WO2003027287A1

WO2003027287A1 - Transporteur d'urate specifique du rein et gene associe

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Publication number: WO2003027287A1
Application number: PCT/JP2002/008457
Authority: WO
Inventors: Hitoshi Endou; Yoshikatsu Kanai; Atsushi Enomoto
Original assignee: Human Cell Systems, Inc.
Priority date: 2001-09-21
Filing date: 2002-08-22
Publication date: 2003-04-03
Also published as: US7510847B2; CA2456172A1; DE60225699T2; EP1428880B1; CA2456172C; JP2003093067A; JP3824899B2; AU2002325545B2; ATE389720T1; HK1066241A1; EP1428880A1; EP1428880A4; US20070117162A1; DE60225699D1; US20040265819A1

Description

明細書腎臓特異尿酸トランスポーターとその遺伝子技術分野

本発明は腎臓における尿酸及びその類似物質の輸送、もしくは尿酸と他の陰ィオンの交換輸送に関与する遺伝子と、その遺伝子がコードするポリペプチドに関する。背景技術

人類と霊長類において、有機酸である尿酸は細胞内におけるプリン代謝の最終代謝産物であり、主に腎臓から排泄される。人類と霊長類以外の種では、肝臓の尿酸酸化酵素（ユリケース）の働きによりさらにアラントインまで代謝されて腎臓より排泄される。したがって他の哺乳類にとっては、中間代謝産物である尿酸の腎臓における動態異常の生体に及ぼす影響は少ないと考えられる。人類が古代より、高尿酸血症による痛風を患ってきたのはユリケースの働きを、その進化の過程のなかで失ったことが原因と考えられる。

ヒトにおいて、腎臓における尿酸の排泄低下により高尿酸血症をきたすと、痛風を高率に発症し、心血管系疾患や高血圧の危険因子となる。一方、腎性低尿酸血症は、腎臓における尿酸排泄亢進が成因であることが知られている。これらの疾患の尿酸動態の異常は明らかではないが、腎臓における尿酸の輸送体（トランスポ一夕一）が深く関わっていることが、これまで推測されてきた。

腎臓における尿酸の動態については、これまで摘出臓器灌流法や単離細胞膜小胞系などを用いた実験系により研究されてきた。ヒトにおいて、尿酸は腎臓糸球体を自由に通過し、その後近位尿細管において再吸収及び分泌の機構が存在することが明らかにされている。しかし従来の手法では、細胞膜を介した尿酸輸送系について詳細に解析することは困難であり、トランスポー夕一そのものを単離して解析することが望まれてきた。

尿酸の腎臓における輸送には、著しい種差が存在し、ブタゃゥサギのような分泌優位の種と、ヒト、ラットゃィヌのような再吸収優位の種が存在することが知られている。分泌優位の種であるブ夕は、単位ネフロンあたり 2 0 0〜 3 0 0 % の尿酸排泄を行うが、尿酸再吸収優位の種であるヒトは、単位ネフロンあたり 1 0 %程度の尿酸排泄しか行わない。また同じ尿酸再吸収優位の種間でも、尿酸排泄促進薬や尿酸排泄抑制薬に対する反応が異なることが知られている。このように、種により腎臓における尿酸の動態や薬物に対する反応が異なり、また両方向性の輸送が行われているため、その存在が想定されているにも関わらず、尿酸輸送体の分子的実体の単離は容易ではなかった。

腎臓における尿酸輸送体のなかでも、尿細管管腔より尿酸を再吸収する輸送体は古くより単離細胞膜小胞系などを用いた実験系により研究されてきた。現在、高尿酸血症及び痛風の患者に対して用いられている種々の薬剤は、腎臓において尿酸を再吸収する輸送体を抑制することが想定されている。またこの輸送体の遺伝子異常により、腎性低尿酸血症が発症することが予想されている。

近年、尿酸の再吸収を司る輸送体は、尿酸と種々の陰イオンの交換輸送体であることが、様々な実験において明らかにされてきた。抗結核薬として現在も第一選択薬として用いられているピラジナミドは、その代謝産物であるピラジン力ルポン酸が、この交換輸送体の交換基質となり、尿酸再吸収を促進することが明らかになっている。抗結核薬を投与されている患者に高率にみられる高尿酸血症の原因と考えられている。

このように、腎臓における尿酸の再吸収を担う輸送体は、尿酸の体内動態に関して重要な役割を担っていると考えられ、その分子的実体を解明することで、尿酸排泄促進薬の作用機序、腎性低尿酸血症の原因解明及び新たな痛風治療薬の開発に広がるものと期待されてきた。

