
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