我々は、以前に腎臓、肝臓、脳、胎盤などにおける薬物輸送において中心的な役割を果たしている有機ァニオントランスポーター OAT ( 0 r g a n i c a n i o n t r a n s p o r t e r ) 1 (S e k i n e , T . e t a 1. , J . B i o l . C h em. , 第 2 7 2卷， 1 8 5 2 6— 1 8 5 2 9頁、 1 9 9 7年）、 OAT 2 (S e k i n e , T. e t a に， F E B S 1 e t t e r，第 4 2 9巻、 1 7 9— 1 8 2頁、 1 9 9 8年）、 OAT 3 (K u s u h a r a， H. e t a 1. ， J . B i o l . C h em. , 第 2 7 4巻、 1 3 6 7 5 — 1 3 6 8 0頁、 1 9 9 9年）、及び OAT 4 (C h a, S . H. e t a 1. , J . B i o l . C h em. , 第 2 7 5巻、 4 5 0 7— 4 5 1 2頁、 2 0 0 0年）を単離し報告してきた。〇 ATファミリーに属するこれらのトランスポーターは化学構造の異なる多くの有機ァニオンを輸送することの出来る卜ランスポー夕一であり、種々のァニオン性薬物の輸送も行っている。

尿酸の輸送体については、既知のトランスポーターファミリ一に属するかは明らかではなかったが、尿酸はピリミジン構造とィミダゾ一ル構造を併せ持つ 2塩基酸であり、有機ァニオンの一つであることより尿酸トランスポ一夕一は発生学的に 0 ATフアミリーに属する可能性が予想された。 OATファミリーのうち 0 AT 4は腎臓の尿細管管腔側に存在しており、尿酸の再吸収を担う輸送体も管腔側にその存在が想定されていることより、発生学的に O AT 4に近いものであることも予想された。

これらの事実から、我々は、腎臓における尿酸トランスポ一ターが有機イオントランスポ一タ一ファミリ一に属するものであることを予測した。発明の開示

本発明の目的は、腎臓における尿酸輸送に関与する新規な尿酸トランスポー夕 —遺伝子およびその遺伝子がコ一ドするポリべプチドである尿酸トランスポ一夕 —を同定し、提供することにある。その他の目的については以下の記載より明白である。図面の簡単な説明

第 1図は、ヒト成人及び胎児の各臓器組織における UR AT 1遺伝子メッセンジャ一 RN Aの発現をノーザンプロッティングにより解析した結果を示す。

第 2図は、 URAT 1遺伝子の c R N Aを注入した卵母細胞による尿酸取り込み実験の時間依存性の結果を示す。

第 3図は、 URAT 1遺伝子の c RN Aを注入した卵母細胞による尿酸取り込み実験の濃度依存性の結果を示す。第 4図は、 URAT 1遺伝子の c RN Aを注入した卵母細胞による尿酸取り込み実験において、添加する塩の影響を調べた結果を示す。

第 5図は、 URAT 1遺伝子の c RN Aを注入した卵母細胞による尿酸取り込み実験の p H依存性の結果を示す。

第 6図は、 URAT 1遺伝子の c RN Aを注入した卵母細胞による尿酸取り込み実験において各有機酸でプレインキュベ一ションした結果を示す。

第 7図は、 URAT 1遺伝子の c RN Aを注入した卵母細胞による尿酸取り込み実験において、非標識の乳酸（ l O OmM, l O O n l ) をあらかじめ注入した影響を調べた結果を示す。

第 8図は、 URAT 1遺伝子の c RN Aを注入した卵母細胞による尿酸取り込み実験において、系への各種有機酸もしくはその類似化合物添加の影響を調べた結果を示す。

第 9図は、 URAT 1遺伝子の c RN Aを注入した卵母細胞による尿酸取り込み実験において、系への各種濃度のプロべネシド添加の影響を調べた結果を示す < 第 1 0図は、 URAT 1遺伝子の c RN Aを注入した卵母細胞による尿酸取り込み実験において、系への各種濃度の口サルタン添加の影響を調べた結果を示す < 第 1 1図は、ヒトゲノムにおける URAT 1遺伝子のェクソンーィントロン構造を示す。発明を実施するための最良の形態

本発明者らは既に述べたように、 4つの有機ァニオントランスポーター OAT

1、 OAT 2、 OAT 3および OAT 4を単離した。これらは相互に 40 %前後のアミノ酸配列の相同性を有している。これらの配列をもとに、ヒトゲノム計画の公開情報を検索し、 ΟΑΤ 1、 2、 3および 4と相同性を有する新規遺伝子断片を複数同定した。このうち OAT 4の遺伝子座位にきわめて近い新規遺伝子断片の 1つを解析し、その中に開始コドンと思われる部位を同定した。この開始コドンの 5 ' 上流に特異的プライマ一を作製し、ヒトの様々な組織由来のメッセンジャー RNAを用いた 3， -RAC E (3， - r a p i d amp l i f i c a t i o n o f c DNA e n d s ) 法により、この新規遺伝子の単離を試みた。その結果、ヒト腎臓メッセンジャー RN Aを用いた 3 ' — RACE法によりこれまでに報告のない新規クローン（URAT 1) を同定した。

本発明の尿酸トランスポーター URAT 1 (u r a t e t r a n s o r t e r 1 ) は、尿酸およびその類似物質を細胞膜を介して一方より他方に輸送する能力を有し、さらに細胞膜の他方の陰イオンを交換基質とする交換輸送体（u r a t e / a n i o n e x c h a n g e r) である。

本発明のタンパク質としては、配列番号 1で示されたアミノ酸配列を有するもののほか、例えば、配列番号 1で示されたアミノ酸配列において 1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有するものが挙げられる。アミノ酸の欠失、置換もしくは付加は、尿酸輸送活性が失われない程度であればよく、通常 1〜約 1 1 0個、好ましくは 1〜約 5 5個である。このようなタンパク質は、配列番号 1で示されたアミノ酸配列と通常、〜 7 5 %、好ましくは〜 9 0 %のアミノ酸配列の相同性を有する。

本発明において、 3 ' — R A C E法による遺伝子の単離は、通常、遺伝子開始コドンの 5 ' 側上流にグァニンあるいはシトシンに富む遺伝子特異的プライマ一を 3 0塩基ほどで作製し、アダプタ一配列のついたオリゴ d Tプライマ一で組織由来のメッセンジャ一 RNAより逆転写反応を行った後、アダプタ一配列と遺伝子特異的プライマ一で P C R (ポリメラ一ゼ連鎖反応）を行うことにより実施できる。 P C Rの正確性をより高めるためには、より f i d e 1 i t yの高い耐熱性ポリメラ一ゼを用いることにより実施できる。

本発明の尿酸トランスポーター遺伝子は、適当な哺乳動物の腎臓の組織や細胞を遺伝子源として用いて作製した c DNAライブラリーをスクリ一二ングすることにより単離取得できる。哺乳動物としては、ィヌ、ゥシ、ゥマ、ャギ、ヒッジ. サル、プ夕、ゥサギ、ラット、マウスなどの非ヒト動物のほか、ヒトが挙げられる。

遺伝子のスクリ一ニングおよび単離は、ホモロジ一スクリーニングおよび P C R法などにより好適に実施できる。

得られた c DN Aについては、常法により塩基配列を決定し、翻訳領域を解析して、これにコードされるタンパク質、即ち UR AT 1のアミノ酸配列を決定することができる。

得られた c D N Aが尿酸トランスポ一ターの c D NAであること、即ち c DN Aにコードされた遺伝子産物が尿酸トランスポーターであることは、例えば次のようにして検証することができる。得られた U RAT I c D NAかも調製した c RNA (相補的 RNA) を卵母細胞に導入して発現させ、尿酸を細胞内に輸送する（取り込む）能力を、尿酸を基質とする通常の取り込み実験（S e k i n e ,

T e t a 1 . , B i o c h e m. B" i o p h i s . R e s . C o mmu n . ，第 2 5 1卷、 5 8 6— 5 9 1頁、 1 9 9 8年）により、細胞内への基質取り込みを測定することにより確認できる。

また、発現細胞に同様の取り込み実験を応用して、 UR AT 1の輸送特性や基質特異性などを調べることができる。

また、発現細胞について、同様の取り込み実験を応用して、 URAT 1の特性、例えば、 UR AT 1が時間依存性の輸送を行っているという特性や、 URAT 1 の基質選択性、 P H依存性などを調べることができる。

得られた URAT 1遺伝子の c DNAを用いて、異なる遺伝子源で作製された適当な c D NAライブラリ一又はゲノミック D NAライブラリ一をスクリーニングすることにより、異なる組織、異なる生物由来の相同遺伝子や染色体遺伝子等を単離することができる。

また、開示された本発明の遺伝子の塩基配列（配列番号 1 ) に示された塩基配列、もしくはその一部）の情報に基づいて設計された合成プライマ一を用い、通常の P C R法により c DNAライブラリーから遺伝子を単離することが出来る。

c DNAライブラリー及びゲノミック DNAライブラリ一等の DNAライブラリ一は例えは、「 M o l e c u l a r C l o n i n g ; S amb r o o k, J . ， F r i t s h , E . F . および M a n i a t i s , T. 著、 C o l d S r i n g H a r b o r L a b o r a t o r y P r e s sより 1 9 8 9年に発刊」に記載の方法により調製することができる。あるいは、市販のライブラリーがある場合にはこれを用いてもよい。

UR AT 1遺伝子のヒトゲノム上における構造を得るには、得られた UR AT 1遺伝子の c D N Aを用いて、ゲノミック DN Aライブラリーをスクリーニングし、得られたクローンを解析する。あるいは公開されているヒトゲノム解析結果の情報をもとにホモロジ一検索プログラムを用いてこれを探索してもよい。

本発明の尿酸トランスポーター（URAT 1 ) は、例えば、尿酸トランスポーターをコードする c DNAを用い、遺伝子組み換え技術により生産することができる。例えば、尿酸トランスポ一ターをコードする DN A (c DNA等）を適当な発現べクタ一に組み込み、得られた組み換え D N Aを適当な宿主細胞に導入することができる。ポリペプチドを生産するための発現系（宿主べクタ一系）としては、例えば、細菌、酵母、昆虫細胞および哺乳動物細胞の発現系等が挙げられる。このうち、機能タンパクを得るためには、昆虫細胞および哺乳動物細胞を用いることが望ましい。

例えば、ポリペプチドを哺乳動物で発現させる場合には、尿酸トランスポ一タ —をコードする DNAを、適当な発現べクタ一（例えば、レトロウイルス系べク夕一、パピ口一マウィルスベクタ一、ワクシニアウィルスベクタ一、 S V 4 0系ベクタ一等）中の適当なプロモータ一（例えば S V 40プロモータ一、 L TRプ口モータ—、ェロンゲ一シヨン 1 ひプロモータ一等）の下流に揷入して発現べク夕一を構築する。次に、得られた発現べクタ一で適当な動物細胞を形質転換して、形質転換体を適当な培地で培養することによって、目的とするポリぺプチドが生産される。宿主とする哺乳動物細胞としては、サル CO S— 7細胞、チヤィニ一ズハムスター CHO細胞、ヒト H e L a細胞または、腎臓組織由来の初代培養細胞ゃフ 'タ腎由来 L L C— P K 1細胞、フクロネズミ腎由来 OK細胞、マウス由来近位尿細管 S l、同 S 2、同 S 3細胞等の細胞株が挙げられる。

尿酸トランスポ一夕一 UR AT 1をコードする c DN Aとしては、例えば、配列 1に示される ½基配列を有する c DN Aを用いることが出来るほか、前記の c DN Aに限定されることなく、アミノ酸配列に対応する DN Aを設計し、ポリべプチドをコードする DNAを用いることもできる。この場合、一つのアミノ酸をコードするコドンは各々 1〜 6種類知られており、用いるコドンの選択は任意でよいが、例えば発現に利用する宿主のコドン使用頻度を考慮して、より発現の高い配列を設計することができる。設計した塩基配列をもつ DN Aは DNAの化学合成、前記 c D N Aの断片化と結合、塩基配列の一部改変等によって取得できる。人為的な塩基配列の一部改変、変異導入は、所望の改変をコードする合成オリゴヌクレオチドからなるプライマーを利用して部位変異導入法（ s i t e s p e c i f i c mu t a g e n e s i s ) 「M a r k， D . F . ら、 P r o c a t l A c a d S c i USA 第 1 8卷、 5 6 6 2— 5 6 6 6頁、 1 9 84年」等により実施できる。

本発明の尿酸トランスポーター遺伝子にストリンジェン卜な条件下で八イブリダイズするヌクレオチド (ォリゴヌクレオチドもしくはポリヌクレオチド）は、尿酸トランスポ一夕一遺伝子を検出するためのプローブとして使用できるほか、尿酸トランスポ一夕一の発現を変調させるために、例えばアンチセンスオリゴヌクレオチド、やリポザィム、デコイとして使用することもできる。このようなヌクレオチドとしては、例えば、配列番号 1で示される塩基配列の中の通常、連続する 1 4塩基以上の部分配列もしくはその相補的な配列を含むヌクレ才チドを用いることができ、ハイブリダィズをより特異的とするためには、部分配列としてより長い配列、例えば 2 0塩基以上あるいは 3 0塩基以上の配列を用いても良い。また、本発明の尿酸トランスポーターまたは、これと免疫学的同等性を有するポリペプチドを用いて、その抗体を取得することが出来、抗体は、尿酸トランスポーター検出や精製などに利用できる。抗体は、本発明の尿酸トランスポ一夕一、その断片、またはその部分配列を有する合成べプチド等を抗原として用いて製造できる。ポリクロナ一ル抗体は、宿主動物（たとえば、ラットゃゥサギ）に抗原を接種し、免疫血清を回収する通常の方法により製造することができ、モノクロナ一ル抗体は、通常のハイプリドーマ法などの技術により製造できる。

さらに、本発明は尿酸排泄促進作用を有する物質のスクリ一二ング方法を提供するものである。本発明のタンパク質は、尿酸を細胞内に輸送するためのものであり、尿酸の再吸収に深くかかわつている。また、第 6図、第 8図、第 9図及び第 1 0図に示されるように本発明のタンパク質の発現している系に尿酸を添加し、さらにスクリ一ニング物質を添加して尿酸の取り込み量をスクリ一ニング物質の無添加の場合と比較することにより、その系におけるスクリ一二ング物質の尿酸の取り込みについての促進作用又は阻害作用を定量化することができる。第 6図及び第 8図に示されるように、臨床において尿酸排泄促進剤として使用されている物質が顕著に前記実験系において尿酸の取り込みを阻害していることから、この系においてスクリ一ニング物質における尿酸排泄促進作用をスクリ一エングすることが可能となることがわかる。このスクリーニング系において使用される細胞としては、下記の実験において使用されている卵母細胞に限定されるものではなく、本発明のタンパク質を発現し得る細胞であれば各種の生体細胞を使用することができる。

したがって、本発明は、本発明のタンパク質を用いて尿酸排泄調整作用を有する物質をスクリ一ニングする方法を提供するものである。本発明の尿酸排泄調整作用としては、尿酸の排泄促進作用又は尿酸の排泄阻害作用があり、高尿酸症や痛風などの治療、予防には尿酸排泄促進作用を有するものが好ましいことから、好ましい尿酸排泄調整作用としては、尿酸排泄促進作用が挙げられる。さらに、本発明は前記したスクリ一ニング方法によりスクリ一ニングされた尿酸排泄調整剤を提供するものである。好ましい尿酸排泄調整剤としては、尿酸排泄促進剤が挙げられる。本発明の方法によりスクリーニングされた尿酸排泄調整剤は、腎臓などにおける尿酸輸送に関与する尿酸トランスポ一夕一による尿酸の取り込みを調整することができることから、高尿酸症や痛風などの尿酸の再吸収に関連する各種疾患の治療、予防の医薬の有効成分として使用することができる。

このようにして得られた有効成分を製薬上許容される担体を用いて医薬組成物とすることができる。実施例

以下、実施例をもって本説明をさらに詳しく説明するが、これらの実施例は本発明を制限するものではない。

なお下記実施例において、各操作は特に断りがない限り、「Mo l e c u l a r C l o n i n g r S amb r o o k, J . ， F r i t s h , E. F. および M a n i a t i s , T . 著、 o l d S p r i n g H a r b o r L a b o r a t o r y P r e s sより 1 9 8 9年に発刊」に記載の方法により行うか、または、市販のキットを用いる場合には市販品の指示書に従って使用した。実施例 1 腎臓特異的尿酸トランスポ一夕一（UR AT 1 ) c DNAの単離とその解析

既に我々が単離した 0 AT 1、 OAT 2、 OAT 3、及び OAT 4の塩基配列情報をもとに、公開されているヒトゲノム計画の解析結果をホモロジ一探索プログラムを用いて探索した。この結果、〇AT 1、 OAT 2、〇AT 3、 OAT 4 と相同性を有する新規遺伝子断片を複数得た。この中で、 O AT 4の遺伝子座位にきわめて近い新規遺伝子断片の 1つを解析し、その中に開始コドンと思われる部位を同定した。この開始コドンの同定は新規遺伝子断片を OA T 1及び OAT 4の遺伝子配列と比較することにより得られた。

予測された開始コドンの 5 ' 側上流に特異的プライマーを 2 8塩基を用いて作製し、ヒトの様々な組織由来のメッセンジャー RN Aを用いた 3，一 RACE (3 ' — r a p i d amp l i f i c a t i o n o f c D N A e n d s ) 法により、この新規遺伝子の単離を試みた。その結果、ヒト腎臓メッセンジャ一 RNAを用いた 3 ' — R A C E法により単一のクローン（URAT 1 ) を得た。 P C R法により得られた単一のバンドを T Aクロ一ニング法を用いて、 p C R I I一 TO P Oベクタ一にサブクローン化したのち、さらに発現ベクターである p c DNA 3. 1 (+ ) ベクタ一にサブクローン化した。この結果、尿酸輸送活性を持つ新規 c DN A (UR AT 1 c DNA) が得られた（輸送機能解析については以下参照）。

上記により得られた c DNA (URAT 1 c DNA) の塩基配列の決定は、特異的プライマ一を用いて、自動シークェンサ一（アプライドバイオシステム社製）によりおこなった。（配列番号 1に記載）

ヒトの各組織における U RAT 1遺伝子の発現（ノーザンブロッテイング）の解析を行った（第 1図）。 URAT 1 c DNAの全長を³² P— d CT Pでラベルし、これをプローブとして用いて、ヒトの種々の組織から抽出した RNAをブロッテイングしたフィルタ一（クロンテック社製）を用いてハイブリダィゼ一シヨンを行った。標識後の URAT 1 c DN A全長を含んだハイブリダィゼ一シヨン液でー晚ハイブリダイセ一シヨンを行い、フィルターを 6 5でにて、 0. 1 % S D Sを含む 0. l x S S Cで洗浄した。ノーザンプロットの結果、腎臓において、強いバンドが検出された。ヒト胎児組織では腎臓においてバンドが検出された。実施例 2 尿酸トランスポーター機能の解析

URAT 1 c DN Aを含むプラスミドから、 T 7 RNAポリメラ一ゼを用いて、 i n v i t r oで c RNA (c DNAに相補的な RNA) を調製した (S e k i n e , T. ， e t a l . ， J . B i o l . C h e m. , 第 2 7 2巻、 1 8 5 2 6— 1 8 5 2 9頁、 1 9 9 7年参照）。

得られた c RNAを、既に報告されている方法に従い（S e k i n e , T. ， e t a l . ， J . B i o l . C h em. ，第 2 7 2卷、 1 8 5 2 6— 1 8 5 2 9頁、 1 9 9 7年）、ァフリカツメガエルの卵母細胞に注入し、この卵母細胞について放射能標識された尿酸による取り込み実験を行った。この結果、第 2図に示すように UR AT 1を発現させた卵母細胞は [¹⁴C] 尿酸の取り込みを示すことが判明した。 UR AT 1を発現させた卵母細胞は [¹⁴C] 尿酸の取り込みの時間依存性を示した。このことから、 UR AT 1は単に尿酸と結合するだけではなく、細胞内に輸送するトランスポーターであることが示された。有機ィオントランスポ一夕一ファミリーの代表的な基質である [¹⁴C] PAH (パラァミノ馬尿酸）及び [¹⁴C] TEA (テトラェチルアンモニゥム）の取り込みは認められなかった（図には示さず）。

UR AT 1の尿酸輸送のミカエリス一メンテン動力学試験をおこなった。種々の濃度の尿酸の U RAT 1による取り込み量の変化を調べることにより、尿酸の UR AT 1による輸送の濃度依存性を検討した。放射能標識された尿酸の取り込み実験は、 URAT 1 c RN Aを注入した卵母細胞を用い、前記記載方法に準じて実施した。この結果（第 3図）、尿酸の取り込みの Km値（ミカエリス定数）は約 3 7 2 ± 2 5 Mであった。

UR AT 1の尿酸輸送における各種電解質の影響を検討した（第 4図）。細胞外ナトリウムをリチウム、コリン及び N—メチルー D—ダルカミン（NMD G) に置換した場合、 UR AT 1を介した尿酸の輸送は変化せず、 URAT 1が細胞外ナトリゥム非依存性の尿酸トランスポー夕一であることが明らかとなった。細胞外のカリウムイオンをすベてナトリウムで置換した場合（第 4図， 0— K + ) 、およびナトリウムをすベてカリゥムイオンで置換した場合（ 9 6 mM K C 1 ) も尿酸の輸送は変化せず、 U RAT 1細胞膜電位に非依存性であることが明らかとなった。細胞外のクロライドイオンをダルコン酸で置換した場合、尿酸の取り込みは有意に増加した。単離細胞膜小胞系などを用いた実験系により、ヒト腎臓の尿細管管腔側に、尿酸とクロライドイオンの交換輸送体の存在が示されており、本実験結果もク口ライドが尿酸との交換基質となることを示唆するものといえる _t

UR AT 1の尿酸輸送における pH依存性を検討した。第 5図に示すように、細胞外の PHをより酸性にしたところ、 URAT 1 C RN Aを注入した卵母細胞の尿酸輸送は増加したが、これは水を注入した卵母細胞（対照）における尿酸の非特異的吸着が原因と考えられた。実質の尿酸輸送（U RAT I—対照）は p Hによつて変化しなかった。実施例 3 尿酸トランスポ一夕一における尿酸の交換基質の検討

単離細胞膜小胞系などを用いた実験系により、ヒト腎臓の尿酸/陰イオン交換輸送体は乳酸、ニコチン酸などのモノカルボン酸が尿酸との交換基質となりうることが示唆されている。 UR AT 1の尿酸の交換基質を検討するため、これらのモノカルボン酸（ ImM) 、パラアミノ馬尿酸、及びケトグルタル酸で卵母細胞をプレインキュベ一トしたのちに尿酸の輸送を測定した（第 6図）。 I mMのピラジンカルボン酸及びニコチン酸（ 3—ピリジンカルボン酸）でプレインキュべ —トした場合、 URAT 1 c RNAを注入した卵母細胞では尿酸の取り込みが有意に増加した。一方、モノカルボン酸ではないパラアミノ馬尿酸ゃケトグル夕ル酸でプレインキュベ一トした場合は尿酸の取り込みを促進しなかった。以上の結果は、ピラジンカルボン酸やニコチン酸などのモノカルボン酸が尿酸との交換基質となっていることを示している。

第 6図において、モノカルボン酸である乳酸でプレインキュペートした場合は尿酸の取り込みを促進しなかった。卵母細胞は内因性の乳酸トランスポーターを豊富に発現しているため、取り込まれた乳酸が URAT 1以外の経路で細胞外に輸送されてしまうためと考えられた。また後に示すように URAT 1に対する乳酸の親和性が低いことも原因と予想された。そこで、あらかじめ 1 0 OmMの放射能非標識の L一乳酸を 1 0 0 n 1注入したのち、放射能標識された尿酸の取り込みを観察した（第 7図）。乳酸をあらかじめ注入した場合、水を注入した場合と比べて有意に高い尿酸の取り込みが観察された。パラアミノ馬尿酸、及びケトダルタル酸を注入しても尿酸の取り込みは、水を注入した場合と変化がみられなかった（図には示さず）。

第 6図及び第 7図の結果より、 U R AT 1は尿酸とモノカルボン酸との交換輸送体（e x c h a n g e r ) である。抗結核薬であるピラジナミドは代謝されてピラジンカルボン酸となり尿中に排泄されるが、一方腎臓での尿酸の再吸収を促進するといわれている。以上の結果は U RAT 1において尿酸とピラジン力ルポン酸が交換輸送される結果、尿酸の取り込みが促進されることを示しており、抗結核薬であるピラジナミドの副作用とされる高尿酸血症を引き起こす機序が明らかにされた。実施例 4 尿酸トランスポーターの阻害物質のスクリ一エング

U RAT 1の基質選択性をさらに検討するために、 URAT 1 c RNAを注入した卵母細胞による [¹⁴C] 尿酸の取り込み実験系において、系へ各種物質を添加し、その影響を調べた（阻害実験）。 [¹⁴C] 尿酸の取り込み実験は、 UR AT I c RNAを注入した卵母細胞を用い、前記記載方法に準じて実施した

(第 8図，第 9図，第 1 0図）。第 8図に示した濃度の各種化合物（非標識）の存在下おょぴ非存在下で、 5 [¹⁴C] 尿酸の取り込みを p H 7. 4の条件下で測定した。その結果、種々のモノカルボン酸（L一乳酸、 D—乳酸、ニコチン酸、ピラジンカルボン酸）は URAT 1による [¹⁴C] 尿酸の輸送を有意に阻害した（第 8図）。ジカルボン酸であり、 O AT 1の交換基質となりうるケトグルタル酸は P H 7. 4の条件下では阻害しなかった。ピラジンカルボン酸と似た構造をもつピラジンジカルボン酸はやや弱い阻害効果を示した。パラアミノ馬尿酸ゃテトラェチルアンモニゥムのようなァニオン性物質及びカチオン性物質は阻害作用を示さなかった（第 8図）。高尿酸血症の治療に用いられているプロベネシド、ベンズブロマロン、スルフインビラゾン、フエニルブタゾンなどの薬剤は、 UR AT 1における尿酸の取り込みを有意に阻害した。また高血圧治療薬である口サルタンは、尿酸排泄促進作用があることが知られているが、口サルタンもその代謝産物である E X P— 3 1 7 4と同様に URAT 1の尿酸の取り込みを有意に阻害した。以上の結果から、 UR AT 1は現在臨床で用いられている代表的な尿酸排泄促進薬の作用点であるプロべネシドと口サルタンの様々な濃度を用いて、 U R AT 1における尿酸取り込み作用に対する阻害効果を調べた（第 9図及び第 1 0図）。 I C 5 0値はそれぞれ約 5 0 M、 2 0 Mであった。実施例 5 U RAT 1遺伝子の構造解析

UR AT 1遺伝子のヒトゲノムにおける構造を解析した。ホモロジ一検索プログラムを利用して公開されているヒトゲノム解析結果の情報を探索したところ、 UR AT 1遺伝子のェクソン · イントロン構造が明らかになった。第 1 1図に示すように UR AT 1遺伝子は 1 0のェクソンからなり、開始コドンは第 1ェクソンに存在した。産業上の利用可能性

本発明の尿酸を選択的に輸送する腎臓特異的尿酸トランスポ一夕一及びその遺伝子は当該トランスポ一ターの発現箇所での尿酸及び尿酸類似物質の輸送のィンピトロでの検討や、それを基にした化合物の体内動態の予測を可能とする。尿酸は高尿酸血症や痛風と深い関わりのある因子であり、当該トランスポ一夕一の発明は将来高尿酸血症及び痛風の病因解明に寄与するものと考えられる。当該トランスポ一夕一は腎臓において尿酸を再吸収する働きを有しており、尿酸再吸収機構の欠損した腎性低尿酸血症の原因遺伝子解明に寄与すると考えられる。さらに. 当該トランスポーターの機能を抑制する新規化合物、及び発現を変調する制御因子を解明することにより、高尿酸血症及び痛風の新たな治療法の開発に寄与することができる。

Claims

請求の範囲

1 . 配列番号： 1に記載されたアミノ酸配列又は該アミノ酸配列において 1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、尿酸及びその類似物質を輸送する能力を有するタンパク質。 ·

2 . ヒト由来である請求の範囲第 1項に記載のタンパク質。

3 . 臓器、組織、もしくは培養細胞由来である請求の範囲第 1項又は第 2項に記載のタンパク質。

4 . 請求の範囲第 1項記載のタンパク質をコ一ドする遺伝子。

5：配列番号： 1に記載された塩基配列からなる D N A、又は該 D N Aとストリンジェントな条件下でハイブリダィズし、尿酸及びその類似物質を輸送、もしくは尿酸と他の陰イオンを交換輸送する能力を有するタンパク質をコードする D N A。

6 . ヒト由来である請求の範囲第 5項記載の遺伝子。

7 . 臓器、組織、もしくは培養細胞由来である請求の範囲第 5項又は第 6項に記載の遺伝子。

8 . 請求の範囲第 4項〜第 7項のいずれかの項に記載の遺伝子もしくは該遺伝子の中のタンパク質をコードする遺伝子を含むプラスミド。

9 . プラスミドが発現プラスミドである請求の範囲第 8項記載のプラスミド。

1 0 . 請求の範囲第 8項又は第 9項に記載のプラスミドで形質転換された宿主細胞。

1 1 . 配列番号 1で示される塩基配列の中の連続する 1 4塩基以上の部分配列もしくはその相補的な配列を含むヌクレオチド。

1 2 . 尿酸及びその類似物質を輸送、もしくは尿酸と他の陰イオンを交換輸送する能力を有するタンパク質をコードする遺伝子を検出するためのプローブとして使用するものである請求の範囲第 1 1項記載のヌクレオチド。

1 3 . 尿酸及びその類似物質を輸送、もしくは尿酸と他の陰イオンを交換輸送する能力を有するタンパク質をコードする遺伝子の発現を変調させるために使用するものである請求の範囲第 1 1項記載のヌクレオチド。

1 4 . 請求の範囲第 1項〜第 3項のいずれかの項に記載する夕ンパク質に対する抗体。

1 5 . 請求の範囲第 1項〜第 3項のいずれかの項に記載のタンパク質を用いて、該タンパク質の有する尿酸及びその類似物質を輸送、もしくは尿酸と他の陰ィォンを交換輸送する能力に対する被検物質の基質としての作用を検出する方法。

1 6 . 請求の範囲第 1項〜第 3項のいずれかに記載のタンパク質を用いて、尿酸排泄調整作用を有する物質をスクリ一二ングする方法。

1 7 . 請求の範囲第 1 6項に記載の方法によりスクリーニングされ得る尿酸排泄調整剤。

1 8 . 請求の範囲第 1項〜第 3項のいずれかの項に記載のタンパク質、その特異抗体、その機能促進物質あるいは機能抑制物質を用いて、該タンパク質の有する尿酸及びその類似物質を輸送、もしくは尿酸と他の陰イオンを交換輸送する能力を変調させることにより、該タンパク質によって輸送される尿酸及びその類似物質の腎臓での動態を変更する方法。

1 9 . 請求の範囲第 1項〜第 3項のいずれかの項に記載のタンパク質、その特異抗体、その機能促進物質あるいは機能抑制物質を用いて、該タンパク質の有する尿酸及びその類似物質を輸送、もしくは尿酸と他の陰イオンを交換輸送する能力を変調させることにより、該タンパク質によって輸送される尿酸及びその類似物質の腎臓での動態に与える影響を変更する方法。

2 0 . 請求の範囲第 1項〜第 3項のいずれかの項に記載のタンパク質、その特異抗体、その機能促進物質あるいは機能抑制物質を用いて、該タンパク質の有する尿酸及びその類似物質を輸送、もしくは尿酸と他の陰イオンを交換輸送する能力を変調させることにより、該タンパク質によって輸送される尿酸及びその類似物質の全身血中濃度に与える影響を変更する方法。

2 1 . 請求の範囲第 1項〜第 3項のいずれかの項に記載のタンパク質、その特異抗体、その機能促進物質あるいは機能抑制物質、それをコードする c D N A (相補的 D N A ) を用いて、該タンパク質を特定の細胞に過剰発現させるか、あるいはすでに細胞に存在する該タンパク質の有する尿酸及びその類似物質を輸送する能力を変調させることにより、該タンパク質によって輸送される尿酸及びその類似物質の腎臓における動態に与える影響を検出および変更する方法。